العربية السورية الجمهورية ةـة الذريـالطاق هيئة

206 ت ت إ/ب ج -هـ ط ذ س

2008تموز

تقرير عن تجربة علمية استطالعية

قسم البيولوجيا الجزيئية والتقانة الحيوية

دراسة إمكانية عزل وتوصيف المورثات المسؤولة عن تحمل الملوحة لدى بعض لبطاطا المحدثة بأشعة غاماطفرات ا

الدآتور انطونيوس الداود

الدآتور بسام الصفدي

المهندس عماد نابلسي

الدآتور نزار مير علي

206ت ت إ / ب ج -هـ ط ذ س

:ةساهم في إنجاز هذه الدراس

نشوان شرف الدين . م.إيمان فواز، والسيد م. م.قمر غنيمة و م. م.السيدتان مساهمت

.بالمساعدة في التحاليل الجزيئية

2

جدول المحتويات

رقم الصفحة العنوان

04 المستخلص 05 المقدمة -1

07 المواد والطرائق -2 10 النتائج -3

13 مناقشةال -4

-5 14 االستنتاجات والتوصيات 14 آلمة شكر -6 15 المراجع -7 17 كليزيالنالمستخلص ا -8

3

دراسة إمكانية عزل وتوصيف المورثات المسؤولة عن تحمل الملوحة لدى بعض طفرات .البطاطا المحدثة بأشعة غاما

والمهندس عماد نابلسي والدآتور نزار مير عليبسام الصفدير انطونيوس الداود والدآتور الدآتو

هيئـــــة الطاقـــــــة الذريـــــــةقسم البيولوجيا الجزيئية والتقانة الحيوية،

مستخلصال Random amplified polymorphic DNA الشكل المضخم عشوائيا متعدد لدناا جرى توظيف تقنيتي

(RAPD) البينيبسيط ال التسلسلراتاوتكر Inter Simple Sequece Repeats )ISSR( لدراسة درجة

عشوائية) Primers( مرئسة 27 تم استخد،بداية .بين سالالت بطاطا طافرة ومتحملة للملوحةالقرابة الوراثية

ت البطاطا بين سالالالقرابة وتحديد درجة تمييزل ISSR مرئسة خاصة بتقنية 25و RAPD خاصة بتقنية

المدروسة بالمقارنة مع للسالالت تطابقا ملحوظا في التوصيف الجزيئي ISSRأظهرت نتائج . المذآورة أنفا

خلصت .شابه تبشكل مآلتا التقنيتين حيث تجمعت العزالت المتشابهة والمختلفة وراثيا بإستخدام RAPDنتائج

جة القرابة الوراثية بين سالالت تحديد در في ISSR وRAPDوموثوقية تقنيتي أهمية الدراسة إلى التأآيد على

المتحملة في السالالت الطافرة ISSR و RAPD دنا باستخدام شدفة 20آما جرى تضخيم . البطاطا المدروسة

تضخيمها ومن ثم تنسيلها ضمن نواقل و، الشدف عزل هذه جرى. ولكنها غابت في الشواهد الحساسة للملوحة

تحديد تتابع القواعد األزوتية للشدف المنسلة ولكن لم جرى . QIAGEN من شرآة عتيداتخاصة باستخدام

تظهر المقارنات على شبكة األنترنت أي تشابه معنوي بينها وبين التسلسالت المتاحة مما يدل على عدم قدرة

.الملوحةعلى تحديد مورثات خاصة بصفة أي من التقنيتين المستخدمتين

التوصيف الجزيئي، الملوحة، ، الشعير،ISSRتقنية الـ، RAPDالتضخيم العشوائي للدنا : الكلمات المفتاحية .القرابة الوراثية

4

:مقدمة -1

2003 سنة العالمي اإلنتاج بلغ حيث واحدا من أهم المحاصيل الزراعية في العالم البطاطا محصول يعد

العربي القطر الخضار في محاصيل طليعة في البطاطا تأتيو ).FAO, 2005a (طن مليون 310 حوالي

285 حوالي إنتاجها بلغهكتار ألف 12 حواليإلى 2003 وصلت المساحة المزروعة عام حيث السوري

الوجبات من العديد في تدخل حيث الشعب فئات لكافة أساسيا غذاء البطاطا وتعد). FAO, 2005b(طن ألف

.الغذائية الصناعات من الكثير في هامة ادةم أنها آما

ملوحة التربة دورا آبيرا في الحد من نمو النباتات حيث يؤدي ازدياد آالجفاف و اإلجهادات الحيويةتلعب

. ملوحة التربة إلى خروج مساحات آبيرة من األراضي الزراعية من إمكانية استعمالها في اإلنتاج الزراعي

) اسموزي( الحصول على الماء من تربة ذات جهد حلولي الك األراضي مشكلتين أولهموتواجه النباتات في ت

Mills( الكلور وآربونات الصوديوم ذات السمية العالية دسالب وثانيهما التعامل مع تراآيز عالية من شوار

et al., 2001.(في العالم تقريبا من األراضي المزروعة 20% تبلغ مساحة األراضي المهددة بالملوحة

. من هذه المساحة50% وتشكل األراضي المروية حوالي

في الوسط الغذائي للنبات في التوازن األيوني والمائي لهذه النباتات األمالحيخل ارتفاع نسبة

UNEP,1992; Glenn et al.,1999; yeo, 1998)(، غالبا اإلجهادات الملحية التي تؤثر على تنتج حيث

يؤثر عنصر ). Hasegawa et al ., 2000( في التربة -ClوNa + نسبة عنصري عارتفاالنبات عن

الخلوي وعلى عملية االنقساممتصاص عنصر البوتاسيوم بالتالي على عملية االصوديوم بشكل مباشر على

ساماعنصر الصوديوميعتبر تواجد . )Charbaji et al., 2001; Charbaji, 1988( الضوئي االصطناع

تراآمية في النباتات نتيجة لحجم الماء المفقود من قبل النبات خواص من لهلمابة ضئيلة في التربة بنسولو

,Zid and Grignon) غالبا في األوراق أما الكلور فهو عنصر يتراآم ) 0Zhu, 200(أثناء عملية التنفس

1985).

ولكن هذا المقياس يصلح فقط ، ملحية النباتات على تعرض هذا النبات لإلجهادات الأوراق ويدل احتراق

فهو مؤشر اإلنتاج النخفاضنسبة ال آذلك األمر ب)Sergey et al., 1998(للنباتات العالية الحساسية للملوحة

العمليات من الباحثين إلى دراسة العديد لجأ لكلذ، ) Belkhodja et al., 1994( وعالي التكلفة بطيء

للنبات تحت الظروف الملحية آمؤشر )الخ .....ألسموزي والمقاومة المسامية الجهد المائي وا(الفيزيولوجية

(Bethke and Drew,1992; Perera et al., 1994) دم تحمله لها ع على تحمل النبات للملوحة أو

تعتبر ملوحة التربة في آثير من المناطق العامل و بشكل مطرد ة تزداد مساحة األراضي المالحة في سوري

هدد مناطق تيشكل اإلجهاد الملحي مشكلة هامة جدا بالنسبة لإلنتاج الزراعي حيث و د لنمو النباتاتالمحد

آما تعتبر المناطق الجافة و نصف الجافة . آثيرة في العالم وخاصة منطقة حوض البحر األبيض المتوسط

البطاطا وضرورة االستفادة ونظرا ألهمية محصول.آالمناطق االستوائية من أآثر المناطق تأثرا بالملوحة

.أصناف بطاطا متحملة للملوحةمن المناطق المتأثرة بالملوحة فقد برزت الحاجة لتطوير

Spuntaسبونتا ، Draga دراجا ،صناف البطاطاأل السويقات الناميةتشعيع بدراسة سابقة،جرى

الجيل والتجديد حتى الزجاج الزراعة في استمرتو غري 35، و 30، 25 بجرعات Diamantوديامونت

جرى إآثار .نتخابلال وصالحةعزل طفرات ثابتة خالية من الكايميرا بغية وذلك MV4 الطافر الرابع

5

أخضع أآثر من .للحصول على عدد آاف من أجل تطبيق ضغط االنتخاب ضد الملوحةالطافرة النباتات

.ت محتوية على تراآيز ملحية مختلفة نبات من األصناف الثالثة لضغط االنتخاب باستخدام بيئا1300

، 200، 100، 0: المرحلة األولى تراآيز ملحيةحيث استخدمت في :أجري ضغط االنتخاب على مرحلتين

، 100، 50، 0 : التراآيز الملحية إلى لمرحلة الثانية في ا النباتاتخضعت . ميلي مول500، و 400، 300

ميلي 200باتات البطاطا حساسة لتراآيز ملحية أعلى من ميلي مول وذلك بعد أن تبين أن ن200، و150

تحصل عليها عن طريق س والم، ميلي مول150 و 100 تباين عدد النباتات المتحملة لترآيزي ومول

.)Al-Safadi and Arabi, 2003 and 2005( االنتخاب في الزجاج من صنف إلى آخر

وآان مجموع النباتات المتحملة ) طفرة19( غري 35رعة التشعيع بجعندنتج أآبر عدد من النباتات الطافرة

وقد ظهر أآبر عدد من النباتات المتحملة للملوحة في . نباتا51في األصناف الثالثة وجرعات التشعيع الثالث

من مجموع % 2.33وذلك من جرعات التشعيع الثالث والتي شكلت نسبة ) نباتا21(الصنف سبونتا

الحصول أمكنآما . المشععة والتي خضعت لعملية عزل الطفرات وضغط االنتخاب explantsاالزدراعات

، على التوالي، من % 1.78و% 1.56 نبات ديامونت متحملة للملوحة وبنسبة16 نبات دراجا و 14على

.)Al-Safadi and Arabi, 2003 and 2005 (مجموع االزدراعات المشععة

:هدف البحث

: هذا البحث إلىيهدف

دراسة إمكانية عزل وتوصيف المورثات المسؤولة عن تحمل الملوحة لدى بعض طفرات البطاطا

تكرارات التسلسل البسيط و)RAPD( الدنا المضخم عشوائيا نيتيستخدام تقابالمحدثة بأشعة غاما

.)ISSR(البيني

:المواد والطرائق -2

1-2 :استخالص الدنا

واتبعت Easy-DNA Kit (Invitrogen ) مت محاليل استخالص جاهزة من شرآةداستخ

:الخطوات التالية

رج تبعها A ميكرو محلول350 واضيف لها السائل باألزوت ملغ مادة نباتية150 حواليطحن

µl 150اضيف و . دقائق 10لمدة مئوية درجة 65بفاصل ثانية للمجانسة ثم حضنت على حرارة

آلوروفورم ورج 500l µثم اضيف ) حتى التجانس (ة عشر ثواني لدقيق رج لمدةتالها B محلول

دقيقة وحرارة 10-20لمدة )د/ د12000 (على السرعة القصوىواحدة ثم ثفل دقيقة المزيج لمدة

.ونقل الطور األعلى ألنبوب جديد درجة مئوية 4

يل على تثف دقيقة ثم 30مل آحول مطلق ،تحضين بالثلج لمدة 1بإضافة DNA ب الـسأخيرا ر

الدنا بالكحول الممدد جرى بعدها غسل . درجة مئوية 4دقيقة وحرارة 10-15 السرعة القصوى

).dd H2O ( والمعقم من الماء المقطرµl100 ـوإذابته ب % )70(

على حرارة والتحضين RNase زيم أن 2µl إضافةفي العينة ب) RNA(تم التخلص من الرنا

بواسطة جهاز قياس الطيف المخصص DNAقيست آمية الـ . ساعةمدة نصف درجة مئوية37

تم التمديد بالماء و Amersham Biociences من شرآة (GeneQuant Spectrometer)لـ

6

PCR ـه في تفاعالت الوذلك الستخدام )ميكرو ليتر/نانوغرام (10المقطر للوصول لترآيز

.الالحقة

PCR Polymerase chain، لي للبوليميرازالتفاعل السلس( تضخيم الدنا 2-2

reaction(:

: Random amplified polymorphic DNA (RAPD)الدنا متعدد الشكل المضخم عشوائيا 2-2-1

.Operon Technologies Inc ( أوبرون في الدراسة مرئسات تم الحصول عليها من شرآتيتاستخدم

USA (شام رأميوAmersham Biosciences, USA)(20أذيبت في الماء المقطر للحصول على ترآيز و

Taqو MgCl22:وعى آل من Rocheمن إنتاج شرآة ) (dNTPsم الحصول على تمايكروليتر و/ نانوغرام

DNA Polmyerase 10المحلول الموقي وXPCRشرآة من )eurobio(. شروط تفاعل التضخيمنفذت

مع بعض التعديالت وآان حجم التفاعل النهائي Williams et al )(1990 وصف من قبلهو مآما الخاص

Tris-HCl 67mM) (PH 8.8 ، 16mM 2SO4 )NH4( ،0.01% : متضمناا ميكروليتر25

Tween20و MgCl21.4mM ،0.1mM لكل واحد من األسس)dATP,dTTP,dGTP,dCTP(، 80ng

. DNA من الـTaq DNA Polmyerase ،20ng وحدة من 1، مرئسة

94 وذلك في درجة حرارة DNAأولي لفصل جديلتي الـ ) Denaturation(تمسخ :وف التضخيمتضمنت ظر

: آل دورة وتضمنت دورة45مدة دقيقة واحدة تبعت بـلدرجة مئوية و

. درجة مئوية ولمدة عشر ثواني94 حرارة على درجة) Denaturation(تمسخ

. عشر ثواني درجة مئوية ولمدة35 درجة حرارة على)Annealing(إسقاء

. ثانية70 درجة مئوية ولمدة 72حرارة درجةعلى ) Extension(استطالة

. درجة مئوية ولمدة دقيقتين72 حرارة درجةنهائية على) Extension(استطالة

من شرآة ( % 1.2 أغاروزعلى هالمة ثم فصلت، درجة مئوية4أبقيت نواتج التفاعل في حرارة

MERCK(. ثيديوم بروميدهالمة إيلل أضيف) EB(لكشف حزم الـ DNA من خالل ضوء الـ UV

.)Fermentas( من شرآة Kb1 )معلم جزيئي ( واستعمل سلم دنا 0.5X TBE محلول موقي واستخدم

: )Inter Simple Sequece Repeats )ISSR البينيرات التسلسل البسيطاتكر 2-2-2

أذيبت في و(Alpha DNA)و ( Invitrogen) من شرآة ها في الدراسة مرئسات تم الحصول عليتاستخدم

ى ل وع(Roche)من إنتاج شرآة ) (dNTPsم الحصول على وتPmol 50الماء المقطر للحصول على ترآيز

من شرآة 10XPCRوالمحلول الموقي ،MgCl22 (eurobio) Taq DNA Polmyerase:آل من

)(eppendorf .2001 موصف من قبل شروط تفاعل التضخيم آما هو نفذت Bornet. and Branchard,

على Tris-HCl 10mM ) (PH 8.3: متضمناا ميكروليتر25مع بعض التعديالت وآان حجم التفاعل النهائي

لكل MgCl21mM ،0.15mMو 50mM KCL ،Mg(OAc)2 1.5mM درجة مئوية،25حرارة

7

Taq DNA وحدة من 0.5 ، مرئسةdATP,dTTP,dGTP,dCTP( ،75 Pmol(واحد من األسس

Polmyerase ،10ngمن الـ DNA .

وذلك في درجة حرارة DNAأولي لفصل جديلتي الـ ) Denaturation(تمسخ : تضمنت ظروف التضخيم

: دورة وتضمنت آل دورة40 تبعت بـدقائق خمس درجة مئوية ولمدة 94

.ثانية 30 درجة مئوية ولمدة 94على درجة حرارة ) Denaturation(تمسخ

. ثانية30ولمدة درجة مئوية 50على درجة حرارة )Annealing(إسقاء

. ثانية30ولمدة درجة مئوية 72حرارة على درجة) Extension(استطالة

.سبع دقائق درجة مئوية ولمدة 72نهائية على درجة حرارة ) Extension(استطالة

.)MERCKمن شرآة % (2 أغاروزلت على هالمةثم فص، درجة مئوية4أبقيت نواتج التفاعل في حرارة

محلول موقي استخدم ،UV من خالل ضوء الـ DNAلكشف حزم الـ) EB(هالمة إيثيديوم بروميد لل أضيف

0.5XTBE معلم جزيئي( واستعمل سلم دنا ( bp100 من شرآة )Roche.(

: تحليل البيانات2-3

ة المسارات الناتجة فيما بينها و أحصيت الحزم على أساسدرست نواتج التضخيم للمرئسات المستخدمة بمقارن

. المكررة في تفاعلين مستقلين و أخذت باإلعتبار الحزم الواضحة فقط و) 0(أو غيابها ) 1(وجود الحزمة

، أنشئت على عدد نواتج التضاعف المشترآةا المستخدمة اعتمادالسالالتلمعرفة درجة القرابة الوراثية بين و

بتطبيق متوسطات ) (Percent Disagreement Values PDVة النسب المئوية لعدم التوافق مصفوف

باستخدام ) Unweighted Pair Group Mean Average) UPGMA المجموعات الزوجية غير المزانة

). Dendrogram( ، ثم وضعت النتائج على شكل شجرة قرابة STATISTICAبرنامج

:النتائج -3

دراجا من األصناف، ميلي مول في الزجاج 150 و 100 إآثار النباتات المتحملة لترآيزي جرىبداية،

Draga، سبونتا Spunta وديامونت Diamant اختيرت الطفرات ). الملوحة( وطبق عليها الضغط اإلنتخابي

شواهد غير طفرات دراجا إضافة الى ال8 طفرات ديامونت و4 طفرات سبونتا، 6األآثر تحمال للملوحة وهي

.)1جدول (المطفرة

RAPD ساللة بطاطا مطفرة وثالثة شواهد بغية دراسته وتحليله باستخدام تقنيتي 18 من DNAجرى عزل الـ

. الجزيئيتينISSRو

:RAPDتحاليل 3-2

فاتاالختال في إظهار فعاليتهاتقييم بغية سالالت البطاطا الطافرةدنا مرئسة عشوائية مختلفة على 45 اختبرت

) 2جدول ( مرئسة عشوائية27 إنتقاء جرى ، إعتمادا على نتائج هذا اإلختبار. المدروسةالسالالت بين الوراثية

,.Williams et al (درجة القرابة الوراثية فيما بينهاتحديد وذلك من أجل الجزيئية RAPD إلجراء تحاليل

1990(.

المدروسة على السالالت OP-A10عليه بإستخدام المرئسة تم الحصول التعددية الشكلية التي 1 الشكلبين ي

.والمتحملة للملوحة

8

عتمادا على عدد نواتج التضاعف االمستخدمة سالالت البطاطا الطافرة بة الوراثية بين المعرفة درجة القر

عات الناجمة من تطبيق متوسطات المجموPDVالتوافق لعدم النسب المئوية تم إنشاء مصفوفات، المشترآة

الـقيم 3 ويظهر الجدول. اإلحصائيSTATISTICAبإستخدام برنامج ) UPGMA(الزوجية غير المزانة

PDV السالالت المدروسةبين.

على شكل شجرة قرابة السالالت المدروسةوضعت بيانات مصفوفة نسب عدم التوافق لكل من

)Dendrogram (2 الشكلوضحها ي.

على عناقيد حسب االصنف الذي تتبع له مع يعض الطافرة المدروسة الت توزع السال2يتبين من الشكل

مما يشير إلى احتمال ذاته االستثناءات حيث تواجدت سالالت تابعة للصنف سبونتا وديامونت في تحت العنقود

. أثناء إآثارها في الزجاجتالسالال هذه في تصنيف أو خلطوجود خطأ

، Di2 التي تتبع الصنف سبونتا والسالالت S5 وS1 ، S2 ، S3 ، S4 تالال العنقود األول على الساحتوى

Di3 ، Di4 و Di5السالالت بينما تضمن العنقود الثاني التابعة للصنف ديامونت S6 ، S7 من الصنف سبونتا

التابعة للصنف Dr9 و Dr2 ، Dr3 ، Dr4 ، Dr5 ، Dr6 ، Dr7 ، Dr8 من الصنف دبامونت و Di1و

ر من عزالت ث من بعضها البعض أآأقرب وراثيا األولالعنقود ب السالالت المتواجدة أن يشيرمما . دراجا

)S6 و S1 ( بين الساللتين0.27 و) S3وS2 ( الساللتين 0.01 بين PDVحيث تراوحت قيم .الثانيالعنقود

. ذاتهمن الصنف

:ISSRتحاليل -3-3

سالالت طافرة من الصنقين سبونتا ودراجا عشرة ى إختيار جر مصداقيتها،وتقدير RAPDبغية توثيق نتائج

لدراستها بتقنية استبعدت السالالت التابعة للصنف ديامونت لعدم القدرة على التأآد من تبعيتها لهذا الصنفو

ISSR) Bornet and Branchard, 2001(.

المختارة السالالت بين التوافق قيم عدميبين و آما ISSR الـ المدروسة بطريقةالسالالت 4ول دجالبين ي

وتسلسالتها ISSR بتقنية المرئسات المستخدمة 5ويظهر الجدول . RAPD والمشتقة من نتائج تحاليل للدراسة

.ورموزها

المختارةالسالالت على B1 وB4 عن إستخدام المرئستينة الناجمالتعددية الشكلية 3 االشكل يوضحآما

.RAPDة توثيق نتائج بغي)األآثر واألقل تماثال(

وبعد قراءة الهالمات )5جدول ( مرئسة مختلفة25 المختارة مستخدمين السالالت على ISSRجرى تطبيق الـ

Percent التوافق لعدم، تم إنشاء مصفوفة النسب المئوية )0(والغائبة ) 1(وتسجيل الحزم الموجودة

Disagreement Values الناجمة من تطبيق متوسطات ISSR المجموعات الزوجية غير المزانة

)UPGMA ( بإستخدام برنامجSTATISTICAوضعت بيانات مصفوفة نسب عدم التوافق . اإلحصائي

)PDV( على شكل شجرة قرابة)Dendrogram (خاصة بنتائج ISSR وذالك بغية مقارنتها بتلك الناجمة عن

. RAPDتحاليل

في هذه الطريقة السالالتبين توزع التطابق الكبير )4الشكل ( ISSRتقنية عن الناجمة شجرة قرابةتوضح

مع إختالف بقيم التباينات الوراثية بين السالالت ) تبعا للصنف(على عنقودين رئيسين RAPDوطريقة

.المدروسة

9

:ؤولة عن تحمل الملوحةتحديد التسلسالت المس 3-4

تم الشواهد الحساسةملة للملوحة والغائبة فيسالالت المتحلل الدنا المضخمة شدفجرى عزل العديد من

فصلت نواتج تفاعل في الحصول عليها ثم التي استعملت المرئسات باستخدام PCRـتضخيمها بواسطة ال

أضيف إليها إثيديوم 0.5X TBE، ضمن محلول موقي )(Merckصنع شرآة % 2 بهالمة أغاروز PCRالـ

، UV المضخمة، من خالل ضوء األشعة فوق البنفسجيةDNA لكشـف حزم الـ، Flukaبرومايد صنع شرآة

الشدف المميزة للسالالتعت اقتطثم . Roche صنع شرآة bp100واستعمل معلم يشير لمواقع وحجم الحزم

DNA gel (طاقم استخالص الدنا تنقيتها بواسطة هالمات االغاروز ومن ثمالمتحملة للملوحة من

extraction kit, QIAGEN, Germany .(رسلت إلى جهاز تحديد تتابع القواعد ا إعداد هذه العينات وجرى

تحديد تتابع القواعد األزوتية لشدف وجرى. لتحديد التتابع النيوآليتيدي لها) DNA sequencer(زوتية للدنا ألا

د يلم نتمكن من تحد ). DNA sequencer( بواسطة جهاز سلسلة الدنا ISSRالدنا الناجمة عن تطبيق تقنية الـ

وذلك لعدم مالئمة مرئسات هذه التقنية لجهاز سلسلة الحمض RAPDتتابع شدف الدنا الناجمة عن تقنية

+pBluescript SKIIبالزمبد الضمن RAPDالناجمة عن بتنسيل الشدف وعليه قمنا . DNAالنووي

المتحملة تزة للسالال مميDNAشدفة لكل 3' إلى النهايةAلك بعد إضافة القاعدة وذ pEQ30أوالبالزميد

الشدف تنسيل ،لكبعد ذجرى .) QIAGEN A-addition kit, 231994 ( ة خاصعتيدةللملوحة باستخدام

(QIAGEN PCR cloning kit, 231222 ) ى أخرعتيدة بواسطة 3' بنهايتها A القاعدة لهاتالتي أضيف

بواسطة الصعق الكهربائي DH5α الساللة E. coli الى بكتريا ين البالزميدجرى أيضا نقل هذينآما .

)Electroporation ( بعد تحضير خاليا منها قابلة للتحوير بهذه الطريقة)cells Electrocompetent .(

إلى جهاز تحديد تتابع القواعد تنقيتها ومن ثم إرسالهاتمت وRAPD شدف المتضمنة البالزميدات تأخيرا عزل

تحديد جرى .لتحديد التتابع النيوآليتيدي لها مستخدمبن مرئسة خاصة) DNA sequencer(تية للدنا زواأل

لم يظهر البحث . ISSR و RAPD شدفة مختلفة من الدناالناجمة عن تطبيق تقنيتي 20زوتية لـتتابع القواعد األ

ورثات محددة أو معروفة أي تشابه معنوي بين الشدف المسلسلة وم) NCBI-Blast(على شبكة االنترنت

.الوظيفة

: المناقشة-4

نظرا بكثرة ولكنها ما تزال مستخدمة والبسيطة نسبيا من الطرائق الجزيئية القديمةRAPDتعتبر تقنية

لسهولة تطبيقها ورخص تكاليفها بالمقارنة مع المعلمات الجزيئية األخرى ذات الدقة والموثوقية العالية

)(MirAli and Nabulsi, 2003; 2004. و تراآيزها جرى تحديد سالالت البطاطا المتحملة للملوحة

ISSR و RAPD تقنية في هذه الدراسةاستخدمت آما.الحرجة الممكن استخدامها على هذه الطفرات

.بين هذه الطفرات القرابة الوراثية درجةلتحديد

أآبرمنPDV( عن بعضهما البعض ياب نس على عنقودين رئيسين بعيدين وراثياالسالالت المدروسةتجمعت

.ISSRالـ بيانات إلى حد آبير مع RAPDتوافقت بيانات آما ).2 الشكل، 0.2

الطفرات المدروسة نحت فقد RAPD وISSR تقنيتي بينالتوافق في قيم عدم إختالفاتعلى الرغم من وجود

. المذآورتين أعالهتينالتقنيستخدام ا عند من حيث التشابه واالختالف ذاتهالمنحى

10

قنيتي ت بين العزالت األآثر قرابة واألآثر بعدا بداللة PDVجرى تحليل قيم وتم التأآد من ذلك إحصائيا حيث

RAPDو ISSRللكشف عن وجودعالقة ارتباط Correlation Value تحصل عليها باستخدام سبين القيم الم

. ISSR وRAPDبين قيم )p <0.01 (قويتباط معنوي وجود ار ليالتحلأظهر . التقنيتين المختلفتين

في ماتزال مستخدمة RAPDونة األخيرة إال أن تقنية على الرغم من ظهور معلمات جزيئية جديدة في اآل

متقاربتين من حيث ISSR و RAPDتعتبر تقنيتي آما .دراسة التنوع الوراثي في العديد من األنواع الحية

من تقنية أنها ذات مصداقية وتكرارية أعلى ISSRأهم ما يميز تقنية إلستخدام ولكن التكلفة والسهولة في ا

RAPD آما جرى تنسيل أآثر . ئسات المستخدمة فيها وإرتفاع درجة حرارة اإلسقاءريعزى ذلك إلى طول المو

سة بغية في الطفرات المتحملة للملوحة وغائبة بالحساISSR أو RAPDمن عشرين شدفة دنا مضخمة بتقنية

بإيجاد ) NCBI-Blast( البحث على شبكة االنترنت فشل .المسؤولة عن تحمل الملوحةتحديد بعض التسلسالت

RAPD مما يشير إلى عدم فعالية طريقتي الـ تشابه معنوي بين الشدف المسلسلة ومورثات معروفة الوظيفةأي

.ت البطاطا الطافرة موضع الدراسةخاصة بتحمل الملوحة في سالال في الكشف عن مورثات ISSRأو الـ

:ستنتاجات والتوصيات اال-5

القرابة درجة التنوع الوراثي وعالقاتأنها ال تزال مجدية في الكشف عن RAPD أظهرت تقنية – 1

.ISSR شبه متطابقة مع التقنية األحدث لنتائجلها وصتمن خالل سالالت طافرة من البطاطاالوراثية بين

األنواع النباتيةتقنية جزيئية واحدة لدراسة درجة القرابة الوراثية بين عدم الإلعتماد على ينصح بإال أنه

.المختلفة

في سالالت عن تحمل الملوحةعلى تضخيم شدف مسؤولة ISSR و RAPD آل من تقنيتي عدم قدرة-2

تخصصية في تحديد استخدام تقنبات أخرى أآثر مما يؤآد الحاجة إلى ،البطاطا الطافرة موضع الدراسة

.المناطق المستهدفة والمسؤولة عن صفة محددة آتحمل النباتات للملوحة

: آلمة شكر-6

إلنجاز المتواصل على دعمه يتقدم المؤلفون بالشكر الجزيل لألستاذ الدآتور المدير العام لهيئة الطاقة الذرية

.العملهذا

):References(المراجع -7

Al-Safadi, B. and Arabi, M.I.E. إحداث وعزل وانتخاب طفرات بطاطا مقاومة لمرض اللفحة المتأخرة

11

.2003تقرير نهائي، هيئة الطاقة الذرية السورية، آانون األول . في الزجاج

Al-Safadi, B. and Arabi, M.I.E. تحسين تحمل البطاطا للملوحة باستخدام تقانات الزراعة النسيجية .2005تقرير نهائي، هيئة الطاقة الذرية السورية، حزيران . االنتخاب في الزجاجوالتشعيع مع

Belkhodja, R.F Moralles, A Abadia, J. Gomes-Aparisi and Abadia, J. 1994.

Chlorophyll fluorescence as a possible tool foor salinity tolerance screening in barley (Hordeum vulgare L.)Plant physiology. 104:667-673.

Bethke, P.C and M.C Drew. 1992 Stomatal and nonstomatal component to inhibition

of photosynthesis in leaves of Capsicum annum during progressive exposure to NaCL salinity. Plant physiology.99:219-226.

Bornet, B. and Branchard, M. 2001. Nonanchord Inter Simple Sequence repeats (ISSR) Markers: Reproducible and Specific Tools for Genome Fingerprinting.

Plant Molecular Biology Reporter 19, 209-215.

Ceccarelli, S. Grando, A. Amri, F. A. Asaad, A. Benbelkacem, M. Harrabi, M. Maatougui, M. S. Mekni, H. Mimoun, R. A. El-Einen, M. El-Felah, A. F. El-

Sayed, A. S. Shreidi and A. Yahyaoui, 2001. Decentralized and participatory plant breeding for marginal environments. In: (Cooper, H.D., Spillane, C, and Hodgink, T. Eds.) Broadening the Genetic Base of Crop Production. CABI/FAO/IPRI, 115-

136.

Charbaji, T., I. Arabi and M.Jawhar. 2001. Mineral balance evaluation of irradiated barley seeds grown on saline media, Agrochimica. 45:46-54.

Charbaji, T. 1988. effet du chlorure de sodium sur la vigne en culture hors-sol (vitis

vinifera c.v. Cabernet Sauvignon c.v.10-14M.et G.)These I.N.P.T.,Toulouse-France.

Glenn, E,P., J.J.Brown and E. Blumwald. 1999. Salt tolerance and crop potential of

halophytes. Crit. Rev. Plant Sci.18:227-255.

Hasgawa, P.M., Bressan, R.A, Zhu, J.K. and Bonhert, J. 2000. Plant cellular and Molecular responses to high salinity. Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 51,463-499.

MirAli, N and Nabulsi, I. 2004. Molecular characterisation and genetic relatedness

among olive cultuvars using RAPD markers. Advance Hoticukture Science, 18 (4), 173-180.

MirAli, N and Nabulsi, I. 2003. Genetic diversity of almonds (Prunus dulcis) using

RAPD technique. Scientia Horticulturae, 98, 461-471. Perera, L.K.R.R., T.A. Mansfield and A.J.C. Mallosh. 1994. Stomatal response to

sodium ions in Aster tripolium: A new hypothesis to explain salinity regulation in above- ground tissues. Plant Cell and Environment. 17:335-340.

Sergey, N., I.Shabala, Svetlana, I. Shabala, A. Martynenko, O. Banbourina and I.A. Newman. 1998. Salinity effect on bioelectric activity, growth, Na accumulation

12

and chlorophyll fluorescence of maize leaves a comparative survey and prospects for screening. Australian Journal of Plant Physiology, 25:609-616.

UNEP. 1992. World Atlas of Desertification" Edward Arnold: London".

Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Levak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphism amplification by arbitrary primers are useful as genetic

markers. Nucleic Acids Resources 18, 6531-6535.

Zid, E. and C. Grignon. 1985. Sodium-calcium interaction in leaves of Citrus aurantium growth in the presence of NaCL. Physiol. Veget. 23(6):895-903.

8- Abstract:

Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD) and Inter-Simple Sequence Repeat

(ISSR) were deployed to study the genetic relatedness of nineteen different potato

lines previously obtained by gamma irradiation and believed to be salt tolerant. The

lines which belong to three different cultivars, Spunta, Draga and Diamant were

confirmed to be salt tolerant in comparison with their controls. Twenty seven random

primers and twenty five ISSR oligonucleotides were utilized to determine the genetic

relatedness and to amplify DNA fragments involved in salt tolerance. ISSR clustering

and Percent disagrement values (PDV) resembled that of the RAPDs for all studied

lines. Consequently, RAPD and ISSR were reliable and could be used to determine

the genetic relatedness of potato lines belonging to the same cultivar. Moreover,

twenty unique DNA fragments were amplified using RAPD or ISSR in the tolerant

mutant lines but not in their respective controls. The fragments were gel excised,

reamplified and cloned in a cloning vector using QIAGEN A-addtion and PCR

cloning Kits. However, Blast data base search with the fragments sequences did not

reveal any significant homology indicating the weakness of both the RAPD and ISSR

techniques in identifying specific targets.

13

: سالالت البطاطا المدروسة، أصنافها وأرقام مساراتها: 1جدول

رمز الساللة االصناف RAPDرقم مسار

S1شاهد سبونتا 1

S2طفرة سبونتا 2

S3طفرة سبونتا 3

S4طفرة سبونتا 4

S5طفرة سبونتا 5

S6طفرة سبونتا 6

S7طفرة سبونتا 7

Di 1شاهد ديامونت 8

Di 2 طفرة ديامونت 9

Di 3طفرة ديامونت 10

Di 4طفرة ديامونت 11

Di 5طفرة ديامونت 12

Dr1هد دراجا شا 13

Dr2 طفرة دراجا 14

Dr3 طفرة دراجا 15

Dr4 طفرة دراجا 16

Dr5 طفرة دراجا 17

Dr6 طفرة دراجا 18

Dr7 طفرة دراجا 19

Dr8 طفرة دراجا 20

Dr9 طفرة دراجا 21

14

وتسلسالتها RAPDالمرئسات المستخدمة في تحاليل : 2جدول .No زالرم التسلسل

AAGAGCCCGT Amersham 4 1 CCCGTCAGCA Amersham 6 2

CAGGCCCTTC

OPA-01 3 AGGGGTCTTG OPA-05 4 GGGTAACGCC OPA-09 5 GTGATCGCAG OPA-10 6 TTCCGAACCC OPA-15 7

AGCCAGCGAA OPA-16 8 CAAACGTCGG OPA-19 9 TTCGAGCCAG OPC-01 10 GGGGGTCTTT OPC-03 11 CCGCATCTAC OPC-04 12 TCTGGTGAGG OPD-04 13 GGGGTGACGA OPD-13 14 GGTGCGGGAA OPE-02 15 CCAGATGCAC OPE-03 16 TGCGGCTGAG OPE-14 17 ACGGATCCTG OPF-01 18 GAGGATCCCT OPF-02 19 CCTGATCACC OPF-03 20 GGTGATCAGG OPF-04 21 GGTCTAGAGG OPF-20 22 GGAAGCTTGG OPF-10 23

GGAGGAGAGG OPI-0 2 24 CCGCCTAGTC OPI -04 25

TGGAGAGCAG OPI -09 26 ACAACGCGAG OPI-10 27

15

مصفوفة النسب المئوية لعدم التوافق بين سالالت البطاطا المدروسة والناجمة عن تطبيق متوسطات المجموعات الزوجية : 3جدول ).UPGMA(غير المزانة

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Di1 Di2 Di3 Di4 Di5 Dr1 Dr2 Dr3 Dr4 Dr5 Dr6 Dr7 Dr8 Dr9

S1 0.00 0.01 0.01 0.01 0.02 0.27 0.26 0.28 0.06 0.06 0.06 0.07 0.25 0.25 0.23 0.24 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27

S2 0.01 0.00 0.01 0.01 0.01 0.26 0.25 0.27 0.05 0.05 0.05 0.06 0.24 0.25 0.22 0.23 0.27 0.26 0.26 0.26 0.26

S3 0.01 0.01 0.00 0.01 0.02 0.27 0.26 0.28 0.06 0.06 0.06 0.07 0.25 0.25 0.23 0.24 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27

S4 0.01 0.01 0.01 0.00 0.01 0.27 0.26 0.28 0.05 0.05 0.05 0.06 0.25 0.25 0.23 0.24 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27

S5 0.02 0.01 0.02 0.01 0.00 0.27 0.26 0.28 0.05 0.05 0.05 0.06 0.24 0.26 0.23 0.24 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27

S6 0.27 0.26 0.27 0.27 0.27 0.00 0.01 0.04 0.27 0.27 0.28 0.28 0.29 0.14 0.10 0.11 0.16 0.15 0.15 0.15 0.15

S7 0.26 0.25 0.26 0.26 0.26 0.01 0.00 0.02 0.27 0.27 0.28 0.27 0.28 0.13 0.09 0.11 0.15 0.15 0.14 0.14 0.15

Di1 0.28 0.27 0.28 0.28 0.28 0.04 0.02 0.00 0.29 0.29 0.30 0.30 0.30 0.12 0.11 0.13 0.18 0.18 0.17 0.17 0.17

Di2 0.06 0.05 0.06 0.05 0.05 0.27 0.27 0.29 0.00 0.01 0.03 0.06 0.25 0.28 0.25 0.26 0.30 0.29 0.29 0.29 0.29

Di3 0.06 0.05 0.06 0.05 0.05 0.27 0.27 0.29 0.01 0.00 0.02 0.04 0.25 0.28 0.25 0.26 0.29 0.28 0.28 0.28 0.29

Di4 0.06 0.05 0.06 0.05 0.05 0.28 0.28 0.30 0.03 0.02 0.00 0.04 0.26 0.28 0.25 0.26 0.29 0.28 0.28 0.28 0.29

Di5 0.07 0.06 0.07 0.06 0.06 0.28 0.27 0.30 0.06 0.04 0.04 0.00 0.25 0.28 0.25 0.26 0.30 0.29 0.29 0.29 0.29

Dr1 0.25 0.24 0.25 0.25 0.24 0.29 0.28 0.30 0.25 0.25 0.26 0.25 0.00 0.24 0.22 0.24 0.28 0.28 0.27 0.27 0.27

Dr2 0.25 0.25 0.25 0.25 0.26 0.14 0.13 0.12 0.28 0.28 0.28 0.28 0.24 0.00 0.04 0.06 0.11 0.11 0.10 0.10 0.10

Dr3 0.23 0.22 0.23 0.23 0.23 0.10 0.09 0.11 0.25 0.25 0.25 0.25 0.22 0.04 0.00 0.02 0.07 0.07 0.06 0.06 0.06

Dr4 0.24 0.23 0.24 0.24 0.24 0.11 0.11 0.13 0.26 0.26 0.26 0.26 0.24 0.06 0.02 0.00 0.06 0.06 0.05 0.05 0.05

Dr5 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27 0.16 0.15 0.18 0.30 0.29 0.29 0.30 0.28 0.11 0.07 0.06 0.00 0.02 0.01 0.01 0.00

Dr6 0.27 0.26 0.27 0.27 0.27 0.15 0.15 0.18 0.29 0.28 0.28 0.29 0.28 0.11 0.07 0.06 0.02 0.00 0.01 0.01 0.01

Dr7 0.27 0.26 0.27 0.27 0.27 0.15 0.14 0.17 0.29 0.28 0.28 0.29 0.27 0.10 0.06 0.05 0.01 0.01 0.00 0.00 0.00

Dr8 0.27 0.26 0.27 0.27 0.27 0.15 0.14 0.17 0.29 0.28 0.28 0.29 0.27 0.10 0.06 0.05 0.01 0.01 0.00 0.00 0.00

Dr9 0.27 0.26 0.27 0.27 0.27 0.15 0.15 0.17 0.29 0.29 0.29 0.29 0.27 0.10 0.06 0.05 0.00 0.01 0.00 0.00 0.00

16

و قيم عدم التوافق بينها و ISSRسالالت البطاطا الطافرة المدروسة بتقنية: 4جدول RAPDبين شواهدها بداللة

PDV الساللة ISSRرقم S1 con 1 0

0.01 S4 2 3 S5 0.02 4 S6 0.27 5 S7 0.26 6 Dr1 Con 0 7 Dr2 0.24 8 Dr3 0.22 9 Dr4 0.24

10 0.28 Dr5

رموزها وتسلسالتها ISSRالمرئسات المستخدمة في تحاليل : 5جدول

رمز

المرئسة

تسلسل المرئسة

A-1 CACACACACACARR

A-4 CACACACACACARY

A-7 CACACACACACARM

A-10 CACACACACACARK

A-13 CACACACACACARS

A-16 CACACACACACAR

A-25 CACACACACACAK

A-31 AGCAGCAGCAGCR

A-34 AGCAGCAGCAGCY

A-37 AGCAGCAGCAGCM

A-40 AGCAGCAGCAGCK

A-44 AGCAGCAGCAGCS

1B- CTC TCT CTC TCT CTC TTG

4B- CAC ACA CAC ACA GG

7B- GTG GTG GTG GC

B_10 CAG CAG CAG CAG CAG

B-13 CAA CAA CAA CAA CAA

B-16 GAC AGA CAG ACA GAC A

C-22 AGAGAGAGAGAGAGAGT

C-23 GAGAGAGAGAGAGAGAA

C-25 GTGGTGGTGGC

C-26 CACACACACACAGG

C-28 GACA GACA GACA GACA

C-29 CAG CAG CAG CAG CAG

C-30 CAA CAA CAA CAA CAA

17

. بين سالالت البطاطا الطافرةOP-A10خدام المرئسة التغاير الشكلي الناجم عن است: 1الشكل

OP-A10

، Di1: 8، المسار S7: 7المسار ، S6: 6، المسار S5: 5، المسار S4: 4، المسار S3: 3، المسار S2: 2، المسار S1: 1المسار : 15، المسار Dr1: 14، المسار Di5: 13سار الم،Di4: 12، المسار معلم جزيئي: 11، المسار Di3: 10، المسار Di2: 9المسار

Dr2 16، المسار :Dr3 17، المسار :Dr4 18، المسار :Dr5 19، المسار :Dr6 20، المسار :Dr7 21، المسار :Dr8 المسار ،22 :Dr9.

18

ا على النسبة المئوية لعدم التوافق لمتوسطات المجموعات شجرة القرابة بين سالالت البطاطا الطافرة المدروسة اعتماد: 2الشكل .RAPDالزوجية غير المزانة لتحاليل

Tree Diagram for 21 RAPD Variables

Unweighted pair-group average

Percent disagreement

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

Dr6Dr8Dr7Dr9Dr5Dr4Dr3Dr2Di1S7S6

Dr1Di5Di4Di3Di2S5S4S3S2S1

Linkage Distance

19

. بين سالالت البطاطا الطافرةB1 وB4التغاير الشكلي الناجم عن استخدام المرئستين : 3الشكل B4

B1

المسار ، Dr1: 7، المسار S7: 6، المسار S6: 5، المسار S5: 4، المسار S4: 3، المسار S1: 2، المسار معلم جزيئي: 1المسار 8 :Dr2 9، المسار :Dr3 10، المسار :Dr4 11، المسار :Dr5 .

20

ا الطافرة المدروسة اعتمادا على النسبة المئوية لعدم شجرة القرابة بين سالالت البطاط: 4الشكل .ISSRالتوافق لمتوسطات المجموعات الزوجية غير المزانة لتحاليل

Tree Diagram for 10 Variables ISSR

Single Linkage

Euclidean distances

0 1 2 3 4 5 6 7

Dr5

Dr4

Dr3

Dr2

Dr1

S7

S6

S5

S4

S1

Linkage Distance

21

SYRIAN ARAB REBABLIC

ATOMIC ENERGY COMMISSION DAMASCUS- P.O.BOX: 6091

Report on Laboratory Reconnaissance Experiment Department of Molecular Biology and Biotechnology

Studying the possibility of isolating and characterizing genes responsible for salinity tolerance in some gamma irradiation-induced

potato mutants

Dr. A. al-daoude Dr. B. Alsafadi

Eng. I. Al-Nabulsi Dr N. MirAli

AECS – B \RRE 206 July 2008

22