Caracteristicas Genero Brucella

ASPECTOS BASICOS DEL GENERO Brucella

M.V. MSc. Datty Rosales-Zambrano Octubre 2014

J-40013861-2

• Hipócrates describe en

su tratado Epidemias

algo similar a la

Brucelosis (400 A.C).

• El apóstol San Pablo

se infecto n su naufragio

en la Isla de Malta :

“Aguijón en la carne”

BRUCELOSIS EN EL MUNDO

• Marston, 1859.

• Bruce, 1884. Micrococcus melitensis.

• Dr. Bernard Bang. Bacillus abortus,1895.

• Comisión de Fiebre Mediterránea, 1905.

• B. suis .Traum. 1914.

• B. ovis .1953. Buddles y Boyes.

• B. canis. Carmichael (Nicoletti,2002).

DATTY R-Z.

Brucelosis en Venezuela

• José María Vargas. 1838. Fiebres Malignas.

• Mosquera y Risquez. Fiebre ondulante.1898 y 1903.

• Kubes. 1939. Observaciones sobre la Brucelosis de los animales domésticos en

Venezuela. Brucella abortus. Encontrados Edo. Zulia. Cepa 19 y Reacción de Huddleson. • Gallo y Vogelsang. 1939. Relaciones entre la infección

brucelar de los animales y de la Fiebre Ondulante en el hombre. Campaña contra la Brucelosis.

• Landaeta y Ortiz,1940. Primer caso identificado de Brucelosis

Humana en el País. • 1941. Inicia producción cepa 19

en • Risquez, Vogelsang y Gallo.

1943-1946. Estado actual de la Brucelosis en Venezuela. ALTO

PORCENTAJE DE GANADO BOVINO AGLUTINANTE A

BANG. • Briceño Iragorry. 1949. Breve

nota sobre Brucella suis. • De Lima, Santader,Pons y col.

1956. Consideraciones sobre Brucelosis Bovina y Humana

en el estado Zulia.

M.V.MSc.Datty Rosales-

Zambrano. Vet.Adv.Technologies

C.A.

Brucelosis en Venezuela

• B. abortus es la especie mas importante (Vargas, 2002).

• B. suis bv.1 ha sido descrita en capibara (Hidrochaeris hidorchaeris ) y pecari (Tayassus tajacu).(Lord et

al.,1983 and 1991).

• Recientemente B. suis en vacuno B.taurus x B. indicus (Rosales-Zambrano et al., 2014)

• B. melitensis, no aislada en el país.

Taxonomía y relaciones filogenéticas de

Brucella sp.

• Phylum: Proteobacteria (16S r)

–Clase: Alphaproteobacteria*

• Orden: Rhizobiales

– Familia: Brucellaceae

» Género: Brucella

Ochrobactrum sp

» * Rickettsias, Bartonella (Parásitos IC)

» *Agrobacterium,Rhizobium (Fitopatógenos)

DATTY R-Z.

DATTY R-Z.

DATTY R-Z.

B. papionis nov. sp 2014

B. inopinata nov. sp 2010

Brucelas atípicas

DRZ

DATTY R-Z. Guzman-Berri at al., 2012

Filogenia del Genero Brucella

Corbel,2006

Especies Zoonóticas

• Especies terrestres:

• B. melitensis

• B. abortus

• B. suis

• B. canis

• Especies marinas:

• B. delphini

• B. pinnipedialis

• B. ceti

DATTY R-Z.

Características Microbiológicas del

Genero Brucella

• Cocobacilos, GRAM negativas, inmóviles, no esporulados, aeróbicos y carboxifílicos, en cadenas o pares (Contreras,1992; López y col,1991 y García,1999).

• Intracelular facultativa (Schuring,1999).

• Colonias pequeñas, húmedas y brillantes, pueden se L,R ,o M.

• Requerimientos complejos: CO2, medios ricos, temp. 37 C°, mínimo 5 días incubación.

• Afecta animales y hombre (López y col,1991).

DATTY R-Z.

DATTY R-Z.

Características estructurales y antigénicas de B. abortus.

• Membrana externa rica en: FL, LPS,y proteínas, FDC y

lípidos de ornitina con AG largos (Joklik y col,1994).

• Algo permeable a agentes hidrófobos.

• Similar a las enterobacterias (López y col,1991).

DATTY R-Z.

Tomado de Castro.2005.

Tomado de Castro.2005.

Estructura de la envoltura celular celular de Brucella

DATTY R-Z.

Factores de Virulencia

• Una vez ingerida, o internalizada las bacterias, el sistema de defensa

• insta la fusión del fagosoma con los lisosomas para formar

fagolisosomas, los orgánulos donde se localizan la mayoría de los

agentes tóxicos bactericidas.

• Las Brucellas pueden permanecer en el fagosoma intacto y bloquear

la fusión posterior con el lisosoma. Ello le protege de la acción de los

péptidos catiónicos y enzimas líticas presentes en los gránulos

lisosómicos.

DATTY R-Z.

DATTY R-Z

Factores de Virulencia

• Se cree que la cadena O (un polisacárido) y quizá lípidos de ornitina

interactuarían directamente con la membrana del fagosoma

impidiendo la fusión.

• Se sabe que la superóxido dismutasa y la catalasa, enzimas presentes

en Brucella, se integran en el mecanismo de defensa frente a la

toxicidad oxidativa.

DATTY R-Z.

Ingreso de Brucella al macrófago.

DATTY R-Z

• Las Brucellas no poseen los siguientes factores de virulencia clásicos:

o EXOTOXINAS

o VARIACION ANTIGENICA

o ACTIVIDAD ENDOTOXICA DE LA LPS ES DE MENOR ACTIVIDAD QUE LA DE ENTEROBACTERIAS

o PLASMIDOS O FAGOS QUE PUEDAN TRANSFERIR GENES DE VIRULENCIA

o PILIS O FIMBRIAS PARA ADHERIR SUSTRATOS

DATTY R-Z.

DATTY R-Z.

TECNICAS DIAGNOSTICAS APLICADAS

A BRUCELOSIS ANIMAL.

DATTY R-Z.

TECNICAS DIAGNOSTICAS APLICADAS

A BRUCELOSIS ANIMAL.

• DIAGNOSTICO DIRECTO:

–Aislamiento y cultivo

–Diagnóstico molecular

DATTY R-Z.

Aislamiento en TSA (colonias pequeñas y translúcidas)

Urea: producción de ureasa

TSI: triple azúcar hierro, Neg.

CIT:citrato de Simmons, Neg.

SIM: medio de SIM ( indol y movilidad), Neg. todas

H2S: producción de H2S en tiras de papel filtro con acetato de plomo, Variable

DATTY R-Z.

FASE DE LA CEPA

La fase en la que se encuentran las Colonias se determina por: •Aglutinacion con suero anti-brucela y acriflavina antes de proceder a identificarla

DATTY R-Z.

Pruebas bioquímicas de Brucella

UREA

TSI CIT SIM

H2S

DATTY R-Z.

Producción de H2S

DATTY R-Z.

Prueba de la ureasa

DATTY R-Z.

Tabla diferenciación Brucella (López, 1989)

DATTY R-Z.

Especies

Uso CO2 Prod H2S Catalasa Oxidasa Tionina Fucsina Aglutinación

A M R Ac

B. abortus 1 2 3 4 5 6 7 8 9

+/- +

+/- +/-

- - - +

+/-

+ + + + -

+/- +/-

- +

+ + + + + + + + +

+ + + + + + + + +

- - + - + + + + +

+ - + + + + + + +

+ + + - - + + - -

- - - + + - + + +

- - - - - - - - -

- - - - - - - - -

B. suis 1 2 3 4

- - - -

+

+/- - -

+ + + +

+ + + +

+ + + +

- - - -

+ + + +

- - - +

- - - -

- - - -

B. melitensis

1 2 3

- - -

- - -

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

- + +

+ - +

- - -

- - -

B. ovis + + + + + + - - + +

B.canis - - + + + - - - + +

B. neotomae

- - + + - - - - - -

DATTY R-Z. Audic et al.,2011

TABLA DE FAGOTIPIFICACION EN Brucella

DATTY R-Z. Corbel, 1989

Bacteriofagos de Brucella

Placas líticas

Cultivo de Brucella sembrada con hisopo

DATTY R-Z.

Crecimiento en tionina 1:50,000

DATTY R-Z.

Crecimiento en fucsina 1:50,000

DATTY R-Z.

• http://www.dnalc.org/view/15924-Making-

many-copies-of-DNA.html

TECNICAS MOLECULARES EN DX.BRUCELOSIS

Kary Mullis. Cetus Co. Calfornia. USA.1986.

USOS

• Taxonomía

– Aislados presuntivos

– Variabilidad fisiológica (Cambios)

– Hospederos

• Identificación y Diagnostico

Confirmatorio

– Alimentos

– Muestras clínicas

– Confirmación definitiva

DATTY R-Z.

OMIC`S

DATTY R-Z.

Genómica Transcriptómica Proteómica

Hospedador

Especifico

Filogenia

y

Evolución

Virulencia y

Patogenicidad

• Octubre 2011: 39 genomas de Brucella

• Mayo 2014: 431 genomas de Brucella (Completos o en emsamblaje)

• B. melitensis 16M (2002)

• B.suis 1330 (2002)

• B. abortus (2005)

• B. ovis y microti (2009)

• B. pinnepedialis (2011)

DATTY R-Z.

DATTY R-Z. Audic et al.,2011

TECNICAS MOLECULARES EN DX.BRUCELOSIS

DATTY R-Z.

• Alta sensibilidad, especificidad, rápido y económico.

• Secuencias usadas:

– IS711 (Bricker y Halling,1994)

– 16sRNA (Romero y col,1995)

– OMP31(Baily y col,1992; Streevatsan y col,2000).

– BCSP-31 (Guarino y col,2000)

• Se pueden usar muestras clínicas: sangre completa,suero, leche, semen, tejidos.

Electroforesis en agarosa al 15.% de amplificados para BCSP-31 obtenidos a partir de sangre completa de búfalos

seropositivos a Brucella sp.

PM C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9

TECNICAS MOLECULARES EN DX.BRUCELOSIS

DATTY R-Z.

• Técnicas para caracterización de cepas y biovares:

– AMOS-PCR (Bricker y Halling,1994).

– Multiplex (García-Yoldi y col,2006)

– RFLP-PCR con IS711 (Halling y col,1993)

– Genotipificación: SNP’s (Scott y col,2008), MLVA, MLST.

Ancora et al.,2005

PCR-Multiplex o Brucella ladder.

DATTY R-Z.

1. Brucelas marinas 2. B. melitensis 3. B. melitensis Rev1 4. B. ovis 5. B. abortus

6. B. abortus RB51 7. B. abortus S19 8. B. suis 9. B. canis 10. B. neotomae Garcia-Yoldi et al, 2006

272bp

→

587bp→

1682bp→

1071bp

→ 794bp→

152bp→

1. Marcador de talla

molecula 1 kb plus de

invitrogen

2. Cepa Venezuela

3. B. suis 1330

4. B. abortus 2308 450bp→

1 2 3 4