連絡者 川上 浩（かわかみ ひろし）

〒1018437 東京都千代田区一ツ橋 221

共立女子大学大学院家政学研究科

(Tel & Fax0332371308

E-mailhirokami＠kyoritsu-wu.ac.jp)

2013年 4 月30日 受付

2013年 5 月23日 受理

Milk Science Vol. 62, No. 2 2013

原著論文

ラクトフェリンに夾雑する成分のプロテオーム解析

川上 浩1，早川 江2，永田宏次2，田之倉優2

（1共立女子大学大学院家政学研究科，東京都千代田区一ツ橋 221，1018437）

（2東京大学大学院農学生命科学研究科，東京都文京区弥生 111，1138657）

Proteomic analysis of impurities coexisted with lactoferrin

Hiroshi Kawakami1, Kou Hayakawa2, Koji Nagata2, and Masaru Tanokura2

(1Department of Food Science and Nutrition, Graduate School of Home Economics, Kyoritsu Women's University,

221 Hitotsubashi, Chiyoda-ku, Tokyo 1018437, Japan

2Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, University of Tokyo,

111 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 1138657, Japan)

Abstract

Lactoferrin is an iron-binding protein present in milk and other secretory ‰uids. Although a single substance, it is

known as being extremely multi-functional. Therefore, we investigated the possibility that, besides the multi-functionali-

ty derived from the lactoferrin itself, lactoferrin expressed behaviors in conjunction with other bioactive components. Im-

purities in lactoferrin used as a reagent and food ingredient were fractionated using multi-stage methods, including a‹ni-

ty chromatography with monoclonal antibodies against lactoferrin, ion exchange chromatography, and reversed-phase

chromatography. The proteins and peptides present were examined using matrix-assisted laser desorption ionization-

time of ‰ight mass spectrometry (MALDITOFMS) proteomic analysis. As a result, 51 types of proteins and peptides

with basic isoelectric points, 22 types of proteins with acidic isoelectric points, and 21 types of low-molecular weight

casein peptides were detected. Among these, many components that exhibit bioactive characteristics, including en-

zymatic activity, immunomodulating eŠects, cell proliferation, cell diŠerentiation, anti-bacterial functions, and enzyme

inhibition were present. Accordingly, close attention must be paid to analysis of the physiological action of lactoferrin

when functionally assessing in vitro cultured cell experiments and in vivo parentally administered animal testing.

緒 言

ラクトフェリン（LF）は，乳などの外分泌液や好中

球に含まれる塩基性タンパク質であり，単一物質として

は極めて幅広い多機能性をもつといわれている1)。1939

年に乳中で確認されて以来，様々な生理作用に関する研

究が行われており，MEDLINE（アメリカ国立医学図書

館生物化学情報センターが作成している生物医学文献

データベース）で検索すると，2013年 4 月時点で6,400

報以上の研究報告が検出される。現在までに，抗菌作

用2)，抗ウイルス作用3)，抗炎症作用4)，免疫調節作

用5,6)，鉄吸収調節作用7)，細胞増殖・分化促進作用8)，

鎮痛作用9)，骨代謝改善作用10,11)など，20種類以上の生

理作用が報告されている。また，生体内の様々な組織に

は，LF と特異的に結合する受容体（レセプター）の存

在も明らかにされている12)。近年，LF の生理作用に関

しては，動物実験だけではなくヒトにおける介入試験で

も，いくつかの生理作用13～16)が実証されるようになっ

た。しかしながら，これまでの生理作用に関するかなり

多くの研究成果は，動物細胞や微生物などを用いた in

vitro での知見である。この際に培養液へ添加する LF

の有効量が極めて多いことや，遺伝子組換え型 LF と乳

由来 LF の生理作用の違いなども報告されている17)。現

在のところ，実験系によって生理作用の検証結果に差異

が生じる原因は，主にヒト型，ウシ型，および遺伝子組

第巻

換え型の LF の糖鎖構造や，タンパク質の高次構造の違

いなどにあるとされており，LF が多機能性をもつタン

パク質であるという考え方が基盤となって，研究が進め

られている。

一方，LF は乳児用調製粉乳や発酵乳をはじめ，栄養

補助食品やサプリメントなどでも実用化され，様々な

LF 配合商品が世界中で販売されるようになった。公益

財団法人日本食品化学研究振興財団が公表している既存

添加物名簿収載品目リスト（平成25年 2 月 7 日更新版）

には，「ラクトフェリン濃縮物」という品名が掲載され

ている。また，その中には「哺乳類の乳から得られた

LF を主成分とするもの」という但し書きも記され，基

原・製法・本質としては，「哺乳類の乳を脱脂分離した

もの，または乳清より精製し，濃縮して得られたもの」

となっている。LF の定義を決める根拠となる定量分析

法も規定されており，ブチル化ポリビニルアルコール系

樹脂カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー

（HPLC）において，全タンパク質あたり LF を85以

上含有するものが LF 原末とされている18)。

このような中，筆者らは LF の多様な生理作用が，

LF 自体の多機能性に由来すること以外に，複数の生理

活性成分と LF が，挙動を共にすることで発現されてい

るのではないかという仮説を立てて研究を進めてきた。

すなわち，現在までに報告されている LF の生理作用が，

LF 自体によるものなのか，LF に夾雑している成分に

よるものなのかを把握しながら，LF の多機能性につい

て明らかにしたいと考えている。一般的に試薬として市

販されている LF の純度は90程度であるが，食品添加

物として使用されている LF 原末は，総タンパク質あた

り85以上の LF を含有していれば，「ラクトフェリン」

として使用できる。そこで，こうした市販 LF に含まれ

る LF 以外の成分を特定し，既に報告されている様々な

生理作用との相関について考察することは重要な課題で

ある。本報では，市販 LF の中の一部ではあるが，比較

的容易に入手できる LF を対象に，各種クロマトグラフ

ィーで夾雑する成分を分離し，そこに含有されるタンパ

ク質およびペプチドについてプロテオーム解析したので

報告する。

材料および方法

. LF 試料

過去に報告された生理作用に関する論文で，最も多く

使用されている Sigma 社のウシ LF（製品番号 L9507），

および海外サプライヤーから入手した LF 原末 3 種類を

用いた。

. 抗 LF モノクローナル抗体の調製

ウシ LF に対するモノクローナル抗体は，アメリカ生

物資源バンク（ATCCAmerican Type Culture Collec-

tion）のマウスハイブリドーマ HB8852を培養して得

た。すなわち，ハイブリドーマ用無血清培地 HyQ

SFM4MAb（HyClone）で HB8852を培養した後，生

理食塩水に分散させて Balb/c 系マウス（日本クレア

雄，8 週齢）の腹腔内に注射し，7～10日後に腹水を回

収した。遠心分離（15,000×g，90分間）で清浄化した

腹水に，飽和硫酸アンモニウム溶液を等量混合し，タン

パク質画分を沈殿させて遠心分離（3,500×g，20分間）

で回収した。さらに，生体成分クロマトグラフィーシス

テム AKTAexplorer 10S（GE ヘルスケアジャパン）を

用いて，HiTrap Protein G HP カラム（GE ヘルスケア

ジャパン）で抗 LF モノクローナル抗体を精製した。

. LF 夾雑画分の分離

抗 LF モノクローナル抗体を HiTrap NHSactivated

HP（GE ヘルスケアジャパン）に固定化し，AKTAex-

plorer 10S で抗体アフィニティークロマトグラフィーを

行い，市販 LF から LF 以外の夾雑成分を分離した。す

なわち，Kawakami ら19)の方法に準じて，抗体固定化

カラムに LF 試料を通液して素通り画分を回収し，透析

モジュール FloatALyzer G2（SPECTRUM Labs

分画分子量100500）で超純水に対して透析後，凍結乾

燥して LF 夾雑画分とした。

. LF 夾雑成分の同定

HPLC システム LC10A（島津製作所）で，陽イオ

ン交換カラム TSKgel SP5PW（東ソー7.5 mm×75

mm）を用いて，LF 夾雑成分を分画した。溶媒は10

mM リン酸緩衝液（pH 7.0）を用い，0.1～1.6 M NaCl

のグラジエント溶出を行った。その際のクロマトグラム

の一例を Fig. 1 に示す。溶出液を20等分のフラクショ

ンに分け，各画分を限外濾過（UF）膜セントリカット

U10（KURABO分画分子量10 kDa）で濃縮した。

UF 濃縮画分については，N末端アミノ酸配列をプロ

テインシークエンサー PPSQ21A（島津製作所）で分

析し，アメリカ国立生物工学情報センター（NCBI

National Center for Biotechnology Information）の配列

データベース検索システム BLAST（Basic Local Align-

ment Search Tool）を利用してタンパク質を同定した。

また，複数成分の存在により同定が困難であった画分に

ついては，トリプシン消化を行った後，XBridge BEH

C18カラム（Waters4.6 mm×150 mm）を用いて，

0.1ギ酸含有アセトニトリルによるグラジエントで分

画し，レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（MALDI

TOFMS）AXIMA CFR plus（島津製作所）を用い

て，ペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）

Fig. 1 Fractionation of impurities coexisted with lac-

toferrin by cation exchange high performance liq-

uid chromatography.

第号

法により質量分析し，タンパク質同定システム MAS-

COT Server（Matrix Science）でタンパク質を同定し

た。UF 透過画分については，Senshu Pak C18カラム

（センシュー科学4.6 mm×150 mm）を用いた HPLC

で分画し，溶出ピークごとに N末端アミノ酸配列を解

析し，BLAST を利用して検知したペプチドの候補を検

索した。また，AXIMA CFR plus で溶出ピーク成分の

MALDITOFMS 解析も行い，分子量を求めた。以上

のように，アミノ酸配列と分子量測定の結果から，総合

的にタンパク質とペプチドを同定した。

結 果

. 塩基性タンパク質

LF 夾雑画分から検出された塩基性（等電点（pI）が

7 を超えるもの）のタンパク質とペプチドを，Table 1

にまとめた。酵素関連では，cAMP 依存性のプロテイ

ンキナーゼ，水酸化酵素であるシトクローム P450，プ

ロテアーゼの一種であるエラスターゼ 2，酸化還元酵素

であるラクトパーオキシダーゼやキサンチンデヒドロゲ

ナーゼ，ペプチドグリカンなどを構成する多糖類の加水

分解酵素であるリゾチーム，高マンノース型糖鎖の加水

分解酵素である aマンノシダーゼ，活性酸素産生に関

与する NADPH オキシダーゼ，ペプチド鎖プロリン残

基のシス・トランス体を異性化するペプチジルプロリル

シストランスイソメラーゼ，およびリボ核酸（RNA）

を加水分解するリボヌクレアーゼが検出された。酵素阻

害成分としては，システインプロテアーゼインヒビター

であるアプロチニン，シスタチン C，およびプロテイン

C インヒビターが検出された。増殖因子としては，コン

ドロモジュリン，繊維芽細胞増殖因子（FGF），イン

スリン様成長因子（IGF)および，神経成長因子

（NGF），トランスフォーミング増殖因子（TGF）b1,

growth regulated protein homologa, b，およびg が検

出された。受容体あるいは結合性タンパク質としては，

FGF 結合性タンパク質，IGF 結合性タンパク質，葉酸

結合性タンパク質，およびオリゴ糖結合性タンパク質が

検出された。抗菌ペプチド関連では，bデフェンシ

ン，舌抗菌ペプチド（lingual antimicrobial peptide），

および気管抗菌ペプチド（tracheal antimicrobial pep-

tide）が検出された。免疫機能関連では，補体 C4，免

疫グロブリン（Ig）g2 鎖定常領域，IgG2a 重鎖定常領

域，IgG3 重鎖定常領域，セクレタリーコンポーネント

（SC），T 細胞受容体 b 鎖，T 細胞表面糖タンパク質

CD8a 鎖，単球走化性タンパク質1（MCP1），上皮細

胞炎症性タンパク質1（epithelial cell in‰ammatory

protein1）が検出された。その他の生理活性成分とし

ては，降圧作用をもつアドレノメデュリン，血管新生作

用をもつアンジオジェニン1，精巣上体から分泌され

て精子の成熟に関与する epididymal secretory protein

E1，卵胞刺激ホルモンの分泌を抑制するインヒビン bB

鎖，転写因子 NFkB p49サブユニット，線維素溶解酵素

プラスミンの前駆体であるプラスミノーゲン，妊娠特異

的糖タンパク質（pregnancy-speciˆc glycoprotein）な

どが検出された。構造および輸送タンパク質としては，

主要組織適合抗原複合体（MHCmajor histocompati-

bility complex）の構成成分である b2ミクログロブリ

ン，細胞間接着分子であるデスモコリン1，クロマチ

ン構成タンパク質であるヒストン H1 および H2A，リ

ボソームタンパク質 S2（ribosomal protein S2），セラ

ミドを小胞体からゴルジ体に運ぶ ceramide transfer

protein などが検出された。

. 酸性タンパク質

LF 夾雑画分から検出された等電点（pI）7 未満の酸

性タンパク質を，Table 2 にまとめた。一般的によく知

られている乳タンパク質としては，aラクトアルブミ

ン，bラクトグロブリン，カゼイン（as1，as2，b，

k），および血清アルブミンが検出された。特に，カゼ

イン類は Fig. 1 のクロマトグラムにおけるほとんどの

画分にみられた。酵素関連では，ホスホリパーゼ A2，

プロスタグランジン D2 シンターゼ，およびアミドヒド

ロラーゼが検出された。免疫関連成分では，腫瘍壊死因

子（TNFa），補体 C3 および C4，免疫グロブリン（Ig）

G1 重鎖定常領域，IgM 重鎖定常領域，Igl 型軽鎖が検

出された。その他の生理活性成分としては，glycosyla-

tion-dependent cell adhesion molecule1（GlyCAM1),

high mobility group protein1 (HMG1), neutrophil

gelatinase-associated lipocalin，およびトランスフェリ

ンが検出された。

Table 1 Basic proteins and peptides detected in commercial lactoferrin.

Group Name pI MW(kDa)

Enzymes cAMPdependent protein kinase 9.0 40.6

Cytochrome P450 9.2 56.8

Elastase 2 9.2 28.9

Lactoperoxidase 9.2 80.6

Lysosomal amannosidase 9.3 108.5

Lysozyme 11.2 14.3

Neutrophil NADPH oxidase factor 1 9.4 45.3

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B 9.5 22.7

Ribonuclease (pancreas) 9.6 13.9

Ribonuclease (brain) 9.8 16.0

Ribonuclease (semen) 9.6 13.7

Xanthine dehydrogenase 8.4 146.8

Enzyme inhibitors Aprotinin 9.7 6.4

Cystatin C 9.5 13.4

Protein C inhibitor 9.6 45.3

Growth factors Chondromodulin II 9.6 14.5

Fibroblast growth factor (FGF) 9.8 17.2

Growth regulated protein homolog a, b, g 10.2 11.0

Insulin like growth factor (IGF)I 9.8 14.7

IGFII 9.6 17.2

Nerve growth factor (NGF) 9.9 13.0

Transforming growth factor (TGF) b1 9.0 36.2

Binding proteins FGF binding protein 9.6 26.2

Folate binding protein 8.7 25.8

IGF binding protein 7.9 34.0

Oligosaccharide binding protein 9.8 21.1

Antimicrobial peptides bdefensin 11.3 4.8

Lingual antimicrobial peptide 11.4 7.0

Tracheal antimicrobial peptide 10.5 6.9

Immunomodulating substances Complement C4 fragment 10.3 9.0

Epithelial cell in‰ammatory protein1 9.8 3.4

Immunoglobulin (Ig)g2 chain C region 8.7 36.0

IgG2a heavy chain constant region 8.3 35.8

IgG3 heavy chain constant region 8.3 38.7

Monocyte chemoattractant protein (MCP)1 9.9 11.1

Secretory component (SC) 7.7 82.4

T cell receptor b chain 10.0 14.3

T cell surface glycoprotein CD8 a chain 9.9 26.4

Other bioactive substances Adrenomedullin 11.1 21.0

Angiogenin1 9.5 14.6

b2microglobulin 8.8 11.8

Ceramide transfer protein 8.3 22.0

Desmocollin1 10.1 87.0

Epididymal secretory protein E1 8.9 16.2

Histone H1 10.8 10.5

Histone H2A 11.2 13.9

Inhibin b B chain 9.2 44.9

NFkB p49 subunit 9.2 49.1

Plasminogen 8.2 91.1

Pregnancy-speciˆc glycoprotein 9.4 42.3

Ribosomal protein S2 10.7 30.5

第巻

Table 2 Acidic proteins detected in commercial lactoferrin.

Group Name pI MW(kDa)

Major milk proteins alactalbumin 4.9 14.1

blactoglobulin 4.8 18.4

as1casein 4.7 24.5

as2casein 4.7 26.0

bcasein 5.4 25.1

kcasein 5.8 17.9

Serum albumin 6.2 69.3

Enzymes Amidohydrolase 4.9 65.0

Phospholipase A2 5.7 60.0

Prostagrandin D2 synthase 4.4 26.0

Immunomodulating substances IgG1 heavy chain constant region 6.6 35.8

IgM heavy chain constant region 5.4 52.3

Ig l light chain 6.1 24.7

Complement C3 5.3 17.0

Complement C4 5.2 28.7

Tumor necrosis factor (TNF)a 5.5 17.3

Other bioactive substances Glycosylation-dependent cell adhesion molecule1(GlyCAM1) 6.8 17.1

High mobility group protein1 5.8 24.9

Neutrophil gelatinase-associated lipocalin 5.3 23.0

Transferrin 5.9 78.0

Table 3 Casein peptides detected in commercial lactoferrin.

Original protein Amino acid sequence region(# of amino acid residues)

as1casein 113(13mer)

115(15mer)

120(20mer)

121(21mer)

2339(17mer)

103121(19mer)

as2casein 138151(14mer)

150157( 8mer)

150165(16mer)

151165(15mer)

151166(16mer)

174180( 7mer)

174181( 8mer)

182190( 9mer)

182197(16mer)

189197( 9mer)

189198(10mer)

189207(19mer)

198203( 6mer)

198207(10mer)

200207( 8mer)

第号

. カゼイン由来ペプチド

精製時に UF 膜を透過した低分子画分からは，Table

3 に示すようなカゼインペプチド群が検出された。すな

わち，as1カゼインの N末端領域のペプチドとして，

アミノ酸配列 113（13mer），115（15mer），120

（20mer），および 121（21mer）が検出された。ま

た，アミノ酸配列2339（17mer）および103121（19

mer）のペプチドが検出された。as2カゼイン由来で

は，C末端領域のペプチドとして189207（19mer），

198207（10mer），および200207（8mer）に相当

するペプチドが検出された。また，アミノ酸配列138

151（14mer），150157（8mer），150165（16mer），

151165（15mer），151166（16mer），174180（7

mer），174181（8mer），182190（9mer），182

197（16mer），189197（9mer），189198（10mer），

および198203（6mer）に相当するペプチドが検出さ

れた。

考 察

LF には多様な生理作用が報告されているが，試験に

供する LF 試料によっては，その作用が LF 自体による

ものなのか，あるいは夾雑成分によるものなのかを，慎

重に判断しなくてはならない可能性が，今回の結果から

明らかとなった。乳は新生児の成長に必須の栄養物であ

るだけでなく，最適な生理状態を維持するために，様々

な生理活性成分を含んでいる生体分泌物である。最近で

は，プロテオーム分析技術の進展とともに，様々な動物

種の乳成分に関する網羅的解析が盛んになり，従来の教

第巻

科書には記載されていないような成分の存在が，次第に

明らかにされつつある。Hettinga ら20)は，人乳と牛乳

に含まれる生体防御タンパク質について，ショットガ

ン・プロテオミクス解析を行い，人乳中に268種類，牛

乳中に269種類のタンパク質を検出した。そのうち，生

体防御系に関与すると思われる成分は，人乳が44種

類，牛乳が51種類であったと報告している。牛乳を加

工利用して一般的な乳製品を生産する際には，全く気に

する必要のなかったような微量成分が，プロテオーム解

析を行うと見えてくる。また，特殊な加工工程を経て生

産される LF のような特定原料では，牛乳中の微量成分

も濃縮されて顕在化する可能性がある。LF の生産方法

は，試薬レベルと原料レベルでは全く異なるが，知的所

有権などの制約もあり，原料メーカーごとに異なってい

る。例えば，LF を濃縮する際に使用されるイオン交換

樹脂の種類，原料乳の種類（脱脂乳あるいは乳清）や熱

履歴，乳牛の品種，および搾乳の時期（泌乳期）などに

よって，LF に夾雑する成分が異なる可能性を筆者らは

感じている。食品添加物の基準においては，「ラクトフ

ェリン濃縮物」という品名の扱いであり，全タンパク質

あたり85以上の LF を含有していれば，原料表示に

「ラクトフェリン」と記載できる。純度100の LF を工

業的に生産することは非常に困難であり，食品原料とし

ては必ずしも高純度 LF を必要としないので，乳の価値

を広く実用化していくためには，極めて現実的な対応が

なされているのが現状である。

一方，学術分野においては，実験に使用する LF 試料

が，どのような夾雑成分を含有しているのかを認識しな

がら，研究を進めることが重要である。特に，in vitro

における培養細胞実験や，実験動物での非経口投与実験

などで生理作用を評価する場合は，本研究で明らかにな

ったような微量成分の存在を無視することはできない。

LF には，20種類以上の様々な生理作用が報告されてい

るが，今回の結果と照らし合わせると，LF 自体の活性

なのかどうかを検証し直す必要性のある生理作用も出て

くる可能性がある。その場合は，純度100の LF と夾

雑成分の生理作用を比較するなどの検討が望まれるが，

乳という生体分泌液から純度100の LF を分離精製す

ることは，実験室レベルであっても決して容易なことで

はない。本研究では，抗 LF モノクローナル抗体を用い

たアフィニティークロマトグラフィーで LF 夾雑成分を

分離したが，抗体カラムに吸着した方の LF には，未同

定の夾雑成分が LF 分子と結合し，残存している可能性

は拭いきれない。そこで最近では，試薬としてだけでは

なく，原料生産レベルでも実用化の可能性がみえてきた

遺伝子組換え型 LF の利用21,22)が注目されている。しか

しながら，遺伝子組換え型 LF を産生する細胞や微生物

菌体を培養する培養液，あるいはトランスジェニック家

畜の乳から，LF を十分に分離精製できるかどうかも重

要な課題である。生体内には LF レセプターの存在が確

認されているが，その研究の中では，LF と非特異的に

結合する様々な生体成分も明らかにされている12)。特

に，塩基性の等電点をもつ LF は，酸性タンパク質と静

電的に結合する可能性があるとともに，イオン交換クロ

マトグラフィーで LF を精製する際には，他の塩基性タ

ンパク質との分離も困難を極めるところである。また，

LF とリポポリサッカライド（LPS）との極めて強固な

結合特性についても知られており，LF と LPS の複合

体が，マクロファージなどの Toll 様レセプター4

（TLR4）に結合することで，炎症性サイトカイン産生

に影響を及ぼすことも報告されている23)。

今回の結果から，酵素，免疫調節物質，増殖因子，抗

菌物質，酵素阻害物質など，様々な生理活性成分の存在

が LF 試料中に確認できた。Fong ら24)は，乳清に含ま

れるタンパク質を，イオン交換クロマトグラフィーで分

画した後，網羅的にプロテオーム解析した結果を報告し

ている。この研究では，脱脂乳に 1M 塩酸を加えて等

電沈殿によりカゼインを除いた後，上澄みの酸ホエイを

分析の対象としている。陰イオン交換 HiTrap Q HP カ

ラムおよび陽イオン交換 HiTrap S HP カラムを用い

て，それぞれに吸着あるいは素通りしたタンパク質を回

収して分析したものである。LF を含む乳清全体を対象

に解析が行われた結果，タンパク質82種類が検出され

た。我々の研究では，LF を精製するための条件で分離

した試料に夾雑する成分を対象にしたプロテオーム解析

であったため，同定されたタンパク質の種類は Fong

ら23)の報告よりも少なかったが，塩基性のタンパク質

やペプチドが51種類と相対的に多く，酸性タンパク質

は22種類であった。特に，細胞増殖因子，各種酵素

類，免疫調節物質，抗菌物質などが検出されたことか

ら，細胞の増殖や分化，酵素活性，免疫調節，抗菌活性

などに関する LF の生理作用にしては，慎重に評価する

必要があると思われる。例えば，LF には骨代謝調節作

用が報告されているが，骨芽細胞や破骨細胞の増殖や分

化に影響を及ぼす TGFb25)，IGF26)，FGF27)，コンド

ロモジュリン28)，ラクトパーオキシダーゼ29)，シスタ

チン C30)，およびアンジオジェニン31)などが，LF 夾雑

成分の中に同定されたことは興味深い。さらに，今回の

解析では，低分子のカゼインペプチドが複数検出された。

as1カゼインの N末端領域や，as2カゼインの C末

端領域のペプチドが複数存在することに特徴がみられた

ことから，降圧作用や免疫調節作用をはじめとする様々

な生理作用32)との関係が示唆される。しかしながら，

これらカゼインペプチドは乳中のプロテアーゼの作用で

生じたものと考えられ，原料乳を保存する際の冷蔵条件

などによって酵素の影響も異なることから，こうしたペ

第号

プチドプロファイルは変動する可能性もある。

プロテオーム分析技術は年々進歩しており，同じ検体

を解析したとしても，さらなる微量成分が検出される可

能性もあるため，今回の解析で LF 夾雑成分の全てが網

羅されているわけではない。また，原料メーカーごとに

LF の製造方法が異なることから，LF 夾雑成分の組成

や量が，LF 原料ごとに異なることも考えられる。LF

は多機能性タンパク質であるといわれ，世界中の研究者

が様々な生理作用を解明すべく，長年にわたり研究を重

ねている。今後も引き続き，実験に供する LF の生化学

的特性に十分注意しながら，生理作用に関する課題に取

り組むことが望まれる。LF の生理作用を検証するヒト

介入試験や動物実験では，経口的に LF を摂取する場合

が多いので，今回検出されたような微量の生理活性成分

が，生体の消化吸収機構を経て生理作用を発揮する可能

性は，それほど高くはないと思われる。しかしながら，

in vitro における培養細胞実験や，in vivo で非経口的に

LF を投与する動物実験などの場合は，極めて微量で活

性発現する夾雑成分が影響する可能性もあると考えられ

る。

要 約

ラクトフェリン（LF）は，乳などの外分泌液に含ま

れる鉄結合性タンパク質であるが，単一物質としてはそ

の多機能性が極めて高いことが知られている。そこで我

々は，この多機能性が LF 自体に由来すること以外に，

その他の生理活性成分と LF が挙動を共にすることで発

現されている可能性について検討した。試薬や食品原料

として使用される LF に夾雑する成分を，抗 LF モノク

ローナル抗体によるアフィニティークロマトグラフ

ィー，イオン交換クロマトグラフィー，および逆相クロ

マトグラフィーなどによる多段階の方法で分画した。さ

らに，レーザーイオン化飛行時間型質量分析計による

MALDITOFMS プロテオーム解析で，含有されるタ

ンパク質およびペプチドを調べた。その結果，塩基性の

等電点をもつタンパク質やペプチドが51種類，酸性の

等電点をもつタンパク質が22種類，および低分子のカ

ゼイン分解ペプチド21種類が検出された。これらの中

には，酵素活性，免疫調節作用，細胞増殖作用，細胞分

化促進作用，抗菌作用，酵素阻害作用など，様々な生理

活性を示す成分が含まれる。したがって，in vitro にお

ける培養細胞実験や，in vivo で非経口的に投与する動

物実験での機能評価においては，LF の生理作用の解析

に細心の注意を払う必要があると考えられた。

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