1

Lehninger Principles of BiochemistryFourth Edition

Chapter 19:Oxidative Phosphorylationand Photophosphorylation

Copyright © 2004 by W. H. Freeman & Company

David L. Nelson and Michael M. Cox

2

F1-eining ATP-sýnþasa ADP: gult, ATP: rautt

3

4

Hvað er ildisháð fosfórýlering (oxidative phosphorylation)?

Rafeindir eru fluttar frá afoxuðum kóensímum, NADH og FADH2, eftir röð rafeindaberaSúrefni (“ildi”) er notað til oxunarinnar, og það afoxast í vatn, en kóensímin enduroxast

Um leið verður ATP-myndun frá ADP og Pi (fosfórýlering)Fosfórýleringin gerist ekki nema súrefni sé tils staðar, er ildisháð

5

Hvað er ildisháð fosfórýlering (oxidative phosphorylation)?

Fulloxun fæðuefna gefur margfalt meira ATP eða orku en loftfirrt efnaskipti (anaerobic)Fita gefur 9 kcal/g, kolhýdröt 4 kcal/g, prótein 4 kcal/g, alkóhól 7 kcal/g

Oxun NADH ~ 2,5 ATPOxun FADH2 ~ 1,5 ATP

6

Hvar gerist ildisháð fosfórýlering?

Ildisháð fosfórýlering gerist í innri himnu mítókondríaÍ einni lifrarfrumu eru allt að 2000 mítókondríur, algengt að um 100 mítókondríur séu í frumuUm helmingur massa hjartavöðva, sem reiðir sig á loftháð efnaskipti, er mítókondríurMítókondríur eru einnig kallaðar “hvatberar”, “kyndikorn” eða “orkukorn”Sítrónusýruhringur og oxun fitusýra, sem leggja til afoxuð kóensím, gerast í mergholi (matrix) mítókondría

7

8

Rafeindaberar og ildisháð fosfórýlering

Rafeindaberar (að mestu sýtókróm) mynda keðju sem er í innri himnu mítókondríaÞessi keðja er kölluð rafeindaberakeðja eða öndunarkeðja

Við rafeindaflutning (oxun kóensíma á kostnað súrefnis) losnar frjáls orka sem er notuð til að dæla prótónum út úr mergholi mítókondría gegn styrkleikastigli

9

Rafeindaberar og ildisháð fosfórýlering

Við það myndast prótónustigull og himnuspennaATP myndast frá ADP og Pi (fosfórýlering) og það er losað frá ensíminu ATP-sýnþasa þegar prótónur flæða aftur inn í merghol undan stigli

Oxun og fosfórýlering eru tengd með prótónustigli

10

Rafeindaberar og ildisháð fosfórýlering Gerð rafeindaberakeðjunnar

Rafeindaberakeðjan er gerð úr fjórum rafeindaberandi ensímakomplexum (prótónudælum) sem eru tengdir saman með tveimur rafeindaberum sem fljóta í innri himnunni

Ensímakomplexarnir eru gerðir úr mörgum próteinum Sum próteinin innihalda járn og brennistein sem taka þátt í rafeindaflutningnum

Þau breyta um lögun í oxunar- og afoxunarhvörfum

11

12

13

14

15

16

17

18

19

Ferredoxín úr bakteríu

20

Rafeindaberar og ildisháð fosfórýlering Gerð rafeindaberakeðjunnar

Önnur prótein eru sýtókróm með járnbundinn hemhóp Þau breyta um litrófseiginleika við oxun og afoxun

Ekki er talið að einingar rafeindaberakeðjunnar raðist skipulega upp í innri himnu mítókondría

21

22

23

24

25

26

Rafeindaberar og ildisháð fosfórýlering Gerð rafeindaberakeðjunnar

Komplex I (NADH-dehýdrógenasi) tekur við rafeindum frá NADH og flytur á úbikvinón (UQ)

Úbikvinón (rafeindaberi) tekur við FADH2 og tengir NADH-redúktasa við röð sýtókróma

27

28

29

30

31

32

Rafeindaberar og ildisháð fosfórýlering Gerð rafeindaberakeðjunnar

Komplex II er súkksínatdehýdrógenasi auk Fe-S-próteina og er ekki prótónudæla

33

34

Komplex II

35

Rafeindaberar og ildisháð fosfórýlering Gerð rafeindaberakeðjunnar

Komplex III: Sýtókróm-bc1-komplex (sýtókrómredúktasi), röð sýtókróma og Fe-S-próteina flytur rafeindir frá úbikvínón að sýtókrómi c (leysanlegur rafeindaberi)

Sýtókróm c er lítið prótein sem hefur verið raðgreint í fjölmörgum lífverum

36

Komplex III

37

38

39

40

Rafeindaberar og ildisháð fosfórýlering Gerð rafeindaberakeðjunnar

Sýtókrómoxídasi (komplex IV) flytur rafeindir frá sýtókrómi c til súrefnis sem afoxast í vatn

41

Komplex IV

42

43

Hvernig gerist ildisháð fosfórýlering?

Eldri tilgátur:“Chemical coupling hypothesis”, Slater, 1953Tenging við orkuríkt millistigsefni knýr áfram ATP-myndun

“Conformational coupling hypothesis”, Boyer, 1965Prótein sem breytir um lögun knýr áfram ATP-myndun (er að hluta til rétt)

Viðtekin tilgáta:“Chemiosmotic hypothesis”, Peter Mitchell, 1961

44

45

46

Hver eru helstu atriði kemíosmótísku tilgátunnar?

1. Við rafeindaflutning (oxun kóensíma á kostnað súrefnis) í rafeindaberakeðju er prótónum dælt úr mergholi

mítókondría gegn styrkleikastigli2. Við það myndast prótónustigull og himnuspenna, þ. e. prótónukraftur

ATP myndast frá ADP og fosfati (fosfórýlering) og það er losað frá ensíminu ATP-sýnþasa við að prótónur

flæða aftur inn í merghol undan stigliÞetta er í eðli sínu gagnhverf breyting

3. Innri himna mítókondría er ógegndræp fyrir prótónur og aðrar jónir4. Í innri himnu mítókondría eru burðarprótein sem stuðla að

sérhæfðum flutningi prótóna, jóna og nauðsynlegra millistigsefna í efnaskiptum

47

48

Hve mörgum prótónum er dælt þegar rafeindir flytjast eftir rafeindaberakeðju?

Ekki er vitað nákvæmlega hve mörgum prótónum er dælt út úr mergholi við rafeindaflutningTalið er að NADH-dehýdrógenasi (komplex I) dæli 4 prótónum út úr mergholiTalið er að sýtókróm-bc1-komplex (komplex III) dæli 4 prótónum út úr mergholiTalið er að sýtókrómoxídasi (komplex IV) dæli 2 prótónum út úr mergholiKomplex II, ubíkvinón og sýtókróm c eru ekki prótónudælur

49

Hve mörgum prótónum er dælt þegar rafeindir flytjast eftir rafeindaberakeðju?

Ekki er vitað nákvæmlega hvernig prótónum er dælt út í mergholRafeindaberarnir geta breytt um lögun við rafeindaflutning og dælt prótónum um leiðEinnig myndast spennumunur sem er leggur til mikinn hluta prótónukrafts

50

Rafeindaflæði og prótónudæling í heild

51

Hvernig er sýnt fram á tengsl prótónudælingar við myndun ATP?

Súrefniselektróða er einfalt tæki, tengt við sírita, sem mælir súrefnisstyrk í lokuðu hvarfahólfiSúrefnisnotkun er hæg þó að oxanlegum efnum sé bætt í sviflausn með mítókondríum

Sé mældum skammti af ADP bætt í lausnina eykst öndunarhraðiHann er stöðugur þar til ADP er upp urið

52

53

54

55

Hvernig er sýnt fram á tengsl prótónudælingar við myndun ATP?

1. ATP afrakstur ýmissa hvarfefna -ketóglútarat: NADH ~ 2,5 ATP súkksínat: FADH2 ~ 1,5 ATP askorbat: ~ 0,5 ATP

2. Varmafræðilegar forsendur G˚´ við rafeindaflutning milli komplexa er borið saman við orku sem þarf til ATP-myndunar

56

Hvernig er sýnt fram á tengsl prótónudælingar við myndun ATP?

3. Sérhæfð hindrun rafeindaflæðis:

rótenón hindrar komplex I (NADH-dehýdrógenasa/úbikvinón)

antimýsín A hindrar komplex III (sýtókróm-bc1-komplex)

sýaníð, azíð og kolmónoxíð hindra komplex IV (sýtókrómoxídasa)

4. Sérhæfð hindrun ATP-sýnþasa með ólígómýsíni

57

58

59

Hvernig er sýnt fram á tengsl prótónudælingar við myndun ATP?

5. Notkun frátengimiðla

6. Notkun sérhæfðra hindra ATP-ADP translókasa (atraktýlósíð og bongkrekínsýra)

7. Notkun endursamsettra himnudælukerfa

60

Hvaða atriði styðja kemíosmótísku tilgátuna?

1. Prótónustigull myndast við rafeindaflutning

2. Unnt er að knýja áfram ATP-myndun með því að breyta pH

3. Innri himna mítókondría verður að vera heil og óskemmd

4. Efni sem ferja prótónur yfir innri himnuna eyðileggja prótónustigulinn og frátengja oxun og fosfórýleringu,

þau eru frátengimiðlar, t. d. 2,4-dínítrófenól

5. Svipuð kerfi er að finna í ljóstillífun og fornbakteríum

6. Endursamsett himnudælukerfi geta myndað ATP

61

62

63

64

65

Endursamsett himnudælukerfi

Lípósóm eru gagnleg módel til að kanna flutninga yfir frumuhimnur

Þau geta einnig verið hentug burðarefni fyrir lyf

Með lípósómatækni er unnt er er að endursamsetja starfandi frumuhimnur úr hreinsuðum og einangruðum byggingarhlutum þeirra (úthverfar himnublöðrur)

66

Endursamsett himnudælukerfi

Unnt er að gera blöðrur úr innri himnu mítókondría þar sem F1-einingin snýr út

Slíkt kerfi getur bæði myndað ATP og hvatt vatnsrof þess

Svipað endursamsett dælukerfi gert úr ljósknúinni prótónudælu úr fornbakteríum myndar ATP

67

68

Hvernig myndast ATP?

ATP myndast í ensímakomplex, sem kallast ATP-sýnþasi eða FoF1-ATPasi eða komplex V

Fo-eining er vatnsfælin: göng sem spanna innri himnu og hleypa prótónum í gegnÓlígómýsín hindrar Fo-eininguna í ATP-sýnþasa (oligomycin-sensitive, Fo)F1-eining er vatnsleysin, situr innan á innri himnu, tengd við Fo-einingu: hvetur ATP-myndun

69

Hvernig myndast ATP?

Á rafsjármyndum sést Fo-eining tengd við stilk sem tengir hana við hnúðlaga F1-einingu

Prótónur sem flæða um Fo-einingu losa emsímbundið ATP af F1-einingu Talið er að þrjár prótónur þurfi til að losa eina ATP-sameind Einn hluti ATP-sýnþasa hreyfist við prótónuflutning og losun ATP

70

71

F1- eining í ATP-sýnþasa

72

73

ATP-sýnþasi

74

ATP-sýnþasi

75

ATP-sýnþasi

76

ATP-sýnþasi

77

ATP-sýnþasi

78

ATP-sýnþasi

79

80

81

82

ATP-sýnþasi

83

ATP-sýnþasi

84

ATP-sýnþasi

85

86

Flutningskerfi í mítókondríuhimnu

Innri himna mítókondría er ógegndræp fyrir margar litlar lífsameindir:

Ógegndræp fyrir: Gegndræp fyrir (flutt sem):NADH Malat, glýseról fosfatFitu-asýl-CoA Fitu-asýl karnitínAsetýl-CoA SítratOxalóasetat Pýrúvat, aspartat, malatFlestar amínósýrur Glútamat, aspartat, pýrúvat

87

Flutningskerfi í mítókondríuhimnu

Þörf er fyrir þessi efni bæði í frymi og mítókondríumFruman skiptist í hólf (compartments), þ. e. mítókondríur og frymi með tilliti til margra efnaFlutningskerfi eða ferjur (carriers) sjá um flutning efna milli frymis og mítókondríaFlest þessi kerfi eru antiportkerfi, en sum eru symportkerfiKerfin eru himnuspannandi prótein sem hafa svipaða byggingu

Hvernig flyst NADH úr frymi í mítókondríur?Malatbrúin er gagnhverf, en glýserólfosfatbrúin ógagnhverfGlýserólfosfatbrúin gefur FADH2 innan mítókondría, en malatbrúin NADH

88

Stýring ATP-smíðar og flutningur þess út úr mítókondríum

ADP-styrkur stýrir hraða ildisháðrar fosfórýleringarÞetta kallast öndunarstýring (respiratory control)

89

Stýring ATP-smíðar og flutningur þess út úr mítókondríum

Hlutföll NAD+/NADH og ATP/ADP hafa áhrif á virkni margra ensímaKomplex IV er stýrt með fosfórýleringu og defosfórýleringu

Skjaldkirtilshormón hafa margvísleg áhrifÞau örva smíð frátengipróteina

Þau bindast Komplex IV sem dælir þá færri prótónumÞau örva einnig smíð Na+-K+-ATPasa

90

Stýring ATP-smíðar og flutningur þess út úr mítókondríum

Flutningur ADP inn í mítókondríur er tengdur flutningi ATP út úr þeim með ATP-ADP-translókasa (antiport-kerfi)

Atraktylosíð og bongkrekinsýra hindra translókasann

91

92

93

94

Hve mikið ATP myndast?

Lengi var talið að P/O hlutföllin væru 3:1 fyrir hvarfefni sem mynda NADH (-ketóglútarat), 2:1 fyrir hvarfefni sem mynda FADH2 (súkksínat), 1:1 fyrir hvarfefni sem oxast í komplex IV (t. d. askorbat)

95

Hve mikið ATP myndast?

Nú er almennt talið að P:O hlutföllin séu ~ 2,5 fyrir -ketóglútarat, ~ 1,5 fyrir súkksínat, ~ 0,5 fyrir askorbat

Þessar niðurstöður fást úr útreikningum á nettó prótónu og rafeindaflutningum

Við íhugun kemíosmótísku tilgátunnar sést að ekki er nauðsynlegt að heilar tölur fáist fyrir P/O hlutföll

96

Hve mikið ATP myndast?

Einfaldir útreikningar á ATP-myndun frá ýmsum hvarfefnum eru á þessa leið:Það þarf 3 prótónur til að losa eina ATP-sameind frá ATP-sýnþasaFlutningur einnar ADP-sameindar inn í mítókondríur og flutningur einnar ATP-sameindar út í frymi krefst flutnings einnar prótónu inn í mítókondrur

Þannig þarf að dæla 4 prótónum út úr mergholi til þess að knýja smíð einnar ATP-sameindar sem er komin í frymi

97

Hve mikið ATP myndast?

Fyrir hvert rafeindapar sem flyst frá NADH til súrefnis er 10 prótónum dælt út úr mergholi, 10/4 = 2,5 ATP myndastVið að oxa FADH2 er dælt 6 prótónum og 1,5 ATP myndast, við oxun askorbats er dælt 2 prótónum og 0,5 ATP myndast

Ekki er fullvíst hve nákvæmar þessar tölur eru

98

Rafeindaflæði og prótónudæling í heild

99

Hve mikið ATP myndast?

Af þessu leiðir að minna ATP myndast við fullbruna fæðuefna en áður hefur verið talið

ATP-myndun við oxun palmítats nú talin vera 106 (ekki 129)

Við fulloxun glúkósa myndast 30 eða 31 ATP í stað 36 eða 38

Fulloxun glúkósa gefur mismunandi mikið ATP eftir því hvernig NADH úr frymi er flutt (glýserólfosfatferja notar FADH2, en malatferja NADH)

100

101

Frátengimiðlar og brúnn fituvefur

Frátengimiðlar (uncouplers) eru veikar sýrur, leysanlegar í frumuhimnuÞeir flytja prótónur inn yfir innri himnu mítókondría - ATP-myndun verður ekkiÞeim má ekki rugla saman við hindra (inhibitora)Áhrifum frátengimiðils má líkja við rafrás þar sem skammhlaup verður

102

Frátengimiðlar og brúnn fituvefur

Í brúnum fituvef er prótein (uncoupling protein) sem stuðlar að flutningi prótóna inn í mítókondríur

Þetta er mikilvægt til varmamyndunar í ungviði og í dýrum sem leggjast í dvalaBrúnn fituvefur er ekki talinn skipta miklu máli varðandi offitu

103

104

105

Prótónukraftur (proticity)

Prótónustigull og spennumunur myndast í elektrónuflutningskeðju og í ljóstillífunPrótónukraftur er notaður til að knýja mörg ferli í lífríkinu: virkur efnaflutningur, varmi, ATP-smíð, hreyfingar baktería

Til þess að prótónustigull geti orðið þarf að aðskilja tvo vatnsfasa með þunnri lípíðahimnu

106

107

108

109

110

Mítókondríugen

Mítókondríur dýra hafa eigið erfðaefni, hringlaga, tvíþátta DNA (mt-DNA) sem skráir 37 gen (13 prótein, 2 rRNA og 22 tRNA)Önnur mítókondríugen eru skráð í kjarna og próteinin flutt inn í mítókondríurMítókondríugen fósturs koma öll frá móður og stökkbreytast mun hraðar en önnur genÍ nokkrum tilvikum skrá táknar aðrar amínósýrur í mítókondríu-DNA en í erfðalyklinumMítókondríur þróuðust sennilega frá samlífisbakteríumTil eru sjaldgæfir erfðakvillar þar sem stökkbreytingar verða á mítókondríugenum

111

Mítókondríugen

Hafa mítókondríur þróast frá samlífisbakteríum?Vísbendingar:Genin eru hringlagaNokkrir táknar eru öðruvísi, og eru þeir sömu og í sumum bakteríumÞað er næstum ekkert kólesteról í innri himnu mítókondría og ekkert í frumuhimnu baktería

112

113

114

Breytingar í mítókondíukvilla