Report chair

Изучение функциональной роли модификаций РНК с применением

методов системной биологии

Евфратов С. А.

Руководитель: проф., д.х.н. Сергиев П. В.

30S

50S

Декодирующий центр

Пептидил-трансферазныйцентр

Метилирование

Псевдоуридинилирование

Другие модификации

Нуклеотид Фермент

16S

Ψ516 RsuA

m7G527 RsmG

m2G966 RsmD

m5C967 RsmB

m2G1207 RsmC

m4Cm1402 RsmI

m4Cm1402 RsmH

m5C1407 RsmF

m3U1498 RsmE

m2G1516 RsmJ

m6

2A1518 RsmA

m6

2A1519 RsmA


23S

m1G745 RlmAI

Ψ746 RluA

m5U747 RlmC

Ψ955 RluC

m6A1618 RlmF

m2G1835 RlmG

Ψ1911 RluD

m3 Ψ1915 RluD

m3 Ψ1915 RlmH

Ψ1917 RluD

m5U1939 RlmD

m5C1962 RlmI


23S

m6A2030 RlmJ

m7G2069 RlmL

Gm2251 RlmB

m2G2445 RlmL

D2449 RldA

Ψ2457 RluE

Cm2498 RlmM

*C2501 RltA

m2A2503 RlmN

Ψ2504 RluC

Um2552 RlmE

Ψ2580 RluC

Ψ2604 RluF

Ψ2605 RluB

как модификации рибосомной РНК влияют на способность к трансляции?

как последовательность мРНК определяет

способность к трансляции?

Используемые методы

● Протеомика– 2D-DIGE

● Другие методы– Кривые роста

– RT RT-PCR

● Флуоресцентные репортёрныe конструкции– Инженерные 5'-UTR

– Природные 5'-UTR

– Природные промотеры

2D-DIGE

Опыт

Контроль

Cy3

Cy5

Суммарный белок

pH

+

-

ИЭФ

+-

SDS-ПААГЭ

Сканированиефлуоресценции

Реализация:Опыт — нокаут, контроль - WT3 реплики1 кросс-мечение

ΔrlmEΔrlmJ

ΔrsmHΔrsmA

sdhA

sdhA

sdhA

sdhA

pepDglpK

pepD glpKpepD glpK

pepD glpK

sucC

sucC sucC

sucC

sucB

sucB sucB

sucCaldA

aldA aldA

aldA

Флуоресцентные двухрепортёрные конструкции

RFP CER

T5 T5

5'-UTR 5'-UTR

Внутренний контроль

Ter

Варьируемая часть

(CER /RFP X

CER /RFPK

)KO

(CER /RFP X

CER /RFPK

)WT =

InAbXKO

InAbXWT =1

> 1 — инициация трансляции в нокаутном штамме идёт активнее, чем в диком типе

< 1 — инициация трансляции в нокаутном штамме идёт хуже, чем в диком типе

Флуоресцентные двухрепортёрные конструкции

● Инженерные– Различные

ШД/спейсеры

– Реинициация

– Вторичная структура 5'-UTR

● Природные– 5'-UTR (спец. регуляция

трансляции)

– Промотеры (спец. транскрипционные сигналы)

– Начало кодирующей области (эффекты элонгации)

Полуавтоматизированная трансформация с высеванием и

измерением флуоресценции

Компетентные клетки

Тестовые конструкции

Тепловой шокФенотипическая

экспрессия

Перенос на агар

РостколонийИнокуляцияИкубация

Считывание флуоресценции

Рандомизированные и мутационные библиотеки

GGCACACACCGGAGCNNNNCATATGAAAGAGACGGACGAGAG

GGCACCCGGAGCNNNNNNNCATATGAAAGAGACGGACGAGAG

GGCACACACCGGAGCNNNNNNNATGAAAGAGACGGACGAGAG

GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGGAGCAACTATGAAAGAGACGGACGAGAG

GGNNNNNNNNNNATGAAAGAGACGGACGAGAG

GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATGAAAGAGACGGACGAGAG

GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATGAAAGAGACGGACGAGAG

CACACAACACCGGAGCAACTATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

AAGCCACAGGAGGAAAACGAATGAAAGAGACGGACGAGAG

TTAACTAGTGACTTGAGGAAAACCTAAATGAAAGAGACGGACGAGAG

4N

7N

7N-New

18N-SD

10N

20N

30N

30N-Down

dsrB (0,01)

eno (~25)

10% вероятность замены

Новые тестовые конструкции и массивы данных транслябельности

Использование рандомизированных библиотек

Электрокомпетентные клетки

Рандомизированная библиотека плазмид

Электропорация Фенотипическая экспрессия

Наращивание культуры

Клеточная сортировка

Выделение плазмид, ПЦР

Полупроводниковое секвенирование

Обработка данных полупроводникового секвенирования

Фильтр подлине

ВыделениеРандомизированного

ФрагментаФильтр по

длине

Фильтр по частоте

Отделение крайних фракций

Самыеслабые

Самыесильные

Фракции в динамическом диапазоне по отношениям

флуоресценции

Фракция - CER/RFP

Вст

реча

емос

ть

CER/RFP для данного варианта

База данных по C/R для всех вариантов

Библиотка Число ридов Варианты Охват, % Сильные Динамич. диапазон

Слабые

4N 114748 254 99,2 13 184 57

7N 107583 2206 13,5 110 1507 589

7N-rep 10578 66 0,40 13 50 3

7N-new 10112 16 9,7·10-2 13 3 0

18N-SD 128234 1985 2,9·10-6 426 1240 319

20N-new 53659 340 3,1·10-8 40 297 3

30N-new 14096 30 2,6·10-15 26 4 0

30N-down 58998 722 6,3·10-14 26 574 122

Обнаруженные статистические корреляции

4N P-value:

Спейсер 7.59e-01

Отжиг aSD 9.21e-02

ΔG фолдинга 1.56e-20

18N P-value:




7NN P-value:




7N P-value:




Очень сильный UTR: GGCATTAGAATATAAAATAGTGATG

мРНК

БелкиФлуориметрия

Гель-электрофорез

Коллекциянокаутов

Коллекциянокаутов

Роль модификацийрибосомной РНК

Предсказательнаямодель инициации

трансляцииИсключения

ПубликацииComparison of mRNA features affecting translation initiation and reinitiation

Ilya A. Osterman, Sergey A. Evfratov, Petr V. Sergiev* and Olga A. Dontsova

474–486 Nucleic Acids Research, 2013, Vol. 41, No. 1doi:10.1093/nar/gks989Published online 23 October 2012

Structural features of telomerase RNA gene in naked mole rat.Acta Naturae. 2014. V. 6. № 2 (21)

Sergey Efratov, Elena Smekalova, Andrey Golovin, Maria Zvereva, Olga Dontsova

НОВАЯ нкРНК: ВЫСОКИЙ УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ И ЯДЕРНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ РНК, ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ С УЧАСТКА ГЕНОМА Danio rerio, СОДЕРЖАЩЕГО ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ЭЛЕМЕНТЫ

О. С. Шубернецкая, О. C. Стрелкова, Д. А. Скворцов*, С. А. Евфратов, В. Д. Черепанинец, Зверева, М. П. Рубцова, О. А. Жиронкина, И. И. Киреев, А. М. Оловников, О. А. Донцова

Тезисы конференций

● «Building a predictive model of translation initiator ability of 5'-UTR prokaryotic mRNA», Sergey Evfratov, Osterman Ilya, FEBS, 2013, СпБ

● «Building a predictive model of translation initiator ability of 5'-UTR prokaryotic mRNA», Sergey Evfratov, Osterman Ilya, Winter FutureBiotech, 2014, Звенигород

Курсовые и дипломные работы

● Курсовая работа «Изучение функциональной роли генов метилтрансфераз рибосомной РНК малой субчастицы RsmA, RsmB и RsmC», Крячков В.А., ХФ, 110гр, 2013.

● Курсовая работа «Изучение зависимости эффективности трансляция E. coli от расстояния между стартовым кодоном и последовательностью Шайна-Дальгарно при помощи двойной репортерной системы RFP-CER», Струнилин И.П., ФББ, 202гр, 2014

● Курсовая работа «Поиск новых элементов, определяющих эффективность трансляции, в 5'нетранслируемой области мРНК E. coli при помощи двойной репортерной системы RFP-CER», Карпова А.Д., ФББ, 201гр, 2014

● Курсовая работа «...», Погорельская А., ФББ, 2015.

● Дипломная работа «...», Савушкин Е., ХФ, 2015.

Чтение ¼ лекции в курсе «молекулярная биология» про повторяющиеся элементы

Career

Report chair