Upload
universitasjenderalsoedirman
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
PEWARNAAN ALIZARIN RED
Oleh :
Nama : Desi Ariana SNIM : B1J012145Rombongan : IKelompok : 5Asisten : Mithun Sinaga
LAPORAN PRAKTIKUM STRUKTUR DAN PERKEMBANGAN HEWAN II
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO
2013
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Alizarin Red merupakan suatu metode untuk mengetahui pembentukan tulang
pada embrio atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio. Pewarnaan
Alizarin Red kita gunakan untuk mengetahui pembentukan tulang pada embrio atau
untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio yang terjadi pada tulang
keras. Tulang yang diwarnai oleh Alizarin red akan berwarna merah tua, yang
menandakan bahwa tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna merah tua
terbentuk karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang.
Proses kalsifikasi pada embrio ayam dapat diamati ketika mulai umur inkubasi 9
hari. Selain metode pewarnaan alizarin red juga terdapat metode Alician Blue yang
digunakan pada tulang rawan (Jessop, 1988).
Alizarin adalah sebuah komponen berwarna merah-orange yang memiliki
rumus molekul C14H8O4. Komponen ini merupakan derivat dari anthraquinon, dengan
gugus hidroksil tersubstitusi pasa posisi 1 dan 2. Alizarin terjadi secara alami sebagai
glukosida pada tanaman Rubia tinctorum (Mahanthesha, et al., 2009).
Struktur Alizarin
Pewarnaan alizarin red ini digunakan untuk mendeteksi proses klasifikasi pada
tulang embrio. Tulang yang diwarnai menggunakan alizarin red akan berwarna
merah tua apabila tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna ini muncul
karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang (Jasin,
1989). Teknik pewarnaan pada tulang dengan zat warna alizarin red. Bagian dalam
modifikasi akan berwarna merah. Bagian tersebut seperti: tulang dahi (frontal),
tulang rahang, radius ulna, tulang ujung jari, scapula, tulang rusuk, femur, tibia, serta
fibula (Sukra, 2000).
Menurut Setyawati (2011), tulang dapat dibentuk dengan dua cara, yaitu
melalui mineralisasi langsung pada matriks yang disekresi oleh osteoblast (osifikasi
intra membranosa) atau melalui penimbunan matriks tulang pada matriks tulang
rawan sebelumnya (osifikasi endokondral). Baik osifikasi intra membranosa atau
osifikasi endokondral, jaringan tulang yang pertama kali dibentuk adalah jaringan
primer atau muda. Tulang primer adalah jaringan yang bersifat sementara dan tidak
lama kemudian diganti oleh jenis tulang berlamela yang tetap, disebut tulang
sekunder. Menurut Huffman et al (2007) tulang esteoid diperkaya dalam
fosfoprotein, asam glikoprotein dan proteoglikan, beberapa yang mirip dengan BSP
atau fragmen nukleator dari kristal hidroksiapatit. Matriks tulang mengandung unsur-
unsur yang sama seperti jaringan-jaringan penyambung lainnya, serat-serat dan
bahan dasar. Pengendapan matriks ini oleh osteoblast disebut osifikasi. Pengendapan
garam-garam kalsium dalam matriks ini disebut kalsifikasi (pengapuran), suatu
proses yang terjadi normal pada tulang tetapi dapat terjadi patologis dalam jaringan
penyambung lain, seperti tulang rawan dan dinding pembuluh darah. Kalsifikasi
belum terjadi dalam matriks tulang, daerah itu disebut osteoid (Yatim 1983).
Praktikum kali ini menggunakan mencit (Mus musculus) karena mencit lebih
mudah diperoleh, tulang-tulang yang sudah terwarnai mudah diamati, dan
menghasilkan anakan yang banyak dalam sekali kehamilan.
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa dapat mengerjakan prosedur
perwarnaan Alizarin dan menerangkan proses kalsifikasi tulang pada fetus mencit
(Mus musculus).
II. MATERI DAN METODE
A. Materi
Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah cawan petri,
baki, 8 botol sampel, kertas label, spuit injeksi tanpa jarum, pipet tetes, fetus mencit
(Mus musculus), larutan alkohol 96%, akuades, KOH 1%, KOH 2%, larutan pewarna
AR, NaCl fisiologis, larutan penjernih A (gliserin 20 bagian + KOH 4% 3 bagian +
akuades 77 bagian), larutan penjernih B (gliserin 50 bagian + KOH 4% 3 bagian +
akuades 47 bagian), dan larutan penjernih C (gliserin 75 bagian + akuades 25
bagian).
B. Metode
Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah :
1. Fetus mencit diletakkan di cawan petri.
2. Bagian amnion fetus dibuang.
3. Fetus mencit dibersihkan dengan cara dimasukkan ke NaCl fisiologis
selama 10 menit.
4. Fetus mencit dimasukkan ke akuades selama 10 menit untuk membilas.
5. Fetus mencit dimasukkan ke dalam larutan alkohol 96% dan direndam
selama 12 jam.
6. Larutan diganti dengan akuades dan direndam selama 10 menit.
7. Larutan diganti dengan KOH 1% dan direndam selama 3 jam.
8. Larutan diganti dengan pewarna AR dan direndam selama 4 jam.
9. Larutan diganti dengan KOH 2% dan direndam selama 30 menit.
10. Larutan diganti dengan larutan penjernih A, B dan C dan direndam masing-
masing selama 1 jam.
11. Bagian yang terwarnai diamati dan didokumentasikan tiap tahapannya.
Gambar J
Keterangan Gambar :
1. Gambar A : Foto fetus mencit sebelum diberi perlakuan
2. Gambar B : Foto fetus mencit di dalam larutan NaCl fisiologis
3. Gambar C : Foto fetus mencit setelah dimasukkan alkohol 96 %
4. Gamabr D : Foto fetus mencit setelah dimasukkan akuades
5. Gambat E : Foto fetus mencit setelah dimasukkan KOH 1%
6. Gambar F : Foto fetus mencit setelah dimasukkan alizarin red
7. Gambar G : Foto fetus mencit setelah dimasukkan larutan penjernih A
8. Gambar H : Foto fetus mencit setelah dimasukkan larutan penjernih B
9. Gambar I : Foto fetus mencit setelah dimasukkan larutan penjernih C
10. Gamabr J : Skematis Gambar Tulang Mencit
Tabel 1. Data PengamatanTulang Yang Terkalsifikasi Rombongan I
No. Kelompok Tulang yang terwarnai
1. 1 Vertebrae, humerus, ribs
2. 2 Sternum, thoracic vertebrae, caudal vertebrae
3. 3 Ribs, sternum, clavicle, scapula
4. 4 Atlas, axis, clavicle, scapula, humerus
5. 5Ribs, mandibulla, humerus, axis, lumbar vertebrae, thoracic
vertebrae, sacrum, scapula, atlas, radius, ulna
6. 6 Lumbar vertebrae, sternum, skull, mandibula, carpal
B. Pembahasan
Berdasarkan praktikum yang dilakukan rombongan I didapatkan hasil bahwa
pada kelompok 1 tulang yang terwarnai adalah vertebrae, humerus dan ribs.
Kelompok 2 adalah sternum, thoracic vertebrae dan caudal vertebrae. Kelompok 3
adalah ribs, sternum, clavicle dan scapula. Kelompok 4 adalah atlas, axis, clavicle,
scapula dan humerus. Kelompok 5 adalah ribs, mandibulla, humerus, axis, lumbar
vertebrae, thoracic vertebrae, sacrum, scapula, atlas, radius dan ulna. Kelompok 6
adalah lumbar vertebrae, sternum, skull, mandibula dan carpal. Menurut Sukra
(2000), tulang-tulang yang mengalami pewarnaan dengan zat warna alizarin red
adalah tulang dahi (frontal), tulang rahang (mandibula dan maxilla), radius ulna,
tulang ujung jari, scapula, tulang rusuk, femur, tibia, serta fibula. Tulang-tulang
tersebut dapat terlihat pada embrio umur 10-15 hari karena proses pembentukan
tulang dengan cara osifikasi intramembran relatif lebih cepat dibandingkan dengan
osifikasi endokondral. Hal ini sedikit berbeda dengan referensi karena embrio yang
diamati yaitu tidak terlihatnya tulang dahi (frontal) yang merupakan tulang yang
terbentuk melalui proses osifikasi intramembran karena embrio terlihat masih terlalu
kecil.
Hasil yang didapat tiap kelompok berbeda-beda mungkin dikarenakan faktor
goncangan mekanik yang terjadi saat membawa fetus, tingkat ketelitian dalam
penambahahan larutan, umur fetus yang berbeda dan lamanya waktu perendaman
pada tiap larutan. Menurut Huffman et al (2007), tulang merupakan jaringan
vaskuler unik yang mengalami mineralisasi sebagai bagian dari proses
perkembangannya. Mineral pada tulang memiliki peran penting terhadap fungsi
tulang belakang, termasuk menyokong struktural, penyimpanan reversibel kalsium
dan fosfor, dan tempat menyimpan kandungan logam dan karbon.
Prosedur pelaksanaan yang dilakukan dalam praktikum pewarnaan alizarin red
dengan preparat fetus mencit (Mus muculus) perlakuan pertama yang kita lakukan
adalah dengan cara memasukkan fetus mencit kedalam botol sampel. Fetus mencit
yang telah bersih dari membran ekstra embrional, pukul 08.20 fetus mencit
dimasukkan ke dalam botol sampel yang telah diisi larutan alkohol 96%. Fetus
mencit direndam dalam larutan alkohol 96 % selama 12 jam, fetus mencit menjadi
lebih kecil, mengkerut dan pucat. Alkohol 96% ini berfungsi sebagai fiksatif. Setelah
12 jam sekitar pukul 20.20, larutan alkohol dibuang menggunakan spuit injeksi tanpa
jarum dan fetus mencit direndam ke dalam akuades selama 10 menit, fetus mencit
terlihat lebih transparan. Akuades ini berfungsi untuk melunturkan warna pucat pada
tubuh fetus. Pukul 20.30 akuades dibuang dan diganti dengan pemberian larutan
KOH 1% selama 3 jam, fetus mencit menjadi transparan, tulangnya mulai terlihat
dan terdapat lendir. Larutan KOH 1% berfungsi untuk mengendurkan otot menjadi
transparan dan skeletonnya terlihat jelas. Setelah jaringan otot transparan, maka
larutan KOH tadi dibuang. Pukul 23.30 larutan diganti dengan larutan pewarna
Alizarin Red dan direndam selama 4 jam, tulang pada fetus mencit mulai terwarnai
menjadi jingga kekuningan. Fungsi alizarin red adalah sebagai pewarna skeleton
menjadi kuning, jingga atau merah agar mudah untuk diamati. Karena dalam
perendaman larutan KOH 1% fetus mencit sudah sangat transparan dan lunak, tidak
dilakukan perlakuan perendaman di dalam larutan KOH 2% untuk menghindari
kerusakan pada fetus mencit. Pukul 03.30 pewarna alizarin red dibuang dan diganti
dengan larutan penjernih A, pukul 04.30 diganti dengan larutan penjernih B, pukul
05.30 diganti dengan larutan penjernih C, fetus mencit terlihat lebih transparan dan
tulangnya terlihat lebih jelas. Larutan penjernih A, B, dan C berfungsi untuk
mengurangi kelebihan pewarna yang masuk ke dalam jaringan otot sehingga otot
menjadi tampak jernih transparan. Tulang-tulang yang telah terwarnai oleh Alizarin
Red diamati dan dibandingkan dengan gambar (Villee dkk, 1988).
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi proses kalsifikasi pada embrio
ayam, yaitu:
1. Hormon paratiroid, kalsitonin, dan vitamin D yang bertanggung jawab
terhadap tingkat kadar kalsium darah yang normal, yang akan mempengaruhi
proses kalsifikasi. Kalsitonin adalah hormon yang berasal dari sel-sel
parafolikuler dari kelenjar tiroid. Hormon tersebut mempunyai aksi dalam
menurunkan kadar kalsium darah dan menghambat resorpsi tulang sehingga
mempengaruhi proses kalsifikasi.
2. Makanan juga berpengaruh dalam proses kalsifikasi. Hal ini khususnya
berlaku terhadap cukupnya persediaan dan tersedianya mineral-mineral
seperti kalsium dan fosfor, yang merupakan komponen-komponen anorganik
utama dari tulang. Kekurangan kalsium atau fosfor dalam makanan
mengakibatkan pelanggaran dan kerapuhan tulang.
Waktu yang diperlukan untuk mendapatkan embrio ayam yang telah
mengalami penulangan yaitu pada umur 10-15 hari, embrio ayam akan mengalami
penulangan. Bagian tulang yang terwarnai adalah tulang tengkorak, tulang panjang
pada alat gerak tubuh. Bagian tulang yang mengalami penulangan ditandai dengan
adanya warna merah atau ungu pada tulang tersebut (Togashi, 2007).
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya, dapat ditarik beberapa
kesimpulan bahwa:
1. Prosedur pewarnaan Alizarin Red dapat dilakukan dengan cara merendam fetus
menggunakan larutan alkohol 96% sebagai larutan fiksatif, larutan akuades
sebagai penetral fetus dari larutan alkohol, larutan KOH 1% dan KOH 2% untuk
mentransparankan otot dan skeleton fetus, pewarna Alizarin Red sebagai
pewarna skeleton dan larutan penjernih A, B dan C untuk mengurangi kelebihan
pewarna Alizarin yang terikat pada matriks tulang.
2. Kalsifikasi atau pengapuran adalah pengendapan garam-garam kalsium dalam
matriks tulang.
B. Saran
Saran yang dapat diberikan dalam praktikum kali ini adalah dalam perendaman
fetus mencit dengan menggunakan KOH 1% sebaiknya jangan terlalu lama karena
dapat merusak bentuk dari fetus mencit itu sendiri dan menjadi sulit untuk diamati.
DAFTAR REFERENSI
Huffman, N, J.K Keightley, C. Chaoying, R. J Midura, D. Lovitch, P. A Veno, S. L Dallas, J.P Gorski. 2007. Association of Specific Proteolytic Processing of Bone Sialoprotein and Bone Acidic Glycoprotein-75 with mineralization within Biomineralization Foci. The journal of biological chemistry. Vol. 282.
Jasin, M. 1989. Sistematika Hewan (Invertebrata dan Vertebrata). Sinar Wijaya, Surabaya.
Jessop, N. M. 1988. Theory and Problem of Zoology. B & JO Entreprise Pte Ltd, Singapore.
Mahanthesha.K.R. et al. 2009. Novel PVC Membrane Based Alizarin Sensor and its application; Determination of Vanadium, Zirconium and Molybdenum. Department of Chemistry, Indian Institute of Technology Roorkee, Roorkee-247 667, India.
Setyawati, Iriani, Dwi Ariani Yulihastuti. 2011. Penampilan Reproduksi dan Perkembangan Skeleton Mencit setelah Pemberian Ekstrak Buah Nanas Muda. Universitas Udayana Kampus Bukit Jimbaran, Kuta, Badung, Bali.
Sukra, Yuhara. 2000. Wawasan Ilmu Pengetahuan Embrio : Benih Masa Depan. Jakarta : Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi.
Togashi, A. Y., Cirano, F. R., Marques, M. M., Pustiglioni, F. E., Antonio, L. 2007. Characterization of Bone Cells Obtained from the Calvaria of Neonatal Rats (osteo-1) after Serial Subculture. J Appl Oral Sci. 2007;15(5):442-7.
Villee, C. A., W. F. Walker, dan R. D. Barnes. 1988. Zoologi Umum. Erlangga, Jakarta.
Yatim, W. 1983. Embryologi. Tarsito, Bandung.