19

เชียงใหม่สัตวแพทยสาร 2557; 12(1): 19-29

บทความต้นฉบับ

ผกามาศ ศุขรุ่งเรือง1, รวีวรรณ รุ่งฤดีสมบัติกิจ1, นิภา โชคสัจจะวาที2, ศริญญา พรเอี่ยม2,

พชรพร บุญโคตร1, ภาคภูมิ ตาดี1, ประภาส พัชนี1, ภาณุวัฒน์ แย้มสกุล1,*

1 คลินิกสุกร ภ�ควิช�คลินิกสัตว์บริโภค คณะสัตวแพทยศ�สตร์ มห�วิทย�ลัยเชียงใหม่2 หน่วยวิจัยเทคโนโลยีชีวภ�พอ�ห�ร ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภ�พแห่งช�ติ

บทคัดย่อ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อเปรียบเทียบอำานาจการจำาแนกและความแตกต่างของลายพิมพ์ดีเอ็นเอ

ของเชื้อSalmonellaRissenและSalmonellaTyphimuriumโดยวิธีทางอณูชีววิทยา2วิธีได้แก่Pulsed-field

GelElectrophoresis(PFGE)และRepetitiveElementsequence-basedPCR(rep-PCR)ซึ่งเชื้อที่นำามาใช้

ในการศกึษาครัง้นีเ้ป็นเชือ้Salmonellaทีเ่พาะแยกจากฟารม์สกุรในพ้ืนทีจั่งหวดัเชียงใหม่ลำาพนูได้แก่เช้ือSalmonella

Rissen จำานวน 16 สายพันธุ์ และ Salmonella Typhimurium จำานวน 14 สายพันธุ์ โดยยืนยันซีโรไทป์ของ

เชือ้แบคทเีรยีโดยศนูยซ์ลัโมเนลลาและชิเจลลากรมวิทยาศาสตรก์ารแพทย์กระทรวงสาธารณสุขทำาการจำาแนกรปูแบบ

ทางพนัธกุรรมของเชือ้ดว้ยวธิีPFGEและrep-PCRและรปูแบบลายพมิพD์NAของเชือ้ท่ีไดจ้ะเขา้สูขั่น้ตอนการเปรียบเทยีบ

ลักษณะความเหมอืนและความแตกต่างและการสรา้งแผนภมูต้ินไม้โดยใชซ้อฟทแ์วร์โปรแกรมBionumericsversion

3.5พบว่าวิธีPFGEมีอำานาจในการจำาแนก(Discriminatorypower)เท่ากับ0.43,0.47,0.85และ0.9ที่ดัชนี

ความเหมือน(Similarityindex)80%,85%,90%และ95%ตามลำาดับและวิธีrep-PCRมีอำานาจในการจำาแนก

เท่ากับ0.55,0.69,0.88และ0.95ที่ดัชนีความเหมือน(Similarityindex)80%,85%,90%และ95%ตามลำาดับ

เชียงใหม่สัตวแพทยสาร 2557;12(1): 19-29

คำาสำาคัญ:PFGE,rep-PCR,Salmonellaspp.

ติดต่อขอสำาเนาบทความไดท้ี ่ :ภาณวุฒัน์แยม้สกลุภาควชิาคลนิกิสตัวบ์รโิภคคณะสตัวแพทยศาสตร์มหาวทิยาลยัเชยีงใหม่ต.แมเ่หยีะ

อ.เมืองจ.เชียงใหม่50100โทรศัพท์:053948024,Email:ninunu@gmail.com

วันที่ได้รับบทความ17สิงหาคม2556

อำานาจจำาแนกและการศึกษาเปรียบเทียบความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อ Salmonella โดยวิธี PFGE และ rep-PCR

บทนำา Salmonella เป็นเชื้อแบคทีเรียแกรมลบ

อยู่ในกลุ่มEnterobacteriaceaeมีลักษณะรูปแท่งสั้น

ไมส่รา้งสปอร์ไมส่รา้งแคปซลูมขีนาด0.7-1.5ไมโครเมตร

ยาว 2.0-5.0 ไมโครเมตร เจริญได้ดีในรูปที่มีและไม่มี

ออกซิเจน (Facultative anaerobe) เป็นเชื้อที่เป็น

สาเหตุสำาคัญของโรคท่ีเกิดจากอาหาร สามารถก่อโรค

ได้ทั้งในมนุษย์และสัตว์ (Ibarra & Steele-Mortimer,

2009) เช่น กระเพาะอาหารและลำาไส้อักเสบ ไปจนถึง

การติดเชื้อในกระแสเลือด ซึ่งก่อให้เกิดการเจ็บป่วย

การตาย และ ความสูญเสียทางเศรษฐกิจ จึงนับว่าเป็น

ปัญหาสาธารณสุขที่ทั่วโลกกำาลังให้ความสำาคัญ (Liuet

al.,2011)ดังนั้นหน่วยงานหลายๆหน่วยงานไม่ว่าเป็น

ด้านปศุสัตว์ อาหาร และสาธารณสุขมีความจำาเป็น

20

ทีจ่ะตอ้งดำาเนนิงานร่วมกันอยา่งใกลชิ้ดโดยพบวา่ทางเดนิ

อาหารของสตัวเ์ปน็แหล่งอมโรคหลกัของเชือ้Salmonella

และมักจะติดต่อไปยังมนุษย์ โดยการปนเป้ือนไปกับ

ผลิตภัณฑ์เนื้อสัตว์(Stepanetal.,2011)

สำาหรบัการพบเชือ้ในสตัว์เชน่ในสกุรสามารถ

พบได้ในอุจจาระสุกรบนพื้นคอกที่มีเช้ือ Salmonella

ปะปนออกมาเปน็ทัง้แหลง่แพรก่ระจายและสะสมของเชือ้

Salmonellaและในสุกรทีเ่ปน็พาหะนำาโรคจะสามารถพบ

เชือ้ได้ทีต่่อมทอนซลิลำาไส้และเน้ือเยือ่น้�เหลอืงทีล่ำาไส้จงึ

ทำาใหสุ้กรทีเ่ป็นพาหะเปน็แหลง่แพรเ่ชือ้ทีส่ำาคญัไปยงัสตัว์

อื่นๆรวมถึงมนุษย์(DeBusseretal.,2011)เนื่องจาก

มโีอกาสปนเป้ือนเช้ือตา่งๆไดต้ลอดกระบวนการผลติเริม่

ตัง้แต่ในขณะท่ีสุกรอยูใ่นฟาร์มเกิดขึน้ในระหวา่งการขนสง่

สกุรจากฟารม์ไปยงัโรงฆ่าสัตว์ในระหว่างกระบวนการฆ่า

สกุรหรอืในระหวา่งการขนสง่และเกบ็รักษาเนือ้สกุรกอ็าจ

เป็นไปได้ (Magistralietal.,2008)ดังนั้นการระบุรูป

แบบการติดต่อตั้งแต่ที่ฟาร์มจึงเป็นขั้นตอนสำาคัญในการ

ลดการปนเปื้อนของเชื้อSalmonellaในเนื้อสุกร

ในการศึกษาทางระบาดวิทยาพบว่ามีวิธีการ

จำาแนกชนดิของเชือ้ในระดับโมเลกลุทีน่ำามาใช้ในการจำาแนก

รูปแบบทางพันธุกรรมของเชื้อ Salmonella หลายวิธี

เช่น Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE)

(Kilicetal.,2010)โดยอาศัยหลักการคือสามารถแยกช้ิน

ส่วนดีเอ็นเอขนาดใหญต่ัง้แต่10กโิลเบสถงึ10เมกาเบส

โดยใช้pulsedelectricfieldซึ่งมีการสลับสนามไฟฟ้า

สองด้าน (Nassonova, 2008) PFGE ใช้ restriction

enzymeในการตดัยอ่ยดเีอน็เอของแบคทเีรยีในตำาแหนง่

ที่จำาเพาะซึ่งจะทำาให้ได้ดีเอ็นเอขนาดหลายๆขนาดและ

นำามาสร้างเป็นลายพิมพ์ดีเอ็นเอ ซึ่งข้อดีของวิธีการนี้

คือสามารถประยุกต์ใช้กับเชื้อแบคทีเรียก่อโรคเพื่อใช้ใน

ทางระบาดวิทยาได้นอกจากนี้ PFGE มีอำานาจในการ

จำาแนกมากกว่าเทคนิค ribotypingหรือmulti-locus

sequence typing ในหลายๆแบคทีเรียและเป็นวิธีที่

สามารถจำาแนกความแตกตา่งของเชือ้ไดอ้ยา่งคงที่สามารถ

ทำาซ้�ได้ถือว่าเป็นgoldstandard(Kilicetal.,2006)

ในการจำาแนกรูปแบบทางพันธุกรรมของเชื้อแบคทีเรีย

แต่อย่างไรก็ตามPulsed-fieldGel Electrophoresis

(PFGE) ไม่สามารถนำาไปปรับใช้ได้กับทุกห้องปฏิบัติการ

เนื่องจากมีใช้เวลานาน ต้องอาศัยผู้ที่มีความเชี่ยวชาญ

และประสบการณ์อีกทั้งวัสดุอุปกรณ์พื้นฐานที่ใช้มีราคา

สูงทำาให้เกิดปัญหาเมื่อต้องวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีจำานวน

มาก แต่ที่ผ่านมาได้มีการศึกษาพบว่ามีวิธีการอื่นที่ใช้

จำาแนกชนิดของเชื้อในระดับโมเลกุลได้เช่นRepetitive

elementsequence-basedPCR(rep-PCR)(Weigel

etal.,2004)ซึ่งจะอาศัยหลักการของรูปแบบลายพิมพ์

ดีเอ็นเอโดยแบคทีเรียสายพันธุ์เดียวกันจะมีช่วงลำาดับ

เบสที่ปรากฏซ้�ที่ตำาแหน่งnon-codingregionเหมือน

กัน(Ben-Darifetal.,2010)ซึ่งทำาให้สามารถนำามาใช้

ในการเปรยีบเทยีบความเหมอืนและความตา่งของลกัษณะ

พันธุกรรมของเชื้อแบคทีเรียได้อย่างมีประสิทธิภาพอีก

ทั้งวิธีrep-PCRเป็นวิธีที่ให้ผลเร็วทำาการปฏิบัติง่ายมี

ราคาถกูและสามารถทำาไดใ้นหอ้งปฏบิติัการพืน้ฐานทัว่ไป

(Kilic et al., 2010) จากที่ได้กล่าวมาข้างต้นพบว่า มี

ความจำาเป็นอย่างยิ่งที่จะศึกษาเปรียบเทียบอำานาจการ

จำาแนกและรูปแบบลายพิมพ์ของSalmonellaRissen

และSalmonellaTyphimuriumโดยวิธีPFGEและ

rep-PCR เพื่อใช้เป็นวิธีทางเลือกในการจำาแนกชนิดของ

เชื้อในระดับโมเลกุลที่มีอำานาจการจำาแนกสูงมีความน่า

เชื่อถือสามารถทำาได้ง่ายและประหยัดค่าใช้จ่ายต่อไป

วตัถุประสงค์ของการศึกษาในคร้ังน้ีเพ่ือเปรียบเทียบอำานาจ

การจำาแนกและความแตกตา่งของลายพมิพด์เีอน็เอของเชือ้

Salmonella RissenและSalmonellaTyphimurium

โดยวธิีPulsed-fieldGelElectrophoresis(PFGE)และ

Repetitiveelementsequence-basedPCR(rep-PCR)

อุปกรณ์และวิธีการ

ตัวอย่างและการเก็บตัวอย่าง

ทำาการศกึษาเชิงพรรณนาในแนวทางการทดสอบ

วินิจฉัย (Diagnostic Test) แต่มีลักษณะพิเศษและมี

วัตถุประสงค์เฉพาะใช้เพื่อศึกษาคุณค่าของวิธีการตรวจ

ภาณุวัฒน์แย้มสกุล

21

เพ่ือการวินิจฉัยโรค โดยเปรียบเทียบผลกับการตรวจท่ี

ถือเปน็มาตรฐานทีด่ท่ีีสดุทำาการศกึษาเชือ้Salmonella

RissenและSalmonellaTyphimuriumโดยไดร้บัการ

ยืนยันสายพันธุ์จากศูนย์ซัลโมเนลลาและชิเจลลา กรม

วิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุขโดยเป็น

เชื้อที่ได้จากการเก็บตัวอย่างจากอุจจาระของสุกร ใน

ฟาร์มสุกรบริเวณพื้นที่จังหวัดเชียงใหม่ลำาพูนเก็บรักษา

ภายใต้อุณหภูมิ-70oCรวมทั้งหมดจำานวน30สายพันธุ์

โดยทำาการแบง่เปน็เชือ้SalmonellaRissenจำานวน14

สายพันธุ์และSalmonellaTyphimuriumจำานวน16

สายพันธุ์

การตรวจทางห้องปฏิบัติการ

Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) ทำาการส่งตัวอย่างเชื้อ Salmonella ทั้ง 30

สายพันธุ์ ไปยังห้องปฏิบัติการ (Infectious disease

molecularepidemiologylaboratoryoftheOhio

StateUniversity)เพื่อหาลายพิมพ์DNAโดยวิธีPFGE

โดยใช้SalmonellaentericaserovarBraenderup

H9812เป็นมาร์คเกอร์อ้างอิงใช้restrictionenzyme

XbaI ในการตัดย่อยดีเอ็นเอของแบคทีเรียในตำาแหน่งที่

จำาเพาะ ซ่ึงจะทำาให้ได้ดีเอ็นเอขนาดหลายๆ ขนาดและ

นำามาสร้างเป็นลายพิมพ์ดีเอ็นเอ นำาภาพเจลที่ได้มาเข้า

สู่โปรแกรมBionumericssoftwareversion3.5เพื่อ

วิเคราะห์ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ(CDCPulseNetProtocol)

(CDC,2000)

Repetitive element sequence-based PCR (rep-PCR) นำาเชือ้SalmonellaRissenและSalmonella

Typhimuriumจากหลอดeppendorfลงในสารละลาย

Nutrientbroth(Difco™NutrientBroth)และนำาเข้าสู่

เคร่ืองเขยา่สารละลายทีค่วามเรว็รอบ200รอบ/นาทีภาย

ใต้อุณหภูมิ37องศาเซลเซียสเป็นเวลา24ชั่วโมงจาก

น้ันนำาไปเขา้เครือ่งปัน่เหวีย่งทีค่วามเรว็รอบ13,000รอบ/

นาทีนำาสารละลายบนผวิหนา้ออกจนเหลอืแต่ตะกอนด้าน

ลา่งและนำาไปสกดัดเีอน็เอดว้ยAlkalinepolyethylene

glycol-basedmethod(ALK-PEG)(Sigma-Aldrich.,

St.Louis,MO,USA)จากนั้นเข้าสู่ขั้นตอนพีซีอาร์โดย

การผสมสารละลายTaKaRaExTaqTMmatermix

(Takara Bio Inc., Shiga, Japan) ที่ใช้ในปฏิกิริยา

พีซีอาร์ลงในหลอดพีซีอาร์ชนิด8หลอดต่อ1แถวโดย

ปริมาตรสุดท้ายเท่ากับ25ไมโครลิตรประกอบด้วยไพร

เมอร์ERICปริมาตร0.5μM(ERIC1R(5’-ATGTAA

GCTCCTGGGGATTCAC-3’)andERIC2(5’-AAG

TAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’)ในปฏิกริยาแรก)

ไพรเมอร์GTG(5’-GTGGTGGTGGTGGTG-3’),ใน

ปฏิกริยาที่2ปริมาตร0.5μMและ10xPCRbuffer

ปริมาตร1.5mMMgCl2dNTPsปริมาตร2.5mM

และTaqDNApolymerase5U/μlทำาปฏิกิริยาพีซี

อาร์ที่95องศาเซลเซียส5นาที1รอบจากนั้นจะใช้

อุณหภูมิที่94องศาเซลเซียสเป็นเวลา45วินาทีจำานวน

30รอบอุณหภูมิ52องศาเซลเซียส เป็นเวลา1นาที

จำานวน30รอบอุณหภูมิ65องศาเซลเซียสเป็นเวลา

10นาที30รอบและรอบสุดท้ายที่อุณหภูมิ65องศา

เซลเซียสเป็นเวลา20นาทีจากนั้นนำาผลิตภัณฑ์พีซีอาร์

ที่ได้ไปตรวจสอบด้วยวิธีelectrophoresisบนagarose

gel1%และนำาเข้าสู่TBEbufferที่ระดับกระแสไฟฟ้า

135วัตต์ เป็นเวลา2ชั่วโมง20นาทีหลังจากนั้นนำา

เจลมาย้อมดว้ยEthidiumbromideและนำาไปถา่ยภาพ

เจลดว้ยเคร่ืองTyphoon9410(AmershamPharmacia

BiotechInc.,NewJersey,USA).

การวิเคราะห์รูปแบบการจำาแนกสายพันธุ์ ด้วยวิธี PFGE และ rep-PCR

นำาข้อมูลพันธุกรรมที่ได้จากวิธี Pulsed-field

GelElectrophoresis(PFGE)และRepetitiveelement

sequence-basedPCR(rep-PCR)ทั้งหมดมาวิเคราะห์

ความหลากหลายหรือความแปรปรวนทางพันธุกรรมใน

รปูของPhylogenetictreeดว้ยโปรแกรมBionumerics

อำานาจจำาแนกและการศึกษาเปรียบเทียบความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อSalmonellaโดยวิธีPFGEและrep-PCR

22

version 3.5 โดยใช้ค่า band position tolerances

2.0%และค่าoptimizationvalues1.5% คำานวณ

similarityofbandpatternโดยใช้Dicecoefficient

และสรา้งdendrogramโดยใช้unweightedpairgroup

ofarithmetricmean(UPGMA)method(Patchanee

etal.,2010)

การคำานวณอำานาจการจำาแนก และความ สอดคล้องระหว่าง PFGE และ rep-PCR การคำานวณเพ่ือหาค่าอำานาจการจำาแนกจาก

สตูรD=1-(∑n(n-1)/N(N-1))ซึง่สามารถคำานวณไดจ้าก

http://insilico.ehu.es/mini_tools/discriminatory

_power/และคำานวณคา่ความสมัพนัธร์ะหวา่งสองวธิโีดย

การหาค่าAdjustedRandcoefficientและWallace

coefficientโดยAdjustedRandcoefficientเป็นค่า

ที่ใช้บอกถึงความสอดคล้องของการจำาแนกสายพันธุ์

ทั้งสองวิธี ในขณะที่ Wallace coefficient แสดงถึง

การประมาณการทำานายผลการจำาแนกสายพนัธุข์องtyping

methodวธิหีนึง่ดว้ยอกีวธิหีนึง่(Severianoetal.,2011)

ซ่ึงสามารถคำานวณไดจ้ากwebsite:http://darwin.phy-

loviz.net/ComparingPartitions/index.php?link=Tut7

รูปที่ 1 Dendrogramเปรียบเทียบลายพิมพ์ดีเอนเอจากวิธีpulsed-fieldgelelectrophoresis(PFGE)ของเชื้อSalmonella

Rissen และ Salmonella Typhimurium ที่เพาะแยกจากกระบวนการผลิตระดับฟาร์ม ในเขตภาคเหนือตอนบน

ของประเทศไทย

ภาณุวัฒน์แย้มสกุล

23

รูปท่ี 2 Dendrogram เปรียบเทียบลายพิมพ์ดีเอนเอจากวิธี Repetitive element sequence-based PCR (rep-PCR))

ของเชื้อ Salmonella Rissen และ Salmonella Typhimuriumที่เพาะแยกจากกระบวนการผลิตระดับฟาร์ม ในเขต

ภาคเหนือตอนบนของประเทศไทย

ผลการศึกษา การจำาแนกสายพันธุ์ด้วยวิธี PFGE และ rep-PCR

จากการศึกษาอำานาจการจำาแนกของ PFGE

และrep-PCRจากตัวอย่างSalmonellaทั้งหมด30

สายพันธุ์ โดยแบ่งเป็นSalmonellaRissen14สาย

พันธุ์และSalmonellaTyphimurium16สายพันธุ์

ภาพแสดงdendrogramจากวิธีPFGEและrep-PCR

แสดงในรูปที่1และ2ตามลำาดบัพบวา่วธิีPFGEมอีำานาจ

ในการจำาแนก(Discriminatorypower)เท่ากับ0.43,

0.47, 0.85 และ 0.9 ที่ดัชนีความเหมือน (Similarity

index)80%,85%,90%และ95%ตามลำาดับและวิธี

rep-PCRมอีำานาจในการจำาแนกเทา่กบั0.55,0.69,0.88

และ0.95ที่ดัชนีความเหมือน(Similarityindex)80%,

85%,90%และ95%ตามลำาดับ(ตารางที่1)

อำานาจจำาแนกและการศึกษาเปรียบเทียบความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อSalmonellaโดยวิธีPFGEและrep-PCR

24

การเปรียบเทียบระหว่างวิธีที่ใช้ในการจำาแนก สายพันธุ์ การประเมนิความสอดคล้องระหวา่งวิธีPFGEและ

rep-PCRสามารถประเมินได้จากการคำานวณAdjusted

RandและWallacecoefficientซึง่คา่AdjustedRand

coefficient ของวิธี rep-PCR ต่อวิธี PFGE ที่ค่าดัชนี

ความเหมือน95%,90%,85%,และ80%มีค่าเท่ากับ

0.199,0.336,0.027,0.283ตามลำาดับดังตารางที่2

ค่าWallacecoefficientของวิธีrep-PCRต่อวิธีPFGE

ทีค่า่ดชันคีวามเหมอืน95%,90%,85%,และ80%มคีา่

เท่ากับ0.368,0.784,0.556,0.724ตามลำาดับและค่า

WallacecoefficientของวิธีPFGEต่อวิธีrep-PCRที่

ค่าดัชนีความเหมือน95%,90%,85%,และ80%มีค่า

เท่ากับ0.184,0.312,0.319,0.577ตามลำาดับ

ตารางที่ 1 แสดงการเปรียบเทียบอำานาจการจำาแนกของวิธี PFGE และ rep-PCR จากการวิเคราะห์ Salmonella

Typhimurium และ Salmonella Rissen (n=30) ที่เพาะแยกจากกระบวนการผลิตระดับฟาร์ม ในเขตภาคเหนือ

ตอนบนของประเทศไทยที่ดัชนีความเหมือน80%,85%,90%และ95%

ตารางที่ 2 แสดงค่าAdjustedRandcoefficientของวิธีPFGEและRep-PCR

Method Similarity index (%) Cluster size Discriminatory power

Serotyping PFGE Rep-PCR Serotyping PFGE Rep-PCR

%Similarity

Index

Typing

Method

Adjusted Rand coefficient

(95%confidence interval)

Wallace Coefficient

(95%confidence interval)

95

90

85

80

95

90

85

80

Serotyping

PFGE

Rep-PCR

0.90

0.70

0.47

0.43

0.96

0.88

0.69

0.55

0.090

(0.000-0.181)

0.184

(0.012-0.356)

1.000

(1.000-1.000)

3,2,2,2,6,1,1,5,4,4

7,2,13,8

7,2,21

9,21

6,1,1,1,1,1,1,2,1,2,1,2,1,2,1,1,1,1,1,1,1

8,1,1,4,1,3,5,1,3,2,1

9,1,4,1,14,1

14,1,15

1.000

(1.000-1.000)

0.184

(0.098-0.270)

0.092

(0.000-0.203)

1.000

(1.000-1.000)

0.199

(0.000-0.433)

1.000

(1.000-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

0.180

(0.097-0.263)

1.000

(1.000-1.000)

0.368

(0.145-0.592)

PFGE

rep-PCR

95%

ภาณุวัฒน์แย้มสกุล

25

วิจารณ์และสรุป จุดประสงค์หลักของการศึกษานี้คือการเปรียบ

เทียบอำานาจจำาแนกและความหลากหลายของเชื้อ

Salmonellaด้วยวิธีPFGEและrep-PCRเพื่อต้องการ

หาวธิทีางเลอืกในการทำาmoleculartypingทีจ่ะสามารถ

นำามาทดแทนการทำาPFGEซึ่งเป็นgoldstandardของ

การจำาแนกเชือ้Salmonella(Kilicetal.,2010)เนือ่งจาก

การทำาPFGEนั้นยังมีข้อจำากัดหลายอย่างในทางปฏิบัติ

ซึ่งได้แก่ ต้นทุนเครื่องมือ อุปกรณ์ที่มีราคาแพง ระยะ

เวลาที่ใช้ รวมถึงความต้องการผู้มีประสบการณ์ในการ

ทำาการทดลอง จึงไม่เหมาะสมกับห้องปฏิบัติการทั่วไป

Serotyping PFGE Rep-PCR Serotyping PFGE Rep-PCR

%Similarity

Index

Typing

Method

Adjusted Rand coefficient

(95%confidence interval)

Wallace Coefficient

(95%confidence interval)

Serotyping

PFGE

Rep-PCR

Serotyping

PFGE

Rep-PCR

Serotyping

PFGE

Rep-PCR

0.242

(0.127-0.356)

0.312

(0.220-0.405)

1.000

(1.000-1.000)

0.630

(0.447-0.813)

0.319

(0.199-0.439)

1.000

(1.000-1.000)

0.929

(0.808-1.000)

0.577

(0.420-0.735)

1.000

(1.000-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

0.223

(0.020-0.424)

0.247

(0.094-0.398)

1.000

(1.000-1.000)

0.197

(0.000-0.539)

0.637

(0.416-0.861)

1.000

(1.000-1.000)

0.263

(0.000-0.618)

0.931

(0.790-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

0.336

(0.000-0.681)

1.000

(1.000-1.000)

0.027

(0.000-0.265)

1.000

(1.000-1.000)

0.283

(0.000-0.646)

1.000

(1.000-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

0.672

(0.599-0.745)

1.000

(1.000-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

0.578

(0.442-0.714)

1.000

(1.000-1.000)

1.000

(1.000-1.000)

0.602

(0.473-0.730)

1.000

(1.000-1.000)

0.408

(0.314-0.502)

1.000

(1.000-1.000)

0.784

(0.696-0.873)

0.635

(0.559-0.711)

1.000

(1.000-1.000)

0.556

(0.445-0.668)

0.701

(0.639-0.764)

1.000

(1.000-1.000)

0.724

(0.651-0.798)

90%

85%

80%

(Wattiauetal.,2011)ซึ่งอาจส่งผลให้เกิดความล่าช้า

ในการศกึษาระบาดวิทยาของเชือ้นี้ทางคณะผูวิ้จยัไดเ้ลือก

วิธี rep-PCR มาเพื่อทำาการเปรียบเทียบอำานาจจำาแนก

ของเชื้อSalmonellaกับวิธีPFGEเนื่องจากเป็นวิธีที่ใช้

ตน้ทนุและระยะเวลาในการทดลองนอ้ยกวา่(Rossetal.,

2005) ซ่ึงจากผลการทดลองพบว่า การแบ่งคลัสเตอร์

จากวธิีrep-PCRสามารถจำาแนกisolateเปน็คลัสเตอรไ์ด ้

มากกว่าการจำาแนกจากวิธี PFGE ซึ่งเมื่อนำามา

คำานวณค่าอำานาจจำาแนก พบว่าค่าอำานาจจำาแนกของ

เชื้อSalmonellaที่ได้จากวิธี rep-PCRมีค่าใกล้เคียง

กับค่าอำานาจจำาแนกที่ได้จากวิธี PFGE ดังตารางที่ 1

อำานาจจำาแนกและการศึกษาเปรียบเทียบความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อSalmonellaโดยวิธีPFGEและrep-PCR

26

โดยมีค่าอำานาจจำาแนกใกล้เคียงกันมากที่สุดที่ดัชนี

ความเหมือน 90% ซึ่งแตกต่างจากงานวิจัยท่ีเคยมีมา

ก่อนหน้า โดยมีการทดลองเปรียบเทียบอำานาจจำาแนก

ในเชือ้Pasteurella multocida(Gunawardanaetal.,2000),

Listeria monocytogenes (Chou&Wang,2006),

Stenotrophomonas maltophilia(Linetal.,2008),

Mannheimia haemolytica (Klimaet al., 2010),

Clostridium difficile (Pasanen et al., 2011)

ซึ่งให้ผลการทดลองไปในทิศทางเดียวกันคือ PFGE

ให้ค่าอำานาจการจำาแนกสูงกว่า rep-PCR จากการ

ทบทวนวรรณกรรมวิธีPFGEถือว่าเป็นgoldstandard

(Kiliçetal.,2006)ในการจำาแนกรูปแบบทางพันธุกรรม

ของเชื้อแบคทีเรีย โดยจะให้อำานาจการจำาแนกท่ีสูง

อันเกิดจากการวิเคราะห์ลายพิมพ์ดีเอนเอเกือบทั้งหมด

ของจีโนมซึ่งแตกต่างจากวิธีrep-PCRเป็นการวิเคราะห์

ในส่วนของ non coding region แต่การศึกษาคร้ังนี้

พบว่าอำานาจการจำาแนกของวธิีrep-PCRสงูกวา่อาจมผีล

มาจากแถบของดีเอ็นเอที่วิเคราะห์โดยวิธีของrep-PCR

มี13-28แถบซึ่งในส่วนของวิธีPFGEมีเพียง8-14แถบ

ดังน้ันโอกาสท่ีจะพบความแตกต่างระหว่าง isolates

จากการrecognizeในแตล่ะแถบดเีอนเอจากวธิีrep-PCR

จึงพบว่ามีสูงกว่า

แตอ่ยา่งไรกต็ามความสอดคลอ้งของวธิีrep-PCR

ตอ่วธิีPFGEมค่ีาค่อนขา้งต�เมือ่พจิารณาจากคา่Adjusted

Randcoefficientและ95%CIโดยค่าความสอดคล้อง

ระว่างPFGEและrep-PCRที่มากที่สุดพบเมื่อคำานวณที ่

คา่ดชันคีวามเหมอืนเทา่กบั90%(adjustedRand=0.336,

95%CI=0-0.681)(ตารางที่2) และเมื่อพิจารณาจากค่า

Wallace coefficient ของวิธี rep-PCR ต่อวิธี PFGE

พบวา่มคีา่สูงสุดทีค่า่ดชันคีวามเหมือนเทา่กบั90%เชน่กนั

โดยWallace=0.784,95%CI=0.696-0.873ซึ่งให้ค่า

ทีค่่อนข้างสูงซึง่หมายความว่าสายพันธุข์องเช้ือ Salmonella

ท่ีอยู่ในคลัสเตอร์เดียวกันจากการวิเคราะห์ด้วยวิธี

rep-PCRจะมโีอกาสถงึ78.4%ทีจ่ะอยูใ่นคลัสเตอรเ์ดยีวกนั

ด้วยผลการวิเคราะห์ลายพิมพ์DNAด้วยวิธีPFGEส่วน

Wallace coefficient ของวิธี PFGE ต่อวิธี rep-PCR

มีค่าสูงสุดที่ค่าดัชนีความเหมือนเท่ากับ80%(Wallace

= 0.577, 95%CI=0.420-0.735) นั่นหมายถึงว่า แม้

ความสอดคล้องในการจำาแนกสายพันธุ์ของท้ังสองวิธี

จะค่อนข้างต � แต่ก็สามารถนำาใช้วิธี rep-PCR ในการ

ทำานายผลการจำาแนกสายพันธุ์ของPFGEได้

ข้อสรุปของการศึกษานี้คือ rep-PCR เป็นวิธี

ทีม่คีวามสามารถในการทำาซ้�และสามารถจำาแนกซโีรไทป์

ของเชือ้Salmonellaทีม่คีวามใกลเ้คยีงกนัได้จึงเหมาะกบั

การนำาไปใชเ้ป็นวธิทีางเลอืกในการทำาmoleculartyping

เพื่อนำาไปใช้ในการสอบสวนระบาดของเชื้อ

กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุณฝ่ายสนับสนุนการวิจัยพัฒนาและ

วิศวกรรม ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีแห่งชาติ

สำานักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ

(สวทช.) ในการสนับสนุนงบประมาณการวิจัยคร้ังนี้

(รหัสโครงการ P-10-10409) ขอขอบคุณเจ้าหน้าที่และ

นักวิจัย ห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพทางอาหาร

หน่วยปฏิบัติการวิจัยกลางไบโอเทคที่ช่วยให้คำาแนะนำา

และเป็นท่ีปรึกษาในช่วงระหว่างทำางานวิจัย ณ ศูนย์

พนัธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีสำานกังานพฒันาวิทยาศาสตร์

และเทคโนโลยีแห่งชาติ

เอกสารอ้างอิง Ben-Darif,E.,DePinna,E.,Threlfall,E.J.,Bolton,F.J.,

Upton,M.,&Fox,A.J.(2010).Comparisonofa

semi-automatedrep-PCRsystemandmultilocus

sequencetypingfordifferentiationofSalmonella

enterica isolates. Journal ofmicrobiological

methods,81(1),11-16.

CDCU.S. Centers for Disease Control and Prevention

(2000). StandardizedMolecular Subtyping

ofFoodborneBacterialPathogensbyPulsed-

FieldGelElectrophoresis.Atlanta,GA.

DeBusser,E.V.,Maes,D.,Houf,K.,Dewulf,J.,Imberechts,

ภาณุวัฒน์แย้มสกุล

27

H.,Bertrand,S.,&DeZutter,L.(2011).Detection

andcharacterizationofSalmonellainlairage,

on pig carcasses and intestines in five

slaughterhouses.Internationaljournaloffood

microbiology,145(1),279-286.

Gunawardana, G. A., Townsend, K.M., & Frost, A. J.

(2000).Molecular characterisation of avian

PasteurellamultocidaisolatesfromAustraliaand

Vietnam by REP-PCR and PFGE. Veterinary

microbiology,72(1-2),97-109.

Ibarra,J.A.,&Steele-Mortimer,O.(2009).Salmonella--the

ultimateinsider.Salmonellavirulencefactors

thatmodulate intracellularsurvival.Cellular

microbiology,11(11),1579-1586.

Kiliç,A.,Senses,Z.,Aydoğan,H.,&Başustaoglu,A.(2006).

[Molecular analysis of vancomycin-resistant

enterococci isolated from clinical samples].

Mikrobiyolojibülteni,40(4),295–299.

Kilic, A., Bedir,O., Kocak,N., Levent, B., Eyigun,C. P.,

Tekbas,O. F., . . . Basustaoglu,A.C. (2010).

AnalysisofanoutbreakofSalmonellaenteritidis

byrepetitive-sequence-basedPCRandpulsed-

fieldgelelectrophoresis.Internalmedicinejournal

,49(1),31-36.

Lin,C.W.,Chiou,C.S.,Chang,Y.C.,&Yang,T.C.(2008).

Comparisonofpulsed-fieldgelelectrophoresis

andthreerep-PCRmethodsforevaluatingthe

genetic relatedness of Stenotrophomonas

maltophiliaisolates.Lettersinappliedmicro

biology,47(5),393-398.

Liu,B.,Zhang,L.,Zhu,X.,Shi,C.,Chen,J.,Liu,W.,...Shi,

X. (2011). PCR identification of Salmonella

serogroupsbasedonspecifictargetsobtained

bycomparativegenomics.Internationaljournal

offoodmicrobiology,144(3),511-518.

Magistrali,C.,Dionisi,A.M.,DeCurtis,P.,Cucco,L.,Vischi,

O., Scuota, S., . . . Pezzotti, G. (2008).

Contamination of Salmonella spp. in a pig

finishing herd, from the arrival of the

animals to the slaughterhouse. Research in

VeterinaryScience,85(2),204-207.

Nassonova,E.S.(2008).Pulsedfieldgelelectrophoresis:

Theory,instrumentsandapplication.Celland

TissueBiology,2(6),557–565.

Pasanen, T., Kotila, S.M., Horsma, J., Virolainen, A.,

Jalava, J., Ibrahem,S., . . . Tissari, P. (2011).

Comparisonofrepetitiveextragenicpalindromic

sequence-basedPCRwithPCRribotypingand

pulsed-field gel electrophoresis in studying

the clonalityofClostridiumdifficile. Clinical

MicrobiologyandInfection,17(2),166-175.

Patchanee,P.,Molla,B.,White,N.,Line,D.E.,&Gebreyes,

W.A.(2010).TrackingSalmonellacontamination

in variouswatersheds and phenotypic and

genotypicdiversity.Foodbornepathogensand

disease,7(9),1113–1120.

Ross,T.L.,Merz,W.G.,Farkosh,M.,&Carroll,K.C.(2005).

Comparison of an automated repetitive

sequence-basedPCRmicrobialtypingsystemto

pulsed-fieldgelelectrophoresisforanalysisof

outbreaksofmethicillin-resistantStaphylococcus

aureus.JournalofClinicalMicrobiology,43(11),

5642-5647.

Severiano,A.,Pinto,F.R.,Ramirez,M.,Carrico,J.A.(2011).

AdjustedWallace Coefficient as ameasure

of congruence between typingmethods.

Journal of Clinical Microbiology, 49(11),

3997-4000.

Severiano,A.,Carrico,J.A.(2011).Comparingpartition.

Retrieved from http://darwin.phyloviz.net/

ComparingPartitions/index.php?link=Tool

Stepan,R.M.,Sherwood,J.S.,Petermann,S.R.,&Logue,

C. M. (2011). Molecular and comparative

analysisofSalmonellaentericaSenftenbergfrom

humansandanimalsusingPFGE,MLSTand

NARMS.BMCMicrobiol,11,153.

UniversityoftheBasqueCountry.(2013).Discriminatory

PowerCalculator.Retrievedfromhttp://insilico.

อำานาจจำาแนกและการศึกษาเปรียบเทียบความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อSalmonellaโดยวิธีPFGEและrep-PCR

28

ehu.es/mini_tools/discriminatory_power/

Wattiau,P.,Boland,C.,&Bertrand,S.(2011).Methodologies

for Salmonella enterica subsp. enterica

subtyping: gold standards and alternatives.

Appliedandenvironmentalmicrobiology,77

(22),7877-7885.

Weigel,R.M.,Qiao,B.,Teferedegne,B.,Suh,D.K.,Barber,

D. A., Isaacson, R. E., &White, B. A. (2004).

Comparisonofpulsedfieldgelelectrophoresis

and repetitive sequence polymerase chain

reactionasgenotypingmethodsfordetectionof

geneticdiversityandinferringtransmissionof

Salmonella.Veterinarymicrobiology,100(3-4),

205-217.

ภาณุวัฒน์แย้มสกุล