Fates of blood:Studies on stem cell differentiation potential

and B lymphocyte generation

in chimeric cattle

Mikael Niku

Department of Basic Veterinary Sciences

University of Helsinki

Finland

Academic dissertation

To be presented, with the permission of the Faculty of Veterinary Medicine,

for public examination in the Walter Auditorium, Agnes Sjöbergin katu 2, Helsinki,

on 12 January 2007, at 12 noon.

Helsinki 2006

Supervisors: Antti Iivanainen, DVM, PhDUniversity of Helsinki, Finland

Lars­Axel Lindberg, DVM, PhDUniversity of Helsinki, Finland

Reviewers: Hanna Mikkola, MD, PhDUniversity of California, USA

Wayne Hein, BVSc (Hons), PhDAgResearch, New Zealand

Opponent: Hannu Sariola, MD, PhDUniversity of Helsinki, Finland

ISBN: 952­10­3579­X (paperback)

ISBN: 952­10­3580­3 (PDF, http://ethesis.helsinki.fi/)

ISSN: 1795­7079

University Printing House

Helsinki 2006

“Omnis cellula e cellula.”

Rudolf Virchow and Robert Remak, 1855

Abstract

Stem cells exist in most adult tissues. Some of these somatic stem cells may be more

plastic than expected, not limited to generating new cells for the tissue of their origin.

While such findings suggest a revolution in regenerative medicine, they remain

controversial. Most stem cell research is based on transplantation experiments of

isolated and often cultured cells in mice, and the results may be affected by the

manipulation of the animals and the transplanted cells.

Here, naturally chimeric twin cattle were used to investigate the differentiation

potential of stem cells in a non­manipulated large mammal. Due to conjoined placental

circulations, blood of the bovine twins is mixed for most of the fetal period, and

circulating stem cells are effectively exchanged. We developed powerful methods for

tracing their progeny in various tissues of freemartin cattle, females born as a twin to a

bull. While from 10% to 90% of the hematopoietic system in freemartins was donor­

derived, donor contribution to non­hematopoietic tissues was in most cases minor.

Thus, hematopoietic stem cells and other cell types circulating in fetal blood do not

generate significant numbers of non­hematopoietic cells in the development, growth

and physiological turnover of bovine tissues. However, they may be important in tissue

repair and regeneration, as suggested by increasing numbers of donor­derived cells in

newly forming granulation tissue.

Chimeric  cattle  were  also  used  to  investigate  the  generation  of  bovine  B

lymphocytes, which occurs differently than in the commonly studied human and

mouse, and is poorly understood. The results indicate that the ileal Peyer’s patch

determines the peripheral B cell pool in young cattle, and is likely responsible for the

production of the preimmune antibody repertoire by post­rearrangement strategies.

To facilitate a direct analysis of bovine stem cells, the first antibodies against bovine

CD34 were generated. The CD34 glycoprotein is commonly used as a marker for

hematopoietic progenitors and endothelial cells in the human and mouse. CD34 mRNA

was found to be alternatively spliced and widely expressed in cattle tissues. Using the

new antibody, the protein was detected in most blood vessel endothelia, primitive

hematopoietic cells and some non­hematopoietic cell types.

Acknowledgements

This study was carried out at the Department of Basic Veterinary Sciences, Division of

Veterinary Anatomy, at the Faculty of Veterinary Medicine, University of Helsinki.

Financial support from the University of Helsinki, the Finnish Veterinary Foundation,

the Academy of Finland, the Ministry of Agriculture and Forestry, the Anna and Karl

Eklund  Foundation  and  the  Mercedes  Zachariassen  Foundation  is  gratefully

acknowledged.

I warmly thank the following persons, in the approximate order of appearance:

My parents, for passing on the genetic material and for encouraging me to pursue an

academic career.

The KoHu guild of international adventurers, for being the best.

Jaakko and Ulla­Maija Lumme, who largely are to blame for my decision to become

a biologist. Jaska, The Geneticist, has been my idol since I was 12. On the

expeditions to Varanger and elsewhere, he convinced me that biologists truly are

supreme beings. Ultsi, my legendary biology teacher, showed me that they may also

have a big warm heart.

Seppo Vainio, for introducing me to the wonderful world of developmental biology.

Antti Iivanainen, my humane and understanding supervisor, for all his ideas, and

for letting me work and learn independently (which I can say almost completely

without the usual sarcasm).

Lars­Axel Lindberg, for the opportunity to work at the Department and for generous

support.

Leif C. Andersson, for allowing us to use the Haartman lab for cell culture and other

work, and for his jolly optimism. I’m sorry we never submitted to Nature (we did try

Science, though).

Tuire Pankasalo (and Hanna Valtonen), for cutting more than 28700 tissue sections,

and for important friendship; Kirsi Lahti, for skilfully staining most of those

sections, among countless other things; Pirjo Puroranta, especially for all the

Western blots; and Merja Salmitie, for the initial observation of Peyer’s patch

chimerism.

Tiina  Pessa­Morikawa,  Runar  Ra,  Satu  Kuure  and Kirsi  Sainio,  for  inspiring

discussions and for the methodological advice provided.

Anna Ekman, Annamari Alitalo, Pauli Turunen, Lotta Ilmonen, Sanna Sirkiä, and

Marisa Palmberg, for the spirit and enthusiasm only bright young minds can bring.

The staff at the Vainio abattoir, for generous and valuable technical assistance and

for providing a cosy work atmosphere.

Jukka Pösö, for kind assistance in accessing and mining the Faba cattle database.

Eeva Jokinen and the whole VIELO team, for adding to my days some art, which I

would have missed.

All of the veterinary students, for refreshing breaks from research work and for

letting me learn by teaching (which is the second best way, after making mistakes,

and certainly more enjoyable).

Hanna Mikkola and Wayne Hein for thoroughly reviewing my thesis and for kind

and constructive comments; and Carol Ann Pelli for carefully editing the English of

the manuscript.

Finally, I am deeply grateful to my family, Mari Elisa, Iikka and Kuutti. You have

shown me what is truly important and have carried me over the moments of

frustration. To Mari Elisa, I am also indebted for reviewing the manuscript of this

thesis, making it significantly less painful an experience for the hypothetical reader.

Helsinki, 6th December 2006

Contents

1. List of original publications ..................................................................................... 1

2. Abbreviations........................................................................................................... 2

3. Introduction ............................................................................................................. 3

4. Review of the literature............................................................................................ 4

4.1. Somatic stem cells ............................................................................................ 4

4.1.1. “The stem cell is the origin of life”............................................................ 44.1.2. Hematopoietic stem cells .......................................................................... 54.1.3. Mesenchymal stem cells ........................................................................... 94.1.4. Epithelial stem cells ................................................................................ 114.1.5. Neuronal stem cells................................................................................. 134.1.6. Somatic stem cell plasticity..................................................................... 154.1.7. What makes a stem cell? ......................................................................... 20

4.2. The freemartin................................................................................................ 24

4.3. Generation of B lymphocytes in ruminants.................................................... 26

4.3.1. Production of the ruminant antibody repertoire ..................................... 274.3.2. The ileal Peyer’s patch ............................................................................ 29

5. Objectives of the study........................................................................................... 32

6. Materials and methods........................................................................................... 33

6.1. Animals, tissues and cells .............................................................................. 33

6.1.1. Animal welfare........................................................................................ 34

6.2. In situ hybridization ....................................................................................... 34

6.2.1. Genomic in situ hybridization................................................................. 346.2.2. Tyramide amplified mRNA in situ hybridization.................................... 356.2.3. Probes...................................................................................................... 35

6.3. Immunostaining ............................................................................................. 36

6.3.1. Antibodies and antigen retrieval ............................................................. 366.3.2. Immunohistochemistry ........................................................................... 366.3.3. Immunofluorescence............................................................................... 37

6.4. Combined ISH and IH double staining........................................................... 37

6.5. Microscopy and photomicrography................................................................ 37

6.6. Cell counting and statistics............................................................................. 38

6.6.1. Counting of donor­derived non­hematopoietic cells in tissues............... 386.6.2. Counting of donor­derived cells in leukocyte fractions........................... 38

6.7. PCR­based IgH analysis .................................................................................. 39

6.7.1. Laser capture microdissection................................................................. 396.7.2. Hybridoma culture.................................................................................. 396.7.3. Preparation of genomic DNA templates .................................................. 396.7.4. PCR amplification and analysis of products............................................ 39

6.8. Leukocyte fractionation .................................................................................. 40

6.9. Generation of a polyclonal anti­bovine CD34 antibody .................................. 40

6.9.1. Cloning of the full­length CD34 cDNA.................................................... 406.9.2. Expression and purification of polypeptide fragments............................ 406.9.3. Antibody production............................................................................... 41

6.10. Western blot.................................................................................................. 41

6.11. Analysis of the bovine CD34 gene and mRNA expression............................ 42

6.11.1. Expression of CD34 mRNA.................................................................... 426.11.2. Assaying single nucleotide polymorphism............................................ 42

7. Results.................................................................................................................... 43

7.1. Detection of bull cells ..................................................................................... 43

7.2. Selection of phenotypic markers .................................................................... 43

7.3. Bull­derived cells in freemartin tissues .......................................................... 43

7.4. Bull­derived cells in freemartin lymphocyte populations............................... 45

7.5. Generation of a polyclonal anti­bovine CD34 antibody .................................. 47

7.5.1. Cloning of bovine CD34 cDNA................................................................ 477.5.2. Expression of CD34 polypeptide fragments............................................. 477.5.3. Production and characterization of a polyclonal antibody...................... 47

7.6. Expression of CD34 mRNA and protein in bovine tissues.............................. 48

8. Discussion .............................................................................................................. 50

8.1. Differentiation potential of somatic cells in adult cattle ................................. 50

8.1.1. Evaluation of methods............................................................................. 508.1.2. Implications of bull­derived cells in freemartin tissues .......................... 51

8.2. Role of the ileal Peyer’s patch in generation of the B cell pool in cattle ......... 55

8.3. Generation of an anti­bovine CD34 antibody.................................................. 56

8.4. Expression of CD34 mRNA and protein in bovine tissues.............................. 57

9. Conclusions............................................................................................................ 59

10. References ............................................................................................................ 60

11. Original publications............................................................................................ 77

1

1. List of original publications

This thesis is based on the following publications:

I Niku M., Ekman A., Pessa­Morikawa T., Iivanainen A. (2006)

Identification of major cell types in paraffin sections of bovine tissues.

BMC Vet. Res. 2, 5.

II Niku M., Ilmonen L., Pessa­Morikawa T., Iivanainen A. (2004) Limited

contribution of circulating cells to the development and maintenance of

nonhematopoietic bovine tissues. Stem Cells 22, 12­20.

III Niku M., Pessa­Morikawa T., Andersson L.C., Iivanainen A. (2002)

Oligoclonal Peyer's patch follicles in the terminal small intestine of cattle.

Dev. Comp. Immunol. 26, 689­695.

IV Pessa­Morikawa T., Niku M., Iivanainen A. (2004) Persistent differences in

the level of chimerism in B versus T cells of freemartin cattle. Dev. Comp.

Immunol. 28, 77­87.

V Niku M., Pessa­Morikawa T., Ra R., Ekman A., Iivanainen A. (2006)

Expression of CD34 mRNA and protein in bovine tissues. Submitted to

Vet. Immunol. Immunopathol.

These publications are referred to in the text by their Roman numerals.

Some unpublished material is presented (V).

Reprints are published in the printed version of this thesis with the permission of the

copyright holders. Publications I and II are freely available in full text on the respective

journals’ websites.

2

2. Abbreviations

ATCC American Type CultureCollection

BCA bicinchoninic acid

Bmi1 B lymphoma Mo­MLVinsertion region 1 (anoncogene)

BSA bovine serum albumin

CD34 hematopoietic progenitorantigen CD34

cDNA complementary DNA

CDR complementarity­determiningregion

CSF3 colony­stimulating factor 3(synonym: G­CSF, granulocytecolony­stimulating factor)

CXCL4  chemokine (C­X­C motif)

DIG digoxigenin

DNP dinitrophenyl

Fab antibody fragment containingthe antibody­binding regions

FACS fluorescence­activated cellsorting

FM freemartin

GALT gut­associated lymphoidtissue(s)

GSL Griffonia simplicifolia lectin

HSC hematopoietic stem cell

Ig immunoglobulin (antibody)

IgH immunoglobulin heavy chain

IgM a class of immunoglobulinsforming pentamers(macroglobulins)

IH immunohistochemistry

ISH in situ hybridization

kDa kilodalton

KDR kinase insert domain receptor(synonym: VEGFR2, vascularendothelial growth factorreceptor 2)

Kithi expressing high levels of thekit oncogene

lin– lineage negative; depleted oflineage commitment markers

linlo expressing low levels oflineage commitment markers

LSK the lin–/lo Sca1+ Kithi fraction

LT­HSC  long­term repopulatinghematopoietic stem cell

MACS magnetic­activated cell sorting

MAPC multipotent adult progenitorcell

ML­I mistletoe lectin I

mRNA messenger RNA

MSC mesenchymal stem cell

NBT/BCIP nitroblue tetrazolium / 5­bromo­4­chloro­3­indolylphosphate

PBS phosphate­buffered saline (abuffer solution)

PCR polymerase chain reaction

PFA paraformaldehyde

PP Peyer’s patch

PTEN phosphatase and tensinhomolog, a tumour suppressor

RT­PCR  reverse transcription – PCR

Sca1+ stem cell antigen­1 positive

SDS­PAGE  sodium dodecyl sulphate –polyacrylamide gelelectrophoresis

SLAM signalling lymphocyteactivation molecule

SP side population (effluxing theHoechst dye 33342)

SSC saline sodium citrate (a buffersolution)

SSPE saline­sodium phosphate­EDTA (a buffer solution)

ST­HSC  short­term repopulatinghematopoietic stem cell

Tek endothelial­specific receptortyrosine kinase (synonym:Tie2)

Y+ Y chromosome positive

3

3. Introduction

Stem cells have been a focus of intense research and publicity for the last decade. They

are changing our understanding of development, physiology and pathophysiology

(Joseph and Morrison, 2005; Clarke and Fuller, 2006). In addition to the embryo, adult

tissues also contain stem cells; even the central nervous system is continuously

renewed by them, contrary to long­held dogma (Gross, 2000). Intriguingly, some of

these somatic stem cells may be more plastic than expected, not limited to generating

cells for the tissue of their origin (Blau et al., 2001). Such discoveries suggest a

revolution in regenerative medicine, stimulating public interest (Weissman, 2000). Yet,

stem cells are also a controversial issue in many ways. Some of the exciting findings

have been problematic to reproduce (Goodell, 2003). In the research models typically

used, the manipulation of cells and animals may affect the results. The interpretation of

experimental data is further complicated by poorly understood biological processes like

cell fusion (Wagers and Weissman, 2004).

The present work aimed to dissect the differentiation potential of stem cells in a

large, long­lived mammal, where tissue maintenance and regenerative processes might

differ from the commonly studied small rodents. Cattle twins provide a unique

chimeric model without artificial manipulation. Blood of bovine twins is mixed for

most of the fetal period, and circulating progenitors, including hematopoietic stem

cells, are effectively exchanged (Lillie, 1917; Owen, 1945). The progeny of donor­

derived cells may then be traced by genetic markers (Wilkes et al., 1981). However,

technical  limitations  have  previously  prevented  an  effective  analysis  of  their

contribution to non­hematopoietic tissues. We have now developed methods making

this possible.

Chimeric cattle also were instrumental in early immunological research (Brent,

1997). Here, they offered a view on the generation and maintenance of the bovine B

lymphocyte pool, a process strikingly different from that of the more commonly studied

mouse and poorly understood.

In this thesis, I review the current literature on somatic stem cells, cattle twins, and

the production of ruminant B lymphocytes. I then present our research on the fates of

circulating cells, on the generation of B cells in cattle and on the expression of the

hematopoietic progenitor antigen CD34 in bovine tissues.

4

4. Review of the literature

4.1. Somatic stem cells

4.1.1. “The stem cell is the origin of life”

A stem cell is defined as being capable of self­renewal and multilineage differentiation

on a single­cell basis (Weissman, 2000).  The zygote, the fertilized egg, is the ultimate

stem cell; it is totipotent, able to generate all cells of the body, as well as the placenta

and the fetal membranes (Harvey, 1651; Seidel, 1952).

The early mammalian embryo forms a hollow sphere of cells, and in most species an

inner cell mass is positioned on one side of the ring (Eakin and Behringer, 2004). These

inner cells are pluripotent; each may produce any cell of the body, but not the placental

structures  (Gardner  and  Rossant,  1979).  They  can  be  isolated  and  cultured  as

embryonic stem cells, which are able to proliferate indefinitely, and can be induced to

differentiate into specific cell types (Evans and Kaufman, 1981).

As the development of the individual proceeds, cells gradually differentiate, losing

potential and acquiring specialized functions. Our bodies mostly consist of terminally

differentiated cells, such as mature neurons, erythrocytes, or keratinocytes of the skin,

which are unable to proliferate (Lipinski and Jacks, 1999). Yet, stem cells also exist in

adult mammals. Lost cells are in many tissues continuously replaced by somatic stem

cells (Fuchs and Segre, 2000). These typically are tissue­specific, generating cells for

the tissue in which they reside. Somatic stem cells are therefore considered multipotent,

capable of generating several cell types, oligopotent or even unipotent, depending on the

case (Sell, 2004).

The actual stem cells typically cycle relatively rarely (Cheshier et al., 1999;

Bickenbach and Mackenzie, 1984). An asymmetric cell division renews the stem cell

and creates a committed daughter (Ho, 2005). The daughter cell has restricted self­

renewal capacity and potency, but often proliferates rapidly before the terminal

differentiation. These progenitor or precursor cells produce the huge numbers of new

cells needed for tissue maintenance, such as an estimated trillion blood cells daily in

man (Akashi et al., 2000; Raff, 2003; Ogawa, 1993). Therefore, they are also called

transit amplifiers.

Somatic stem cells

5

A stem cell is the beginning of an individual, and stem cells renew the tissues

throughout life. Thus, the stem cell indeed is the origin of life, as phrased poetically by

Sell (2004). It can also be an origin of death: cancer appears to be largely a stem cell

disease (Clarke and Fuller, 2006), and stem cells may have a major role in aging (van

Zant and Liang, 2003). In this review, however, I focus on somatic stem cells in a

healthy animal. I introduce some of the best characterized stem cell types and methods

for identifying or enriching them. Evidence of somatic stem cell plasticity and currently

emerging general principles in stem cell biology are discussed.

4.1.2. Hematopoietic stem cells

Hematopoietic stem cells (HSCs) are the most studied stem cells, and widely used in

the clinic for treatment of leukemias, other cancers, and congenital immunodeficiencies

(Kondo et al., 2003). Their existence was proposed already in 1906 by Alexander

Maximov, in his hematopoietic theory (Maximow, 1906). Proof arrived decades later,

when the use of nuclear weapons inspired the investigations of radiation effects on

animals, and HSC failure was shown to be a cause of radiation death (Weissman, 2000).

Lethally irradiated animals could be rescued by spleen or bone marrow transplants

from normal animals (Jacobson et al., 1951; Lorenz et al., 1952; Nowell et al., 1956;

Ford et al., 1956). These were soon shown to contain multipotent hematopoietic

progenitors (Till and McCulloch, 1961; Becker et al., 1963).

HSC is a multipotent somatic stem cell: a single HSC is able to generate all blood

cell lineages (Osawa et al., 1996). A subset of HSCs is capable of life­long self­renewal,

and these are called long­term hematopoietic stem cells (LT­HSCs; Jones et al., 1990;

Smith et al., 1991). They give rise to short­term HSCs (ST­HSCs), which are also

multipotent but have a reduced self­renewal potential (Smith et al., 1991; Osawa et al.,

1996; Morrison et al., 1997). ST­HSCs generate non­renewing multipotent progenitors

(Morrison et al., 1997) or, according to a recent alternative model (Fig. 1), common

myeloid progenitors and lymphoid­primed multipotent progenitors lacking significant

megakaryocyte and erythrocyte potentials (Adolfsson et al., 2005). Mature blood cell

lineages are finally produced through further committed progenitor stages.

Review of the literature

6

Figure 1. Two proposed models for hematopoietic lineage development.

For brevity, the final stages are omitted from the alternative model.LT­HSC: long­term HSC; ST­HSC: short­term HSC; MPP: multipotentprogenitor; LMPP: lymphoid­primed multipotent progenitor; CLP: commonlymphoid progenitor; CMP: common myeloid progenitor; GMP: granulocyte/ macrophage progenitor; MkEP: megakaryocyte / erythroid progenitor; B: Bcell; T: T cell; NK: natural killer cell. Based on Adolfsson et al. (2005).

Hematopoietic stem cells can be enriched by fluorescence­activated cell sorting

(FACS), using monoclonal antibodies against cell surface antigens (Muller­Sieburg et

al., 1986). In addition, HSCs in several species actively efflux certain fluorescent dyes,

allowing isolation of the so­called side population (SP), highly enriched for LT­HSCs

(Goodell et al., 1996; Goodell et al., 1997; Zhou et al., 2001b). Some of these strategies

are summarized in Table I. The markers in use are, however, neither directly related to

stem cell­like properties nor completely stem cell­specific (Zipori, 2004). Definitive

proof for the “stemness” of an isolated cell population is provided by functional assays.

Long­term self­renewal and complete blood reconstitution capacity are difficult to

analyse in vitro, as the hematopoietic microenvironment is poorly understood. While

Somatic stem cells

7

several in  vitro and  xenograft  models  have  been  developed,  only  allograft

transplantation of candidate stem cell populations to lethally irradiated recipients is

considered an unequivocal test (Kondo et al., 2003). HSCs have thus been most

thoroughly characterized in mice. Even there, the precise phenotypes of the various

hematopoietic cell populations, and subsequently also the hematopoietic fate map,

remain somewhat uncertain, as shown in Fig. 1. In mammals other than mouse and

man, HSC phenotypes are poorly characterized, but they have been enriched using

lineage depletion (Leon et al., 2005) or Kit positivity (Le Guern et al., 2003).

In the developing embryo, the hematopoietic and cardiovascular organ systems are

the first to appear, being essential beyond the early postimplantation period (Copp,

1995). The earliest hematopoietic and endothelial progenitors are detected in the yolk

sac, at embryonic day 7.25 in the mouse (Ferkowicz and Yoder, 2005). They appear to

have a common precursor, the hemangioblast (Huber et al., 2004; Bailey et al., 2004).

The yolk sac first produces primitive erythrocytes, which are initially nucleated and

express embryonic globins; later, it also generates hematopoietic progenitors and

erythrocytes of the adult type (McGrath and Palis, 2005). In the embryo proper,

definitive HSCs are generated in the aorta­gonad­mesonephros region from day 10.5

(Dieterlen­Lièvre and Martin, 1981; Medvinsky and Dzierzak, 1996; de Bruijn et al.,

2000); the placenta has recently been recognized as another significant source (Gekas et

al., 2005; Ottersbach and Dzierzak, 2005). HSCs soon colonize the liver, which becomes

the main hematopoietic organ for most of the fetal life (Johnson and Moore, 1975;

Houssaint, 1981; Morrison et al., 1995; Ema and Nakauchi, 2000). Bone marrow is

seeded by circulating LT­HSCs only shortly before birth, at day 17.5, migrating in a

chemotactic response to the stromal cell­derived chemokine CXCL12 and the kit ligand

(Christensen et al., 2004). In the mouse, at least, the seeding occurs gradually, with low

numbers of HSCs constitutively circulating in the fetal bloodstream. Engraftment to the

marrow is dependent on the calcium­sensing receptor, suggesting that it is guided by

the high extracellular calcium concentrations associated with bone modelling (Adams

et al., 2006).

In larger mammals, the timing of the changes in the hematopoietic environment is

somewhat different. Hematopoietic activity is seen in the bone marrow from 10­15

weeks’ gestation in human fetuses (Charbord et al., 1996) and from the 4th month in

cattle (Rüsse, 1991).

Review of the literature

8

Table I. Some strategies for enrichment of adult hematopoietic stem cells.

The marker profile changes during ontogeny. For phenotypes of embryonicand fetal HSCs, see Mikkola and Orkin (2006).

Marker(s) Comments

CD34 Transmembrane glycoprotein commonly used as a marker to enrich humanHSCs for transplantation (Berenson et al., 1991; Kondo et al., 2003). Inmurine HSCs, the expression is variable (Ito et al., 2000). Human andmurine CD34 expression may be differently regulated (Okuno et al.,2002), but CD34– HSCs also exist in the human (Zanjani et al., 1998;Bhatia et al., 1998). The CD34+ fraction is very heterogenous and containslarge numbers of committed progenitors (Bhatia et al., 1997).

CD34+KDR+ Highest achieved purity of repopulating human HSCs, about 20% (Ziegleret al., 1999).

CD133(prominin­1)

A recently published marker possibly unifying human CD34+ and CD34–

HSCs (Gallacher et al., 2000).

lin–/lo Sca1+ Kithi Also called the LSK fraction. Contains virtually all murine HSC activity;represents approximately 0.05­0.1% of all bone marrow cells (Spangrudeet al., 1988; Ikuta and Weissman, 1992). The population is heterogeneous,and only about 20% of the cells are capable of long­term reconstitutionafter single­cell transplantation (Osawa et al., 1996).

Side population (SP) Cells that actively efflux the vital dye Hoechst 33342 by ABC transporters(Zhou et al., 2001b). This property allows in several species the isolationof a population that is enriched for LT­HSCs (Goodell et al., 1997). In themouse, the SP is largely lin–/lo Sca1+ and about 1000­fold enriched for LT­HSCs (Goodell et al., 1996). Dye toxicity prevents clinical use (Durandand Olive, 1982).

Tip­SP CD34–LSK Cells with strongest dye efflux activity, further selected for a CD34–LSKphenotype. These are practically pure LT­HSCs in the mouse (Matsuzakiet al., 2004). The fraction represents only 0.001­0.01% of marrowmononuclear cells, and possibly not all murine LT­HSCs are confined tothis very rare subset.

CD150+CD48– A recently published simple isolation strategy for murine HSCs, based onthe expression pattern of various SLAM family cell surface receptors (Kielet al., 2005). Allows enrichment efficiency comparable to LSK. Incombination with CD41– selection, almost half of the population is capableof long­term reconstitution as single cells.

The hematopoietic microenvironment of the bone marrow is only beginning to be

understood. HSCs are thought to lodge primarily in two specific marrow niches. The

most dormant stem cells are located on endosteal surfaces (Gong, 1978; Zhang et al.,

2003; Arai et al., 2004). They are anchored via N­cadherin to osteoblasts, which

regulate the number and function of HSCs (Zhang et al., 2003; Arai et al., 2004; Calvi et

Somatic stem cells

9

al., 2003; Visnjic et al., 2004; Wilson and Trumpp, 2006). HSCs are also found in

association with the marrow sinusoidal endothelium (Kiel et al., 2005), where they

proliferate more actively (Wilson and Trumpp, 2006). Small numbers of HSCs are

normally present in the circulation, quickly migrating through blood and exiting within

minutes (Goodman and Hodgson, 1962; Wright et al., 2001). This may serve to maintain

hematopoietic homeostasis by distributing HSCs to unoccupied niches, but could also

be a means to delete unwanted stem cells (Abkowitz et al., 2003). Rare HSCs can also

be found in most other organs (Asakura and Rudnicki, 2002; Kotton et al., 2005;

McKinney­Freeman et al., 2002).

Most HSCs in adult bone marrow are quiescent at any one time (Cheshier et al.,

1999; Kiel et al., 2005). Yet, they are regularly recruited to cycle and can be rapidly

activated and mobilized in response to stress or injury (Wilson and Trumpp, 2006). The

hematopoietic cytokine CSF3 is commonly used in the clinic to mobilize HSCs to blood

for  transplantation;  interestingly,  the  process  appears  to  be  regulated  by  the

sympathetic nervous system (Katayama et al., 2006). Membrane­bound kit ligand

expressed by osteoblasts is essential for long­term maintenance of HSC activity (Lyman

and  Jacobsen,  1998).  Osteoblasts  maintain  stem  cell  quiescence  through

Tek/angiopoietin­1 signalling (Arai et al., 2004).

HSCs have been shown to generate differentiating progeny by asymmetric cell

division (Suda et al., 1984; Takano et al., 2004; Giebel et al., 2006), but the mechanisms

inducing the asymmetry are not understood (Wilson and Trumpp, 2006). Notch and

Wnt signalling are thought to promote self­renewal and inhibit differentiation in an

integrated manner (Duncan et al., 2005; Reya and Clevers, 2005; Maillard et al., 2003).

Also the transcription factors HoxB4 and c­myc and the tumour suppressor PTEN have

been implicated as important regulators of HSC renewal and differentiation (Antonchuk

et al., 2002; Wilson et al., 2004; Zhang et al., 2006b).

4.1.3. Mesenchymal stem cells

Bone marrow also contains a non­hematopoietic stem cell system, the mesenchymal

stem  cells  (MSCs;  Prockop,  1997;  Väänänen,  2005).  Cells  generating  clones  of

mesenchymal lineages (fibroblasts, osteoblasts, chondroblasts and adipocytes) can be

enriched by simple plastic adhesion from the marrow and several other tissues

(Friedenstein et al., 1970; Friedenstein et al., 1987; Kuznetsov et al., 2001; Zuk et al.,

Review of the literature

10

2002). These cells are highly expandable in culture, growing up to 50 population

doublings, and multipotent on a single­cell basis  (Friedenstein et al., 1987; Colter et al.,

2000; Pittenger et al., 1999; de Bari et al., 2006). They are thus regarded as stem cells,

although their stem­like properties have not been assayed as rigorously as those of

HSCs (Javazon et al., 2004). MSCs are poorly characterized and little is known of their

in vivo biology; they are of nevertheless of considerable clinical interest, due to the

favourable in vitro properties (Väänänen, 2005).

MSCs differ from HSCs in several ways. Turnover of mesenchymal tissues is very

slow compared with blood; thus, the production of differentiated cells is limited, and

also the self­renewal capacity of MSCs in vivo is poorly elucidated (Dennis and

Charbord, 2002). MSC lineages appear to be less strictly defined than hematopoietic

lineages. The commitment to a specific blood cell lineage is thought to be irreversible

under  normal  conditions  (Akashi  et  al.,  2000).  Fully  differentiated  osteoblasts,

adipocytes and chondrocytes, by contrast, may transdifferentiate to other mesenchymal

lineages (Song and Tuan, 2004). On the other hand, MSCs and HSCs may be

functionally connected. MSCs produce hematopoiesis­supporting stroma (Dennis and

Charbord, 2002) and colocalize with HSCs throughout ontogeny (Mendes et al., 2005).

MSCs are found in the fetal circulation, suggesting that they might migrate through

blood like HSCs (Campagnoli et al., 2001).

No specific markers for MSCs are known, although they are generally negative for

hematopoietic and endothelial markers, and can be enriched by integrin 1 positivity

or using the monoclonal antibody STRO­1 (Deschaseaux and Charbord, 2000; Simmons

and Torok­Storb, 1991; Stewart et al., 2003; Gronthos et al., 2003; Javazon et al., 2004).

Therefore, MSCs are primarily identified by their in vitro differentiation capacity, and

all MSC populations investigated are heterogeneous (Javazon et al., 2004). MSC

cultures can be fractionated by FACS scatter analysis to small rapidly renewing cells,

which are highly clonogenic, and larger, granular, slowly proliferating cells (Colter et

al., 2000; Smith et al., 2004).

Recently, progenitor cells capable of generating mesenchymal and other lineages

have been isolated from bone marrow and other tissues (Reyes and Verfaillie, 2001;

Jiang et al., 2002a; Jiang et al., 2002b).  These multipotent adult progenitors (MAPCs)

were obtained by prolonged culture of cells depleted for hematopoietic markers, in a

medium supplemented by epidermal growth factor, platelet­derived growth factor BB,

and for the murine cells, leukemia inhibitory factor (Jiang et al., 2002a). MAPCs may

Somatic stem cells

11

represent a rare subset of MSCs, but could also be a product of the culture conditions

used to isolate them.

4.1.4. Epithelial stem cells

Epithelial stem cells have been primarily studied in the rapidly renewing epithelia of

the skin and the intestine (Rizvi and Wong, 2005). In contrast to the HSC niches, the

microanatomy of these epithelial stem cell systems is well defined, but less is known of

their cell biology. The stem cells are typically identified as retaining a label in the

chromosomal DNA, introduced by modified nucleotides or histone proteins (Tumbar et

al., 2004). In non­stem cells, the label is gradually diluted by DNA replication or is lost

by cell death, while stem cells retain the label because of their relative quiescence or,

possibly, due to selective chromatin segregation (Potten et al., 2002).

The epidermis is continuously renewed every one to three weeks, depending on

species and location (Potten, 1975a; Potten, 1975b). Cells proliferate at the basal layer

next  to  the  basement  membrane,  then  move  towards  the  surface,  gradually

differentiating into dying proteinaceous sacs, which are finally sloughed off (Alonso

and Fuchs, 2003). In normal epidermal homeostasis, the tissue is replenished by basal

layer stem cells, which probably comprise about 10% of all basal cells, and their

progeny, the rapidly proliferating transit amplifying cells (Levy et al., 2005; Ito et al.,

2005; Mackenzie, 1997). Still, the most multipotent epidermal stem cells are found in

the hair follicles (Fig. 2a; Moore and Lemischka, 2006). The follicle is a complex

epidermal appendage, consisting of a permanent upper portion and a cycling lower

portion which generates the hair (Alonso and Fuchs, 2003). The bulge region of the

outer root sheath, below the sebaceous gland and near the attachment to the arrector

pili muscle, is considered to be the follicular stem cell niche (Cotsarelis et al., 1990;

Alonso and Fuchs, 2003). A single cultured bulge stem cell is able to generate all

epithelial lineages of  the hair follicle and sebaceous gland and also transiently

contributes to damaged interfollicular epidermis (Blanpain et al., 2004; Claudinot et al.,

2005; Levy et al., 2005; Ito et al., 2005). The stem cells are self­renewing. They can be

cultivated for more than 120 doublings, theoretically producing far more epithelium

than necessary to cover every human being (Rochat et al., 1994). The progeny of a

single  cultured  cell  can  generate  thousands  of  hair  follicles,  even  in  serial

transplantation to a secondary recipient (Claudinot et al., 2005; Blanpain et al., 2004).

Review of the literature

12

Figure 2. Epithelial stem cell niches.

a) Multipotent epidermal stem cells in the hair follicle. Based on Reya andClevers (2005) and Ross (2003).

b) Stem cells in the small intestine. Based on Potten (1998) and Reya andClevers (2005).

No specific markers for epidermal stem cells are available, but they can be enriched

by 6 and 1 integrin and CD34 (Li et al., 1998; Jones et al., 1995; Trempus et al.,

2003). In addition, the bulge area is positive for cytokeratin 15 (Lyle et al., 1998).

Highly purified DNA label­retaining cells have been isolated from the basal layer as the

Hoechst dye effluxing side population (Dunnwald et al., 2001).

The intestinal epithelium is replaced in a few days by stem cells residing in the

intestinal crypts, in a spatially well­defined process (Potten, 1998). An estimated four to

six multipotent stem cells, which may be originally monoclonal, are located at a

specific position near the base of each crypt (Fig. 2b; Rizvi and Wong, 2005). They

generate all four differentiated cell types of the epithelium (Gordon et al., 1992).

Progeny of the stem cells migrate up towards the intestinal lumen. They first become

Somatic stem cells

13

transit amplifying cells at the upper part of the crypt, then differentiate and stop

proliferating, and finally are exfoliated to the lumen (Potten, 1998). Paneth cells in the

small intestine follow an opposite course, settling at the crypt bases (Rizvi and Wong,

2005). The villi of the small intestine are covered by sectors of epithelium originating

from several neighbouring crypts (Bjerknes and Cheng, 1999).

Studies of the intestinal epithelium have been hindered by the lack of markers.

Recently, the RNA binding protein Musashi­1 was reported to label stem and early

progenitor cells in the intestine (Potten et al., 2003; Kayahara et al., 2003).

 The Wnt signalling cascade is essential in the regulation of epithelial proliferation

and differentiation in both the skin and the intestine (Reya and Clevers, 2005). It is

required for the maintenance of intestinal crypt progenitors (Korinek et al., 1998), and

persistent activation of the pathway is an initiating event in colorectal cancer (Reya and

Clevers, 2005). On the other hand, Wnt signals induce the differentiation of Paneth

cells (van Es et al., 2005). Through the EphB/ephrin­B system, the Wnt pathway also

affects the sorting and positioning of intestinal epithelial cells (Batlle et al., 2002). In

the epidermis, Wnt signalling is thought to promote proliferation and hair follicle

development  (Reya  and  Clevers,  2005).  The  bone  morphogenetic  protein  (BMP)

signalling pathway is integrated with Wnt to negatively regulate stem cell proliferation

and stimulate differentiation (Moore and Lemischka, 2006). Notch signalling is also

implicated in the regulation of differentiation in both the epidermis and the intestinal

epithelium (Rizvi and Wong, 2005).

4.1.5. Neuronal stem cells

New neurons are continuously produced in the brains of adult vertebrates, contrary to

the long­held dogma (Gross, 2000; Garcia­Verdugo et al., 2002). Adult neurogenesis was

originally suggested by DNA labelling experiments in the rodent hippocampus (Altman

and Das, 1965), and then shown to be associated with vocal learning in songbirds (for a

historical review, see Nottebohm, 2004). However, this theory was not generally

accepted until the 1990s (Ming and Song, 2005). Multipotent neural stem cells are now

known to exist in the hippocampus and in the walls of the lateral ventricles of adult

rodents and humans (Fig. 3; Reynolds and Weiss, 1992; Reynolds and Weiss, 1996;

Palmer et al., 1997; Eriksson et al., 1998; Kukekov et al., 1999; Ahn and Joyner, 2005).

They are capable of self­renewal and clonal generation of neurons and glia in vitro and

Review of the literature

14

in vivo. In culture, the stem cells typically form floating aggregates of cells called

neurospheres (Reynolds and Weiss, 1992). In the hippocampus, new neurons are

generated in the subgranular zone of the dentate gyrus and then differentiate into

granular neurons (Altman and Das, 1965; Kaplan and Bell, 1984; Bayer, 1982; Stanfield

and  Trice,  1988).  The  stem  cells  in  the  ventricular  walls  are  located  at  the

subventricular zone, below the ependymal layer (Lois and Alvarez­Buylla, 1993;

Chiasson et al., 1999). In rodents, their progeny migrates to the olfactory bulb, along the

rostral migratory stream (Lois and Alvarez­Buylla, 1994; Sanai et al., 2004). In other

areas of the central nervous system, the generation of new neurons is controversial and

species­dependent (Falk and Frisen, 2005; Garcia­Verdugo et al., 2002). The cerebral

cortex of healthy adult humans showed no neuronal turnover in an ingenious study

applying 14C dating to cellular DNA (Spalding et al., 2005).

Figure 3. Neuronal stem cell niches in the murine brain.

Schematic sagittal view. Based on Uchida (2000) and Sidman et al. (1971).

In both germinal regions, neuronal stem cells are astroglia­like cells expressing glial

fibrillary acidic protein (GFAP), a traditional marker of mature astroglia (Doetsch et al.,

1999a; Seri et al., 2001; Garcia et al., 2004). They also express nestin (Lendahl et al.,

1990) and prominin­1 (Uchida et al., 2000). Yet, labelling of dividing cells remains the

principal method for reliably identifying them and their progeny (Ming and Song,

2005).

The neuronal stem cell niches appear to be associated with blood vessels (Doetsch,

2003). Hippocampal neurogenesis occurs around capillaries in proliferative clusters

Somatic stem cells

15

also containing endothelial precursors (Palmer et al., 2000). In the subventricular zone,

the proliferating cells are in contact with specialized extensions of the vascular basal

lamina (Mercier et al., 2002), and the stem cells occasionally also extend to the

ventricle (Doetsch et al., 1999b).

Neuronal stem cells are thought to generate several stages of transit­amplifying cells,

which  then  differentiate  into  postmitotic  neurons  (Alvarez­Buylla  et  al.,  2001;

Kempermann et al., 2004). They acquire a neuronal phenotype, express neuron­specific

receptor proteins, establish synaptic connections, display typical electrophysiological

properties and respond to stimuli (Carlén et al., 2002; van Praag et al., 2002; Song et al.,

2002; Belluzzi et al., 2003; Carleton et al., 2003). The new neurons are thought to

differentiate in an activity­dependent manner, possibly sensing activities of the local

neuronal network even before receiving synaptic innervation (Carleton et al., 2003).

The process resembles the neuronal development in the embryo (Esposito et al., 2005).

The functional significance of adult neurogenesis is still unclear, largely due to the

extreme complexity of the central nervous system. It seems to be associated with

learning and memory, although the process is too slow for acute benefits (Kempermann

et al., 2004). Neurogenesis is also stimulated by physical exercise or injury, and

possibly reduced in stress and depression (Ming and Song, 2005).

Major developmental signalling pathways regulate stem cells also in the central

nervous  system  (Alvarez­Buylla  and  Lim,  2004).  Wnt  signalling  is  required  for

neurogenesis, at least in the hippocampus (Lie et al., 2005), whereas Sonic hedgehog

and Notch are thought to maintain both stem cell populations (Alvarez­Buylla and Lim,

2004). The tumour suppressors PTEN and p53 inhibit stem cell self­renewal (Groszer et

al., 2006; Meletis et al., 2006).

4.1.6. Somatic stem cell plasticity

Somatic stem cells  are  traditionally thought to be restricted to particular fates,

producing only cell types found in the tissue of their origin (Lakshmipathy and

Verfaillie, 2005; Wagers and Weissman, 2004). This dogma has been challenged by

reports of stem cell plasticity, claiming that somatic stem cells are also capable of

generating cells of nonrelated tissues. Transplanted bone marrow cells have been

reported to produce in vivo skeletal and cardiac muscle (Ferrari et al., 1998; LaBarge

and Blau, 2002; Orlic et al., 2001), liver (Petersen et al., 1999; Theise et al., 2000),

Review of the literature

16

endothelium (Asahara et al., 1999), epithelia (Okamoto et al., 2002; Körbling et al.,

2002; Kale et al., 2003), neurons (Mezey et al., 2000; Brazelton et al., 2000; Mezey et al.,

2003; Priller et al., 2001) and even oocytes and male germ cells (Johnson et al., 2005;

Nayernia et al., 2006). Of the various bone marrow lineages, purified HSCs (typically

defined as the LSK fraction) also seem to contribute to muscle (Corbel et al., 2003;

Camargo et al., 2003), liver (Lagasse et al., 2000), endothelium (Grant et al., 2002; Bailey

et  al.,  2004),  various  epithelia  (Krause  et  al.,  2001)  as  well  as  astrocytes  and

oligodendrocytes  (Koshizuka  et  al.,  2004).  Similarly,  MSCs  were  reported  to

differentiate into cardiomyocytes (Toma et al., 2002) and astroglia (Kopen et al., 1999),

besides the various mesenchymal lineages. In addition to these bone marrow­derived

stem cells, MAPCs isolated from several tissues generate hematopoietic cells, various

epithelia, and skeletal muscle (Jiang et al., 2002a; Jiang et al., 2002b; Muguruma et al.,

2003); skeletal muscle appears to produce hematopoietic cells (Jackson et al., 1999);

and neuronal stem cells may give rise to blood (Bjornson et al., 1999), muscle (Galli et

al., 2000) and, indeed, in chimeric embryos, to all germ layers (Clarke et al., 2000).

Plasticity of somatic stem cells could revolutionize our understanding of tissue

development and maintenance, and a multitude of clinical applications may be

envisioned (Herzog et al., 2003). Unfortunately, it has often been problematic to

reproduce  the  reported  findings.  Bone  marrow  transplants,  purified  HSCs  and

parabiosis partners have repeatedly failed to yield neuronal cells in an intact or injured

brain, although their contribution to microglia is remarkable (Castro et al., 2002;

Roybon et al., 2006; Massengale et al., 2005). Instead, some of the bone marrow

hematopoietic populations were confusingly found to express proteins regarded as

neuronal markers. In another study, recipients of single HSCs showed no contribution

to most tissues, and only a single donor­derived neuron was detected in more than 13

million total cells examined, despite a robust hematopoietic engraftment (Wagers et al.,

2002). HSCs also failed to generate cardiomyocytes (Murry et al., 2004), and no oocytes

were derived from bone marrow transplants or long­term parabiosis partners (Eggan et

al., 2006). Generally, reported frequencies of bone marrow­derived engraftment vary

several orders of magnitude, and are usually low, around 0.5­2% of non­hematopoietic

cells in various tissues and experiments (Goodell, 2003). Concerning neuronal stem

cells, hematopoietic capacity was undetected in almost 130 · 106 neurosphere cells

transplanted to more than 100 recipient mice (Morshead et al., 2002). Hence, the

Somatic stem cells

17

plasticity of somatic stem cells is clearly a controversial issue (Goodell, 2003; Raff,

2003; Wagers and Weissman, 2004).

The outcomes of the experiments obviously vary depending on the type and status

of the transplant recipient. Tissue damage generally promotes engraftment (Petersen et

al., 1999; LaBarge and Blau, 2002; Okamoto et al., 2002); this is in many studies

intentional, but poorly defined damage is also induced by common transplantation

procedures (Prise et al., 2005). The transplanted cells are to a variable degree affected

by the manipulation involved in their isolation and possible cultivation (Morshead et

al., 2002).

Some of the findings may even be due to detection artefacts; the risk is increased in

the analysis of exceedingly rare events. The transplanted cells can be traced in recipient

tissues by labels such as the Y chromosome, a detectable genetic polymorphism, or a

transgene, typically expressing green fluorescent protein (GFP) or ­galactosidase.

Colocalization of the label with various phenotypic markers, most commonly using

immunostaining, then reveals the fates of donor­derived cells (Herzog et al., 2003). In

ordinary light microscopy, superimposed cells may produce an illusion of marker

colocalization (Goodell, 2003). Any labelling method used to track stem cells and their

progeny is subject to potential false positives: in situ hybridization to genomic markers

could be unspecific, autofluorescence may confuse interpretation of GFP signals and

endogenous ­galactosidase activity occurs in some conditions (Herzog et al., 2003).

Regarding derivatives of human bone marrow transplants, false positives may be caused

by male cells existing in female tissues in the absence of transplantation (Stevens et al.,

2004; Khosrotehrani et al., 2004). These may be of fetal origin, but are found quite often

even in women who have not given birth to a son (Yan et al., 2005). False negatives

may be caused by unstable or low­level transgene expression (Torensma and Figdor,

2004). In addition, antibodies (or even antigens!) used to assay the phenotypes of

labelled cells are often not completely specific (Goodell, 2003).

Still, detection artefacts cannot account for all of the observations suggestive of

somatic cell  plasticity.  Confocal  microscopy with  3D  reconstruction  and  double

staining with hematopoietic markers have been used to resolve potential cell overlays

(LaBarge and Blau, 2002; Jiang et al., 2002a). Specificity of labels can be ensured with

careful controls or by the verification of results with several different labelling systems

(Bailey et al., 2004). Unambiguous morphological properties of cells or functional

analysis support the immunostaining data in some works (Priller et al., 2001; Lagasse et

Review of the literature

18

al., 2000). A stepwise progression of bone marrow cells to muscle, in response to

various stimuli, has also been documented (LaBarge and Blau, 2002).

Several biological explanations may account for the apparent plasticity, depending

on the experimental setup (Fig. 4). These have been directly addressed in few studies

(Raff, 2003; Wagers and Weissman, 2004; Lakshmipathy and Verfaillie, 2005).

True plasticity would involve transdifferentiation (Fig. 4a) or dedifferentiation (Fig.

4b) of somatic cells. Transdifferentiation  refers  to a direct  lineage change  to a

completely different cell type, while dedifferentiation implies a conversion of a tissue­

specific cell to a more primitive stem cell, followed by redifferentiation along a new

pathway (Wagers and Weissman, 2004). These processes have not been unambiguously

documented in mammals (Wagers and Weissman, 2004). Transit­amplifying precursors

may be converted to stem cells in the brain (Doetsch et al., 2002) and intestinal

epithelium (Potten, 1998); also, HSCs express a multitude of genes related to non­

hematopoietic tissues (Akashi et al., 2003). Theoretically, plasticity clearly should be

possible. Nuclei of even extremely specialized cells like lymphocytes can sometimes be

reprogrammed to enable cloning of an animal (Hochedlinger and Jaenisch, 2002), and

regeneration  involving plasticity of differentiated cells  occurs readily  in urodele

amphibians (Brockes and Kumar, 2002).

Unfortunately,  in  many  of  the  cases  presented  above,  the  transplanted  cell

populations are far from homogeneous. Unfractioned bone marrow preparations are

likely to contain several kinds of stem and progenitors cells, instead of a single highly

plastic type (Fig. 4c; Wagers and Weissman, 2004). Yet, in several studies, single

purified cells have been transplanted, indicating true multipotency and attributing this

capacity to actual stem cells at least indirectly (Krause et al., 2001; Jiang et al., 2002a;

Bailey et al., 2004).

Alternatively, rare multipotent stem cells may contaminate the isolated tissue­

specific stem cells (Fig. 4d; Wagers and Weissman, 2004). Contaminating HSCs seem to

account for the reported hematopoietic capacity of skeletal muscle (McKinney­Freeman

et al., 2002). In addition, as presented in section 4.1.3., highly potent MAPCs have been

derived from many tissues, although their actual existence in vivo is unclear (Jiang et

al., 2002b). In transplantations of single stringently purified LSK HSCs, multilineage

differentiation obviously indicates actual plasticity of HSCs defined by the currently

recognized criteria; even this population is, however, known to be heterogeneous

(Osawa et al., 1996).

Somatic stem cells

19

Figure 4. Potential mechanisms for apparent somatic stem cell plasticity.

a) Transdifferentiation.

b) Dedifferentiation.

c) Multiple stem cells (a heterogeneous population isolated).

d) A rare multipotent stem cell among tissue­specific stem cells.

e) Cell fusion.

Based on Herzog et al. (2003) and Wagers and Weissman (2004).

Finally, bone marrow­derived cells have been shown to contribute to several tissues

by cell fusion (Fig. 4e). In culture, bone marrow cells fuse to embryonic stem cells,

adopting their phenotype (Terada et al., 2002). Under selective pressure, bone marrow­

derived hepatocytes in vivo arise primarily by fusion (Wang et al., 2003). In another

studies, bone marrow cells fused to liver, Purkinje cells and cardiac muscle in

irradiated recipients, with no actual transdifferentiation events detected (Alvarez­

Dolado et al., 2003), and to intestinal stem cells (Rizvi et al., 2006). Fusion to Purkinje

cells was shown to produce stable heterokaryons, where the bone marrow cell nucleus

is reprogrammed (Weimann et al., 2003). Cell fusion is a well­known property of

macrophages (Vignery, 2005), and indeed, HSCs appear to contribute to skeletal muscle

through myeloid intermediates rather than directly (Camargo et al., 2003). On the other

hand, fusion events are rare in the absence of selection (Wagers and Weissman, 2004).

Observations of HSC and neuronal stem cell plasticity have also been reported in the

absence of cell fusion (Jang et al., 2004; Bailey et al., 2004; Wurmser et al., 2004).

Taken together, the significance of somatic stem cell plasticity is still unclear, and

understanding  the  often  apparently  contradictory  observations  requires  further

research. To convincingly demonstrate an actual transdifferentiation event, several

stringent criteria are proposed: the investigated cells should be minimally manipulated

and cultured; clonal analysis should be performed; the transdifferentiated cells must be

Review of the literature

20

unambiguously identified, phenotyped and shown to be functionally engrafted to

tissue; nuclear reprogramming should be assessed, and cell fusion must be excluded

(Wagers and Weissman, 2004). However, clinical applications may be feasible, even if

transdifferentiation is not a physiologically relevant process.

4.1.7. What makes a stem cell?

The basis of “stemness” is not understood, despite intensive research (Mikkers and

Frisen, 2005). The commonly used definitions of a stem cell are ambiguous: some

differentiated cells are able to self­renew (Luckey et al., 2006), and some stem cells,

such as those of the germline, are unipotent, generating a single type of progeny (de

Rooij and Grootegoed, 1998).

Stem cells do share some characteristics. Several signalling pathways, including

Wnt and Notch, are common to multiple stem cell types, as presented above. In

addition, specific small RNAs are emerging as important stem cell regulators (Zhang et

al., 2006a). Stem cells in various tissues have been enriched by their dye efflux ability,

as  the side population. The  enhanced membrane transport may be  involved in

protection of long­lived stem cells from cytotoxic substances (Challen and Little, 2006).

Stem cells also seem to carefully protect their genomic DNA. Telomerase is commonly

expressed by stem and progenitor cells, preserving chromosome ends from degradation

(Harrington, 2004). Evidence is also accumulating for the immortal strand hypothesis;

asymmetrically dividing stem cells apparently retain the original template strands,

passing the newly synthesized chromatids to the committed daughters (Cairns, 1975;

Merok et al., 2002; Potten et al., 2002; Smith, 2005; Karpowicz et al., 2005; Shinin et al.,

2006).  In  contrast,  some  forms  of  DNA  repair  may  actually  be  downregulated;

potentially mutated stem cells are preferentially replaced, in agreement with a strict

control of genomic stability (Cairns, 2002).

Despite such general features, no unambiguous molecular markers of stem cells are

available, let alone markers common to all stem cell types (Zipori, 2004). In search of a

stem cell signature, transcriptomes of embryonic, hematopoietic, and neuronal stem

cells have been compared by three independent groups using DNA array technology

(Ivanova et al., 2002; Ramalho­Santos et al., 2002; Fortunel et al., 2003). All groups

found more than 200 genes upregulated in all stem cell types, thus representing

putative “stemness” genes. These gene sets were, however, strikingly different; only a

Somatic stem cells

21

single gene, integrin 6, was identified in all three studies, although a multitude of

genes enriched for embryonic or neuronal stem cells were reported in good agreement

(Fortunel  et al.,  2003).  While  variations  in stem  cell  purification methods and

shortcomings in the current DNA arrays partially explain the discrepancies, it appears

that specific stemness genes are expressed at a low level or only transiently, or may not

exist at all (Fortunel et al., 2003; Zipori, 2004). Instead, stemness may be established by

subtle differences in the expression of many genes, or different stem cells may use

distinct genetic programs for self­renewal and differentiation (Fortunel et al., 2003).

Figure 5. Stem cell: a blank state (a) or priming for multipotentiality (b)?

Adapted from Zipori (2004) with permission.

HSCs show a highly promiscuous gene expression pattern, expressing multiple

genes active in specific hematopoietic lineages, and even genes characteristic of non­

hematopoietic cells (Akashi et al., 2003). As the cells differentiate to various committed

progenitors, the expression pattern is progressively restricted. HSCs actively express

genes associated with energy metabolism and translation (Hüttmann et al., 2006). They

thus appear to be quiescent only with regard to proliferation, otherwise prepared to

rapidly respond to environmental stimuli. Stem cells may in fact be characterized by a

wide­open chromatin structure (Mikkers and Frisen, 2005). Rather than representing a

blank state that gradually obtains properties of differentiated cells (Fig. 5a), stem cells

could be primed for multipotentiality by expression of many genes, which are then

selectively repressed or enhanced during differentiation (Fig. 5b; Zipori, 2004). The

importance of chromatin modification in the specification of stemness is illustrated by

the requirement of Bmi1 in self­renewal of hematopoietic and neuronal stem cells, as

well as many murine and human cancers (Valk­Lingbeek et al., 2004). This polycomb

group member is involved in epigenetic regulation.

Review of the literature

22

Difficulties in defining a stem cell, heterogeneity of isolated stem cell populations,

and observed plasticity have led some authors to suggest that stemness is a regulatable

state rather than a discrete entity (Zipori, 2004; Blau et al., 2001; Fig. 6). Perhaps any

cell is able to function as a stem cell, given the correct environment (although

differentiated cells are less likely to do so)!

Figure 6. Route stem cell.

A stem cell landscape inspired by the initial reports of plasticity. Stem cellsare envisioned here as travelling in the bloodstream, entering diverse tissuesand generating appropriate cell types in response to local cues.Reproduced from Blau et al. (2001) with permission. Original artwork by N.Gewertz and B. Colyear.

Indeed, the niche appears essential in stem cell biology, as exemplified above for

various stem cell types. The niche is a specialized microenvironment sheltering the

stem cells, consisting of neighbouring cells and extracellular substance (Moore and

Lemischka, 2006; Fuchs et al., 2004; Spradling et al., 2001). By interactive signalling,

the niche maintains a balance of stem cell quiescence and activity, regulating self­

renewal and differentiation. Best characterized in the Drosophila ovary, asymmetry and

Somatic stem cells

23

subsequent differentiation may be commonly achieved by directional cell division,

where one daughter remains attached to the niche, and the other is separated, as

schematically shown in Fig. 7 (Spradling et al., 2001). Little is known, though, of the

strategies actually used by mammalian somatic stem cells (Morrison and Kimble, 2006).

Figure 7. Symmetric and asymmetric division in the niche.

Symmetric divisions expand the stem cell population; asymmetric divisionsgenerate differentiating daughter cells and renew the stem cells. Based onSpradling et al. (2001).

The state and history of the cell are still likely to affect the interpretation of

environmental signals (Mikkers and Frisen, 2005). This is a central principle in

developmental biology (Gilbert, 2006). As previously presented, intestinal stem cells

and Paneth cells reside in intimate proximity, yet certain signals seem to affect them in

almost opposite ways. Stem cells may be described as being halted in the progression

towards differentiation, an apparently inherent tendency of mammalian cells (Fig. 8;

Mikkers and Frisen, 2005; Clarke and Fuller, 2006). This status is maintained by

complex interactions between the stem cell and the niche (Mikkers and Frisen, 2005).

Review of the literature

24

Figure 8. Stem cells are halted in the progression towards differentiation.

Adapted from Mikkers and Frisén (2005) with permission. Artwork assistedby Iikka Niku.

4.2. The freemartin

Cattle provide a unique large animal model for stem cell research: most bovine twins

are naturally chimeric as a result of conjoined fetal circulations. It is thus unnecessary

to apply the typical transplantation procedures, where poorly defined radiation damage

affects the results (Prise et al., 2005). Isolation and in vitro cultivation of transplanted

cells are also avoided, minimizing alterations caused by manipulation (Morshead et al.,

2002).

Vascular anastomosis occurs in about 92% of cattle twins, due to fused chorions

(Fig. 9; Marcum, 1974; Lillie, 1917). The anastomoses form early in the development,

from the 10­ to 15­mm crown­rump stage (Lillie, 1917; Bissonnette, 1924; Ohno and

Gropp, 1965). This corresponds to about 30­35 days post­coitum or Carnegie stages 15­

18; the limb buds and forelimb plates are visible, many internal organs develop rapidly,

and the genital ridges appear (Ohno and Gropp, 1965; Rüsse, 1991; Butler and Juurlink,

1987; Bissonnette, 1924). The blood is thus effectively mixed between the fetuses for

most of the 280­day gestation. Postnatally, the twins permanently share identical

The freemartin

25

composite blood types, indicating that HSCs are exchanged and successfully engraft in

the recipient (Owen, 1945). The proportions of donor­derived nucleated cells in blood

and bone marrow in different twins are reported to be randomly distributed between

less than 5% and more than 95% (Wilkes et al., 1981). The twins are tolerant to tissue

allografts from each other (Anderson et al., 1951; Billingham et al., 1952). This

serendipitous discovery led to further research in mice and chickens, unravelling the

basis of acquired immunological tolerance (Billingham et al., 1953); the findings earned

Peter Medawar a Nobel prize in 1960 (Brent, 1997).

In other species, chimerism caused by vascular anastomosis is rare, although it has

been  reported  in  at  least  sheep,  goats  and  pigs  (Marcum,  1974).  Low­level

microchimerism appears to be surprisingly common in humans (Boklage, 2006).

However, this may be primarily caused by cell exchange between temporarily fused

early embryos, rather than through vascular connections between fetuses or between a

fetus and the mother.

Donor­derived cells can be readily identified in a female animal born as a twin to a

male, as only bull cells contain a Y chromosome. In cattle, a female calf born as a twin

to a bull is usually infertile due to disturbances in the development of the reproductive

organs. These are probably caused by the anti­Müllerian hormone produced by the

male fetus (Jost, 1970; Vigier et al., 1977; Vigier et al., 1987); the bovine twins were a

key research model in the early days of reproductive endocrinology (Lillie, 1917; Capel

and Coveney, 2004). Otherwise, the animals develop normally (Padula, 2005).

The infertile heifers are called freemartins. The “free” may derive from the Scottish

farrow, for a cow not giving milk or without a calf, or from the Anglo­Saxon fearr, a bull

(Forbes, 1946). The “martin” possibly originates from the Gaelic and Irish mart,

meaning cow, heifer, ox, cow for slaughter, or beef. The term was often applied to cattle

killed at the time of the Martinmas festival in November, to preserve the meat for

winter; the non­productive freemartins were probably selected for slaughter. In the

scientific literature, freemartins were first described more than two hundred years ago

by John Hunter (1779):

“ It  is a known fact, and, I believe, is understood to be universal, that when acow brings forth two calves, and that one of them is a bull­calf, and the other acow  to  appearance,  the  cow­calf  is  unfit  for  propagation;  but  the  bull­calfbecomes a very proper bull. They are known not  to breed:  they do not  evenshew  the  least  inclination  for  the  bull,  nor  does  the  bull  ever  take  the  leastnotice of them.”

Review of the literature

26

Diagnostic  methods  for  freemartinism  range  from  clinical  examination  to  Y­

chromosome­specific PCR (Padula, 2005). Composition of freemartin tissues has been

analysed by cytogenetic techniques (Wilkes et al., 1981). Still, due to limitations of

these methods, little is known of the contribution of bull­derived cells to the non­

hematopoietic tissues.

Figure 9. Cattle twins.

1: arterial anastomosis; 2: cotyledon with venous connection with bothsides; 3: opened amniotic sacs; 4: clitoris of the freemartin. Reproducedfrom Lillie (1917) with permission of Wiley­Liss, Inc. a subsidiary of JohnWiley & Sons, Inc. Copyright  1917 John Wiley & Sons, Inc.

4.3. Generation of B lymphocytes in ruminants

Our current understanding of the immune system is mostly based on mouse research,

and to some extent on the human system. However, it turns out that these species are

not representative of all mammals (Reynolds, 1997). A striking lesson is provided by

the ontogeny of the antibody­producing B lymphocytes in ruminants. In this part of the

review, I discuss the strategies ruminants use for the generation of their antibody

repertoire, and the major role of the ileal Peyer’s patch in this process.

Generation of B lymphocytes in ruminants

27

4.3.1. Production of the ruminant antibody repertoire

Antibodies are able to specifically recognize almost any substance due to tremendous

variation in their antigen­binding sites (Janeway et al., 2001). Every immunoglobulin

(Ig) variant cannot be directly encoded in the genome because they are far more

numerous than all of our genes. Instead, vertebrates use various alternative strategies to

generate the necessary diversity (Ratcliffe, 2002).

The  variable  regions  of  Igs  are  assembled  from  several  gene  segments  by

rearrangements of genomic DNA in developing B lymphocytes (Fig. 10). In the mouse

and human, multiple slightly different copies of each gene segment are available,

allowing a high number of possible combinations. Additional diversity is generated in

the joints between gene segments by addition and removal of nucleotides (Janeway et

al.,  2001).  This preimmune  repertoire  is  produced  in  the  absence  of  antigenic

stimulation (Griebel and Hein, 1996). In postnatal mice and humans, the process occurs

in bone marrow, continuing more or less throughout life (Nunez et al., 1996; Min et al.,

2006). Since B cells arise there from uncommitted progenitors (see Fig. 1), the bone

marrow is regarded as a primary or central lymphoid tissue (Janeway et al., 2001). Igs

are fine­tuned later, as B cells are exposed to antigens, to create the immune repertoire.

In the process of somatic hypermutation, point mutations are introduced at a high rate

into the variable region genes. This takes place in secondary or peripheral lymphoid

tissues, such as the lymph nodes (Janeway et al., 2001).

In chicken and in several mammalian species, gut­associated lymphoid tissues

(GALT) are essential for the generation of B lymphocytes (Reynolds, 1997; Weill and

Reynaud, 1998). Actually, B cells were first identified as bursa­dependent lymphocytes

in the chicken, produced in the cloaca­associated bursa of Fabricius (Glick et al., 1956).

Lymphoid follicles in the ileal Peyer’s patch appear to function analogously in

ruminants, the best­characterized of which are sheep (Yasuda et al., 2006). Cattle are

speculated to be similar.

The GALT species seem to rely less on the combinatorial diversity than the mouse

and human. Instead, their preimmune Ig repertoire is generated largely in GALT by

antigen­independent somatic hypermutation or gene conversion, where pseudogene

sequences replace parts of the functional Ig genes (Ratcliffe, 2002).

Sheep were originally reported to have a very limited selection of Ig variable region

gene segments, even fewer of which are actually used (Reynaud et al., 1991). Igs are

subsequently  diversified  by  somatic  hypermutation,  where  point  mutations  are

Review of the literature

28

introduced to the variable regions at an extremely high rate. The process starts antigen­

independently in the sterile fetus and continues after birth (Reynaud et al., 1995).

However, more Ig gene segments have later been identified in the ovine genome,

suggesting that the combinatorial mechanisms contribute more greatly to Ig diversity

than previously appreciated (Jenne et al., 2003). While somatic hypermutation does

play a role, reassessment of the original data suggests that it occurs mostly after birth,

when the animal is exposed to foreign antigens.

Figure 10. Construction of an immunoglobulin heavy chain.

A simplified view; the actual number of available gene segments is largerand species­dependent. V: variable segment, D: diversity segment, J: joiningsegment, C: constant segment specifying the antibody isotype. Based onJaneway et al. (2001) and Tizard (2004).

Cattle are thought to generate their antibody repertoire using strategies similar to

sheep, although available data are even more limited (Zhao et al., 2006; Kaushik et al.,

Generation of B lymphocytes in ruminants

29

2002). A small number of utilized Ig gene segments have been detected (Sinclair et al.,

1997; Saini et al., 1997; Berens et al., 1997). Both somatic hypermutation and gene

conversion have been proposed to be involved in the Ig diversification (Parng et al.,

1996; Berens et al., 1997; Lucier et al., 1998). CDR3, one of the highly variable

complementarity­determining regions of Igs, shows marked length heterogeneity in

cattle Ig heavy chains (Berens et al., 1997; Sinclair et al., 1997; Saini et al., 1997; Saini

and Kaushik, 2002). In a substantial proportion of bovine antibodies, the CDR3 is

longer than found in any other species (Saini et al., 1999), at least partially due to

exceptionally long diversity (D) segments in the germline genome (Shojaei et al., 2003).

This is thought to provide additional material for somatic hypermutation in the

diversification of bovine immunoglobulins (Kaushik et al., 2002).

4.3.2. The ileal Peyer’s patch

Lymphoid organs called Peyer’s patches (PPs) exist in the walls of the mammalian

small intestine (Yasuda et al., 2006; Griebel and Hein, 1996). They are accumulations of

lymphoid follicles, with considerable variation in structure and distribution between

species. In ruminants, pigs, horses, dogs and humans, most of the follicles are

contained in a single ileal PP, while in jejunum multiple discrete accumulations are

found (Griebel and Hein, 1996). PPs are generally responsible for mucosal immunity. In

the mammalian GALT species, however, the large ileal PP is important for the entire

peripheral B cell pool (Reynolds, 1997).

The lymphoid follicles in the PPs extend from the lamina propria to the submucosa

of the intestine (Fig. 11). In the ileal PP, they are larger and more cylindrical than in the

jejunum (Reynolds and Morris, 1983b). A dome covered by a specialized follicle­

associated epithelium protrudes towards the mucosa; this is more prominent in the

follicles  of  jejunal  PPs.  Each  follicle  is  encapsulated  by  connective  tissue  and

surrounded by lymphatic sinuses draining from the intestinal villi (Reynolds and

Morris, 1983b; Lowden and Heath, 1992). The ileal follicles contain mostly B cells

expressing surface IgM, supported by a rich network of stromal cells (Hein et al., 1989;

Griebel and Hein, 1996; Reynolds, 1997).

The ileal PP develops relatively late in the ruminant fetus, as compared with jejunal

PPs and other lymphoid organs. In sheep, it forms by day 110 of the 150­day gestation

(Reynolds and Morris, 1983b). In cattle, the first ileal lymphocyte clusters are seen at

Review of the literature

30

day 150, and the follicular structures can be distinguished by 180­185 days’ gestation

(Ishino et al., 1991; Beyaz and Asti, 2004; Doughri et al., 1972). The PP is seeded by B

cells, which have already rearranged one Ig light chain allele and express surface IgM

(Jenne et al., 2006; Reynaud et al., 1991; Griebel et al., 1992). The B cells are thought to

originate at least partially from the spleen, although they can also be produced in other

locations (Lucier et al., 1998; Press et al., 2001). The essential population appears to

exist already at day 63, when an injection of anti­IgM antibody is able to perturb later

PP development (Press et al., 1996).

By observing Ig light chain rearrangement patterns, sheep ileal PP follicles were

discovered to be oligoclonal, indicating that each follicle is founded by a small number

of B cells (Reynaud et al., 1995). Igs are then diversified by somatic hypermutation.

Based on sequence genealogies, diversification of the light chain variable regions has

been shown to occur in the ileal PP also in cattle; some of the diversity is, however,

already present in the fetal spleen (Lucier et al., 1998).

Growing until 6­8 weeks after birth, the ileal PP is up to 2.5 meters long in young

lambs and contains about 105 lymphoid follicles; it accounts for up to 1.2% of body

weight, more than the T cell­producing thymus (Reynolds and Morris, 1983b). The

ovine ileal PP starts to involute at about 3 months postnatally and is mostly replaced by

connective tissue by 18 months of age (Reynolds and Morris, 1983b). The jejunal PPs

remain even in old animals.

The follicular B cells in the ileal PP proliferate rapidly already in the fetus. About

5% of them enter metaphase each hour, equalling the production of 3.6 · 109 new cells;

this is approximately ten times the mitotic rate in the thymus (Reynolds, 1986;

Reynolds, 1987). Uncontrolled, the mass of such an expanding population would

exceed that of the whole animal within a week (Reynolds, 1997). About 5% of the B

cells leave the PP and are distributed to all lymphoid tissues, with no preference for the

mucosal sites (Pabst and Reynolds, 1987; Reynolds et al., 1991). Most of the rest are

removed by apoptosis (Pabst and Reynolds, 1986; Pabst and Reynolds, 1986; Motyka

and Reynolds, 1991). A poorly understood selection process may be involved in the

deletion of B cells (Yasuda et al., 2006).

Bovine ileal PP follicles were recently characterized by serial analysis of gene

expression (Neill et al., 2006). Conforming to earlier studies in sheep, the data indicate

active protein synthesis, IgM­dominant expression of Ig genes and apoptotic activity.

Generation of B lymphocytes in ruminants

31

Figure 11. The ileal Peyer’s patch.

A longitudinal section from cattle ileum, showing follicles of the ileal PP.The lumen is at the top of the image. MU = mucosa, SM = submucosa, ME= muscularis externa. F = a single outlined follicle, D = dome area.

Removal of the ileal PP in neonatal lambs causes a prolonged, although not fully

permanent  B  cell  deficiency, suggesting  an important role  for  the  PP  in  ovine

lymphopoiesis (Gerber et al., 1986; Reynolds, 1997). The sheep bone marrow contains

few lymphocytes compared with that in rodents or humans (Tizard, 2004). As the PP

involutes at puberty, adult sheep are thought to depend on the peripheral B cell pool

originally created in the young animal (Reynolds, 1997).

The ovine ileal PP is sometimes referred to as a primary lymphoid organ, since the

preimmune antibody repertoire is largely produced there. However, new B cells do not

arise from uncommitted precursors in the PP, and rearrangements of Ig genes do not

occur (Reynolds, 1997). In addition, antigen exposure is necessary for the postnatal

function of the ileal PP, as it develops normally in isolated, sterile intestinal loops until

birth, but then involutes prematurely (Reynolds and Morris, 1983a; Reynolds and

Morris, 1984; Reynaud et al., 1995; Yasuda et al., 2006). The primary and secondary

functions are thus not clearly distinct and separated. The traditional classification

arises from the mouse and human systems and appears largely artificial with regard to

GALT species (Griebel and Hein, 1996).

32

5. Objectives of the study

The present work aimed to characterize the differentiation potential of somatic stem

cells in a large, unmanipulated mammal to complement the data obtained from mouse

and human transplantation experiments. We studied naturally chimeric twin cattle,

where a substantial proportion of hematopoietic stem cells originates from the sibling.

The donor contribution to the immune system was also examined to investigate the role

of the ileal Peyer’s patch in the generation and maintenance of bovine B lymphocytes.

The following specific objectives were set:

1. To develop methods for detecting bull­derived cells in the tissues of female

twin siblings (freemartins), while preserving tissue architecture (III).

2. To select and develop tools for identifying the phenotypes of bull­derived

cells in freemartin tissues (I, V).

3. To use these methods to characterize the distribution and phenotypes of

bull­derived cells in freemartin tissues (II).

4. To  analyse  the  distribution  of  bull­derived cells  in  various  leukocyte

populations in freemartins to better understand the function of the ileal

Peyer’s patch in the generation and maintenance of the B cell pool in cattle

(III, IV).

33

6. Materials and methods

Detailed descriptions of methods, including primer and probe sequences, are available

in the original publications.

6.1. Animals, tissues and cells (I­V)

Heterosexual cattle twins were located by veterinarian contacts or the cattle database

maintained  by  the  Finnish  Animal  Breeding  Association.  The  chimerism  was

quantitated by Y chromosome­specific in situ hybridization to blood samples, as

described below. Blood samples were acquired from farms. Tissues were collected from

chimeric and normal cattle, which were either anaesthesized and exsanguinated at the

facilities of the Department of Basic Veterinary Sciences or slaughtered routinely at an

abattoir. Altogether 12 freemartins aged 20 days to 20 months were studied.

To obtain newly generated granulation tissue, block­shaped Cellspon cellulose

viscose sponges (Cellomeda, Finland; Viljanto and Kivikoski, 1962) were implanted

subcutaneously in the prescapular region of a 70­day­old freemartin calf. Five sponges

were implanted at one­week intervals. Operations were performed under surgical

anaesthesia, by A. Iivanainen. The calf was sacrificed and implants recovered one week

after the last operation.

Tissue samples were processed for paraffin sections or cryosections. For paraffin

sections, they were fixed either in 4% phosphate­buffered paraformaldehyde (PFA) for

24 h at +4 C or in 100% ethanol for 2 h at +4 C followed by 120 h at ­20 C, embedded

in paraffin and cut to 2­ to 4­ m sections on Superfrost Plus slides (Menzel­Gläser,

Germany). For cryosections, the samples were frozen in liquid nitrogen, stored at ­80 C

and cut to 10­ m sections.

Leukocytes were collected from heparinized blood samples and bone marrow

suspensions by Ficoll gradient centrifugation. Erythrocytes were lysed where necessary.

Bone marrow was obtained from sternal pieces from slaughtered animals or as aspirates

from the wing of the ilium, taken under surgical anaesthesia prior to exsanguination.

For isolation of cells from the spleen, lymph nodes and thymus, tissue samples were

cut into small pieces in medium, and the released cells filtered through a Cell Strainer

(Becton Dickinson Labware, NJ) and centrifuged on a Ficoll gradient. Lymphocytes

from the ileal mucosa were isolated as described previously (Parsons et al., 1996).

Materials and methods

34

Cells were generally processed for cytocentrifuge preparations at 105 cells per slide,

fixed with ethanol or acetone, air­dried and stored at ­80ºC. Smears were prepared from

bone marrow aspirates.

6.1.1. Animal welfare (I­V)

The use of animals was approved by the local authorities. Care was taken to minimize

any pain and suffering, and mostly post­mortem material was used.

6.2. In situ hybridization

6.2.1. Genomic in situ hybridization (II­IV)

Optimized in situ hybridization (ISH) protocols were developed for the detection of the

Y chromosome in bovine tissue sections and cytocentrifuge preparates. For tissue

material, paraffin sections were used. The sections were deparaffinized and then

permeabilized by detergent treatment, microwave heating in 2×SSC pH 6, and protease

P6911 (for PFA­fixed material; Sigma­Aldrich, MO) or detergent and protease only

(ethanol­fixed material). Protease concentration (5­250 g/ml) was optimized for each

tissue. The sections were then quickly fixed in PFA, dehydrated in graded ethanols,

and air­dried. Genomic DNA was denatured by heating slides at +85 C after applying

hybridization solution and coverslips. Hybridization was carried out for 40 h in

humidified chambers at room temperature. The hybridization solution contained 7.5­15

nM digoxigenin (DIG)­labelled oligonucleotide probe (see below), 50% formamide,

4×SSPE pH 7.4, 1 mg/ml ssDNA and 5×Denhardt's solution. The hybridized sections

were washed in 50% formamide, 4×SSPE and in 1.5×SSPE, at room temperature. DIG­

labelled probe was detected by alkaline phosphatase­conjugated anti­DIG­Fab fragments

(Roche, Germany) and visualized using the NBT/BCIP chromogen (Roche). Sections

were lightly counterstained with Mayer's haematoxylin and mounted, usually with

Faramount (Dako Cytomation, Denmark).

In most cases, the slides were assembled in Shandon Coverplates (ThermoElectron),

with the exception of the hybridization steps. Normal bull and cow tissues and cells

were used as positive and negative controls in the analysis of freemartin material.

Cytocentrifuge  preparates  and  bone  marrow  smears  were  processed  essentially

similarly, with optimized pretreatments and an overnight hybridization.

In situ hybridization

35

6.2.2. Tyramide amplified mRNA in situ hybridization (V)

To analyse the expression of the CD34 gene in bovine tissues, ISH to mRNA was

performed. Fresh cryosections were used for this purpose. The sections were heated at

+60 C for 1 min and air dried. They were fixed in ice­cold 4% PFA pH 7.4 for 1 hour,

acetylated, incubated in 0.2 M HCl for 6 min, treated with 0.5 – 1 g/ml proteinase K for

30 min at room temperature, dehydrated, and air dried. The probes were diluted at 200­

400 pg/ l in a hybridization buffer containing 50% formamide, 4×SSPE pH 7.4, 1

mg/ml ssDNA, and 5×Denhardt’s, denatured, and hybridized to the tissue sections at

+52 C overnight. The slides were washed in 4×SSPE; 4×SSPE, 50% formamide; and

1.5×SSPE, at +52 C. They were then assembled with Shandon Coverplates. The

sections were incubated in a blocking reagent and anti­DIG­peroxidase conjugate (both

Roche). Tyramide amplification was performed using the TSA Plus DNP alkaline

phosphatase system (Perkin Elmer, MA), with the NBT/BCIP substrate (Roche). The

sections were then counterstained with haematoxylin and mounted.

6.2.3. Probes (II­V)

The Y chromosome probe, designed by A. Iivanainen, was a degenerate 28mer

oligonucleotide [5'­TT(A/C/T) TCA GCC CTG TGC C(C/T)T GG(A/C/G/T) (A/G)A(C/T)

TGT G­3'] corresponding to the repetitive bovine btDYZ locus (Perret et al., 1990). As a

positive control, a previously described oligonucleotide probe (Modi et al., 1993) for the

bovine autosomal 1.709 satellite sequence (Skowronski et al., 1984) was applied. Both

probes contained a single DIG label and were synthesized by Proligo (France).

DIG­labelled antisense riboprobes and sense control probes were prepared by in

vitro transcription from plasmids containing the respective cDNA sequences, using T7

and SP6 polymerases and DIG­11­UTP (Roche, Germany). The CD34 probe consisted of

the sequence for the extracellular part (bases 57­859). The DNA template was removed

by RQ1 DNAse (Promega, WI), and the probes purified by ethanol­LiCl precipitation.

Products were checked by agarose gel electrophoresis and by a UV absorption spectrum

analysis using a Nanodrop spectrophotometer (Nanodrop Technologies, DL).

Materials and methods

36

6.3. Immunostaining

6.3.1. Antibodies and antigen retrieval (I­V)

We evaluated the usefulness of 39 antibodies and lectins for the identification of major

cell types in paraffin­embedded cattle tissues. Antibodies raised against bovine antigens

or known to be bovine cross­reactive were used where possible. If no information on

bovine reactivity was available, antibodies with the broadest species cross­reactivity

were selected. A comprehensive list of these markers can be found in open­access

publication  I.  Some  additional  anti­bovine  leukocyte  antibodies  were  used  in

publication IV, as described in Results. An anti­bovine CD34 antibody was generated as

a part of the work (V); all other antibodies and lectins are commercially available.

Immunostaining with each antibody was optimized with regard to tissue fixation

(PFA or ethanol) and antigen retrieval methods, as described in publication I. Each

antibody was tested with a standard test battery of retrieval procedures. This included

microwave heating in an acid, neutral or alkaline buffer (for PFA­fixed material) and

protease  treatments  (for  PFA­  and  ethanol­fixed  material).  The  specificity  and

sensitivity of the staining in various tissues were evaluated, and the fixation and

antigen retrieval methods yielding the best results selected for subsequent use.

6.3.2. Immunohistochemistry (I­V)

Immunohistochemistry (IH) was performed using either the avidin biotin complex

(ABC) method or tyramide amplification, in most cases applying Shandon Coverplates.

Paraffin­embedded sections were dewaxed, rehydrated, subjected to an optimized

antigen retrieval procedure and permeabilized with Tween­20 in PBS. The sections

were then blocked for endogenous biotin, when necessary, and for non­specific binding

with goat serum in PBS. They were incubated in the primary antibody overnight at

+4 C, in PBS containing 1% BSA, washed and incubated with goat biotinylated anti­

mouse or anti­rabbit secondary antibody (Dako, Denmark) for 2 h at room temperature.

The  ABC  detection was  performed using  the  Vectastain  Elite ABC  kit and  the

diaminobenzidine  substrate  kit  (both  Vector  Laboratories,  CA)  according  to

manufacturer’s instructions. For tyramide amplification, sections were incubated in

avidin D conjugated peroxidase (Vector), in biotinylated tyramide (Hopman et al.,

Immunostaining

37

1998), again in avidin­peroxidase and in diaminobenzidine substrate. The sections

were counterstained with Mayer’s haematoxylin and embedded with Faramount.

6.3.3. Immunofluorescence (V)

Immunofluorescence staining was performed essentially as described above for IH.

Secondary antibodies conjugated with Alexa Fluor dyes (Invitrogen, OR) were used.

Autofluorescence was suppressed where necessary by incubation in 0.1% Sudan Black

B (Merck, Germany) in 70% ethanol. For cytocentrifuge and smear preparates, no

antigen retrieval was performed, and antibody incubations were shortened. The slides

were embedded using Mowiol 40­88 (Aldrich, Germany).

6.4. Combined ISH and IH double staining (II)

Combining ISH and IH was necessary to reliably analyse the phenotypes of bull­derived

cells. This was problematic, as the ISH protocol destroyed many of the antigens, and

the IH reaction products caused false negatives in ISH. As a solution, tyramide

amplification was utilized in IH, depositing a covalently bound label to the target before

the colour reaction. Thus, the immunodetection could be started first. After the

tyramide reaction, ISH was performed, and thereafter the IH protocol was finished.

Diaminobenzidine (Vector Laboratories) was used as the peroxidase substrate. Sections

were counterstained with Mayer’s haematoxylin and mounted with Faramount (Dako).

For lectin histochemistry, the ISH protocol was beneficial. In combined genomic

ISH and lectin histochemistry, the lectin staining was therefore performed after ISH.

6.5. Microscopy and photomicrography

The  stained  preparates  were  viewed  and  documented  using  an  Olympus  BH2

microscope (Olympus Life and Material Science Europa, Germany) equipped with a

ColorView 12 digital camera and AnalySIS 3.0 image analysis software (both Soft

Imaging  System,  Münster,  Germany),  or  a  Leica  DM4000  microscope  (Leica

Microsystems, Germany) with an Olympus DP70 camera and Cell^P software (both

Olympus).

Materials and methods

38

6.6. Cell counting and statistics (II, IV)

To determine the frequency of Y chromosome­containing (Y+) cells, several tissue

sections or cytocentrifuge preparates were hybridized, and the samples with the highest

Y+ cell frequencies were selected. They provided the most reliable data, as no false

positives were detected in any of the control female samples (see Results).

6.6.1. Counting of donor­derived non­hematopoietic cells in tissues (II)

Y+ and Y– nuclei were counted in digitally photographed tissue sections doubly stained

for the Y chromosome and the hematopoietic marker CD45. The touch count tool of

AnalySIS 3.0 image analysis software was used. Nuclei in all cells negative for

hematopoietic markers in a field of 230 m × 185 m were counted. The process was

repeated for additional fields until the cumulative percentage of Y+ nuclei no longer

fluctuated more than 0.2 percentage units. If no non­leukocyte Y+ cells were found, the

whole section was viewed, and the total number of screened nuclei was estimated by

measuring the area viewed. It should be noted that for tissues with multinucleated

cells, such as the skeletal muscle, the Y+ count represents the proportion of donor­

derived nuclei, rather than entire cells.

Numbers were  corrected with counts obtained  from similar bull  tissues. All

statistical analyses were performed in SPSS 10.0 for Windows. Mann­Whitney U test

was used for estimating statistical significance of differences in cell frequencies.

Similarity of the implanted animal to the other freemartins was evaluated by comparing

scatterplots of cell counting results from different animals.

6.6.2. Counting of donor­derived cells in leukocyte fractions (IV)

Y+ and Y– cells were counted in cytocentrifuge preparates processed for genomic ISH.

A total of 300­500 cells were counted from each slide until the variation in the

cumulative percentage was less than 2 percentage units. Accuracy of counting was

controlled by analysing leukocytes from normal cows and bulls mixed in known

proportions.

PCR­based IgH analysis

39

6.7. PCR­based IgH analysis (III)

Genomic PCR was used to analyse the size of complementarity­determining region 3

(CDR3) within the IgH locus, in individual ileal Peyer’s patch (PP) follicles. CDR3 size

can be used to mark a single B cell clone (Arnold et al., 1983). The assay is especially

feasible in cattle due to the large variation in the CDR3 size (Saini et al., 1999).

6.7.1. Laser capture microdissection

Individual ileal Peyer's patch follicles were laser microdissected from membrane­

mounted, light green­stained, PFA­fixed paraffin sections of freemartin ileum using a

PALM  laser  microscope  system  (P.A.L.M.  Microlaser  Technologies,  Germany),

essentially as described previously (Bohm et al., 1997).

6.7.2. Hybridoma culture

For controls, two bovine B cell – mouse myeloma hybridoma lines ( BL5C2.870005 and

BL5C2.870009)  were  obtained  from  ATCC.  These  were  cultured  in  Dulbecco's

modified Eagle's medium with 4.5 g/l glucose, supplemented with 10% horse serum.

6.7.3. Preparation of genomic DNA templates

The microdissected follicles were digested with proteinase K at +56 C for 5­7 days. The

enzyme was inactivated by heating. The crude digest was then used as PCR template.

For controls, genomic DNA was isolated from bovine peripheral blood leukocytes and

from the two B cell hybridoma lines.

6.7.4. PCR amplification and analysis of products

A region containing the hypervariable CDR3 segment of the rearranged bovine IgH

locus was PCR amplified. Primer cocktails were designed based on bovine IgH

sequences in GenBank. The 5' primer was specific to the framework 3 region of the IgH

gene, and the 3’ primer was specific to the framework 4.

The PCR products were analysed by agarose gel electrophoresis. The specificity of

products was confirmed by Southern blotting using a DIG­labelled internal framework

3 probe. Alkaline phosphatase­conjugated anti­DIG­Fab fragments (Roche) and the CDP­

Materials and methods

40

Star substrate (Roche) were used for detection. Results were visualized using the

Molecular Imager phosphor imager (Bio­Rad, Hercules, CA).

6.8. Leukocyte fractionation (II, V)

Magnetic­activated  cell  sorting  (MACS)  was  used  to  isolate  various  lymphocyte

fractions from Ficoll­isolated mononuclear cells and to deplete bone marrow cells for

lineage markers. MACS columns (Miltenyi Biotec Inc., Germany) were used according

to the manufacturer’s instructions for indirect separation. The efficiency of separation

and depletion was controlled by FACS after incubation of the cells with a fluorescently

labelled secondary antibody.

Granulocytes were isolated using Ficoll gradient centrifugation. They were obtained

from the cell fraction under Ficoll by lysis of the red blood cells.

Cell fractionations were performed by T. Pessa­Morikawa.

6.9. Generation of a polyclonal anti­bovine CD34 antibody (V)

6.9.1. Cloning of the full­length CD34 cDNA

Full­length CD34 cDNA was produced by RT­PCR from total RNA of bone marrow

mononuclear  cells.  The  total  RNA  was  isolated  by  the  single­step  guanidium­

isothiocyanate method (Kingston et al., 1996).

The first strand was synthesized using M­MuLV reverse transcriptase (Finnzymes,

Finland) and a primer specific for the 3’­UTR (Zhou et al., 2001a). The product was

amplified in semi­nested PCR using DynaZyme EXT polymerase (Finnzymes) and

primers specific for the 5’­UTR and 3’­UTR of bovine CD34.

The  cDNA  was  ligated  into  a  SacII/SalI  digested  pBluescript  II  SK  plasmid

(Stratagene, CA), and the recombinant plasmid was used for transforming Escherichia

coli. Five clones were sequenced at the DNA sequencing laboratory of the Viikki

campus. A full­length sequence conforming to previously published data (Zhou et al.,

2001a) was then assembled from these clones.

6.9.2. Expression and purification of polypeptide fragments

The following three fragments of the CD34 polypeptide were selected for antigen

expression based on structure analysis with several prediction software programs: the

Generation of a polyclonal anti­bovine CD34 antibody

41

predicted extracellular domain, a part of the extracellular domain without most of the

predicted glycosylation sites and the predicted cytoplasmic domain.

The corresponding DNA sequences were PCR amplified from the cDNA plasmid and

ligated  into  a  NcoI/XhoI  digested  pET­22b  expression  plasmid  (Novagen,  WI)

containing the T7lac promoter and sequences for the pelB periplasmic localization

signal and C­terminal 6×His­tag. The plasmids were then sequenced to exclude

potential PCR errors.

Protein expression was performed using E. coli strain BL21(DE3) (Novagen). The

partial extracellular fragment and the cytoplasmic fragment were selected for large­

scale production, as the complete extracellular domain was found insoluble. Bacterial

cells were cultured in Luria­Bertani medium with 100 g/ml ampicillin, and protein

expression  induced  with  1  mM  isopropyl­1­thio­ ­d­galactoside.  The  cytoplasmic

fragment was collected from the supernatant, and the extracellular fragment from the

supernatant and the periplasmic space. Both fractions were dialysed to remove free

histidine and histidine­containing oligopeptides.

The His­tagged polypeptides were purified by metal affinity chromatography, using

the Ni­NTA Superflow nickel­nitriloacetic acid resin (Qiagen, MD). The polypeptides

were bound to the resin, washed with buffer containing 1­20 mM imidazole and eluted

with 250 mM imidazole.

The fractions were quantitated with the BCA assay and analysed using SDS­PAGE

electrophoresis.  Identities  of  the  polypeptides  were  confirmed  by  N­terminal

sequencing  and  mass  spectrometry  from  reversed­phase  high­performance  liquid

chromatography fractions, at the protein chemistry core facility of Viikki campus.

6.9.3. Antibody production

Rabbit polyclonal antibodies were raised against the CD34 polypeptide fragments. The

antibodies were produced by Sigma Genosys (Cambridge, UK) according to a standard

custom protocol. They were then purified by affinity chromatography on antigen

coupled to NHS­activated Sepharose (Amersham, Sweden).

6.10. Western blot (V)

Samples of homogenized bovine tissues were run on SDS­PAGE gels, transferred to

polyvinylidine difluoride membranes and probed with the CD34 antibody. To test

Materials and methods

42

specificity,  free  polypeptide  antigen  was  included  in  some  experiments.  After

incubation with a peroxidase­conjugated goat anti­rabbit antibody (Dako Cytomation),

the blots were developed by enhanced chemiluminescence substrates (ECL, Amersham)

and visualized using a Fuji LAS3000 camera (Fuji Photo Co., Ltd., Japan). T. Pessa­

Morikawa was responsible for the Western blots.

6.11.  Analysis of the bovine CD34 gene and mRNA expression (V)

6.11.1. Expression of CD34 mRNA

The possible alternative splicing of the CD34 mRNA in cattle was first examined by

bioinformatics. The tentative intron 7 splice sites in the bovine CD34 gene were

predicted by a CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) alignment of the human and cattle

genomic sequences (Genbank accessions NT_021877 and NW_929130). This part of the

work was performed by A. Iivanainen.

The expression of CD34 mRNA in various bovine tissues was analysed using RT­

PCR by R. Ra. To detect putative splice variants, a strategy published previously for

murine CD34 was used (Suda et al., 1992). Total RNA was reverse­transcribed using the

M­MuLV reverse transcriptase (Fermentas), and the products were PCR amplified with

the Dynazyme EXT DNA polymerase (Finnzymes). Primers specific for exons 7 and 8 of

the bovine CD34 gene, enclosing the possible exon 7 extension, were used in these

reactions. Products were then analysed by agarose gel electrophoresis.

In addition, the expression pattern of CD34 mRNA was analysed by in situ

hybridization, as described above.

6.11.2. Assaying single nucleotide polymorphism

A potential single nucleotide polymorphism (SNP) in the bovine CD34 gene was

suggested by a difference in our sequence to the previously published data. The

presence of the SNP was assayed by restriction fragment length in bovine genomic DNA

samples (9 different breeds, 49 animals in total). DNA was extracted from blood

samples using the Wizard genomic DNA purification kit (Promega, WI) or obtained

from the Nordic Gene Bank Farm Animals (the Japanese black cattle sample from

Professor Masahiro Yasuda, University of Miyazaki). The genomic DNA was then PCR

amplified using primers corresponding to bovine CD34 exons 4 and 6. The products

were digested using BshTI and analysed by agarose gel electrophoresis.

43

7. Results

7.1. Detection of bull cells (II­IV)

The optimized Y chromosome in situ hybridization (ISH) protocol was shown to be

both sensitive and highly specific (III / Fig. 1). In bull tissues, approximately 40­70% of

cells were strongly  labelled, depending on tissue type, even in double staining

combined with immunohistochemistry (II). In the 2­ to 4­ m tissue sections, the Y

chromosomes were unavoidably excluded from some nuclei. No false­positive signals

were seen in any of the female control samples (more than 1700 hybridizations using

20 different tissue types). In the counting of bull­derived cells on cytocentrifuge

preparates, the results of control experiments with known proportions of bull and cow

cells varied less than 3 percentage units from the actual values (IV / Fig. 2). For

paraformaldehyde­fixed paraffin sections, effective hybridization required an enhanced

pre­treatment with both microwave heating and protease.

7.2. Selection of phenotypic markers (I)

To facilitate the analysis of the phenotypes of the bull­derived cells, various markers

were evaluated for immunohistochemistry (IH) and lectin histochemistry. A panel of 31

useful markers was selected. These allowed the identification of all major differentiated

cell types in cattle tissue sections, including epithelia, connective tissue, muscle and

nervous tissue, as well as cell proliferation and apoptosis (I). With paraformaldehyde­

fixed material, heat­induced antigen retrieval at a specific pH was beneficial for most

antibodies. By selecting a suitable retrieval protocol, most of these markers could be

successfully applied to this type of material.

7.3. Bull­derived cells in freemartin tissues (II, III)

To characterize the distribution of bull­derived cells in freemartin tissues, a wide Y

chromosome ISH screening was first performed. Samples from 20­74 different body

sites per animal were analysed from 12 freemartins. In total, more than 1650 freemartin

tissue sections were successfully hybridized. Y chromosome­positive (Y+) bull­derived

cells were detected in all of the animals in all tissues examined. The frequency of Y+

Results

44

cells was highest in blood, bone marrow and lymphoid tissues, with considerable

variation  present  between  individual  animals.  In  blood  mononuclear  cells,  the

proportion of Y+ cells varied from 10% to 90%. The variation was less pronounced in

other organs.

The distribution of the bull­derived cells and double stainings with cell type­

specific  immunohistochemistry  (primarily  neuronal  markers;  unpublished

observations) suggested that a significant proportion of the Y+ cells were infiltrating

leukocytes. These are often difficult to distinguish from parenchymal cells in a

standard histological staining. To reliably label the leukocytes residing in the tissues, Y

chromosome ISH was combined with immunohistochemistry for the pan­leukocyte

marker CD45 (Thomas, 1989), as described in Methods. In the analysis of the central

nervous system, mistletoe lectin I (ML­I) histochemistry was used to label bovine

microglial cells (Hewicker­Trautwein et al., 1996).

Using double staining, 14 different tissues were examined, representing all major

tissue types and derivatives of all embryonic layers. A total of 472 successfully double­

stained freemartin tissue sections were viewed. CD45/ML­I– Y+ cells were identified in

most tissues, but in 11 of the 12 calves they were mostly sporadic. Thus, the Y+ cells

were overwhelmingly of the hematopoietic lineage (II / Fig. 1A­G). One of the calves

(designated FM10) was a striking exception, with high numbers of CD45/ML­I– Y+ cells

in several tissues, as discussed below.

The proportion of Y chromosome­positive CD45/ML­I– cells among all CD45/ML­I–

cells was determined for 4­5 calves per tissue. With the exception of FM10, the calves

did not differ markedly in the relative frequency of CD45/ML­I– Y+ cells, which

constituted less than 1% of all CD45/ML­I– cells in most tissues investigated (II / Fig. 2).

No obvious correlation was observed in the frequency of Y+ cells between blood and

non­hematopoietic tissues, or between various non­hematopoietic tissues in a single

animal.

In 11 of the 12 freemartins, the highest numbers of CD45/ML­I– Y+ cells were

detected in the mammary gland connective tissue (0.94 0.67%), liver (0.85 0.41%,

mostly not hepatocytes), and skeletal muscle (0.83 0.26% of nuclei). The average

frequency of CD45–Y+ cells was 0.1% or less in cardiac and smooth muscle, renal

epithelia, and the epidermis. Bull­derived non­hematopoietic cells were markedly less

frequent in the ectoderm­derived epidermis and the central nervous system. In the

brain, ML­I– Y+ cells were extremely rare, despite a robust contribution to the microglia

Bull­derived cells in freemartin tissues

45

(notably, though, the lectin also labels most endothelia). In the cerebral cortex and the

underlying white matter, 0.0020 0.0023% of ML­I– cells were Y+. No ML­I–Y+ cells were

detected in the hippocampus or the olfactory bulb, among the approximately 2 105 cells

screened per tissue. No Y+ cells showing unambiguous neuronal morphology were seen

in more than 700 successfully hybridized sections of the freemartin central nervous

system. These included samples from the cerebral cortex, cerebellum, brainstem,

corpus callosum, hippocampus, olfactory bulb, thalamus, ventricular walls, hypophysis

and spinal cord, representing approximately 28 106 cells in total.

In FM10, the distribution of CD45/ML­I– Y+ cells differed substantially from the

other calves. Higher numbers of CD45–Y+ cells were detected in the epithelium of small

intestine (19%, II / Fig. 1H), in the connective tissue of mammary gland (15%), and in

liver (4.3%), epithelium of mammary gland (4.0%), skeletal muscle (2.3%), cardiac

muscle (1.0%) and smooth muscle (0.5%). In the brain and renal epithelia, the

frequency did not differ notably from the other calves. Continuous strands of CD45–Y+

cells were seen in the villi of the intestinal mucosa (II / Fig. 1H). In the hematopoietic

system, the bull contribution to B cells was clearly weaker than to the total leukocyte

pool (data not shown).

Newly formed granulation tissue in subcutaneously implanted cellulose viscose

sponges contained relatively high numbers of CD45–Y+ cells (II / Fig. 1I and Fig. 2). The

frequency increased within an incubation period of 4 weeks. At 4 weeks, the frequency

of CD45–Y+ cells in the newly forming tissue was significantly higher than in most

other non­hematopoietic tissues of the same animal (P=0.12 for liver, P<0.02 for any

other tissue  investigated). However, no obvious Y+ cell clusters indicating local

proliferation were seen. In the other tissues of the sponge recipient, the frequencies of

CD45/ML­I– Y+ cells did not differ markedly from those in the 10 other calves of the

majority type.

7.4. Bull­derived cells in freemartin lymphocyte populations (III, IV)

In the ileal Peyer's patch (PP) of freemartin cattle, a striking variation in the frequency

of Y+ cells was observed between individual follicles (Fig. 12 and III / Fig. 2A, B). Some

follicles were almost exclusively of the male genotype, while others were female. The

variation appeared discontinuous, with 2 or 3 discrete intermediate groups of follicles

identifiable based on the frequency of bull­derived cells. The mosaic pattern was

Results

46

specific to the ileal PP follicles. In the jejunal PPs (III / Fig. 2C, D), the interfollicular

variation in the frequency of Y+ cells was very modest.

Figure 12. Y chromosome­specific in situ hybridization to the ileal Peyer’s patch of afreemartin calf.

A composite image assembled from several photomicrographs. Theintestinal lumen is at the top of the image. For a description of the structure,see Fig. 11.

To directly estimate the number of founder clones per follicle, the size distribution

of the CDR3 regions of the rearranged IgH genes in B cells isolated from individual

follicles were analysed. A small number of different PCR products were generated from

the ileal follicles, in comparison with reactions from blood cells (III / Fig. 3) or from the

jejunal or splenic follicles (data not shown).

To  investigate  the  significance  of  the  ileal  PP  for  the  bovine  peripheral  B

lymphocyte pool, we compared the frequencies of bull­derived cells in freemartin B

cells, T cells and other leukocytes isolated from blood and various lymphoid tissues. In

2 freemartins (designated as FmC and FmD) of the 16 analysed, a striking difference in

the bull contribution was observed between blood B and T cells. The proportion of Y+

cells was only 8% and 9% among B lymphocytes, but as much as 90% and 63% in T

lymphocytes (IV / Fig. 1). Slightly less pronounced yet substantial differences were also

seen in two other calves. In the first two calves, FmC and FmD, the values remained

stable for a follow­up period of 9 months (IV / Fig. 3). They were also essentially the

same in lymphocytes isolated from the lymph nodes and spleen, and in T cells from the

thymus (IV / Fig. 5). This was reflected by Y chromosome ISH staining of lymphoid

tissue sections, where high numbers of Y+ cells were seen in T cell­rich areas, while B

cell follicles were mostly devoid of them (IV). In the ileal PP of these animals, the great

majority  of  follicles  were  dominated  by  female  cells.  The  bull  contribution  to

granulocytes and monocytes closely matched that of T cells (Fig. IV / Fig. 4). The twin

Generation of a polyclonal anti­bovine CD34 antibody

47

brother of one of these freemartins was also examined, and similar proportions of Y+

cells were found in the various leukocyte fractions and tissues (IV / Fig. 4).

7.5. Generation of a polyclonal anti­bovine CD34 antibody (V)

To facilitate a direct analysis of the bull contribution to various stem cell populations in

freemartins, we set out to generate antibodies against the bovine CD34, one of the most

widely used markers for hematopoietic stem and progenitor cells in other species

(Krause et al., 1996).

7.5.1. Cloning of bovine CD34 cDNA

RT­PCR of bone marrow mononuclear cell total RNA yielded cDNA clones with a 1149­

bp open reading frame. A sequence identical to the previously published bovine CD34

cDNA (Zhou et al., 2001a) was assembled, except for a difference of one nucleotide

(T781  C), changing one amino acid in the polypeptide (Trp261  Arg). This position

was identical in all of our clones. A C781 was identified in all samples analysed from 49

animals, representing 9 different cattle breeds (Finnish Ayrshire, Finnish Holstein­

Friesian, Eastern Finncattle, Northern Finncattle, Western Finncattle, Icelandic cattle,

Doela cattle, Danish Red, and Japanese black cattle). This also is in agreement with the

cattle genomic data in GenBank (accession NW_929130).

7.5.2. Expression of CD34 polypeptide fragments

The partial extracellular domain and the cytoplasmic domain of the CD34 polypeptide

were successfully expressed in E. coli, while the complete extracellular domain was

insoluble. The His­tagged polypeptides were adequately purified by metal affinity

chromatography, as shown by SDS­PAGE (for the partial extracellular domain, see Fig.

13).  Mass  spectrometry  indicated  the  expected  fragment  sizes,  and  N­terminal

sequencing confirmed that the periplasmic signal peptide introduced by the expression

vector was correctly cleaved.

7.5.3. Production and characterization of a polyclonal antibody

A useful rabbit polyclonal antibody against the bovine CD34 was obtained with the

partial extracellular domain of the polypeptide. The antibody was affinity­purified and

Results

48

tested in Western blots and immunostaining of cytocentrifuge preparates and tissue

sections.

The antibody, designated as boCD34ecf, recognized a protein of predicted size in

Western blots, showing broad and hazy bands characteristic of heavily glycosylated

membrane proteins (V / Fig. 4). An expected staining pattern, with positively labelled

blood  vessels,  was  also  seen  in  immunostained  paraformaldehyde­fixed  paraffin

sections (V / Fig. 5); a heat­induced antigen retrieval in an acid buffer and a mild

protease treatment were necessary. Some unspecific staining was observed, most

intensely in erythrocytes and the epidermis. The antibody did not label living cells.

Thus, it could not be used in fluorescence activated cell sorting.

Figure 13. Purification of the His­tagged extracellular fragment of the CD34 polypeptideby metal affinity chromatography, as seen in SDS­PAGE.

Crude culture medium (med), unbound fraction (ub) and fractions elutedwith 10, 20 and 250 mM imidazole are shown. STD: size standard (bandsizes shown in kDa).

7.6. Expression of CD34 mRNA and protein in bovine tissues (V)

We characterized the expression of CD34 mRNA in bovine tissues, and used the

boCD34ecf antibody to investigate the expression at the protein level.

CD34 mRNA was detected by RT­PCR in all tissues analysed, including blood

leukocytes (V). Two products of expected sizes were obtained, confirming the existence

of two splice variants as predicted by analysis of genomic data. Tyramide amplified in

situ hybridization showed CD34 mRNA in vascular endothelia (V / Fig. 5O) and

fibroblast­like connective tissue cells.

In Western blots, the approximate molecular weight of the bovine CD34 was 105­

115 kDa in the lung and lymph nodes, and 125­132 kDa in lysates of the brain, muscle,

spleen and bone marrow cells enriched for lineage marker negative cells (V / Fig. 4). In

Expression of CD34 mRNA and protein in bovine tissues

49

the testis, two bands were present, with sizes of around 118 and 150 kDa. The

expression was weak in lymph nodes and the spleen. All of these bands were blocked

by free antigen (shown in V).

To further investigate the distribution of the CD34 protein in bovine tissues, double

immunofluorescence staining using boCD34ecf and the endothelial marker lectin GSL

I­B4 was applied. Vascular endothelia were widely labelled by the antibody (V / Fig. 5).

The staining was generally strongest in blood capillary endothelium, which was CD34

positive in all tissues examined. The endothelium of hepatic sinuses was negative (V).

In larger blood vessels, the expression of CD34 was variable and generally weaker. The

endocardial  endothelium  was  also  weakly  boCD34ecf  positive.  In  contrast,  all

histologically identifiable lymphatic vessels were negative for CD34 (V / Fig. 5D, E).

In cytocentrifuge preparates of bone marrow mononuclear cells, around 7.5% of the

cells were positive for boCD34ecf immunofluorescence (V). The proportion of labelled

cells was increased by enrichment for lineage negative cells (using antibodies against

CD3, IgM, CD14, CD41/61, IgG, granulocytes and red blood cells).

In addition to endothelia and primitive hematopoietic cells, certain other cell

populations were stained by the antibody. Smooth muscle in most vessel walls and

other tissues was strongly positive in the immunofluorescent staining with boCD34ecf.

Large numbers of fibroblast­like cells were labelled in connective tissues (V / Fig. 5B, D,

I). In the brain, cytoplasmic staining was seen in subpopulations of neurons, such as

the cerebellar Purkinje cells and rare neurons in the thalamus and olfactory bulb.

Thymic  epithelioreticular  cells  were  stained  (shown  in  V).  In  addition,

immunofluorescence labelling was associated with spermatids in the seminiferous

tubules, but not with mature spermatozoa or earlier phases of spermatogenesis (V / Fig.

5I, L). In all of these tissues, the staining was blocked with the antigenic polypeptide.

For maximal specificity,  the tissues  were  also stained using  tyramide amplified

immunohistochemistry, which allows very dilute solutions of antibodies. By this

method, endothelia and fibroblasts were strongly labelled, but most smooth muscle was

negative or weakly stained, and no boCD34ecf staining could be seen in neurons (V /

Fig. 5A), epithelioreticulocytes and spermatids.

In bovine fetuses of the second trimester (110­180 days of gestation), vascular

endothelia were generally intensely stained in immunofluorescence. Liver sinusoids

were negative, as in adult tissues. Large numbers of individual cells were labelled in

fetal liver (V / Fig. 5H).

50

8. Discussion

8.1. Differentiation potential of somatic cells in adult cattle

At the time that this work was started, transplanted bone marrow was reported to

generate non­hematopoietic tissues in mice (Ferrari et al., 1998; Petersen et al., 1999).

We  set  out  to  investigate  somatic  stem  cell  differentiation  potential  in  an

unmanipulated large mammal. Chimeric cattle twins are a unique model for this

purpose; placental anastomosis allows mixing of blood for most of the fetal period,

resulting in high­level hematopoietic chimerism (Lillie, 1917; Owen, 1945; II­IV). The

permanent nature of the chimerism proves the exchange of hematopoietic stem cells

(HSCs)  by  the  strictest  criteria  applied  in  any  model  system,  the  long­term

repopulation, although no specific markers for cattle HSCs are available. In addition,

other stem cell populations circulating in the fetal blood are likely to be exchanged,

such as the mesenchymal stem cells (MSCs; Campagnoli et al., 2001); this was not

directly assayed in the present work. The sibling­derived cells observed in twin cattle

thus are the progeny of HSCs and any other cells received during the fetal period.

Due to the probable heterogeneous nature of this originating population, the twins

cannot be used to confirm true plasticity of any somatic stem cell type. Rather, they

may provide information on the differentiation potential of circulating somatic stem

cells at a general level, or potentially reject the plasticity of any stem cell type. This

may seem a drawback compared with the commonly used mouse models. However, the

isolation of absolutely pure and homogenous stem cell populations is uncertain, a

matter of methodological definition, even in mice (Osawa et al., 1996; Wagers and

Weissman, 2004). Processes of tissue maintenance and regeneration in small short­lived

rodents may differ from those in large animals, and manipulations necessary for the

induction of artificial chimerism may affect the results. Thus, naturally chimeric cattle

twins valuably complement the data obtained in mouse experiments and clinical

human transplantations.

8.1.1. Evaluation of methods

Y chromosome­specific in situ hybridization (ISH) was shown to be a powerful method

for tracing the bull­derived cells in freemartin tissues. In contrast to cytogenetic

Differentiation potential of somatic cells in adult cattle

51

techniques previously used (Wilkes et al., 1981), ISH is not restricted to dividing cells,

and tissue structure is preserved. The method was demonstrated to be highly specific

and sufficiently sensitive (II, III). The high signal intensity allowed rapid screening of

large  numbers  of  cells.  Furthermore,  quantification  of  bull­derived  cells  on

cytocentrifuge preparates was highly accurate (IV).

Identification of the phenotypes of donor­derived cells is complicated by the narrow

range of markers available for cattle research, as compared with mouse or human tools.

In the present work, we were able to assemble a panel of antibodies and lectins

allowing identification of all major differentiated cell types in paraffin sections of

bovine tissues (I). While only some of them were fully exploited in the context of this

work, they provide a basis for further investigations. Few bovine stem cell markers are

available. Hence, we generated the first anti­bovine CD34 antibodies, as discussed

below.

 Ordinary transmitted light microscopy was used to analyse the localization of the

genetic and phenotypic markers. Serial sectioning or confocal microscopy is generally

regarded as necessary for unambiguous marker colocalization.  In this work, however,

the double staining for the Y chromosome and hematopoietic markers was used as

negative selection, to identify the non­hematopoietic bull­derived cells (II). Possible

false positives thus did not affect the results essentially.

Cell fusion has recently been implicated as a major cause of apparent plasticity

(Wagers and Weissman, 2004). Multinucleated foreign body giant cells with both Y

chromosome­positive and ­negative nuclei were seen in the granulation tissue (II).

However, our attempts of assaying nuclear fusion events between bull­derived cells and

female cells were unsuccessful due to technical limitations in the labelling of other

chromosomes  (unpublished observations). Chromosomal  probes  suitable  for  such

experiments should be developed in the future.

8.1.2. Implications of bull­derived cells in freemartin tissues

An abundance of bull­derived (Y+) cells was observed in most freemartin tissues,

including the intestinal mucosa, liver, and brain (II­IV). However, double staining with

hematopoietic  markers  indicated  that  a  vast  majority  of  them  were  infiltrating

leukocytes (II). In most cases, clearly less than 1% of all non­hematopoietic (CD45/ML­

I– Y+) cells in a tissue were of bull origin. The lack of donor contribution was especially

Discussion

52

striking in the central nervous system, although a significant proportion of microglia

were bull­derived. This contrasts with several reports of bone marrow cells generating

neurons (Mezey et al., 2000; Brazelton et al., 2000; Priller et al., 2001). Less than

0.005% of all non­hematopoietic cells were Y+ in the cerebral cortex. The hippocampus

and the olfactory bulb are involved in the generation of new neurons in adult mammals

(Altman and Das, 1965; Lois and Alvarez­Buylla, 1994); not a single bull­derived non­

hematopoietic cell was detected in these areas. No groups of non­hematopoietic Y+ cells

indicating local clonal expansion were seen in any tissues in the majority of calves.

One of the freemartins (FM10) showed an exceptionally high frequency of donor­

derived cells in several tissues, especially in the intestinal mucosa and the mammary

gland, but not in the brain or the renal epithelia (II). In the intestinal villi, strands of

CD45–Y+ cells were observed, suggesting that some of the crypt stem cells were bull­

derived. This was surprising, as the intestinal epithelium is thought to be derived from

the primitive gut endoderm (Trier and Moxey, 1979; Ponder et al., 1985). A similar

engraftment has, however, been reported with intravenously injected multipotent adult

progenitor cells (MAPCs) in immunodeficient mice (Jiang et al., 2002a). On the other

hand, the mammary gland is a highly plastic organ, theoretically a candidate target for

circulating stem cells. In the infertile freemartins, however, the glands obviously are

not engaged in the cyclic expansion and involution associated with pregnancy and

lactation.

The reasons for the remarkable donor contribution in the single freemartin (1 of 12)

are unknown. It was of the same breed as the majority of the other freemartins. While it

was the oldest animal examined (20 months), the difference in age to the closest cases

was modest (only 4 and 6 months). The animal was apparently healthy (unpublished

observations), but an earlier insult on the intestinal epithelium or other tissues could

have gone undetected. Genetic deficiencies in the freemartin cells could provide donor

cells with a competitive advantage in some tissues; in absence of such data, this

remains speculative. A very early formation of vascular anastomoses in the fetus might

result in an exchange of more multipotent primitive cells than available later, but this is

unlikely to occur, as discussed in study II. Instead, a rare fusion of early embryos could

result in substantial chimerism in random tissues. The Y+ cells in FM10 could originate

from either the surviving twin brother, or a third embryo lost before birth. In the first

case, the embryonic event would be impossible to retrospectively distinguish from the

effects of placental anastomosis, whereas triplets would be detectable by careful genetic

Differentiation potential of somatic cells in adult cattle

53

analysis. Intriguingly, spontaneous chimerism resulting from embryonic cell exchange

was recently proposed to have a 10% incidence in humans (Boklage, 2006). The high

bull contribution in FM10 may thus be explained by factors other than placental

anastomoses.

Our results indicate that HSCs (and any other somatic cell type circulating in the

fetal blood) generally do not produce significant numbers of non­hematopoietic cells in

the development, growth or turnover of bovine tissues. HSC plasticity does not appear

as a major physiological phenomenon, and the same is probably true for MSCs. It is

possible that a stronger contribution of donor­derived cells would be seen in aged

animals. However, this is unlikely, as no obvious correlation was observed between age

and the level of chimerism in calves from 20 days to 20 months old (II).

In contrast, the progeny of circulating cells may be important in tissue repair and

regeneration. To begin to investigate such processes in cattle, we induced the formation

of granulation tissue in subcutaneous cellulose viscose implants (II). The proportion of

non­hematopoietic Y+ cells was markedly high in the newly forming granulation tissue,

and increased over time. Apparently, cells are recruited from the circulation or adjacent

tissues, from a population with a higher frequency of Y+ cells than in the intact

subcutaneous tissue. They probably do not proliferate extensively, as no clusters of

bull­derived cells were seen. The origin of cells in granulation tissue is controversial,

with evidence for both local (Ross et al., 1970; Rangan, 1967) and systemic (Petrakis et

al., 1961) sources. Peripheral blood cells positive for vimentin, fibronectin, collagen,

CD45 and CD34 have been implicated in tissue repair (Abe et al., 2001). They could be

derived  from  the  HSCs,  a  major  proportion  of  which  must  be  bull­derived  in

freemartins. In the present study, though, the leukocyte lineages were excluded due to

the CD45 expression, unless it is downregulated after extravasation. MSCs would be

another candidate source, although the frequency of Y+ cells in this population has not

been determined.

Notably, the relatively short follow­up time of 4 weeks does not allow us to

conclude that the donor­derived cells stay in the repaired tissue permanently. Instead,

they may be accessory cells transiently promoting the repair process. Compatible with

this hypothesis, the frequency of Y+ cells around the fully healed ear tag holes was

comparable with that of the surrounding tissues (unpublished observations).

 No comprehensive analysis with various cell type­specific markers was carried out

in this work due to the generally low frequencies of donor­derived cells. Thus, the exact

Discussion

54

phenotypes of the CD45/ML­I–Y+ cells in freemartin tissues were not determined. The

morphology and spatial organization of donor­derived non­hematopoietic cells suggest,

however, that they are primarily fibroblast­like cells, pericytes, possibly myocytes

and/or associated satellite cells, and occassional epithelial cells (II). No cells with an

unambiguously endothelial phenotype were found. A majority of the donor­derived

non­hematopoietic cells may represent interstitial cell populations, and integration into

parenchymal populations appears rare. The phenotypes of Y+ cells in the granulation

tissue will be characterized in the future.

The results from the present work are in agreement with several recent reports

questioning the plasticity of HSCs and other bone marrow cells (Castro et al., 2002;

Massengale et al., 2005; Roybon et al., 2006; Wagers et al., 2002; Murry et al., 2004). In

other studies, markedly higher contribution of transplants to non­hematopoietic tissues

was observed, as discussed in the literature review. Especially in the central nervous

system, engraftment rates in our material were strikingly lower than those reported in

some earlier  experiments. These disparities may be explained by  the effects  of

transplantation procedures,  such  as radiation  damage  to  the  blood­brain barrier,

variable criteria for defining the donor­derived cells or species differences. The MAPCs,

convincingly documented as highly multipotent (Jiang et al., 2002a), may not have been

exchanged through fetal blood, although this would be expected due to the probable

MSC circulation. Alternatively, they could indeed be non­existent in vivo, arising

through the culture methods used to isolate them.

Our results do, however, support the findings that injury stimulates the contribution

of bone marrow to non­hematopoietic tissues, at least in the short term (Petersen et al.,

1999; LaBarge and Blau, 2002; Okamoto et al., 2002). Due to the very restricted sample

size in this work, these processes in freemartins warrant further investigation.

The low level of chimerism in non­hematopoietic tissues of freemartins should

enable the transplantation and follow­up of such cells or tissues from their male twins,

naturally tolerated by the recipient. The cattle twins may thus be used as a large animal

model for investigations of non­hematopoietic stem cell systems.

Role of the ileal Peyer’s patch in generation of the B cell pool in cattle

55

8.2. Role of the ileal Peyer’s patch in generation of the B cell pool incattle

In study III, we report that the bovine ileal Peyer’s patch follicles are oligoclonal. This

was clearly shown by the discontinuous variation in the proportion of Y+ cells in the

ileal Peyer’s patch follicles, together with the small number of different PCR products of

the rearranged IgH loci obtained from single follicles. Apparently, each follicle is

founded by a few B cells only, and later entry is prevented, as the oldest animals in the

study  were  about  1.5  years  of  age.  Theoretically,  a  restricted  CDR3  length

polymorphism could be produced by an intense selection process, but this would

probably not affect the distribution of bull­derived cells in the observed manner. In

contrast, oligoclonality of lymphoid follicles was not observed in the jejunal PPs or

other lymphoid organs.

Surprisingly, a very uneven bull contribution to B and T lymphocytes was found in

some freemartins (IV). In the two animals studied in detail, the proportion of Y+ cells in

B cells was drastically lower than in T cells and other leukocyte populations. The

difference was uniform in all lymphocyte compartments and stable for at least 9

months.

The mechanisms establishing and maintaining the disparity are unclear. The

common dominance of either bull or cow cells throughout the hematopoietic system of

freemartins  may  be  explained  by  subtle  differences  in  the  speed  of early  fetal

development. Fetal liver is colonized by HSCs around days 27­32 of gestation (Rüsse,

1991). This coincides with the earliest vascular anastomoses detected at about day 30,

immediately accompanied by chimerism in the liver (Ohno and Gropp, 1965). Cells

from a slightly more advanced fetus may thus have the opportunity to colonize the

whole conjoined system. However, the timing alone does not readily explain the minor

donor contribution specifically to the B cell pool. The bull­derived hematopoietic

progenitors may have had a weaker tendency to commit to the B lineage, or they could

have been less effective in the population of the PP follicles. Alternatively, they could

have been inferior in their capacity for rapid proliferation or for the survival of the

selection  processes.  Testing  these  hypotheses  would  require  the  isolation  of

uncommitted  progenitors  in  this  type  of  freemartins  and  their  brothers  and  a

comparison of their B cell generation potential in vitro or in transplantation models.

The observations are also compatible with a self­sufficient pool of cells committed

to the B lineage. The stability of the differences between lymphocyte populations may

Discussion

56

indicate that few B cells are continuously generated from HSCs or common lymphoid

progenitors in young cattle (see Fig. 1). As the majority of all other leukocytes

investigated  were  bull­derived,  the  donor  contribution  to  HSCs  was  probably

substantial. This would be expected also for de novo produced B cells, unless the B

lymphopoietic  potency  of  the  donor­derived  progenitors  is  persistently  severely

inferior.

Our  results  indicate  a  special role  for  the  ileal  PP in  the  production of  B

lymphocytes in cattle, and suggest that it may be responsible for the generation and

maintenance of the bovine peripheral B cell pool in juvenile animals. Moreover, the

limited number of IgH rearrangements in the PP follicles is compatible with the view

that cattle rely on post­rearrangement mechanisms in the generation of antibody

diversity. Thus, cattle appear largely similar to sheep with regard to strategies for B

lymphopoiesis. For a detailed description of bovine B lymphocyte ontogeny, further

studies are necessary. The sites where ruminant B cells are originally generated from

uncommitted precursors remain unknown. The production of B cells in aged cattle has

also not yet been investigated.

8.3. Generation of an anti­bovine CD34 antibody (V)

Direct investigation of various stem cell populations requires specific markers, which

are scarcely available for cattle. To expand the tool kit, the first antibodies against

bovine CD34 were generated in the present work. This sialomucin is commonly used as

a marker for purification of human hematopoietic HSCs (Krause et al., 1996). CD34­

enriched cells have also been reported to contribute to several non­hematopoietic

tissues (Krause et al., 2001). Although CD34 is hardly a perfect stem cell marker, as

discussed in the literature review, it certainly is one of the best known. Thus, it is a

reasonable starting point for stem cell investigations in cattle and provides a basis for

comparative studies. In addition, CD34 is useful as a vascular marker, being expressed

in endothelial cells from the earliest stages of development to adulthood (Young et al.,

1995).

Polypeptide fragments produced in E. coli were used as immunogens, although

bacteria are unable to produce the heavy glycosylation of the native CD34 protein

(Krause et al., 1996). The glycosylation is cell type­specific (Shailubhai et al., 1997), but

antibodies directed against the polypeptide backbone may recognize the protein in any

Expression of CD34 mRNA and protein in bovine tissues

57

cell. The extracellular polypeptide fragment yielded a polyclonal antibody, designated

boCD34ecf, which was found useful in Western blots, cytocentrifuge preparates, and

paraffin  sections.  However,  it  did not  label  living cells.  While  this  is a  major

shortcoming, such a reagent is still valuable for veterinary research and for the use of

cattle as a large animal model in stem cell and cardiovascular biology. In addition, the

polyclonal antibody will be helpful in the generation of monoclonal antibodies against

the glycosylated CD34 protein.

8.4. Expression of CD34 mRNA and protein in bovine tissues (V)

The expression of bovine CD34 was characterized at the mRNA level. The boCD34ecf

antibody was then used to investigate the previously unknown distribution of the CD34

protein in cattle tissues.

RT­PCR analysis of the CD34 mRNA expression confirmed that two splice variants

are expressed in cattle, as predicted by the genomic data. The cytoplasmic domain is

truncated in the alternatively spliced variant by an exon extension introducing a stop

codon. This is the case also in human (Nakamura et al., 1993) and mice (Suda et al.,

1992), but has not been demonstrated previously for cattle (Zhou et al., 2001a). Both

isoforms were detected in all tissues investigated. The method applied did not provide

reliable  quantitative  information.  However,  any  tissue­level  analysis  would

nevertheless primarily reflect vascular densities; based on in situ hybridization, the

majority of CD34 mRNA is produced by endothelial cells. Studying the expression

patterns of the two splice variants specifically in situ will be interesting. They may be

produced by different cell types or in different cellular states, thus reflecting the poorly

known physiological roles of CD34.

In Western blots, several forms of the bovine CD34 protein with different apparent

molecular weights (105­150 kDa) were detected, depending on the tissue. These

probably represent both alternatively spliced and variably glycosylated forms of the

protein.

Immunofluorescence staining showed the tissue distribution of the bovine CD34 to

be comparable with the other species investigated. The endothelium was positive in

most blood vessels, generally most intensely in the capillaries, arterioles and venules.

Hepatic sinusoids and lymphatic vessels were negative. BoCD34ecf staining was

enriched by lineage depletion of bone marrow mononuclear cells, suggesting CD34 as a

Discussion

58

marker of primitive hematopoietic cells also in cattle. Assaying CD34 expression in the

actual  HSCs  obviously  requires  the  isolation  of  live  cells  and  testing  of  their

differentiation and self­renewal capacity, impossible with the current antibody.

The  boCD34ecf  antibody  also  stained  fibroblast  subpopulations,  thymic

epithelioreticulocytes,  some  types  of  neurons  and  smooth  muscle.  These  have

previously been reported to express the CD34 protein in mice and humans (Lin et al.,

1995; Miettinen et al., 1994). Only the fibroblast staining could be reproduced in

tyramide amplified immunohistochemistry, where a more specific staining is expected

due to highly diluted antibodies. We also were unable to detect CD34 mRNA in the

other cells and tissues by tyramide amplified in situ hybridization. Although the CD34

protein is known to be more long­lived than the mRNA (Beauchamp et al., 2000), these

immunofluorescence results must be interpreted with caution. The antibody may

recognize a related, highly immunogenic epitope on another protein in the more

permissive conditions of non­amplified immunofluorescence stainings.

BoCD34ecf immunofluorescence was associated with late spermatids in the walls of

seminiferous tubules. The spermatid tails were apparently labelled, although it is not

possible to distinguish these from the surrounding Sertoli cells at the level of resolution

provided by standard epifluorescence microscopy. Mature spermatozoa in the lumen

were negative, as were the sections of the tubules without spermatids. The CD34 ligand

L­selectin (Baumheter et al., 1993) has been reported in rat Sertoli cells (Freeman et al.,

2002). It is tempting to speculate that CD34 may have a role in cell adhesion and

control  of  differentiation  at  the  late  stages  of  spermatogenesis,  as  it  does  in

hematopoietic progenitors and muscle satellite cells (Majdic et al., 1994; Healy et al.,

1995; Hu and Chien, 1998; Gordon et al., 2000; Beauchamp et al., 2000). However, the

findings could not be reproduced by tyramide amplified immunohistochemistry or

confirmed by in situ hybridization. Further studies are thus needed to validate the

immunofluorescence findings.

59

9. Conclusions

a) The chimeric freemartin cattle are a useful large animal model for somatic

stem cell research.

b) Y chromosome in situ hybridization, combined with immunohistochemistry,

is a powerful method for analysing the contribution of bull­derived cells to

freemartin tissues.

c) Hematopoietic stem cells, and the progeny of other cell types circulating in

the fetal blood, do not generate significant numbers of non­hematopoietic

cells in the development, growth and physiological turnover of bovine

tissues.  However, they may be important in tissue repair and regeneration.

d) The  ileal  Peyer’s  patch  has  a  dominant  role  in  the  generation  and

maintenance of the bovine B lymphocyte pool, as it is thought to have in

sheep. Peripheral B cells are probably produced within the ileal Peyer’s

patch, rather than generated de novo from uncommitted bone marrow

precursors, at least in young animals. The oligoclonal nature of the Peyer’s

patch  follicles  suggests  that  cattle  rely  largely  on  post­rearrangement

strategies in the diversification of immunoglobulins.

e) The  first anti­bovine CD34 antibody was produced in this  work. The

polyclonal  antibody  can  be  used  to  study  cattle  hematopoietic  and

cardiovascular systems in tissue sections, cytocentrifuge preparates and

Western blot. The bovine CD34 mRNA is alternatively spliced, and both

splice variants are widely expressed. The CD34 protein was detected in most

blood vessel endothelia, primitive hematopoietic cells and also in some non­

hematopoietic cells.

References

60

10. References

Abe,R., Donnelly,S.C., Peng,T., Bucala,R., and Metz,C.N. (2001). Peripheral blood fibrocytes:differentiation pathway and migration to wound sites. J. Immunol. 166, 7556­7562.

Abkowitz,J.L., Robinson,A.E., Kale,S., Long,M.W., and Chen,J. (2003). Mobilization ofhematopoietic stem cells during homeostasis and after cytokine exposure. Blood 102, 1249­1253.

Adams,G.B., Chabner,K.T., Alley,I.R., Olson,D.P., Szczepiorkowski,Z.M., Poznansky,M.C.,Kos,C.H., Pollak,M.R., Brown,E.M., and Scadden,D.T. (2006). Stem cell engraftment at theendosteal niche is specified by the calcium­sensing receptor. Nature 439, 599­603.

Adolfsson,J., Mansson,R., Buza­Vidas,N., Hultquist,A., Liuba,K., Jensen,C.T., Bryder,D., Yang,L.,Borge,O.J., Thoren,L.A., Anderson,K., Sitnicka,E., Sasaki,Y., Sigvardsson,M., and Jacobsen,S.E.(2005). Identification of Flt3+ lympho­myeloid stem cells lacking erythro­megakaryocyticpotential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell 121, 295­306.

Ahn,S. and Joyner,A.L. (2005). In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells respondingto Sonic hedgehog. Nature 437, 894­897.

Akashi,K., He,X., Chen,J., Iwasaki,H., Niu,C., Steenhard,B., Zhang,J., Haug,J., and Li,L. (2003).Transcriptional accessibility for genes of multiple tissues and hematopoietic lineages ishierarchically controlled during early hematopoiesis. Blood 101, 383­389.

Akashi,K., Traver,D., Miyamoto,T., and Weissman,I.L. (2000). A clonogenic common myeloidprogenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature 404, 193­197.

Alonso,L. and Fuchs,E. (2003). Stem cells of the skin epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.100 Suppl 1, 11830­11835.

Altman,J. and Das,G.D. (1965). Autoradiographic and histological evidence of postnatalhippocampal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol. 124, 319­335.

Alvarez­Buylla,A., Garcia­Verdugo,J.M., and Tramontin,A.D. (2001). A unified hypothesis on thelineage of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 2, 287­293.

Alvarez­Buylla,A. and Lim,D.A. (2004). For the long run: maintaining germinal niches in theadult brain. Neuron 41, 683­686.

Alvarez­Dolado,M., Pardal,R., Garcia­Verdugo,J.M., Fike,J.R., Lee,H.O., Pfeffer,K., Lois,C.,Morrison,S.J., and Alvarez­Buylla,A. (2003). Fusion of bone­marrow­derived cells with Purkinjeneurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature 425, 968­973.

Anderson,D., Billingham,R.E., Lampkin,G.H., and Medawar,P.B. (1951). The use of skin graftingto distinguish between monozygotic and dizygotic twins in cattle. Heredity 5, 379­397.

Antonchuk,J., Sauvageau,G., and Humphries,R.K. (2002). HOXB4­induced expansion of adulthematopoietic stem cells ex vivo. Cell 109, 39­45.

Arai,F., Hirao,A., Ohmura,M., Sato,H., Matsuoka,S., Takubo,K., Ito,K., Koh,G.Y., and Suda,T.(2004). Tie2/angiopoietin­1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bonemarrow niche. Cell 118, 149­161.

Arnold,A., Cossman,J., Bakhshi,A., Jaffe,E.S., Waldmann,T.A., and Korsmeyer,S.J. (1983).Immunoglobulin­gene rearrangements as unique clonal markers in human lymphoid neoplasms.N. Engl. J. Med. 309, 1593­1599.

Asahara,T., Masuda,H., Takahashi,T., Kalka,C., Pastore,C., Silver,M., Kearne,M., Magner,M., andIsner,J.M. (1999). Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatalvasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ. Res. 85, 221­228.

Asakura,A. and Rudnicki,M.A. (2002). Side population cells from diverse adult tissues arecapable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339­1345.

Bailey,A.S., Jiang,S., Afentoulis,M., Baumann,C.I., Schroeder,D.A., Olson,S.B., Wong,M.H., andFleming,W.H. (2004). Transplanted adult hematopoietic stems cells differentiate into functionalendothelial cells. Blood 103, 13­19.

61

Batlle,E., Henderson,J.T., Beghtel,H., van den Born,M.M., Sancho,E., Huls,G., Meeldijk,J.,Robertson,J., van de Wetering,M., Pawson,T., and Clevers,H. (2002). Beta­catenin and TCFmediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression ofEphB/ephrinB. Cell 111, 251­263.

Baumheter,S., Singer,M.S., Henzel,W., Hemmerich,S., Renz,M., Rosen,S.D., and Lasky,L.A.(1993). Binding of L­selectin to the vascular sialomucin CD34. Science 262, 436­438.

Bayer,S.A. (1982). Changes in the total number of dentate granule cells in juvenile and adultrats: a correlated volumetric and 3H­thymidine autoradiographic study. Exp. Brain Res. 46, 315­323.

Beauchamp,J.R., Heslop,L., Yu,D.S., Tajbakhsh,S., Kelly,R.G., Wernig,A., Buckingham,M.E.,Partridge,T.A., and Zammit,P.S. (2000). Expression of CD34 and Myf5 defines the majority ofquiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221­1234.

Becker,A.J., McCulloch,E.A., and Till,J.E. (1963). Cytological demonstration of the clonal natureof spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature 197, 452­454.

Belluzzi,O., Benedusi,M., Ackman,J., and LoTurco,J.J. (2003). Electrophysiologicaldifferentiation of new neurons in the olfactory bulb. J. Neurosci. 23, 10411­10418.

Berens,S.J., Wylie,D.E., and Lopez,O.J. (1997). Use of a single VH family and long CDR3s in thevariable region of cattle Ig heavy chains. Int. Immunol. 9, 189­199.

Berenson,R.J., Bensinger,W.I., Hill,R.S., Andrews,R.G., Garcia­Lopez,J., Kalamasz,D.F., Still,B.J.,Spitzer,G., Buckner,C.D., Bernstein,I.D., and . (1991). Engraftment after infusion of CD34+marrow cells in patients with breast cancer or neuroblastoma. Blood 77, 1717­1722.

Beyaz,F. and Asti,R.N. (2004). Development of ileal Peyer's patches and follicle associatedepithelium in bovine foetuses. Anat. Histol. Embryol. 33, 172­179.

Bhatia,M., Bonnet,D., Murdoch,B., Gan,O.I., and Dick,J.E. (1998). A newly discovered class ofhuman hematopoietic cells with SCID­repopulating activity. Nat. Med. 4, 1038­1045.

Bhatia,M., Wang,J.C., Kapp,U., Bonnet,D., and Dick,J.E. (1997). Purification of primitive humanhematopoietic cells capable of repopulating immune­deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 94, 5320­5325.

Bickenbach,J.R. and Mackenzie,I.C. (1984). Identification and localization of label­retaining cellsin hamster epithelia. J. Invest. Dermatol. 82, 618­622.

Billingham,R.E., Brent,L., and Medawar,P.B. (1953). Actively acquired tolerance of foreign cells.Nature 172, 603­606.

Billingham,R.E., Lampkin,G.H., Medawar,P.B., and Williams,H.L. (1952). Tolerance tohomografts, twin diagnosis, and the freemartin condition in cattle. Heredity 6, 201­212.

Bissonnette,T.H. (1924). The development of the reproductive ducts and canals in the freemartinwith comparison of the normal. Am. J. Anat. 33, 267­345.

Bjerknes,M. and Cheng,H. (1999). Clonal analysis of mouse intestinal epithelial progenitors.Gastroenterology 116, 7­14.

Bjornson,C.R., Rietze,R.L., Reynolds,B.A., Magli,M.C., and Vescovi,A.L. (1999). Turning braininto blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science 283, 534­537.

Blanpain,C., Lowry,W.E., Geoghegan,A., Polak,L., and Fuchs,E. (2004). Self­renewal,multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.Cell 118, 635­648.

Blau,H.M., Brazelton,T.R., and Weimann,J.M. (2001). The evolving concept of a stem cell: entityor function? Cell 105, 829­841.

Bohm,M., Wieland,I., Schutze,K., and Rubben,H. (1997). Microbeam MOMeNT: non­contactlaser microdissection of membrane­mounted native tissue. Am. J. Anat. 151, 63­67.

Boklage,C.E. (2006). Embryogenesis of chimeras, twins and anterior midline asymmetries. Hum.Reprod. 21, 579­591.

References

62

Brazelton,T.R., Rossi,F.M., Keshet,G.I., and Blau,H.M. (2000). From marrow to brain: expressionof neuronal phenotypes in adult mice. Science 290, 1775­1779.

Brent,L. (1997). The discovery of immunologic tolerance. Hum. Immunol. 52, 75­81.

Brockes,J.P. and Kumar,A. (2002). Plasticity and reprogramming of differentiated cells inamphibian regeneration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 566­574.

Butler,H. and Juurlink,B.H.J. (1987). An atlas for staging mammalian and chick embryos. (BocaRaton: CRC Press).

Cairns,J. (1975). Mutation selection and the natural history of cancer. Nature 255, 197­200.

Cairns,J. (2002). Somatic stem cells and the kinetics of mutagenesis and carcinogenesis. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 10567­10570.

Calvi,L.M., Adams,G.B., Weibrecht,K.W., Weber,J.M., Olson,D.P., Knight,M.C., Martin,R.P.,Schipani,E., Divieti,P., Bringhurst,F.R., Milner,L.A., Kronenberg,H.M., and Scadden,D.T. (2003).Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 425, 841­846.

Camargo,F.D., Green,R., Capetanaki,Y., Jackson,K.A., and Goodell,M.A. (2003). Singlehematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates. Nat. Med. 9,1520­1527.

Campagnoli,C., Roberts,I.A., Kumar,S., Bennett,P.R., Bellantuono,I., and Fisk,N.M. (2001).Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first­ trimester fetal blood, liver,and bone marrow. Blood 98, 2396­2402.

Capel,B. and Coveney,D. (2004). Frank Lillie's freemartin: illuminating the pathway to 21stcentury reproductive endocrinology. J. Exp. Zoolog. A Comp. Exp. Biol. 301, 853­856.

Carlén,M., Cassidy,R.M., Brismar,H., Smith,G.A., Enquist,L.W., and Frisen,J. (2002). Functionalintegration of adult­born neurons. Curr. Biol. 12, 606­608.

Carleton,A., Petreanu,L.T., Lansford,R., Alvarez­Buylla,A., and Lledo,P.M. (2003). Becoming anew neuron in the adult olfactory bulb. Nat. Neurosci. 6, 507­518.

Castro,R.F., Jackson,K.A., Goodell,M.A., Robertson,C.S., Liu,H., and Shine,H.D. (2002). Failureof bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo. Science 297, 1299.

Challen,G.A. and Little,M.H. (2006). A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells 24,3­12.

Charbord,P., Tavian,M., Humeau,L., and Peault,B. (1996). Early ontogeny of the human marrowfrom long bones: an immunohistochemical study of hematopoiesis and its microenvironment.Blood 87, 4109­4119.

Cheshier,S.H., Morrison,S.J., Liao,X., and Weissman,I.L. (1999). In vivo proliferation and cellcycle kinetics of long­term self­renewing hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.96, 3120­3125.

Chiasson,B.J., Tropepe,V., Morshead,C.M., and van der Kooy,D. (1999). Adult mammalianforebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but onlysubependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462­4471.

Christensen,J.L., Wright,D.E., Wagers,A.J., and Weissman,I.L. (2004). Circulation andchemotaxis of fetal hematopoietic stem cells. PLos Biol. 2, E75.

Clarke,D.L., Johansson,C.B., Wilbertz,J., Veress,B., Nilsson,E., Karlstrom,H., Lendahl,U., andFrisen,J. (2000). Generalized potential of adult neural stem cells. Science 288, 1660­1663.

Clarke,M.F. and Fuller,M. (2006). Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell 124, 1111­1115.

Claudinot,S., Nicolas,M., Oshima,H., Rochat,A., and Barrandon,Y. (2005). Long­term renewal ofhair follicles from clonogenic multipotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 14677­14682.

Colter,D.C., Class,R., DiGirolamo,C.M., and Prockop,D.J. (2000). Rapid expansion of recyclingstem cells in cultures of plastic­adherent cells from human bone marrow. Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 97, 3213­3218.

63

Copp,A.J. (1995). Death before birth: clues from gene knockouts and mutations. Trends Genet.11, 87­93.

Corbel,S.Y., Lee,A., Yi,L., Duenas,J., Brazelton,T.R., Blau,H.M., and Rossi,F.M. (2003).Contribution of hematopoietic stem cells to skeletal muscle. Nat. Med. 9, 1528­1532.

Cotsarelis,G., Sun,T.T., and Lavker,R.M. (1990). Label­retaining cells reside in the bulge area ofpilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis.Cell 61, 1329­1337.

de Bari,C., Dell'Accio,F., Vanlauwe,J., Eyckmans,J., Khan,I.M., Archer,C.W., Jones,E.A.,McGonagle,D., Mitsiadis,T.A., Pitzalis,C., and Luyten,F.P. (2006). Mesenchymal multipotency ofadult human periosteal cells demonstrated by single­cell lineage analysis. Arthritis Rheum. 54,1209­1221.

de Bruijn,M.F., Speck,N.A., Peeters,M.C., and Dzierzak,E. (2000). Definitive hematopoietic stemcells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. EMBO J. 19, 2465­2474.

de Rooij,D.G. and Grootegoed,J.A. (1998). Spermatogonial stem cells. Curr. Opin. Cell Biol. 10,694­701.

Dennis,J.E. and Charbord,P. (2002). Origin and differentiation of human and murine stroma.Stem Cells 20, 205­214.

Deschaseaux,F. and Charbord,P. (2000). Human marrow stromal precursors are alpha 1 integrinsubunit­positive. J. Cell Physiol. 184, 319­325.

Dieterlen­Lièvre,F. and Martin,C. (1981). Diffuse intraembryonic hemopoiesis in normal andchimeric avian development. Dev. Biol. 88, 180­191.

Doetsch,F. (2003). A niche for adult neural stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 13, 543­550.

Doetsch,F., Caille,I., Lim,D.A., Garcia­Verdugo,J.M., and Alvarez­Buylla,A. (1999a).Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell 97, 703­716.

Doetsch,F., Garcia­Verdugo,J.M., and Alvarez­Buylla,A. (1999b). Regeneration of a germinallayer in the adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11619­11624.

Doetsch,F., Petreanu,L., Caille,I., Garcia­Verdugo,J.M., and Alvarez­Buylla,A. (2002). EGFconverts transit­amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells.Neuron 36, 1021­1034.

Doughri,A.M., Altera,K.P., and Kainer,R.A. (1972). Some developmental aspects of the bovinefetal gut. Zentralbl. Veterinarmed. A 19, 417­434.

Duncan,A.W., Rattis,F.M., DiMascio,L.N., Congdon,K.L., Pazianos,G., Zhao,C., Yoon,K.,Cook,J.M., Willert,K., Gaiano,N., and Reya,T. (2005). Integration of Notch and Wnt signaling inhematopoietic stem cell maintenance. Nat. Immunol. 6, 314­322.

Dunnwald,M., Tomanek­Chalkley,A., Alexandrunas,D., Fishbaugh,J., and Bickenbach,J.R.(2001). Isolating a pure population of epidermal stem cells for use in tissue engineering. Exp.Dermatol. 10, 45­54.

Durand,R.E. and Olive,P.L. (1982). Cytotoxicity, mutagenicity and DNA damage by Hoechst33342. J. Histochem. Cytochem. 30, 111­116.

Eakin,G.S. and Behringer,R.R. (2004). Diversity of germ layer and axis formation amongmammals. Semin. Cell Dev. Biol. 15, 619­629.

Eggan,K., Jurga,S., Gosden,R., Min,I.M., and Wagers,A.J. (2006). Ovulated oocytes in adult micederive from non­circulating germ cells. Nature 441, 1109­1114.

Ema,H. and Nakauchi,H. (2000). Expansion of hematopoietic stem cells in the developing liverof a mouse embryo. Blood 95, 2284­2288.

Eriksson,P.S., Perfilieva,E., Bjork­Eriksson,T., Alborn,A.M., Nordborg,C., Peterson,D.A., andGage,F.H. (1998). Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat. Med. 4, 1313­1317.

References

64

Esposito,M.S., Piatti,V.C., Laplagne,D.A., Morgenstern,N.A., Ferrari,C.C., Pitossi,F.J., andSchinder,A.F. (2005). Neuronal differentiation in the adult hippocampus recapitulatesembryonic development. J. Neurosci. 25, 10074­10086.

Evans,M.J. and Kaufman,M.H. (1981). Establishment in culture of pluripotential cells frommouse embryos. Nature 292, 154­156.

Falk,A. and Frisen,J. (2005). New neurons in old brains. Ann. Med. 37, 480­486.

Ferkowicz,M.J. and Yoder,M.C. (2005). Blood island formation: longstanding observations andmodern interpretations. Exp. Hematol. 33, 1041­1047.

Ferrari,G., Cusella­De Angelis,G., Coletta,M., Paolucci,E., Stornaiuolo,A., Cossu,G., andMavilio,F. (1998). Muscle regeneration by bone marrow­derived myogenic progenitors. Science279, 1528­1530.

Forbes,T. (1946). The origin of freemartin. Bull. Hist. Med. 20, 461­466.

Ford,C.E., Hamerton,J.L., Barnes,D.W., and Loutit,J.F. (1956). Cytological identification ofradiation­chimaeras. Nature 177, 452­454.

Fortunel,N.O., Otu,H.H., Ng,H.H., Chen,J., Mu,X., Chevassut,T., Li,X., Joseph,M., Bailey,C.,Hatzfeld,J.A., Hatzfeld,A., Usta,F., Vega,V.B., Long,P.M., Libermann,T.A., and Lim,B. (2003).Comment on " 'Stemness': transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells" and "astem cell molecular signature". Science 302, 393.

Freeman,E.A., Jani,P., and Millette,C.E. (2002). Expression and potential function of Rho familysmall G proteins in cells of the mammalian seminiferous epithelium. Cell Commun. Adhes. 9,189­204.

Friedenstein,A.J., Chailakhjan,R.K., and Lalykina,K.S. (1970). The development of fibroblastcolonies in monolayer cultures of guinea­pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet. 3,393­403.

Friedenstein,A.J., Chailakhyan,R.K., and Gerasimov,U.V. (1987). Bone marrow osteogenic stemcells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 20, 263­272.

Fuchs,E. and Segre,J.A. (2000). Stem cells: a new lease on life. Cell 100, 143­155.

Fuchs,E., Tumbar,T., and Guasch,G. (2004). Socializing with the neighbors: stem cells and theirniche. Cell 116, 769­778.

Gallacher,L., Murdoch,B., Wu,D.M., Karanu,F.N., Keeney,M., and Bhatia,M. (2000). Isolationand characterization of human CD34(­)Lin(­) and CD34(+)Lin(­) hematopoietic stem cells usingcell surface markers AC133 and CD7. Blood 95, 2813­2820.

Galli,R., Borello,U., Gritti,A., Minasi,M.G., Bjornson,C., Coletta,M., Mora,M., De Angelis,M.G.,Fiocco,R., Cossu,G., and Vescovi,A.L. (2000). Skeletal myogenic potential of human and mouseneural stem cells. Nat. Neurosci. 3, 986­991.

Garcia,A.D., Doan,N.B., Imura,T., Bush,T.G., and Sofroniew,M.V. (2004). GFAP­expressingprogenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain. Nat.Neurosci. 7, 1233­1241.

Garcia­Verdugo,J.M., Ferron,S., Flames,N., Collado,L., Desfilis,E., and Font,E. (2002). Theproliferative ventricular zone in adult vertebrates: a comparative study using reptiles, birds, andmammals. Brain Res. Bull. 57, 765­775.

Gardner,R.L. and Rossant,J. (1979). Investigation of the fate of 4­5 day post­coitum mouse innercell mass cells by blastocyst injection. J. Embryol. Exp. Morphol. 52, 141­152.

Gekas,C., eterlen­Lievre,F., Orkin,S.H., and Mikkola,H.K. (2005). The placenta is a niche forhematopoietic stem cells. Dev. Cell 8, 365­375.

Gerber,H.A., Morris,B., and Trevella,W. (1986). The role of gut­associated lymphoid tissues inthe generation of immunoglobulin­bearing lymphocytes in sheep. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 64( Pt 3), 201­213.

65

Giebel,B., Zhang,T., Beckmann,J., Spanholtz,J., Wernet,P., Ho,A.D., and Punzel,M. (2006).Primitive human hematopoietic cells give rise to differentially specified daughter cells upontheir initial cell division. Blood 107, 2146­2152.

Gilbert,S. (2006). Developmental biology. (Sunderland: Sinauer Associates).

Glick,B., Chang,T., and Jaap,G. (1956). The bursa of Fabricius and antibody production. PoultrySci. 35, 224­225.

Gong,J.K. (1978). Endosteal marrow: a rich source of hematopoietic stem cells. Science 199,1443­1445.

Goodell,M.A. (2003). Stem­cell "plasticity": befuddled by the muddle. Curr. Opin. Hematol. 10,208­213.

Goodell,M.A., Brose,K., Paradis,G., Conner,A.S., and Mulligan,R.C. (1996). Isolation andfunctional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp.Med. 183, 1797­1806.

Goodell,M.A., Rosenzweig,M., Kim,H., Marks,D.F., DeMaria,M., Paradis,G., Grupp,S.A.,Sieff,C.A., Mulligan,R.C., and Johnson,R.P. (1997). Dye efflux studies suggest that hematopoieticstem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat.Med. 3, 1337­1345.

Goodman,J.W. and Hodgson,G.S. (1962). Evidence for stem cells in the peripheral blood of mice.Blood 19, 702­714.

Gordon,J.I., Schmidt,G.H., and Roth,K.A. (1992). Studies of intestinal stem cells using normal,chimeric, and transgenic mice. FASEB J. 6, 3039­3050.

Gordon,M.Y., Marley,S.B., Davidson,R.J., Grand,F.H., Lewis,J.L., Nguyen,D.X., Lloyd,S., andGoldman,J.M. (2000). Contact­mediated inhibition of human haematopoietic progenitor cellproliferation may be conferred by stem cell antigen, CD34. Hematol. J. 1, 77­86.

Grant,M.B., May,W.S., Caballero,S., Brown,G.A., Guthrie,S.M., Mames,R.N., Byrne,B.J.,Vaught,T., Spoerri,P.E., Peck,A.B., and Scott,E.W. (2002). Adult hematopoietic stem cellsprovide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization. Nat. Med. 8, 607­612.

Griebel,P.J. and Hein,W.R. (1996). Expanding the role of Peyer's patches in B­cell ontogeny.Immunol. Today 17, 30­39.

Griebel,P.J., Kennedy,L., Graham,T., Davis,W.C., and Reynolds,J.D. (1992). Characterization ofB­cell phenotypic changes during ileal and jejunal Peyer's patch development in sheep.Immunology 77, 564­570.

Gronthos,S., Zannettino,A.C., Hay,S.J., Shi,S., Graves,S.E., Kortesidis,A., and Simmons,P.J.(2003). Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derivedfrom human bone marrow. J. Cell Sci. 116, 1827­1835.

Gross,C.G. (2000). Neurogenesis in the adult brain: death of a dogma. Nat. Rev. Neurosci. 1, 67­73.

Groszer,M., Erickson,R., Scripture­Adams,D.D., Dougherty,J.D., Le,B.J., Zack,J.A.,Geschwind,D.H., Liu,X., Kornblum,H.I., and Wu,H. (2006). PTEN negatively regulates neuralstem cell self­renewal by modulating G0­G1 cell cycle entry. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103,111­116.

Harrington,L. (2004). Does the reservoir for self­renewal stem from the ends? Oncogene 23,7283­7289.

Harvey,W. (1651). Exercitationes de generatione animalium: quibus accedunt quaedum departu, de membranis ac humoribus uteri et de conceptione. (London: Ent, Sir George).

Healy,L., May,G., Gale,K., Grosveld,F., Greaves,M., and Enver,T. (1995). The stem cell antigenCD34 functions as a regulator of hemopoietic cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92,12240­12244.

Hein,W.R., Dudler,L., and Mackay,C.R. (1989). Surface expression of differentiation antigens onlymphocytes in the ileal and jejunal Peyer's patches of lambs. Immunology 68, 365­370.

References

66

Herzog,E.L., Chai,L., and Krause,D.S. (2003). Plasticity of marrow­derived stem cells. Blood 102,3483­3493.

Hewicker­Trautwein,M., Schultheis,G., and Trautwein,G. (1996). Demonstration of amoeboidand ramified microglial cells in pre­ and postnatal bovine brains by lectin histochemistry. Anat.Anz. 178, 25­31.

Ho,A.D. (2005). Kinetics and symmetry of divisions of hematopoietic stem cells. Exp. Hematol.33, 1­8.

Hochedlinger,K. and Jaenisch,R. (2002). Monoclonal mice generated by nuclear transfer frommature B and T donor cells. Nature 415, 1035­1038.

Hopman,A.H., Ramaekers,F.C., and Speel,E.J. (1998). Rapid synthesis of biotin­, digoxigenin­,trinitrophenyl­, and fluorochrome­labeled tyramides and their application for In situhybridization using CARD amplification. J. Histochem. Cytochem. 46, 771­777.

Houssaint,E. (1981). Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of thehaemopoietic cell line. Cell Differ. 10, 243­252.

Hu,M.C. and Chien,S.L. (1998). The cytoplasmic domain of stem cell antigen CD34 is essentialfor cytoadhesion signaling but not sufficient for proliferation signaling. Blood 91, 1152­1162.

Huber,T.L., Kouskoff,V., Fehling,H.J., Palis,J., and Keller,G. (2004). Haemangioblast commitmentis initiated in the primitive streak of the mouse embryo. Nature 432, 625­630.

Hunter,J. (1779). Account of the Free Martin. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 69, 279­293.

Hüttmann,A., Duhrsen,U., Heydarian,K., Klein­Hitpass,L., Boes,T., Boyd,A.W., and Li,C.L.(2006). Gene expression profiles in murine hematopoietic stem cells revisited: analysis of cDNAlibraries reveals high levels of translational and metabolic activities. Stem Cells 24, 1719­1727.

Ikuta,K. and Weissman,I.L. (1992). Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c­kitbut do not depend on steel factor for their generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1502­1506.

Ishino,S., Kadota,K., Matsubara,Y., Agawa,H., and Matsui,N. (1991). Immunohistochemicalstudies on ontogeny of bovine lymphoid tissues. J. Vet. Med. Sci. 53, 877­882.

Ito,M., Liu,Y., Yang,Z., Nguyen,J., Liang,F., Morris,R.J., and Cotsarelis,G. (2005). Stem cells inthe hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat.Med. 11, 1351­1354.

Ito,T., Tajima,F., and Ogawa,M. (2000). Developmental changes of CD34 expression by murinehematopoietic stem cells. Exp. Hematol. 28, 1269­1273.

Ivanova,N.B., Dimos,J.T., Schaniel,C., Hackney,J.A., Moore,K.A., and Lemischka,I.R. (2002). Astem cell molecular signature. Science 298, 601­604.

Jackson,K.A., Mi,T., and Goodell,M.A. (1999). Hematopoietic potential of stem cells isolatedfrom murine skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 14482­14486.

Jacobson,L.O., Simmons,E.L., Marks,E.K., and Eldredge,J.H. (1951). Recovery from radiationinjury. Science 113, 510­511.

Janeway,C., Travers,P., Walport,M., and Shlomchik,M. (2001). Immunobiology. The immunesystem in health and disease. (New York: Garland Publishing).

Jang,Y.Y., Collector,M.I., Baylin,S.B., Diehl,A.M., and Sharkis,S.J. (2004). Hematopoietic stemcells convert into liver cells within days without fusion. Nat. Cell Biol. 6, 532­539.

Javazon,E.H., Beggs,K.J., and Flake,A.W. (2004). Mesenchymal stem cells: paradoxes ofpassaging. Exp. Hematol. 32, 414­425.

Jenne,C.N., Kennedy,L.J., McCullagh,P., and Reynolds,J.D. (2003). A new model of sheep Igdiversification: shifting the emphasis toward combinatorial mechanisms and away fromhypermutation. J. Immunol. 170, 3739­3750.

Jenne,C.N., Kennedy,L.J., and Reynolds,J.D. (2006). Antibody repertoire development in thesheep. Dev. Comp. Immunol. 30, 165­174.

67

Jiang,Y., Jahagirdar,B.N., Reinhardt,R.L., Schwartz,R.E., Keene,C.D., Ortiz­Gonzalez,X.R.,Reyes,M., Lenvik,T., Lund,T., Blackstad,M., Du,J., Aldrich,S., Lisberg,A., Low,W.C.,Largaespada,D.A., and Verfaillie,C.M. (2002a). Pluripotency of mesenchymal stem cells derivedfrom adult marrow. Nature 418, 41­49.

Jiang,Y., Vaessen,B., Lenvik,T., Blackstad,M., Reyes,M., and Verfaillie,C.M. (2002b). Multipotentprogenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp.Hematol. 30, 896­904.

Johnson,G.R. and Moore,M.A. (1975). Role of stem cell migration in initiation of mouse foetalliver haemopoiesis. Nature 258, 726­728.

Johnson,J., Bagley,J., Skaznik­Wikiel,M., Lee,H.J., Adams,G.B., Niikura,Y., Tschudy,K.S.,Tilly,J.C., Cortes,M.L., Forkert,R., Spitzer,T., Iacomini,J., Scadden,D.T., and Tilly,J.L. (2005).Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow andperipheral blood. Cell 122, 303­315.

Jones,P.H., Harper,S., and Watt,F.M. (1995). Stem cell patterning and fate in human epidermis.Cell 80, 83­93.

Jones,R.J., Wagner,J.E., Celano,P., Zicha,M.S., and Sharkis,S.J. (1990). Separation of pluripotenthaematopoietic stem cells from spleen colony­forming cells. Nature 347, 188­189.

Joseph,N.M. and Morrison,S.J. (2005). Toward an understanding of the physiological function ofmammalian stem cells. Dev. Cell 9, 173­183.

Jost,A. (1970). Hormonal factors in the sex differentiation of the mammalian foetus. Philos.Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 259, 119­130.

Kale,S., Karihaloo,A., Clark,P.R., Kashgarian,M., Krause,D.S., and Cantley,L.G. (2003). Bonemarrow stem cells contribute to repair of the ischemically injured renal tubule. J. Clin. Invest112, 42­49.

Kaplan,M.S. and Bell,D.H. (1984). Mitotic neuroblasts in the 9­day­old and 11­month­old rodenthippocampus. J. Neurosci. 4, 1429­1441.

Karpowicz,P., Morshead,C., Kam,A., Jervis,E., Ramunas,J., Cheng,V., and van der Kooy,D.(2005). Support for the immortal strand hypothesis: neural stem cells partition DNAasymmetrically in vitro. J. Cell Biol. 170, 721­732.

Katayama,Y., Battista,M., Kao,W.M., Hidalgo,A., Peired,A.J., Thomas,S.A., and Frenette,P.S.(2006). Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egressfrom bone marrow. Cell 124, 407­421.

Kaushik,A., Shojaei,F., and Saini,S.S. (2002). Novel insight into antibody diversification fromcattle. Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 347­350.

Kayahara,T., Sawada,M., Takaishi,S., Fukui,H., Seno,H., Fukuzawa,H., Suzuki,K., Hiai,H.,Kageyama,R., Okano,H., and Chiba,T. (2003). Candidate markers for stem and early progenitorcells, Musashi­1 and Hes1, are expressed in crypt base columnar cells of mouse small intestine.FEBS Lett. 535, 131­135.

Kempermann,G., Jessberger,S., Steiner,B., and Kronenberg,G. (2004). Milestones of neuronaldevelopment in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447­452.

Khosrotehrani,K., Johnson,K.L., Cha,D.H., Salomon,R.N., and Bianchi,D.W. (2004). Transfer offetal cells with multilineage potential to maternal tissue. JAMA 292, 75­80.

Kiel,M.J., Yilmaz,O.H., Iwashita,T., Yilmaz,O.H., Terhorst,C., and Morrison,S.J. (2005). SLAMfamily receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelialniches for stem cells. Cell 121, 1109­1121.

Kingston,R.E., Chomczynski,P., and Sacchi,N. (1996). Guanidine methods for total RNApreparation. In Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M., Brent R, Kingston R.E.,D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, and K.Struhl, eds. (Hoboken, NJ: John Wiley & Sons).

Kondo,M., Wagers,A.J., Manz,M.G., Prohaska,S.S., Scherer,D.C., Beilhack,G.F., Shizuru,J.A., andWeissman,I.L. (2003). Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications forclinical application. Annu. Rev. Immunol. 21, 759­806.

References

68

Kopen,G.C., Prockop,D.J., and Phinney,D.G. (1999). Marrow stromal cells migrate throughoutforebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatalmouse brains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 10711­10716.

Körbling,M., Katz,R.L., Khanna,A., Ruifrok,A.C., Rondon,G., Albitar,M., Champlin,R.E., andEstrov,Z. (2002). Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral­blood stem cells. N. Engl. J. Med. 346, 738­746.

Korinek,V., Barker,N., Moerer,P., van Donselaar,E., Huls,G., Peters,P.J., and Clevers,H. (1998).Depletion of epithelial stem­cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf­4. Nat.Genet. 19, 379­383.

Koshizuka,S., Okada,S., Okawa,A., Koda,M., Murasawa,M., Hashimoto,M., Kamada,T.,Yoshinaga,K., Murakami,M., Moriya,H., and Yamazaki,M. (2004). Transplanted hematopoieticstem cells from bone marrow differentiate into neural lineage cells and promote functionalrecovery after spinal cord injury in mice. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63, 64­72.

Kotton,D.N., Fabian,A.J., and Mulligan,R.C. (2005). A novel stem­cell population in adult liverwith potent hematopoietic­reconstitution activity. Blood 106, 1574­1580.

Krause,D.S., Fackler,M.J., Civin,C.I., and May,W.S. (1996). CD34: structure, biology, and clinicalutility. Blood 87, 1­13.

Krause,D.S., Theise,N.D., Collector,M.I., Henegariu,O., Hwang,S., Gardner,R., Neutzel,S., andSharkis,S.J. (2001). Multi­organ, multi­lineage engraftment by a single bone marrow­derivedstem cell. Cell 105, 369­377.

Kukekov,V.G., Laywell,E.D., Suslov,O., Davies,K., Scheffler,B., Thomas,L.B., O'Brien,T.F.,Kusakabe,M., and Steindler,D.A. (1999). Multipotent stem/progenitor cells with similarproperties arise from two neurogenic regions of adult human brain. Exp. Neurol. 156, 333­344.

Kuznetsov,S.A., Mankani,M.H., Gronthos,S., Satomura,K., Bianco,P., and Robey,P.G. (2001).Circulating skeletal stem cells. J. Cell Biol. 153, 1133­1140.

LaBarge,M.A. and Blau,H.M. (2002). Biological progression from adult bone marrow tomononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. Cell 111,589­601.

Lagasse,E., Connors,H., Al Dhalimy,M., Reitsma,M., Dohse,M., Osborne,L., Wang,X.,Finegold,M., Weissman,I.L., and Grompe,M. (2000). Purified hematopoietic stem cells candifferentiate into hepatocytes in vivo. Nat. Med. 6, 1229­1234.

Lakshmipathy,U. and Verfaillie,C. (2005). Stem cell plasticity. Blood Rev. 19, 29­38.

Le Guern,A.C., Giovino,M.A., Abe,M., Theodore,P.R., Qi,J., Down,J.D., Sachs,D.H., Sykes,M.,and Yang,Y.G. (2003). Stem cell activity of porcine c­kit+ hematopoietic cells. Exp. Hematol. 31,833­840.

Lendahl,U., Zimmerman,L.B., and McKay,R.D. (1990). CNS stem cells express a new class ofintermediate filament protein. Cell 60, 585­595.

Leon,L.G., Ostronoff,L.K., Fermin,M.L., Fragio,C., Kremmer,E., Kolb,H.J., and Tejero,C. (2005). Invitro generation of mature neutrophils from canine Lin­ bone marrow cells. Vet. Immunol.Immunopathol. 107, 41­50.

Levy,V., Lindon,C., Harfe,B.D., and Morgan,B.A. (2005). Distinct stem cell populationsregenerate the follicle and interfollicular epidermis. Dev. Cell 9, 855­861.

Li,A., Simmons,P.J., and Kaur,P. (1998). Identification and isolation of candidate humankeratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3902­3907.

Lie,D.C., Colamarino,S.A., Song,H.J., Desire,L., Mira,H., Consiglio,A., Lein,E.S., Jessberger,S.,Lansford,H., Dearie,A.R., and Gage,F.H. (2005). Wnt signalling regulates adult hippocampalneurogenesis. Nature 437, 1370­1375.

Lillie,F.R. (1917). The free­martin; a study of the action of sex hormones in the foetal life ofcattle. J. Exp. Zool. 23, 371­452.

69

Lin,G., Finger,E., and Gutierrez­Ramos,J.C. (1995). Expression of CD34 in endothelial cells,hematopoietic progenitors and nervous cells in fetal and adult mouse tissues. Eur. J. Immunol.25, 1508­1516.

Lipinski,M.M. and Jacks,T. (1999). The retinoblastoma gene family in differentiation anddevelopment. Oncogene 18, 7873­7882.

Lois,C. and Alvarez­Buylla,A. (1993). Proliferating subventricular zone cells in the adultmammalian forebrain can differentiate into neurons and glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90,2074­2077.

Lois,C. and Alvarez­Buylla,A. (1994). Long­distance neuronal migration in the adult mammalianbrain. Science 264, 1145­1148.

Lorenz,E., Congdon,C., and Uphoff,D. (1952). Modification of acute irradiation injury in miceand guinea­pigs by bone marrow injections. Radiology 58, 863­877.

Lowden,S. and Heath,T. (1992). Lymph pathways associated with Peyer's patches in sheep. J.Anat. 181 ( Pt 2), 209­217.

Lucier,M.R., Thompson,R.E., Waire,J., Lin,A.W., Osborne,B.A., and Goldsby,R.A. (1998).Multiple sites of V lambda diversification in cattle. J. Immunol. 161, 5438­5444.

Luckey,C.J., Bhattacharya,D., Goldrath,A.W., Weissman,I.L., Benoist,C., and Mathis,D. (2006).Memory T and memory B cells share a transcriptional program of self­renewal with long­termhematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3304­3309.

Lyle,S., Christofidou­Solomidou,M., Liu,Y., Elder,D.E., Albelda,S., and Cotsarelis,G. (1998). TheC8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hairfollicle stem cells. J. Cell Sci. 111 ( Pt 21), 3179­3188.

Lyman,S.D. and Jacobsen,S.E. (1998). c­kit ligand and Flt3 ligand: stem/progenitor cell factorswith overlapping yet distinct activities. Blood 91, 1101­1134.

Mackenzie,I.C. (1997). Retroviral transduction of murine epidermal stem cells demonstratesclonal units of epidermal structure. J. Invest. Dermatol. 109, 377­383.

Maillard,I., Adler,S.H., and Pear,W.S. (2003). Notch and the immune system. Immunity 19, 781­791.

Majdic,O., Stockl,J., Pickl,W.F., Bohuslav,J., Strobl,H., Scheinecker,C., Stockinger,H., andKnapp,W. (1994). Signaling and induction of enhanced cytoadhesiveness via the hematopoieticprogenitor cell surface molecule CD34. Blood 83, 1226­1234.

Marcum,J. (1974). The freemartin syndrome. Anim. Breed. Abstr. 42, 227­242.

Massengale,M., Wagers,A.J., Vogel,H., and Weissman,I.L. (2005). Hematopoietic cells maintainhematopoietic fates upon entering the brain. J. Exp. Med. 201, 1579­1589.

Matsuzaki,Y., Kinjo,K., Mulligan,R.C., and Okano,H. (2004). Unexpectedly efficient homingcapacity of purified murine hematopoietic stem cells. Immunity 20, 87­93.

Maximow,A.A. (1906). Über experimentelle Erzeugung von Knochenmarks­Gewebe.Anatomischer Anzeiger 28, 609­612.

McGrath,K.E. and Palis,J. (2005). Hematopoiesis in the yolk sac: more than meets the eye. Exp.Hematol. 33, 1021­1028.

McKinney­Freeman,S.L., Jackson,K.A., Camargo,F.D., Ferrari,G., Mavilio,F., and Goodell,M.A.(2002). Muscle­derived hematopoietic stem cells are hematopoietic in origin. Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 99, 1341­1346.

Medvinsky,A. and Dzierzak,E. (1996). Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by theAGM region. Cell 86, 897­906.

Meletis,K., Wirta,V., Hede,S.M., Nister,M., Lundeberg,J., and Frisen,J. (2006). p53 suppresses theself­renewal of adult neural stem cells. Development 133, 363­369.

Mendes,S.C., Robin,C., and Dzierzak,E. (2005). Mesenchymal progenitor cells localize withinhematopoietic sites throughout ontogeny. Development 132, 1127­1136.

References

70

Mercier,F., Kitasako,J.T., and Hatton,G.I. (2002). Anatomy of the brain neurogenic zonesrevisited: fractones and the fibroblast/macrophage network. J. Comp. Neurol. 451, 170­188.

Merok,J.R., Lansita,J.A., Tunstead,J.R., and Sherley,J.L. (2002). Cosegregation of chromosomescontaining immortal DNA strands in cells that cycle with asymmetric stem cell kinetics. CancerRes. 62, 6791­6795.

Mezey,E., Chandross,K.J., Harta,G., Maki,R.A., and McKercher,S.R. (2000). Turning blood intobrain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science 290, 1779­1782.

Mezey,E., Key,S., Vogelsang,G., Szalayova,I., Lange,G.D., and Crain,B. (2003). Transplantedbone marrow generates new neurons in human brains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

Miettinen,M., Lindenmayer,A.E., and Chaubal,A. (1994). Endothelial cell markers CD31, CD34,and BNH9 antibody to H­ and Y­antigens ­ evaluation of their specificity and sensitivity in thediagnosis of vascular tumors and comparison with von Willebrand factor. Mod. Pathol. 7, 82­90.

Mikkers,H. and Frisen,J. (2005). Deconstructing stemness. Embo Journal 24, 2715­2719.

Mikkola,H.K. and Orkin,S.H. (2006). The journey of developing hematopoietic stem cells.Development 133, 3733­3744.

Min,H., Montecino­Rodriguez,E., and Dorshkind,K. (2006). Effects of aging on the commonlymphoid progenitor to pro­B cell transition. J. Immunol. 176, 1007­1012.

Ming,G.L. and Song,H. (2005). Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.Annu. Rev. Neurosci. 28, 223­250.

Modi,W.S., Gallagher,D.S., and Womack,J.E. (1993). Molecular organization and chromosomallocalization of six highly repeated DNA families in the bovine genome. Anim. Biotechnol. 4,143­161.

Moore,K.A. and Lemischka,I.R. (2006). Stem cells and their niches. Science 311, 1880­1885.

Morrison,S.J., Hemmati,H.D., Wandycz,A.M., and Weissman,I.L. (1995). The purification andcharacterization of fetal liver hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 10302­10306.

Morrison,S.J. and Kimble,J. (2006). Asymmetric and symmetric stem­cell divisions indevelopment and cancer. Nature 441, 1068­1074.

Morrison,S.J., Wandycz,A.M., Hemmati,H.D., Wright,D.E., and Weissman,I.L. (1997).Identification of a lineage of multipotent hematopoietic progenitors. Development 124, 1929­1939.

Morshead,C.M., Benveniste,P., Iscove,N.N., and van der Kooy,D. (2002). Hematopoieticcompetence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigeneticalterations. Nat. Med. 8, 268­273.

Motyka,B. and Reynolds,J.D. (1991). Apoptosis is associated with the extensive B cell death inthe sheep ileal Peyer's patch and the chicken bursa of Fabricius: a possible role in B cellselection. Eur. J. Immunol. 21, 1951­1958.

Muguruma,Y., Reyes,M., Nakamura,Y., Sato,T., Matsuzawa,H., Miyatake,H., Akatsuka,A., Itoh,J.,Yahata,T., Ando,K., Kato,S., and Hotta,T. (2003). In vivo and in vitro differentiation of myocytesfrom human bone marrow­derived multipotent progenitor cells. Exp. Hematol. 31, 1323­1330.

Muller­Sieburg,C.E., Whitlock,C.A., and Weissman,I.L. (1986). Isolation of two early Blymphocyte progenitors from mouse marrow: a committed pre­pre­B cell and a clonogenic Thy­1­lo hematopoietic stem cell. Cell 44, 653­662.

Murry,C.E., Soonpaa,M.H., Reinecke,H., Nakajima,H., Nakajima,H.O., Rubart,M.,Pasumarthi,K.B., Virag,J.I., Bartelmez,S.H., Poppa,V., Bradford,G., Dowell,J.D., Williams,D.A.,and Field,L.J. (2004). Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytesin myocardial infarcts. Nature 428, 664­668.

Nakamura,Y., Komano,H., and Nakauchi,H. (1993). Two alternative forms of cDNA encodingCD34. Exp. Hematol. 21, 236­242.

71

Nayernia,K., Lee,J.H., Drusenheimer,N., Nolte,J., Wulf,G., Dressel,R., Gromoll,J., and Engel,W.(2006). Derivation of male germ cells from bone marrow stem cells. Lab Invest 86, 654­663.

Neill,J.D., Ridpath,J.F., and Liebler­Tenorio,E. (2006). Global gene expression profiling of bovineimmature B cells using serial analysis of gene expression. Anim. Biotechnol. 17, 21­31.

Nottebohm,F. (2004). The road we travelled: discovery, choreography, and significance of brainreplaceable neurons. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1016, 628­658.

Nowell,P.C., Cole,L.J., Habermeyer,J.G., and Roan,P.L. (1956). Growth and continued function ofrat marrow cells in x­radiated mice. Cancer Res. 16, 258­261.

Nunez,C., Nishimoto,N., Gartland,G.L., Billips,L.G., Burrows,P.D., Kubagawa,H., andCooper,M.D. (1996). B cells are generated throughout life in humans. J. Immunol. 156, 866­872.

Ogawa,M. (1993). Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood 81, 2844­2853.

Ohno,S. and Gropp,A. (1965). Embryological basis for germ cell chimerism in mammals.Cytogenetics. 4, 251­261.

Okamoto,R., Yajima,T., Yamazaki,M., Kanai,T., Mukai,M., Okamoto,S., Ikeda,Y., Hibi,T.,Inazawa,J., and Watanabe,M. (2002). Damaged epithelia regenerated by bone marrow­derivedcells in the human gastrointestinal tract. Nat. Med. 8, 1011­1017.

Okuno,Y., Iwasaki,H., Huettner,C.S., Radomska,H.S., Gonzalez,D.A., Tenen,D.G., and Akashi,K.(2002). Differential regulation of the human and murine CD34 genes in hematopoietic stemcells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 6246­6251.

Orlic,D., Kajstura,J., Chimenti,S., Limana,F., Jakoniuk,I., Quaini,F., Nadal­Ginard,B.,Bodine,D.M., Leri,A., and Anversa,P. (2001). Mobilized bone marrow cells repair the infarctedheart, improving function and survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 10344­10349.

Osawa,M., Hanada,K., Hamada,H., and Nakauchi,H. (1996). Long­term lymphohematopoieticreconstitution by a single CD34­low/negative hematopoietic stem cell. Science 273, 242­245.

Ottersbach,K. and Dzierzak,E. (2005). The murine placenta contains hematopoietic stem cellswithin the vascular labyrinth region. Dev. Cell 8, 377­387.

Owen,R.D. (1945). Immunogenetic consequenses of vascular anastomoses between bovine twins.Science 102, 400­401.

Pabst,R. and Reynolds,J.D. (1986). Evidence of extensive lymphocyte death in sheep Peyer'spatches. II. The number and fate of newly­formed lymphocytes that emigrate from Peyer'spatches. J Immunol. 136, 2011­2017.

Pabst,R. and Reynolds,J.D. (1987). Peyer's patches export lymphocytes throughout the lymphoidsystem in sheep. J Immunol. 139, 3981­3985.

Padula,A.M. (2005). The freemartin syndrome: an update. Anim. Reprod. Sci. 87, 93­109.

Palmer,T.D., Takahashi,J., and Gage,F.H. (1997). The adult rat hippocampus contains primordialneural stem cells. Mol. Cell Neurosci. 8, 389­404.

Palmer,T.D., Willhoite,A.R., and Gage,F.H. (2000). Vascular niche for adult hippocampalneurogenesis. J. Comp. Neurol. 425, 479­494.

Parng,C.L., Hansal,S., Goldsby,R.A., and Osborne,B.A. (1996). Gene conversion contributes to Iglight chain diversity in cattle. J. Immunol. 157, 5478­5486.

Parsons,K.R., Sopp,P., Jones,B.V., Bland,P., and Howard,C.J. (1996). Identification of a moleculeuniquely expressed on a gamma/delta TCR+ subset within bovine intestinal intraepitheliallymphocytes. Immunology 87, 64­70.

Perret,J., Shia,Y.C., Fries,R., Vassart,G., and Georges,M. (1990). A polymorphic satellite sequencemaps to the pericentric region of the bovine Y chromosome. Genomics 6, 482­490.

Petersen,B.E., Bowen,W.C., Patrene,K.D., Mars,W.M., Sullivan,A.K., Murase,N., Boggs,S.S.,Greenberger,J.S., and Goff,J.P. (1999). Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells.Science 284, 1168­1170.

References

72

Petrakis,N.L., Lucia,S.P., and Davis,M. (1961). In vivo differentiation of human leukocytes intohistiocytes, fibroblasts and fat cells in subcutaneous diffusion chambers. Blood 17, 109­118.

Pittenger,M.F., Mackay,A.M., Beck,S.C., Jaiswal,R.K., Douglas,R., Mosca,J.D., Moorman,M.A.,Simonetti,D.W., Craig,S., and Marshak,D.R. (1999). Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells. Science 284, 143­147.

Ponder,B.A., Schmidt,G.H., Wilkinson,M.M., Wood,M.J., Monk,M., and Reid,A. (1985).Derivation of mouse intestinal crypts from single progenitor cells. Nature 313, 689­691.

Potten,C.S. (1998). Stem cells in gastrointestinal epithelium: numbers, characteristics and death.Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 353, 821­830.

Potten,C.S. (1975b). Epidermal cell production rates. J. Invest. Dermatol. 65, 488­500.

Potten,C.S. (1975a). Epidermal transit times. Br. J. Dermatol. 93, 649­658.

Potten,C.S., Booth,C., Tudor,G.L., Booth,D., Brady,G., Hurley,P., Ashton,G., Clarke,R.,Sakakibara,S., and Okano,H. (2003). Identification of a putative intestinal stem cell and earlylineage marker; musashi­1. Differentiation 71, 28­41.

Potten,C.S., Owen,G., and Booth,D. (2002). Intestinal stem cells protect their genome byselective segregation of template DNA strands. J. Cell Sci. 115, 2381­2388.

Press,C.M., McCullagh,P., and Landsverk,T. (2001). Effect of early fetal splenectomy on prenatalB­cell development in sheep. Immunology 102, 131­136.

Press,C.M., Reynolds,J.D., McClure,S.J., Simpson­Morgan,M.W., and Landsverk,T. (1996). Fetallambs are depleted of IgM+ cells following a single injection of an anti­IgM antibody early ingestation. Immunology 88, 28­34.

Priller,J., Persons,D.A., Klett,F.F., Kempermann,G., Kreutzberg,G.W., and Dirnagl,U. (2001).Neogenesis of cerebellar Purkinje neurons from gene­marked bone marrow cells in vivo. J. CellBiol. 155, 733­738.

Prise,K.M., Schettino,G., Folkard,M., and Held,K.D. (2005). New insights on cell death fromradiation exposure. Lancet Oncol. 6, 520­528.

Prockop,D.J. (1997). Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science276, 71­74.

Raff,M. (2003). Adult stem cell plasticity: fact or artifact? Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 1­22.

Ramalho­Santos,M., Yoon,S., Matsuzaki,Y., Mulligan,R.C., and Melton,D.A. (2002). "Stemness":transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells. Science 298, 597­600.

Rangan,S.R. (1967). Origin of the fibroblastic growths in chicken buffy coat macrophagecultures. Exp. Cell Res. 46, 477­487.

Ratcliffe,M.J. (2002). B cell development in gut associated lymphoid tissues. Vet. Immunol.Immunopathol. 87, 337­340.

Reya,T. and Clevers,H. (2005). Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 434, 843­850.

Reyes,M. and Verfaillie,C.M. (2001). Characterization of multipotent adult progenitor cells, asubpopulation of mesenchymal stem cells. Ann. N. Y. Acad. Sci. 938, 231­233.

Reynaud,C.A., Garcia,C., Hein,W.R., and Weill,J.C. (1995). Hypermutation generating the sheepimmunoglobulin repertoire is an antigen­independent process. Cell 80, 115­125.

Reynaud,C.A., Mackay,C.R., Muller,R.G., and Weill,J.C. (1991). Somatic generation of diversityin a mammalian primary lymphoid organ: the sheep ileal Peyer's patches. Cell 64, 995­1005.

Reynolds,B.A. and Weiss,S. (1992). Generation of neurons and astrocytes from isolated cells ofthe adult mammalian central nervous system. Science 255, 1707­1710.

Reynolds,B.A. and Weiss,S. (1996). Clonal and population analyses demonstrate that an EGF­responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1­13.

Reynolds,J. (1997). The genesis, tutelage and exodus of B cells in the ileal Peyer's patch of sheep.Int. Rev. Immunol. 15, 265­299.

73

Reynolds,J.D. (1986). Evidence of extensive lymphocyte death in sheep Peyer's patches. I. Acomparison of lymphocyte production and export. J Immunol. 136, 2005­2010.

Reynolds,J.D. (1987). Mitotic rate maturation in the Peyer's patches of fetal sheep and in thebursa of Fabricius of the chick embryo. Eur. J. Immunol. 17, 503­507.

Reynolds,J.D., Kennedy,L., Peppard,J., and Pabst,R. (1991). Ileal Peyer's patch emigrants arepredominantly B cells and travel to all lymphoid tissues in sheep. Eur. J. Immunol. 21, 283­289.

Reynolds,J.D. and Morris,B. (1983a). The influence of gut function on lymphoid cell populationsin the intestinal mucosa of lambs. Immunology 49, 501­509.

Reynolds,J.D. and Morris,B. (1984). The effect of antigen on the development of Peyer's patchesin sheep. Eur. J. Immunol. 14, 1­6.

Reynolds,J.D. and Morris,B. (1983b). The evolution and involution of Peyer's patches in fetal andpostnatal sheep. Eur. J. Immunol. 13, 627­635.

Rizvi,A.Z., Swain,J.R., Davies,P.S., Bailey,A.S., Decker,A.D., Willenbring,H., Grompe,M.,Fleming,W.H., and Wong,M.H. (2006). Bone marrow­derived cells fuse with normal andtransformed intestinal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6321­6325.

Rizvi,A.Z. and Wong,M.H. (2005). Epithelial stem cells and their niche: there's no place likehome. Stem Cells 23, 150­165.

Rochat,A., Kobayashi,K., and Barrandon,Y. (1994). Location of stem cells of human hair folliclesby clonal analysis. Cell 76, 1063­1073.

Ross,M., Kaye,G., and Pawlina,W. (2003). Histology. A text and atlas. (Baltimore: LippincotWilliams & Wilkins).

Ross,R., Everett,N.B., and Tyler,R. (1970). Wound healing and collagen formation. VI. The originof the wound fibroblast studied in parabiosis. J. Cell Biol. 44, 645­654.

Roybon,L., Ma,Z., Asztely,F., Fosum,A., Jacobsen,S.E., Brundin,P., and Li,J.Y. (2006). Failure oftransdifferentiation of adult hematopoietic stem cells into neurons. Stem Cells 24, 1594­1604.

Rüsse,I. (1991). Lehrbuch der Embryologie der Haustiere. (Berlin: Parey).

Saini,S.S., Allore,B., Jacobs,R.M., and Kaushik,A. (1999). Exceptionally long CDR3H region withmultiple cysteine residues in functional bovine IgM antibodies. Eur. J. Immunol. 29, 2420­2426.

Saini,S.S., Hein,W.R., and Kaushik,A. (1997). A single predominantly expressed polymorphicimmunoglobulin VH gene family, related to mammalian group, I, clan, II, is identified in cattle.Mol. Immunol. 34, 641­651.

Saini,S.S. and Kaushik,A. (2002). Extensive CDR3H length heterogeneity exists in bovine foetalVDJ rearrangements. Scand. J. Immunol. 55, 140­148.

Sanai,N., Tramontin,A.D., Quinones­Hinojosa,A., Barbaro,N.M., Gupta,N., Kunwar,S.,Lawton,M.T., McDermott,M.W., Parsa,A.T., Manuel­Garcia,V.J., Berger,M.S., and Alvarez­Buylla,A. (2004). Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells butlacks chain migration. Nature 427, 740­744.

Seidel,F. (1952). Die Entwicklungspotenzen einer isolierten Blastomere des Zweizellenstadiumsim Saugetierei. Naturwissenschaften 39, 355­356.

Sell,S. (2004). Stem cells. In Stem cells handbook, S.Sell, ed. (Totowa: Humana Press), pp. 1­18.

Seri,B., Garcia­Verdugo,J.M., McEwen,B.S., and Alvarez­Buylla,A. (2001). Astrocytes give rise tonew neurons in the adult mammalian hippocampus. J. Neurosci. 21, 7153­7160.

Shailubhai,K., Streeter,P.R., Smith,C.E., and Jacob,G.S. (1997). Sulfation and sialylationrequirements for a glycoform of CD34, a major endothelial ligand for L­selectin in porcineperipheral lymph nodes. Glycobiology 7, 305­314.

Shinin,V., Gayraud­Morel,B., Gomes,D., and Tajbakhsh,S. (2006). Asymmetric division andcosegregation of template DNA strands in adult muscle satellite cells. Nat. Cell Biol.

Shojaei,F., Saini,S.S., and Kaushik,A.K. (2003). Unusually long germline DH genes contribute tolarge sized CDR3H in bovine antibodies. Mol. Immunol. 40, 61­67.

References

74

Sidman,R., Angevine,J., and Pierce,E. (1971). Atlas of the mouse brain and spinal cord.(Cambridge, Massachusetts: Harvard University Press).

Simmons,P.J. and Torok­Storb,B. (1991). Identification of stromal cell precursors in human bonemarrow by a novel monoclonal antibody, STRO­1. Blood 78, 55­62.

Sinclair,M.C., Gilchrist,J., and Aitken,R. (1997). Bovine IgG repertoire is dominated by a singlediversified VH gene family. J. Immunol. 159, 3883­3889.

Skowronski,J., Plucienniczak,A., Bednarek,A., and Jaworski,J. (1984). Bovine 1.709 satellite.Recombination hotspots and dispersed repeated sequences. J Mol. Biol. 177, 399­416.

Smith,G.H. (2005). Label­retaining epithelial cells in mouse mammary gland divideasymmetrically and retain their template DNA strands. Development 132, 681­687.

Smith,J.R., Pochampally,R., Perry,A., Hsu,S.C., and Prockop,D.J. (2004). Isolation of a highlyclonogenic and multipotential subfraction of adult stem cells from bone marrow stroma. StemCells 22, 823­831.

Smith,L.G., Weissman,I.L., and Heimfeld,S. (1991). Clonal analysis of hematopoietic stem­celldifferentiation in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 2788­2792.

Song,H.J., Stevens,C.F., and Gage,F.H. (2002). Neural stem cells from adult hippocampusdevelop essential properties of functional CNS neurons. Nat. Neurosci. 5, 438­445.

Song,L. and Tuan,R.S. (2004). Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cellsderived from bone marrow. FASEB J. 18, 980­982.

Spalding,K.L., Bhardwaj,R.D., Buchholz,B.A., Druid,H., and Frisen,J. (2005). Retrospective birthdating of cells in humans. Cell 122, 133­143.

Spangrude,G.J., Heimfeld,S., and Weissman,I.L. (1988). Purification and characterization ofmouse hematopoietic stem cells. Science 241, 58­62.

Spradling,A., Drummond­Barbosa,D., and Kai,T. (2001). Stem cells find their niche. Nature 414,98­104.

Stanfield,B.B. and Trice,J.E. (1988). Evidence that granule cells generated in the dentate gyrus ofadult rats extend axonal projections. Exp. Brain Res. 72, 399­406.

Stevens,A.M., McDonnell,W.M., Mullarkey,M.E., Pang,J.M., Leisenring,W., and Nelson,J.L.(2004). Liver biopsies from human females contain male hepatocytes in the absence oftransplantation. Lab Invest 84, 1603­1609.

Stewart,K., Monk,P., Walsh,S., Jefferiss,C.M., Letchford,J., and Beresford,J.N. (2003). STRO­1,HOP­26 (CD63), CD49a and SB­10 (CD166) as markers of primitive human marrow stromal cellsand their more differentiated progeny: a comparative investigation in vitro. Cell Tissue Res. 313,281­290.

Suda,J., Suda,T., and Ogawa,M. (1984). Analysis of differentiation of mouse hemopoietic stemcells in culture by sequential replating of paired progenitors. Blood 64, 393­399.

Suda,J., Sudo,T., Ito,M., Ohno,N., Yamaguchi,Y., and Suda,T. (1992). Two types of murine CD34mRNA generated by alternative splicing. Blood 79, 2288­2295.

Takano,H., Ema,H., Sudo,K., and Nakauchi,H. (2004). Asymmetric division and lineagecommitment at the level of hematopoietic stem cells: inference from differentiation in daughtercell and granddaughter cell pairs. J. Exp. Med. 199, 295­302.

Terada,N., Hamazaki,T., Oka,M., Hoki,M., Mastalerz,D.M., Nakano,Y., Meyer,E.M., Morel,L.,Petersen,B.E., and Scott,E.W. (2002). Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells byspontaneous cell fusion. Nature 416, 542­545.

Theise,N.D., Nimmakayalu,M., Gardner,R., Illei,P.B., Morgan,G., Teperman,L., Henegariu,O.,and Krause,D.S. (2000). Liver from bone marrow in humans. Hepatology 32, 11­16.

Thomas,M.L. (1989). The leukocyte common antigen family. Annu. Rev. Immunol. 7, 339­369.

Thompson,J.D., Higgins,D.G., and Gibson,T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position­specific gappenalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673­4680.

75

Till,J.E. and McCulloch,E.A. (1961). A direct measurement of the radiation sensitivity of normalmouse bone marrow cells. Radiat. Res. 14, 213­222.

Tizard,I. (2004). Veterinary immunology. An introduction. (Philadelphia: Saunders).

Toma,C., Pittenger,M.F., Cahill,K.S., Byrne,B.J., and Kessler,P.D. (2002). Human mesenchymalstem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation 105,93­98.

Torensma,R. and Figdor,C.G. (2004). Differentiating stem cells mask their origins. Stem Cells 22,250­252.

Trempus,C.S., Morris,R.J., Bortner,C.D., Cotsarelis,G., Faircloth,R.S., Reece,J.M., andTennant,R.W. (2003). Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulgewith the cell surface marker CD34. J. Invest. Dermatol. 120, 501­511.

Trier,J.S. and Moxey,P.C. (1979). Morphogenesis of the small intestine during fetal development.Ciba Found. Symp. 70, 3­29.

Tumbar,T., Guasch,G., Greco,V., Blanpain,C., Lowry,W.E., Rendl,M., and Fuchs,E. (2004).Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science 303, 359­363.

Uchida,N., Buck,D.W., He,D., Reitsma,M.J., Masek,M., Phan,T.V., Tsukamoto,A.S., Gage,F.H.,and Weissman,I.L. (2000). Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 14720­14725.

Väänänen,H.K. (2005). Mesenchymal stem cells. Ann. Med. 37, 469­479.

Valk­Lingbeek,M.E., Bruggeman,S.W., and van Lohuizen,M. (2004). Stem cells and cancer; thepolycomb connection. Cell 118, 409­418.

van Es,J.H., Jay,P., Gregorieff,A., van Gijn,M.E., Jonkheer,S., Hatzis,P., Thiele,A., van denBorn,M., Begthel,H., Brabletz,T., Taketo,M.M., and Clevers,H. (2005). Wnt signalling inducesmaturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nat. Cell Biol. 7, 381­386.

van Praag,H., Schinder,A.F., Christie,B.R., Toni,N., Palmer,T.D., and Gage,F.H. (2002).Functional neurogenesis in the adult hippocampus. Nature 415, 1030­1034.

van Zant,G. and Liang,Y. (2003). The role of stem cells in aging. Exp. Hematol. 31, 659­672.

Vigier,B., Prepin,J., Perchellet,J., and Jost,A. (1977). Développement de l'effet freemartin chez lefoetus de veau. Ann. Méd. Vét. 521­536.

Vigier,B., Watrin,F., Magre,S., Tran,D., and Josso,N. (1987). Purified bovine AMH induces acharacteristic freemartin effect in fetal rat prospective ovaries exposed to it in vitro.Development 100, 43­55.

Vignery,A. (2005). Macrophage fusion: the making of osteoclasts and giant cells. J. Exp. Med.202, 337­340.

Viljanto,J. and Kivikoski,A. (1962). Local effect of neutral salt­soluble collagen on formation ofgranulation tissue ­ a histological study with viscose cellulose implants on rats. Ann. Med. Exp.Biol. Fenn. 40, 118­127.

Visnjic,D., Kalajzic,Z., Rowe,D.W., Katavic,V., Lorenzo,J., and Aguila,H.L. (2004). Hematopoiesisis severely altered in mice with an induced osteoblast deficiency. Blood 103, 3258­3264.

Wagers,A.J., Sherwood,R.I., Christensen,J.L., and Weissman,I.L. (2002). Little evidence fordevelopmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science 297, 2256­2259.

Wagers,A.J. and Weissman,I.L. (2004). Plasticity of adult stem cells. Cell 116, 639­648.

Wang,X., Willenbring,H., Akkari,Y., Torimaru,Y., Foster,M., Al­Dhalimy,M., Lagasse,E.,Finegold,M., Olson,S., and Grompe,M. (2003). Cell fusion is the principal source of bone­marrow­derived hepatocytes. Nature 422, 897­901.

Weill,J.C. and Reynaud,C.A. (1998). Galt versus bone marrow models of B cell ontogeny. Dev.Comp. Immunol. 22, 379­385.

Weimann,J.M., Charlton,C.A., Brazelton,T.R., Hackman,R.C., and Blau,H.M. (2003).Contribution of transplanted bone marrow cells to Purkinje neurons in human adult brains.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2088­2093.

References

76

Weissman,I.L. (2000). Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers andopportunities. Science 287, 1442­1446.

Wilkes,P.R., Wijeratne,W.V., and Munro,I.B. (1981). Reproductive anatomy and cytogenetics offreemartin heifers. Vet. Rec. 108, 349­353.

Wilson,A., Murphy,M.J., Oskarsson,T., Kaloulis,K., Bettess,M.D., Oser,G.M., Pasche,A.C.,Knabenhans,C., Macdonald,H.R., and Trumpp,A. (2004). c­Myc controls the balance betweenhematopoietic stem cell self­renewal and differentiation. Genes Dev. 18, 2747­2763.

Wilson,A. and Trumpp,A. (2006). Bone­marrow haematopoietic­stem­cell niches. Nat. Rev.Immunol. 6, 93­106.

Wright,D.E., Wagers,A.J., Gulati,A.P., Johnson,F.L., and Weissman,I.L. (2001). Physiologicalmigration of hematopoietic stem and progenitor cells. Science 294, 1933­1936.

Wurmser,A.E., Nakashima,K., Summers,R.G., Toni,N., D'Amour,K.A., Lie,D.C., and Gage,F.H.(2004). Cell fusion­independent differentiation of neural stem cells to the endothelial lineage.Nature 430, 350­356.

Yan,Z., Lambert,N.C., Guthrie,K.A., Porter,A.J., Loubiere,L.S., Madeleine,M.M., Stevens,A.M.,Hermes,H.M., and Nelson,J.L. (2005). Male microchimerism in women without sons:quantitative assessment and correlation with pregnancy history. Am. J. Med. 118, 899­906.

Yasuda,M., Jenne,C.N., Kennedy,L.J., and Reynolds,J.D. (2006). The sheep and cattle Peyer'spatch as a site of B­cell development. Vet. Res. 37, 401­415.

Young,P.E., Baumhueter,S., and Lasky,L.A. (1995). The sialomucin CD34 is expressed onhematopoietic cells and blood vessels during murine development. Blood 85, 96­105.

Zanjani,E.D., Almeida­Porada,G.A., Livingston,A.G., Flake,A.W., and Ogawa,M. (1998). Humanbone marrow CD34­ cells engraft in vivo and undergo multilineage expression that includesgiving rise to CD34+ cells. Exp. Hematol. 26, 353­360.

Zhang,B., Pan,X., and Anderson,T.A. (2006a). MicroRNA: A new player in stem cells. J. CellPhysiol.

Zhang,J., Grindley,J.C., Yin,T., Jayasinghe,S., He,X.C., Ross,J.T., Haug,J.S., Rupp,D., Porter­Westpfahl,K.S., Wiedemann,L.M., Wu,H., and Li,L. (2006b). PTEN maintains haematopoieticstem cells and acts in lineage choice and leukaemia prevention. Nature 441, 518­522.

Zhang,J., Niu,C., Ye,L., Huang,H., He,X., Tong,W.G., Ross,J., Haug,J., Johnson,T., Feng,J.Q.,Harris,S., Wiedemann,L.M., Mishina,Y., and Li,L. (2003). Identification of the haematopoieticstem cell niche and control of the niche size. Nature 425, 836­841.

Zhao,Y., Jackson,S.M., and Aitken,R. (2006). The bovine antibody repertoire. Dev. Comp.Immunol. 30, 175­186.

Zhou,J.H., Hikono,H., Ohta,M., and Sakurai,M. (2001a). Cloning of bovine CD34 cDNA. J. Vet.Med. Sci. 63, 1051­1053.

Zhou,S., Schuetz,J.D., Bunting,K.D., Colapietro,A.M., Sampath,J., Morris,J.J., Lagutina,I.,Grosveld,G.C., Osawa,M., Nakauchi,H., and Sorrentino,B.P. (2001b). The ABC transporterBcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of theside­population phenotype. Nat. Med. 7, 1028­1034.

Ziegler,B.L., Valtieri,M., Almeida Porada,G.A., De,M.R., Muller,R., Masella,B., Gabbianelli,M.,Casella,I., Pelosi,E., Bock,T., Zanjani,E.D., and Peschle,C. (1999). KDR receptor: a key markerdefining hematopoietic stem cells. Science 285, 1553­1558.

Zipori,D. (2004). The nature of stem cells: state rather than entity. Nat. Rev. Genet. 5, 873­878.

Zuk,P.A., Zhu,M., Ashjian,P., De Ugarte,D.A., Huang,J.I., Mizuno,H., Alfonso,Z.C., Fraser,J.K.,Benhaim,P., and Hedrick,M.H. (2002). Human adipose tissue is a source of multipotent stemcells. Mol. Biol. Cell 13, 4279­4295.

77

11. Original publications