Stabilität von Proteinen -...

Stabilität von Proteinen

Physiologische Stressbedingungen - extreme Temperaturen (-5 - 115°C) - hydrostatischer Druck (> 1200 bar) - hohe Salzkonzentrationen (> 4 M NaCl) - extreme pH Werte (-1 < pH < 12)

Anpassung des Organismus - Ausschließen des Faktors (z.B. Kompartimentierung) - Neutralisierung des Faktors (z.B. Synthese osmotischer Substanzen) - Toleranz (Adaptation) Anpassung auf molekularer Ebene

- Thermophilie, Psychrophilie - Barophilie - Halophilie - Acidophilie

Denaturierter Zustand von Proteinen

Tanford (1968): alle Strukturen, die vom nativen Protein durch die höchste Energiebarriere getrennt sind

heute: random coil

Ene

rgie

Reaktionskoordinate

U

N

ÜS

Größenverteilung eines random coil

Methoden der Denaturierung - Harnstoff, Guanidin - pH oder Temperatur - Detergenzien - org. Lösungsmittel Nachweis: Spektroskopie, Aktivität, Viskosität

ΔG

Messung eines Denaturierungsüberganges

Bestimmung der Harnstoff- bzw Guanidinkonzentration

ΔN = Brechungsindex (Guanidin) - Brechungsindex (Puffer)

Messung eines Denaturierungsüberganges Fl

uore

scen

ce /

CD

frac

tion

unfo

lded

urea (M) urea (M) temperature

frac

tion

unfo

lded

Voraussetzung für thermodynamische Analyse:

- reversibel (gleicher Übergang für N & U aus Ausgangsmaterial)

- gleicher Übergang mit unterschiedlichen Methoden

Auswertung eines Guanidinüberganges nach 2-Zustandsmodell ΔG = ΔGD + RT lnK (K = FU/FF)

im Gleichgewicht: ΔG = 0

ΔGD = -RT lnK

Bestimmung von ΔG unter Standardbedingungen (O M Denaturans, 25°C)

Methoden der Extrapolation - Bindungsmodell - Gleichgewichtsmodell nach Tanford - linear

1) Bindungsmodell

ΔGD = ΔG(H20) - Δn RT ln(1 + Ka)

mit: n = unterschiedliche Anzahl der Bindungsstellen für Denaturans an Protein in N und D

K = Bindungskonstante für Denaturans (Gdm = 0.6 M, Harnstoff = 0.1 M)

a = chem. Aktivität des Denaturans

Extrapolation 2) Gleichgewichtsmodell nach Tanford

Transferenergien für Aminosäuren (Lösungsmittel: Wasser / Denaturans)

Extrapolation 3) Lineare Extrapolation

ΔGD = ΔG(H20) - m [Denaturans]

mit: m = Steigung der Geraden

häufigste (einfachste) verwendete Methode kein theoretischer Hintergrund

Voraussetzung für thermodynamische Analyse:

- reversibel (gleicher Übergang für N & U aus Ausgangsmaterial)

- 2-Zustandsmodell: N <-> U

Denaturierung nach 3-Zustandsmodell

U I N α-Laktalbumin

(o) Tertiärstruktur (Nah UV CD) (Δ) Sekundärstruktur (Fern UV CD)

mit Calcium: - 2-Zustandsmodell

ohne Calcium: - Tertiär- und Sekundärstruktur verhalten sich unterschiedlich => mindest. 3 Zustände

Qualitativer Nachweis des Überganges mit Harnstoff-Gradientengelen

Thermische Denaturierung von Proteinen ΔG = ΔGT + RT lnK (K = FU/FF)

im Gleichgewicht: ΔG = 0

ΔGT = -RT lnK

Problem: nichtlineare Abhängigkeit von dGT und Temperatur ==> keine einfache Extrapolation auf 20 (25) °C (Standardbedingung)

T

Thermische Denaturierung von Proteinen

°C

kcal

/mol

°C °C

ΔG = ΔH - TΔS

°C

kcal

/mol

ΔG = Gnative - Gunf

Thermische Denaturierung - Auswertung Berechnung von ΔGT wie bei Gdm-Übergang,

aber keine einfache Extrapolation auf 25°C, da Enthalpie und Entropie nicht linear von T abhängen

Berechnung von ΔG bei T nach:

ΔG(T) = ΔHm(1-T/Tm) - ΔCp[(Tm - T) + T ln(T/Tm)]

erforderliche experimentelle Größen: Tm ΔHm ΔCp

1) Tm aus Auftragung von ΔG gegen T bekannt ( ΔG(Tm) = 0 )

2) Berechnung von ΔHm : ΔG(Tm) = 0 = ΔHm - TΔSm Auftragung ΔG gegen T Steigung in Tm entspricht ΔSm und ΔHm = TmΔSm

3) Berechnung von ΔCp : d(ΔH) / d(T) = ΔCp Messung des Wertepaares ΔHm und Tm bei verschiedenen Bedingungen (z.B. pH) (Näherung: ΔCp = 12 cal/mol/deg/residue (Protein 100 aa -> 1200 cal/mol/deg )

Thermische Denaturierung - Auswertung -

Detaillierte Protokolle zu finden in:

Pace and Scholz Measuring the conformational stability of a protein in: Protein Structure, a practical approach 2nd edition, ed.: T.E. Creighton; IRL Press, Oxford pp. 299-321

Thermische Denaturierung Differential Scanning Calorimetry (DSC)

Messgrößen:

Peakfläche entspr. Enthalpie

Peakspitze entspr. Tm

Differenz der Vor- und Nach- Übergangsbaseline entspr. ΔCp

keine direkte Messung von ΔG, aber

ΔG(T) = ΔHm(1 - T/Tm) -ΔCp[(Tm - T) + T ln(T/Tm)]