Vplyv vybraných génových polymorfizmov receptoru vitamínu D na priebeh sclerosis multiplex

Vplyv vybraných génových polymorfizmov receptoru vitamínu D na priebeh sclerosis multiplex

Čierny Daniel 1, Michalik, J. 2, Dobrota, D. 1, Lehotský, J. 1

UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVEJesseniova lekárska fakulta v Martine

1 Ústav lekárskej biochémie JLF UK, Martin2 Neurologická klinika, Univerzitná nemocnica Martin

14. vědecko-pedagogická konference učitelů biochemických oborů lékařských fakult v ČR a SR

Plzeň, 30. 5. 2013

Etiopatogenéza sclerosis multiplex

Environmentálne faktory

• vitamín D• infekcie – EBV, HSV• fajčenie

Genetické faktory

• HLA gény• non-HLA gény

Epigenetické zmeny

• demyelinizačné zápalové autoimunitné ochorenie CNS

• autoreaktívny klon T-lymfocytov → zápal → poškodenie myelínu →

axonálna degenerácia → remyelinizácia → neurologický deficit

Rýchlosť progresie sclerosis multiplexSkóre EDSS (Expanded Disability Status Scale, Kurtzke) : 0 – 10

• rozšírená Kurtzkeho škála funkčnej nespôsobilosti

• posudzuje hybnosť rúk, schopnosť chôdze, výkon denných aktivít, sebestačnosť, schopnosť komunikácie, prehĺtania, poruchy funkčných systémov

Zneschopnenie pacienta

KURTZKE, J.F. 1983.

„malígna“ SM ČAS (roky)

„benígna“ SM

EDSS ≥ 3,5 5

EDSS ≥ 4 7 EDSS ≤ 2EDSS ≥ 5 10 EDSS ≤ 3 EDSS ≥ 6 15 EDSS ≤ 4

EDSS ≥ 6,5 20 EDSS ≤ 5EDSS ≥ 7 30 EDSS ≤ 6

Vitamín D

• príjem – v potrave, tvorba v koži (UV žiarenie)

• odporúčaná denná dávka – cca 1000 IU

• regulácia kostného metabolizmu

• imunomodulačné účinky (karcinogenéza, autoimunita)

Imunomodulačné účinky vitamínu D

• T-lymfocyty - inhibícia sekrécie INF-γ TH1-ly, zlepšenie funkcie TREG-ly,

↑ tvorby IL-10, posun v smere TH2

• B-lymfocyty – ↓ expresie MHC II molekúl, ↓ tvorby Ig,

↓ diferenciácie plazmatických buniek

• makrofágy a dendritické bunky - ↓ sekrécie IL-12 a TNF-ɑ, ↓sekrécie

stimulačných molekúl, ↓ zrenia a chemotaxie DC

(Bikle, 2011)

Vitamín D a sclerosis multiplex

• vplyv na oligodendrocyty už počas vývinu jedinca

• protektívny efekt voči vzniku SM (Munger et al., 2004)

• hypovitaminóza D – rizikový faktor vzniku SM

• denná dávka 400 IU redukuje riziko vzniku SM o 80 % (Simon et al., 2010)

• plazmatická hladina negatívne koreluje s výskytom relapsov SM (Soilu- Hanninen et al., 2005)

• v oblastiach mierneho klimatického pásma, tehotné ženy, deti s

anamnézou SM – preventívna suplementácia vit. D (Pierrot-Deseilligny a

Souberbielle, 2011, Chaudhuri, 2005)

• potenciálne liečebné účinky u pacientov s SM (Cadden et al.., 2011)

Mechanizmus účinku vitamínu D

Imunomodulačné účinky

KALCITRIOL v plazmevitamín D viažúci proteín (DBP)

Cieľové tkaniváVDR - receptor

vitamínu D

Kostný metabolizmus

hydroxylácia

Antibakteriálne účinky

Génové polymorfizmy VDR

Ovplyvnenie: • VDR mRNA – hladina, stabilita, zostrih• VDR proteín – stabilita, izoformy, interakcie

Génové polymorfizmy VDR a SM

• zámena C / T resp. F / f (SNP rs10735810)

• spôsobuje posun iniciačného kodónu VDR génu

• alelová varianta f (resp. T) - vznik VDR proteínu dlhšieho o 3 aminokyseliny v porovnaní s alelou F

• alela F (resp. C) – kratší VDR proteín divého typu – vyššia transkripčná aktivita (účinnejšia interakcia s TFIIB)

Fok I polymorfizmus VDR

Fok I polymorfizmus VDR

• protektívny efekt vitamínu D z exogénnych zdrojov – iba u jedincov s genotypom ff (Simon et al., 2010)

• zníženie rizika vzniku SM – genotyp ff (Partridge et al.,2004)

• nižšia frekvencia genotypu ff u pacientov s vyšším EDSS skóre (Mamutse et al., 2008)

• u jedincov s genotypom obsahujúcim alelu F nižšia plazmatická hladina kalcidiolu (Orton et al., 2008)

FF Ff ff

ApaI a TaqI polymorfizmus VDRApaI polymorfizmus

• zámena G / T resp. A / a (SNP rs7975232)• bez zmeny aminokyseliny, ale mení stabilitu mRNA• alela A – vyššie riziko vzniku SM (Tajouri et al., 2005)

• alela A – ↑ frekvencia u SM pacientov, ↑ riziko SM v kombinácii s alelou b a HLA-DRB1*1501 (Niino et al., 2000)

TaqI polymorfizmus

• zámena T / C resp. T / t (SNP rs731236)• alela t – ↑ frekvencia u SM pacientov, 2-krát ↑ riziko vzniku SM,

3-krát ↑ riziko vzniku progresívnej SM (Tajouri et al., 2005)

Súbor vyšetrovaných jedincov

Doteraz nazbierané vzorky DNA:

160 dobrovoľných darcov krvi205 pacientov s SM

Vyšetrení jedinci: PACIENTI SMSPOLU 100POMALÁ PROGRESIA 33RÝCHLA PROGRESIA 21KONVENČNÁ SM 79

ZDRAVÍ JEDINCISPOLU 100

Metodika práce• odber 5 ml vzorky periférnej krvi

• izolácia DNA

• amplifikácia DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

• štiepenie produktu PCR restrikčnými endonukleázami

(FokI , ApaI, TaqI)

• elektroforéza (2% agarózový gél, etídiumbromid)

• vyhodnotenie (UV lampa)

Predbežné výsledky

• 39 pacientov s SM (18 RP SM, 21 PP SM) a 58 zdravých jedincov

S rýchlejšou progresiou SM je asociovaná:

• alela f FokI polymorfizmu (OR = 2,48, 95% CI = 1,14 – 5,35, p = 0,016, vs. CTL)

• alela a ApaI polymorfizmu (OR = 2,5, .95% CI = 0,99 – 6,26, p = 0,04, vs. PP SM)

alela F alela f0.00%

10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%

CTLSMRP SMPP SM

FokI polymorfizmus – alelové frekvencie

alela A alela a0.00%

10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%80.00%

CTLSMRP SMPP SM

ApaI polymorfizmus – alelové frekvencie

Výsledky – ApaI polymorfizmus VDR

ApaI polymorfizmus VDR - genotypy

AA Aa aa

CTL 34 37 29

SM 30 52 18

POMALÁ PROGRESIA 12 17 4

RÝCHLA PROGRESIA 6 7 8

KONVENČNÁ SM 24 45 10

Výsledky – Taq I polymorfizmus VDR

TaqI polymorfizmus VDR - genotypy

TT Tt tt

CTL 41 41 18

SM 36 52 12

POMALÁ PROGRESIA 7 22 4

RÝCHLA PROGRESIA 10 7 4

KONVENČNÁ SM 26 45 8

Výsledky – Fok I polymorfizmus VDR

FokI polymorfizmus VDR - genotypy

FF Ff ff

CTL 35 53 12

SM 32 52 16

POMALÁ PROGRESIA 9 19 5

RÝCHLA PROGRESIA 3 12 6

KONVENČNÁ SM 29 40 10

V skupine s rýchlou progresiou SM:• signifikantne vyššia frekvencia alely f (vs. CTL: p = 0.02; OR = 2.12; .95 CI = 1.08 – 4.18)

(vs. konv. SM: p = 0.02; OR = 2.17; .95 CI = 1.09 – 4.34)

**

*

Záver

• alelové frekvencie polymorfizmov FokI, ApaI a TaqI sa nelíšia medzi kontrolnou skupinou a SM

• alelové varianty polymorfizmov ApaI a TaqI nesúvisia s rýchlosťou progresie SM

• alela f polymorfizmu FokI je spojená s rýchlejšou progresiou SM

• predpoklad - efekt je spôsobený znížením aktivity VDR a následnou nedostatočnou imunomodulačnou a protizápalovou funkciou vitamínu D

Ďalšie ciele• overiť zistené súvislosti vo väčšej skupine jedincov• analyzovať imunologické a biochemické parametre• vyšetriť ďalšie génové polymorfizmy metabolizmu vitamínu D

Gén Funkcia Lokalizácia génu

SNP Polymorfná alela

CYP27B1 (25-hydroxy-vitamín D-1α-hydroxyláza)

hydroxylácia 12q13

rs703842 C/Trs10877012 G/Crs4646536 C/T

rs10877015 A/Grs118204009 A/Grs118204012 A/Grs118204011 C/T

CYP2R1 (mikrozomálna vitamín D 25-hydroxyláza)

hydroxylácia 11p15 rs10741657 A/Grs10500804 G/Trs12794714 A/G

DBP (vitamín D viažúci proteín) transport v plazme 4q12 rs7041 G/Trs4588 A/C

VDR (vitamín D receptor)receptor 12q13

rs1544410 (BsmI) T/C (B/b)rs7975232 (ApaI) T/G (A/a)rs731236 (TaqI) T/C (T/t)

rs10735810 (FokI) C/T (F/f)rs11568820 (Cdx2) G/A

rs2254210 A/Grs98784 C/T

CYP24A1 (vitamín D 24-hydroxyláza) deaktivácia 20q13 rs2296241 A/G

Spolupráca

• Ústav lekárskej biochémie JLF UK

• Neurologická klinika UNM

• Národná transfúzna služba v Martine

Ďakujem za pozornosť!