1

1. PROJEN N AMACI

Plastik ve türevlerinin yüzyıllarca do ada bozunmadan kalması öncelikle toprak

kirlili i olmak üzere çevreye pek çok zarar vermektedir. Ancak günümüzde plastiklerin yerini

do ada tamamen parçalanabilme özelliklerinden dolayı biyoplastikler almaktadır.

Çalı mamızda ülkemizdeki biyoplastik kaynaklarına dikkat çekmek amacıyla zmir Körfezi

deniz suyu ve canlılarından izole edilen biyolüminesen özellikli bakterilerin bir biyoplastik tipi

olan PHB (polihidroksi- -bütirat)’yi üretim kapasiteleri ara tırılmı tır.

Bu amaçla;

1. zmir Körfezi deniz suyu ve canlılarından izole edilen biyolüminesen özellikli

bakterilerden PHB üretilmi ,

2. PHB standartlarına göre, hücre kuru a ırlı ına ba lı olarak biyolüminesen izolatlar

tarafından üretilen biyoplastik PHB miktarları kar ıla tırılmı ve verimlilikleri tespit edilmi tir.

2

2. G R

2.1. Biyolüminesens

2.1.1. Biyolüminesensin Tanımlanması

Biyolüminesens canlı organizmalar tarafından kimyasal bir reaksiyonlarla ı ık

üretilmesidir. Organizmadaki ı ık üretimi kimyasal enerjinin ı ık enerjisine dönü mesi

sonucu ortaya çıkar ( ekil 1).

Biyolüminesens bakteriler, dinoflagellatlar, funguslar ve çe itli omurgalı ve omurgasız

hayvanlarda meydana gelmektedir (ERSOY, 2005). Karasal habitatlarda ve tatlı sularda bu

olay gözlenir; ama yaygın olarak denizel habitatlarda gözlenen bir olaydır. Biyolüminesens

okyanusun tüm seviyelerinde vardır, ancak en sık yüzeyde tanımlanır. Güne ı ı ının derine

inemedi i okyanus bölgelerinde ı ı ın tek kayna ıdır. Okyanusun bu bölgesinde ya ayan

canlıların %90 kadarı ı ık üretme yetene ine sahiptir.

ekil 1: Lüminesen bakteri görünümü (www.flickr.com)

2.1.2. Biyolüminesens yapan canlı çe itleri

- Tek hücreli organizmalar

- Bakteriler: Radiolaria, Vibrio, Photobacterium, Shewanella ve Photorhabdus cinsleri

- Dinoflagellatlar: Fungi

-Sölentereler ve ktenoforlar: medüzler, sifonoforlar, yumu ak mercanlar

-Ahtapotlar: Poliketler, annelidler

- Derisidikenliler

-Larvalar

-Çe itli balık türleri

3

2.1.3. Biyolüminesensin Tarihçesi

Biyolüminesensin farkına varılması 1700-1800’lü yıllara kadar uzanmaktadır. Deniz

suyunda ve deniz canlılarında gözlenen farklı renklerdeki ı ımalar insanların hem dikkatini

çekmi hem de ürkütmü tür. Tabii ki sadece denizel ortamlarda de il aynı zamanda karasal

alanlarda da gece oldu u zaman çe itli mantarlarda ve böceklerde de i ik renklerde ı ık

oldu unun fark edilmesi ara tırmacıları bu olayın nedenini bulmaya yöneltmi tir (ERSOY,

2005).

2.1.4. Canlıların Biyolüminesens Yapmasının Nedenleri

Organizmaların biyolüminesensi 4 ana amaç için kullandı ı dü ünülmektedir.

1. Avlanmak

2. Di er türlerle ileti im kurmak

3. Kendini belli etmek

4. Saldırganlardan kurtulmak

Bakteri ve fungusların ya amını sürdürmek, neslini devam ettirmek gibi canlılı ın temel

fonksiyonlarını yerine getirmek için biyolüminesens olayını gerçekle tirdi i dü ünülmektedir.

2.1.5. Lüminoz Vibrio Türlerinin Genel Özellikleri

Vibrio grubu gram-negatif, fakültatif aerob, fermentasyon metabolizmasına sahip

basillerden olu ur. Ço u kamçılıdır. Ayrıca ço u Vibrio ve ilgili di er bakteriler tatlı sularda

ya da denizlerde ya arlar. Vibrio cholerae insanlarda "kolera"ya sebep olan patojendir. Bu

organizmanın su aracılı ıyla bula tı ı bilindi i için içme sularının arıtılması oldukça önemlidir

(www.biltek.tubitak.gov.tr). Düz ya da kıvrık çubuk morfolojisine sahiptirler. 0.5-0,8 μm

eninde ve 1,4-2,6 μm boyundadırlar. Endospor ve mikrokist olu turmamaktadırlar. Denitrifiye

edici de ildirler. Hepsi kemoorganotroftur ve birço u D-glukoz ve NH4Cl içeren mineral

ortamda büyüyebilme kabiliyetine sahiptir. Na+ iyonları tüm türlerin büyümesini stimüle

etmektedir. Vibrio türleri deniz suyu bazlı ortamlarda çok iyi bir ekilde üremektedir. Tümü D-

glukoz, D-fruktoz, maltoz ve gliserolü kullanmaktadır. Birçok tür oksidaz pozitiftir. Ço u 20-

30°C’de büyümektedir. Oldukça geni bir tuz aralı ına sahip sucul habitatlarda

bulunmaktadır. Denizel çevrelerde ve deniz hayvanlarının yüzey ve ba ırsak içlerinde

oldukça yaygın bir ekilde bulunmaktadırlar ( ekil 2). V.harveyi, V.fischeri, V.splensdidus I

ve V.logei biyolüminesen özellikteki lüminoz türlerdir (ERSOY,2005).

4

ekil 2: Vibrio türleriyle simbiyoz ya ayan bir balık(www.biltek.tubitak.gov.tr)

2.1.6. Lüminoz Bakterilerin Sınıflandırılması ve Özellikleri

Çizelge 1: Lüminoz türler, habitatları ve biyolüminesen simbiyozları

Türler Habitatlar Biyolüminesen Simbiyoz

Denizel Bölge

Vibrio fischeri Ilık kıyısal deniz suyu Monosentrid balık, mürekkep

balıkları

Vibrio harveyi Ilık tropikal kıyısal deniz suyu,

sediment -

Vibrio logei Kıyısal so uk deniz suyu, kuzey

kutbu ve kapalı deniz Sepiloid mürekkep balıkları

Vibrio orientalis Deniz suyu, karides yüzeyi -

Vibriosplendidius

Kıyısal deniz suyu -

Photobacterium angustrum

Deniz suyu ve balık ba ırsa ı -

Photobacterium leiognathi

Kıyısal ılık-tropikal deniz suyu,

leiognathid balık

Acropomatid, apogonoid ve

loliginid mürekkep balıkları

Photobacterium phosphoreum

Kıyısal ve pelajik so uk deniz suyu

Morid, macrourid, trachichthyid,

opisthoproctid, chlorophthalmid,

steindachneriid balık

Shewanella hanedai

So uk deniz suyu ve sediment -

Shewanella woodyi

Deniz suyu ve mürekkep -

Tatlı su

Vibrio cholerae Ilık, tropikal körfez, kıyısal deniz suyu -

5

Türler Habitatlar Biyolüminesen Simbiyoz

Karasal bölge

Photorhabdus temperata

Heterorhabditid nematodlarıyla

enfekteli böcek larvaları-

Photorhabdus luminescens

Heterorhabditid nematodlarıyla

enfekteli böcek larvaları-

Photorhabdus asymbiotica

nsanlardaki deri lezyonları -

Lüminoz bakteriler Vibrio, Photobacterium, Shewanella ve Photorhabdus cinslerinin

üyeleridir. Bu bakteriler gram(-) , proteobakterilerdir. Bu bakterilerin birço u fakültatif

aerobiktir. Lüminoz Photobacterium, Shewanella ve Vibrio cinslerinin türlerinin birço u

denizel ortamlarda bulunmasına ra men Photorabdus cinsinin türleri karasal çevrelerde

bulunmaktadır. Vibrio cholerae türü ise temiz olmayan çevreler ve tatlı sularda bulunan tek

lüminoz tür konumundadır (ERSOY,2005).

2.1.7. Bakterilerde Biyolüminesens Mekanizması

Biyolüminesensin temel reaksiyonu (KARABOZ,2001);

Lüsiferin Oksilusiferaz + I IK eklindedir.

Bakterilerde ı ık yaymayı sa layan reaksiyon ve alt ünitelerinden olu an lusiferaz

enzimi tarafından katalizlenmektedir. Bakteriyel lusiferazlar alfa-beta heterodimerleri

eklinde yapılmı tamamen proteinik yapıda olup herhangi bir ekilde metal, prostetik grup

ve aminoasit residüleri içermemektedirler ( ekil 3).

Di er tüm reaksiyonlarında oldu u gibi bakteriyel biyolüminesens için de temel

substrat olan lusiferin, lusiferini okside eden lusiferaz enzimi ve oksijenin bulunması, bunun

yanı sıra bakterilerde uzun zincirli bir alifatik aldehitin de yardımcı faktör olarak bulunması

gerekmektedir ( ekil 6). Bakterilerdeki lusiferin flavin mononükleotid (FMN)’den

olu maktadır. Bakteriyel lüminesenste primer elektron vericisi NADH olup elektronlar

lusiferaz aracılı ıyla iletilmektedir ( ekil 4) (KARABOZ,2001).

ATPLusiferaz

6

ekil 3: Bakteriyel lusiferinin yapısı ekil 4: Bakteriyel lusiferinin 3 boyutlu yapısı

(KARABOZ,2001) (ERKOÇ,2005)

Bu reaksiyon;

FMNH2 + O2 + RCHO FMN + RCOOH+ H2O+hv(490 nm)

Reaksiyondan kaynaklanan kuantum ürünü 0,1-1,0 foton olarak hesaplanmı tır.

Reaksiyon FMNH2 için oldukça spesifiktir. Uzun zincirli aldehit sentezi bir NADPH ba lı açil

protein redüktaz(‘r’, 54 kDa), bir açil transferaz (‘t’, 33 kDa) ve bir ATP ba lı sentetaz (‘s’, 42

kDa)’dan olu an bir ya asidi redüktaz kompleksi tarafından katalizlenmektedir. Aktivitesi

aldehit yoklu unda ı ık üretimi için gerekli olmaktadır ( ekil 5).

ekil 5: Biyolüminesens ve hücre metabolizması arasındaki ili ki(ERSOY,2005)

ATPLusiferaz

alt ünitesi

alt ünitesi

7

ekil 6: Vibrio harveyi’de lusiferaz (ERKOÇ,2005)

2.1.8. Quorum Sensing

Biyolüminesens gösteren bakterilerde lusiferaz enzimi üzerinde “otoindükleme” adı

verilen bir regülatör sentezi ile çalı an bir kontrol mekanizması bulunmaktadır. Lüminoz

bakteriler büyüme esnasında kültür ortamında biriken, miktarı belli bir düzeye ula tı ında

lusiferaz enziminin olu umunu indükleyen otoindükleyici adı verilen özel bir madde

üretmektedir. Büyüme yeterli düzeye ula ıp otoindükleyici birikir ve fonksiyon gösterirse

lüminoz hale gelmektedirler. Bu olay biyolojide “quorum sensing” olarak bilinir. Hücre

ileti iminin kompleks mekanizma tiplerinin varlı ını ortaya koyan kanıt ilk olarak Gram(-) ve

biyolüminesen özellikte olan ve bir karides patojeni olan V.harveyi çalı malarından elde

edilmi tir (KARABOZ,2001).

Hücreler arası evrensel sinyal moleküllerine ilave olarak tür spesifik sinyal

moleküllerinin de ke fi bakterilerin karma ık ileti im mekanizmalarını kullanarak bir di erini

etkiledi ini gözler önüne sermektedir. Quorum sensing gen regülasyonunda önemli bir rol

oynamaktadır, bakteri hücrelerinde PHB birikim mekanizmasında ve birçok patojenin

enfeksiyon geli tirmesinde önemli bir unsur olarak ortaya çıkmaktadır. V.harveyi’de

depolama ürünü olan PHB üretimi quorum sensing tarafından kontrol edilmektedir ( ekil 7).

Tür içi ya da türler arası hücre-hücre ileti imini zorla tıran sentetik stratejilerin geli imi ya da

do al stratejilein tanımlanması bakteriyel hastalıklar için yeni tedavi yöntemlerinin

geli tirilmesine imkân sa lamaktadır (ERSOY,2005).

8

ekil 7: Bakterilerde quorum sensing mekanizması (www.biltek.tubitak.gov.tr)

2.1.9. Biyolüminesensin Kullanım Alanları

Biyolüminesens okyanus ekolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. deo kameralarla

dünyanın birçok bölgesindeki ticari balıkların yüzeye yakın sürülerini bulmak için

kullanılmı tır ve sava zamanında gemilerin, torpidoların ve denizaltıların gece süresince

hareketleri yine biyolüminesens sayesinde görüntülenmi tir. Denizel organizmalardan

ekstrakte edilen biyolüminesens sistemler,aktif oksijen gibi potansiyel olarak zarar verici

radikallerin varlı ını ya da belirli bir biyokimyasal olayı i aret eden intrasellülar markerlar

olarak u anda geni kapsamda kullanılmaktadır.

Denizanalarından ekstrakte edilen fotoproteinler intrasellülar kalsiyumun rolü

hakkında bizlere çok fazla bilgi sa lamaktadır. Yine denizanalarından ekstrakte edilen ye il

fluoresan protein (GFP) intrasellülar bir marker olarak geni bir kullanım alanına sahiptir.

Mikrobiyal inokülantların biyoremediasyondaki etkilerini görüntülemek için biyomarker olarak

GFP geni ve ate böce i lusiferazını kodlayan luc geni kullanılmaktadır. Luc geni gasolin ya

da klorofenolün biyoremediasyonundaki etkilerini görüntülemek için kullanılmaktadır. GFP

geni ise GFP proteinin floresensine dayalı olarak topraktaki klorofenol degredasyonundaki

bakterileri görüntülemek için kullanılır.

Bu sistemler, biyomedikal açıdan kullanı lılı ını göstermek için genetik olarak

klonlanmakta ve modifiye edilmektedir. Denizel bakterilerin biyolüminesensini kontrol eden

genler de identifiye edilmi ve klonlanmı tır. Bunlar ve denizanası genleri raportör genler

olarak di er genlerin aktivasyonu hakkında haber vermektedir ve bu i i kolayca

görüntülenebilen ı ık yayımına neden olarak yapmaktadır.

Biyolüminesen bakteriler, ı ınımlarının kolay, hızlı ve niceliksel olarak ölçülebilir olma

avantajları nedeniyle son yıllarda biyoteknolojik uygulamalarda oldukça sık kullanılmaktadır.

Aynı zamanda genel toksik aktivitelerinin izlenmesi için dedektör olarak kullanılabilirler.

9

Biyolüminesens tıpta ve gıda sektörüne oldukça fazla uygulama alanına sahiptir.

Tıpta lipopolisakkarit assayi albumin ba lama kapasitesinin saptanması, psikofarmakolojik

maddelerin görüntülenmesi, dental hastalıkların te his ve tedavisi, ilaçların etkinli i ve

biyosensör olarak kullanım alanlarına sahiptir (ERSOY,2005).

Son yıllarda ara tırmacılar ate böceklerinin biyolüminesens etkilerinin kanser

hücrelerini kendi içlerinde yok edece ini bulmu lardır. Yani bir ate böce i kansere kar ı

güçlü bir silah üreticisi pozisyonundadır. Bu ate böce i tekni i fotodinamik terapiye yeni ve

kapsamlı bir yakla ım sa layabilmektedir. Bu terapi internal organların yüzeyleri üzerinde ya

da deri yüzeyine yakın yerlerde bulunan tümörlere saldırmak için ı ık patlamasını kullanan

etkili bir tedavi biçimidir (ERSOY,2005).

Su endüstrisiyle ilgili toksite görüntülenmesi i leminde hayvanlar kullanılırken artık

bakteriyel assayler kullanılmaktadır. ATP biyolüminesens teknolojisiyle yapabileceklerden bir

di er çalı ma da toplam canlı biyomasını saptamaktır.

2.2. Plastik

2.2.1. Plasti in Tanımlanması

Plastikler, karbonun hidrojen, oksijen azot ve di er organik ve inorganik elementli

elementlerle olu turdu u monomerler diye adlandırılan en küçük ve basit moleküllü

gruplardaki çift ba ın koparılarak polimerler diye adlandırılan uzun zincirli yapıya

dönü türülmesi ile elde edilen maddelerdir. Polimerler, belli bir sıcaklık ve basınç altında ve

belli katalizörler kullanılarak bir reaktörde monomerleri reaksiyona sokularak elde

edilmektedir. Örne in; etilen bir monomerdir. Bu monomerden olu turulan polimer olan

polietilen ise polimerdir. En çok kullanılan plastikler ba ında gelmektedir. Polimerlerin plastik

ürünlerine dönü ümü üç kademede gerçekle mektedir.

Bunlar;

Reçine granüller veya tozları yumu atmak için ısıtılır,

Yumu atılmı madde belli kalıplara dökülür,

Ürün so utulur ve ekillenmi plastik ürün elde edilir (PEHL VAN, 1995).

10

2.2.2. Bazı Plastik Çe itleri

Polietilen (PE): Geni bir kullanım alanı vardır. Maliyeti dü üktür.

Polipropilen (PP): Yaygın kullanılan plastiklerdendir. Otomobil yan sanayinde, bahçe

mobilyalarında vb. yerlerde kullanılır.

Polistiren (PS): Paketleme, elektronik ve beyaz e yaların plastik kısımlarında vb.

kullanım alanları vardır.

Polietilen tereftalat (PETE): Pet i e vb. üretimlerde kullanılır.

Poliamid (PA)(Nylon): Fiber, di fırçası kılları, misina vb. kullanım alanları vardır.

Poliester: Tekstilde kullanımı yaygındır.

Polivinil klorid (PVC): Boru, profil vb. imalatlarında kullanılır.

Polikarbonat (PC): CD, gözlük vb. imalatlarında kullanılır.

Akrilonitril bütadien strien (ABS): Bilgisayar monitörleri, yazıcılar, klavyeler gibi

elektronik aletlerin plastik aksamında yaygın olarak kullanılır.

Poliviniliden klorid (PVDC): Yiyecek paketlemede kullanılır (PEHL VAN, 1995).

2.2.3. Plasti in Zararları

Plastikleri çöpe atıldı ı zaman çürümez, paslanmaz, çözünme biyolojik olarak

bozulmaz ve do ada bozulmadan uzun yıllar kalmaktadır. Bazı plastikler vardır ki do ada

700 yıl bozulmadan kalabilmektedir. Suyun ve topra ın kirlenmesine neden olmaktadır.

Sulardaki canlılara zarar verip hatta ölümlerine neden olmaktadır (PEHL VAN, 1995). Her yıl

birkaç yüz bin ton plastik denize atılır ve okyanusta birikir. Bu nedenle, son yıllarda

plastikler, ekolojik problemlerin kayna ı olarak kar ımıza çıkar.

Do ada parçalanma süresi çok uzun olan yani do ada parçalanmayan plastikler

olarak adlandırılan plastiklerin maliyetlerin yüksek ve petrole ba ımlı olması, atık problemi

olu turmaları ve geri dönü ümde ayrı tırmanın zor olması gibi nedenler normal plastiklerin

problem ta ıyan yanlarıdır. Uzakla tırılmasında yakma yönteminin kullanılması hem pahalı

hem de atmosfere zararlı kimyasallar salması bakımından tehlikelidir. Geri dönü ümü,

plastiklerin ayrı tırılmasının zor ve maliyetli olması bakımından yine de bir alternatif olarak

görülmektedir. Araziye gömme ise en az pahalı olan yöntem oldu undan en çok

uygulanmamı olandır ancak do aya hasar vermekte, canlıların ölmesine sebep olmaktadır

(PEHL VAN, 1995).

11

2.3. Biyoplastikler

2.3.1. Biyoplastiklerin Genel Özellikleri

Plastik atıkların çevrede uzun yıllar parçalanmaması, do ada bulunan canlıların

ya amını tehdit etmesi, ehirlerin ve ormanların estetik kaliteleri üzerine olumsuz etkilerinin

bulunması, yok etme yöntemlerinin biri olan yakarak uzakla tırma yönteminin soludu umuz

havaya zararlı gazların salınımı açısından insan sa lı ını tehdit edici unsurlar ta ıması

nedeniyle alternatif bir uygulama olan biyoplastik üretimini bir çözüm önerisi olarak

kar ımıza çıkarmaktadır.

Biyoplastik hem do ada tamamen parçalanabilme özelli i nedeniyle hem de petrole

gereksinimi ortadan kaldırarak yenilenebilir enerji kaynaklarını kullanımı ile üretilmesi

nedeniyle ve sentetik plastiklerin fiziksel ve kimyasal özelliklerine sahip olması nedeniyle

plastik sektöründe çok de erli bir maddedir. Petrol rezervlerinin dünyada giderek azalması

ve artan fiyatlarla üretim maliyetinin artması, ayrıca do aya büyük zararlar vermesi

nedeniyle en azından plastik sektöründe petrol türevli sentetik plastik hammaddelerinin

yerine biyoplastik hammaddelerinin gelmesi son derece önemlidir (TEK N,2008).

Biyoplastik dendi inde biyolojik olarak yenilenebilir enerji kaynaklarıyla canlı hücreler

tarafından üretilen termoplastik özelli e sahip polimer yapıları akla gelmektedir. ki ekilde

kullanılmaktadırlar ya da petrol kökenli plastiklerle karı ımları hazırlanarak kullanılmaktadır.

Biyoplastikler; ni asta kökenli plastikler, poliaktik asit plastikler, poli-3-hidroksibütirat kökenli

plastikler, poliamid 11 kökenli plastikler ve biyolojik etanol kökenli polietilenler eklindedir

(ANDERSON, 1990).

2.3.2. PHA ve Önemi

Biyoplastiklerin polyester yapısına sahip polimerleri olan polihidroksialkanoatlar

(PHA’lar) do ada tamamen (%100) parçalanabilen bir polimer sınıfıdır. Poliester ailesi

olarak katı ve kırılgan plastikler özelli inden, elastomerik ve lastik özelli ine kadar de i ik

özelliklere sahip pek çok PHA türleri bulunmaktadır. Gram negatif ve gram pozitif 250’den

fazla farklı bakterinin çe itli PHA moleküllerini depoladı ı rapor edilmi tir. PHA’lar esas

olarak R-(-)-3-hidroksialkanoik asit monomerlerinden olu maktadır. PHA olu umunda

yakla ık 150 farklı hidroksialkanoik asidin görev aldı ı bilinmektedir (ANDERSON, 1990).

12

2.3.3. Polimerin Üretimi

PHA ço u bakteri tarafından azot, fosfor, oksijen, magnezyum, gibi büyüme

faktörlerinin sınırlı oldu u ancak karbon kayna ının bol miktarda bulundu u büyüme

ko ullarında hücre içerisinde sentezlenir ve depo edilir. PHA’ların etkin bir ekilde üretimi

için ko ulların geli tirilmesi halen devam eden bir prosestir.

PHA’nın endüstriyel çapta üretiminde kullanılacak mikroorganizmaların seçiminde

bazı faktörlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bunlar, hücrenin ucuz karbon kaynaklarını kullanma

kapasitesi, büyüme hızı, polimer sentez hızı, polimer akümülasyonu substrata ba lı

maksimum miktardadır.

Tüm maliyeti azaltmak için, PHA’yı yüksek üretkenlikle ve yüksek üründe üretmek

önemlidir. Kesikli ve sürekli kültürler gibi bazı metodlar üretkenli in arttırılması için

uygulanmı tır (OJUMU, 2004).

PHA olu umuna neden olan bazı sınırlayıcı besin maddeleri

Amonyum

Karbon

Demir

Magnezyum

Manganez

Oksijen

Fosfat

Potasyum sülfat

eker ya da ni astanın eklenmesi

Fosfat açlı ı ve ni asta fazlalı ı (TEK N,2008)

2.3.4. PHB

Birçok çe idi bulunan PHA’lar, lineer, uzun, 3-hidroksi ya asidi monomerlerinden

ibaret, aktif mikrobiyal polyesterlerdir (ANDERSON,1990). Bunlar içinde yer alan

polihidroksi- -bütirat (PHB), PHA’ların en yaygın ve geni kapsamlı olarak çalı an tipidir ve

polimerin bu sınıfına ticari ilginin do masına sebep olan PHA’ dır (MADISON,1999).

13

Do ada en yaygın bulunan PHA çe idi olan PHB, poli-3-hidroksibütirik asit

(poli(3HB)) yapısında olup bakteriyel ve arkeyal karbon ve enerji depo materyalidir ( ekil 8).

Poli-3-hidroksibütirik asit ve di er PHA’lar suda çözünmeyen inklüzyonlar halinde

sitoplazmada depolanmaktadır. Granülleri kristalize olmayan polimer yapısındadır. Su

polimere plastikle tirici (akı kanla tırıcı) gibi etki etmektedir (ANDERSON, 1990).

ekil 8: Hücrenin içindeki PHB görüntüleri

2.3.5. PHB’nin Özellikleri

PHB, yapısında kısa zincirli -hidroksi ya asitleri içeren, prokaryotların membranla

çevrili hücre içi depo maddesi olup, tekrarlanan hidrofobik birimlerden olu an bir

polimerdir (POIRIER,2002).

PHB’nin genel formülü (C4H6O2)n eklindedir.

Hücrede bir redoks düzenleyicisidir. PHB granülleri kolaylıkla gözlenebilir.

Granüllerin yakla ık % 98’i PHB, %2’si protein içermektedir (YILMAZ,2003).

PHB’ler, polipropilen gibi petrol türevli yaygın plastiklerle benzer materyal özellikler

gösterirler. Ancak bir termoplastik olan PHB’nin sertli i, polietilene kıyasla dört misli

fazladır. Hücre içinde sıvı, atmosferde katı halde olan PHB, organik çözücü ile

hücreden özütlendi inde kristalize olur (YILMAZ,2003).

ekil 9: PHB'nin kimyasal yapısı

14

PHB’nin erime sıcaklı ı, 157–188 oC’dir. PHB termoplastik oldu undan preslenip

ekil verilebilir (DAVE,1996).

Erime sıcaklı ı parçalanma sıcaklı ına çok yakın bir de erdedir. Bu durum

enjeksiyonla i leme sırasında polimerin kalıpla masını zorla tırmaktadır ( LEE,

1996).

PHB’nin UV ı ımalarına dirençli oldu u ancak, asit ve baz uygulamalarına kar ı zayıf

dirence sahip oldu u bildirilmektedir. Ayrıca, polimerin su ve hava geçirmez olu u

hidrolitik parçalanmaya kar ı direnç sa ladı ından PHB’nin kullanım olanakları

geni lemektedir (POIRIER,2002).

2.3.6. PHB’nin Önemi ve Yararları

Biyolojik olarak parçalanabilir olmalarından dolayı ve termoplastik özelli inden dolayı

tek kullanımlık ürünlerde paketleme endüstrisinde, tıpta, eczacılıkta, tarımda, besin

endüstrisinde, enantiomerik olarak saf kimyasalların sentezinde ham madde olarak ve boya

üretiminde kullanılmaktadır (REHM, 2003).

Tek kullanımlık ürünler, paketleme için P(HB-HV) filmleri, i e üretimi, tıp alanında

P(HB-HV) estetik ameliyatta, hidrolitik parçalanma özelli inin yava olu u ve vücut içinde

biyouyumlu bir molekül olu u ve PHB’nin degradasyon ürünü olan D(-)3-hidroksibütiratın

insan kanı plazmasında oldukça yüksek miktarda bulundu u saptanmı tır (LEE, 1996). Bu

nedenle, memelilerde dokulara PHB inplantasyonu toksik olmaması açısından doku ve

organ mühendisli i için oldukça de erli bir materyaldir.

Tek kullanımlık ki isel hijyen ürünlerinde P(HB-HV) tek ba ına yapısal materyal

olarak kullanılabilmektedir. Bunun dı ında parçalanabilen kısımlarından da olu abilir.

Örne in, matriks materyali olarak polipropilen / polietilenin yerini alabilirler.

2.3.7 PHB Olu um artları ve Tayini

Ara tırmacılar, PHB’nin birçok mikroorganizma tarafından, uygun olmayan üreme

ko ullarında olu turuldu unu ve PHB birikiminin genellikle, fazlaca karbon kayna ında,

ancak büyüme için gerekli nitrojen kayna ı, oksijen ve esansiyel elementler (N, P, S, Mg, K,

Fe vb.) gibi besleyici maddelerin eksikli inde gerçekle ti ini bildirmektedirler ( ekil 10).

15

ekil 10: Hücrelerde PHB sentez mekanizması (ATE ,1997)

Canlı bakteri hücresi içindeki PHB depo granüllerinin tespit edilmesi için geni olarak

kullanılan metotlardan biri de lipofilik boyalarla boyamaktır. Bu amaçla Nil Blue A (fluoresan

boya), Sudan Black B ve Sudan III (normal boya) gibi bazı boyalar kullanılabilir.

2.3.8. PHB’nin Biyolojik Parçalanabilirli i

PHB, P-(HB-HV) ve di er polihidroksialkanotlar mikroorganizmalar için enerji kayna ı

oldu u görülmü tür. P-(HB-HV) mikrobiyal olarak aktif çevrelerde biyolojik olarak

parçalanabilmektedir. Mikroorganizmalar polimerin yüzeyinde kolonize olarak P(HB-HV)’yi

parçalayarak enzimler salgılamakta; HB ve HV birimlerine dönü türmektedir. Bu birimler

daha sonra biyokütle büyümesinde hücre tarafından karbon kayna ı olarak alınmaktadır.

Polimer degrasyonunun hızı yüzey alanı, atık çevredeki mikrobiyal aktivite, pH, sıcaklık,

nem, di er besin maddelerinin olu turdu u baskı gibi çe itli etkenlere ba lı olarak

gerçekle mektedir. P(HB-HV) suda çözünmemekte dolayısıyla nemden de

etkilenmemektedir. Normal depolama sırasında parçalanmamaktadır. Havaya maruz

kaldı ında belirsiz bir nedenle stabil kalmaktadır. Aerobik ko ullarda PHA degradasyonu

sonucu olu an son ürün, su ve karbondioksittir. Anaerobik ko ullarda ise metan da

üretilmektedir ( LEE, 1996).

PHB, biyolojik parçalanabilirli i nedeniyle, bir kez kullanılıp atılan e yaların

üretiminde büyük avantajlar sa lar.

PHB’nin en önemli özelliklerinden biri, toprak ve insan vücudu vb. yerlerde, toksik

ürünler meydana getirmeksizin tamamen parçalanabiliyor olmasıdır. PHB’nin aerobik

ortamdaki parçalanma ürünleri karbondioksit ve su; anaerobik ortamda parçalanma ürünü

ise metandır.

16

PHB’nin parçalanma süresi birkaç aydan birkaç aydan (anaerobik), birkaç yıla (deniz

suyu) kadar, katkı maddesi ile ayarlanabilir. Parçalanmada nitrojen oksidi olu maması,

çevre korunmasında önemlidir. Parçalanan biyoplastik bitkilerin geli mesini olumlu yönde

etkilemektedir.

PHB’nin parçalanmasında, topraktaki birçok mikroorganizma görev alır. Aerobik ve

anaerobik PHB parçalayan bakteriler dı ında funguslar da, bu yıkıma katılmaktadır. Bunlar

toptak, kompostlar, aerobik ortamlar, anaerobik bataklıklar, göl-deniz suları ve hava gibi

çe itli ekosistemlerden izole edildiklerinden PHB’nin bu ortamlarda parçalanabilirli i

bildirilmi tir. Topraklarda yer alan parçalayıcı organizmaların bazı gram negatif

mikroorganizmalar, Gram pozitif basiller ve mantarlar oldu u bildirilmi tir.

2.3.9. PHB’nin Yenilenebilme Özelli i

PHB’nin biyolojik yapısı ve biyolojik yıkıma u raması kadar önemli olan, onun

yenilenebilen kaynaklara dayalı üretilebilmesi gerçe idir. Bir do al materyal olan bu

polyester bakteriyel orijinlidir ve gerçekten birçok mikroorganizma, bu makromolekülü

parçalama yetene ine sahiptir. Bunun yanı sıra, petrokimyasal termoplastlar gibi, geri

dönü türülebilir bir biyoparçalanma gösterirler ( ekil 11).

Biyoplastiklerin yeniden olu um devresi, sentez-parçalanma-sentez olarak

bilinmektedir. Bu devre tabiatta kendili inden gerçekle ebilece inden, çevre korunması

açısından da önemlidir (YILMAZ,2003).

ekil 11: PHB’nin karbon döngüsü (YILMAZ,2003)

17

2.3.10.PHB’nin Kullanım Alanları

Kolay ekil alma ve parçalanabilme özellikleri nedeniyle daha çok paketleme

malzemesi olarak kullanılmaktadır. Ancak biouyum yeteneklerinin de olması implantasyon

maddesi olarak kullanımınıda her geçen gün arttırmaktadır. Özellikle PHB ve kopolimer poli-

-hidroksibütirat-co-polihidroksivalerat P(HB-HV) gıda ve kozmetik alanındaki paketleme

maddeleri, tarım, ki isel temizlik araçları ve biyomedikal ürünler gibi alanlarda çok geni

potansiyel uygulamalara açıktır (YILMAZ,2003).

Biyouyumlu olan PHB monomerleri insan vücudunda bulunan do al metabolit olması

nedeniyle, polimer vücutta sadece çok hafif bir immünolojik cevap olu masına neden olur.

Bu özelli inden dolayı PHB insanlarda ilaçların kontrollü salınımı için test edilmi tir. Böyle

çalı malarda ilaç, PHB’den yapılmı bir hap içine sıkı tırılmı ve a ız yoluyla hastalara

verilmi tir. PHB’nin vücut içinde biyolojik parçalanması yava tır. nsan vücudu PHB

depolimeraz enzimi içermez. Bu özelli inden dolayı da PHB cerrahi diki ler, protezler ve

i neler gibi cerrahi maddelerin yapımında kullanılmı tır.

Yapılan çalı malar, tekstil sanayisinde, PHB’den yararlanabilece ini göstermi tir.

PHB granülleri sayesinde yüksek ısı kapasitesi ve dü ük termal geçirgenli e sahip olan

transgenik liflerin tekstil sanayisi uygulamalarında avantaj sa ladı ı bildirilmi tir.

Biyobozunur plastiklerin paketleme, gıda, tıp, eczacılık ve tarımdaki kullanım alanları

ise öyledir;

Paket filmleri, po etler, torbalar, gıda muhafazasında kullanılmak üzere tepsiler ve

çe itli kaplar,

ampuan ve me rubat i eleri, karton süt kutularının iç yüzey kaplamaları,

laç, tablet, insektisit, herbisit ve gübrenin uzun sürede, belli hızda salıverilmesi için

biyoparçalanır ta ıyıcılar,

Bir kereye mahsus kullanılan tıra bıça ı, çatal, bıçak, tabak gibi mutfak kapları ve

bebek bezleri,

Cerrahi pens, ameliyat ipli i, eldiven, önlük ve maske,

Kemik de i tirilmesi ve cerrahi plakalar,

Pansuman sargısı,

Kan damarı de i tirilmesi,

Bitki sulama boruları, bitki yapraklarının kaplanması,

Pi (izoelektrik nokta) özelliklerinden yaralanılarak kemik büyütülmesi ve tedavisi,

18

Taze balık, peynir, et ve et ürünleri, kurutulmu ürünler, kurutulmu pastacılık

ürünleri, cipsler, ekerlemeler gibi gıdalarda nem ve oksijene kar ı koruma veya

parlaklık sa lama, aroma kaybını önleme amacıyla kullanılmaktadır (YILMAZ,2003).

2.3.11. Türkiye’de Yapılan PHB Çalı malarından Bazıları:

Karaboz ve Umay (1994) tarafından Pseudomonas extorquens’ ten PHB üretimi

ara tırılmı ve üç farklı içeri e sahip besi yerinde PHB verimleri gliserin yeast ekstrakt içeren

temel; %1,0 gliserinli oldu unda %22, %1,5 glikozlu oldu unda %15, %0,5 metanollü

oldu unda ise %27 ortamında PHB üretti i saptanmı tır. Yöntemde sokslet cihazı

kullanılarak kloroformla ekstrakte edilip, hekzanla prespite edilmi tir. Ardından 10 mL sülfirik

asit eklenerek sıcak su banyosunda 10 dk. tutulmu tur. 235 nm’de absorbansı sülfirik aside

kar ı okunmu tur. Ve standarda göre kar ıla tırılarak %PHB verimi elde edilmi tir. Buna

göre 0.81 μg/mL hücre kuru a ırlı ından %1 gliserinli ortamda 0,18 μg/mL PHB elde

edilmi tir. 0,93 μg/mL hücre kuru a ırlı ından %1,5’lik glikozlu ortamda 0,14 μg/mL PHB

elde edilmi tir. 1,18 μg/mL hücre kuru a ırlı ından %0,5’lik metanolde 0,32 μg/mL PHB elde

edilmi tir.

Mercan (2002) tarafından yapılan bir ba ka çalı mada Rhizobium spp. 2426 ile L-sisteinli

YEM sıvı besi yerinde 0,2825 gr/L PHB ile %74,03’lük verim elde edilmi tir.

Cyanobakteriler fotosentetik bakterilerdir. Yolda ve arkada larına(2003) göre

Synecocystysis su larının Beggiatoa besi yerinde %3,8-77,5 oranında PHB ürettikleri

spektrofotometre ile saptanmı tır.

19

3. MATERYAL VE METOD

3.1. Deneylerde Kullanılan Kimyasal Maddeler: NaCl, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, KCl,

Tris, NH4Cl, K2HPO4.3H2O, kloroform, FeSO4.7H2O, Agar, Pepton, Yeast, Gliserol, Sudan

Black B, Nile Red, PHB, Sülfirik asit, Etanol, DMSO, Xylen, Safranin, Asetik Asit’tir.

3.2. Deneylerde Kullanılan Aletler

Çizelge 2: Kullanılan aletler ve markaları

Kullanılan Elektronik Cihazlar Marka

1 Otoklav Hırayama Hıclave HVE-50

2 Pastör Fırını Heraeus

3 Hassas terazi Denver Instrument(d=0,0001 g)

4 Mikroskop Olympus Binoculer CX 21

5 Çalkamalı inkübatör Innova 4340

6 Santrifüj Rotiha 35R

7 Spektrofotometre Cary 300 Bio UV Visible Spectrofotometer

8 Liofilizatör EDWARDS

9 Manyetik karı tırıcı CHILTERN MS21S

10 Sıcak su banyosu Kottermann Labortechnik

11 UV UVP Dual-intensity Transilluminator

12 Fluoresan Mikroskobu Leica DM4000B

3.3. Deneyler

3.3.1. zolatların Elde Edilmesi

Deneylerde kullanılan izolat türleri Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü

Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Ara . Gör. Esra ERSOY ÖMERO LU’ndan alındı.

20

3.3.2. SWC(Seawater Composition) Ortamının Hazırlanması

Çizelge 3: SWC ortam içeri i

Madde Miktar

Pepton 5g/L

Yeast Extract 3g/L

Gliserol 3ml/L

Agar 20g/L

CaCO3 1g/L

Literatürde belirtilen ortam içeri ine göre 200 mL’lik 10 tane petri hazırlandı ( ekil

12). Bu ortamlar aktivasyon için kullanıldı ve daha sonra BMA ortamına izolatlar ekildi.

Bunlardan iki tanesine O5 ve Se4Lü49-2 bakteri izolatları ekildi ve optimum ko ullardaki 20

˚C’deki etüve kaldırıldı geri kalan petriler stoklandı ( ekil 13). O5 tanımlanmı bir Vibrio

harveyi türü iken Se4Lü49-2’nin türü bilinmeyip biyolüminesens bir bakteridir. O5 Holothuria

tabulasa ba ırsak içeri inden alınan bir örnektir. Se4Lü49-2’nin ise genetik tanısı henüz

yapılmamı Vibrio genusu oldu u dü ünülen bu biyolüminesen zmir Körfezi’nin

sedimentinden alınmı tır. Ekilen petriler literatürde belirtildi i üzere en iyi PHB üretti i 36.

saatten itibaren Sudan Black-B boyası ile boyanmak üzere etüvden alındı.

ekil 12: SWC ortamının hazırlanması ekil 13: Ekimi yapılmı izolatların etüve kaldırılması

3.3.3. Sudan Black B boyasının hazırlanması ve Preparatların Boyanması

0.3 gr Sudan Black-B boyası 75 ml %95’lik etanolde çözülerek üzerine 25 ml distile

su ilave edildi ve iyice karı tırıldı. Filtreden geçirildi. Temiz bir lam üzerine ince bakteriyel

film hazırlandı ve ate te fiksasyonları yapıldı. Daha sonra preparatlar, hazırlanan Sudan

Black-B boyası ile örtüldü ( ekil 14). So ukta 5 dk. muameleye bırakıldı. Süre sonunda

boya dökülüp preparatlar dikkatlice kurulandı. Xylen ile yakandı ve tekrar kurutuldu.

21

Daha sonra üzerleri safraninle boyanarak 30 sn. beklendi. Preparatlar yıkandı

kurulandı. Olympus Binoculer CX21 marka mikroskopla immersiyon objektifine kadar bakıldı

( ekil 15).

ekil 14: Sudan Black B Boyaması ekil 15: Binoküler Mikroskop

3.3.4. ASW (Artificial Seawater) ve BMA (Basal Medium Agar) ortamının hazırlanmasıve izolatların UV lambası altında bakılması

Çizelge 4: ASW (Artificial Seawater ) ortamının içeri i

Madde Miktar

NaCl 23,4 g/L

MgSO4.7H2O 24,6 g/L

KCl 1,5 g/L

CaCl2.2H2O 2,9 g/L

Çizelge 5: BMA (Basal Medium Agar) ortamının içeri i

Madde Miktar

Tris 6,1 g/L

NH4Cl 1,0 g/L

K2HPO4.3H2O 0,075 /Lg

FeSO4.7H2O 0,028 g/L

Agar 20 g/L

Su 1 L

Pepton 2,5 g/L

Yeast 1 gr/L

Gliserol 30 ml/L

22

Hazırlanı ı: 500 mL distile suya 11,7 g NaCl, 12,3 g MgSO4.7H2O, 0,75 g KCl ve

1,45 CaCl2.2H2O sırayla konulmu tur. Di er maddeye geçmeden öncekinin çözülmesi

beklenmi tir. Böylece daha hızlı ve kolay bir çözünme elde edilmi tir. Daha sonra elde

etti imiz bu yapay deniz suyunun üzerine 500 mL distile su eklenerek ASW ortamımız hazır

olmu tur. Bunun üzerine besi ortamımız olan BMA ortamı hazırlanmı tır. BMA ortamı

hazırlanan 1L’lik ASW çözeltisinde hazırlanmı tır. BMA ortamına 1 g NH4Cl, 0,075 g

K2HPO4.3H2O, 0,028 g FeSO4.7H2O eklenmi iyice çözüldükten sonra ise 6,1 g Tris

eklenmi tir. Tris iyice çözündükten sonra ortamımızın pH’sı 7,5 olacak ekilde 1N NaOH ile

ayarlama yapılmı tır. pH’sı ayarlandıktan sonra 20 g Agar eklenmi tir. 250 mL’lik ortam

i elerine payla tırılıp steril olması için otoklava konmu tur ( ekil 16). Ba ka bir yerde de 5

μg Nile Red boyası 10 mL DMSO’da çözüldü. yice çözündükten sonra 0,22 μg por çaplı

milipor filtreden geçirilerek boyaların sterilizasyonu sa lanmı tır ( ekil 17). Otoklavdan çıkan

steril ortam i elerine 250 mL’de 0,5 mL olacak ekilde konmu tur. Daha sonra iyice

karı tırılarak steril petrilere 20’ er mL olacak ekilde 50 tane hazırlanmı tır ( ekil 18).

So uması için beklenmi daha sonra izolatlarımız çizgi ekim yöntemiyle ekilerek üremeleri

için, 20 oC’lik etüvlere kaldırılmı tır ( ekil 19). Daha sonra 42. saatten itibaren sürekli 254

nm dalga boyunda örneklerimiz kontrol edilmi , ı ımalarına bakılmı tır.

ekil 16: Sterilizasyonlarının sa lanması ekil 17: Fluoresan boyası olan Nile Red

için örneklerin otoklavlanması boyasının milipordan geçirilmesi

ekil 18: Besiyerlerin petrilere dökülmesi ekil 19: zolatların çizgi ekimle petrilere ekimi

23

3.3.5. zolatların Fluoresans Mikroskobunda Bakılması

zolatlarımızda PHB’nin varlı ının kesinle tirilmesi için fluoresan mikroskobunda

tekrar bakılmı ve u yollar izlenmi tir. Bazal Medium Agar ortamıyla aynı ortam hazırlanmı

sadece içine agar konmayarak sıvı bir besi yeri (Basal Medium Broth) hazırlanmı tır.

Üzerlerine ekilen örneklerimiz Y ne 20 oC’lik etüvde beklendikten sonra 42. saatte alındı ve

lamda bakteriyel film hazırlandı. Ate te fiksasyonları yapıldıktan sonra boya dolu jara konup

55 oC’lik etüvde 10 dakika bekletildi, suyla yıkandı. Daha sonra %8’lik asetik asitte bekletildi

ve tekrar yıkandı, kurulandı. Üzerlerine 1 damla gliserol konup lamelle kapatıldı ve

fluoresans mikroskobunda bakıldı ( ekil 20). Bu i lemlerin hepsi karanlık ortamda

gerçekle tirilmi tir.

ekil 20: Fluoresans Mikroskobu

3.3.6. PHB Standart Grafi inin Çıkarılması

0.05 g PHB alındı. Üzerine 100 ml kloroform eklendi. 50˚C manyetik karı tırıcıda

ısıtılarak çözüldü. yice çözüldükten sonra 1 ml alındı ve üzerine 99 ml kloroform eklendi.

Elde edilen çözeltiden sırasıyla, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ml alınıp 50 mL’lik

beherlere kondu. Kaynayan sıcak su banyosunda kloroform tamamen uçuruldu. Her bir

erlene 10 ml sülfirik asit ilave edildi. Daha sonra 10 dk. kaynayan sıcak su banyosunda

tutuldu.Bu sırada PHB krotonik aside dönü tü. 235 nm’de spektrofotometrede okuma yapıldı

(Kör olarak sülfirik asit kullanıldı). Sonuçta, 1μg/ml, 2μg/ml, 3μg/ml, 4μg/ml, 5μg/ml, 6μg/ml,

7μg/ml, 8μg/ml, 9μg/ml, 10μg/ml konsantrasyonlara göre absorbanslar elde edilmi oldu. Bu

de erlere göre standart grafi i çıkarıldı. Kullanılan tüm cam malzemeler bir gün önceden

asitten ve distile sudan geçirilmi ve 1 gece pastör fırınında kurutulmu tur.

24

3.3.7. zolatlardaki PHB De erlerinin Ölçülmesi

lk önce izolatlarımız BMA ortamlarında aktive edildi ve bir gün aktif olmaları için

beklendi ertesi gün bunlar sıvı ortam olan BMB’ye aktarıldı. BMB’de üremeleri için gene bir

gün beklendi. Takip eden günün ak am 19.00 da ekimin olması için 18.30’dan itibaren

izolatlarımızı tekrar BMB’ye a ılama ve OD 600 nm’de 1 de erine ayarlama çalı ması

yapıldı. Amacımız yakla ık olarak e it sayıdaki hücreler üzerinde çalı mayı sürdürmekti.

Daha sonra bunlardan %2 oranında a ılanarak 42 ve 48 saat çalkalamalı inkübatörde

inkübe edildi. nkübasyon sonucunda ö len 1’de alınan örnekler santrifüj aletinde 6000

rpm’de 15 dakika 50 mL’lik Falcon tüplerinde santrifüjlendikten sonra hücrelerin lizisi için 15

dakika da suyla santrifüjlenmi tir. Daha sonra da donmaları için -20oC’ye kaldırılmı tır. 48.

saatte de aynı i lemler gerçekle tirilmi daha sonra liofilizatöre kaldırılarak kurumaları

sa lanmı tır. Bir gece liofilizatörde bekleyen izolatlar ertesi gün tartılmı daralarından

çıkarılarak biyomasları ( Kuru Hücre A ırlıkları) tartılmı tır. zolatlar daha sonra 250 mL’lik

erlenlere alınarak üzerlerine 10’ar mL sülfirik asit eklenmi ve 10 dakika kaynar sıcak su

banyosuna tabi tutulmu tur. Sıcak su sonunda PHB’ler krotonik aside dönü mü tür. Daha

sonra bu çözeltilerden 1 mL alınarak üzerlerine 9’ar mL sülfirik asit ilave edildi. Bunun

yapılmasının sebebi çözeltilerin çok yo un olmasıdır. Bu ekilde seyreltme i lemi yapılmı

ve 235 nm’deki spektrofotometrede okunmu tur. Fakat de er 10.000 nm’den yüksek çıkmı

ve seyreltmeleri artırılarak O5 1/100 Se4Lü49-2 ise 1/1000 yapılmı tır.

Okunan de erler denklemde yerine konmu tur. Daha sonra yüzde verimi de alttaki

formülle hesaplanmı tır.

Denklem: Y= M * X

Z= X * SF * SF

Y= okunan absorbans de eri

SF= seyreltme faktörü

SF= ilave seyreltme faktörü

Z= μg PHB

k mg kuru hücrede Z mg PHB üretiliyorsa

100 mg kuru hücrede x

25

4-SONUÇLAR VE TARTI MA

1) Deneylerde hazırladı ımız ortamlarda ço alan bakteri türlerinde ba langıçta PHB

boyaması Sudan Black-B ile yapılarak mikroskopta inceleme yapıldı. Bu inceleme sonunda,

boyama sırasında kullanılan safraninin pembe bir ekilde hücreyi, Sudan Black-B’nin de

PHB granüllerini lacivert ve mor renklerinde boyadı ı gözlendi. Se4Lü49-2’de PHB

granüllerinin çok yo un oldu u ( ekil 21) O5’inse o denli PHB granülü üretmedi i

gözlenmi tir ( ekil 22).

ekil 21: Se4Lü49-2 mikroskop görüntüsü ekil 22: O5 mikroskop görüntüsü

2) Deneylerin di er a amasında hazırlanan ortamlara fluoresan özellikteki Nile Red

boyası eklenmi , izolatların ı ımaları UV lambası altında de erlendirilmi tir. O5’in 42 ve 48.

saatlerde yaptı ı ı ımanın Se4Lü49-2 ’den daha az ı ıma yaptı ı görüldü. ekilde 1

numaralı bölümde ekim yapılmamı ken 2. bölümde PHB üretmeyen bir tür 3. Bölüme O5 ve

4. bölüme Se4Lü49-2 bakterileri ekilmi tir. Görüldü ü gibi 1. bölümde üreme yokken 2.

bölümde üreme olmu fakat ı ıma olmamı tır. 4. bölümde ve 3. bölümde ise ı ımalar

gözlenirken Se4Lü49-2’nin ı ıması daha fazladır ( ekil 23).

ekil 23: UV lambası altındaki ı ıma gözlenmesi

12

43

26

3) Fluoresan mikroskobunda incelendi inde hem O5’in hem de Se4Lü49-2’nin PHB

üretti i kanıtlandı. PHB olan bölgeler kırmızı olarak görüldü. Se4Lü49-2’de PHB’ler daha

kırmızı ve yo un biçimde görüldü ( ekil 24). O5’te ise kırmızı ı ıma daha az görülmü tür

( ekil 25).

ekil 24: Se4Lü49-2’nin fluoresans mikroskobu görüntüsü

ekil 25: O5’in fluoresans mikroskobu görüntüsü

4) Çe itli deri imlerde çözeltilerin absorbanslarına göre olu turulan standart

grafi inin regresyon katsayısı 1’e çok yakın olarak tespit edildi. Bu durum standart grafi inin

güvenilirli ini kanıtlamaktadır. ( ekil 26)

27

PHB STANDARDI y = 0,1754xR2 = 0,9955

0

0,5

1

1,5

2

2,523

5 nm

abs

orba

ns d

eer

i

μg/ml PHB

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ekil 26: PHB standart grafi i

5) PHB standart grafi ine ba lı olarak PHB de erleri ölçüldü ünde a a ıdaki veriler

elde edilmi tir.

Çizelge 6: Saatlere göre hücre kuru madde miktarlarının a ırlıkları

O5 Se4Lü49-2

42.saat 165,4 mg 242,1 mg

48.saat 164,1 mg 230,7 mg

Çizelge 7: Saatlere göre hücre içerisindeki PHB granüllerinin a ırlıkları

O5 Se4Lü49-2

42.saat 8,1528 mg 58,153 mg

48.saat 8,4076 mg 52,514 mg

Çizelge 8: Saatlere göre PHB verimlerinin kar ıla tırılması

O5 Se4Lü49-2

42.saat %4,93 %24

48.saat %5,12 %22,76

28

Se4Lü49-2 izolatının O5 izolatına göre oldukça yüksek PHB verimlili ine sahip

oldu u görülmü tür. Biyoplastik üretim a amasında Se4Lü49-2 izolatının kullanılması

endüstriyel ve ekonomik olarak kazanç sa layabilir. Aynı zamanda bu türün PHB üreten

di er bakteri genusları türlerine göre daha hızlı üremesi oldukça avantajlı görünmektedir.

6) Yüksek verimli olan Se4Lü49-2 izolatını farklı karbon ve azot kaynaklarında

denenmesi, üretilmesi ve daha sonra da fiziksel ve kimyasal mutasyona u ratılması, PHB

miktarını arttırabilece i bu anlamda yeni projeler tasarlanabilece i de dü ünülmektedir.

Biyoplastik tıp alanında cerrahi müdahalelerde kullanılan ipler, platinlerin yerini

alması vücutta kolay eriyebilmesi dolayısıyla tıpta kullanımı yaygınla maktadır. Hayvan

dokularına PHB giri i yüksek iddette toksik etki yapmadı ından; vücutta absorbe edilebilen

protez aletlerin ve cerrahi aletlerin yapımında PHB’nin kullanımı artmaktadır. PHB ve

kopolimerlerinin hayvan dokularına implante edildi inde onların biyolojik olarak

parçalanabildi i görülmü , hem tıbbi, hem de eczacılık alanlarında PHA’lara olan ilgi

artmı tır. Plastik ve türevlerinin çevreye yaydı ı zarar günümüzde çe itli geri dönü üm

projelerinin temel sebebini olu turur. Biyoplastik üretiminin yaygınla tırılması plastik ve

türevlerine daha ekolojik ve ekonomik olarak yeni bir alternatif olu turacaktır. Dünyada

gittikçe yaygınla an biyoplastik kullanımının ülkemizde de yaygınla tırılması için bu ve

benzeri projeler daha çok desteklenmeli ve geli tirilmelidir.

29

5-TE EKKÜR

Projelerimizde bize destek veren okul müdürümüz Sayın Yavuz KAHRAMAN’a ve müdür

yardımcımız Sayın Aylin MUSLUO LU’na, her türlü problemimize ko an Özel Ege Lisesi

Fen Bilimleri Bölümü Biyoloji Ö retmeni Sayın Mesut ESEN’e çok te ekkür ederiz.

Ayrıca; bilimsel destek sa layan Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Mikrobiyoloji

Ana Bilim Dalı Bölüm Ba kanı Sayın smail KARABOZ’a, Ara tırma Görevlisi Sayın Esra

ERSOY ÖMERO LU’na ve laboratuvar çalı anlarına te ekkür ederiz.

30

6-KAYNAKLAR

1. ANDERSON, A., DAWES, E., (1990), Occurrence, metabolism, metabolic role, and

industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates, Microbiological Reviews, 54(4): 450-472.

2. ATE ,M., (1997), Batık Kültür Fermentasyonu Yöntemiyle Bazı Bakterilerden PHB

Üretimi, Doktora Tezi, Ege Üniv. Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, ZM R.

3. BOYANDIN, A. N., (2007), Synthesis of reserve polyhydroxyalkanoates by

luminescent bacteria, Mikrobiologia, 77 (3): 364-369.

4. CHIEN, C., CHEN, C., CHOI, M, KUNG, S., WEI, Y., (2007), Production of poly- -

hydroxybutyrate(PHB) by Vibrio spp. solated from marine environment, Journal of

Biotechnology, 132: 259-263.

5. DAVE, H., (1996), Production of polyhydroxybutyrate by petrochemical activated

sludge and Bacillus sp., INDIA.

6. ERKOÇ, F., (2005) Lusiferaz, Gazi Üniv. E itim Fakültesi, ANKARA.

7. ERSOY, E., (2005), zmir li Deniz Suyu ve Deniz Canlılarındaki Lüminoz

Bakterilerin zolasyonu ve Tanılanması, Ege Üniv. Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü

Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, ZM R.

8. FUKASAWA, S., (1988) Purification and Properties of a Proteinase from a marine

luminous bacterium, Vibrio harveyi strain, Agricultural Biological Chemistry, (52): 435-441.

9. KARABOZ, ., SUKATAR, A., (2001), Sucul Canlılarda Biyolüminesens , E.Ü. Su

Ürünleri Dergisi, 18(3): 547-554.

10. KARABOZ, ., UMAY, F.B., (1994), Pseudomonas extorquens' den PHB

Üretiminde Farklı Karbon Kaynaklarının Etkisi. XII. Ulusal Biyoloji Kongresi, Edirne, Cilt: V ,

Moleküler Biyoloji, Genetik ve Mikrobiyoloji Seksiyonu,14-18.

11. LEE, S.Y., (1996), Bacterial Polyhydroxyalkanoates, Biotechnology and

Bioengineering, 49: 1-14.

31

12. MERCAN, N., (2002), Bazı Rhizobium bakterilerinin poli- -hidroksibütirat (PHB)

üretimleri, Pamukkale Üniv. Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, DEN ZL .

13. OJUMU, T.V., (2004), Production of bipolyhydroxyalkanoates a bacterial

biodegradable polymer, African Journal of Biotechnology, 3: 18-24.

14. PEHL VAN, E., (1995), Geri Kazanılabilir Maddelerin Potansiyelinin Ara tırılması,

Yıldız Teknik Üniv. Fen Bilimleri Enstitiüsü, Yüksek Lisans Tezi, STANBUL.

15. POIRIER, Y., (2002), Polyhydroxyalkanoate synthesis in plants as a tool for

biotechnology and basic studies of lipid metabolism, Progress in Lipid Research, 41: 131-

155.

16. TEK N, E., (2008), zmir Çamaltı Tuzlasından PHB Üreticisi Halofilik

Mikroorganizmaların zolasyonu ve PHB Verimlili inin Ara tırılması, Yüksek Lisans Tezi,Ege

Üniv. Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, ZM R.

17. YILMAZ, M., BEYATLI, Y., (2003), Biyoplastik: Poli- -Hidroksibütirat (PHB), Orlab

On-Line Mikrobiyoloji Dergisi, 01(09): 1-33.

nternet Adresleri

www.biltek.tubitak.gov.tr

www.biochem.wisc.edu

www.science-direct.com

www.flickr.com