Embed Size (px)
Citation preview
PENGARUH PAPARAN ASAP ROKOK TERHADAP JUMLAH SEL
OSTEOKLAS PADA TULANG ALVEOLAR TIKUS PUTIH (Rattus
norvegicus) YANG DIINDUKSI BAKTERI Aggregatibacter
actinomycetemcomitans
SKRIPSI
Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran Gigi
Oleh :
John Victor Tampubolon
NIM: 145070407111024
PROGRAM STUDI SARJANA KEDOKTERAN GIGI
FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
DAFTAR ISI
Halaman Judul .....………………………………….……………………………….. i Halaman Persetujuan….……………………………………….………………….... ii Halaman Pengesahan…………………………………………………………….... iii Kata Pengantar …………………………………………….………………………. iv Abstrak……………………………………………………………………………….. vi Abstract……………………………………………………………………………..... vii Daftar Isi ……………..……………………………………………………………… viii Daftar Gambar ……………………………………………………………………… xi Daftar Tabel …………………………………………………………………………. xii Daftar Lampiran…………………………………………………………………….. . xiii Daftar Singkatan……………………………………………………………………… xiv BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang……………………………………………………….... 1 1.2 Rumusan Masalah…………………………………………………….. 3 1.3 Tujuan………………………………………………………………….... 4
1.3.1 Tujuan Umum.......................................................................... 4 1.3.2 Tujuan Khusus......................................................................... 4
1.4 Manfaat Penelitian ……………………………………………………. 4 1.4.1 Manfaat Akademis ………………………………...………….... 4 1.4.2 Manfaat Aplkatif…………………………………….………….... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Jaringan Periodontal ………………………...………………………… 6
2.1.1 Gingiva ..............………….……………………………..………. . 6 2.1.1.1 Marginal Gingiva……………………………………….. 7 2.1.1.2 Sulkus Gingiva………………………..………………... 7 2.1.1.3 Attached Gingiva…………………………………..…... 7
2.1.1.4 Interdental Gingiva……………………..………....…… 7 2.1.2 Sementum ………………………………………………………... 8 2.1.3 Ligamen Periodontal …………………………………….……… 8 2.1.4 Tulang Alveolar …………………………………….……………. 9
2.2 Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) .................... 10 2.3 Peridontitis Agresif .......................................……………...……….... 14 2.4 Osteoimunologi ...................………………………………………….. 17
2.4.1 Tulang…………………………….……………………………… 17 2.4.2 Osteblas………………………………………………………….. 18 2.4.3 Osteoklas………………………………………………………… 18 2.4.4 RANK dan RANKL…………………..………………………….. 20 2.4.5 OPG……………………………………………………………….. 21 2.4.6 Mekanisme RANKL secara patofisiologis…………………….. 22
2.5 Rokok .........................................……….…………………................ 23 2.5.1 Definisi Rokok……………….…………………………………. 23 2.5.2 Bahan Baku Rokok……….…………………………………… 23 2.5.3 Asap Rokok ……………………………………………………. 24 2.5.4 Kandungan Asap Rokok.. …………………………………….. 25
2.5.4.1 Nikotin……………………………………………........… 25 2.5.4.2Tar………………………………………………………... 26 2.5.4.3 Karbon Monoksida (CO)……………………………… . 27 2.5.4.4 Timah Hitam (Pb)…………………………………….. .. 27
2.5.5 Jenis-Jenis Rokok………….………………………………….. 27
2.5.6 Klasifikasi Perokok……………………………….………......... 28 2.5.7 Efek Rokok Terhadap Periodontal……………………………. 31
2.6 Rattus norvegicus ………………………………….………………… . 32 2.7 Identifikasi Bakteri Aa ………………………………………………… 34
2.7.1 Pewarnaan Gram………………………………………………... 34 2.7.2 Tes Katalase …………………………………………………….… 34 2.7.3 Tes Oksidase ……………………………………………………… 35 2.7.4 Uji Hemolisis …………………………………………………….… 35 2.7.5 Uji Agar MacKonkey ……………………………………………… 36
BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN 3.1 Kerangka Konsep………….………………..………………………… 37
3.2 Penjelasan Kerangka Konsep ……………………………....………. 38 3.3 Hipotesis Penelitian…………………………………………………… 39
BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian………………………………………………… 40 4.2 Sampel Penelitian…...…………………………………..……………. 40
4.2.1 Kriteria Sampel Penelitian…………………………………… 40 4.2.2 Besar Sampel Penelitian......................................................... 41
4.3 Variabel Penelitian……………………………………………………. 42 4.3.1 Variabel Terikat ………………………………………..……..… 42 4.3.2 Variabel Bebas……..……………….…………………………… 42
4.4Lokasi dan Waktu Penelitian…………………………………………. 42 4.5 Bahan dan Alat/Instrumen Penelitian……………………………….. 42
4.5.1 Identifikasi Bakteri Aa …………………………………………... 42 4.5.2 Pembiakan Bakteri Aa………………….……………………….. 43 4.5.3 Penentuan kadar dan densitas bakteri Aa …………………… 44 4.5.4 Induksi bakteri Aa pada Tikus………….………….…………... 44 4.5.5 Swab bakteri Aa pada tikus……………………………………. 44 4.5.6 Penghitungan koloni bakteri Aa……………………………….. 44 4.5.7 Pemaparan asap rokok pada tikus……………………………. 44 4.5.8 Pengambilan sel osteoklas pada tikus………………………… 44 4.5.9 Penghitungan jumlah sel osteoklas pada tikus…………… … 45
4.6 Definisi Operasional……………………………………………………. 45 4.7 Prosedur Penelitian…………………………………………………….. 46
4.7.1 Ethical Clearence……………………………………………….. 46 4.7.2 Persiapan Hewan Coba ……………………………………..... 46 4.7.3 Prosedur Identifikasi Bakteri Aa…………………………......... 46 4.7.4 Pembiakan bakteri Aa……………...........……………………... 48
4.7.5 Spektrofotometri……………………………………………….. .. 49 4.7.6 Prosedur Induksi Bakteri Aa pada Tikus……..,……….……… 49 4.7.7 Prosedur swab bakteri Aa pada Tikus…….…………………... 50 4.7.8 Pembuatan penghitungan koloni bakteri Aa………………….. 50 4.7.9 Prosedur pemaparan asap rokok pada Tikus……..……….. . 50 4.7.10 Prosedur pengambilan jaringan penelitian………………….. 51 4.7.11 Pembuatan preparat jaringan………………………………… 52 4.7.12 Prosedur pengitungan jumlah sel osteoklas………………… 55
4.8 Analisis Data ………………………………………………..………... 56 4.9 Kerangka Konsep Penelitian ……………………………..………….. 57
BAB V HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA 5.1 Hasil uji identifikasi bakteri Aa………………..………………………. 58 5.2 Hasil penghitungan jumlah sel osteoklas………………..…………... 59 5.3 Analisis Data……………………………………………………………. 61
5.3.1 Uji normalitas data……………………………………………… 61
5.3.2 Uji homogenitas ragam………………………………………… 62 5.3.3 Uji oneway anova………………………………………………. 62 5.3.4 Uji Post Hoc Multiple Comparison…………………………….. 63 5.3.5 Uji Korelasi Pearson……………………………………………. 64
BAB VI PEMBAHASAN……….……………………………………………………. 65 BAB VII PENUTUP
7.1 Kesimpulan………..………………………………………………….. 70 7.2 Saran…………………………………………………………………... 71
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………….…….………. 72 LAMPIRAN………………………………………………………………………….… 80
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Struktur anatomis jaringan periodontal sehat…………………. 6 Gambar 2.2 Interdental gingiva …………………………………………….... 8 Gambar 2.3 Penampang tulang rahang manusia …………………………... 9 Gambar 2.4 Koloni Aggregatibacter actinomycetemcomitans…………….. 11 Gambar 2.5 Komponen membran luar bakteri gram negatif (LPS)……….. 14 Gambar 2.6 Gambaran radiografis periodontitis agresif lokal…………….. 16 Gambar 2.7 Gambaran radiografis periodontitis agresif generalisata…….. 16 Gambar 2.8 Osteoklas pada preparat histologi……………………………... 20 Gambar 2.9 Prevalensi Merokok Penduduk Indonesia……………………. 30 Gambar 2.10 Rattus norvegicus………………………………………………. 33 Gambar 2.11 Uji Pewarnaan Gram………………………………………….. 34 Gambar 2.12 Hasil Uji Katalase………………………………………………. 35 Gambar 2.13 Hasil Uji Oksidase……………………………………………… 35 Gambar 2.14 Hasil Uji Hemolisis……………………………………………… 36 Gambar 2.15 Hasil Uji MacKonkey…………………………………………… 36 Gambar 5.1 Hasil Identifikasi Bakteri Aa……………………………………… 59 Gambar 5.2 Diagram rata-rata jumlah sel osteoklas……………………….. 60 Gambar 5.3 Perbandingan histologi sel osteoklas………………….. ……… 60
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Tabel Klasifikasi Perokok ………………………………………… 29 Tabel 5.1 Uji normalitas data…………………………………………………. 61 Tabel 5.2 Uji homogenitas ragam……………………………………………. 62 Tabel 5.3 Uji One Way Anova………………………………………………… 62 Tabel 5.4 Uji Post Hoc………………………………………………………… 63 Tabel 5.5 Uji Korelasi Pearson……………………………………………….. 64
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Pernyataan Keaslian Tulisan ………………………………….. 80 Lampiran 2 Hasil Uji Statistik ………………………………………………… 81 Lampiran 3 Pengukuran Berat Badan Tikus………………………………… 83 Lampiran 4 Ethical Clearance………………………………………………… 85
Lampiran 5 Foto Penelitian …………………………………………………… 86
DAFTAR SINGKATAN
LPS lipopolisakarida IL-1α Interleukin-1α IL-1β Interleukin-1β TNF-α Tumor Necrosis Factor-α
MMP Matriks Metalloproteinase mRNA messenger-Ribonucleic acid RANK Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B RANKL Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand OPG Osteoprotegerin IL-6 Interleukin-6 IL-8 Interleukin-8 PG-E2 Prostaglandin-E2 IL-4 Interleukin-4 GCF Gingival Crevicular Fluid CEJ Cemento-Enamel Juction Aa Aggregatibacter actinomycetemcomitans Pg Porphyromonas gingivalis GAP Generalized Aggressive Periodontitst LAP Localized Aggressive Periodontitist PMN polymorphonuclear leukocytes CO Carbon monoksida MS Mainstream Smoke SS Sidestream Smoke AROL Asap Rokok Orang Lain VSM Vascular Smooth Muscles BAP Blood Agar Plate UV-Vis Ultraviolet-Visibel BNF Bufferd Neutral Formalin
HALAMAN PENGESAHAN
SKRIPSI
PENGARUH PAPARAN ASAP ROKOK TERHADAP JUMLAH SEL
OSTEOKLAS PADA TULANG ALVEOLAR TIKUS PUTIH (Rattus noNegicus)
YANG OIINDUKSI BAKTERI Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran Gigi
Telah diuji pada
Hari : Jumat
Tanggal : 25 Mei 2018
Telah dinyatakan lulus oleh:
Penguji 11/Pembimbing I
drg. Diena Fuadiyah, M.Si NIK.2014058612292001
Penguji I
drg. Dia , Sp.Peno
NIK.2010037203292001
Mengetahui,
iii
Penguj
6
bing II
drg. Nenny Prasetyaningrum. M.Ked NIK.2009028129222001
ABSTRAK
Victor Tampubolon,John. 2018. Pengaruh Paparan Asap Rokok Terhadap
Jumlah Sel Osteoklas pada Tulang Alveolar Tikus Putih (Rattus
norvegicus) yang Diinduksi Bakteri Aggregatibacter
actinomycetemcomitans. Skripsi, Fakultas Kedokteran Gigi Universitas
Brawijaya. Pembimbing: (1) Diena Fuadiyah, drg., M.Si., (2) Nenny
Prasetyaningrum, drg., M.Ked.
Permasalahan gigi dan mulut yang memiliki tingkat prevalensi cukup tinggi di
Indonesia adalah periodontitis. Periodontitis dapat disebabkan oleh beberapa
jenis bakteri, salah satunya adalah bakteri Aggregatibacter
actinomycetemcomitans. Namun selain bakteri banyak faktor yang dapat
memperparah timbulnya periodontitis salah satunya adalah rokok, karena
memiliki banyak kandungan zat kimia berbahaya seperti nikotin. Nikotin dapat
mempengaruhi proses terjadinya resorpsi tulang yang dilakukan oleh sel
osteoklas pada penyakit periodontitis. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
melihat pengaruh jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar yang dipaparkan
asap rokok dan diberi induksi bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
Penelitian ini menggunakan metode laboratories true experimental post test only
control group design. Sampel dalam penelitian ini berjumlah 27 tikus yang dibagi
menjadi 3 kelompok yaitu kelompok K (-), K (+), dan kelompok perlakuan yang
diberi induksi bakteri Aa dengan dosis 0,1 cc selama 21 hari dan pemaparan
asap rokok selama 40 hari. Pada hari ke 62 seluruh tikus didekaputasi dan
diambil tulang mandibula yang selanjutnya dilakukan penyayatan pada tulang
alveolar dan pembuatan preparat dengan pengecatan Haematoksilin Eosin.
Analisis data dilakukan menggunakan uji korelasi pearson dan didapatkan hasil
jumlah sel osteoklas yang meningkat namun tidak signifikan jika dibandingkan
kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol positif. Kesimpulan dari penelitian
ini yaitu tidak terdapat pengaruh antara jumlah sel osteoklas dengan pemaparan
asap rokok yang dilakukan selama 40 hari.
Kata kunci : Aggregatibacter actinomycetemcomitans, rokok, sel osteoklas.
ABSTRACT
Victor Tampubolon, John. 2018. The Effect of Cigarette Smoke Exposure to the
Number of Osteoclast Cells in White Rats (Rattus norvegicus)’s Alveolar
bone Induced by Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Final
Assigntment. Faculty of Dentistry Brawijaya University. Supervisor : (1)
Diena Fuadiyah, drg., M.Si., (2) Nenny Prasetyaningrum, drg., M.Ked.
Problems of teeth and mouth that has a high prevalence rate in Indonesia is
periodontitis. Periodontitis can be caused by several types of bacteria, one of
which is the bacterium Aggregatibacter actinomycetemcomitans. But in addition
to bacteria many factors that can aggravate the onset of periodontitis one of them
is a cigarette, because it has a lot of harmful chemicals such as nicotine. Nicotine
can affect the process of bone resorption performed by osteoclast cells in
periodontitis disease. The purpose of this study was to examine the effect of
osteoclast cell count on alveolar bone exposed to cigarette smoke and induction
of Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteria. This research uses
laboratories true experimental post test only control group design method. The
samples in this study were 27 mice divided into 3 groups: K (-), K (+), and
treatment group given Aa bacteria with 0.1 cc dose for 21 days and cigarette
smoke exposure for 40 days. On 62nd day, all mice were decaputated and
mandibular bones were removed, which were then applied to the alveolar bone
and preparing the preparations with the Eosin Haematoxylin treatment. Data
analysis was done by using Pearson correlation test and the result of osteoclast
cell count increased but not significant compared to treatment group with positive
control group. The conclusion of this research is that there is no influence
between osteoclast cell number with cigarette smoke exposure done for 40 days.
Keywords: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, cigarette, osteoclast cells.
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Rokok bagi masyarakat Indonesia bukan sesuatu hal yang asing.
Konsumen rokok di Indonesia tidak hanya orang dewasa saja, melainkan kaum
anak hingga remaja. WHO memperkirakan bahwa terdapat 300 juta perokok di
negara maju, sedangkan di negara berkembang mendekati tiga kali lipat yaitu
sebanyak 800 juta. Rokok mengandung lebih dari 4000 bahan kimia yang dapat
menghasilkan suatu pembakaran tidak sempurna dan dapat diendapkan dalam
tubuh ketika dihisap oleh manusia. Asap rokok mengandung bahan kimia
berbahaya diantaranya adalah tar, nikotin, karbon monoksida (CO), benzene,
ethanol, ammonia, formaldehid, dan ratusan bahan berbahaya lainnya, namun
diantara zat berbahaya tersebut nikotin merupakan zat yang paling berbahaya.
Zat berbahaya tersebut dapat terserap melalui jaringan lunak di rongga mulut
dan masuk mengikuti peredaran darah sehingga dalam dosis tertentu rokok
dapat merubah fungsi dan jumlah sel osteoklas yang ada di dalam tubuh
(Dharmayanti,2012).
Permasalahan kesehatan gigi dan mulut yang terjadi di masyarakat
Indonesia semakin kompleks. Salah satu permasalahan kesehatan gigi dan
mulut yang memiliki prevalensi tinggi adalah penyakit periodontal
(Dharmayanti,2012). Prevalensi penyakit periodontal di Indonesia pada semua
kelompok umur mencapai 96,58% dan salah satu penyakit periodontal yang
paling sering dijumpai adalah periodontitis (Dinkes Malang, 2009). Periodontitis
merupakan suatu keradangan yang terjadi pada jaringan pendukung gigi dan
2
secara perlahan akan menyebabkan kerusakan pada ligamen periodontal dan
tulang alveolar. Faktor penyebab utama timbulnya periodontitis adalah bakteri.
Bakteri yang paling banyak berperan pada periodontitis adalah bakteri Gram
negatif, yaitu Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetecomitans,
Prevotella intermedia, dan Bacteriodes forsythus. Bakteri ini akan mengeluarkan
produk Lipopolisakarida (LPS) yang akan menyebabkan terjadinya keradangan
pada gingiva dan kerusakan tulang alveolar sehingga terjadi periodontitis (Laine,
2012).
Selain dikarenakan oleh bakteri, kerusakan tulang alveolar juga dapat
disebabkan oleh faktor lingkungan seperti paparan asap rokok yang
mengandung nikotin. Nikotin yang terpapar melalui rongga mulut secara terus-
menerus dapat merangsang ganglion simpatik untuk memproduksi
cathecolamine, yang merupakan reseptor pada vascular smooth muscles (VSM)
pada pembuluh darah perifer di jaringan gingiva, sehingga migrasi neutrofil dan
monosit ke daerah inflamasi akan jauh lebih cepat. Hal tersebut menyebabkan
terjadinya peningkatan aktivasi makrofag yang lebih cepat. Peningkatan aktivasi
makrofag juga dapat dipengaruhi oleh munculnya LPS yang dihasilkan oleh
bakteri gram negatif. Makrofag akan memicu pelepasan mediator kimia yaitu
Tumor Necrosis Factor (TNF) dan interleukin-1β (IL-1β) yang akan mengaktivasi
pelepasan Limfosit Sel B dan Limfosit Sel T yang sekaligus akan meningkatkan
stimulasi pengeluaran RANKL (receptor activator of nucklear factor kappaB
ligand ). Peningkatan RANKL akan meningkatkan proses pembentukan
osteoklas (osteoklastogenesis). Hal tersebut akan meningkatkan pembentukan
Matrix Metalloproteinase (MMP), dimana MMP memiliki peran penting dalam
destruksi tulang alveolar. Peningkatan pada MMP akan mengakibatkan
3
terjadinya penurunan densitas tulang alveolar dan menyebabkan resorpsi dari
tulang alveolar (Newman, 2015). LPS memilki potensi yang kuat sebagai
stimulator inflamasi apabila diinjeksikan secara in vivo karena LPS mampu
menembus ke dalam jaringan periradikuler dan bertindak sebagai endotoksin
dalam organisme inangnya sehingga menyebabkan peradangan pada
periradikuler dan berlanjut dengan terjadinya kerusakan tulang (Kumar, et al.,
2007).
Telah diketahui bahwa keradangan kronis pada periapikal akan
menyebabkan peningkatan jumlah sel osteoklas sehingga terjadinya resorpsi
tulang alveolar. Proses keradangan kronis tersebut dipengaruhi oleh faktor
aktivitas bakteri gram negatif yang dapat menghasilkan LPS, serta faktor
eksternal seperti paparan nikotin pada asap rokok (Takayanagi,2007). Namun
seberapa besar pengaruh nikotin pada paparan asap rokok terhadap
peningkatan sel osteoklas pada kondisi periodontitis agresif masih belum jelas.
Menurut permasalahan diatas, maka penelitian ini dilakukan untuk mengetahui
lebih lanjut mengenai pengaruh paparan asap rokok terhadap perubahan jumlah
sel osteoklas pada jaringan periodontal, khususnya pada tulang alveolar hewan
coba yaitu tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi oleh bakteri
Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
1.2 Rumusan Masalah
Apakah terdapat pengaruh paparan asap rokok terhadap jumlah sel
osteoklas pada tulang alveolar tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi
bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans?
4
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Tujuan Umum
Mengetahui pengaruh paparan asap rokok terhadap jumlah sel osteoklas
pada tulang alveolar tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi bakteri
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
1.3.2 Tujuan Khusus
1. Menghitung jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar tikus putih tanpa
paparan asap rokok dan tanpa induksi bakteri Aggregatibacter
actinomycetemcomitans.
2. Menghitung jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar tikus putih (Rattus
norvegicus) yang diinduksi bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans
dan tanpa paparan asap rokok.
3. Menghitung jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar tikus putih (Rattus
norvegicus) yang diinduksi bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans
dan dipapar asap rokok.
4. Menganalisis jumlah sel osteoklas pada kelompok kontrol negatif, dan
kelompok tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi bakteri
Aggregatibacter actinomycetemcomitans, serta kelompok tikus putih (Rattus
norvegicus) yang diinduksi bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans
dan dipapar oleh asap rokok.
1.4 Manfaat Penelitian
1.4.1 Manfaat Akademis
Penelitian ini dapat menyumbang pengetahuan tentang pengaruh paparan
asap rokok terhadap jumlah sel osteoklas yang pada tulang alveolar tikus putih
5
(Rattus norvegicus) yang diinduksi bakteri Aggregatibacter
actinomycetemcomitans.
1.4.2 Manfaat Aplikatif
1. Menambah wawasan ilmu dan pengetahuan mengenai pengaruh paparan
asap rokok terhadap jumlah sel osteoklas di tulang alveolar pada tikus putih
(Rattus norvegicus) yang diinduksi bakteri Aggregatibacter
actinomycetemcomitans.
2. Dapat dijadikan sebagai landasan untuk penelitian lebih lanjut.
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Jaringan Periodontal
Jaringan periodontal adalah jaringan yang berfungsi sebagai penyangga
gigi. Jaringan periodontal memiliki beberapa struktur yaitu gingiva, ligament
periodontal, sementum dan tulang alveolar. (Suryono,2014)
2.1.1 Gingiva
Gingiva merupakan salah satu komponen penyusun jaringan periodontal
yang secara anatomis menempati posisi paling luar, sehingga secara klinis
terlihat dengan mata. Gingiva sehat mempunyai ciri berwarna coral pink,
teksturnya stippling, berbentuk tajam seperti kerjh baju dan konsistensinya
kenyal. Hal tersebut dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain kandungan
pigmen melanin pada epitel, vaskularisasi, kandungan hemoglobin dalam darah,
derajat keratinisasi epitel, dan ada tidaknya inflamasi (Fitri, 2014). Gingiva
menutupi tulang procesus alveolaris dari rahang atas dan rahang bawah, yang
berperan sebagai barrier terhadap stimulant baik secara mekanis maupun
mikrobiologis (Suryono,2014)
Gambar 2. 1 Struktur anatomis jaringan periodontal sehat Sumber: Newman (2015)
7
2.1.1.1 Marginal gingiva
Marginal gingiva atau unattached gingiva merupakan tepi atau batas gingiva
yang mengelilingi gigi dengan bentuk seperti kerah baju. Marginal gingiva dan
attached gingiva dibatasi oleh sebuah lekukan dangkal yang disebut dengan free
gingival groove. Marginal gingiva memiliki lebar sebesar 1mm, dan membentuk
dinding jaringan lunak dari sulkus gingiva (Newman et al, 2015).
2.1.1.2 Sulkus Gingiva
Sulkus gingiva merupakan alur di antara permukaan gigi dan epitelium yang
melapisi bagian gusi yang bebas (Dorland, 2012). Kedalaman sulkus gingiva
normal adalah 1-3mm, sedangkan pada jaringan penyangga gigi yang memiliki
kedalaman sulkus gingiva sebesar 4-6mm menunjukkan tahap awal terjadinya
penyakit periodontal yang akan semakin dalam ukurannya jika tidak segera
ditangani (Hassanpour et al, 2015).
2.1.1.3 Attached Gingiva
Attached gingiva atau gingiva cekat merupakan bagian dari gingiva yang
meluas dari dasar celah gingiva hingga mucogingival junction. Struktur gingiva
cekat kuat, elastis, dan berikatan baik dengan periosteum. Lebar gingiva cekat
pada region anterior maksila adalah 3.5-4.5mm, pada region anterior mandibula
sebesar 3.3-3.9mm. 1.9mm pada premolar maksila dan 1.8mm pada premolar
mandibula (Malathi et al, 2013).
2.1.1.4 Interdental Gingiva
Interdental gingiva berada pada celah interproksimal di bawah titik kontak gigi
geligi yang berbentuk piramida. Ujung papilla interdental tidak hanya terdapat
tepat di bawah titik kontak gigi geligi, namun dapat juga berbentuk seperti
8
lekukan yang menghubungkan antara papilla pada sisi fasial dan lingual.
Permukaan fasial dan lingual meruncing ke arah kontak interproksimal,
sedangkan permukaan mesial dan distal berbentuk cekung (Newman et al,
2015).
Gambar 2. 2 Interdental gingiva Sumber: Newman (2015)
2.1.2 Sementum
Sementum merupakan salah satu struktur jaringan periodontal yang
mengalami kalsifikasi dan menutupi akar gigi, memberikan tempat bagi
perlekatan ligamen periodontal pada gigi. (Suryono,2014)
2.1.3 Ligamen Periodontal
Ligamen periodontal merupakan jaringan lunak yang menghubungkan
antara dinding dalam soket alveolar dengan permukaan akar gigi. Ligamen
periodontal tersusun atas ikatan sel-sel kolagen (terutama kolagen tipe I) yang
menghubungkan sementum gigi ke gingiva dan tulang alveolar. Kandungan sel
terbesar dalam ligamen periodontal adalah fibroblast, yang mempertahankan
serta memperbaiki tulang alveolar dan sementum. Ligamen periodontal mampu
mendeteksi adanya tekanan yang dialami oleh gigi geligi (Mortazavi and
Baharvand, 2016).
9
2.1.4 Tulang Alveolar
Tulang terdiri dari 2/3 bahan inorganik dan 1/3 matriks organik. Bahan
inorganik tersusun dari kalsium, fosfat, hidroksil, karbonat, sitrat, dan beberapa
ion lain seperti sodium, magnesium, dan fluor. Garam mineral berbentuk kristal
hidroksiapatit dan menyusun 2/3 struktur tulang. Matriks organic terdiri dari
kolagen tipe I (90%), dengan sejumlah kecil protein non-kolagen seperti
osteokalsin, osteonektin, protein morfogenetik, fosfoprotein, dan proteoglikan
(Newman et al, 2015).
Gambar 2. 3 Penampang tulang rahang manusia Sumber: Newman (2015)
Remodelling merupakan proses perubahan bentuk tulang, ketahanan tulang
terhadap adanya tekanan, perbaikan luka, serta homestasis kalsium dan fosfat
dalam tubuh. Remodelling melibatkan dua macam sel, yaitu osteoblas dan
osteoklas. Osteoblas memproduksi matriks tulang berupa osteoid yang akan
mengalami mineralisasi setelah melalui proses pengendapan. Osteoklas berasal
dari jaringan hematopoeitik, dan mensekresikan enzim hidrolitik ketika berada
dalam bentuk aktif. Enzim tersebut akan merusak bahan organik dari tulang.
Aktivitas resorpsi tulang bisa juga terjadi melalui mekanisme perubahan
lingkungan permukaan tulang menjadi asam, yang dapat melarutkan komponen
10
mineral pada tulang. Ten Cate mendiskripsikan urut-urutan pada proses resorpsi
tulang, antara lain:
1. Perlekatan osteoklas pada permukaan tulang yang telah mengalami
mineralisasi.
2. Menciptakan lingkungan asam melalui aktivitas pelepasan proton yang dapat
menyebabkan tulang mengalami demineralisasi.
3. Degradasi matriks organik menjadi asam amino akibat adanya pelepasan
enzim berupa asam fosfatase dan cathepsin.
4. Memindahkan ion-ion mineral dan asam amino ke dalam osteoklas (Newman
et al, 2015).
2.2 Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)
Bakteri Aa adalah bagian dari flora normal pada individu yang sehat,
tetapi juga sebagai agen utama dalam beberapa bentuk periodontitis yang
agresif. Bakteri ini pertama kali diisolasi oleh seorang ahli mikrobiologi asal
Jerman bernama Klinger pada tahun 1912 dari lesi cervicofacial actinomycosis.
Dalam berbagai bentuk periodontitis agresif bakteri Aa sering ditemukan dengan
jumlah yang tinggi pada sampel subgingiva dari bagian gigi yang terinfeksi.
Dalam sebuah studi longitudinal menunjukkan bahwa anak-anak dengan
keadaan periodontal yang sehat dengan adanya koloni Aa memiliki peningkatan
risiko untuk berkembangnya periodontitis agresif lokalisata (Van der
Velden,2006).
Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans merupakan bakteri kecil,
bergerak cepat, non-motil, gram negatif, tidak berkapsul, tumbuhnya lambat, dan
capnophilic, serta berbentuk batang dengan ujungnya bulat. Bakteri ini
pertumbuhannya lambat pada suhu 370C, aerobik atau anaerobic, dalam media
11
borth standard atau pada media padat non-inhibitor yang tersedia terdapat
suasana sekitar 5% karbon dioksida. Bakteri Aa telah menunjukkan banyak
faktor virulensi yang dapat meningkatkan kelangsungan hidupnya di rongga
mulut dan memungkinkan untuk menghindari strategi pertahanan dari host.
Menurut taksonominya, Aa diklasifikasikan berdasarkan:
Kingdom : Bacteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gammaproteobacteria Ordo : Parteurellales Famili : Pasteurellaceae Genus : Aggregatibacter Spesies : Actinomycetemcomitans
Gambar 2.4 Koloni Aggregatibacter actinomycetemcomitans pada mikroskop cahaya
Sumber: Nanaiah (2013)
Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans memiliki sejumlah faktor
virulensi yang membantu progresifitas penyakit. Virulensi menentukan kekuatan
dari potensi patogenik sebuah bakteri yang dapat menyebabkan kerusakan host
dan kemampuannya untuk menguasai pertahanan tubuh (Newman, 2015).
Berikut faktor virulensi pada bakteri Aa:
a) Leukotoksin
Bakteri Aa memiliki leukotoksin yang secara spesifik membunuh
makrofag dan leukosit PMN. Proses ini sangat cepat dan menyebabkan
pembentukan pori-pori pada membrane sel target (Sriraman et al., 2014).
12
b) Superantigen
Superantigen merupakan protein bakteri yang mengaktivasi sel T yang
berhubungan dengan reseptor V beta spesifik sel T. Akibat dari aktfitas ini
adalah apoptosis sel T dan superantigen ini bisadianggap sebagai
immunosupresan (Sriraman et al., 2014).
c) Cytolethal distending toxin
Cytolethal distending toxin (CDT) merupakan protein modulator siklus sel
dengan fungsi sebagai immunosupresan (Sriraman et al., 2014). CDT dapat
menginduksi terjadinya apoptosis sel limfosit dan mempengaruhi induksi dari
respon imun humoral (Mythireyi dan Krishnababa, 2012).
d) Fragmen crystallisable (Fc) binding protein
Reseptor Fragmen crystallisable (Fc) berfungsi sebagai penghambat
aktifasi komplemen yang ditemukan pada permukaan bakteri (Sriraman et al.,
2014).
e) Penghambat Kemotatik (Chemotatic Inhibitor)
Sinyal kemotatik berfungsi sebagai penarik neutrophil pada area yang
terinfeksi (Sriraman et al., 2014). Neutrofil ditarik menuju daerah yang
terinfeksi dengan mengikuti gradien konsentrasi dari sinyak kemotasis. Bakteri
Aa telah terbukti mampu menghambat kemotaksis (Mythireyi dan
Krishnababa, 2012).
f) Faktor Immunosupresif
Bakteri Aa telah diteliti mampu memproduksi protein yang dapat
menghambat sintesis DNA, RNA, dan protein pada sel T manusia yang
diaktivasi oleh mitogen atau antigen (Sriraman et al., 2014).
13
g) Bakteriosin
Bakteriosin bekerja dengan meningkatkan permeabilitas membrane sel.
Bakteriosin merupaka salah satu protein yang bisa mematikan strain atau
spesies bakteri lain dan berhubungan dengan permukaan sel juga vesikel
ekstraseluler bakteri (Sriraman et al., 2014).
h) Kolagenase
Koleganase dapat menyebabkan berkurangnya densitas kolagen yang
sering terjadi pada penyakit periodontal (Sriraman et al., 2014).
i) Sitotoksin
Sitotoksin menyebabkan lisis pada leukosit PMN dan makrofag. Sitotoksin
yang dihasilkan oleh bakteri Aa berupa heat-labile sitotoksin. Bakteri Aa dapat
menghasilkan 115 Kda protein heat-labile (Sriraman et al., 2014).
j) Lipopolisakarida
Lipopolisakarida (LPS) adalah salah satu penyebab terjadinya kelainan
periodontium. Bahan ini merupakan struktur utama dinding sel bakteri gram
negatif yang berfungsi untuk integritas struktur bakteri dan melindungi bakteri
dari sistem pertahanan imun hospes. Lipopolisakarida bersifat endotoksin
yang menginduksi diproduksinya faktor lokal yaitu sitokin proinflamatori dan
eicosanoid yaitu PG-E2. Komposisi endotoksin terdiri dari rantai polisakarida
(rantai O) yang di berbagai spesies bervariasi dan tidak toksik melapisi luar
membran. Pemberian injeksi endotoksin murni atau lipid pada hewan coba
dapat menimbulkan gejala syok sepsis. Beberapa mediator penyaji secara
tidak langsun menyebabkan sepsis, endotoksin bakteri gram negatif mengikat
larutan LPS-binding protein atau membrane luar sel mononukleus. Pengaruh
interaksi antara monosit, ,makrofag, dan neutrofil dapat melepas mediator
14
inflamasi seperti interleukin (IL), interferon (IF), platelet activating factor (PAF),
dan tumor necrosis factor (TNF) (Stashenko,2002).
Gambar 2.5 Komponen membran luar bakteri gram negative (LPS)
Sumber: Todar (2010)
2.3 Periodontitis Agresif
Prevalensi periodontitis agresif di dunia cukup tinggi. Penelitian yang
dilakukan di Brazil pada tahun 2005 menunjukkan prevalensi periodontitis agresif
pada usia 12-25 tahun sebesar 6,5% dan meningkat menjadi 9,9% (Albandar,
2005), sedangkan pada tahun 2006 ditemukan bahwa 25,9% dari subyek yang
diteliti menderita periodontitis agresif. Bakteri yang dominan pada periodontitis
agresif adalah bakteri Aa (Levine et al., 2006).
Periodontitis agresif merupakan penyakit pada jaringan periodontal yang
bersifat destruktif dan mampu berkembang dengan cepat, ditandai dengan
kerusakan tulang alveolar dan ligament periodontal secara cepat, kehilangan
gigi, dan respon minim terhadap perawatan periodontal. Pada periodontitis
agresif, kerusakan tulang yang terjadi sangat cepat dan progresif tidak sebanding
dengan bakteri plak dan kalkulus yang terlihat sedikit (Amalina, 2011).
Kerusakan yang terjadi pada periodontitis agresif berhubungan dengan
faktor genetik dan gangguan pada sistem pertahanan tubuh. Generalized
aggressive periodontitst (GAP) dapat terjadi pada usia <30 tahun. Kelainan ini
15
ditandai dengan hilangnya perlekatan interproksimal secara menyeluruh,
melibatkan sedikitnya tiga gigi permanen selain insisif dan molar pertama
(Newman, 2015).
Beberapa kasus periodontitis agresif dapat mengakibatkan kerusakan
tulang yang terus berlanjut meskipun telah dilakukan perawatan periodontal
secara konvensional, sehingga penderita kehilangan gigi. Pertumbuhan bakteri
Aa berhubungan dengan gangguan pada sistem regulasi respon imun, yaitu
terdapat defek fungsional pada monosit, polymorphonuclear leukocytes (PMN)
atau keduanya (Gehrig et al., 2008).
Periodontitis agresif terbagi menjadi dua yaitu localized aggressive
periodontitist (LAP) dan generalized aggressive periodontitist (GAP). Secara
klinis LAP memiliki kedalaman poket yang berat serta jumlah plak minimal. LAP
terjadi pada usia pubertas dan terjadi kerusakan tulang yang cepat. LAP
didominasi oleh bakteri Aa (Reddy, 2011). Periodontitis agresif lokal ditandai
dengan adanya onset penyakit yang relatif cepat dan resorpsi tulang alveolar ≥
4mm khususnya pada regio molar pertama dan insisif permanen, disertai dengan
hilangnya perlekatan interproksimal sebesar ≥ 4mm minimal pada dua gigi
permanen (Ferreira et al, 2014). American Academy of Periodontology (AAP)
menjelaskan bahwa periodontitis agresif lokal bermanifestasi pada individu
dengan rentang usia pubertas dan sekitar 25 hingga 30 tahun. Gambaran
radiografis dari penyakit ini menunjukkan adanya radiolusensi berbentuk
lengkung pada regio molar pertama, dimulai dari sisi distal premolar kedua
meluas hingga sisi mesial molar kedua permanen (Roshna and Nandakumar,
2011).
16
Gambar 2.6 Gambaran radiografis periodontitis agresif lokal Sumber: Roshna dan Nandakumar (2011)
Periodontitis agresif generalisata (GAP) didefinisikan sebagai adanya
kehilangan perlekatan interproksimal minimal pada tiga gigi permanen selain
molar pertama dan insisif. GAP umumnya terjadi pada usia <30 tahun, namun
bisa terjadi pada usia >30 tahun dan tidak ada predileksi jenis kelamin. GAP
memiliki jumlah plak bakteri yang minimal dengan kerusakan jaringan yang cepat
dan mengenai semua gigi. GAP didominasi bakteri Aa dan Pg (Reddy, 2011).
Pasien tidak menampakkan gejala apapun pada fase awal terjadinya penyakit.
Gingiva tampak berwarna merah muda dan sehat, namun terbentuk poket
periodontal yang dalam dari pemeriksaan probing. Kerusakan tulang alveolar dan
hilangnya perlekatan akan muncul dalam beberapa minggu, bulan, bahkan
tahun. Gingiva akan menampakkan gejala inflamasi sedang hingga berat.
Gambaran radiografis dari penyakit ini tampak berupa kerusakan tulang alveolar
yang luas, baik berbentuk defek vertikal maupun horizontal (Roshna and
Nandakumar, 2011).
Gambar 2.7 Gambaran radiografis periodontitis agresif generalisata dengan defek tulang vertikal
Sumber: Roshna dan Nandakumar (2011)
17
2.4 Osteoimunologi
Osteoimunologi merupakan cabang ilmu pengetahuan yang
menggabungkan antara osteologi dan imunologi. Observasi mengenai
osteoimunologi dimulai ketika angka kejadian resorpsi tulang akibat penyakit
inflamasi semakin meningkat (Rauner et al, 2007). Resorpsi tulang berkaitan erat
dengan aktivitas metabolisme yang melibatkan beberapa molekul di antaranya
Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B (RANK), Receptor Activator of
Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANKL), Osteoklas, Osteoblas dan
Osteoprotegerin (OPG).
2.4.1 Tulang
Tulang merupakan organ padat yang berfungsi sebagai pelindung organ
dalam, penyokong struktur tubuh, tempat perlekatan otot serta pembentukan sel-
sel darah (Rauner et al, 2007). Kepadatan tulang secara fisiologis bergantung
pada keseimbangan antara pembentukan tulang oleh osteoblas dan resorpsi
tulang oleh osteoklas (Soysa et al, 2012).
Tulang mengalami proses remodeling secara terus-menerus sepanjang
hidup. Proses tersebut terdiri dari 4 tahap, yaitu aktivasi, resorpsi, transisi, dan
pembentukan tulang baru. Tahap pertama merupakan inisiasi bone lining cells
(BLCs) yang melapisi permukaan tulang. Sel-sel prekursor osteoklas bergerak
menuju permukaan tulang yang menjadi target, kemudian teraktivasi dan
berdiferensiasi menjadi osteoklas matang, sehingga mendorong terjadinya
resorpsi tulang. Terdapat dua mekanisme resorpsi tulang oleh osteoklas pada
proses remodeling yaitu perubahan lingkungan menjadi asam dan pelepasan
enzim hidrolitik, yang dapat melarutkan serta mendegradasi matriks organik
tulang. Sel-sel mononuklear akan muncul untuk mempersiapkan pembentukan
18
tulang baru, sedangkan osteoklas menghilang setelah proses resorpsi tulang
berhenti. Osteoblas memulai sintesis dan deposisi matriks tulang hingga
terbentuk tulang baru (Rauner et al, 2007).
2.4.2 Osteoblas
Rauner et al. pada tahun 2007 mengemukakan bahwa osteoblas berasal
dari sel-sel mesenkimal yang berperan penting dalam aktivitas sintesis dan
mineralisasi matriks organik. Tulang tersusun dari 70% komponen inorganik,
20% komponen organik, 10% air. 90% dari komponen organik tulang merupakan
kolagen tipe I. Osteoblas mampu memproduksi kolagen dan protein non-kolagen
(osteokalsin, sialoprotein, osteopontin, dan osteonektin) serta beberapa sitokin
seperti insulin-like growth factor I, II, transforming growth factor β (TGF-β), dan
bone morphogenetic proteins (BMPs) yang berperan dalam proses diferensiasi
osteoblas. Osteoblas berbentuk bulat dan terdapat pada permukaan tulang.
Osteoblas mampu berdiferensiasi menjadi osteosit yang tertanam di dalam
matriks tulang dan BLCs yang melapisi permukaan tulang. BLCs berperan
penting dalam proses remodeling, sedangkan osteosit berperan dalam regulasi
metabolisme tulang dengan cara menerima dan mengirim sinyal berupa tekanan
mekanis. Osteosit terdapat pada lakuna, terhubung satu sama lain melalui
kanalikuli yang dapat menyuplai nutrisi dan oksigen dari pembuluh darah kapiler
(Nakamura, 2007).
2.4.3 Osteoklas
Osteoklas adalah sel yang berperan dalam proses resorpsi tulang.
Osteoklas merupakan sel dengan banyak inti berukuran besar sehingga mudah
dikenali dan bertanggungjawab dalam proses resorpsi tulang. Osteoklas memiliki
banyak mitokondria dan badan golgi. Sel osteoklas berasal dari progenitor
19
makrofag di sumsum tulang dan pada proses pembentukan sampai
perkembangannya memerlukan faktor soluble yang didapat dari sel osteoblas.
Ultrastuktur dari sel osteoklas menampakkan sejumlah mitokondria, retikulum
endoplasma, apparatus golgi yang mengelilingi nukleus, vesikel, lisosom, dan
vakuola. Struktur tersebut mengindikasikan bahwa osteoklas memiliki
kemampuan untuk memproduksi energi (terutama enzim lisozim) dan melakukan
aktivitas sintesis protein. Aktivasi dan diferensiasi dari osteoklas diatur oleh
adanya keseimbangan antara RANKL dan OPG pada sel-sel osteoblas
(Nakamura, 2007).
Osteoklas berasal dari hematopoietic stem cells (HSC) yang mengalami
beberapa fase diferensiasi dan menghasilkan sel multinukleat dengan
kemampuan osteo-resorpsi. Osteoklas dihasilkan oleh sel-sel progenitor turunan
dari monosit/makrofag yang disebut dengan granulocyte macrophage progenitors
(GMP). GMP mampu berdiferensiasi menjadi granulosit dan makrofag
matang/osteoklas/ sel-sel dendritik. Mobilisasi sel-sel prekursor osteoklas
melibatkan adanya pelepasan sel menuju sirkulasi darah dari sum-sum tulang.
Sel tersebut terus berjalan menuju ke jaringan perifer tempat sel prekursor
osteoklas imatur berdiferensiasi menjadi osteoklas matang. Diferensiasi
osteoklas terdiri dari 3 fase, antara lain proliferasi HSC pada turunan dari sel
makrofag, berkembang menuju fase osteoklas awal, dan diakhiri dengan fase
fusi atau penyatuan (Soysa et al, 2012).
Sel stromal dan prekursor osteoblas mengekspresikan suatu anggota
kelompok TNF-Ligand yang disebut RANKL. Ligand permukaan sel ini
menstimulasi osteoklastogenesis dan aktivitas osteoklas dengan berikatan pada
reseptor umpannya, yaitu RANK, pada permukaan prekursor osteoklas.
20
Macrophage colony-stimulating factor juga diperlukan untuk diferensiasi dan
pertahanan hidup osteoklas. RANKL diekspresikan oleh osteoblas/sel stromal,
fibroblast pada keadaan normal, dan sel limfosit yang telah teraktivasi pada
keadaan inflamasi (Newman, 2015).
Osteoklas merusak tulang dengan cara menempel pada permukaan
tulang dan menurunkan ph sekelilingnya mencapai kadar asam sekitar 4,5.
Mineral tulang kemudian larut dan kolagen menjadi pecah (Antonio Nanci, 2008).
Gambar 2.8 Osteoklas pada preparat histologi
Sumber : Eroschenko (2010)
2.4.4 RANK dan RANKL
RANK termasuk dalam superfamili tumor necrosis factor reseptor (TNFR)
yang banyak ditemukan pada permukaan sel-sel osteoklas dan sel-sel dendritik
(Rauner et al, 2007). RANK memiliki efek osteo-resorpsi dan berfungsi untuk
meningkatkan penggandaan osteoklas pada tulang (Stejskal et al, 2001).
RANKL, famili dari tumor necrosis factor (TNF) merupakan protein
pengikat RANK yang diekspresikan oleh sel-sel stroma sum-sum tulang,
osteoblas, osteosit, serta sel T aktif, dan mendorong adanya aktivitas
osteoklastogenesis atau pembentukan osteoklas (Nakamura, 2007; Soysa et al,
21
2012). Rauner et al pada tahun 2007 mengemukakan bahwa RANKL memiliki
beberapa istilah lain, yaitu TNF-related activation-induced cytokine (TRANCE);
osteoclast differentiating factor (ODF); osteoprotegerin ligand (OPGL); dan TNF
superfamily member 11 (TNFSF11). Organ-organ yang menjadi tempat produksi
dari RANKL antara lain nodus limfa, thymus, paru-paru, limpa, dan sum-sum
tulang (Boyce and Xing, 2007).
Produksi RANKL diregulasi oleh PG-E2, parathyroid hormone (PTH),
glukokortikoid, dan beberapa sitokin seperti IL-1, IL-6, IL-11, serta TNF-α
(Schoppet et al, 2002; Nakamura, 2007).
2.4.5 OPG
OPG, salah satu jenis protein dalam superfamili TNFR, diproduksi oleh
sel-sel osteoblas dan berperan sebagai reseptor RANKL yang mampu
menghambat aktivitas osteoklastogenesis (Nakamura, 2007; Soysa et al, 2012).
OPG diproduksi oleh beberapa jaringan yang ada di dalam tubuh, antara lain
jaringan pada sistem kardiovaskular (jantung, arteri, dan vena), paru-paru, ginjal,
usus, tulang, sel-sel imun dan hematopoeitik. Produksi OPG diregulasi oleh
beberapa sitokin seperti TNF-α, IL-1α, IL-18, transforming growth factor-β (TGF-
β), bone morphogenetic proteins (BMP), dan hormon steroid seperti 17β-
estradiol. Glukokortikoid, siklosporin A, PTH, PG-E2, fibroblast growth factor
(FGF) mampu menekan produksi OPG (Schoppet et al, 2002).
Efek anti-resorpsi dari OPG pada manusia telah diteliti oleh Whyte et al
pada tahun 2002. Penelitian tersebut dilakukan dengan cara menghilangkan 100
kilobase OPG pada 2 pasien yang menderita Paget’s disease, sebuah kelainan
autosom resesiv yang ditandai dengan adanya peningkatan aktivitas remodeling
tulang, osteopenia, dan fraktur. OPG juga memiliki kemampuan untuk mencegah
22
kalsifikasi pada pembuluh darah besar. Eliminasi OPG pada tikus dapat
menyebabkan kalsifikasi pada aorta dan arteri renalis (Schoppet et al, 2002).
Penelitian yang dilakukan oleh Bennett et al pada tahun 2006 membuktikan
bahwa tikus dengan kadar OPG yang rendah dapat mempercepat terjadinya
kalsifikasi pada kasus atheroskelrosis (Rauner et al, 2007).
2.4.6 Mekanisme Efek RANKL secara Patofisiologis
RANKL berikatan dengan reseptor pada permukaan preosteoklas (RANK)
dan menstimulasi adanya diferensiasi menjadi osteoklas aktif, sehingga
mendorong terjadinya aktivitas osteo-resorpsi. Hal ini terjadi bersamaan dengan
aktivitas TNF-α yang mendorong osteoklastogenesis semakin meningkat setelah
ikatan antara RANK dan RANKL terjadi. OPG menghambat aktivitas
osteoklastogenesis dengan cara berikatan pada RANKL, sehingga proses
maturasi osteoklas menjadi terganggu (Stejskal et al., 2001).
Peningkatan aktivitas regulasi RANKL berhubungan dengan adanya
penurunan aktivitas regulasi dari OPG. Rasio OPG/RANKL merupakan penentu
dari kepadatan massa tulang (Boyce and Xing, 2007). Jika rasionya meningkat,
maka aktivitas resorpsi tulang akan meningkat, dan menyebabkan kehilangan
struktur tulang (Smith, 2012). Produksi berlebihan dari OPG dapat menghambat
osteoklas dan memicu osteopetrosis, sedangkan kurangnya produksi OPG dapat
memicu osteoporosis (Rauner et al, 2007).
Stejskal et al. pada tahun 2001 menyebutkan bahwa terdapat beberapa
hormon dan sitokin yang mengatur konsentrasi RANKL dan OPG di dalam tubuh.
Agen yang dapat menurunkan rasio OPG/RANKL antara lain glukokortikoid
dengan cara menghambat produksi OPG; beberapa sitokin inflamatorik (IL-1β,
IL-4, IL-6, IL-11, IL-17, dan TNF-α) dengan cara menginduksi ekspresi ligan
23
OPG; FGF-2 dengan cara menghambat produksi OPG dan meningkatkan
produksi RANKL; hormon paratiroid dengan cara menghambat produksi OPG
dan meningkatkan produksi RANKL; serta PG-E2 dengan meningkatkan produksi
RANKL dan menekan produksi OPG. Agen yang dapat meningkatkan rasio
OPG/RANKL antara lain esterogen dengan cara meningkatkan sekresi OPG dan
menghambat produksi RANKL; serta TGF-β dengan cara menginduksi sekresi
OPG.
2.5 Rokok
2.5.1 Definisi Rokok
Rokok adalah hasil olahan tembakau yang terbungkus, dihasilkan dari
tanaman Nicotiana Tabacum, Nicotiana Rustica dan spesies lainnya atau
sintetisnya yang mengandung nikotin dan tar dengan atau tanpa bahan
tambahan (Heryani, 2014). Rokok merupakan gabungan dari beberapa bahan
kimia. Satu batang rokok yang dibakar dapat mengeluarkan 4000 bahan kimia
berbahaya dan bahan kimia tersebut dapat mengendap dalam tubuh ketika
dihisap.
2.5.2 Bahan Baku Rokok
Bahan baku yang digunakan untuk membuat rokok adalah sebagai
berikut:
a. Tembakau
Jenis tembakau yang dibudidayakan dan berkembang di Indonesia termasuk
dalam spesies Nicotiana tabacum (Santika, 2011).
b. Cengkeh
Bagian yang biasa digunakan adalah bunga yang belum mekar. Bunga
cengkeh dipetik dengan tangan oleh para pekerja, kemudian dikeringkan di
24
bawah sinar matahari, kemudian cengkeh ditimbang dan dirajang dengan
mesin sebelum ditambahkan ke dalam campuran tembakau untuk membuat
rokok kretek (Santika, 2011).
c. Saus Rahasia
Saus ini terbuat dari beraneka rempah dan ekstrak buah-buahan untuk
menciptakan aroma serta cita rasa tertentu. Saus ini yang menjadi pembeda
antara setiap merek dan varian kretek (Santika, 2011).
2.5.3 Asap Rokok
Asap rokok merupakan campuran yang kompleks dan dinamis dari
komponen-komponen kimia yang terikat dalam partikel-partikel aerosol atau
partikel bebas yang berada dalam fase gas, yang timbul sebagai akibat dari
distilasi, pirolisis dan pembakaran dari tembakau. Penelitian memperkirakan
asap rokok memiliki 7357 komponen kimia dari berbagai kelas. Sifat dan
karakteristik dari asap rokok berbeda-beda, bergantung pada komposisi bahan
kimia, konsentrasi dari komponen-komponen kimia, serta ukuran dan muatan
dari partikelnya. Secara konvensional, asap rokok akan dibagi menjadi fase tar
atau fase partikulat dan fase gas. Fase tar atau fase partikulat, oleh Pillsbury,
didefinisikan sebagai material yang terperangkap saat asap melewati Cambridge
glass-fiber filter yang menyaring atau menahan 99.9 % dari keseluruhan materi
partikulat dengan ukuran >0,1 μm (Singh et al, 2013).
Asap rokok merupakan campuran lebih dari 4700 senyawa kimia dan
setidaknya 60 senyawa pada asap rokok memiliki efek karsinogenik. Asap rokok
dibagi menjadi dua kategori, yakni mainstream smoke (MS) dan sidestream
smoke (SS). Mainstream smoke atau disebut juga first-hand smoke adalah
paparan asap rokok yang dihisap oleh perokok selama merokok. Sedangkan SS
25
adalah asap rokok yang dihasilkan dari hasil pembakaran rokok. Mainstream
smoke terbagi menjadi fase partikulat (padat) yang berisi tar, komponen organik
volatil, ROS, serta radikal bebas. Pada dasarnya, komposisi senyawa kimia pada
kedua jenis asap rokok adalah sama, namun SS mengandung senyawa organik
lebih banyak, sehingga pada kuantitas yang sama SS bersifat lebih toksik
dibanding MS (Singh et al, 2013).
2.5.4 Kandungan Asap Rokok
Asap rokok berbahan utama tembakau mengandung fase gas yang terdiri
dari karbon monoksida, nitrogen, oksigen, dan karbondioksida serta fase padat
yang mengandung nikotin, air, dan hidrokarbon aromatik polisiklik (Singh et al,
2013). Berikut ini merupakan beberapa kandungan kimia utama beserta efek
yang dapat ditimbulkan oleh tembakau:
2.5.4.1 Nikotin
Nikotin merupakan zat atau bahan senyawa pirrolidin yang terdapat dalam
Nikotiana tabacum, Nicotiana rustica, dan spesies lainnya atau sintesisnya yang
bersifat adiktif dapat menyebabkan ketergantungan (PP RI Nomor 109 Tahun
2012 pasal I Nomor 4). Komponen ini paling banyak dijumpai di dalam rokok.
Nikotin merupakan alkaloid yang bersifat stimulan dan pada dosis tinggi bersifat
racun. Zat ini hanya ada dalam tembakau, sangat aktif dan mempengaruhi otak
atau susunan saraf pusat, menyempitkan pembuluh perifer, dan juga memiliki
karakteristik efek adiktif dan psikoaktif (Sitepoe, 2000).
Nikotin juga dapat meningkatkan adrenalin yang membuat jantung berdebar
lebih cepat dan bekerja lebih keras, frekuensi jantung meningkat dan kontraksi
jantung meningkat sehingga menimbulkan tekanan darah meningkat (Tawbariah
et al., 2014). Nikotin merupakan bahan yang bersifat toksik dan dapat
26
menimbulkan ketergantungan psikis. Zat ini merupakan alkaloid alam yang
bersifat toksis, berbentuk cairan, tidak berwarna, dan mudah menguap. Nikotin
dapat berubah warna menjadi kecoklatan dan berbau seperti tembakau saat
bersentuhan dengan udara. Nikotin berperan dalam menghambat perlekatan dan
pertumbuhan sel fibroblas pada jaringan periodontal, menurunkan isi protein
fibroblas, dan dapat merusak sel membran (Shah,2016).
Nikotin mempengaruhi aliran darah dengan adanya vasokonstriksi sehingga
menyebabkan supresi hemoragik serta mengganggu proses penyembuhan.
Nikotin dapat menyebabkan defek fungsi neutrofil, yaitu fungsi kemotaksis dan
kemampuan fagositosisnya. Nikotin mempengaruhi sitokin jaringan dan
mengganggu respon inflamasi dari sel inang. Nikotin meningkatkan Interleukin -6
(IL-6), Interleukin-8 (IL-8), dan TNF-α, serta menurunkan Interleukin-4 (IL-4) dan
IL-1α. Nikotin juga memiliki efek resorpsi tulang dengan meningkatkan
prostaglandin-E2 (PG-E2) dan IL-1β (Zhou, 2006).
2.5.4.2 Tar
PP RI Nomor 109 Tahun 2012 Pasal I Nomor 5 menjelaskan bahwa tar adalah
kondensat asap yang merupakan total residu dihasilkan saat rokok dibakar
setelah dikurangi nikotin dan air, yang bersifat karsinogenik. Tar merupakan
senyawa yang berwarna coklat, lengket, dan dapat mengubah warna permukaan
gigi menjadi kuning kecoklatan (Singh et al, 2013). Tar adalah substansi
hidrokarbon yang bersifat lengket dan menempel pada paru-paru, mengandung
bahan-bahan karsinogen (Mardjun, 2012). Pada saat rokok dihisap, tar dapat
masuk ke dalam rongga mulut sebagai uap padat yang setelah dingin akan
menjadi padat dan membentuk endapan berwarna coklat pada permukaan gigi,
27
dan saluran pernapasan. Komponen di dalam tar mengandung radikal bebas dan
zat-zat karsiogenik.
2.5.4.3 Karbon monoksida (CO)
Karbon monoksida merupakan gas berbahaya yang terkandung dalam asap
pembuangan kendaraan. CO menggantikan 15% oksigen yang seharusnya
dibawa oleh sel-sel darah merah. CO juga dapat merusak lapisan dalam
pembuluh darah dan meninggikan endapan lemak pada dinding pembuluh darah,
menyebabkan pembuluh darah tersumbat. Jumlah kadar oksigen yang dibawa
oleh darah ditekan akibat efek karbon monoksida. Kadar oksigen dapat
berkurang hingga 15% (Singh et al, 2013).
2.5.4.4. Timah hitam
Timah hitam (Pb) yang dihasilkan oleh sebatang rokok sebanyak 0,5 ug.
Sebungkus rokok (isi 20 batang) yang habis dihisap dalam satu hari akan
menghasilkan 10 ug. Sementara ambang batas bahaya timah hitam yang masuk
ke dalam tubuh adalah 20 ug per hari. Bisa dibayangkan, bila seorang perokok
berat menghisap rata-rata 2 bungkus rokok per hari berapa banyak zat
berbahaya ini masuk ke dalam tubuh. (Sugeng D Triswanto, 2007)
2.5.5 Jenis-Jenis Rokok
Rokok dibedakan menjadi beberapa jenis, yaitu:
1. Rokok berdasarkan bahan baku atau isinya, dibedakan menjadi:
a. Rokok Putih
Isi rokok ini hanya daun tembakau yang diberi saus untuk mendapatkan efek
rasa dan aroma tertentu (Mardjun, 2012). Rokok putih mengandung 14 - 15
mg tar dan 5 mg nikotin (Alamsyah, 2009).
b. Rokok Kretek
28
Bahan baku atau isinya berupa daun tembakau dan cengkeh yang diberi saus
untuk mendapatkan efek rasa dan aroma tertentu (Mardjun, 2012). Rokok
kretek mengandung sekitar 20 mg tar dan 44-45 mg nikotin (Alamsyah, 2009).
c. Rokok Klembak
d. Bahan baku atau isinya berupa daun tembakau, cengkeh, dan kemenyan
yang diberi saus untuk mendapatkan efek rasa dan aroma tertentu.
2. Rokok berdasarkan penggunaan filter menurut Mardjun (2012) dibagi menjadi
dua kelompok, yaitu:
a. Rokok Filter: rokok yang pada bagian pangkalnya terdapat gabus
b. Rokok Non Filter: rokok yang pada bagian pangkalnya tidak terdapat gabus
2.5.6 Klasifikasi Perokok
Cara mengklasifikasikan seorang perokok dapat berbagai versi, salah
satunya yang dilakukan Sitepoe pada tahun 1999. Sitepoe melakukan klasifikasi
perokok berdasarkan jumlah rokok yang dikonsumsi tiap hari. Klasifikasi ini
membagi perokok menjadi perokok ringan, perokok sedang dan perokok berat.
Perokok ringan adalah perokok yang mengonsumsi satu hingga sepuluh batang
rokok per hari. Perokok sedang adalah perokok yang mengonsumsi sebelas
hingga dua puluh empat batang per hari. Sementara perokok berat mengonsumsi
lebih dari dua puluh empat batang rokok per hari. Penggunaan jumlah rokok
yang dikonsumsi sebagai dasar klasifikasi juga dilakukan oleh Mu’tadin, dengan
penambahan intensitas atau waktu merokok sebagai dasar klasifikasi. Mu’tadin
membagi perokok menjadi empat golongan, perokok ringan, perokok sedang,
perokok berat dan perokok sangat berat. Klasifikasi ini menggunakan Indeks
Brinkman. Indeks Brinkman menggunakan hasil perkalian antara rerata jumlah
batang rokok yang dihisap tiap hari dan lama merokok dalam tahun
29
Cara klasifikasi perokok yang telah disebutkan akan diringkas dalam tabel
berikut:
Kategori Klasifikasi
Perokok
Indeks Brinkman Kalasifikasi
menurut Sitepoe
Klasifikasi
menurut Smet
Klasifikasi menurut
Mu’tadin
Perokok Ringan Indeks Brinkman
0-199 poin
1-10 batang per
hari
1-4 batang per
hari
Sekitar 10 batang per
hari,
selang waktu 60
menit
setelah bangun tidur
Perokok Sedang Indeks Brinkman
200-559 poin
11-24 batang per
hari
5-14 batang
per hari
11-21 batang rokok
per
hari, selang waktu
31-60
menit setelah bangun
tidur
Perokok Berat Indeks Brinkman
lebih dari 600 poin
Lebih dari 24
batang per hari
Lebih dari 15
batang per hari
21-30 batang rokok
per
hari, selang waktu 6-
30
menit setelah bangun
tidur
Perokok Sangat
Berat
- - - Lebih dari 31 batang
rokok
per hari, selang
waktu lima
menit setelah
bangun tidur
Tabel 2.1 Klasifikasi Perokok
Sumber : Sitepoe (2000)
30
Klasifikasi perokok berdasarkan paparan asap yang dihirup dapat dibagi
menjadi dua, yaitu perokok aktif dan perokok pasif.. Perokok aktif (active smoker)
adalah orang yang merokok dan langsung menghisap rokok serta bisa
mengakibatkan bahaya bagi kesehatan diri sendiri maupun lingkungan
sekitarnya. Perokok pasif adalah asap rokok yang di hirup oleh seseorang yang
tidak merokok (Sapphire,2009).
Hasil penelitian juga menyebutkan kejadian paparan asap rokok di
angkutan umum 87,2 %. Kejadian paparan asap rokok yang mengenai orang lain
di tempat kerja 68,4 %.Sedangkan paparan asap rokok yang mengenai orang
lain di rumah 61,6 %. Dari hasil survey tersebut dapat disimpulkan resiko
paparan asap rokok di tempat umum masih sangat tinggi. Ini menunjukan masih
perlunya sosialisasi aturan merokok di tempat umum, dan kesadaran akan
pengaruh asap rokok yang dapat membawa resiko buruk bagi lingkungan
terdekat (keluarga) bisa menjadi motivasi kepatuhan terhadap aturan merokok.
Kejelasan aturan, serta kedisiplinan penerapan aturan juga dapat menekan
resiko paparan asap rokok kepada perokok pasif (Sjaiful. dkk, 2013).
Gambar 2.9 Prevalensi Merokok Penduduk Indonesia Sumber : Litbang Kompas-LD FEUI (2013)
31
2.5.7 Efek Rokok terhadap Jaringan Periodontal
Rokok berpotensi menimbulkan beberapa penyakit kronis serta
meningkatkan risiko kematian. Asia dan Australia merupakan dua kawasan
dengan konsumsi tembakau terbanyak di dunia yaitu sebanyak 57%, disusul
dengan Eropa Timur dan Uni Soviet sebanyak 14%, Amerika 12%, Eropa Barat
9%, serta 8% pada penduduk Timur Tengah dan Afrika. ASEAN merupakan
kawasan dengan 10% dari seluruh pengguna rokok di dunia dan 20% penyebab
kematian global akibat tembakau (Shavey et al, 2009).
Merokok memiliki risiko 3 kali leih besar terserang periodontitis
dibandingkan dengan non-perokok (Hiremath, 2007). Rokok menimbulkan efek
imunosupresif pada sel inang, mempengaruhi interaksi antara sel inang dengan
bakteri, dan menciptakan lingkungan yang kondusif bagi perkembangan bakteri
patogen di dalam plak. Rokok mempengaruhi jaringan periodontal melalui jalur
vaskularisasi dan respon imun tubuh (Sreedevi et al, 2011).
Tanda dan gejala inflamasi pada perokok lebih rendah dibandingkan
dengan non-perokok karena rokok dapat menyebabkan vasokonstriksi pembuluh
darah perifer pada jaringan gingiva, sehingga mampu menekan gejala inflamasi
berupa perdarahan gingiva, kemerahan, dan eksudasi (Sreedevi et al, 2011).
Mekanisme vasokonstriksi telah dijelaskan oleh Trauth et al. pada tahun 2001.
Kandungan nikotin di dalam tembakau menstimulasi ganglion simpatik untuk
memproduksi neurotransmitter berupa catecholamines yang mempengaruhi α1-
reseptor pada pembuluh darah, tepatnya pada vascular smooth muscles (VSM).
Hal tersebut menyebabkan terjadinya vasokonstriksi pembuluh darah perifer
pada jaringan gingiva dan peningkatan peripheral resistance (hambatan aliran
darah dalam pembuluh) serta tekanan darah arteri sistemik. Vasokonstriksi yang
32
terjadi menstimulasi neutrofil dan monosit pada daerah inflamasi untuk
mengeliminasi bakteri serta debris seluler (Polimeni et al, 2006). Proses yang
terjadi selanjutnya adalah stimulasi makrofag (Broughton et al, 2006).
Merokok juga dapat minimbulkan efek destruktif terhadap fungsi
kemotaksis dan fagositosis leukosit polymorphonuclear (PMN) di dalam rongga
mulut. Adanya supresi pembuluh darah pada reaksi inflamasi di bawah pengaruh
rokok mengindikasikan kerusakan mekanisme pertahanan sel inang dalam
merespon iritasi, sehingga mengakibatkan penurunan jumlah mediator inflamasi.
(Sreedevi et al, 2011).
2.6 Rattus norvegicus
Hewan coba adalah hewan yang sengaja dipelihara untuk digunakan
sebagai hewan model guna mempelajari dan mengembangkan berbagai macam
bidang ilmu dalam skala penelitian atau pengamatan laboratorik (Larasaty,
2013). Penelitian secara in vivo banyak memanfaatkan hewan coba (Hewitt et al,
1989; Iheidioha et al, 2012). Anggota Rodentia seperti tikus (Rattus norvegicus)
dan mencit (Mus musculus) sering dijadikan sebagai hewan coba karena
memiliki sistem fisiologi yang mirip dengan manusia (Smith and Mangkoewidjojo,
1988; Johnson, 2012). R. norvegicus memiliki beberapa sifat yang
menguntungkan sebagai hewan coba penelitian di antaranya perkembangbiakan
cepat, mempunyai ukuran yang lebih besar dari mencit, dan mudah dipelihara
dalam jumlah yang banyak (Akbar, 2010).
Klasifikasi R. norvegicus yang digunakan dalam penelitian ini menurut
Krinke pada tahun 2000 adalah sebagai berikut:
33
Kingdom : Animalia Phylum : Chordata Subphylum : Vertebrata Class : Mammalia Order : Rodentia Family : Muridae Genus : Rattus Species : norvegicus
Gambar 2.10 Rattus norvegicus
Sumber: Koolhas (2010)
R. norvegicus memiliki beberapa karakteristik yaitu berambut kasar dan
agak panjang, hidung berbentuk tumpul, badan besar, pendek, dan silindris agak
membesar ke belakang, warna badan bagian atas coklat hitam kelabu
sedangkan bagian bawah coklat kelabu, warna ekor bagian atas gelap
sedangkan bagian bawah gelap agak pucat, berat badan 150-600 gram, panjang
kepala dan badan masing-masing 150-250 mm, panjang ekor 160-210 mm,
panjang dari ujung hidung sampai ujung ekor 310-460 mm, lebar telinga 18-24
mm, panjang telapak kaki belakang 40-47 mm (Solichah, 2007).
Terdapat tiga galur tikus putih yang memiliki kekhususan untuk dimanfaatkan
sebagai hewan percobaan antara lain Wistar, Long Evans, dan Sprague Dawley
(Malole dan Promono, 1989). Tikus wistar memiliki karakteristik mudah
dikendalikan dan perilaku agresif pada wistar jantan serta cenderung
berkembang dengan lambat. Sprague Dawley berasal dari perkawinan silang
antara tikus wistar betina dengan tikus jantan yang tidak diketahui asalnya. Tikus
34
jenis ini termasuk jinak dan mampu berkembang hingga ukuran yang cukup
besar. Long Evans berasal dari perkawinan tikus wistar betina dengan tikus
jantan liar. Kepala dan anggota geraknya berwarna hitam sedangkan tubuhnya
berwarna putih, mudah dikendalikan namun cenderung menunjukkan perilaku
yang agresif (Koolhas, 2010).
2.7 Identifikasi Bakteri Aa
2.7.1 Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram mempermudah pemeriksaan mikroskopik apusan untuk
mendeteksi bakteri, pus, basil Vincent, dan Candida albicans. Tujuan pewarnaan
gram adalah untuk membedakan antara bakteri gram postif dan gram negatif.
Bakteri gram positif menghasilkan warna ungu kecoklatan pada pemeriksaan
preparat di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif menghasilkan
warna merah. (Garrels and Oatis, 2011).
Gambar 2.11 Uji Pewarnaan Gram
Sumber: Bernal (2016)
2.7.2 Tes Katalase
Untuk mengetahui kemampuan produksi enzim katalase dari suatu
bakteri, isolat bakteri dicampurkan dengan larutan H2O2 3% kemudian diamati
ada atau tidaknya gelembung yang muncul pada preparat isolat. Bakteri yang
positif menghasilkan gelembung menandakan kemampuan bakteri untuk
menghasilkan enzim katalase semakin tinggi, (Acharya, 2013).
35
Gambar 2.12 Hasil uji katalase
Sumber: Acharya (2013)
2.7.3 Tes Oksidase
Tes oksidase digunakan untuk mengindentifikasi bakteri yang
memproduksi enzim cytochrome c-oxidase dan menghasilkan perubahan warna
pada isolat bakteri menjadi ungu. Bakteri yang tidak mengandung enzim ini akan
menghasilkan preparat tidak berwarna. Hasil tes oksidase dapat teridentifikasi
dalam waktu 10 detik (Acharya, 2013).
Gambar 2. 13 Hasil Uji Oksidase
Sumber: Acharya (2013)
2.7.4 Uji Hemolisis
Hemolisis merupakan proses rusaknya sel-sel darah merah, disebabkan
oleh substansi yang disebut hemolisin. Terdapat 3 istilah reaksi hemolisis bakteri
pada pengamatan dalam blood agar plates (BAP), yaitu Beta-hemolysis (β-
hemolysis) yang menggambarkan lisis sel darah merah total yang mengelilingi
koloni bakteri. Alpha-hemolysis (α-hemolysis) yang menggambarkan lisis sel
darah merah sebagian disertai dengan penurunan kadar haemoglobin dan
Gamma-hemolysis (ɣ-hemolysis) atau non-hemolytic yang menunjukkan bahwa
koloni bakteri tidak mengarah pada alpha maupun beta hemolysis (Aryal, 2015).
36
Gambar 2.14 Hasil Uji Hemolisis
Sumber: Versalovic (2011)
2.7.5 Uji Agar MacConkey
Metode ini digunakan untuk mengisolasi dan membedakan bakteri Gram
negatif dengan cara mengamati perubahan warna pada indikator pH hasil
fermentasi laktosa bakteri. Fermentasi laktosa bakteri mampu menurunkan pH di
sekitar koloni dan menimbulkan perubahan warna pada indikator pH menjadi
merah atau merah muda sedangkan bakteri yang tidak memfermentasikan
laktosa tumbuh dengan koloni tidak berwarna dan transparan (Batt et al., 2014).
Gambar 2.15 Hasil Uji MacKonkey
Sumber: Versalovic (2011)
37
BAB III
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Konsep
Keterangan :
: Variabel yang diteliti : Variabel yang tidak diteliti : Berpengaruh : Berhubungan
Nikotin
Osteoklas
Induksi bakteri A.
actinomycetemcomitans
pada gingiva tikus putih
TNF-α, IL-1
Pelarutan matriks tulang alveolar
Aktivasi
Makrofag
RANK
PG-E2
MMP-9
Asam hidroklorik
RANKL
Densitas tulang alveolar
LPS
Inflamasi
OPG
Migrasi neutrofil dan monosit ke area inflamasi
Vasokonstriksi pembuluh darah
perifer pada jaringan gingiva
α1 reseptor pada VSM
Catecholamine
s
Ganglion simpatik
Osteoblas
Pre-Osteoklas
M-CSF
38
3.2 Penjelasan Kerangka Konsep
Bakteri Aggregobacter actinomycetecomitans termasuk dalam
golongan bakteri anaerob fakultatif, yang mampu memproduksi
lipopolisakarida (LPS). Lipopolisakarida yang dihasilkan dapat berpengaruh
terhadap terjadinya inflamasi pada gingiva. Hal tersebut dapat dilakukan
dengan cara meningkatkan akses ke jaringan atau sulkus gingiva lalu
menimbulkan inflamasi yang menyebabkan teraktivasinya makrofag yang
sekaligus akan mengaktifkan sitokin proinflamasi yaitu TNF-α dan IL-1β
serta prostaglandin E2 dengan kadar tinggi. Peningkatan TNF-α, IL-1β dan
prostaglandin E2 akan menstimulasi peningkatan ekspresi RANKL oleh
osteoblas. Selain mempengaruhi terbentuknya RANKL, prostaglandin E2
dan sitokin proinflamasi menghambat terbentuknya osteoprotegerin (OPG)
yang juga diekspresikan oleh osteoblas yang berfungsi sebagai reseptor
penyeimbang dan berkompetisi dengan RANK mencegah berikatan dengan
RANKL.
Aktivasi makrofag juga menyebabkan terjadinya peningkatan
Macrofag Colony Stimulating Factor (M-CSF) yang akan menstimulasi
terjadinya proliferasi sel pre-osteoklas dan meregulasi pengekspresian
RANK, dimana RANK berada pada permukaan sel pre-osteoklas. Karena
produksi dari RANKL lebih tinggi daripada produksi dari OPG, maka terjadi
ikatan antara RANKL dengan RANK yang meningkatkan diferensiasi pre-
osteoklas menjadi osteoklas aktif (osteoklastogenesis), yang memiliki efek
osteo-resorpsi.
Rokok memiliki berbagai kandungan zat kimia berbahaya, diantaranya
adalah nikotin, tar, dan karbonmonoksida. Diantara ketiga zat berbahaya
39
tersebut, nikotin merupakan zat yang memiliki peran dalam fase akut maupun
kronis dari periodontitis. Jaringan periodontal yang terpapar oleh nikotin
mampu menstimulasi ganglion simpatik untuk memproduksi catecholamines,
yaitu suatu neurotransmiter yang dapat mempengaruhi α1 reseptor pada
vascular smooth muscles (VSM). Aktivasi α1 reseptor menyebabkan
vasokonstriksi pembuluh darah perifer di jaringan gingiva. Terjadi respon
seluler berupa stimulasi neutrofil dan monosit pada daerah inflamasi yang
berfungsi untuk mengeliminasi bakteri serta debris seluler. Proses yang
terjadi selanjutnya adalah stimulasi makrofag untuk memproduksi beberapa
mediator pro-inflamasi di antaranya adalah IL-1β, TNF-α, dan PG-E2.
Pada fase kronis, nikotin akan menyebabkan terjadinya peningkatan
ekspresi enzim protease, yaitu Matriks Metalloproteinase (MMP-9) yang
diproduksi oleh osteoklas. MMP 9 berperan dalam stimulasi produksi asam
hidroklorik yang berfungsi untuk pelarutan matriks-matriks tulang, sehingga
terjadi penurunan densitas tulang alveolar.
Dalam penelitian ini, pemberian paparan asap rokok sebagai upaya
untuk pengamatan seberapa besar peningkatan jumlah sel osteoklas pada
tulang alveolar tikus putih yang diinduksi LPS Aggregobacter
actinomycetecomitans (Aa).
3.2 Hipotesis Penelitian
Paparan asap rokok dapat meningkatkan jumlah sel osteoklas pada
tulang alveolar tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi bakteri
Aggregobacter actinomycetecomitans (Aa).
40
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental secara in-vivo dengan
menguji hubungan sebab-akibat. Penelitian ini menggunakan metode
laboratories true experimental post test only control group design.
Keterangan :
S = Sampel Penelitian
R = Random Alokasi
K(-) = Kontrol Negatif, tanpa diinduksi bakteri Aa dan tanpa pemaparan asap rokok
K(+) = Kontrol Positif, perlakuan dengan diinduksi bakteri Aa selama 21 hari
P = Perlakuan dengan diinduksi bakteri Aa dan pemaparan asap rokok selama
40 hari
O = Observasi tulang alveolar tikus
4.2 Sampel Penelitian
4.2.1 Kriteria Sampel Penelitian
Sampel yang digunakan pada penelitian ini memenuhi kriteria inklusi
sebagai berikut:
1. Usia 3-4 bulan.
2. Memiliki berat badan 150-300 gram.
3. Tikus berbulu putih, sehat, bergerak aktif, dan nafsu makan normal.
S
P
K(+) RA O
K(--)
41
4. Memiliki kondisi jaringan periodontal normal serta fisik yang sehat.
Adapun kriteria eksklusi dari sampel yang akan digunakan dalam
penelitian ini diantaranya adalah:
1. Tidak tampak gejala periodontitis agresif (adanya kegoyangan gigi) setelah
tikus diinduksi bakteri Aa selama 21 hari.
2. Tikus yang kondisinya menurun atau mati selama penelitian berjalan
3. Terdapat kelainan sistemik lain di luar rongga mulut.
4.2.2 Besar Sampel Penelitian
Estimasi besar sampel yang digunakan pada penelitian ini dihitung
berdasarkan Rumus Frederer sebagai berikut:
(t-1) (n-1) ≥ 15
(3-1) (n-1) ≥ 15
2(n-1) ≥ 15
2n-2 ≥ 15
2n ≥ 17
n ≥ 8.5 (dibulatkan menjadi 9)
Keterangan:
t = perlakuan
n = jumlah sampel
15 = nilai konstanta
Penelitian ini dilakukan pada dua kelompok perlakuan, tiap kelompok
perlakuan terdiri dari 9 ekor hewan coba dan kelompok kontrol negatif terdiri dari
9 ekor hewan coba serta diberikan cadangan 1 hewan coba tiap kelompok
sehingga total sampel penelitian sejumlah 30 ekor.
42
4.3 Variabel Penelitian
4.3.1 Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian adalah jumlah sel osteoklas pada tulang
alveolar tikus putih (Rattus norvegicus).
4.3.2 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah lamanya pemaparan asap rokok
pada tikus putih (Rattus norvegicus).
4.4 Lokasi dan Waktu Penelitian
Lokasi penelitian dilakukan di Laboratorium Institut Biosains Universitas
Brawijaya, Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Patologi Anatomi
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang. Penelitian berlangsung dari
bulan Januari 2018 hingga April 2018.
4.5 Bahan dan Alat/Instrumen Penelitian
4.5.1 Identifikasi Bakteri Aa
1. Pewarnaan Gram
Bahan yang digunakan pada pewarnaan gram antara lain isolat bakteri
Aa, bahan pewarnaan Gram (Kristal violet, lugol, alkohol 96%, safranin),
nutrient broth, ose, kapas, kertas penghisap, dan minyak emersi. Alat yang
digunakan pada prosedur pewarnaan Gram antara lain anaerobic jar,
mikroskop, object glass, tabung reaksi, dan bunsen brander (Chaskes et al.,
2015).
43
2. Tes Katalase
Prosedur tes katalase bakteri menggunakan bahan berupa isolat bakteri
Aa dan larutan H2O2 3%, sedangkan alat yang digunakan adalah object glass,
pipet, serta anaerobic jar (Reiner, 2013).
3. Tes Oksidase
Bahan yang digunakan pada prosedur tes oksidase antara lain isolat
bakteri Aa, kertas filter, dan reagen oksidase tetrametil p-fenilendiamin
dihidroklorida 1% atau Kovac (Reynolds, 2012).
4. Uji Hemolisis
Aryal (2015) menyebutkan alat-alat yang digunakan untuk uji hemolisis
antara lain inkubator, sedangkan bahan yang digunakan adalah isolat bakteri
Aa dan blood agar plate (BAP).
5. Uji Agar MacKonkey
Alat yang digunakan pada prosedur ini adalah anaerobic jar dan
inkubator, sedangkan bahan yang dibutuhkan antara lain isolat bakteri Aa dan
medium MacKonkey agar (Batt et al., 2014).
4.5.2 Pembiakan Bakteri Aa
Bahan yang digunakan pada prosedur ini adalah isolat bakteri Aa yang
telah dibiakkan secara murni pada media MHA (Muller Hinton Agar), larutan NaCl
0.9%, dan nutrient broth, sedangkan alat yang digunakan adalah
spektrofotometer, ose steril, bunsen brander, korek api, Vortex, dan inkubator
(Soraya et al, 2016).
44
4.5.3 Penentuan Kadar dan Densitas Bakteri Aa
Prosedur yang dilakukan sebelum menginduksi bakteri Aa pada tikus
adalah penentuan kadar dan densitas isolat bakteri Aa dengan metode
spektrofotometri ultraviolet-visibel (UV-Vis). Metode tersebut menggunakan alat
berupa spektrofotometer, mikro pipet, dan wadah sampel atau kuvet, sedangkan
bahan yang diperlukan adalah isolat bakteri Aa (Belton, 2009).
4.5.4 Induksi Bakteri Aa pada Tikus
Prosedur induksi bakteri Aa pada tikus memerlukan isolat bakteri Aa yang
telah teridentifikasi dan dibiakkan sebelumnya. Alat yang digunakan adalah spuit
insulin (Andayani et al, 2016).
4.5.5 Swab Bakteri Aa pada Tikus
Alat yang digunakan untuk swab bakteri pada tikus adalah syringe 1cc,
sedangkan bahan yang digunakan antara lain larutan Ketamin 10%, paper point,
larutan PBS, danTrypticase soy agar (Kang et al, 2012).
4.5.6 Penghitungan Koloni Bakteri Aa
Prosedur perhitungan koloni bakteri Aa membutuhkan isolat bakteri Aa
yang telah dibiakkan sebelumnya, colony counter, dan pena atau spidol
(Rostavia et al, 2016).
4.5.7 Pemaparan Asap Rokok pada Tikus
Prosedur pemaparan asap rokok pada tikus menggunakan bahan berupa
rokok kretek, korek api, dan alat yang disebut dengan closed smoking device
(Radwan et al, 2016).
4.5.8 Pengambilan Sel Osteoklas pada Tikus
Prosedur pengambilan sel osteoklas dilakukan dengan melakukan
pemotongan tulang mandibula dari hewan coba. Bahan yang digunakan adalah
45
obat anestesi yaitu ketamine 80 mg/KgBB dan alat yang digunakan adalah
syringe, knable tang, scalpel,blade scalpel, handscoon, masker, pinset bedah.
(Radwan et al, 2016).
4.5.9 Penghitungan Jumlah Sel Osteoklas pada Tikus
Prosedur perhitungan kadar sel osteoklas pada hewan coba
menggunakan alat diantaranya adalah preparat yang telah terdapat sayatan
tulang alveolar hewan coba dan mikroskop cahaya dengan perbesaran 40x,100x
untuk menentukan daerah penghitungan dan 400x untuk penghitungan sel
osteoklas. (Radwan et al, 2016).
4.6 Definisi Istilah/Operasional
a. Pemaparan asap rokok merupakan pemaparan asap ke hewan coba yang
didapatkan dari proses pembakaran 1 batang rokok kretek pada setiap hari
selama 40 hari berturut-turut. Asap rokok kretek dipaparkan dengan
menggunakan alat spuit 5cc dan wadah tertutup yang disebut closed smoking
device.
b. Jumlah sel osteoklas adalah hasil penghitungan sel osteoklas tulang alveolar
pada mandibula hewan coba dari kelompok kontrol negatif, kontrol positif, dan
perlakuan. Osteoklas memiliki ciri-ciri yaitu sel berinti banyak (multinukleus)
dan pipih yang berada di daerah cekungan dangkal ( Howship’s lacunae )
pada permukaan tulang, berwarna merah dengan inti berwarna hitam apabila
dibuat preparat atau sediaan mikroskopis dengan pengecatan HE (Harrus
Hematoxyllin – Eosin) dan dilihat pada 5 lapang pandang dengan
menggunnakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x.
46
c. Induksi bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans merupakan
pemberian bakteri penyebab utama periodontitis pada sulkus gingiva antara
gigi insisiv rahang bawah tikus sebesar 0,1 ml dengan densitas 108 selama 21
hari berturut-turut. Isolat bakteri didapatkan dari Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang dan bakteri tersebut
diidentifikasi terlebih dahulu sebelum dipaparkan pada kelompok kontrol
positif dan kelompok perlakuan.
4.7 Prosedur Penelitian/Pengumpulan Data
4.7.1 Ethical Clearence
Penelitian diawali dengan pengurusan ethical clearence di Komisi Etik
Penelitian Kesehatan, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
4.7.2 Persiapan dan Perawatan Hewan Coba
Tikus putih ditimbang menggunakan neraca analitik. Hewan coba
kemudian diaklimatisasi selama satu minggu. Tikus dipelihara dalam kandang
yang terbuat dari bak plastik bersih berukuran 35x20x15 cm dengan tutup
kandang dibuat dari anyaman kawat. Hewan coba dipelihara dengan suhu
ruangan 18ºC - 27ºC , ventilasi kandang terjaga dengan baik. Satu kandang
berisi 1 ekor tikus. Tiga hari sekali dilakukan penggantian sekam dan setiap hari
dilakukan pemberian minum dengan air matang (15-20 ml/hari), dan pemberian
makan dengan pellet (10%-15% dari berat badannya/hari)
4.7.3 Prosedur Identifikasi Bakteri Aa
1. Pewarnaan Gram
Chaskes et al. (2015) telah melakukan penelitian mengenai pewarnaan
Gram dengan prosedur sebagai berikut:
47
a. Membuat suspensi air suling dan koloni bakteri pada object glass dan
dikeringkan di udara.
b. Fiksasi sediaan yang telah mengering di atas api bunsen brander.
c. Sediaan diberi larutan Kristal violet selama 1 menit, kemudian dibilas dengan
air yang mengalir.
d. Sediaan diberi larutan lugol selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air yang
mengalir.
e. Sediaan diberi larutan safranin dan didiamkan selama 30 detik, kemudian
dibilas dengan air yang mengalir.
f. Sediaan dikeringkan dengan kertas saring, ditetesi minyak emersi.
g. Mengamati sediaan di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x.
2. Tes Katalase
Uji katalase berfungsi untuk mendeteksi kandungan enzim katalase yang
ada dalam bakteri. Enzim katalase mampu menetralisir efek bakterisidal dari
hidrogen peroksida (H2O2). Prosedur uji katalase pada bakteri adalah sebagai
berikut:
a. Sediakan perbenihan bakteri pada object glass.
b. Tetesi sediaan dengan larutan H2O2 3%.
c. Amati gelembung-gelembung udara yang muncul pada object glass.
d. Hasil uji katalase pada bakteri Aa menunjukkan hasil positif (Reiner, 2013).
3. Tes Oksidase
Uji oksidasi berfungsi untuk mendeteksi kandungan enzim cytochrome
oxide pada bakteri. Bakteri yang terbukti positif mengandung enzim tersebut,
mampu mengoksidasi reagen sehingga menimbulkan adanya perubahan warna
pada kertas reagen. Uji oksidase dilakukan dengan mengambil koloni bakteri dari
48
media padat, kemudian digoreskan pada kertas saring yang telah diberi reagen
oksidase berupa tetrametil p-fenilendiamin dihidroklorida 1%. Bakteri Aa
menunjukkan hasil positif dengan adanya perubahan warna pada kertas reagen
oksidase menjadi ungu dalam waktu kurang dari 10 detik (Reynolds, 2012).
4. Uji Hemolisis
Uji hemolisis dilakukan dengan metode streaking pada media blood agar
plate (BAP). Bakteri yang telah di streaking pada media BAP diinkubasi pada
inkubator dengan suhu 370C selama 18-24 jam. Bakteri Aa menunjukkan non-
hemodialisis atau ɣ- hemolisis yaitu tidak tampak adanya perubahan warna pada
BAP (Aryal, 2015).
5. Kultur pada Agar MacKonkey
Metode ini digunakan untuk mengisolasi dan membedakan bakteri Gram
negatif dengan cara mengamati perubahan warna pada indikator pH hasil
fermentasi laktosa bakteri. Fermentasi laktosa bakteri mampu menurunkan pH di
sekitar koloni dan menimbulkan perubahan warna pada indikator pH menjadi
merah atau merah muda. Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa tumbuh
dengan koloni tidak berwarna dan transparan. Inokulasi bakteri Aa dilakukan
dengan metode streaking pada medium agar, kemudian diinkubasi selama 18-24
jam dengan suhu 370C. Bakteri Aa menunjukkan hasil negatif (Batt et al., 2014).
4.7.4 Pembiakan Bakteri Aa
Koloni bakteri Aa yang telah dikultur pada media MHA diambil dengan
menggunakan jarum ose yang telah disterilkan sebanyak 1-2 ose, kemudian
dimasukkan ke dalam tabung yang berisi nutrient broth (NB) sebanyak 5ml lalu
dihomogenkan dengan vortex. Suspensi diinkubasi selama 48 jam pada suhu
49
370C dengan suasana anaerob. Prosedur selanjutnya adalah penentuan densitas
suspensi bakteri sehingga setara dengan 1x108 CFU/ml (Soraya et al, 2016).
4.7.5 Spektrofotometri
a. Menyalakan tombol on/off pada spektrofotometer.
b. Memasukkan medium blanko sebanyak 3ml pada kuvet blanko untuk
membuat angka spektrofotometer menjadi nol (0) menggunakan mikro pipet.
c. Membersihkan permukaan kuvet menggunakan tissue. Memegang
permukaan kuvet pada area yang buram. Area transparan nantinya akan
dilewati oleh sinar pada spektrofotometer.
d. Kuvet berisi blanko diletakkan di dalam spektrofotometer.
e. Menentukan panjang gelombang.
f. Sebelum alat digunakan untuk menghitung sampel, pastikan spektrofotometer
menunjukkan angka nol (0).
g. Memasukkan sampel ke dalam kuvet sebanyak 3ml menggunakan mikro
pipet.
h. Membersihkan permukaan kuvet menggunakan tissue.
i. Kuvet berisi sampel diletakkan di dalam spektrofotometer. Catat nilai
absorbansi.
j. Menghitung panjang gelombang (Belton, 2009).
4.7.6 Prosedur Induksi Bakteri Aa pada Tikus
Jumlah tikus yang akan diinduksi oleh bakteri Aa berjumlah 18 ekor
(berasal dari kelompok kontrol positif dan perlakuan). Masing-masing tikus akan
dipaparkan bakteri Aa sebanyak 0.1 ml dengan densitas sebesar 108 per tikus
selama 21 hari berturut-turut (Jia et al., 2015). Induksi bakteri Aa dilakukan pada
sisi mesial insisif pertama rahang bawah tikus.
50
4.7.7 Prosedur Swab Bakteri Aa pada Tikus
Swab bakteri pada tikus dilakukan sebanyak 2 kali, yaitu setelah inokulasi
bakteri Aa dan pada saat sebelum hewan dikorbankan. Tikus diberi injeksi
anestesi ketamine 40-60mg/kgBB, selanjutnya mikroflora rongga mulut tikus
diambil dengan menggunakan paper point (Fontana C.R et al, 2004). Sampel
yang telah diambil kemudian dimasukkan ke dalam tabung berisi 1ml larutan
PBS. Prosedur berikutnya adalah melarutkan sampel hingga 10 kali pelarutan
dan ditanam pada plate yang berisi medium Tryticase soy agar, kemudian
diinkubasi dalam suasana anaerob pada suhu 370C selama 7 hari (Kang et al,
2012).
4.7.8 Prosedur Penghitungan Koloni Bakteri Aa
Menghubungkan stop kontak dengan sumber tenaga, kemudian menekan
tombol on/off pada posisi ON untuk mengaktifkan alat. Apabila angka pada
colony counter masih belum menunjukkan angka 0, maka tekan tombol reset.
Meletakkan plate yang berisi koloni bakteri yang akan dihitung di atas meja yang
dilengkapi dengan skala, kemudian menandai koloni dengan mengarahkan
pulpen ke arah meja skala. Terdapat lampu yang berfungsi untuk memberikan
penerangan sehingga letak koloni bakteri mudah terdeteksi. Adapun kaca
pembesar yang berfungsi untuk membantu operator melihat koloni bakteri
(Rostavia et al, 2016).
4.7.9 Prosedur Pemaparan Asap Rokok pada Tikus
Prosedur pemaparan asap rokok pada hewan coba adalah sebagai
berikut:
a. Tempat pemaparan dibersihkan terlebih dahulu dari kotoran sisa pemaparan
yang sebelumnya.
51
b. Memasang rokok pada spuit 5cc dan difiksasi menggunakan isolasi.
c. Memasukkan 1 ekor tikus ke dalam kotak pemaparan dan segera ditutup.
d. Menyalakan rokok yang telah difiksasi pada spuit 5cc menggunakan korek api
lalu dimasukkan ke dalam lubang masuk rokok pada tempat pemaparan
e. Pemaparan asap rokok dilakukan dengan bantuan spuit 5cc setelah itu
ditunggu hingga 5 menit lalu tikus dipindahkan ke kandang semula.
f. Sebelum melakukan pemaparan untuk kelompok tikus selanjutnya, tempat
pemaparan dibersihkan dahulu dari sisa asap dan abu rokok perlakuan
sebelumnya. (Jia et al., 2015).
4.7.10 Prosedur Pegambilan Jaringan Penelitian
Prosedur pengambilan sel osteoklas pada tulang alveolar adalah sebagai
berikut :
a. Hewan coba dikurbankan menggunakan teknik dislokasi servikal yang
sebelumnya dibius dengan anestesi total ketamin (80 mg/kg BB).
b. Pengambilan organ mandibular hewan coba menggunakan gunting bedah.
c. Pemotongan pada tulang alveolar mandibular hewan coba menggunakan
knable tang dan scalpel pada bagian anterior rahang bawah.
d. Setelah dilakukan perlakuan, tubuh hewan coba yang tersisa dibersihkan dan
dilakukan aseptik dengan alkohol 70% dan dikubur dengan kedalaman 1
meter.
e. Potongan mandibular kemudian dilakukan pengawetan menggunakan
formalin 10% dan EDTA 10% untuk mendekalsifikasi tulang. (Jusuf,2009).
52
4.7.11 Pembuatan Preparat Jaringan
a. Jaringan yang sudah terambil dilakukan fiksasi menggunakan larutan Bufferd
Neutral Formalin (BNF) 10%. Fiksasi jaringan dilakukan selama minimal 24
jam (Radwan et al, 2016).
b. Dilakukan proses dekalsifikasi dengan tujuan menghilangkan sisa garam
kalsium dan jaringan tulang menjadi lebih lunak sehingga memudahkan
proses pemotongan. Dekalsifikasi menggunakan EDTA 14% dilakukan
perendaman selama 4 minggu dan larutan dekalsifikasi diganti apabila sudah
mulai mengeruh. Setelah proses dekalsifikasi selesai jaringan dibersihkan
dengan menggungakan air mengalir (Radwan et al, 2016).
c. Proses pembuatan preparat histologi dilakukan dengan beberapa tahapan,
antara lain :
a) Dehidrasi
Proses ini bertujuan untuk mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat
dalam jaringan yang telah difiksasi sehingga jaringan nantinya dapat diisi
dengan parafin atau zat lainnya yang dipakai untuk membuat blok preparat.
Hal ini perlu dilakukan karena air tidak dapat bercampur dengan cairan parafin
atau zat lainnya yang dipakai untuk membuat blok preparat (Jusuf,2009).
b) Clearing
Pembeningan adalah suatu tahap untuk mengeluarkan alkohol dan cairan
lain dari jaringan dan menggantinya dengan suatu larutan yang dapat
berikatan dengan parafin. Jaringan tidak dapat langsung dimasukkan ke
dalam parafin karena alkohol dan parafin tidak bisa saling melarutkan. Proses
mengeluarkan alkohol dari jaringan ini sangat krusial karena bila di dalam
jaringan masih tertinggal sedikit alkohol maka parafin tidak bisa masuk
53
kedalam jaringan sehingga jaringan menjadi “matang diluar, mentah di dalam”
dan akan menyebabkan jaringan menjadi sulit untuk dipotong dengan
mikrotom (Jusuf,2009).
c) Impregnasi
Pembenaman (impregnasi) adalah proses untuk mengeluarkan cairan
pembening (clearing agent) dari jaringan dan diganti dengan parafin. Pada
tahap ini jaringan harus benar-benar bebas dari cairan pembening karena sisa
cairan pembening dapat mengkristal dan sewaktu dipotong dengan mikrotom
akan menyebabkan jaringan menjadi mudah robek. Zat pembenam
(impregnasi agent) yang dipakai adalah parafin cair panas yang mempunyai
temperatur lebur (Melting temperature) kira-kira 56-59C, parafin histotek
khusus (Tissue mat) dengan suhu 56C, dan paraplast yaitu campuran parafin
murni dengan beberapa polimer plastik (Jusuf,2009).
d) Blocking
Pengecoran (Blocking) adalah proses pembuatan blok preparat agar
dapat dipotong dengan mikrotom. Untuk membuat blok preparat dapat
digunakan 2 macam cara :
1. Cara lama yaitu dengan menggunakan potongan besi berbentuk L
(Leuckhart). 2 buah potongan besi disusun diatas lembaran logam hingga
rapat dan membentuk ruang seperti kubus. Tuangkan sedikit parafin cair
di bagian pinggir tempat pertemuan potongan besi agar tak bocor.
Jaringan kemudian dimasukkan ke dalam ruangan kubus. Selanjutnya
parafin dituangkan kedalam ruangan kubus tersebut. Hal yang harus
dicegah adalah jangan sampai gelembung udara mengisi kedalam blok
parafin tersebut (Jusuf,2009).
54
2. Cara baru yaitu dengan menggunakan cetakan dari plastik dan piringan
logam. Dengan cara ini histoplate dari plastik diletakkan di atas piringan
logam (seperti cetakan membuat es batu). Tuangkan sedikit cairan
parafin ke dalam cetakan tersebut. Secepatnya masukkan jaringan
dengan menggunakan pinset yang telah dipanaskan (agar parafin tak
beku) dan diatur posisinya di dalam cetakan. Parafin cair kemudian
dituangkan kembali hingga menutupi seluruh cetakan tersebut. Selama
tindakan ini cetakan (histoplate dari plastik) dan piringan logam harus
diletakkan diatas hot plate (Jusuf,2009).
e) Pemotongan
Sebelum melakukan pemotongan serangakaian persiapan yang harus
dilakukan adalah persiapan pisau mikrotom. Pisau mikrotom harus diasah
sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong dengan baik dan tidak koyak
sehingga didapatkan jaringan yang baik. Pisau mikrotom kemudian diletakan
pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu. Lalu rekatkan blok parafin
pada holder dengan menggunakan spatula atau scalpel. Letakkan tempat
duduk blok parafin beserta blok preparat pada tempatnya pada mikrotom.
Selanjutnya persiapkan Kaca Objek. Kaca objek yang akan direkatkan
preparat harus telah dicoated (disalut) dengan zat perekat seperti albumin
(putih telur), gelatin atau tespa. Persiapkan Waterbath atau wadah berisi air
hangat dengan temperatur 37-400C dan terakhir persiapan sengkelit atau kuas
(Jusuf,2009).
f) Pengecatan Haematoksilin Eosin (HE)
Pewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan yang telah
dipotong sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat dikenali / diamati
55
dengan mikroskop. Proses timbulnya warna terkait dengan terjadinya ikatan
antara molekul tertentu yang terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang
tertentu. Sinar dengan panjang gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar
yang berasal dari cahaya matahari atau lampu mikroskop yang dipaparkan
pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi (diserap) atau diteruskan.
Zat warna yan terikat pada jaringan akan menyerap sinar dengan panjang
gelombang tertentu sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna.
Preparat yang akan diwarnai diletakkan pada rak dan dicelupkan ke
dalam 2 wadah berisi xylol masing-masing selama 3 menit untuk
menghilangkan paraffin dari jaringan (deparafinasi). Setelah itu preparat
dimasukkan ke dalam alkohol absolute masing masing selama 3 menit selama
2 kali berturut-turut, alkohol 90% selama 3 menit, alkohol 80% selama 3
menit, bilas dengan air mengalir selama 1 menit. Selanjutnya dimasukkan ke
dalam larutan Haematoksilin selama 6-7 menit, bilas dengan air mengalir 1
menit, kemudian diamsukkan ke dalam larutan Eosin selama 1-5 menit, bilas
dengan air mengalir 1 menit kemudian masukkan preparat ke dalam alkohol
80% sebanyak 10 celupan, alkohol 90% sebanyak 10 celupan, alkohol
absolute 10 celupan ditambah 1 menit. Preparat jaringan kemudian
dimasukkan ke dalam 3 wadah berisi xylol masing-masing selama 3 menit.
Preparat diangkat dalam keadaan basah lalu ditetesi satu tetes entellan
(Canada balsam), tahap terakhir ditutup dengan kaca penutup/deck glass
(Jusuf,2009).
4.7.12 Prosedur Penghitungan Jumlah Sel Osteoklas
Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan
perbesaran 40x,100x untuk menentukan daerah penghitungan, dan 400x untuk
56
penghitungan sel osteoklas. Kemudian dilakukan penghitungan jumlah osteoklas
pada tulang alveolar dengan pembagian 3 lapang pandang yaitu sepertiga atas
tulang alveolar, sepertiga tengah dan sepertiga bawah tulang alveolar. Hasil
pengamatan tersebut kemudian dirata-rata. (Jusuf,2009).
4.8 Analisis Data
Data hasil percobaan hewan coba maupun perlakuan dianalisis secara
statistic menggunakan program SPSS dengan tingkat signifikansi 0,05 (p=0,05)
dan taraf kepercayaan 0,95% (α=0,05) Langkah-langkah uji hipotesis komparatif
dan korelatif adalah uji normalitas data, uji homogenitas varian, uji One-Way
ANOVA, uji Post Hoc dan uji korelasi Pearson lalu hasil analisis data dibuat
dalam bentuk tabel.
57
4.9 Kerangka Konsep Penelitian
.
Kelompok Kontrol Negatif Kelompok Kontrol Positif
Pembedahan dan pengambilan tulang
alveolar mandibular anterior tikus
Isolat bakteri Aa
Pembuatan preparat HPA dengan
pengecatan HE
Pengamatan dan Penghitungan
Jumlah Sel Osteoklas
Analisis Data
Diberikan
induksi bakteri
Aa selama 21
hari, dibiarkan
selama 40 hari
dan dikurbankan
pada hari ke 62
Tidak diberikan
induksi bakteri
Aa dan paparan
asap rokok, dan
dikurbankan
pada hari ke 62
Kelompok Perlakuan
Diberikan induksi
bakteri Aa
selama 21 hari,
lalu paparan
asap rokok
selama 40 hari
dan dikurbankan
pada hari ke 62
Identifikasi Bakteri Aa
Aklimatisasi hewan coba
Pembiakan bakteri Aa
Swab bakteri Aa pada tikus
58
BAB V
HASIL PENELTIAN DAN ANALISIS DATA
5.1 Hasil Uji Identifikasi Bakteri Aa
Sebelum dilakukan induksi bakteri Aa pada kelompok kontrol positif,
bakteri dilakukan identifikasi terlebih dahulu di Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya untuk memastikan bahwa bakteri
tersebut merupakan benar bakteri Aa. Pengujian dilakukan dengan beberapa
macam uji, yaitu uji pewarnaan gram, uji katalase, uji oksidase, uji hemolisis, dan
kultur pada agar MacKonkey.
Pada uji pewarnaan gram didapatkan hasil sediaan menyerap warna
merah yang menandakan bakteri tersebut adalah gram negatif. Pada uji katalase
didapatkan hasil yaitu munculnya gelembung gelembung udara pada object
glass setelah diteteskan H2O2 3% yang menandakan bakteri tersebut memiliki
enzim katalase, dimana enzim tersebut berfungsi untuk penetralisir efek
bakterisidal dari H2O2. Pada uji oksidase didapatkan hasil positif yang ditandai
oleh munculnya warna ungu pada kertas saring yang telah digoreskan bakteri Aa
dan diberi reagen oksidase berupa tetrametil p-fenilendiamin dihidroklorida 1%.
Pada uji hemolisis didapatkan hasil positif yang ditandai oleh tidak terjadi
perubahan warna pada bakteri yang telah ditanam pada media blood agar plate
(BAP) dan diinkubasi pada inkubator selama 18-24 jam. Pada hasil uji
MacKonkey juga didapatkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri Aa
dengan adanya perubahan warna pada indikator pH menjadi merah atau merah
muda yang menandakan bahwa terjadi fermentasi laktosa bakteri yang mampu
59
menurunkan pH di sekitar koloni. Hasil dari seluruh uji tersebut menyatakan
bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri Aa.
Uji identifikasi bakteri Aa ini juga dilakukan pada akhir induksi bakteri
yaitu pada tanggal 12 Februari 2018, lalu pada tanggal 1 Maret 2018, dan pada
akhir penelitian pada tanggal 21 Maret 2018 dengan cara swab menggunakan
papper point yang dioleskan pada sulkus gingiva gigi anterior rahang bawah
bagian mesiolabial lalu ditanam pada media blood agar plate (BAP) yang
kemudian akan diuji kembali seperti uji identifikasi bakteri diatas. Hal ini
dilakukan untuk memastikan bahwa bakteri Aa tetap hidup pada sulkus gingiva
hingga penelitian selesai.
Gambar 5.1 Hasil Identifikasi Bakteri Aa
5.2 Hasil Penghitungan Jumlah Sel Osteoklas
Analisis jumlah sel osteoklas dilakukan menggunakan mikroskop elektrik
CX10 di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya dengan perbesaran 400x pada lima lapang pandang. Sel osteoklas
memiliki ciri berinti sel banyak (multinukleus) dan agak pipih serta berada pada
daerah cekungan dangkal (Howship’s lacunae) pada permukaan tulang dan
60
memiliki inti berwarna merah kehitaman. Berikut adalah hasil rerata dari
penghitungan jumlah sel osteoklas :
Gambar 5.2 Diagram rata-rata jumlah sel osteoklas
Gambar 5.3 Perbandingan histologis tulang alveolar tikus dengan pewarnaan Hematoksin-
Eosin menggunakan mikroskop elektrik Olympus CX10 dengan perbesaran 400x: (A) Kelompok K- , (B) Kelompok K+ , (C) Kelompok Perlakuan. Tanda panah menunjukkan sel
osteoklas
0
5
10
15
20
25
30
kontrol - (8,3) kontrol + (20,67) Perlakuan (26,7)
8,3
20,67
26,7
A B
C
61
5.3 Analisis Data
Data hasil penghitungan jumlah sel osteoklas dianalisis menggunakan
metode One Way Anova. Data hasil penelitian sebelumnya diuji terlebih dahulu
menggunakan uji normalitas data dan homogenitas ragam. Untuk uji normalitas
data yang digunakan adalah uji Shapiro-Wilk karena sampel data kurang dari 50
dan uji homogenitas ragam yang digunakan adalah uji Levene, kedua uji ini
menggunakan tingkat kesalahan (α) 0,05.
Pada uji One Way Anova hipotesis ditentukan dengan rumusan yaitu H
dan rumusan tersebut dapat diterima jika nilai signifikansi yang diperoleh >0,05
atau H, dan ditolak jika nilai signifikansi yang diperoleh <0,05 atau H yang berarti
memiliki perbedaan rata-rata antara jumlah osteoklas antar kelompok.
5.3.1 Uji Normalitas Data
Pengujian normalitas data menggunakan uji one sample Shapiro-Wilk
karena jumlah data 27 (n<50), sedangkan untuk data yang berjumlah lebih dari
50 menggunakan uji Kolmogorov-smirnov. Uji normalitas data dilakukan dengan
tujuan untuk menguji apakah sebaran data yang ada dalam distribusi normal
atau tidak dengan melihat besaran hasil signifikansi. Jika nilai signifikansi >0,05
(α=5%) maka distribusi data normal.
Kelompok Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistik df Sig. Statistik df Sig.
Kontrol Negatif
0.131 9 0.200 0.932 9 0.501*
Kontrol positif
0.172 9 0.200 0.931 9 0.490*
Perlakuan 0.208 9 0.200 0.935 9 0.531*
Tabel 5.1 Uji normalitas data
62
Hasil uji normalitas data menunjukkan bahwa nilai signifikansi rata-rata
jumlah sel osteoklas pada kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol positif, dan
kelompok perlakuan memiliki nilai yang lebih besar dari 0,05, sehingga dapat
disimpulkan data yang diperoleh berdistribusi normal.
5.3.2 Uji Homogenitas Ragam
Setelah diketahui bahwa data penelitian berdistribusi normal selanjutnya
dilakukan uji homogenitas ragam yang bertujuan untuk mengetahui apakah data
yang diperoleh homogen atau tidak. Dalam uji homogenitas varian dilakukan
dengan menggunakan uji Levene.Uji homogenitas ragam terpenuhi jika nilai
signifikansi lebih besar dari 0,05 (p>0,05).
Levene Statistic df1 df2 Sig.
1.986 2 24 0.159*
Tabel 5.2 Uji homogenitas ragam
Dari hasil penghitungan bahwa didapatkan hasil nilai signifikansi yang
lebih besar dari 0,05(p>0,05) yaitu 0,159. Sehingga dapat disimpulkan bahwa
data penelitian bersifat homogen.
5.3.3 Uji One Way Anova (Analysis of Variance)
Uji Anova (F) dilakukan dengan tujuan mengevaluasi perbedaan nilai
jumlah sel osteoklas masing-masing kelompok. Uji ini harus berdistribusi normal,
ragam yang homogen, dan diambil dari sampe acak.
Groups Sum of Squares
df Mean Square F Sig.
Between Groups 1569.079 2 784.539 12.948 0.000*
Within Grooups 1454.178 24 60.591
Total 3023.256 26
Tabel 5.3 Uji One Way Anova
63
Dari hasil uji one way anova diatas didapatkan bahwa nilai signifikansi
lebih kecil dari 0,05 yaitu 0,000, maka H0 ditolak sehingga dapat dikatakan
terdapat perbedaan jumlah sel osteoklas yang signifikan setiap kelompok.
5.3.4 Uji Post Hoc Multiple Comparison
Uji ini bertujuan untuk melihat kelompok mana yang paling berbeda
diantara tiga kelompok tersebut. Uji yang digunakan adalah uji Turkey HSD pada
pilihan menu Post Hoc. Suatu data dikatakan berbeda secara bermakna apabila
nilai signifikansi p<0,05.
Kelompok(I) Kelompok (J) Mean Difference
(I-J)
Std. Error
Sig. 95% Confidence Interval
Lower Upper
Kontrol Negatif
Kontrol positif -12.48889* 3.66942 0.006* -21.6525 -3.3253
Perlakuan -18.26667* 3.66942 0.000* -27.4303 -9.1031
Kontrol positif Kontrol Negatif 12.48889* 3.66942 0.006* 3.3253 21.6525
Perlakuan -5.77778 3.66942 0.276 -14.9414 3.3858
Perlakuan Kontrol Negatif 18.26667* 3.66942 0.000* 9.1031 27.4303
Kontrol positif 5.77778 3.66942 0.276 -3.3858 14.9414
Tabel 5.4 Uji Post Hoc
Dari hasil uji Turkey HSD menunjukan bahwa terdapat perbedaan yang
signifikan antara kelompok kontrol negatif dan kelompok kontrol positif serta
kelompok kontrol negatif dan kelompok perlakuan dilihat dari hasil signifikansi
yang kurang dari 0,05, yaitu 0,006 dan 0,000. Namun hal sebaliknya terjadi
antara kelompok kontrol positif dan kelompok perlakuan dengan melihat hasil
signifikansi yang lebih dari 0,05 yaitu 0,276 maka dapat disimpulkan tidak
terdapat perbedaan yang signifikan.
64
5.3.5 Uji Korelasi Pearson
Kelompok osteoklas
Kelompok Pearson Correlation 1 0.705
Sig. (2-tailed) 0.000*
N 27 27
osteoklas Pearson Correlation 0.705 1
Sig. (2-tailed) 0.000*
N 27 27
Tabel 5.5 Uji Korelasi Pearson
Uji korelasi pearson digunakan karena pada data penelitian ini memiliki
distribusi yang normal, jika tidak memiliki distribusi normal dapat menggunakan
uji Spearman. Hasil penghitungan didapatkan sebesar 0,705, dibaca pada nilai
pearson correlation. Hasil tersebut juga menandakan bahwa terdapat hubungan
yang kuat antara kelompok sampel dengan jumlah sel osteoklas karena hasil
yang mendekati angka 1. Nilai siginifikansi yang sama dengan 0,00<0,05
menandakan bahwa terdapat hubungan yang signifikan. Tanda positif juga
menandakan bahwa korelasi yang terjadi adalah hubungan yang berbanding
lurus, yaitu ketika semakin lama kelompok sampel dipaparkan asap rokok maka
semakin besar jumlah sel osteoklas.
65
BAB VI
PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Hewan Biosains Institut
Universitas Brawijaya pada bulan Januari-Maret 2018 yang bertujuan untuk
mengetahui pengaruh paparan asap rokok terhadap peningkatan jumlah sel
osteoklas pada tulang alveolar tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi
bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa). Penelitian ini dilakukan
dengan membagi hewan coba menjadi 3 kelompok. Kelompok pertama adalah
kelompok kontrol negatif, kelompok kedua adalah kelompok hewan coba yang
diberikan perlakuan induksi bakteri Aa selama 21 hari berturut-turut, dan
kelompok ketiga adalah kelompok hewan coba yang diberikan perlakuan induksi
bakteri Aa selama 21 hari dan dilanjutkan dengan paparan asap rokok selama 40
hari. Penelitian ini diawali dengan induksi bakteri Aa selama 21 hari berturut
turut.
Pada penelitian ini, induksi bakteri Aa dilakukan pada sulkus gingiva
antara gigi insisif rahang bawah pada kelompok kontrol positif selama 21 hari.
Hal ini berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Jia R et al, 2015 sebelumnya,
bahwa induksi bakteri Aa selama 21 hari berturut-turut dapat menyebabkan
adanya kerusakan tulang alveolar yang dibuktikan secara gambaran klinis
dengan adanya oedema dan kemerahan pada gingiva tikus serta gambaran
radiografi yang ditunjukkan dengan penurunan densitas tulang alveolar.
Terjadinya penurunan tulang alveolar pada penelitian ini dibuktikan dengan
dental probe untuk mengukur kedalaman poket gingiva hewan coba. Dental
66
probe digunakan karena memiliki tekstur yang lebih rigid, dapat masuk ke dalam
sulkus gingiva dan telah memiliki indikator pengukuran.
Asap rokok yang dipaparkan ke tikus merupakan hasil dari pembakaran
jenis rokok kretek dikarenakan rokok kretek memiliki kandungan nikotin yang
lebih banyak dan tidak memiliki filter sehingga asap yang dihasilkan juga lebih
banyak dibandingkan dengan rokok filter (Alamsyah,2009). Asap rokok
dipaparkan menggunakan bantuan syringe 5cc yang dimasukkan ke dalam
closed smoking device. Dan dipaparkan ke kelompok perlakuan selama 40 hari
berturut-turut dan dilakukan dalam durasi 5 menit.
Hasil penelitian berdasarkan uji oneway ANOVA menunjukkan bahwa
terdapat perbedaan bermakna antara kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol
positif dan kelompok perlakuan. Hal tersebut menunjukkan bahwa terjadi
peningkatan jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar tikus putih (Rattus
norvegicus) yang diinduksi bakteri Aa selama 21 hari dan dipaparkan asap rokok
selama 40 hari.
Kelompok kontrol positif yaitu kelompok yang diinduksi bakteri Aa selama
21 hari memiliki jumlah sel osteoklas yang lebih banyak jika dibandingkan
dengan kelompok kontrol negatif. Hal tersebut menandakan bahwa bakteri Aa
yang diberikan dalam dosis dan durasi tertentu efektif dapat menyebabkan
terjadinya peningkatan jumlah sel osteoklas. Bakteri Aa menghasilkan sebuah
zat endotoksin berupa lipopolisakarida (LPS) yang akan mengaktifkan makrofag
dalam tubuh. Sebagai respon alami tubuh maka makrofag akan memicu
terjadinya pelepasan mediator kimia berupa Tumor Necrosis Factor (TNF),
Interleukin (IL), dan Prostaglandin E2 (PGE2), dan Matrix Metalloproteinase
(MMP). Tubuh juga merespon dengan mengaktifkan sistem adaptiv dengan
67
memicu produksi limfosit B dan T yang nantinya dibantu oleh TNF akan
mensekresi RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa-β Ligand).
RANKL yang akan bertugas untuk mengaktivasi sel osteoklas dan destruksi
tulang. Dalam proses destruksi tulang RANKL akan berikatan dengan RANK
yang sekaligus menginduksi TNF reseptor-activator 6 (TRAF 6). TRAF 6 ini yang
berperan dalam proses transkripsi sel osteoklas (Newman,2015).
Jika jumlah RANKL tidak seimbang dengan jumlah OPG, dimana jumlah
OPG lebih banyak daripada RANKL maka proses resorpsi tulang dapat dicegah.
Namun jika jumlah RANKL lebih tinggi daripada OPG maka terjadilah proses
osteoklastogenesis yang akan meningkatkan resorpsi tulang. Ikatan yang dapat
mengaktifkan sel osteoklas adalah ikatan antara RANKL dan RANK. Saat sel
osteoklas telah banyak yang aktif maka terjadilah peningkatan jumlah sel
osteoklas dimana sel osteoklas juga akan memproduksi MMP. MMP ini akan
merusak ikatan antara gingiva dan tulang alveolar dan berperan dalam pelarutan
senyawa kimia dalam tulang alveolar karena pH nya yang asam sehingga terjadi
resorpsi tulang alveolar (Zhao, Ran et al,2013).
Hasil uji Post Hoc juga menunjukkan terjadinya peningkatan jumlah sel
osteoklas yang signifikan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol
negatif. Kelompok perlakuan merupakan kelompok tikus yang diinduksi bakteri
Aa selama 21 hari dan diberikan paparan asap rokok selama 40 hari. Hal ini
disebabkan karena dua hal, yaitu faktor bakteri Aa yang dapat meningkatkan
jumlah sel osteoklas dan faktor nikotin yang terkandung di dalam asap rokok
yang dipaparkan ke hewan coba. Nikotin merupakan salah satu kandungan
berbahaya dalam asap rokok. Zat ini memiliki sifat toksik dan dapat berperan
dalam menghambat perlekatan dan pertumbuhan sel fibroblas pada jaringan
68
periodontal, menurunkan isi protein fibroblas, dan dapat merusak sel membran
(Zhou, 2013). Nikotin juga mempengaruhi produksi sitokin jaringan dan
mengganggu respon inflamasi dari sel inang dengan meningkatkan Interleukin -6
(IL-6), Interleukin-8 (IL-8), dan TNF-α, serta menurunkan Interleukin-4 (IL-4) dan
IL-1α. Nikotin juga memiliki efek resorpsi tulang dengan meningkatkan
prostaglandin-E2 (PG-E2) dan IL-1β (Zhou, 2013).
Berdasarkan uji Post Hoc tidak ditemukan perbedaan yang signifikan
antara jumlah sel osteoklas pada kelompok kontrol positif dan perlakuan. Hal ini
dapat disebabkan karena durasi dari paparan asap rokok yang kurang lama dan
kurang intens serta pemberian paparan asap rokok merupakan bersifat pasif
sehingga memiliki efek lebih minimal pada bagian lokal seperti rongga mulut
dibandingkan dengan efek sistemik sehingga menyebabkan perbedaan yang
dimunculkan dalam paparan selama 40 hari tidak signifikan. Namun melalui
penghitungan manual jumlah sel osteoklas tetap terlihat terjadinya peningkatan
jika dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yang hanya diinduksi bakteri
Aa saja.
Pada uji korelasi Pearson didapatkan angka signifikansi yaitu 0,705. Hasil
tersebut merupakan hasil yang kuat karena memiliki hasil yang telah mendekati
angka 1. Serta dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa arah korelasi positif
yang menandakan bahwa semakin lama induksi bakteri dan paparan asap rokok
dilakukan maka jumlah sel osteoklas juga akan semakin meningkat.
69
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemaparan asap rokok mampu
meningkatkan jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar tikus putih (Rattus
norvegicus) yang diinduksi oleh bakteri Agregatibacter actinomycetemcomitans
namun tidak signifikan. Hal tersebut dapat dilihat dari hasil penghitungan manual
dan hasil statistik jumlah sel osteoklas.
70
BAB VII
PENUTUP
7.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan mengenai pengaruh
paparan asap rokok terhadap jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar tikus
putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi bakteri Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, maka dapat disimpulkan bahwa:
1. Tidak terdapat pengaruh antara paparan asap rokok terhadap jumlah sel
osteoklas pada tulang alveolar tikus putih (Rattus norvegicus) yang
diinduksi bakteri Agregatibacter actinomycetemcomitans.
2. Penghitungan rerata jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar tikus putih
(Rattus norvegicus) tanpa diinduksi bakteri Agregatibacter
actinomycetemcomitans dan tanpa dipaparkan asap rokok yaitu 8,3.
3. Penghitungan rerata jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar tikus putih
(Rattus norvegicus) yang diinduksi bakteri Agregatibacter
actinomycetemcomitans dan tanpa dipaparkan asap rokok yaitu 20,67.
4. Penghitungan rerata jumlah sel osteoklas pada tulang alveolar tikus putih
(Rattus norvegicus) yang diinduksi bakteri Agregatibacter
actinomycetemcomitans dan dipaparkan asap rokok yaitu 26,7.
5. Terdapat perbedaan selisih rerata jumlah sel osteoklas sebesar 6,03
antara kelompok tikus yang diinduksi bakteri Agregatibacter
actinomycetemcomitans dan tanpa dipaparkan asap rokok dengan
kelompok tikus yang diinduksi bakteri Agregatibacter
actinomycetemcomitans dan dipaparkan asap rokok.
71
7.2 Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang durasi lama pemaparan
asap rokok pada tikus putih (Rattus norvegicus) yang diinduksi bakteri
Agregatibacter actinomycetemcomitans..
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang pemaparan asap rokok
menggunakan hewan coba dengan ordo yang lebih tinggi.
3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang efek samping dari
pemaparan asap rokok yang mungkin dapat mempengaruhi organ lain
pada rongga mulut.
72
DAFTAR PUSTAKA
Acharya T. 2013. Catalase Test: Principle, Uses, Procedure, and Result.
Accessed from https://microbeonline.com/catalase-test-principle-uses-procedure-results/. Diakses pada 27 April 2017.
Acharya T. 2013. Oxidase Test: Principle Procedure and Oxidase Positive Organism. Accessed from http://microbeonline.com/oxidase-test-principle-
procedure-and-oxidase-positive-organisms/. Diakses pada 27 April 2017.
Ade Ratri Y, Ketut S, Dian Agustin W. 2012. Peningkatan Jumlah Osteoklas Pada Keradangan Periapikal Akibat Induksi Lipopolisakarida Porphorymonas Gingivalis. Jurnal JBP Vol.14.
Akbar, Budhi. 2010. Tumbuhan dengan Kandungan Senyawa Aktif yang Berpotensi sebagai Senyawa Infertilitas. Jakarta: Adabia Press.
Alamsyah, R. 2009. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Kebiasaan Merokok dan
Hubungannya dengan Status Penyakit Periodontal Remaja di Kota Medan
Tahun 2007. (Thesis). Universitas Sumatera Utara. Medan.
Albandar, J.M., 2005, Epidemiology of Aggressive Periodontitis in a South Brazilian Population, IADR., J Periodont Res. 83:255-62.
Amalina, R. 2011. Perbedaan Jumlah actinobacillus Actinomycetemcomitans pada Periodontitis Agresif Berdasarkan Jenis Kelamin. Yogyakarta.
Andayani R., Imron A., Rahimi A. 2016. Kemampuan Air Rebusan Daun Salam (Eugenia polyantha wight) terhadap Jumlah Makrofag pada Gambaran Histologi Periodontitis Agresif (Penelitian pada Tikus Model). Cakradonya Dental Journal, Vol. 8(2): 79-87.
Antonio Nanci. 2008. Oral Histology Vol. 7. St. Louis: The CV Mosby Co.
Arnett, T., 2003. Bone Structure and Bone Remodelling. London: University College .London
Aryal S. 2015. Blood Agar-Composition, Preparation, Uses and Pictures. Accessed from http://www.microbiologyinfo.com/blood-agar-composition-preparation-uses-and-pictures/. Diakses pada 14 April 2017.
Batt C. 2014. Encyclopedia of Food Microbiology 2nd Edition. USA: CRC Press Taylor and Francis Group.
Belton C. 2009. UV-VIS Spectrophotometer. London: Imperial College.
Bernal S.O., 2016. “Identificación por PCR de Listeria monocytogenes, L.
innocua y L. ivanovii aisladas de Apio (Apium graveolens) expedido en
Ciudad Obregón, Sonora. Mexico : Ingeniero Biotecnólogo
73
Boyce B.F. and Xing L. 2007. Biology of RANK, RANKL, and Osteoprotegerin. Arthritis Research and Therapy 2007, Vol. 9(1): 1-7.
Broughton G., Janis J.E., Attinger C.E. 2006. The Basic Science of Wound Healing Plast Reconstr Surg 117, Vol. 7: 12-34.
Cairlan M. and Lestari E. 2003. Pedoman Teknik Dasar Untuk Laboratorium Kesehatan. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Chaskes S., Austin R. 2015. Practical Handbook of Microbiology 3rd Edition. USA: CRC Press Taylor and Francis Group.
Dharmayanti, Agustin. 2012. Deoxypyridinoline Level in Gingival Crevicular Fluid as Alveolar Bone Loss Biomarker in Periodontal Disease. J KG Unej; 2(3):
2-6.
Dinas Kesehatan Kota Malang. 2009. Laporan Bulanan Kegiatan Puskesmas Tahun 2009.
Dorland W.A.N. 2012. Kamus Saku Kedokteran Dorland Edisi 28. Jakarta:
Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Eroschenko VP. 2010. Atlas Histologi diFiore dengan Korelasi Fungsional Edisi 11. Jakarta: EGC. Hlm: 93
Ferreira D.C.A., Aguiar S.M.F., Nelson P., Mussolino A., Rossi A.D. 2014. Localized Aggressive Periodontitis–Clinical, Radiographic, Microbiological and Immunological Findings. RSBO, Vol. 11(4): 393-397.
Fitri, A.N.I. 2014. Persiapan Jaringan Periodontal untuk Perawatan Gigi Tiruan Sebagian dan Gigi Tiruan Penuh. Skripsi. tidak diterbitkan, Fakultas
Kedokteran Gigi Fakultas Hasanuddin, Makassar.
Fontana C.R., et al. 2004. Microbial reduction in periodontal pockets under
exposition of a medium power diode laser: An experimental study in rats.
Wiley Online Library. Published on October 18th 2004.
Garrels M. and Oatis C.S. 2011. Laboratory Testing for Ambulatory Settings: A Guidance for Health Care Professionals. China: Elsevier.
Gehrig JSN, Willmann DE. 2008. Periodontitis In: Gehrig JSN, Willmann DE, eds. Foundation Periodontist for teh Dental Hygienist. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.
Graves DT,Oaes T, Garlet GP, 2011. Review of osteoimmunology and the host response in endodontic and periodontal lessions. Journal of microbiologi Oral. Published on 17 January 2011
74
Hassanpour M., Tamam S., Shigapov T. 2015. A Histological and Clinical Evaluation of Shallow Deep Probing Depths. International Dental Journal of Student’s Research, Vol. 3(2): 55-58.
Heryani, R. 2014. Kumpulan Undang – Undang dan Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Khusus Kesehatan. Jakarta : CV. Trans Info Media
Hewitt C.D., Innes D.J., Savory J., Willis M.R. 1989. Normal Biochemical and Hematological Values in New Zealand White Rabbits. Clinical Chemistry, Vol.
35(8): 1777-1779.
Hosadurga R.R., et al. 2015. Evaluation of The Efficacy of 2% Ocimum sanctum Gel in the Treatment of Experimental Periodontitis. International Journal of Pharmaceutical Invertigation, Vol. 5(1).
Huang S., et al. 2011. The Role of Psychologic Stress‐Induced Hypoxia‐Inducible
Factor‐1α in Rat Experimental Periodontitis. International Journal of
Periodontology. Published on June 2011.
Ingle J, Backland L, 2008. Endodontics 6. Hamilton: BC Decker Inc. pp. 502-503
Indahyani ED, Santoso A, Utoro T, HNE M, 2007. Pengaruh Induksi Lipopolisakarida terhadap Osteopontin Tulang Alveolaris Tikus pada Masa Erupsi Gigi. Indonesian Journal of Detistry: Jakarta. Ed 14(1). Pp 2-
7.
Jia R, et al. 2015. Aggregatibacter actinomycetemcomitans Induces Th17 Cells In Atherosclerotic Lesions. FEMS Patogens and Diseases Journals, Vol. 73.
Jusuf A. 2009. Histologi teknik Dasar. Jakarta : Histologi Faklutas Kedokteran
Universitas Indonesia.
Kang J, et al. 2012. Aggregatobacter actinomycetemcomitans Infection Enhances Apoptosis In Vivo through a Caspase-3-Dependent Mechanism in Experimental Periodontitis. IAI Journals, Vol. 80(6).
Koolhaas, J.M. 2010. The Laboratory Rat - The UFAW Handbook on the Care and Management of Laboratory and Other Research Animals, Eighth Edition. Netherlands: University of Groningen.
Kumar V, Cotran R, Robbings, Stanley, 2007. Buku Ajar Patologi Robbins Ed. . Vol.1. Jakarta: EGC
Kusumawardani A., Sarwendah K., Rahmad L., dkk. 2013. Sitotoksik Asap Rokok pada Kornea Tikus Putih Wistar yang Diberi (Curcuma Domestica Val.). Jurnal Sain Veteriner, Vol. 31(1): 89-99.
Laine ML, Crielaard W, Loos BG. 2012. Genetic Susceptibility to Periodontitis.
Larasaty, Widya. 2013. Uji Antifertiltas Ekstrak Etil Asetat Biji Jarak Pagar (Jatropha Curcas L.) pada Tikus Putih Jantan (Rattus norvegicus) Galur Sprague Dawley secara In Vivo. Skripsi. Tidak diterbitkan, Program Studi
75
Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta.
Levine L, V Baev, R Lev, A Stabholz and M Ashkenazi. 2006. Aggressive
Periodontitis Among Young Israeli Army Personnel. J Periodontology
77:1392-6
Malathi K., Arjun S., Blaisie R.M.P., Dhanesh S. 2013. Attached Gingiva: A Review. International Journal of Scientific Research and Review, Vol. 3(2): 188-198.
Malole, M. B. M. and C. S. Pramono. 1989. Penggunaan Hewan-hewan Percobaan Laboratorium. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Mardjun, Y. 2012. Perbandingan Keadaan Tulang Alveolar Antara Perokok dan Bukan Perokok. Universitas Hasannudin. Makasar.
Manson J.D., Eley B.M. 2004. Periodontics, Fifth Edition, Edinburgh London New York etc: Wright
Mariano, F.S., Sardi, J.C.O., Duque, C., Hofling, J.F., Goncalves, R.B. 2010. The Role of Immune System in teh Development of Periodontal Disease : a Brief Review. Rev Odonto Cienc. 25(3) : 300 – 5.
Mortazavi H. and Baharvand M. 2016. Review of Common Condition of Assosiated with Periodontal Ligament Widening. Imanging Science In Dentistry, Vol. 46: 229-237.
Mustaqimah D. 2002. Faktor-Faktor Penyebab serta Mekanisme Perusakan Tulang Alveolar oleh Osteoklas. Jurnal PDGI Edisi Khusus.
Mythireyi D, Krishnababa MG. 2012. Aggregatibacter actinomycetemcomitans, anaggressive oral bacteria – a review. International Journal of Health Sciences and Research; 2:105-17
Nakamura Hiroaki. 2007. Morphology, Function, and Differentiation of Bone Cells. Journal of Hard Tissue Biology, Vol. 16(1): 15-20.
Nanaiah KP, Nagarathna DV, Manjunath N. 2013. Prevalence of periodontitis among the adolescents aged 15-18 years in Mangalore City: An epidemiological and microbiological study. India : Department of Periodontics, Dayananda Sagar College of Dental Sciences, Karnataka, India
Nazir, M. 2005. Metodologi penelitian. Bogor : Ghalia Indonesia
Newman M.G., Takei H., Klokkevold P.R., Carranza, F.A., 2015. Carranza’s Clinical Periodontology 12th Edition. Elsevier Saunders, Singapore.
76
Notoadmodjo, S. 2005. Metodologi Penelitian Kesehatan. Jakarta: Rineka Cipta.
Orban’s,1991. Oral Histology and Embriology. Chapter 7. 11th Ed. US Amerika:
Mosby Year Book
Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Nomor 109 Tahun 2012 tentang Pengamanan Bahan yang Mengandung Zat Adiktif berupa Produk Tembakau bagi Kesehatan. 2012. Admin Perpu, Jakarta.
Polimeni G., Xiropaidis A.V., Wikesjo U.M.E. 2006. Biology and Principles of Periodontal Wound Healing/Regeneration. Periodontology 2000, Vol. 41: 30-47.
Radwan L.R.S., Grawish M.E., Elmadawy S.H., El-Hawary Y.M. 2016. Ultrasurface Morphological Changes in the Rat Tongue Posterior One-Third Exposed to Passive Smoke. EC Dental Science Research Article, Vol. 4(4): 846-847.
Raja M., Ummer F., Dhivakar C.P. 2014. Aggregatibacter actinomycetemcomitans-A Tooth Killer?. Journal of Clinical and Diagnostic Research, Vol. 8(8): 13-14.
Rauner M., Sipos W., Pietschmann P. 2007. Osteoimmunology. International Archieves of Allergy and Immunology, Vol. 143: 31-41.
Reddy S. 2011. Essentials of Clinical Periodontology and Periodontitics 3rd Ed. New Delhi: Jaypee Ltd. 220, 225-228..
Reiner K. 2013. Catalase Test Protocol. Accessed From http://www.microbelibrary.org.library/laboratory+test/3226-catalase-test-protocol. Diakses pada 14 April 2017.
Reynolds J. 2012. Oxidase Test. Richland College; Biol 2421.
Rosa M.R., Luca G.Q., and Lucas O.N. 2008. Cigarrette Smoking and Alveolar Bone In Young Adults: A Study Using Digitized Radiographic. Journal Periodontal, Vol. 79: 232-244.
Roshna T. and Nandakumar K. 2011. Generalized Aggressive Periodontitis and ItsTreatment Options: Case Reports and Review of the Literature. Case Reports in Medicine.
Rostavia I, Ariswati H.G, Nugraha P.C. 2016. Colony Counter Multipen. Seminar Tugas Akhir.
Santika, E. 2011. Mengintip Kisah Dibalik Tembakau. Nasionalis Rakyat merdeka
news Online. 19 September 2014. http://nrmnews.com/2011/12/01/house-of-
sampoerna-mengintip-kisah-dibaliktembakau/
Sapphire, 2009. Bahaya Perokok Pasif. http: //www.Send.garp.com. diakses 28
Mei 2018
77
Schoppet M., Preissner K.T., Hofbauer L.C. 2002. RANK Ligand and Osteoprotegerin- Paracrine Regulators of Bone Metabolism and Vascular Function. Arterioscler Thromb Vasc Biol, Vol. 22: 549-553.
Schreiner H.C, et al. 2003. Tight-adherence Genes of Actinobacillus actinomycetemcomitans are Required for Virulence In A Rat Model. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America, Vol. 100(12): 7295-7300.
Seyedmajidi S.A., et al. 2014. Effect of Zinc-Deficient Diet on Oral Tissues and Periodontal Indices Rats. International Journal of Molecular and Cellular Medicine, Vol. 3(2): 81-87.
Shah, S., Al-Sheyab, N., Alomari, M.A., Gallagher, P., Gallagher, R. Prevalence, Patterns and Correlates of Cigarette Smoking in Male Adolescents in Northern Jordan, and the Influence of Waterpipe Use and Asthma Diagnosis : A Descriptive Cross-Sectional Study. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2014, 11, 9008-23
Shavey O., Michael E., Ross H., Mackay J. 2009. The Tobacco Atlas Third Edition. American Cancer Society, Atlanta.
Sinaga C.A, 2013. Prevalensi merokok penduduk di Indonesia. Jakarta : Litbang Kompas – Fakultas Ekonomi Universitas Indonesia.
Singh G.H., Amit B., Yaswin S. 2013. Smoking and Periodontal Disease. Journal of Pharmaceutical and Scientific Innovation, Vol. 2(2): 7-11.
Sitepoe M. 2000. Kekhususan rokok Indonesia. Jakarta: Grasindo,: 12-30.
Sjaiful A., Mardhiati R., Yusuf Y., 2013. Hasil Survey Paparan Asap Rokok
Kepada Perokok Pasif. Jakarta : Lemlitbang UHAMKA.
Smith J.B. and Mangkoewidjojo S. 1988. Tikus Laboratorium (Rattus norvegicus).
Dalam: Pemeliharaan, Pembiakan, dan Penggunaan Hewan Percobaan di
Daerah Tropis. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press).
Solichah, Zumrotus. 2007. Mengenal Jenis Tikus. BALABA, Edisi 005(2): 18-19.
Soraya C., Sunnati, Maulina V. 2016. Efek Anti Bakteri Ekstrak Batang Serai (Cymbopogon citratus) terhadap Pertumbuhan Enterococcus faecalis. Cakradonya Dental Journal, Vol. 8(2): 69-78.
Soysa N.S., Alles N., Aoki K., Ohya K. 2012. Osteoclast Formation and Differentiation: An Overview. Journal of Medical and Dental Sciences, Vol. 59: 65-72.
Sreedevi M., Ramesh A., Dwarakanath C. 2011. Periodontal Status in Smokers and Nonsmokers: A Clinical, Microbiological, and Histopathological Study. International Journal of Dentistry.
78
Sriraman P, dkk,. 2014. Aggregatibacter actinomcetemcomitans in Periodontal disease. Research Journal of Pharmaceutical, Biological, and Chemical Science Volume 5 (2). Hlm 406 – 19.
Stashenko P. Interrelationship of Dental Pulp and Apical Periodontitis. In: Hargreaves KM, Goodis, (Eds). Dental Pulp. Chicago: Quintessence Publishing Co.Inc. 2002: 389-409.
Stejskal D., Bartekb J., Pastorkováa, Ruzickaa V., Orala I., Horalika, Dalimil. 2001. Osteoprotegerin, RANK, RANKL. Biomed Papers, Vol. 145(2): 61-62.
Suryono, 2014. Bedah Dasar Periodonsia. Yogyakarta: Deepublish
Susilowati, 2010. Peran Matriks Metaloproteinase-8 pada Cairan Krevikuler Gingiva Selama Pergerakan Gigi Ortodontik. Jurnal Kedokteran Gigi
Dentofasial. Vol 9. No 1.
Takayanagi H, 2007. Osteoimmunology: Shared Mechanism and Crosstalk Between The Immune and Bone Sistems. Vol 7. Published on April. Tokyo: Nature Publishing Group. Pp 292-302
Tawbariah, L., Apriliana, E., Wintoko, R., Sukohar, A., 2014. The Corelation of Consuming Cigarette with Blood Pressure of The Society in Pasaran Island Kota Karang Village East Teluk Betung Sub-District Bandar Lampung. Medical Journal Of Lampung University. Vol 3.
Todar, K., 2008. Online Textbook of Bacteriology. USA : Wisconsin, Madison. Available from : http://textbookofbacteriology.net/structure.html.
Triswanto, Sugeng D. 2007. Stop Smoking. Progresif Books, Jakarta
Van der Velden U, Abbas F, Armand S, Loos BG, Timmerman MF, Van der Weijden GA, Van Winkelhoff AJ, Winkel EG, 2006, Java project on periodontal diseases; The natural of periodontitis; risk factor, risk predictors and risk determinants, JOP 33(8):540-8.
Versalovic, J., et al. 2011. Manual of Clinical Microbiology 10th Edition.
Washington DC: ASM Press.
Witari A.S. and Nurika I. 2016. Penentuan Isolat Bakteri Asidogenik yang Mampu Menghasilkan Total Asam Tertinggi dari Limbah Cair Tahu. Jurnal Industria, Vol. 5(1): 13-24.
Yulvizar C. 2013. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada Rastrelliger sp.
Biospecies, Vol. 6(2): 1-7.
Zhao R, Kamon M, Sakamoto K,2013. Epigallocatechin-3 gallate Interferes RANKL/RANK Signal Pathway and Induces Apoptosis during Osteoclastogenesis in RAW 264 Cell. Food and Nutrition Sciences J. 5:107-116
79
Zhou J. 2006. Posphyromonas Gingivalis Affects Host Collagen Degradation by Affecting Expression, Activation, and Inhibition of Matrix Metealloproteinases. Journal of Periodontal Research, Vol. 41(1): 47-54.
