Laboratorijska dijagnostika alkoholizmaKliniki zavod za kemiju, Odjel za hitnu laboratorijsku dijagnostikuKlinika bolnica SESTRE MILOSRDNICEAna-Maria imundi

ALKOHOLIZAM20 30 % prijema u bolnicu i zdravstvenih trokova u svezi s alkoholomstalni porast konzumacije alkohola per capita (u SAD 35% ne pije alkohol; u Finskoj

ALKOHOLIZAMgotovo nitamaloumjerenopunoBez posljedicaNeznatnepromjeneUmjerenepromjeneZnaajneposljedicePosljedice i oteenjaKoliina alkoholaAlkoholizam je uestali i ozbiljan zdravstveni problem.RizikProblemNiski rizikOvisnik

STANDARDNA JEDINICA1 jedinica alkohola = 7 - 14 grama alkohola.

DNEVNA PREPORUKA

METABOLIZAM ALKOHOLACH3CH2OHCH3CHOCH3COOHNADNADH2ADHetanolacetaldehidacetatNADNADH2ALDHCYP2E1NADPH H+ + O2NADP+ H 2OH 2OH 2O2H 2OkatalazaMEOScitosolperoksisomimitohondrijFAEEFAEE sintazaPEthfosfolipaza DEtGUDPG transferazaEtSS transferaza

BILJEZI ALKOHOLIZMA disfunkcija organa dg. alkoholne ovisnosti korisniji u mukaraca ne ukazuju na nedavnu konzumaciju promijenjeni tjednima

ALT, AST, GGT, CDT, MCV

metabolizam alkohola povieni nakon konzumacije (krv, mokraa dani tjedni; kosa mjeseci) ne ukazuju na alkoholnu bolest

etanoletilni ester masnih kiselina (FAEE)etil glukuronid (EtG)fosfatidil etanol (PEth)DIREKTNIINDIREKTNI

Genetski biljezi alkoholizma metabolizam alkohola(polimorfizmi ADH i ALDH; polimorfizmi MAO) odgovor organizma na alkohol (neurotransmiteri, dopamin, neuropeptid ) promjene inhibicije i impulzivnosti pridrueni psihijatrijski poremeajiDO DANAS NITI JEDAN BILJEG NIJE U KLINIKOJ PRIMJENI.

unutar 4 6 hDIREKTNI POKAZATELJI ALKOHOLIZMAALKOHOLKVALITATIVNI TESTOVI alkotest, alkometarKVANTITATIVNI TESTOVI enzimska metoda kromatografija

faza apsorpcije (30 120 min) via koncentracija u arterijskoj krvi nego u perifernoj venskoj krviALKOHOL apsorpcija, raspodjela, metabolizam, eliminacija

ALKOHOL interpretacija rezultata koncentracija etanola > 1,5 g bez znakova intoksikacije koncentracija etanola > 3,0 g poveana tolerancija

(pomo u razlikovanju akutne intoksikacije i kroninog alkoholizma)Eliminacija etanola je 1,5 x bra u kroninih alkoholiara.promil = grami alkohola po kubinom centimetru (g/cm3).

0,5 g0,5 g alkohola na 1000 cm3 krvi

g/STANJE0,2 0,3nema gubitka koordinacije, lagana euforija. 0,4 0,6euforija, smetnje u razboritosti i sjeanju te smanjenje opreza0,7 0,9lagane smetnje u ravnotei, govoru, vidu, procjene i samokontrole, razboritosti i sjeanju1,0 1,25znaajne smetnje u motornoj koordinaciji i gubitak pravilne procjene, potekoe u govoru i ravnotei.1,3 1,5znaajan gubitak ravnotee i vida, stanje tjeskobe, depresije i nemira. Ozbiljne smetnje u procjeni.1,6 1,9prevladava stanje tjeskobe, depresije i nemira, moe se javiti munina. 2,0 2,5munina i povraanje, ozbiljne smetnje u svim mentalnim, fizikim i osjetilnim funkcijama3,0 3,5stupor, nesvjestica i tee buenje iz tog stanja, mogua koma. Stanje poput kirurke anestezije. 4,0koma i mogua smrt (prestanak disanja i pada tlaka).

KVALITATIVNO ODREIVANJE: alkometar elektrokemijski senzor za alkohol neinvazivno, trenutan rezultat predanalitike pogrjeke minimalne

tehnika disanja patoloka stanja interferencije (acetaldehid i dr. ugljikovodici), nema potvrdne analize 15 minuta prije testa nita ne jesti niti piti! - interferencije

CH3CH2OHADHCH3CHO NAD+NADH H+ ADH je specifina za etanol (interferencije metanola su 3%, izopropanola 7% i etilenglikola 4%) HKMB > preporuena metoda (tona, precizna i pouzdana metoda) uzorak: serum, plazma, puna krv, mokraa, slina(paziti serum : puna krv 1,14; alkohol je u vodenoj fazi) metoda je podudarna s referentnom plinskom kromatografijom u irokom podruju od 0.1 - 4.0 g/ uzorak zaepiti, serum stabilan 14 dana na sobnoj temp.KVANTITATIVNO ODREIVANJE:enzimska metodaetanolacetaldehid = 340 nm

Saracevic A, Simundic AM, Dukic L. The stability of ethanol in unstoppered tubes. CLB 2014;47:92-5. CONCLUSIONS:Alcohol concentration can be accurately measured in the unstoppered samples within two hours upon decapping the tube, when stored at room temperature. Longer storage time (>2 hours) in the unstoppered samples introduces significant bias in alcohol concentrationstoppered tube Tube B unstoppered tube

ENZIMSKA METODA - nastavak u fazi nakon apsorpcije koncentracija je 1,3 x via od plazmatske alkohol je mogue detektirati do 8h nakon konzumacijemokraa tapii za prikupljanje sline komercijalni kitovi kontrola kvalitete ?!slina

KVANTITATIVNO ODREIVANJE: GCPlinska kromatografija HKMB: referentna metoda osjetljiva i specifina Naelo:

komponente smjese prevedu se u plinovito stanje smjesa se uvodi strujom inertnog plina nosaa u kromatografsku kolonu prolaskom kroz kolonu sastojci se razdjeljuju izmeu sorbensa (stacionarne faze) i plina nosioca (pokretne faze) odijeljeni sastojci smjese nakon izlaska iz kolone odreuju se na detektoru koji registrira prisutnost izoliranog sastojka kao funkciju vremena odziv detektora registrira se na pisau kao kromatogram

SHEMA RADA PLINSKOG KROMATOGRAFAplin nosa(He, N, H)injektorkolona(u termostatiranoj komori)detektorkromatogram

minuteLegenda:metanoletanoli-propanoln-propanoln-butanolKROMATOGRAM: retencijska vremena

CH3CH2OHCH3CHOCH3COOHNADNADH2ADHetanolacetaldehidacetatNADNADH2ALDHCYP2E1NADPH H+ + O2NADP+ H 2OH 2OH 2O2H 2OkatalazaMEOScitosolperoksisomimitohondrijFAEEFAEE sintazaPEthfosfolipaza DEtGUDPG transferazaEtSS transferazaETILNI ESTER MASNIH KISELINA (FAEE)

FAEE: nastavak prisutne u serumu ubrzo nakon konzumacije alkohola ostaju u cirkulaciji i do 24h nakon konzumacije u tkivima pronaene i 24-48h nakon konzumacije

prisutne u cirkulaciji i kad je koncentracija alkohola nemjerljiva

u cirkulaciji se veu na albumin, lipofilne, prelaze u masno tkivo, nakupljaju se u tkivima

inhibiraju funkciju mitohondrija (nekroza stanica!), toksine za mnoge organe

metoda odreivanja: GC-MS; uzorak: serum, mekonij, kosa (mjeseci)

Autodigestija acinarnih stanica pankreasa nastaje zbog: (1) destabilizacije lizosoma (L) i zimogenih granula (ZG).(2) poveane sinteza mRNA (koja kodira brojne pankreatine enzime)Patogeneza alkoholnog pankreatitisauloga FAEE

Minoran put razgradnje ( 0.02-0.06%) u jetri EtG prisutan u kosi, svim tjelesnim tekuinama (puna krv, serum/ plazma, likvor i mokraa) i tkivima (jetra, mozak, masno tkivo) konc. EtG u cirkulaciji je max. nakon 2 3.5 sata i prisutna je 5 dana nakon potpune eliminacije alkohola EtG je nedavno otkriven u tkivu 27 godina postmortem osjetljiv i specifian mogui su LP zbog fermentacije glukoze od strane bakterija u mokrai mogui su LN zbog bakterijske -glukuronodaze u mokrai (infekcija) LP i LN je mogue izbjei pohranjivanjem uzorka u hladnjak i dodatkom NaF ETIL GLUKURONID (EtG)

Metoda detekcije:

imunokemijske analize (EIA i ELISA) GC-MS LC-MS i LC-MS-MSDetekcija EtG nakon jednog piaEtG (ng/mL) u mokrai

alkohol () u izdisaju, krvi i mokraidani

FOSFATIDIL ETANOL (PEth)Fosfatidil kolinHidroliza+ vodafosfatidna kiselinaTransfosfatidilacija+ ETANOLFosfolipaza D patoloki fosfolipid, prvenstveno se nalazi u eritrocitima dugotrajnim unosom i manjih koliina alkohola prisutan u cirkulaciji (3 tjedna) post-mortem biljeg tekog alkoholizma

PONOVIMO...

INDIREKTNI BILJEZI ALKOHOLIZMA Alanin aminotransferaza ALT Aspartat aminotranferaza AST -glutamil transferaza GGT Srednji volumen eritrocita MCV Ugljikohidratima deficijentni transferin - CDT

AMINOTRANSFERAZE (AST, ALT) biljezi jetrenog oteenja povieni u cca 40-50% alkoholiaraNiemel O. Biomarkers in alcoholism. Clin Chim Acta. 2007;377(1-2):39-49.

AST, ALT - nastavak

AST, ALT - nastavak dijagnostika tonost vea u kombinaciji sa GGT (Se 95%, Sp 80%) AST vrijednost ima dugoronu prognostiku vrijednost !!AST/ALT (DeRitisov kvocijent) < 1 blago oteenje jetre (upala)> 2 ozbiljno oteenje jetre (nekroza) prekomjerno konzumiranje alkohola ALT specifian za jetru (citosol), AST prisutan i u drugim tkivima

GAMA GLUTAMIL TRANSFERAZA (GGT)Membranski vezan enzim koji katalizira prijenos gama-glutamilne skupine s glutationa na razne aminokiseline.kronina konzumacija alkohola (Se 50%)

debljinadobintoksikacija lijekovimajetrene bolesti

kava

niska specifinost

GGT: jetrena bolest u alkoholiaraapstinencija8-10 x referentni intervalznaajni pad aktivnosti aktivnost nepromijenjenaalkoholizamoteenje jetre druge etiologije(nekoliko tjedana)2-3 x referentni intervalapstinencija(nekoliko tjedana)aktivnost unutar ref. int. jetrena bolest nije prisutna!

Niemel O. Biomarkers in alcoholism. Clin Chim Acta. 2007;377(1-2):39-49.GGT BMI i alkohol

SREDNJI VOLUMEN ERITROCITA (MCV)MCV (fL) direktno mjerenje ili prema jednadbi: povien u cca 40% alkoholiara porast od 1-2 fL i kod umjerene konzumacije alkohola (

UGLJIKOHIDRATIMA DEFICIJENTNI TRANSFERIN (CDT) transferin nastaje u jetri, t je 7-10 dana transportni protein MM79, 5 kDa, N-glikoziliran alkohol inhibira glikozilaciju i inducira sialidazu nastaju ugljikohidratima deficijentne izoforme (asialo-, mono- i disialotransferin)

Sijalinska kis.CDTPentasijalo (pI 5.2)Tetrasijalo (pI 5.4)Trisijalo(pI 5.6)Disijalo (pI 5.7)Asijalo (pI 5.9)(-) naboj

UGLJIKOHIDRATIMA DEFICIJENTNI TRANSFERIN (CDT) FDA je odobrio CDT kao diagnostiki test za detekciju kronine konzumacije alkohola manja tonost u mlaih osoba, ena (hormonske promjene), puaa i kod konzumacije manjih koliina alkohola tjelesna teina utjee na CDT (pretilost, anoreksija) genetske varijante transferina!>80-100g/danSe = 60-65% (90%!)>50-80g/danmjerljivCDTnakon 14-17 dana apstinencije CDT se normaliziratijekom 2-3 tjedna

Osjetljivost?Vidali M, et al. False negativity to carbohydrate-deficient transferrin and drugs: a clinical case. Biochemia Medica 2014; 24(1): 175-179.

METODE ZA ODREIVANJE CDT koncentracija (U/L) % kromatografsko razdvajanje na mikrokolonama s ionskim izmjenjivaem uz imunokemijsku detekciju HPLC CE IEF latex imunonefelometrija (kompetitivna)Izraavanje rezultata CDT:Metode: razliiti referentni intervali! potrebna standardizacija, harmonizacija vanjska QC?!

*************************************