LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Ieva Bajoriūnienė

17-O TIPO T LIMFOCITŲ PAGALBININKŲ VAIDMUO

SERGANT ALERGINE ASTMA

Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,

medicina (06B)

Kaunas, 2014

1

Disertacija rengta 2009–2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Pulmonologijos ir imunologijos klinikoje.

Mokslinis vadovas prof. dr. Kęstutis Malakauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universite-tas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

2

TURINYS

SANTRUMPOS .................................................................................................................... 5

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI .......................................................................... 7

2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS........................................................................... 8

3. LITERATŪROS APŽVALGA ................................................................................... 10

3.1. Astmos apibrėžimas ir paplitimas ....................................................................... 10 3.2. Astmos rizikos veiksniai ..................................................................................... 11

3.2.1. Dermatophagoides pteronyssinus alergeno vaidmuo astmos išsivystymui .......................................................................................... 12

3.2.2. Alerginis rinitas .................................................................................... 13

3.3. Astmos fenotipai ................................................................................................. 14 3.4. Astmos imunologija ............................................................................................ 17

3.4.1. Nespecifinio imuniteto komponentai .................................................... 17 3.4.2. Specifinio imuniteto patofiziologiniai mechanizmai ............................ 18

3.4.2.1. Ankstyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas ........................................ 18 3.4.2.2. Vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas ........................................... 21

3.4.3. T limfocitai – pagrindinės astmos patogenezėje dalyvaujančios ląstelės .................................................................................................. 23

3.4.3.1. 17-o tipo T limfocitai pagalbininkai ..................................................... 24 3.4.3.2. Interleukinas-17 .................................................................................... 25

4. TYRIMO METODIKA ............................................................................................... 30

4.1. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga ................................................................ 30

4.1.1. Atrankos kriterijai ................................................................................. 30 4.1.2. Tyrimo eiga ........................................................................................... 31

4.2. Tyrimų metodai .................................................................................................. 32

4.2.1. Alerginiai odos dūrio mėginiai ............................................................. 32 4.2.2. Plaučių funkcijos tyrimas ..................................................................... 33 4.2.3. Bronchų provokacijos mėginys su metacholinu ................................... 33 4.2.4. Bronchų provokacijos mėginys su Dermatophagoides

pteronyssinus alergenu .......................................................................... 34 4.2.5. Skreplių indukcija ir citologinis tyrimas ............................................... 34 4.2.6. Periferinio kraujo citologinis tyrimas ................................................... 35 4.2.7. Periferinio kraujo T limfocitų subpopuliacijų tyrimas .......................... 36 4.2.8. Citokinų koncentracijos serume ir indukuotų skreplių

supernatante nustatymas ....................................................................... 39

4.3. Matematinė statistinė duomenų analizė .............................................................. 40

3

5. REZULTATAI ............................................................................................................ 41

5.1. Tiriamųjų demografiniai ir klinikiniai duomenys ............................................... 41 5.2. Periferinio kraujo T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijos ............................. 45 5.3. Citokinų ir uždegimo ląstelių kiekis periferiniame kraujyje bei jų

tarpusavio sąsajos ............................................................................................... 46 5.4. Bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu

sukelti periferinio kraujo T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijų kiekybiniai pokyčiai ............................................................................................ 48

5.5. Bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu sukelti citokinų ir uždegimo ląstelių kiekio periferiniame kraujyje pokyčiai bei jų tarpusavio sąsajos .................................................................................... 52

5.6. Indukuotų skreplių ląstelių sudėtis bei citokinų koncentracijos prieš ir po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu .......................................... 55

5.7. Sergančiųjų alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija periferinio kraujo citokinų ir uždegimo ląstelių kiekis bei jų tarpusavio sąsajos ................................................................................................................. 65

6. REZULTATŲ APTARIMAS .......................................................................................... 77

6.1. 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų bei interleukino-17 reikšmė sergant alergine astma ..................................................................................................... 77

6.2. Bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu sukelti vietinio ir sisteminio uždegimo pokyčiai sergant alergine astma ............ 82

6.3. Alerginės astmos, pasireiškiančios ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija po kontakto su alergenu, imuninio atsako ypatumai ........................................... 85

IŠVADOS ............................................................................................................................ 89

DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ ........................................................................................ 91

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS .......................................................................................... 92

DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ............................. 105

PADĖKA ........................................................................................................................... 107

4

SANTRUMPOS

APC (angl. antigen-presenting cells) − antigeną pateikiančios ląstelės ARIA (angl. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma) − Alerginis rinitas ir jo įtaka astmai BAL − bronchoalveolinis lavažas BHR (angl. bronchial hyperresponsiveness) – bronchų hiperrektyvumas CCL2 (angl. C-C chemokine ligand 2) − CC chemokino ligandas 2 CCR (angl. C-C chemokine receptor) − CC chemokino receptorius CD (angl. cluster of differentiation) − diferenciacijos grupė CGRP (angl. calcitonin-gene-related peptide) − su kalcitonino genu susijęs peptidas DTT (angl. dithiothreitol) – ditiotreitolas ECP (angl. eosinophil cationic protein) − eozinofilų katijoninis baltymas ELISA (angl. enzyme-linked immunosorbent assay) − imunofermentinis tyrimas ERS (angl. European Respiratory Society) − Europos respiratologų draugija FcεRI (angl. high-affinity IgE receptors) − didelio afiniteto receptorius antikūno Fc fragmentui FEV1 (angl. forced expiratory volume in 1 sec.) − forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę FITC (angl. fluorescein isothiocyanate) – fluoresceino izotiocianatas Foxp3 (angl. forkhead box P3) – transkripcijos veiksnys Foxp3 g (angl. relative centrifuge force expressed in units of gravity) − išcentrinė jėga GINA (angl. Global Initiative for Asthma) − Visuotinė astmos iniciatyva GM-CSF (angl. granulocyte macrophage- colony stimulating factor) − granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis veiksnys ICAM (angl. intercellular adhesion molecule) – tarpląstelinės adhezijos molekulė IFN − interferonas Ig − imunoglobulinas IL – interleukinas IQR (angl. interquartile range) − tarpkvartilinis plotis iRNR − informacinė ribonukleino rūgštis IS (angl. induced sputum) − indukuoti skrepliai K3EDTA (angl. ethylene diamine tetra acetic acid tribasic potassium salt) − tribazis kalio etilendiamintetraacetatas l – litrai LSMU − Lietuvos sveikatos mokslų universitetas LT – leukotrienas mAk (angl. monoclonal antibody) − monokloninis antikūnas MHC (angl. major histocompatibility complex) – pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas min. − minutė MMP (angl. matrix metalloproteinase) – matrikso metaloproteinazė NaCl − natrio chloridas NF-κB (angl. nuclear factor-κB) – branduolio veiksnys κB NK (angl. natural killer) − ląstelė natūralioji žudikė PAF (angl. platelet activating factor)- trombocitus aktyvinantis veiksnys PBS (angl. phosphate-buffered saline) − fosfatinio buferio tirpalas

5

PD20− provokacinė metacholino dozė, sumažinanti FEV1 20 proc. lyginant su pradiniu dydžiu PerCP (angl. peridinin chlorophyll a protein) − peridino chlorofilo baltymas PG − prostaglandinas proc. procentas PSO – Pasaulio sveikatos organizacija PŠS − priekinė šviesos sklaida RORγt (angl. retinoic acid receptor–related orphan receptor-γt) − tanskripcijos veiksnys ROR γt ROS (angl. reactive oxygen species) − reaktyvios deguonies formos sav. – savaitė SEM (angl. standart error mean) − standartinė vidurkio paklaida STAT (angl. signal transducer and activator of transcription) − signalo perdavėjas ir transkripcijos aktyvatorius ŠŠS − šoninės šviesos sklaida T-bet (angl. T-box transcription factor) − transkripcijos veiksnys T-bet TCR (angl. T-cell receptor) − T limfocitų receptorius TGF-β (angl. transforming growth factor-β) − transformuojantis augimo veiksnys-β Th (angl. T helper cells) − T limfocitai pagalbininkai TLR (angl. Toll-like receptor) − transmembraninis atpažinimo receptorius TNF (angl. tumor necrosis factor) − naviko nekrozės veiksnys Treg (angl. regulatory T cells) − Treguliaciniai limfocitai TSLP (angl. thymic stromal lymphopoietin) − užkrūčio stromos limfopoetinas TX – tromboksanas val.− valanda VCAM (angl. vascular cell adhesion molecule) − kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulė VEGF (angl. vascular endothelial growth factor) − kraujagyslių endotelio augimo veiksnys

6

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas Įvertinti 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų vaidmenį sergant alergine

astma.

Darbo uždaviniai 1. Ištirti sergančiųjų alergine astma T limfocitų pagalbininkų (17-o

tipo, 1-o tipo ir 2-o tipo T limfocitų pagalbininkų) kiekį periferi-niame kraujyje ir palyginti su sergančiųjų alerginiu rinitu ir sveikų asmenų duomenimis;

2. Nustatyti sergančiųjų alergine astma interleukino-17 koncentraciją indukuotų skreplių supernatante ir periferinio kraujo serume, įvertinti sąsajas su 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų kiekiu perife-riniame kraujyje bei palyginti su sergančiųjų alerginiu rinitu ir svei-kų asmenų duomenimis;

3. Nustatyti 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų kiekio periferiniame kraujyje pokyčius bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu sukeltos vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimo metu;

4. Nustatyti Dermatophagoides pteronyssinus alergeno sukeltus interleukino-17 koncentracijos pokyčius indukuotų skreplių supernatante ir periferinio kraujo serume bei įvertinti sąsajas su kitų citokinų (interleukino-8, interleukino-5) ir uždegimo ląstelių (limfocitų, neutrofilų, eozinofilų) kiekiu sergant alergine astma;

5. Įvertinti 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų ir interleukino-17 kiekį sergantiesiems alergine astma, kuriems Dermatophagoides ptero-nyssinus alergenas sukelia ankstyvą ir vėlyvą bronchų obstrukciją, bei palyginti su sergančiaisiais alergine astma, kuriems alergenas sukelia tik ankstyvą bronchų obstrukciją.

7

2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS

Astma yra lėtinė kvėpavimo takų uždegimo liga, kurios paplitimo ir sergamumo rodikliai pastaraisiais metais pastebimai didėja daugelyje išsivysčiusių šalių, tarp jų ir Lietuvoje. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, net 300 milijonų žmonių visame pasaulyje serga šia liga. Todėl įvairių šalių mokslininkai skiria ypatingą dėmesį klinikiniams stebėjimams ir moksliniams tyrimams, siekdami išsiaiškinti astmos atsira-dimo priežastis, provokuojančius veiksnius, uždegimo kvėpavimo takuose ypatumus, ilgainiui sąlygojančius ligos progresavimą ir plaučių funkcijos sutrikimą. Mokslininkai neabejoja, jog antro tipo T limfocitai pagalbininkai (Th2) bei eozinofilinis kvėpavimo takų uždegimas yra astmos patogenezės pagrindas. Tačiau šis mechanizmas ne visuomet gali paaiškinti astmos metu esančio kvėpavimo takų uždegimo bei klinikinių simptomų įvairumą, eigos ypatumus ir net skirtingą atsaką į gydymą. Todėl įvairių šalių mokslininkai nenuilsdami ieško naujų astmos patogenezės veiksnių.

Šiame moksliniame tyrime pirmą kartą Lietuvoje tirta sergančių alergine astma 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų (Th17) subpopuliacija. Pastarųjų metų tyrimai įrodė, jog Th17 limfocitai ir jų citokinai, interleu-kinai (IL-17A ir IL-17F), reikšmingi autoimuninių ir uždegiminių ligų formavimuisi. Eksperimentiniai tyrimai su gyvūnais parodė Th17 limfocitų svarbą alerginės astmos vystymuisi. Šios T limfocitų pagalbininkų subpopu-liacijos imuninis atsakas charakterizuojamas specifiniu IL-17 poveikiu struktūrinėms kvėpavimo takų ir uždegimo ląstelėms, kurios sukelia padi-dintą uždegimą skatinančių mediatorių raišką, lemia neutrofilų bei makro-fagų susikaupimą uždegimo židinyje, jų aktyvumą ir besitęsiantį uždegimą.

Nauja ir reikšminga atlikto tyrimo dalis yra ta, kad pirmą kartą LSMU įdiegta ir optimizuota Th17 limfocitų nustatymo periferiniame kraujyje tėk-mės citometru metodika.

Pasaulinėje mokslinėje literatūroje publikuoti tyrimų rezultatai, kuriuo-se pagrindžiama Th17 limfocitų svarba sunkios, dažnai paūmėjančios, nea-lerginės ar neutrofilinės astmos patogenezėje. Tačiau Th17 reikšmė speci-finio alergeno sukelto imuninio atsako vystymuisi dar nėra ištirta.

8

Šiame moksliniame tyrime nauja yra tai, kad Th17 limfocitų imuninio atsako tyrimui sergant alergine astma pasirinktas ir sėkmingai įdiegtas bronchų provokacijos namų dulkių erkės, Dermatophagoides pteronyssinus (D. pteronyssinus) alergenu, modelis. Jis leidžia įvertinti dinamiškus Th17 limfocitų subpopuliacijos pokyčius − praėjus 7 ir 24 val. po alergeno įkvė-pimo, o vėlyva kvėpavimo takų uždegimo fazė, kuri atsiranda praėjus valandoms po alergeno įkvėpimo, pripažįstama kaip labiausiai atspindinti astmos patogenezę, o jos tyrimai laikomi reikšmingiausiais tiriant sergan-čiuosius astma.

9

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Astmos apibrėžimas ir paplitimas

Astma yra lėtinė kvėpavimo takų uždegimo liga, kuriai būdingas padidėjęs bronchų reaktyvumas, pasikartojantys sutrikusio bronchų laidumo epizodai, pasireškiantys veržimu krūtinėje, švokštimu, dusuliu ar kosuliu, išnykstantys savaime ar gydant [16].

Lėtinio neinfekcinio kvėpavimo takų uždegimo kaip pagrindinio astmos patogenezės mechanizmo samprata įsigalėjo XX a. Pradėti intensyviai vyk-dyti moksliniai tyrimai atskleidė, kad ligos simptomus provokuoja aplinkoje esantys alergenai, o bronchų gleivinės infiltracija uždegimą sukeliančiomis ląstelėmis [29] sukelia padidėjusį kvėpavimo takų jautrumą [39]. Astmai būdingi ilgai išliekančio uždegimo požymiai kvėpavimo takuose: gleivinės infiltracija leukocitais [81], epitelio pažeidimas [154] ir bazinės membranos sustorėjimas [94], gleives išskiriančių liaukų [139] ir lygiųjų raumenų išvešėjimas [52].

PSO duomenimis, astma serga daugiau nei 300 milijonų žmonių visame pasaulyje, o net 250 000 kas metai miršta nuo jos [16]. Tai viena dažniausių ir vaikų, ir suaugusių lėtinių ligų. Manoma, jog 2025 m. sergančių astma bus 100 milijonų daugiau nei šiandien. Daugelis epidemiologinių tyrimų skelbia gana skirtingus astmos paplitimo, sergamumo ir mirtingumo rodiklius. Juos sunku palyginti dėl tam tikrų nuolat besikeičiančių astmos diagnostikos kriterijų, tiriamųjų populiacijų amžiaus, etninių, socialinių bei ekonominių skirtumų. Minima, kad įvairiose šalyse astma serga nuo 1 iki 18 proc. populiacijos. Europoje astma nustatoma nuo 5 iki 15 proc. populia-cijos, o Europos šiaurinėje dalyje šie skaičiai dar didesni. Europos Sąjun-goje tiesioginės išlaidos kvėpavimo sistemos ligoms yra didelės ir sudaro apie 6 proc. viso sveikatos apsaugai skiriamo biudžeto, o su astma susijusios išlaidos siekia apie 17,7 milijardų eurų per metus.

Visai neseniai manyta, kad astma − tai ekonomiškai išsivysčiusių šalių problema. Paskutinių tyrimų duomenys parodė, kad ir besivystančiose šalyse sergamumas astma sparčiai auga. Manoma, kad tokį spartų serga-mumo augimą lemia urbanizacijos procesai besivystančiose šalyse, didėjanti oro tarša, cheminių priedų naudojimas maisto pramonėje, ankstyvas vaikų kontaktas su alergenais, rūkymas. Lietuvos statistikos departamento duome-nimis 2012 m. sergančių astma suaugusių asmenų buvo 13,5 atvejų 1000 gyventojų, o vaikų iki 17 metų amžiaus − 38,7/1000. Išlaidos, susijusios su kvėpavimo organų ligų gydymu, blogėjant epidemiologinei situacijai taip pat didėja. Šių laikų mokslininkai ir sveikatos specialistai viena iš svar-

10

biausių krypčių laiko astmos vystymosi mechanizmų tyrimus, naujų diag-nostikos galimybių ir gydymo būdų paiešką.

3.2. Astmos rizikos veiksniai

Kalbant apie astmos atsiradimo priežastis, dažniausiai minimas gene-tinis paveldimumas, žalingų aplinkos veiksnių įtaka, nuolatinė infekcija kvėpavimo takuose. Tikroji priežastis, sukelianti lėtinį kvėpavimo takų uždegimą, vis dar lieka neaiški. Pastarųjų metų mokslinėje literatūroje svar-biausiais vadinami genetiniai ir aplinkos veiksniai, jų tarpusavio sąveika. Identifikuota daugiau nei 100 genų, galinčių nulemti astmos atsiradimą. Nepaisant didelių skirtumų tarp populiacijų, pastarųjų metų klinikiniais bei eksperimentiniais tyrimais nustatyti genai, galintys nulemti: padidintą specifinių imunoglobulino (Ig) E klasės antikūnų gamybą, kvėpavimo takų reaktyvumą, uždegimo mediatorių gamybą, pirmo tipo T limfocitų pagalbi-ninkų (Th1) ir Th2 limfocitų imuninio atsako pusiausvyrą [137]. Net gydy-mo efektyvumas, atsakas į skiriamus bronchus plečiančiuosius vaistus ar gliukokortikoidus, kaip rodo farmakogenetiniai tyrimai, gali būti susijęs su tam tikru genotipu [83]. Genetinių skirtumų ir klinikinio astmos varianto įvertinimas leidžia kiekvienai astma sergančių pacientų grupei parinkti efektyviausią gydymą, užtikrinti tinkamą vaistų vartojimą, sumažinti paša-linį jų poveikį.

Aplinkos veiksniai – svarbi astmos rizikos veiksnių grupė. Kai kurie iš jų ne tik provokuoja ligos atsiradimą, bet kartu gali būti simptomų pasi-kartojimo ir ligos paūmėjimų veiksnys, blogos astmos kontrolės priežastis. Svarbiausiais astmą sukeliančiais aplinkos veiksniais laikomi oro alergenai: tai medžių, žolių, piktžolių žiedadulkės, esančios ore augalų žydėjimo metu, bei nuolatinai patalpų alergenai: šunų ir kačių epidermis, namų dulkių erkės, grybeliai. Nustatyta, kad vaikams, kurių namų aplinkoje pirmaisiais gyve-nimo metais yra didelis įvairių alergenų kiekis, nustatomas įsijautrinimas šiems alergenams, o ateityje – didesnė rizika susirgti astma [106]. Be to, tiriant epidemiologiškai stebimas aiškus sergančių astma skaičiaus didėji-mas miestuose bei padidintos oro taršos regionuose [128]. Įrodyta, kad rū-kančių tėvų vaikai turi du kartus didesnę tikimybę sirgti astma nei jų bendraamžiai, augantys nerūkančioje šeimoje.

Astma nevienodai dažna ankstyvame amžiuje ir subrendus, vyriškos ir moteriškos lyties atstovams. Pastebima, kad vaikų iki 14 metų populiacijoje astma serga dvigubai daugiau berniukų nei mergaičių [11], o vyresni vaikai ir suaugusieji serga vienodai dažnai. Nors tikroji priežastis nėra aiški, manoma, jog pokyčiai brendimo metu ir hormonų pusiausvyra nulemia

11

lyties specifinius požymius, o kartu ir skirtingą atsaką į aplinkos veiksnius. Paauglystėje ir suaugus, greta jau anksčiau išvardintų aplinkos veiksnių, veikiančių astmos atsiradimą, vis dažniau minimi mitybos ypatumai ir nutukimas [143]. Didesnis kūno masės indeksas susijęs su didesne astmos rizika, o sergantiems ja gali apsunkinti ligos gydymą. Ne mažiau domės mokslininkams kelia ir astmos vystymąsi aiškinanti higienos teorija. Paste-bėta, jog mažėjant infekcinių ligų dažniui ankstyvame amžiuje, imuninės sistemos vystymasis nukreipiamas kita, alerginių ligų vystymosi linkme [30,45], o vaikai, augantys kaimuose ar lankantys vaikų kolektyvus, rečiau serga alerginėmis ligomis [54]. Vėliau šiuos pastebėjimus mokslininkai pagrindė T limfocitų pagalbininkų tyrimais, išaiškino endotoksino, gram-neigiamų bakterijų membranos dalies lipopolisacharido, imuninį atsaką modifikuojančiu poveikiu. Kita vertus, daugelis tyrimų patvirtino, kad ankstyvame amžiuje respiracinio sincitinio ar rinoviruso sukelta infekcija yra astmos rizikos veiksnys, ypatingai asmenims, turintiems genetinį polinkį sirgti atopinėmis ligomis [99,101,168].

Plačiai tyrinėjamas ryšys tarp aplinkos alergeno, jo koncentracijos, ekspozicijos laiko bei įsijautrinimo ir ligos atsiradimo. Įrodyta, kad įsi-jautrinimas namų aplinkos alergenais, tokiais kaip naminių gyvūnų – šunų, kačių epidermis, Alternaria grybelio alergenai, priklauso astmos rizikos veiksniams [150,181]. Yra ir kitą nuomonę atstovaujantys tyrimai: vaikai, nuo pat gimimo turėję kontaktą su naminių gyvūnų alergenais, yra apsaugoti nuo astmos išsivystymo bei įsijautrinimo kitais oro alergenais [10,193]. Namų dulkių erkės yra vienas svarbiausių namų aplinkos alergenų ir nepri-klausomai nuo kontakto intensyvumo ir trukmės sukelia astmą, teigia mokslininkai [189]. O, būdamos nuolatiniai aplinkos alergenai, lemia sun-kesnę ligos eigą, prastesnę sergančių alergine astma plaučių funkciją. Namų dulkių erkių paplitimas bei įsijautrinimas jų alergenais yra vienas didžiausių iš gana plataus spektro namų aplinkos alergenų, tiesa, įvairiuose pasaulio regionuose, priklausomai nuo klimato sąlygų, jis gerokai svyruoja. Jung-tinėse Amerikos Valstijoje įsijautrinimas namų dulkių erkėmis nustatomas 20,3 proc. populiacijos [157].

3.2.1. Dermatophagoides pteronyssinus alergeno vaidmuo astmos išsivystymui Įsijautrinimas viena iš namų dulkių erkių, priklausiančia Pyroglyphidae

nariuotakojų voragyvių šeimai ir Dermatophagoides pteronyssinus genčiai, visoje Europoje yra vidutiniškai 31,3 proc., o skirtingose šalyse svyruoja: kaimyninėje Lenkijoje – 22,2 proc. Danijoje – 51,5 proc., o Portugalijoje net 68,8 proc. [75]. Svarbu pabrėžti, kad įsijautrinimas D. pteronyssinus aler-

12

genu dažniausiai susijęs su klinikiniais alerginių ligų simptomais: ≥ 70 proc. teigia Austrijos tyrėjai, ≥ 50 proc. Italijos, Vokietijos, Suomijos, Olandijos [34].

D. pteronyssinus sudarytas iš daugelio įvairios struktūros ir skirtingų savybių alergenų. Der p 1 (25 kDa) ir Der p 2 (14 kDa) yra imunodominuo-jantys alergenai, sukeliantys specifinių IgE klasės antikūnų gamybą ir Th2 limfocitų atsaką daugiau nei 80 proc. D. pteronyssinus įsijautrinusių asmenų [69]. Kiti D. pteronyssinus alergenai (jų yra išskiriama 20), tokie kaip 3, 5, 6 ir 8 grupių, pasižymi menkesnėmis antigeninėmis savybėmis ir tik 50 proc. asmenų sukelia specifinių IgE klasės antikūnų gamybą ir nedidelę jų kon-centraciją serume [176]. Didesnės molekulinės masės D. pteronyssinus alergenai, priklausantys 11, 15 ir 18 grupėms, pasižymi didesniu gebėjimu jungtis su specifiniais IgE antikūnais [169], o taip pat poveikiu kitoms plaučių ar imuninės sistemos ląstelėms. D. pteronyssinus alergenų sudėtyje yra medžiagos, nepriklausomai nuo IgE stimuliuojančios uždegimą ir susi-jusios su vėlyvos fazės uždegimo vystymusi [74]. Šios uždegimo fazės ge-nezę gyvūnų modeliuose tyrinėję mokslininkai nustatė, kad D. pterony-ssinus alergenų sudėtyje esančios serino ir cysteino proteazės tiesiogiai pažeidžia barjerinę kvėpavimo takų funkciją bei veikia bronchų epitelio ląstelių funkcijas [187]. Iš aplinkos patekusios proteazės skatina chemokinų išsiskyrimą, bazofilų aktyvaciją, užkrūčio stromos limfopoetino sekreciją, transmembraninių atpažinimo receptorių, TLR4 (angl. Toll-like receptor) aktyvaciją struktūrinėse plaučių ląstelėse ir Th2 limfocitų imuninį atsaką [70,190]. Chitinas, kita D. pteronyssinus sudėtyje esanti medžiaga, aktyvuo-ja makrofagus, sukelia leukotrienų (LTB4) išsiskyrimą, sutelkia neutrofilus uždegimo židinyje bei padidina jų aktyvumą. Todėl vien tik Der p1 ar Der p2 alergenai, lyginant su visu pilnu D. pteronyssinus alergenu, sukelia ne tokį intensyvų lėtosios uždegimo fazės atsaką sergantiesiems alergine astma asmenims [183].

3.2.2. Alerginis rinitas Alerginis rinitas – dažniausia alerginė kvėpavimo liga. Jos raidą lemia

genetiniai, imunologiniai bei aplinkos veiksniai. Svarbiausiu laikomas aler-geno sukeltas Th2 limfocitų tarpininkaujamas uždegimas [155]. PSO inicia-tyva suformuoto dokumento „Alerginis rinitas ir jo įtaka astmai“ (angl. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma, ARIA) duomenimis, apie 50 proc. suaugusių planetos gyventojų serga alerginiu rinitu, o tai yra 500 milijonų asmenų [26]. Stebimas spartus sergamumo alerginiu rinitu didė-jimas. Įrodyta, kad alerginis rinitas yra astmos rizikos veiksnys [68]. Jis

13

diagnozuojamas daugiau nei 80 proc. astma sergančių asmenų [109, 163, 178] ir dažnai yra susijęs su sunkesne alerginės ligos eiga [114].

Ne vienerius metus mokslininkai bando surasti alerginį rinitą ir astmą vienijančius ir skiriančius požymius. Teiginys „vieni kvėpavimo takai – viena liga“ sulaukia daugiau pritarimo nei abejonių [96]. Alerginis uždegi-mas gali būti nustatomas ir viršutiniuose, ir apatiniuose kvėpavimo takuose net ir nesant atitinkamų ligų klinikinių simptomų. Segmentinė bronchų provokacija alergenu išprovokuoja viršutinių ir apatinių kvėpavimo ligų simptomus, nosies ir bronchų infiltraciją uždegimo ląstelėmis praėjus 24–48 val. po provokacijos [31]. Sergantiems alergine astma asmenims nosies gleivinės biopsijos metu nustatomas eozinofilinis uždegimas net ir nesant alerginio rinito simptomų. Sergantiems alergine astma asmenims nosies gleivinės biopsijoje nustatomas eozinofilinis uždegimas be alerginio rinito simptomų [59]. Ir atvirkščiai, alerginiu rinitu sergantiems asmenims nosies provokacija padidina bronchų reaktyvumą metacholinui [23], viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų eozinofiliją [32] bei uždegimo ląstelių ir citokinų koncentracijų pokyčius serume [199]. Įdomu ir tai, kad nosies provokacija namų dulkių erkės Blomia tropicalis alergenu sukėlė nosies simptomus bei išprovokavo vėlyvą bronchų obstrukciją sergantiems astma. Yra keletas šį ryšį aiškinančių teorijų. Įtikimiausia teigia, kad vietinis kvėpavimo takų uždegimas yra lydimas sisteminio atsako, kuris aktyvuoja kaulų čiulpuose kamienines ląsteles, jų aktyvumą, brendimą, migraciją į uždegimo židinį [46].

3.3. Astmos fenotipai

Astma – sudėtinga ir įvairialypė liga. Literatūroje galima aptikti ją vadinant net ne viena liga, bet ligų grupe su įvairiais atskirais sindromais.

Kalbant apie astmą, dažniausia minima alergeno sukelta, būdingais dusulio, sunkumo krūtinėje, švokštimo ar kosulio epizodais pasireiškianti liga. Esminis jos požymis – kvėpavimo takų uždegimas ir padidintas kvėpavimo takų jautrumas, ilgainiui pažeidžiantys plaučių funkciją. Ilgą laiką vyravo teorija, kad astma yra atopinė liga, kurios metu alergenui pa-tekus į kvėpavimo takus aktyvuojami Th2 limfocitai, skatinamas citokinų išskyrimas (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13) ir eozinofilinis kvėpavimo takų užde-gimas, stimuliuojami B limfocitai, gaminami IgE klasės antikūnai, kurie, prisijungę prie putliųjų ląstelių, stimuliuoja mediatorių išskyrimą ar gamybą ir sukelia nuolatinį kvėpavimo takų uždegimą [13,41,91]. Ir iš tiesų, alerginė astma yra vienas dažniausių astmos variantų [116]. Pradėjus plačiai vartoti įkvėpiamus vaistus, gliukokortikoidus ir bronchus plečiančius, kurie veikia

14

visus išvardintus astmos vystymosi mechanizmus, buvo galima tikėtis visiš-kai kontroliuoti astmą. Tačiau klinikinė praktika rodo, kad vieniems pacien-tams liga valdoma vartojant nedideles vaistų dozes, kitiems, nepaisant inten-syvaus gydymo ir didelių vaistų dozių, astmos kontrolės pasiekti nepa-vyksta. Be to, ir gydytojams, ir pacientams nerimą kelia sunki, dažnai paūmėjanti ar nuolatine bronchų obstrukcija pasižyminti astma. Šie ligos variantai ne tik pablogina sergančių gyvenimo kokybę, bet ir gali tapti sveikatos praradimo ar net mirties priežastimi. Pasigirsta vis nauji argu-mentai, dėl ko reikalinga suskirstyti ir apibūdinti įvairius astmos variantus, kitaip dar vadinamus fenotipais. Astmos fenotipų išskyrimas leistų geriau suprasti ligos vystymosi mechanizmus, atskleistų galimybę susieti genotipą ir patofiziologinius ligos ypatumus. O tai svarbu parenkant individualų sergančių astma gydymą, tinkamą, efektyvų ir saugų [195]. Astmos fenotipo sąvoka iki šiol neapibrėžta. Visuotinės astmos iniciatyvos (angl. Global Initiative for Asthma, GINA) rekomendacijose astma apibūdinama kaip turinti klinikinių skirtumų, bet patomorfologiškai panaši liga, todėl astmos fenotipų išskyrimas klasifikuojant ligą netikslingas, o gydymas vaistais parenkamas pagal paciento jaučiamus simptomus ar plaučių funkcijos rodiklius [58]. Nuolat vykdomi eksperimentiniai tyrimai atskleidžia vis naujus faktus apie astmos formų skirtumus, nulemiančius ligos kliniką ir atsaką į skiriamą gydymą. Mokslinėje literatūroje dažnai išskiriami astmos fenotipai, norint pabrėžti ir išryškinti tam tikrus svarbius ligos vystymosi mechanizmus. Kita vertus, pastaruoju metu daugėja duomenų, įrodančių, kad skirtingos, o kai kada ir tos pačios klinikinės eigos astma gali būti pro-vokuojama skirtingų veiksnių ir nulemta skirtingų patofiziologinių pokyčių.

Išskiriami klinikiniai astmos fenotipai, kuriems priklauso įvairios eigos ir sunkumo liga, dažnai paūmėjanti, su nuolatine bronchų obstrukcija, pri-klausoma nuo atsako į gydymą, vaikų ir suaugusiųjų amžiuje atsiradusi astma. Pagal provokuojantį veiksnį išskiriama fizinio krūvio sukelta ir aspi-rininė astma. Labiausiai paplitęs skirstymas į uždegiminius astmos feno-tipus, kuomet kvėpavimo takuose randamas eozinofilinis ar neutrofilinis uždegimas. Reikia pasakyti, kad šis fenotipų skirstymas dažnai esti nepa-kankamas, nes yra stebimi tarpusavyje persipynę alerginės ir nealerginės astmos klinikiniai, eozinofilinės ir neutrofilinės astmos uždegiminiai fenotipai. Segančiųjų alergine astma bronchų gleivinėje aptinkamas padi-dėjęs eozinofilų bei Th2 limfocitų pagalbininkų kiekis, o neutrofilai ir limfocitai vyrauja sergant nealergine astma [13,100].

Iki šiol manoma, kad eozinofilinis kvėpavimo takų uždegimas yra esminis astmos vystymosi procese, sąlygojantis struktūrinius ir funkcinius astmai būdingus kvėpavimo takų pokyčius [91]. Eozinofilija ir padidėjęs

15

eozinofilų degranuliacijos produktų kiekis indukuotuose skrepliuose, bron-chų išplovose, kvėpavimo takų biopsijos mėginiuose nustatomas daugumai astma sergančių asmenų [24,47]. Eozinofilinis uždegimas nustatomas ser-gant įvairaus sunkumo astma ir esant astmos paūmėjimui, pagerėja gydant ją įkvėpiamais gliukokortikoidais [90,149]. Kita vertus, eozinofilinio kvėpa-vimo takų uždegimo sumažinimas ne visuomet susijęs su bronchų reakty-vumo ar klinikinių požymių sumažėjimu [93]. Tyrimai rodo, kad tik daliai sergančių astma asmenų nustatomas eozinofilinis kvėpavimo takų užde-gimas [49,165].

Įrodyta, kad egzistuoja ir neeozinofilinis astmos uždegiminis fenotipas. Jis dažniausiai susijęs su padidėjusiu neutrofilų skaičiumi kvėpavimo ta-kuose ir pasižymi skirtingu nei eozinofilinės astmos atvejo kvėpavimo takų histopatologiniu vaizdu ir struktūriniais pokyčiais, kvėpavimo takų disfunk-cijos mechanizmais, ligą sukeliančiais ir provokuojančiais veiksniais, atsaku į gydymą ir, galimai, prognoze. Neutrofilinis uždegimas kvėpavimo takuose sergant astma susijęs su įgimto imuniteto atsako vyravimu [65,165]. Provo-kuojantys bakteriniai ir virusiniai agentai, kaip ir aplinkos tarša ir rūkymas, yra svarbiausi šios rūšies uždegimo iniciatoriai. Pastarųjų metų eksperimen-tiniai alerginės astmos tyrimai parodė, kad neutrofilų veikla gali būti susijusi ir su specifiniu imuniniu atsaku [76].

Kai kurie tyrėjai, norėdami ištirti ir geriau suprasti alergeno sukelto imuninio atsako ypatumus, išskiria nuo reakcijos į alergeną priklausomą alerginės astmos fenotipus: Sergantys astma, kuriems bronchų provokacija alergenu sukelia ankstyvą, bei Sergantys astma, kuriems bronchų provokacija alergenu sukelia ankstyvą ir vėlyvą bronchų obstrukciją. Toks ligos suskirstymas padėjo atskleisti, kad Sergantys alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, išsivysčiusia po alergeno stimulia-cijos, pasižymi didesniu Th1 ir Th2 limfocitų chemokinų kiekiu, kuris sąly-goja intensyvesnį ir ilgalaikį kvėpavimo takų uždegimą bei bronchų obst-rukciją [112,130].

Visi šie duomenys patvirtina hipotezę, kad astma yra heterogeninė liga, turinti skirtingus patofiziologinius ir patomorfologinius fenotipus, lemian-čius ligos klinikinius skirtumus, o jų savalaikis identifikavimas svarbus parenkant gydymą, planuojant profilaktiką ar numatant prognozę.

16

3.4. Astmos imunologija

3.4.1. Nespecifinio imuniteto komponentai Kvėpavimo takus dengia daugiasluoksnis stulpinis epitelis, darniai

reguliuojamas organizmo apsaugos barjeras, nepralaidus daugeliui iš aplin-kos patenkančių agentų. Glaudžiosios tarpląstelinės jungtys, transmembra-niniai adhezijos baltymai tampriai sujungia greta esančias epitelio ląsteles ir palaiko struktūrinį kvėpavimo takų gleivinės vientisumą. Sergantiems astma apsauginė kvėpavimo takų epitelio funkcija sutrinka, o pralaidumas antige-nams – padidėja. Tokį epitelio struktūros pakitimą sergant astma gali nulem-ti ir genetiniai, ir aplinkos veiksniai. Pavyzdžiui, odos ir gleivinių struktū-rinio baltymo filagrino geno mutacijos ir šio baltymo pakitimai sumažina odos barjerinę funkciją ir sukelia odos ichtiozę bei padidina atopinio dermatito išsivystymo riziką [194]. Apie 50 proc. atopiniu dermatitu sergan-čių asmenų gali turėti filagrino geno mutacijas, tokie asmenys dažnai serga ir astma [88]. Su genetiniais pokyčiais siejama ir sutrikusi citokinų – inter-ferono (IFN-β, IFN-λ) gamyba, sumažėjęs fermentų – superoksido dismuta-zės ir glutationo peroksidazės kiekis epitelyje [42]. Kvėpavimo takų epitelio ląstelės skatina dendritinių ląstelių susikaupimą kvėpavimo takuose, sergant astma nustatomas didesnis jų kiekis [148]. Nespecifinio imuniteto grandies pažeidimas sudaro palankias sąlygas įkvėptiems alergenams, virusams ar cheminėms medžiagoms lengvai prasiskverbti į gilesnius kvėpavimo organų audinius ir sukelti imuninį atsaką.

Užkrūčio stromos limfopoetinas (angl. thymic stromal lymphopoietin, TSLP) yra citokinas, kurį išskiria žmogaus kvėpavimo takų epitelio ląstelės, sąveikaudamos su kai kuriais mikrobų produktais (peptidoglikanais, lipotei-choinės rūgšties dariniais ir dvigrande viruso ribonukleino rūgštimi (RNR)), fiziniais stimulais, uždegimo citokinais (IL-1β, tumoro nekrozės veiksniu (TNF)). Padidintas TSLP kiekis nustatomas ir sergančių astma kvėpavimo takuose, o TSLP informacinės ribonukleino rūgšties (iRNR) raiška koreliuo-ja su ligos sunkumu [89]. Be to, TSLP sukelia padidintą bronchų reaktyvu-mą, stimuliuodamas nespecifinį įgimto imuniteto atsaką, sužadindamas putliąsias ląsteles [9]. TSLP svarbus ir specifinio imuninio atsako iniciacijai [63,167]. Jis yra vienas iš pagrindinių dendritinių ląstelių, kurios kvėpavimo takuose atlieka antigeną pateikiančios ląstelės (angl. antigen-presenting cells, APC) funkciją, aktyvintojų. TSLP didina TLR raišką. TSLP sti-muliuoja kvėpavimo takų dendritines ląsteles pateikti perdirbtus alergenus, kartu su II klasės pagrindiniu audinių suderinamumo kompleksu (angl. major histocompatibility complex, MHC), T limfocitams. Apskritai nėra aišku, kokiu būdu TSLP ir dendritinės ląstelės gali nukreipti T limfocitų

17

diferenciaciją – patologiniu ar reguliaciniu keliu. Tačiau jau dabar galima sakyti, kad jis veikia daugelį astmos patogenezės grandžių ir nėra susijęs tik su alerginiu, veikiau – su nealerginiu (nesusijusiu su Th2 limfocitų imuniniu atsaku) uždegimu [173].

TSLP paskatina dendritines ląsteles pradėti T limfocitų (Th1, Th2, Th17 ar T reguliacinių limfocitų (Treg)) imuninį atsaką bei lėtinio uždegimo kaskadą. Savo ruožtu, dendritinės ląstelės, reaguodamos į aplinkos poky-čius, gali tiesiogiai reguliuoti skirtingą T limfocitų diferenciaciją: išskirda-mos IL-6 kartu su transformuojančiu augimo veiksniu beta (angl. trans-forming growth factor-β, TGF-β) ar IL-23 veikia Th2 ; išskirdamos TGF-β ar IL-10 reguliuoja Treg; išskirdamos IL-12 reguliuoja Th1; IL-1, IL-6 ar IL-23 reguliuoja Th17 limfocitus.

3.4.2. Specifinio imuniteto patofiziologiniai mechanizmai Specifinio imuninio atsako sergant alergine astma pagrindas – padidinto

jautrumo imuninė reakcija. Šių imuninių reakcijų klasifikacija pagrįsta imuninio atsako tipu, taip pat efektorinių mechanizmų, atsakingų už ląstelių ir audinių pažeidimus, ypatumais. 1963 m. britų mokslininkai P. G. H. Gell ir R. R. A. Coombs, atsižvelgdami į efektorinę imuninio atsako fazę, išskyrė I–IV tokių reakcijų variantus [2]. Ši klasifikacija su nedidelėmis pataisomis, naudojama ir šiomis dienomis įvairių imuninių ligų, taip pat ir alerginių, mechanizmų paaiškinimui. Imuninės sistemos reakcija kiekviename organizme plėtojasi skirtingai, dažnai jos intensyvumo ir trukmės ne-įmanoma nuspėti, o nerimstanti ir besitęsianti ji įtraukia vis naujas imuninės sistemos dalis, ląsteles, audinius ir organus, todėl dažnai būna lėtinė.

3.4.2.1. Ankstyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas Ankstyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas sergant alergine astma

paprastai atsiranda per keletą minučių alergenui patekus į įsijautrinusio or-ganizmo kvėpavimo takus ir atspindi putliųjų ląstelių ir bazofilų mediatorių sukeltus patofiziologinius pokyčius (3.4.2.1.1 pav.) [121]. Pastarąją dažnai lydi vėlyva uždegimo fazė, kylanti dėl gausybės uždegimo ląstelių (eozi-nofilų, neutrofilų, T limfocitų, makrofagų, plaučių struktūrinių ląstelių) ir jų produktų poveikio [22]. Besitęsiantis lėtinis uždegimas ilgainiui sąlygoja struktūrinius kvėpavimo organų pokyčius: kvėpavimo takų epitelio ir liau-kinio audinio bei lygiųjų raumenų ląstelių išvešėjimą, bazinės membranos sustorėjimą, pogleivio fibrozę. Šis procesas vadinamas remodeliacija [53].

Įsijautrinusių asmenų putliosios ląstelės ir bazofilai savo paviršiuje paprastai jau turi alergenui specifinių IgE klasės antikūnų ir didelio afiniteto receptorių antikūno Fc fragmentui (angl. high-affinity IgE receptors, FcεRI)

18

kompleksą. Pakartotinai patekęs alergenas sujungia ne mažiau kaip dvi tokias IgE molekules. Šis junginys yra ląstelės aktyvinimo signalas – suke-liama putliųjų ląstelių degranuliacija [180]. Dendritinės ląstelės, monocitai, o taip pat ir neutrofilai pasižymi skirtinga FcεRI raiška [66]. Yra duomenų, kad astma sergančių asmenų neutrofilai taip pat gali būti aktyvinami IgE priklausomu keliu, o aktyvinti – sukelti IL-8 gamybą [125], ciklooksige-nazės-2 ekspresiją, prostaglandino E2 (PGE2), tromboksano A2 (TXA2), eozinofilų katijoninio baltymo (angl. eosinophil cationic protein, ECP) [126], išskyrimą. Šie patys mokslininkai nurodo, kad sveikų asmenų neutrofilams tokia FcεRI raiška nebūdinga arba jie nėra jautrūs IgE priklausomam aktyvavimui.

Iš aktyvintų putliųjų ląstelių granulių išsiskiria citokinai (IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-16, naviko nekrozės veiksnys alfa (angl. tumor necrosis factor-α, TNF-α), granuliocitų-monocitų kolonijas stimuliuojantis veiksnys (angl. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), augimo veiksniai (kraujagyslių endotelio augimo veiksnys A (angl. vascular endothelial growth factor A,VEGFA), biogeniniai aminai (hista-minas ir serotoninas), proteoglikanai (heparinas, chondroitinsulfatas), pro-teazės (chimazė, triprazė, karbokslipeptidazė), įvairūs fermentai. Taip pat sintetinami nauji lipidiniai mediatoriai – arachidono rugšties metabolitai (prostaglandinas D2 (PGD2), LTC4, LTD4, LTE4, LTB4 ir iš membranos fofolipidų sintetinamas trombocitus aktyvinantis veiksnys (angl. platelet activating factor, PAF) [28, 72, 185]. Tam tikros anatominės srities putlio-sios ląstelės yra šiek tiek skirtingos, o ir reakcija į stimulus ir mediatorių išskyrimas varijuoja. Aktyvuoti bazofilai taip pat išskiria histaminą, leuko-trienus (LTC4, LTD4, LTE4), citokinus (IL-4, IL-13). Išsiskyrę mediatoriai sergantiems alergine astma sukelia šiuos ūminius patofoziologinius poky-čius: kraujagyslių išsiplėtimą ir jų sienelės laidumo padidėjimą, audinių paburkimą, stimuliuoja jutiminių nervų nociceptorius, sukelia lygiųjų bron-chų raumenų susitraukimą, padidina gleivių sekreciją. Dėl besikeičiančio kvėpavimo takų pralaidumo sutrikimo jaučiami būdingi astmos simptomai: dusulys, kosulys, švokštimas.

19

3.4.2.1.1 pav. Ankstyvosios fazės alergeno sukeltas kvėpavimo takų

uždegimas (pagal Galli S. J, 2008) [61]. FcεRI − didelio afiniteto receptorius antikūno Fc fragmentui; IgE – imunoglobulinas E; IL – interleukinas; LT – leukotrienas; PGD2 – prostaglandinas D2; TNF-α – tumoro nekro-zės veiksnys alfa; VEGFA − kraujagyslių endotelio augimo veiksnys A; PAF – trombocitus aktyvinantis veiksnys; CCL2 – C-C chemokino ligandas 2.

Alergenas ant putliųjų ląstelių, susijungęs su IgE ir FcεRI molekulių kompleksu, aktyvina šias ląsteles, stimuliuoja mediatorių išskyrimą bei naujų mediatorių gamybą. Greitai išskirti putliosiose ląstelėse susikaupę mediatoriai sukelia bronchų pralaidumo sumažėjimą dėl lygiųjų bronchų raumenų susitraukimo ir padidėjusios gleivių sekrecijos bei gleivinės pabur-kimo. Putliųjų ląstelių išskirti mediatoriai ne tik padidina kraujagyslių sie-nelės pralaidumą, bet ir skatina uždegimo ląstelių priplūdimą į uždegimo ži-dinį – kvėpavimo takus. Tai vyksta dėl TNF-α poveikio kraujagyslės endotelio adhezijos molekulėms, chemoatraktantų LTB4 ir PGD2, chemo-kinų IL-8 ir C-C chemokino ligando 2 (CCL2). Visa tai yra vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimo pradžia.

20

3.4.2.2. Vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas Vėlyvos fazės uždegimo kvėpavimo takuose požymiai paprastai atsi-

randa praėjus 2–6 val. po alergeno patekimo ir ankstyvosios fazės uždegimo (3.4.2.2.1 pav.) [62]. Nėra aišku, kodėl ji išsivysto ne visiems asmenims, sergantiems astma, o ir aiškios ribos tarp ankstyvos fazės uždegimo pabaigos ir vėlyvos pradžios nėra. Manoma, kad leukocitų susitelkimą uždegimo židinyje skatina putliųjų ląstelių mediatoriai, o kiek vėliau – ir aktyvuotų Th2 limfocitų citokinai (IL-5 ir GM-CSF) [19]. Putliųjų ląstelių mediatoriai, naujai gaminami ląstelėse, išsiskiria įvairiu metu, o jų poveikis skirtingas: TNF-α, LTB4, IL-8, CCL2 gali tiesiogiai ir netiesiogiai skatinti uždegimo ląstelių migraciją į uždegimo židinį; TNF-α ir IL-5 aktyvuoja nespecifinio imuninio atsako ląsteles; IL-10, TNF-α, TGF-β, histaminas stimuliuoja dendritines ląsteles, T ir B limfocitus [60,67]. Kai kurie iš putliųjų ląstelių mediatorių reguliuoja ir kvėpavimo organų struktūrinių ląstelių-epitelinių, endotelio, fibroblastų, lygiųjų raumenų ir nervinių ląste-lių veiklą. Astmos patofiziologiniai simptomai – vėlyva bronchų obstruk-cija – atsiranda dėl struktūrinių kvėpavimo organų ląstelių ir periferinio kraujo leukocitų, priplūstančių į kvėpavimo takuose esantį alerginio uždegi-mo židinį, veikimo [79]. Epitelio ląstelių ir T limfocitų gaminamas ir išski-riamas su kalcitonino genu susijęs peptidas (angl. calcitonin-gene-related peptide, CGRP) yra svarbus kraujagyslių išsiplėtimą vėlyvos fazės užde-gimo metu skatinantis veiksnys [92].

Vėlyvos fazės uždegimo svarbiausi veikėjai – eozinofilai, T limfocitai pagalbininkai, neutrofilai, makrofagai – ne tik susikaupia uždegimo židi-nyje, bet aktyvuoti išskiria žalojančius kvėpavimo takų audinius mediato-rius, sukelia lėtinį uždegimą [145]. Mokslininkai sutaria, kad vėlyvos fazės uždegimas geriausiai atspindi astmos patogenezės esmę, o jo tyrimai – svarbiausi aiškinant astmos išsivystymą.

21

3.4.2.2.1 pav. Vėlyvos fazės alergeno sukeltas kvėpavimo takų uždegimas

(pagal Galli S. J, 2008) [61]. IL – interleukinas; TNF-α – tumoro nekrozės veiksnys alfa; LT-leukotreinas; GM-CSF – granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis veiksny; Th – T limfocitas pagalbininkas; MMP – matrikso metaloproteinazė.

Vėlyva fazė atsiranda praėjus 2–6 valandoms po alergeno stimuliacijos ir ankstyvos fazės uždegimo. Tai įgimto ir specifinio imuninio atsako ląste-lių, esančių kvėpavimo organuose ar priplūstančių iš sisteminės kraujotakos, taip pat ir jų išskiriamų mediatorių veiklos rezultatas. Čia veikia įgimto imuniteto veiksniai – neutrofilai, eozinofilai, bazofilai. O alergeno, IgE anti-kūnų ir FcRI susijungimas putliųjų ląstelių paviršiuje ir jų aktyvavimas, taip pat T limfocitų sugebėjimas atpažinti alergeną yra svarbiausia specifinio imuninio atsako grandis astmos patogenezėje. Aktyvuoti T limfocitai pagal-bininkai diferencijuojasi į įvairias subpopuliacijas, besiskiriančias savo funkcijomis, įtaka uždegimui ir astmos raidai. Th17 limfocitai susiję su neu-trofilų, o Th2 limfocitai – su eozinofilų veiklos skatinimu. Vėlyvos fazės uždegimo metu neutrofilų elastazė aktyvuoja matrikso metaloproteinazę (MMP) ir III tipo kolageno degradaciją ir sukelia kvėpavimo takų pažei-

22

dimą; eozinofilų pagrindinis baltymas ir kai kurie kiti mediatoriai pažeidžia epitelio ląsteles, sukelia bronchų susiaurėjimą.

3.4.3. T limfocitai – pagrindinės astmos patogenezėje dalyvaujančios ląstelės T limfocitai – pagrindinės specifinio imuninio atsako ląstelės. T limfo-

citų pavadinimas kilęs iš lotyniško užkrūčio liaukos pavadinimo thymus, kurioje ir vyksta šių ląstelių brendimas. Ląstelės laisvai cirkuliuoja kraujyje, telkiasi limfiniuose organuose, visuose audiniuose ir organuose. T limfocitai gali specifiškai atpažinti į organizmą iš aplinkos patekusį antigeną. Jie nu-lemia imuninio atsako įvairovę, specifiškumą, imuninę atmintį. T limfocitų paviršiuje esantys receptoriai (angl. T cell receptors, TCR) išskiria šias ląs-teles iš kitų limfocitų. Jie reikalingi T limfocitui atpažįstant antigenus, aso-cijuotus su pagrindiniu audinių suderinamumo komplekso (angl. major histocompatibility complex, MHC) I ir II klasės molekulėmis. Be to, T limfocitų paviršiuje yra baltymai, vadinami CD molekulėmis arba diferen-ciacijos grupių molekulės (angl. cluster of differentiation, CD), kurios rodo ląstelių diferenciacijos laipsnį, aktyvumą, funkcinę paskirtį. Jie yra ir atskirų ląstelių grupių – populiacijų žymenys (T limfocitų, B limfocitų, NK ląste-lių). Priklausomai nuo to, kokias molekules CD4+ ar CD8+ paviršiuje turi T limfocitai, jie skirstomi į dvi stambias populiacijas: T limfocitai pagalbi-ninkai ir T limfocitai žudikai. CD4+ yra T limfocitų pagalbininkų skiriamoji molekulė. Ne tik T limfocitai, bet ir kitos ląstelės (monocitai, makrofagai) pasižymi šios molekulės raiška savo paviršiuje. CD8+ molekulė yra T lim-focitų žudikų skiriamasis požymis. Svarbiausios šių molekulių funkcijos – signalo perdavimas ir ląstelių sąveika.

T limfocitų veikla reguliuojama daugeliu būdų: signalas perduodamas dalyvaujant visai eilei molekulių, antigeną sujungiančių receptorių, citokinų, kinazių, transkripcijos veiksnių. Antigenui patekus į organizmą, jį atpažįsta įgimto imuniteto ląstelės (dendritinės ląstelės kvėpavimo takuose) ir, pagal antigeno tipą, MHC I ar II klasės molekulių pagalba pateikiami naiviesiems CD4+ T limfocitams. Taip sukeliamas specifinis imuninis atsakas. Paska-tinti naivieji CD4+T limfocitai diferencijuojasi į skirtingas efektorinių T limfocitų subpopuliacijas: CD4+INF-γ (pirmo tipo T limfocitus pagalbinin-kus, Th1), CD4+IL-4+ (antro tipo T limfocitus pagalbininkus, Th2), CD4+IL-9+ (devinto tipo T limfocitus pagalbininkus, Th9), CD4+IL-17+ (septyniolikto tipo T limfocitus pagalbininkus, Th9), CD4+CD25+ (T regu-liacinius limfocitus, Treg) [166,201,202].

CD4+ T limfocitai (T limfocitai pagalbininkai) – pagrindinės imuninės sistemos ląstelės. Jie skatina B limfocitus gaminti antikūnus, reguliuoja

23

CD8+ T limfocitų (T limfocitų žudikų) bei makrofagų funkcijas, suderina imuninės sistemos įvairių komponentų veiksmus, nukreiptus į svetimų or-ganizmui agentų sunaikinimą, reguliuoja/slopina imuninį atsaką, kontro-liuoja autoimunitetą, reguliuoja imuninio atsako stiprumą. Pagrindinė CD8+ T limfocitų funkcija yra sunaikinti virusų infekuotas piktybines bei pažeistas ląsteles. Paskatinti CD8+ T limfocitai gali diferencijuotis į skirtingas subpo-puliacijas, kaip antai CD8+IFN-γ, CD8+IL-4. Dar viena svarbi T limfocitų subpopuliacija yra CD4+CD25+T limfocitai arba reguliaciniai T limfocitai. Ši specializuota T limfocitų subpopuliacija slopina imunines reakcijas, pa-laiko imuninės sistemos homeostazę ir toleranciją saviems antigenams. Šių ląstelių išskiriami citokinai (IL-10 ir TGF-β) pasižymi uždegimą slopinan-čiu poveikiu [110]. Pastebėta, kad Treg limfocitai, slopindami signalo perdavėją ir transkripcijos veiksnį 3 (angl. signal transducer and activator of transcription 3, STAT3), kuris reikalingas Th17 limfocitų aktyvavimui, sukelia nekontroliuojamą, nuo šių ląstelių veikimo priklausomą lėtinį uždegimą [36].

3.4.3.1. 17-o tipo T limfocitai pagalbininkai Atsakydama į įvairius dirgiklius, imuninė sistema gamina mediatorius,

stimuliuojančius naiviuosius T limfocitus ir, TCR bei kostimuliuojančių mo-lekulių pagalba, sukelia skirtingų T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijų susidarymą. IFN-γ ir IL-2 sukelia Th1 limfocitų subpopuliacijos gausėjimą bei aktyvuoja juos kovojant su viduląsteliniais mikroorganizmais. IL-2 skatina ir Th2 limfocitų subpopuliacijos susidarymą. Pastaroji susijusi su B limfocitų aktyvinimu ir antikūnų gamyba. Šios subpopuliacijos ląstelės svarbios gynybai nuo įvairių mikroorganizmų, parazitų, alergenų. Be to, efektoriniai citokinai, kuriuos išskiria aktyvuoti T limfocitai, grįžtamuoju ryšiu gali stiprinti jų pačių diferenciaciją. Pastebėtas tam tikras antagoniz-mas tarp šių dviejų skirtingų T limfocitų subpopuliacijų. Beveik ketvirtį amžiaus gyvavo darnaus Th1 ir Th2 limfocitų santykio teorija, pagal kurią autoimuninės ar alerginės ligos priklauso tik nuo šių subpopuliacijų santykio [129]. Viskas pasikeitė nustačius naują T limfocitų populiaciją – CD4+ T limfocitus, išskiriančius IL-17.

Th17 yra skirtinga efektorinių T limfocitų subpopuliacija. Pirmoji ir reikšmingiausia jų funkcija – kova su ekstraląsteliniais patogenais, nuo kurių neapsaugo Th1 ir Th2 limfocitų imuninis atsakas. Pastebėta jų reikšmė lėtinio uždegimo raidai. O nauji moksliniai tyrimai su gyvūnais atranda vis naujus Th17 limfocitų ir jų išskiriamų citokinų poveikius, svarbius alerginės astmos vystymuisi. Tai suburia mokslininkus detalesniems Th17 limfocitų subpopuliacijos tyrinėjimams.

24

Pirmieji moksliniai tyrimai, nustatę IL-17 gaminančias ląsteles gyvūnų ir žmogaus organizmuose, buvo atlikti paskutiniuoju praeito šimtmečio dešimtmečiu. 2000 m. mokslininkai aprašė skirtingą nei Th1 ir Th2 lim-focitų subpopuliaciją, kuri, paskatinta mikrobinės kilmės veiksniais, gamina ir išskiria IL-17 [82]. Literatūroje aprašomos tyrimuose su gyvūnais nusta-tytos IL-17 gaminančios ląstelės, reikšmingesnės nei Th1 limfocitai artrito bei encefalomielito vystymuisi [104,131]. Šie atradimai buvo ženklas apie IL-17 bei jį gaminančių ląstelių reikšmę lėtinio uždegimo raidai, paskatinęs naujus mokslinius tyrinėjimus. Th17 limfocitų vystymasis skiriasi nuo kitų T limfocitų subpopuliacijų. Nustatytas aktyvuotų dendritinių ląstelių gami-namas IL-23 [138], skatinantis vystytis Th17 limfocitų subpopuliaciją ir išskirti IL-17 [5]. Skirtingai nei Th1 ir Th2 limfocitų vystymuisi, jiems ne-reikalingi transkripcijos veiksniai, tokie kaip signalo perdavėjai ir transk-ripcijos aktyvatoriai STAT1, STAT4 ir STAT6 bei transkripcijos veiksnys T-bet (angl. T-box transcription factor) [71]. Svarbiausiais Th17 limfocitų transkripcijos veiksnys yra RORγt (angl. retinoic acid receptor-related orphan receptor-γt) [84]. Vėliau atliktais tyrimais nustatyta, kad ne vien tik IL-23, o veikiau kiti citokinai reikalingi IL-17 gaminančių ląstelių diferenciacijai. Pelių eksperimentinės astmos modeliuose tai IL-6 kartu su transformuojančiu augimo veiksniu TGF-β (angl. transforming growth factor-β, TGF-β) [21]. Paskatinus T limfocitus IL-6 kartu su TGF-β bei IL-23, sulaukiama intensyvaus IL-17 gaminančių ląstelių atsako, o kitas interleukinas (IL-10), kuris pasižymi priešuždegiminiu veikimu, iš viso negaminamas [117]. Be to, nesant IL-6, autokrininis Th17 limfocitų IL-21 gali skatinti šių ląstelių vystymąsi [135]. Kitų autorių darbai rodo, kad yra mediatorių, tokių kaip IL-27, kurie, veikdami naiviuosius T limfocitus, skatina Th1 T limfocitų atsako formavimąsi bei slopina Th17 limfocitų vystymąsi [17]. IL-35, kurį išskiria CD4+CD25+Foxp3+T limfocitai, slopi-na Th17 T limfocitų imuninį atsaką pelių eksperimentinio kolagenu indu-kuoto artrito modelyje [134]. Reikia priminti, kad žmogaus organizme IL-1β su IL-23 ar IL-1β su IL-6, bet ne kiekvienas atskirai ir ne TGF-β, sukelia Th17 limfocitų subpopuliacijos gausėjimą ir brendimą.

3.4.3.2. Interleukinas-17 Interleukinas-17 yra 20–30 kDa baltymas, gaminamas CD4+T limfo-

citų. Nustatyta, kad IL-17 gali gaminti ir išskirti kitos, taip pat ir bronchų epitelio ląstelės ir fibroblastai. Šį citokiną mokslininkai nustatė dar 1995 m. Jie pastebėjo, kad IL-17A baltymo amino rūgščių seka 57 proc. sutampa su T ląstelių tropizmu pasižyminčio viruso, Herpes Saimiri, geno 13 (HVS13) kodu, nors šio panašumo biologinė reikšmė ir nėra aiški [86]. Išskiriama ke-

25

letas šių citokinų: IL-17 (dar vadinamas IL-17A), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (taip pat žinomas kaip IL-25) ir IL-17F. IL-17, kaip ir jo receptoriai (IL-17RA, RB, RC, RD, RE), yra vieninteliai tokios rūšies, nepanašūs į kitus. Šis interleukinas veikia daugelyje organizmo vietų, o jo biologinis veikimas – įvairialypis. IL-17 yra potencialus audinių destrukcijos ir lėtinio uždegimo sukėlėjas [141]. Literatūros duomenys rodo, kad IL-17, veik-damas tiesiogiai ir netiesiogiai, stimuliuoja neutrofilų brendimą, migraciją ir funkciją [33,76,162]. Jis aktyvuoja kvėpavimo takų struktūrines ląsteles – epitelines, lygiųjų raumenų, fibroblastus. Iš bronchų epitelio ląstelių daugiau išsiskiria β-defensino, tarpląstelinių adhezijos molekulių (angl. intracellular adhesion molecule, ICAM) ICAM-1, IL-8, chemokino ligando, CXCL1, CCL20, G-CSF, daugiau epitelio mucinų (MUC5AC ir MUC5B). IL-17 taip pat skatina IL-6 ir IL-8 išskyrimą iš bronchų lygiųjų raumenų ląstelių [77,85]. Be to, IL-17 stimuliuoja makrofagus išskirti uždegimo mediatorius, IL-1β ir TNF-α, o veikdamas kartu su TNF-α sukelia fibroblastuose IL-6 ir GM-CSF gamybą [57]. Visa tai stimuliuoja granulopoezę kaulų čiulpuose, neutrofilų priplūdimą į uždegimo židinį ir sukelia ženklią kvėpavimo takų neutrofiliją. Be to, tyrėjai nustatė, kad IL-17 veikia ir neutrofilų funkciją juos aktyvindamas [102]. Įvertinus šiuos duomenis, aiškėja teigiamas užde-gimą skatinantis IL-17 poveikis ir jo reikšmė kovojant su infekcija. Kleb-siella pneumoniae sukelto plaučių uždegimo modelyje, pelėms, neturin-čioms IL-17R, nustatyta sutrikusi kvėpavimo takų apsauga nuo infekcijos ir šimtaprocentinis mirštamumas lyginant su kontrole [87]. Tačiau yra ir antroji, kitaip tariant, neigiama šio citokino biologinio veikimo pusė. Įvairių stimulų paskatintos įgimto ir įgyto imuninio atsako ląstelės išskiria IL-17, pastarasis skatina lėtinį neinfekcinį uždegimą ir aktyviai dalyvauja autoimu-ninių, alerginių ligų patogenezėje. Sergant reumatinėmis ligomis IL-17 su-kelia kremzlės destrukciją dėl MMP aktyvumo stimuliacijos ir proteoglika-nų sintezės slopinimo, osteoklastų aktyvinimą ir dėl to atsirandantį kaulinio audinio nykimą. Tai patvirtina eksperimentiniai kolagenu indukuoto artrito tyrimai bei klinikiniai tyrimai sergantiesiems reumatoidiniu artritu [4,184,203]. Uždegiminių žarnyno ligų metu IL-17 stimuliuoja MMP, IL-6, IL-8 gamybą žarnyno pogleivio miofibroblastuose. Sergantiesiems Krono liga ar opiniu kolitu IL-17 stimuliuoja neutrofilų judėjimą ir žarnos sienelės uždegimą [97]. Keletas tyrimų, atliktų sergantiesiems psoriaze, atopiniu dermatitu, pemfigoidu atskleidė, kad IL-17 reguliuoja GM-CSF, IL-6, redu-kuoto grafeno oksidas gamybą keratinocituose, tokiu būdu sukeldamas specifinius lėtinių odos uždegiminių ligų klinikinius požymius [98,177]. Centrinėje nervų sistemoje IL-17 sutrikdo hematoencefalinį barjerą, gerin-damas sąlygas CD4+T limfocitų migracijai bei jų patologiniam veikimui

26

sergant išsėtine skleroze. Visi šie radiniai leidžia pamatyti daugialypį IL-17 veikimą autoimuninių ir uždegiminių ligų patogenezėje. Pastarųjų metų mokslinėje literatūroje išskirtinis dėmesys skiriamas IL-17 bei jo įtakai neutrofiliniam kvėpavimo takų uždegimui sergant astma [123].

Įsivyravo nuomonė, kad astma yra Th2 limfocitų imuninio atsako su-kelta ir eozinofiliniu uždegimu kvėpavimo takuose pasireiškianti liga. Ser-gantiesiems astma padidėja Th2 limfocitų kiekis bei jų aktyvumas. Šia liga sergančių pacientų bronchoalveolinio lavažo (BAL) skystyje, indukuotuose skrepliuose (IS) ar plaučių audinio biopsijoje nustatomi padidėję šių ląstelių išskiriamų citokinų IL-4, IL-5, IL-13 ir jų iRNR kiekis. Transkripcijos veiksnio GATA-3 raiška Th2 limfocituose sergant astma – didelė. Visa tai patvirtina šios efektorinės T limfocitų subpopuliacijos reikšmę astmos pato-genezėje. Mokslininkai patvirtino, kad T limfocitai pagalbininkai reguliuoja granuliocitų migraciją į kvėpavimo takus sergant obstrukcinėmis plaučių ligomis. Th2 limfocitai ir jų išskiriamas IL-5 yra svarbus eozinofilų migracijos į kvėpavimo takus sergant astma mediatorius [132]. Tyrimuose su gyvūnais įrodyta, kad specifiniai antikūnai prieš T limfocitus pagalbinin-kus, anti-IL-2, sutrikdo alergenų sukeltą eozinofilų ir neutrofilų priplūdimą į kvėpavimo takus alerginės astmos modelyje [152]. T limfocitų pagalbininkų išskirti veiksniai, skatinantys neutrofilų migraciją sergant alergine astma, nėra iki galo ištirti. Toks veiksnys galėtų būti IL-17.

Literatūroje aprašomi moksliniai tyrimai, kurių metu nustatytas padi-dėjęs IL-17 kiekis sergančių astma BAL, IS, serume. Pastebėta, kad padidė-jusi IL-17 koncentracija skrepliuose dažnai yra susijusi su padidintu bron-chų reaktyvumu [15] ar astmos sunkumu [35]. Šie faktai teigia, kad IL-17 ir jį gaminančios ląstelės gali būti vieni iš svarbesniųjų astmos patogenezės dalyvių. Pastebime, kad IL-17 skatinanti uždegimą veikla iš pirmo žvilgsnio visiškai nesusijusi su Th2 limfocitų imuniniu atsaku: IL-8 yra žinomas neutrofilų chemoatraktantas, IL-6 ir GM-CSF svarbūs granuliocitų, ypatin-gai neutrofilų, gamybai. Tyrimuose su gyvūnais nustatyta įkvėpus IL-17 atsirandanti kvėpavimo takų neutrofilija [80], o stimuliavus sergančių astma bronchų epitelio ląsteles, sukeliamas IL-8 ir neutrofilų kiekio kvėpavimo takuose padidėjimas [102]. Remiantis šiais pastebėjimais, astmos patogene-zės aiškinimas įgavo naujų argumentų, o neutrofilinis astmos fenotipas vėl atsirado dėmesio centre.

Eksperimentiniuose tyrimuose su alerginės astmos gyvūnų modeliais aktyviai tiriama IL-17 išskiriančių CD4+ T limfocitų veikla ir reikšmė ligos patogenezei. Viename iš jų aptariami rezultatai, kuomet ovalbumino inhalia-cija juo įsijautrinusioms pelėms, esant eozinofiliniam lėtiniam kvėpavimo takų uždegimui, sukelia žymų IL-17 iRNR pagausėjimą plaučių audinyje,

27

lydimą neutrofilų kiekio padidėjimo [76]. Tame pačiame tyrime pastebėta, kad anti-IL-17 monokloniniai antikūnai (mAk), suleisti pelėms prieš provokaciją ovalbuminu, žymiai sumažina neutrofilų priplūdimą į kvėpavi-mo takus, padidindami IL-5 kiekį kvėpavimo takuose bei eozinofilinį uždegimą. Šis gydymas sumažino kvėpavimo takų neutrofiliją lygiagrečiai su neutrofilų kiekio periferiniame kraujyje ir jų sintezės kaulų čiulpuose sumažėjimu. Kitame tyrime nustatyta, kad IL-17R neturinčioms pelėms ne tik nesukeliamas neutrofilinis kvėpavimo takų uždegimas, bet sumažėja ir eozinofilinis, susijęs su Th2 limfocitų veikimu [159]. Panašius duomenis skelbia kiti tyrėjai, kurie nustatė, kad, nesant IL-17, pelėms po provokacijos alergenu sutrinka Th2 limfocitų atsakas. Taigi IL-17 ir IL-17R nebuvimas sumažina ne tik neutrofilinį, bet ir su Th2 limfocitais susijusį eozinofilinį kvėpavimo takų uždegimą pelių alerginės astmos modeliuose. Yra tyrėjų, kurie nurodo dvigubą ar net priešingą IL-17 veikimą eozinofilinio uždegimo atžvilgiu. Jie nustatė, kad alergeno patekimas įsijautrinusioms pelėms plaučiuose sukelia padidintą IL-23 iRNR raišką, o IL-23 sukelia ir eozino-filų, ir neutrofilų susitelkimą kvėpavimo takuose, skatina Th2 limfocitų citokinų išskyrimą, liaukinio audinio vešėjimą, kvėpavimo takų jautrumo padidėjimą [76,186]. Abiejų, Th2 ir T17 limfocitų, veiklos sąlygotas užde-gimas padidina bronchų jautrumą, tačiau pastebima, kad CD4+IL-17 T limfocitai sąlygoja gydymui įkvepiamaisiais gliukokortikosteroidais atsparų uždegimą. Šis atradimas yra svarbus siekiant išaiškinti gydymui įkvepiamais gliukokortikoidais atsparios astmos fenotipą [118]. Nepaisant neginčytinų ir svarių argumentų, patvirtinančių Th17 limfocitų svarbą astmos vystymuisi, vis dėlto nėra žinoma, kaip ir kodėl Th17 limfocitai dalyvauja alergeno sukeltame su Th2 limfocitais susijusiame imuniniame atsake.

Neutrofiliniai granuliocitai – imuninės sistemos ląstelės, kurių svar-biausia funkcija yra apsaugoti nuo bakterinės ar grybelinės infekcijos. Dau-gelis tyrimų nurodo neutrofilus esant astmos pažeistuose kvėpavimo ta-kuose. Jų randama tiriant astma sergančių pacientų plaučių audinio biopsinę medžiagą, BAL ar IS [124]. Kvėpavimo takų neutrofilija nustatoma sergant sunkios eigos astma, yra susijusi su nuolatiniu kvėpavimo takų siaurėjimu [164]. Kai kurie tyrimai patvirtina, kad neutrofilai yra dominuojančios kvė-pavimo takų uždegimo ląstelės esant sunkios astmos paūmėjimui [140], nu-statomi mirusiųjų nuo astmos asmenų kvėpavimo takuose [171]. Moksli-ninkai atskleidė, kad sergantiesiems alergine astma, kurių kvėpavimo takuose vyrauja neutrofilai, mažiau efektyvus gydymas įkvepiamaisiais gliukokortikoidais [20]. Kita vertus, gyvuoja ir kita nuomonė – sergantie-siems sunkios eigos astma ir gydomiems didelėmis įkvepiamųjų gliukokor-tikoidų dozėmis padidėja neutrofilų kiekis kvėpavimo takuose dėl šių

28

ląstelių natūralios žūties (apoptozės) slopinimo. Tai prailgina neutrofilų gyvavimą ir veiklą sergančių astma kvėpavimo takuose. Aktyvuoti neutro-filai gamina LTA2, LTB2, TXA2, citokinus (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α), augi-mo veiksnį TGF-β, proteazes (elastazę, MMP2 ir MMP9), mieloperoksidazę (MPO), prilipimo molekules, reaktyvias deguonies formas (angl. reactive oxygen species, ROS) ir eozinofilų katijoninį baltymą [126]. Išsiskyrusios į aplinką šios biologiškai aktyvios medžiagos skatina nuolatinį kvėpavimo takų uždegimą, ilgainiui sergantiesiems astma sukeliantį struktūrinius kvė-pavimo takų ir kvėpavimo organų funkcijos pokyčius.

Pastaraisiais metais mokslininkai nustatė, kad ne tik putliosios ląstelės, bazofilai, eozinofilai, trombocitai, monocitai, dendritinės ir Langerhanso ląstelės turi savo paviršiuje FcεRI. Nustatyta, kad atopine astma sergančių asmenų periferinio kraujo neutrofilams būdinga FcεRI raiška ir sugebėjimas sujungti IgE [127]. Priešingai, sveikų žmonių neutrofilai neturi FcεRI arba negali būti aktyvinami su IgE susijusiu mechanizmu. IgE prailgina neutro-filų išlikimą kvėpavimo takuose slopindamas šių ląstelių apoptozę [156], tuo pačių skatindamas IL-8 išsiskyrimą bei neutrofilų pritraukimą į už-degimo židinį. Kai kurie tyrėjai pastebėjo, kad po bronchų provokacijos alergenu, neutrofilai kvėpavimo takuose pastebimi ankščiau nei eozinofilai [113], pastebimas jų veiklos suaktyvėjimas [107]. Šis mechanizmas vis dar nėra ištirtas. Gali būti, kad vienas iš neutrofilų migraciją ir jų aktyvumo padidėjimą sergantiems astma sukeliančių veiksnių yra alergeno įkvėpimo sužadintas IL-17 koncentracijos padidėjimas kvėpavimo takuose.

Apibendrinant šiuos literatūros duomenis galima iškelti hipotezę, kad Th17 limfocitai bei jų išskiriamas neutrofilus veikiantis IL-17 galėtų būti svarbi alerginės astmos patogenezės grandis.

29

4. TYRIMO METODIKA

Perspektyvusis mokslinis tyrimas atliktas 2010–2012 m. Lietuvos svei-katos mokslų universiteto (LSMU) Medicinos akademijos Pulmonologijos ir imunologijos klinikoje, gavus Kauno regioninio Biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (2010 12 06, Nr. P1-48/2004, versija 4, 2010), Valstybinės duomenų apsaugos inspekcijos leidimą atlikti asmens duomenų tvarkymo veiksmus (2014 05 16, Nr. 2R-2556 (2.6-1)). Šis mokslinis tyrimas buvo Lietuvos mokslų tarybos Nacionalinės mokslo programos „Lėtinės neinfekcinės ligos“ finansuojamo projekto „Uždegiminių ląstelių fenotipo ir funkcijų ypatumai alerginių kvėpavimo ligų eigos progno-zavimui“ (LIG-18/2010) dalis. Visi pakviesti į tyrimą asmenys buvo supa-žindinti su mokslinio tyrimo protokolu, o tyrime apsisprendę dalyvauti asmenys savo sutikimą patvirtino raštu informuoto asmens sutikimo for-moje. Vienas sutarties variantas atiduotas tiriamajam.

4.1. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga

4.1.1. Atrankos kriterijai Dalyvauti moksliniame tyrime atrinkti 102 nerūkantys asmenys, kurios

tyrė ir gydė gydytojas alergologas ir klinikinis imunologas 2010–2012 metais LSMUL KK Pulmonologijos ir imunologijos klinikos ambulato-riniame kabinete. Į tyrimą įtraukta 80 asmenų (47 vyrai ir 33 moterys, amžiaus vidurkis 34 ± 3 metai), kurie atitiko visus atrankos kriterijus. Iš jų: 30 sergančių alergine astma; 30 sergančių alerginiu rinitu (palyginamoji grupė); 20 sveikų asmenų (kontrolinė grupė).

Visiems tiriamiesiems taikyti šie bendrieji atrankos kriterijai: Bendrieji įtraukimo kriterijai: 1. Amžius nuo 18 iki 50 metų; 2. Vyrai ir moterys; 3. Informuoti apie mokslinio tyrimo tikslą ir eigą, o sutikimą daly-

vauti jame patvirtinę raštu. Bendrieji neįtraukimo kriterijai: 1. Kitos kvėpavimo ligos (tokios kaip lėtinė obstrukcinė plaučių liga,

plaučių vėžys, sarkoidozė, tuberkuliozė ir kt.); 2. Kvėpavimo organų infekcija per paskutinį mėnesį iki tyrimo

pradžios; 3. Kitos ženklios vidaus organų ligos ir būklės (įskaitant psichikos

sutrikimus) su organų funkcijos nepakankamumu; 30

4. Kontraindikacijos alerginių odos ir (ar) bronchų provokacijos mė-ginių atlikimui;

5. Kontraindikacijos adrenalino naudojimui; 6. Forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę (FEV1) < 70 proc.

normos; 7. Rūkymas; 8. Nėštumas ir žindymas. Sergančių alergine astma įtraukimo kriterijai: 1. Intermituojanti ar persistuojanti lengva/vidutio sunkumo astma,

nustatyta vadovaujantis GINA 2002 m. kriterijais [133]; 2. Astmos simptomų trukmė ≥ 1 metai; 3. Forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę (FEV1) ≥ 70 proc.

normos; 4. Teigiamas bronchų provokacijos mėginys su metacholinu; 5. Teigiamas odos dūrio mėginys su namų dulkių erkės D. pterony-

ssinus alergenu. Sergančių alerginiu rinitu įtraukimo kriterijai: 1. Alerginio rinito diagnozė nustatyta vadovaujantis ARIA 2001 m.

kriterijais [26]; 2. Alerginio rinito simptomų trukmė ≥1 metai; 3. Teigiami odos dūrio mėginiai su namų dulkių erkės D. pterony-

ssinus alergenu. Sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu bendri neįtraukimo kri-

terijai: 1. Klinikiniai sezoninės alergijos simptomai; 2. Kliniškai reikšmingos nuolatinės alergijos simptomai (pvz.,

sukeltos katės, šuns epidermio alergenų); 3. Astmos paūmėjimas per paskutinį mėnesį iki tyrimo pradžios; 4. Gydymas vaistais: vietinio poveikio (tame tarpe ir įkvepiamais) bei

sisteminio poveikio gliukokortikoidais paskutinį mėnesį iki tyrimo pradžios; H1 receptorių blokatoriais, tricikliais antidepresantais, leukotrienų receptorių blokatoriais – paskutinę savaitę iki tyrimo pradžios; ilgai veikiančiais bronchus plečiančiais vaistais – 48 val., o trumpai veikiančiais – 12 valandų iki tyrimo pradžios.

4.1.2. Tyrimo eiga Atvykti į Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Pulmonologijos ir

imunologijos kliniką tiriamieji asmenys buvo kviečiami 3 kartus. Atrankos vizito metu (pirmas vizitas) patikrinti įtraukimo/neįtraukimo kriterijai, atlik-tas fizinis tiriamųjų asmenų ištyrimas, plaučių funkcijos tyrimas, bronchų

31

provokacija su metacholinu ir alerginiai odos dūrio mėginiai. 24 val. iki bronchų provokacijos su D. pteronyssinus (antras vizitas) atlikta spiromet-rija, paimtas periferinis kraujas, indukuoti skrepliai, atliktas citologinis periferinio kraujo ir indukuotų skreplių ląstelių tyrimas, limfocitų imunofe-notipavimas, užšaldyti biologiniai mėginiai citokinų tyrimams. Bronchų provokacija su D. pteronyssinus (trečias vizitas) pradėta 8:00 valandą ryte, po jos kartotinai tirta plaučių funkcija: kas 10 min. pirmąją valandą, vėliau 6 valandas – kas viena valanda. Fizinis ištyrimas, periferinio kraujo paėmimas bei skreplių indukcija kartoti 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus, atlikti periferinio kraujo, indukuotų skreplių citologinis tyrimai, limfocitų imunofenotipavimas, užšaldyti biologiniai mėginiai citokinų tyrimams. Tyrimo eiga pavaizduota 4.1.2.1 pav.

4.1.2.1 pav. Tyrimo eiga

4.2. Tyrimų metodai

4.2.1. Alerginiai odos dūrio mėginiai Visiems tiriamiesiems asmenims buvo atlikti alerginiai odos dūrio mė-

giniai naudojant diagnostinius alergenus: D. pteronyssinus, D. farinae, 12 žolių žiedadulkių, beržinių medžių žiedadulkių, piktžolių, kiečio, mikro-skopinių grybelių (Alternaria, Aspergillus, Cladosporius) bei katės, šuns epitelio ir tarakonų (Stallergenes S.A., Prancūzija). Mėginio teigiamai

32

kontrolei naudotas 10 mg/ml histamino dihidrochlorido tirpalas, neigiamai kontrolei – alergenų diagnostinio tirpalo skiediklis. Visi pacientai iki tyrimo nevartojo vaistų, galinčių įtakoti mėginio rezultatus (nurodyta neįtraukimo kriterijų sąraše). Mėginys atliktas pacientui sėdint, tiriamieji alergenai la-šinti ant vidinio dilbio odos, 3 cm atstumu. Kiekvienam alergenui naudotos atskiros sterilios adatos, kuriomis, duriant stačiai per užlašintus lašus, pažeidžiamas tik epidermis. Odos reakcija vertinta po 15 minučių, liniuote išmatuojant didžiausią ir jam statmeną papulės skersmenį bei apskaičiuojant aritmetinį jų vidurkį – vidutinį papulės dydį (mm). Mėginys vertintas teigiamai, kai vidutinis papulės dydis didesnis nei 3 mm [25].

4.2.2. Plaučių funkcijos tyrimas Visiems tiriamiesiems buvo ištirta plaučių funkcija taikant spirometrijos

metodą. Plaučių funkcija tirta pneumotachometriniu spirometru CustoVitM (Custo Med; Miunchenas, Vokietija). Visi tiriamieji nevartojo trumpai vei-kiančių bronchus plečiančiųjų vaistų 12 val., o ilgai veikiančių bronchus plečiančiųjų vaistų – 48 val. iki tyrimo. Kiekvienas tiriamasis atliko ne mažiau kaip 3 kokybiškus forsuoto iškvėpimo veiksmus, nustatant didžiau-sią forsuoto iškvėpimo tūrį per pirmąją sekundę (FEV1) ir forsuotą gyvybinę plaučių talpą (FVC). Plaučių funkciją atspindintys FVC ir FEV1 rodikliai buvo išreikšti absoliučiais dydžiais (litrais) bei procentais normos, t. y. atitinkamos lyties, amžiaus bei ūgio sveikų žmonių vidurkio pagal standar-tizuotą metodiką [119]. Plaučių funkcija laikyta normalia, jei FEV1 buvo ≥80 proc. normos, o FEV1/FVC ≥88 proc. normos vyrams ir FEV1/FVC ≥89 proc. normos moterims.

4.2.3. Bronchų provokacijos mėginys su metacholinu Bronchų reaktyvumas tirtas atliekant bronchų provokacijos mėginį su

metacholinu, naudojant rezervuarinį metodą (Pari Provocation I; Pari, Vokietija) [18] – pradedant nuo 0,015 mg metacholino ir kas penkios mi-nutės šią dozę dvigubinant iki maksimalios suminės 3,870 mg metacholino dozės. Po kiekvienos įkvėptos dozės praėjus 30 ir 90 sekundžių tiriamie-siems buvo atliekama spirograma ir vertinamas FEV1 pokytis (lyginant su pradine FEV1 verte). Tyrimas nutraukiamas nustačius FEV1 sumažėjimą ≥ 20 proc. lyginant su pradiniu dydžiu arba pasiekus maksimalią metacho-lino dozę. Metacholino dozė, sumažinanti FEV1 20 proc. (PD20), apskaičiuo-ta linijinės interpoliacijos tarp dviejų taškų metodu.

33

4.2.4. Bronchų provokacijos mėginys su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu Bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu atlikta naudojant

KoKo DigiDoser purkštuvą (Sunrise Medical, Somerset, PA, JAV) [112]. Liofilizuotas D. pteronyssinus alergeno ekstraktas (Stallergenes S.A., Pran-cūzija) praskiestas steriliu natrio chlorido tirpalu (0,9 proc. NaCl). Naudotos skirtingos D. pteronyssinus alergeno tirpalo koncentracijos: 0,01 IR/ml, 0,1 IR/ml, 1,0 IR/ml, 10 IR/ml, 33,3 IR/ml. Alergeno koncentracijos matavimo vienetas IR (angl. Index of Reactivity, IR) reiškia, jog atliekant odos dūrio mėginį su 100 IR/ml koncentracijos alergenu trisdešimčiai šiuo alergenu įsijautrinusių asmenų sukeliama 7 mm diametro (geometrinis vidurkis) papulė, tuo pat metu nustatant ir odos reaktyvumą histamino dihidrochlo-ridui (10 mg/ml). Tyrimas pradėtas įkvėpus 5 kontrolinio tirpalo (0,9 proc. NaCl) įkvėpimus. Po 10 min. atlikta spirometrija ir įvertintas FEV1, kurio vertė buvo laikoma pradine. Po kiekvienos įkvėptos alergeno dozės, kuri buvo didinama kas 10 min., tiriamiesiems buvo atliekama spirometrija ir vertinamas FEV1 pokytis. Ankstyva bronchų obstrukcija nustatyta, jei per pirmąją valandą po bronchų provokacijos alergenu pasiektas ≥ 20 proc. FEV1 pokytis išliko ne mažiau kaip 10 min. Tuomet tolesnis alergeno sky-rimas sustabdytas, o spirometrija kartota kas 10 min., kol FEV1, atsistatys iki vertės < 10 proc. lyginant su pradine. Norint nustatyti vėlyvą bronchų obstrukciją, spirometrija karta kas 1 val. sekančias šešias valandas. Vėlyva bronchų obstrukcija nustatyta, kuomet antrą–septintą valandą po bronchų provokacijos alergenu FEV1 pokytis buvo ≥ 15 proc. lyginant su pradiniu dydžiu ir išliko ≥ 15 min.

4.2.5. Skreplių indukcija ir citologinis tyrimas Skreplių atkosėjimui paskatinti naudotas sterilus hipertoninis natrio

chlorido tirpalas. Skirtingų koncentracijų (3, 4 ir 5 proc.) po 10 ml tirpalo inhaliuota per ultragarsinį purkštuvą Ultraneb 2000 (DeVilbiss Health Care, Somerset, JAV), kurio galia 3 ml/min., o inhaliacijos etapo trukmė –7 min. [142]. Po kiekvieno inhaliacijos etapo tiriamojo asmens buvo prašoma atko-sėti skreplių į sterilų indelį. Nepavykus atkosėti skreplių, sekančias 7 min. procedūra tęsiama su didesnės koncentracijos natrio chlorido tirpalu. Atko-sėti indukuoti skrepliai surinkti į sterilią Petri lėkštelę, laikomą ant ledo, ir nedelsiant gabenti tolimesniam paruošimui ir tyrimui.

Prieš pradedant skreplių indukciją visiems tiriamiesiems atlikta spiro-metrija ir įvertintas pradinis FEV1 dydis. Vėliau, visos skreplių indukcijos procedūros metu, kas penkias minutes buvo kartojami FEV1 matavimai no-

34

rint nustatyti besivystančią bronchų obstrukciją. FEV1 sumažėjus daugiau nei 20 proc. lyginant su pradiniu dydžiu – tyrimas buvo nutraukiamas ir paskiriama 200 μg salbutamolio (Ventolin, Galxo Wellcome) inhaliacija.

Atskirti nuo seilių priemaišų skrepliai maišyti su 4 kartus didesniu kiekiu nei skreplių svoris 0,1 proc. ditiotreitolio tirpalu (DTT; Sigma-Aldrich, Vokietija) 15 min. kambario temperatūroje. Po maišymo įpilta fosfatinio buferio tirpalo (PBS; Sigma-Aldrich, Vokietija), kurio kiekis buvo toks pats, kaip prieš tai naudoto DDT tirpalo. Sumaišyta suspensija filtruota per 40 μm nailoninį filtrą (Milipore; North Ryde, Australija). Naudojant Neubauerio hemocitometrą (Heinz-Herenz, Vokietija) ir mikroskopą B5 Professional (Motic; Kinija) nustatytas ląstelių gyvybingumas Trypano blue metodu (Fluka, Šveicarija), įvertintas epitelio ląstelių skaičius, bendrasis ląstelių skaičius, suskaičiuotas ląstelių kiekis viename grame skreplių [149]. Kokybiškais laikyti preparatai, kuriuose gyvų ląstelių buvo ≥ 50 proc., o epitelinių – ≤ 20 proc., skaičiuojant nuo visų ląstelių skaičiaus. Ląstelių suspensija centrifuguota 410×g 10 min., 4°C temperatūroje. Baigus centrifu-guoti supernatantas nusiurbtas ir perpiltas į 4 po 0,5 ml talpos šaldymui skirtus Eppendorf tipo mėgintuvėlius saugoti –70°C temperatūroje toli-mesniems tyrimams. Likusi ląstelių suspensija praskiesta PBS tirpalu iki reikiamos koncentracijos 1×106 ląstelių/ml.

Ląstelių preparatai tyrimui paruošti naudojant citocentrifugą Cytospin 2 (Shandon Scientific; Sewickley, JAV). Jie dažyti standartizuotu May-Grün-vald-Giemsa metodu [14]. Analizė atlikta šviesiniu mikroskopu B5 Profes-sional (Motic; Kinija). Atsitiktinai pasirinktame lauke, naudojant ×10 objek-tyvą ir ×100 aliejaus imersinį objektyvą, mikroskopuota ir įvertinta ląstelių morfologija ir sudėtis. Ląstelės atskirtos pagal joms būdingus morfologinius požymius (branduolį, citoplazmos granules). Ląstelių sudėtis vertinta su-skaičiavus apie 400 ląstelių (neįskaičiuojant epitelinių). Jų kiekis išreikštas absoliučiais (×106/ml) bei santykiniais (nuo bendro ląstelių kiekio) dydžiais.

4.2.6. Periferinio kraujo citologinis tyrimas Tyrimui kraujas imtas į mėgintuvėlį su antikoaguliantu K3 etilendiami-

no tetraacto rūgštimi, K3EDTA. Periferinio kraujo ląstelių sudėtis (bendras leukocitų, neutrofilų, eozinofilų, limfocitų, monocitų skaičius) tirta automa-tiniu hematologiniu kraujo analizatoriumi (Sysmex XE 7000, Japonija).

35

4.2.7. Periferinio kraujo T limfocitų subpopuliacijų tyrimas Periferinio kraujo limfocitų imunofenotipavimas atliktas tėkmės cito-

metrijos metodu taikant tiesioginio dažymo metodiką bei trispalvę citomet-rinę analizę FacsCanto tėkmės citometru (BD Immunocytometry Systems; San Jose, CA, JAV).

Limfocitų subpopuliacijų tyrimams kraujas imtas į mėgintuvėlius su antikoaguliantu natrio heparinu. Tyrimai atlikti ne vėliau kaip per 2 val. nuo kraujo paėmimo. Limfocitų populiacijai išgryninti buvo naudotas aukšto tankio gradientas (Ficoll, GE Healthcare, Suomija), išpilstytas į centrifu-ginius mėgintuvėlius (Falcon, BD, JAV), o paviršius atsargiai padengtas fosfatinio buferio tirpalu (PBS), 1:1 santykiu praskiestu krauju. Paruošti mėginiai centrifuguoti 400×g, 30 min. 10°C temperatūroje. Po centrifugavi-mo virš eritrocitų susidaręs limfocitų žiedas atsargiai nusiurbtas ir perkeltas į kitą centrifuginį mėgintuvėlį. Pastarasis centrifuguotas 200×g, 10 min., 4°C temperatūroje naudojant PBS. Neubauerio hemocitometru ir mikro-skopu B5 Professional (Motic; Kinija) nustatytas ląstelių gyvybingumas (Trypano blue metodu) ir bendrasis ląstelių skaičius. Įvertinus ląstelių kiekį, mėginys praskiestas mitybine terpe RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, JAV), papildyta 15 mM L-gliutaminu iki tolimesniems tyrimams reikalingos koncentracijos.

Viduląstelinių citokinų gamybą siekta suaktyvinti stimuliuojant ląstelių mėginius (2×106 ląstelių /ml) 5 val. 37°C temperatūroje su PMA reagentu (angl. phorbol-12-myristate-13-acetate, 50 ng/mL; Sigma-Aldrich, JAV) ir jonomicinu (1 μg/mL; Invitrogen, JAV) kartu su baltymo transporto inhibi-toriumi, stabdančiu citokinų išskyrimą (4 μl/ 6 ml ląstelių; BD GolgiStop™, BD Biosciences, JAV). Mėginys centrifuguotas 250×g 10 min. kambario temperatūroje, ląstelės plautos 2 kartus naudojant FBS (angl. fetal bovine serum, FBS; BD Biosciences, JAV). Ląstelių mėginys fiksuotas šaltu fiksa-cijos buferiu BD Cytofix™ (BD Biosciences, JAV) 15 min. kambario temperatūroje. Po fiksacijos ląstelės plautos 2 kartus ir centrifuguotos 250×g 10 min. kambario temperatūroje. Ląstelės paliktos 4°C temperatūroje FBS tirpale 6–8 val. iki tolimesnio tyrimo.

Vėliau mėginys centrifuguotas 250×g 10 min. kambario temperatūroje. Į 1 ml ląstelių tirpalo pridėta 1 ml šviežiai paruošto buferio BD Perm/Wash™ (BD Biosciences, JAV), inkubuota 15 min. kambario temperatūroje. Super-natantas pašalintas centrifuguojant 250×g 10 min. kambario temperatūroje. Ląstelės dažomos pridėjus 20 μl žmogaus Th1/Th2/Th17 monokloninių antikūnų mišinio (BD Biosciences, JAV), kurio sudėtyje yra monokloninis antikūnas (mAk) prieš žmogaus CD4, žymėtas PERCP-CY5.5, mAk prieš žmogaus IL-17A, žymėtas PE, mAk prieš žmogaus IFN-GMA, žymėtas

36

FITC, mAk prieš žmogaus IL-4, žymėtas APC ir inkubuojant 30 min. kam-bario temperatūroje, tamsoje. Ląstelių mėginys plaunamas 2 kartus buferiu Perm/Wash™ (santykiu 1ml ląstelių ir 1 ml buferio) ir laikomos FBS buferyje iki analizės citometru.

Analizei surinkta ne mažiau nei 70 000 ląstelių. Pagal monochrominės lazerio šviesos sklaidą vertintas ląstelių dydis (pagal priekinę šviesos sklaidą, PŠS) ir grūdėtumas (pagal šoninę šviesos sklaidą, ŠŠS). Pasirenkant limfocitų populiaciją, naudotos taškinės diagramos su ŠŠS ir CD4 raiškos deriniu. Ląstelės atrinktos taškinėje diagramoje aplink tiriamąsias ląsteles apibrėžiant regioną.

Pasirinkus regioną, įvertintas regiono ląstelių kiekis. Tolimesnė analizė vertinant CD raišką atlikta tik su apibrėžto regiono ląstelėmis. Neigiamos ir teigiamos žymenų raiškos ribos nustatytos naudojant neigiamą izotipinę kontrolę (Anti-mouse Ig, κ /negative control (FBS) compensation particles (BD Biosciences, JAV)). Limfocitų subpopuliacijų santykiniai dydžiai išreikšti vertinant subpopuliacijai specifinio žymens raišką (CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17+) ir rodo limfocitų subpopuliacijos dydį procentais nuo CD4+ T limfocitų populiacijos.

37

4.2.7.1 pav. Tėkmės citometrijos taškinės diagramos, reprezentuojančios

17-o tipo T limfocitų pagalbininkų subpopuliaciją vieno asmens, sergančio alergine astma, periferiniame kraujyje, prieš ir po bronchų

provokacijos su D. pteronyssinus alergenu Limfocitų regiono pasirinkimas remiantis šonine spindulio sklaida (ŠŠS) ir CD4 raiška (A); 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų kiekis periferiniame kraujyje 24 val. prieš bronchų provokaciją su alergenu(B) ir praėjus 24 val. po bronchų provokacijos (C).

38

4.2.8. Citokinų koncentracijos serume ir indukuotų skreplių supernatante nustatymas Serumo mėginiams paruošti kraujas imtas į mėgintuvėlius be priedų ir

laikytas kambario temperatūroje apie 30 min. Susidarius krešuliui, centri-fuguotas 1000×g, 10 min. kambario temperatūroje. Serumas nusiurbtas į sterilius šaldymui skirtus Eppendorf tipo mėgintuvėlius ir saugotas –70°C temperatūroje tolimesniems tyrimams.

Citokinų (IL-17, IL-8, IL-5) koncentracijos nustatymui indukuotų skreplių supernatante bei serume naudotas standartizuotas imunofermentinis ELISA (angl. enzyme linked immunosorbent assay) metodas. Kiekvieno citokino koncentracija tirta vadovaujantis gamintojo pateiktomis metodo-loginėmis rekomendacijomis: IL-17 (BioSource S.A., Belgija); IL-8 ir IL-5 (BD Biosciences, JAV).

Sterilios 96 šulinėlių ELISA plokštelės padengtos dengiamuoju mono-kloniniu antikūnu prieš atitinkamus žmogaus citokinų antigenus. Sandariai uždengtos plokštelės 18 val. inkubuotos 4°C temperatūroje. 3 kartus praplo-vus plovimo buferiniu tirpalu, nespecifinės reakcijos 1 val. blokuotos ana-liziniu skiedikliu. Po blokavimo ir praplovimo (2 kartus) etapų, į šulinėlius įpilta kartotinio skiedimo rekombinantinio citokino antikūno tirpalų (stan-dartinių tirpalų), neigiamos kontrolės (analiziniu skiedikliu) ir tiriamųjų mėginių. Plokštelės inkubuotos atsižvelgiant į gamintojo rekomendacijas kiekvieno žymens koncentracijai nustatyti 1–2 val. Praplovus plokštelių šulinėlius, įpilta antrinio žymėto krienų peroksidaze monokloninio antikūno ir inkubuota 1 val. Gerai praplovus šulinėlius, įpilta substratinio buferio (Chemicon, Australija) ir inkubuota tamsoje. Po 30 min. imunofermentinė reakcija sustabdyta naudojant 2N koncentracijos sieros rūgšties tirpalą (Chemicon, Australija). Mėginių optinis tankis nuskaitytas mikroplokštelių skaitytuvu (BIO-TEK Elx800 Microplate reader, JAV), naudojant 450 nm bangos ilgį. IL-17, IL-8, IL-5 koncentracijos mėginiuose paskaičiuotos pa-gal standartinę kreivę, gautą naudojant kartotinius rekombinantinio antikūno skiedimų (standartinių tirpalų) optinius tankius. Standartinė kreivė nubrėžta naudojant „Imunlab“ programinę įrangą (Oksfordo universitetas, Didžioji Britanija). X (abscisių) ašyje žymėta žinoma citokino koncentracija, Y (ordinačių) – optinis tankis. Tiriamojo mėginio citokino koncentracija buvo apskaičiuota naudojantis sudaryta kalibracine kreive, atsižvelgta į skiedimo koeficientą. Visi mėginiai analizuoti po 2 kartus. Minimali nustatoma koncentracija: IL-17 – 2 pg/ml; IL-5 – 4 pg/ml; IL-8 – 7 pg/ml.

39

4.3. Matematinė statistinė duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant statistinės programos pa-ketą „Statistical Package for the Social Sciences, version 20.0 for Windows“ (SPSS for Windows, 20.0 versija, JAV).

Hipotezė apie matuojamų požymių reikšmių normalųjį skirtinį tikrinta taikant Kolmogorov-Smirnov testą.

Tiriamiesiems požymiams, turintiems normalųjį skirstinį, buvo taiko-mos šios aprašomosios statistikos charakteristikos: vidurkis, standartinio vi-durkio paklaida (SEM). Tiriamiesiems požymiams, kurie netenkino norma-liojo skirstinio kriterijų, buvo taikomos šios aprašomosios statistikos charak-teristikos: mediana, tarpkvartilinis plotis (IQR).

Taikydami vienfaktorinę dispesinę analizę ANOVA (angl. analysis of variance) lyginome kelių nepriklausomų imčių, turinčių normalųjį skirstinį, vidurkius, o skirtumui tarp dviejų nepriklausomų imčių įvertinimui naudotas Stjudento t kriterijus. Požymių, turinčių normalųjį skirstinį, skirtumui tarp trijų ir daugiau priklausomų grupių įvertinimui naudota kartotinų matavimų dispersinė analizė (ANOVA), o skirtumui tarp dviejų priklausomų grupių – porinis Stjudento t kriterijus.

Esant mažoms imtims (n < 20) arba tirtiems požymiams netenkinant normaliojo skirstinio kriterijų, skirtumui tarp kelių nepriklausomų grupių įvertinti naudotas neparametrinių duomenų Kruskal-Wallis testas, o skirtu-mui tarp dviejų nepriklausomų grupių įvertinimui naudotas Mann-Whitney U testas. Skirtumui tarp kelių priklausomų grupių įvertinti naudotas nepa-rametrinių duomenų Friedman testas, tuo tarpu tarp dviejų priklausomų grupių – Wilcoxon testas.

Ryšys tarp tirtųjų požymių reikšmių nustatytas regresinės analizės me-todu pagal Spearman (duomenims, netenkinantiems normaliojo skirstinio kriterijų) koreliacijos koeficientą. Statistinių hipotezių tikrinimui pasirin-kome kriterijaus reikšmingumo lygmenį p < 0,05.

40

5. REZULTATAI

5.1. Tiriamųjų demografiniai ir klinikiniai duomenys

Sergantys alergine astma ir alerginiu rinitu bei sveiki asmenys buvo panašaus amžiaus, visose tiriamųjų grupėse buvo panašus vyrų ir moterų santykis. Tiriamųjų demografiniai ir klinikiniai duomenys pateikti 5.1.1 len-telėje. Sergantiesiems alergine astma ir alerginiu rinitu alerginiais odos dū-rio mėginiais patvirtintas įsijautrinimas D. pteronyssinus alergenui. Vidu-tinis papulės dydis, sukeltas D. pteronyssinus alergeno, abiejose sergančių asmenų grupėse buvo panašus. Odos dūrio mėginys su D. pteronyssinus alergenu sveikiems asmenims papulės nesukėlė. FEV1 (vertinant procentais ir litrais) buvo mažesnis sergančių alergine astma grupėje lyginant su alerginiu rinitu. Provokacinė metacholino dozė, sumažinanti FEV1 20 proc. lyginant su pradiniu dydžiu (PD20), buvo nustatyta visiems sergantiesiems alergine astma ir 4 asmenims, sergantiems alerginiu rinitu. Sveikiems kontrolinės grupės asmenims metacholino PD20 nenustatyta, tai yra maksimali metacholino dozė bronchų obstrukcijos nesukėlė.

5.1.1 lentelė. Visų tyrime dalyvavusių asmenų demografiniai ir klinikiniai duomenys

Požymis Sergantys alergine astma

(n = 30)

Sergantys alerginiu rinitu

(n = 30)

Sveiki asmenys (n = 20)

Amžius, vidurkis ± SEM (reikšmių ribos), metai

34 ± 4 (21–50)

30 ± 1 (20–36)

30 ± 3 (22–45)

Lytis (vyrai/moterys), n 14/16 19/11 12/8 Vidutinis papulės dydis, sukeltas D. pteronyssinus, vidurkis ± SEM (reikšmių ribos), mm

6,2 ± 0,9 (4–12)

7,9 ± 0,7 (4–15)

0

FEV1, vidurkis ± SEM (reikšmių ribos), proc. normos

98,0 ± 7,9† (82–116)

112,0 ± 10,2 (97–141)

104,9 ± 13,6 (79–114)

FEV1, vidurkis ± SEM (reikšmių ribos), litrais

3,6 ± 0,3† (2,5–5,1)

5,0 ± 0,3 (3,1–6,5)

4,1 ± 0,4 (2,5–6,0)

PD20, geometrinis vidurkis (reikšmių ribos), mg

0,4 (0,1–0,7)

2,8# (1,0–3,9)

–

PD20 – provokacinė metacholino dozė, sumažinanti FEV1 20 proc. lyginant su pradiniu dydžiu; FEV1 – forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę; #PD20 nustatyta 4 asmenims sergantiems alerginiu rinitu; †p < 0,05 lyginant su sergančiais alerginiu rinitu.

41

Pagal bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu rezultatus, sergantys alergine astma (n = 30) suskirstyti į du pogrupius:

1. Sergantys alergine astma, kuriems po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu išsivystė tik ankstyva bronchų obstruk-cija (n = 16);

2. Sergantys alergine astma, kuriems po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu išsivystė ankstyva ir po jos sekanti vėly-va bronchų obstrukcija (n = 14).

Ankstyvos ir vėlyvos bronchų obstrukcijos kriterijai aprašyti 4.2.4 sky-riuje. Sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija demografiniai ir klinikiniai požymiai pateikti 5.1.2 lentelėje.

Abiejuose sergančių alergine astma pogrupiuose vyrų ir moterų san-tykis, amžiaus vidurkis ir vidutinis D. pteronyssinus alergeno sukeltos papu-lės dydis buvo panašūs. Didžiausias FEV1 (proc.) sumažėjimas po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu per pirmąją valandą sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija bei sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupiuose buvo atitinkamai 26 ± 4 proc. ir 29 ± 3 proc. Didžiausias FEV1 (proc.) sumažėjimas po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu per antrą – septintą valandą sergančių alergine astma pogrupyje su ankstyva ir vėlyva bronchų obstruk-cija buvo 31 ± 10 proc. Sergantiesiems alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija antrą–septintą valandą po bronchų provokacijos reikšmingo FEV1 (proc.) sumažėjimo nenustatyta (7 ± 2 proc.). Bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu nesukėlė jokių sunkių ar reikalaujančių papildo-mo gydymo pašalinių reakcijų sergantiesiems alerginėmis kvėpavimo ligo-mis asmenims. Sergantiems alerginiu rinitu bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu išprovokavo alerginio rinito simptomus, bet plaučių funkcijos pakitimų nesukėlė. Sveikiems asmenims bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu plaučių funkcijos pakitimų nesukėlė.

42

5.1.2 lentelė. Sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija demografiniai ir klinikiniai duomenys

Požymis

Sergantys alergine astma (n = 30) Su ankstyva bronchų obstrukcija (n = 16)

Su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija (n = 14)

Amžius, vidurkis ± SEM (reikšmių ribos), metai

34 ± 6 (21–50)

29 ± 5 (21–42)

Lytis (vyrai/moterys), n 8/8 6/8 Vidutinis papulės dydis, sukeltas D. pteronyssinus, vidurkis ± SEM (reikšmių ribos), mm

6,5 ± 0,7 (4,5–11)

6,8 ± 0,5 (4–11)

FEV1, vidurkis ± SEM (reikšmių ribos), proc. normos

103 ± 2 (92–118) 99 ± 2 (82–104)

PD20, geometrinis vidurkis (reikšmių ribos), mg

0,36 (0,1–0,7)

0,33 (0,1–0,7)

Didžiausias FEV1 sumažėjimas (proc.) per pirmąją valandą po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus, vidurkis ± SEM (reikšmių ribos)

26 ± 4 (20–33)

29 ± 3 (22–32)

Didžiausias FEV1 sumažėjimas (proc.) per antrą–septintą valandas po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus, vidurkis ± SEM (reikšmių ribos)

7 ± 2 (5–9)

31 ± 10 (15–62) #

PD20 – provokacinė metacholino dozė, sumažinanti FEV1 20 proc. lyginant su pradiniu dydžiu; FEV1 – forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę; #p < 0,05 lyginant su sergančiais alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija.

Nustatyta, kad indukuotų skreplių ląstelės bei uždegimo baltymai at-spindi kvėpavimo takų pažeidimo sergant alergine astma patomorfologinius mechanizmus [95]. Šio tyrimo metu norėjome įvertinti vietinio imuninio atsako pokyčius sergantiems alergine astma po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu. Pasirinkome nesudėtingą, tačiau informatyvų kvėpavimo takų uždegimo tyrimo metodą – indukuotų skreplių tyrimą.

Iš visų 80 tirtųjų asmenų tik 36 (18 vyrų ir 18 moterų, kurių amžiaus vidurkis 30 ± 2 metai) atkosėjo reikiamą kiekį kokybiškų skreplių, todėl šioje tyrimo dalyje analizuoti tik šių asmenų atitinkami duomenys. Sergan-čių alergine astma grupėje analizuoti 15 asmenų (7 asmenų su ankstyva bronchų obstrukcija bei 8 asmenų su ankstyva ir vėlyva bronchų obstruk-

43

cija) duomenys, sergančių alerginiu rinitu – 13, o sveikų asmenų grupėje – 8 asmenų duomenys. Šių asmenų demografiniai ir klinikiniai duomenys pateikti 5.1.3 lentelėje. Sergantiems alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija nustatytas mažesnis FEV1 (proc.) lyginant su sergančias alerginiu rinitu ir sveikais asmenimis.

5.1.3 lentelė. Sergančių alergine astma, alerginiu rinitu ir sveikų asmenų, atkosėjusių kokybiškų skreplių, demografiniai ir klinikiniai duomenys

Požymis

Sergantys alergine astma (n = 15)

Sergantys alerginiu

rinitu (n = 13)

Sveiki asmenys (n = 8) Su ankstyva

bronchų obstrukcija

(n = 7)

Su ankstyva ir vėlyva bronchų

obstrukcija (n = 8)

Amžius, mediana ± IQR (reikšmių ribos), metai

36 ± 4 (21–50)

29 ± 4 (21–42)

30 ± 4 (20–36)

31 ± 6 (22–45)

Lytis (vyrai/moterys), n 4/3 3/5 9/4 2/6 Vidutinis papulės dydis sukeltas D. pteronyssinus, mediana ± IQR (reikšmių ribos), mm

6,1 ± 0,4 (4–7)

6,6 ± 1,0 (4–11)

7,2 ± 0,8 (3–15)

0

FEV1, mediana ± IQR (reikšmių ribos), proc. normos

106 ± 4 (92–118)

95 ± 4*# (82–104)

112 ± 11 (97–141)

108 ± 10 (79–119)

PD20, geometrinis vidurkis (reikšmių ribos), mg

0,36 (0,19–0,96)

0,32 (0,06–0,96)

–

–

Didžiausias FEV1 sumažėjimas (proc.) per pirmąją valandą po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus, mediana ± IQR (reikšmių ribos)

26 ± 5 (20–33)

29 ± 4 (22–32)

7 ± 2 (3–9)

5 ± 2 (2–8)

Didžiausias FEV1 (proc.) sumažėjimas per antrą-septintą valandas po bronchų provoka-cijos su D. pteronyssinus, mediana ± IQR (reikšmių ribos)

7 ± 3 (5–9)

33 ± 13† (15–62)

6 ± 2 (2–8)

6 ± 2 (4–7)

PD20 – provokacinė metacholino dozė, sumažinanti FEV1 20 proc. lyginant su pradiniu dydžiu; FEV1 – forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę; #p < 0,05 lyginant su sergančiais alerginiu rinitu; *p < 0,05 lyginant su sveikais asmenimis; †p < 0,05 lyginant su sergančiais alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija.

44

5.2. Periferinio kraujo T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijos

Ištyrus T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijas periferiniame kraujyje nustatyta, jog sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu grupėse yra reikšmingai didesnis Th17 limfocitų kiekis lyginant su sveikais asmenimis (1,3 ± 0,3 proc. ir 1,0 ± 0,5 proc. vs. 0,5 ± 0,2 proc., p < 0,001 abiem atve-jams) (5.2.1 pav. A). Sergančių alergine astma periferiniame kraujyje nusta-tytas reikšmingai mažesnis Th1 limfocitų kiekis lyginant su sveikais asme-nimis (9,8 ± 2,1 proc. vs. 12,0 ± 1,5 proc., p < 0,01), tačiau šių limfocitų subpopuliacija lyginant su sergančiais alerginiu rinitu nesiskyrė (5.2.1 pav. B). Sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu asmenų periferiniame kraujyje nustatytas reikšmingai didesnis Th2 limfocitų kiekis lyginant su sveikais asmenimis (3,8 ± 0,2 proc. ir 3,1 ± 0,2 proc. vs. 1,6 ± 0,1 proc., p < 0,001 abiem atvejams) (5.2.1 pav. C).

5.2.1 pav. T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijos sergančių alergine

astma, alerginiu rinitu bei sveikų asmenų periferiniame kraujyje: Th17 (A), Th1 (B), Th2 (C) limfocitai.

Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 20); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); AA – asmenys, sergantys alergine astma (n = 30).

45

5.3. Citokinų ir uždegimo ląstelių kiekis periferiniame kraujyje bei jų tarpusavio sąsajos

Sergant alergine astma ir alerginiu rinitu nustatyta reikšmingai didesnė IL-17 koncentracija serume lyginant su sveikais asmenims (4,1 ± 2,0 pg/ml ir 3,6 ± 0,9 pg/ml vs. 1,1 ± 1,5 pg/ml, p<0,001 abiem atvejams) (5.3.1 pav. A). Reikšmingai didesnė IL-8 koncentracija serume nustatyta sergantiems alergine astma ir alerginiu rinitu lyginant su sveikais asmenimis (18,3 ± 2,2 pg/ml ir 12,9 ± 4,7 pg/ml vs. 9,6 ± 1,5 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejams), o sergančių alergine astma grupėje IL-8 koncentracija serume buvo reikšmingai didesnė nei sergančių alerginiu rinitu (p < 0,001) (5.3.1 pav. B). IL-5 koncentracija serume buvo reikšmingai didesnė sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu grupėse lyginant su sveikais asmenimis (46,4 ± 2,2 pg/ml ir 40,2 ± 6,7 pg/ml vs.16,8 ± 1,3 pg/ml, p <0 ,001), o taip pat sergančių alergine astma grupėje lyginant su sergančiais alerginiu rinitu (p<0,01) (5.3.1 pav. C).

5.3.1 pav. Citokinų koncentracija sergančių alergine astma, alerginiu rinitu bei sveikų asmenų periferinio kraujo serume:

IL-17 (A), IL-8 (B), IL-5 (C). Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 20); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); AA – asmenys, sergantys alergine astma (n = 30).

46

Sergančių alergine astma grupėje, kaip ir sergančių alerginiu rinitu, Th2 limfocitų kiekis reikšmingai teigiamai siejosi su IL-5 koncentracija periferiniame kraujyje (5.3.1 lentelė). Periferinio kraujo ląstelių sudėtis pateikta 5.4.2 lentelėje. Reikšminga teigiama sąsaja nustatyta tarp Th17 limfocitų ir IL-17 kiekio periferiniame kraujyje sergant alergine astma.

5.3.1 lentelė. Citokinų ir uždegimo ląstelių kiekio periferiniame kraujyje tarpusavio sąsajos. IL-5

(pg/ml) IL-8

(pg/ml) IL-17

(pg/ml) Eozinofilai

(proc.) Neutrofilai

(proc.) Limfocitai

(proc.)

Th1

lim

foci

tai

(pro

c.)

AA r=0,378; p=0,060

r=–0,116; p=0,540

r=–0,216; p=0,252

r=–0,008; p=0,968

r=0,279; p=0,135

r=–0,166; p=0,381

AR r=0,02; p=0,904

r=–0,040; p=0,834

r=0,293; p=0,116

r=0,141; p=0,457

r=0,392; p=0,062

r=–0,534; p=0,062

SA r=0,169; p=0,477

r=–0,34; p=0,888

r=0,021; p=0,929

r=0,162; p=0,494

r=–0,204; p=0,388

r=–0,528; p=0,071

Th2

lim

foci

tai

(pro

c.)

AA r=0,686; p=0,001

r=–0,137; p=0,472

r=–0,090; p=0,636

r=0,222; p=0,239

r=0,622; p=0,078

r=–0,557; p=0,061

AR r=0,495; p=0,005

r=–0,172; p=0,364

r=–0,284; p=0,128

r=0,325; p=0,080

r=0, 193; p=0,306

r=–0,217; p=0,250

SA r=–0,479; p=0,063

R=0,098; p=0,682

r=0,359; p=0,120

r=–0,044; p=0,853

r=–0,017; p=0,945

r=0,422; p=0,064

Th1

7 lim

foci

tai

(pro

c.)

AA r=–0,142; p=0,455

r=–0,026; p=0,894

r=0,639; p=0,014

r=0,158; p=0,406

r=–0,344; p=0,063

r=0,339; p=0,067

AR r=0,236; p=0,160

r=–0,219; p=0,245

r=0,186; p=0,326

r=–0,035; p=0,853

r=0,076; p=0,690

r=–0,036; p=0,851

SA r=–0,004; p=0,987

r=–0,033; p=0,889

r=0,023; p=0,923

r=0,357; p=0,123

r=–0,102; p=0,667

r=–0,375; p=0,103

AA – asmenys, sergantys alergine astma (n = 30); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); SA – sveiki asmenys (n = 20); r– Spearman koreliacijos koeficientas; p – reikšmingumo lygmuo.

47

5.4. Bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu sukelti periferinio kraujo T limfocitų pagalbininkų

subpopuliacijų kiekybiniai pokyčiai

Po bronchų provokacijos alergenu sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu asmenų periferiniame kraujyje, lyginant su sveikais asmenimis, stebimas reikšmingai didesnis Th17 limfocitų kiekis: praėjus 7 val. (2,0 ± 1,0 proc. ir 1,3 ± 0,6 proc. vs. 0,5 ± 0,2 proc., p < 0,001 abiem atvejams) ir 24 val. (2,3 ± 1,0 proc. ir 1,7 ± 1,1 proc. vs. 0,5 ± 0,2 proc., p < 0,001 abiems atvejams) (5.4.1 pav. A). Lyginant su pradiniais duomenimis, ser-gančių alerginiu rinitu periferiniame kraujyje stebimas reikšmingas Th17 limfocitų kiekio padidėjimas praėjus 24 val. po bronchų provokacijos (p < 0,05). Sergančių alergine astma grupėje, praėjus 7 val. ir 24 val. po bronchų provokacijos, šios limfocitų subpopuliacijos kiekis buvo reikšmingai didesnis nei sergančių alerginiu rinitu (p < 0,001 ir p < 0,05, atitinkamai), bei lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,001 abiem atvejams).

Reikšmingai mažesnis Th1 limfocitų kiekis sergančių alergine astma periferiniame kraujyje lyginant su sveikais asmenimis rastas praėjus 7 val. (9,7 ± 0,4 proc. vs. 12,0 ± 1,9 proc., p < 0,01) bei 24 val. (9,1 ± 0,2 proc. vs. 12,0 ± 5,2 proc., p < 0,05) po bronchų provokacijos alergenu (5.4.1 pav. B). Tuo tarpu tarp sergančių alerginiu rinitu bei sveikų asmenų grupėse nei prieš, nei po bronchų provokacijos alergenu reikšmingų skirtumų nenusta-tyta.

Po bronchų provokacijos alergenu sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu periferiniame kraujyje, lyginant su sveikais asmenimis, stebimas reikšmingai didesnis Th2 limfocitų kiekis: praėjus 7 val. (4,7 ± 0,2 proc. ir 2,9 ± 0,2 proc. vs. 1,7 ± 0,1 proc., p < 0,001 abiem atvejais), o praėjus 24 val. (5,5 ± 0,1 proc. ir 3,8 ± 0,2 proc. vs. 1,6 ± 0,1 proc., p < 0,001 abiem atvejais) (5.4.1 pav. C). Lyginant su pradiniais duomenimis, sergančių astma periferiniame kraujyje stebimas reikšmingas Th2 limfocitų kiekio padidėji-mas, praėjus 7 val. (p < 0,01) ir 24 val. (p < 0,001) po bronchų provokacijos alergenu. Sergančių alergine astma grupėje 7 val. ir 24 val. po bronchų pro-vokacijos, lyginant su sergančių alerginiu rinitu grupe, Th2 limfocitų kiekis periferiniame kraujyje buvo didesnis (p < 0,01 ir p < 0,001, atitinkamai). Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu šių limfocitų kiekis reikš-mingai padidėjo ir sergančių alerginiu rinitu grupėje (p < 0,05), lyginant su pradiniais duomenimis.

Bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu sveikų asmenų gru-pėje nesukėlė nei vieno iš T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijų pokyčių.

48

5.4.1 pav. Bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu sukelti T

limfocitų subpopuliacijų pokyčiai sergančių alergine astma, alerginiu rinitu ir sveikų asmenų periferiniame kraujyje: Th17 (A); Th1 (B); Th2 (C) limfocitai.

Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 20); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); AA – asmenys, sergantys alergine astma (n = 30); *p < 0,001; **p < 0,01; ***p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis; †p < 0,001; ††p < 0,01; †††p < 0,05 lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,001; ##p < 0,01 ; ###p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu.

Tyrimo metu nustatėme reikšmingą Th17 ir Th1 limfocitų santykio bei Th1 ir Th2 limfocitų santykio padidėjimą sergančių alergine astma bei alerginiu rinitu grupėse, lyginat su sveikais asmenimis (5.4.1 lentelė). Bron-chų provokacija su alergenu taip pat paskatino šių santykių padidėjimą po provokacijos praėjus 7 val. ir 24 val.: reikšmingas padidėjimas buvo stebimas sergančių alergine astma grupėje lyginant ne tik su sveikais asmenimis, tačiau ir su sergančiais alerginiu rinitu. Praėjus 24 val. po bron-chų provokacijos alergenu, lyginant su pradiniais duomenimis, stebėtas reikšmingas šių santykių padidėjimas sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu grupėse, o praėjus 7 val. tik alerginės astmos grupėje. Th17/Th2 santykis padidėjo 7 val. po bronchų provokacijos alergenu abiejų sergančių asmenų grupėse, lyginant su sveikais asmenimis. Sergančių alergine astma

49

grupėje, palyginus su padiniais duomenimis, nustatytas šio santykio padidėjimas praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu. Sveikiems asmenims Th17/Th1, Th17/Th2 ir Th1/Th2 limfocitų santykių pokyčių nei prieš, nei po bronchų provokacijos su alergenu nenustatyta.

5.4.1 lentelė. Sergančių alergine astma, alerginiu rinitu bei sveikų asmenų periferinio kraujo T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijų santykis prieš ir po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu

Požymis –24 val. +7 val. +24 val. Sergantys alergine astma (n = 30) Th17/Th1 Th17/Th2 Th1/Th2

0,14 ± 0,06* 0,36 ± 0,13

2,52 ± 0,74*#

0,19 ± 0,10*#† 0,43 ± 0,14*† 2,12 ± 0,59*#†

0,25 ± 0,12*#† 0,44 ± 0,21†

1,64 ± 0,27*#† Sergantys alerginiu rinitu (n=30) Th17/Th1 Th17/Th2 Th1/Th2

0,11 ± 0,09* 0,34 ± 0,22

3,38 ± 1,18*

0,11 ± 0,06* 0,44 ± 0,22* 3,43 ± 2,05

0,17 ± 0,13*†

0,46 ± 0,30 2,72 ± 1,01*†

Sveiki asmenys (n=20) Th17/Th1 Th17/Th2 Th1/Th2

0,04 ± 0,01 0,32 ± 0,21 7,11 ± 3,86

0,04 ± 0,02 0,30 ± 0,14 7,36 ± 2,17

0,05 ± 0,04 0,34 ± 0,10 7,95 ± 5,29

Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR) ; *p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis; †p < 0,05–lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu.

Ištyrus periferinio kraujo ląstelių sudėtį matome, kad sergantiems alerginėmis kvėpavimo ligomis būdingas padidėjęs eozinofilų kiekis (5.4.2 lentelė). 24 val. prieš bronchų provokaciją alergine astma sergančių grupėje buvo reikšmingai didesnis absoliutus ir santykinis eozinofilų kiekis procentais, o sergančių alerginiu rinitu – absoliutus eozinofilų kiekis, lyginant su sveikais asmenimis. Praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu reikšmingai didesnis absoliutus ir santykinis eozinofilų kiekis nustatytas visų sergančių kvėpavimo alerginėmis ligomis asmenų grupėse, lyginant su sveikais asmenimis. Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, lyginant su pradiniais duomenimis, nustatytas reikšmingas absoliutus ir santykinis eozinofilų kiekio padidėjimas sergančių alergine astma grupėje. Be to, sergančių alergine astma grupėje 24 val. po bronchų provokacijos nustatomas reikšmingai didesnis santykinis eozinofilų kiekis lyginant su sergančiais alerginiu rinitu. Praėjus 7 val. po bronchų pro-vokacijos, sergančių alerginiu rinitu asmenų grupėje nustatytas reikšmingai didesnis bendras leukocitų kiekis lyginant su sveikais asmenimis bei su

50

pradiniais duomenimis. Limfocitų kiekio pakitimų nei vienoje iš tirtųjų asmenų grupių nenustatyta. Bronchų provokacija alergenu sveikų asmenų periferinio kraujo ląstelių sudėties nepakeitė.

5.4.2 lentelė. Sergančių alergine astma, alerginiu rinitu ir sveikų asmenų periferinio kraujo ląstelių sudėtis prieš ir po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu

Požymis -24 val. +7 val. +24 val. Sergantys alergine astma (n = 30) Leukocitai, ×109l Eozinofilai, proc. Eozinofilai, ×109l Neutrofilai, proc. Neutrofilai, ×109l Limfocitai, proc. Limfocitai, ×109l

5,9 (1,4)

5,4 (2,5)* 0,3 (0,2) * 61,4(1,3) 3,7 (1,3)

26,4 (10,3) 1,7 (0,6)

5,9 (1,8)

5,3 (2,5)* 0,3 (0,2)* 62,2 (7,9) 3,6 (1,4)

27,0 (9,3) 1,6 (0,8)

6,4 (2,3)

5,5 (3,0)*# † 0,4 (0,2)* †

59,7(8,9) 3,6 (1,6)

30,2 (9,1) 1,9 (0,7)

Sergantys alerginiu rinitu (n = 30) Leukocitai, ×109l Eozinofilai, proc. Eozinofilai, ×109l Neutrofilai, proc. Neutrofilai, ×109l Limfocitai, proc. Limfocitai, ×109l

5,9 (1,2) 3,7 (2,9)

0,2 (0,2)* 70,0 (13,9) 3,4 (1,6)

26,4 (9,9) 1,9 (0,5)

6,6 (2,0)*† 4,1 (1,6)* 0,3 (0,1)*

57,3 (10,2) 3,2 (1,0)

27,2 (11,9) 1,9 (0,6)

6,3 (1,0)

5,4 (1,3)* 0,3 (0,1) * 65,6 (8,1) 3,5 (0,7)

28,6 (6,0) 1,9 (0,5)

Sveiki asmenys (n = 20) Leukocitai, ×109l Eozinofilai, proc. Eozinofilai, ×109l Neutrofilai, proc. Neutrofilai, ×109l Limfocitai, proc. Limfocitai, ×109l

5,4 (1,7) 2,9 (2,0) 0,1 (0,1)

55,1 (12,8) 3,1 (1,2)

32,2 (8,7) 1,6 (0,9)

5,4 (1,5) 3,2 (1,4) 0,1 (0,1)

59,4 (3,4) 3,0 (1,0)

29,8 (8,1) 1,6 (0,3)

5,3(1,8) 3,3 (1,2) 0,2 (0,1)

60,0 (5,7) 3,3 (1,1)

30,0 (8,0) 1,7 (0,6)

Duomenys pateikti: mediana (tarpkvartilinis plotis, IQR); *p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis; †p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu.

51

5.5. Bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu sukelti citokinų ir uždegimo ląstelių kiekio periferiniame kraujyje

pokyčiai bei jų tarpusavio sąsajos

Sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu asmenų grupėse, lyginant su sveikais asmenimis, nustatyta reikšmingai didesnė IL-17 koncentracija serume praėjus 7 val. (7,4 ± 1,3 pg/ml ir 5,4 ± 2,0 pg/ml vs. 1,9 ± 1,2 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejams) ir 24 val. (12,3 ± 2,8 pg/ml ir 8,2 ± 2,2 pg/ml vs. 2,0 ± 1,9 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejams) po bronchų provokacijos alergenu (5.5.1 pav. A). Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu sergančių alergine astma bei alerginiu rinitu grupėse nustatytas IL-17 koncentracijos padidėjimas, lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,001 abiem atvejams). O praėjus 24 val. po provokacijos sergančių alergine astma asmenų serume IL-17 koncentracija buvo didesnė nei sergančių alerginiu rinitu (p < 0,05).

Sergant alergine astma ir alerginiu rinitu, lyginant su sveikais asmenimis, nustatyta reikšmingai didesnė IL-8 koncentracija serume praėjus 7 val. (19,9 ±3 pg/ml ir 19 ± 8,5 pg/ml vs. 10,1 ± 1,3 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejais) ir 24 val. (22,7 ± 6,3 pg/ml ir 18,8 ± 2,4 pg/ml vs. 9,3 ± 1,8 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejais ) po bronchų provokacijos alergenu (5.5.1 pav. B). Nustatytas reikšmingas IL-8 koncentracijos padidėjimas sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu grupėse praėjus 7 val. (p < 0,05 ir p < 0,01, atitinkamai) ir 24 val. (p < 0,001 abiem atvejais), lyginant su pradiniais duomenimis. Be to, segančių alergine astma grupėje IL-8 kiekis 24 val. po bronchų provokacijos buvo reikšmingai didesnis nei sergančių alerginiu rinitu grupėje (p < 0,001).

Reikšmingai padidėjusi IL-5 koncentracija serume sergant alergine astma ir alerginiu rinitu, lyginant su sveikas asmenimis, nustatyta praėjus 7 val. (52,3 ± 3,7 pg/ml ir 46,2 ± 3,4 pg/ml vs. 16,7 ± 2,3 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejais) ir 24 val. (69 ± 5,1 pg/ml ir 51,4 ± 2,1 pg/ml vs. 17,6 ± 1,9 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejais) po bronchų provokacijos su Dermatopha-goides pteronyssinus alergenu (5.5.1 pav. C). Reikšmingas IL-5 koncent-racijos padidėjimas sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu grupėse buvo nustatytas praėjus 24 val. po bronchų provokacijos lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,05). IL-5 koncentracija sergančių alergine astma serume praėjus 7 val. ir 24 val. po bronchų provokacijos buvo didesnė lyginant su alerginiu rinitu (p < 0,05 abiem atvejais).

Bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu nesukėlė IL-5, IL-8, IL-17 koncentracijos serume pokyčių sveikiems asmenims.

52

5.5.1 pav. Bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu sukelti citokinų pokyčiai sergančių alergine astma, alerginiu rinitu bei sveikų

asmenų periferinio kraujo serume: IL-17 (A), IL-8 (B), IL-5 (C). Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n=20); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); AA – asmenys, sergantys alergine astma (n = 30); *p < 0,001; **p < 0,01; ***p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis; †p < 0,001; †††p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, # p < 0,001; ##p < 0,01; ###p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu.

Vertinome citokinų ir uždegimo ląstelių periferiniame kraujyje tarpu-savio sąsajas praėjus 7 val. po bronchų provokacijos alergenu (5.5.1 lentelė). Periferinio kraujo ląstelių sudėtis pateikta 5.4.2 lentelėje. Sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu grupėje Th2 limfocitų kiekis reikšmingai teigiamai siejosi su IL-5 koncentracija, o sergančiųjų alergine astma grupėje – ir su eozinofilų kiekiu periferiniame kraujyje. Reikšminga teigiama sąsaja nusta-tyta sergančių alergine astma grupėje tarp Th17 limfocitų, neutrofilų kiekio periferiniame kraujyje ir IL-8 koncentracijos serume.

53

5.5.1 lentelė. Citokinų ir uždegimo ląstelių kiekio periferiniame kraujyje są-sajos sergant alergine astma, alerginiu rinitu ir sveikiems asmenims praėjus 7 val. po bronchų provokacijos alergenu IL-5

(pg/ml) IL-8

(pg/ml) IL-17

(pg/ml) Eozinofilai

(proc.) Neutrofilai

(proc.) Limfocitai

(proc.)

Th1

lim

foci

tai

(pro

c.)

AA r=0,369; p=0,055

r=0,254; p=0,0175

r=0,267; p=0,153

r=0,297; p=0,612

r=–0,056; p=0,764

r=–0,003; p=0,988

AR r=–0,0,67; p=0,725

r=0,146; p=0,441

r=0,226; p=0,230

r=–0,314; p=0,091

r=0,017; p=0,930

r=0,205; p=0,277

SA r=0,097; p=0,741

r=–0,083; p=0,728

r=0,085; p=0,723

r=0,142; p=0,550

r=0,114; p=0,633

r=0,099; p=0,677

Th2

lim

foci

tai

(pro

c.)

AA r=0,792; p=0,001

r=0,430; p=0,058

r=0,624; p=0,061

r=0,437; p=0,016

r=0,218; p=0,248

r=–0,283; p=0,129

AR r=0,427; p=0,019

r=0,011; p=0,098

r=–0,188; p=0,319

r=0,331; p=0,074

r=–0,019; p=0,634

r=–0,111; p=0,560

SA r=–0,218; p=0,365

r=0,157; p=0,509

r=–0,028; p=0,908

r=–0,108; p=0,649

r=0,081; p=0,736

r=–0,216; p=0,360

Th1

7 lim

foci

tai

(pro

c.)

AA r=0,092; p=0,629

r=0,439; p=0,015

r=0,252; p=0,180

r=–0,278; p=0,137

r=0,366; p=0,047

r=–0,166; p=0,380

AR r=0,220; p=0,244

r=0,278; p=0,124

r=–0,051; p=0,789

r=–0,172; p=0,362

r=–0,042; p=0,827

r=0,056; p=0,771

SA r=–0,210; p=0,375

r=0,432; p=0,057

r=–0,163; p=0,493

r=–0,094; p=0,694

r=0,123; p=0,606

r=–0,212; p=0,370

AA – asmenys, sergantys alergine astma (n = 30); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); SA – sveiki asmenys (n = 20); r – Spearman koreliacijos koeficientas; p – reikšmingumo lygmuo.

Citokinų ir periferinio kraujo uždegimo ląstelių periferiniame kraujyje tarpusavio sąsajas dar kartą vertinome praėjus 24 val. po bronchų provoka-cijos alergenu. Nustatyta, kad visų sergančių alerginėmis kvėpavimo ligo-mis grupėse Th2 limfocitų kiekis reikšmingai teigiamai siejosi su IL-5 kon-centracija ir eozinofilų kiekiu (5.6.2 lentelė). Be to, sergančių alergine astma grupėje šių ląstelių kiekis reikšmingai teigiamai siejosi ir su IL-8, ir su IL-17 koncentracija. Alerginio rinito grupėje Th2 limfocitų kiekis reikšmin-gai neigiamai siejosi su periferinio kraujo neutrofilų kiekiu. Reikšminga tei-giama sąsaja nustatyta sergančių alergine astma grupėje tarp IL-17 koncent-racijos ir Th17 limfocitų kiekio. Be to, astmos grupėje reikšmingai teigiamai siejosi Th17 limfocitų ir IL-8 kiekis.

54

5.5.2 lentelė. Citokinų ir uždegimo ląstelių kiekio periferiniame kraujyje tarpu-savio sąsajos sergant alergine astma, alerginiu rinitu ir sveikiems asmenims praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu IL-5

(pg/ml) IL-8

(pg/ml) IL-17

(pg/ml) Eozinofilai

(proc.) Neutrofilai

(proc.) Limfocitai

(proc.)

Th1

lim

foci

tai

( pro

c.)

AA r=–0,082; p=0,668

r=0,070; p=0,972

r=–0,047; p=0,807

r=–0,103; p=0,587

r=0,031; p=0,869

r=–0,069; p=0,716

AR r=0,011; p=0,953

r=0,286; p=0,126

r=–0,014; p=0,941

r=–0,150; p=0,429

r=–0,327; p=0,078

r=0,301; p=0,106

SA r=–0,495; p=0,056

r=0,096; p=0,688

r=0,090; p=0,707

r=0,353; p=0,127

r=0,145; p=0,542

r=–0,282; p=0,229

Th2

lim

foci

tai

( pro

c.)

AA r=0,763; p=0,001

r=0,680; p=0,001

r=0,428; p=0,018

r=0,608; p=0,001

r=0,152; p=0,423

r=–0,106; p=0,576

AR r=0,520; p=0,003

r=–0,161; p=0,397

r=0,053; p=0,078

r=–0,210; p=0,265

r=–0,379; p=0,039

r=0,142; p=0,453

SA r=0,145; p=0,542

r=–0,494; p=0,067

r=0,058; p=0,808

r=0,157; p=0,509

r=0,091; p=0,704

r=–0,143; p=0,548

Th1

7 lim

foci

tai

(pro

c.)

AA r=0,261; p=0,163

r=0,408; p=0,025

r=0,558; p=0,001

r=0,033; p=0,861

r=0,083; p=0,051

r=0,111 p=0,558

AR r=0,089; p=0,641

r=–0,055; p=0,773

r=0,120; p=0,528

r=–0,242; p=0,197

r=–0,309; p=0,097

r=0,137; p=0,471

SA r=0,308; p=0,186

r=–0,030; p=0,899

r=0,235; p=0,319

r=–0,242; p=0,304

r=–0,057; p=0,813

r=0,020; p=0,934

AA – asmenys, sergantys alergine astma (n = 30); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); SA – sveiki asmenys (n = 20); r – Spearman koreliacijos koeficientas; p – reikš-mingumo lygmuo.

5.6. Indukuotų skreplių ląstelių sudėtis bei citokinų koncentracijos prieš ir po bronchų provokacijos su

D. pteronyssinus alergenu

Kvėpavimo takų uždegimo sergant alergine astma ištyrimui pasirinktas nesudėtingas, tačiau gerai atspindintis kvėpavimo takų patomorfologinius pakitimus tyrimas – skreplių indukcija. 36 tiriamiems asmenims (55 proc.) pavyko atkosėti reikiamą kiekį kokybiškų skreplių. Tolimesnei analizei atrinkti 15 sergančių alergine astma duomenys (iš jų 7 sergantys alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija ir 8 sergantys alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija); 13 sergančių alerginiu rinitu duomenys (palyginamoji grupė); 8 sveikų asmenų duomenys (kontrolinė grupė). Demografinės tiriamų asmenų charakteristikos pateiktos 5.1.3

55

lentelėje. Atlikti indukuotų skreplių mėginiai buvo vertinti kaip kokybiški, kuomet ląstelių gyvybingumas visose tiriamųjų grupėse buvo > 60 proc., o epitelio ląstelės mėginiuose sudarė ne daugiau nei 20 proc. (5.6.1 lentelė).

5.6.1 lentelė. Indukuotų skreplių kokybės ir kiekybės charakteristikos

Požymis Sergantys alergine astma Sergantys alerginiu

rinitu (n = 13)

Sveiki asmenys (n = 8)

su ankstyva obstrukcija

(n = 7)

su ankstyva ir vėlyva obstrukcija

(n = 8) Skreplių indukcijos trukmė, min.

16,1 ± 6,2 15,5 ± 9,4 18,4 ± 6,7 21,5 ± 5,8

FEV1 pokytis tyrimo metu, proc.

8,6 ± 5,2 9,6 ± 4,2 5,3 ± 4,6 4,5 ± 3,1

Ląstelių gyvybingumas indukuotuose skrepliuose, proc.

64,3 ± 2,07 64,1 ± 3,4 67,2 ± 1,8 68,8 ± 2,1

Epitelio ląstelių kiekis indukuotuose skrepliuose, proc.

14,4 ± 7,5 14,7 ± 4,1 16,2 ± 4,5 17,3 ± 3,5

Bendras ląstelių skaičius, ×106/1g skreplių

5,4±0,2 5,5±0,8 4,4±0,1 4,1±0,6

Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR).

Indukuotų skreplių ląstelių sudėtis vertinta apskaičiavus jų kiekį absoliučiais skaičiais (×106/ml) (5.6.2 lentelė). Eozinofilų kiekis indukuo-tuose skrepliuose prieš bronchų provokaciją alergenu buvo reikšmingai didesnis abiejuose sergančių alergine astma pogrupiuose, lyginant su sergančiais alerginiu rinitu bei sveikais asmenimis. Praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu eozinofilų kiekis sergančių alerginiu rinitu grupėje, sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupiuose reikšmingai padidėjo lyginant su pradiniais duomenimis, o sergančių astma pogrupiuose buvo didesnis nei sergančių alerginiu rinitu.

56

Vertinant neutrofilų kiekį prieš bronchų provokaciją alergenu visose tirtų asmenų grupėse skirtumų nenustatyta. Reikšmingas neutrofilų kiekio padidėjimas buvo stebėtas praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu abiejuose sergančių alergine astma pogrupiuose lyginant su sveikais asmenimis. Praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje, o praėjus 24 val. – ir sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje, nustatytas reikšmingas didesnis neutrofilų kiekis lyginant su sergančiais alerginiu rinitu. Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu neutrofilų kiekis sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija IS padidėjo reikšmingai, lyginant su pradiniais duomenimis.

Limfocitų kiekis sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstruk-cija IS buvo didesnis nei sveikiems asmenims 24 val. prieš ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu ir, 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, jų buvo daugiau nei sergant alerginiu rinitu. Sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje, praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, limfocitų kiekis buvo didesnis sveikų asmenų, o 24 val. – ir lyginant su sergančiais alerginiu rinitu bei pradiniais duomenimis.

Bendras ląstelių kiekis, lyginant su sveikais asmenimis, nustatytas abiejuose sergančių astma pogrupiuose 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos, be to, 24 val. po bronchų provokacijos jis buvo didesnis nei sergant alergi-niu rinitu. Sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstruk-cija pogrupyje 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos buvo reikšmingai padi-dėjęs lyginant su pradiniais duomenimis. Bronchų provokacija su alergenu nepakeitė sveikų asmenų IS ląstelių sudėties.

57

5.6.2 lentelė. Indukuotų skreplių ląstelių sudėties palyginimas sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, alerginiu rinitu bei sveikų asmenų grupėse prieš ir po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu

Ląstelės

Sergantys alergine astma su ankstyva ir vėlyva

obstrukcija (n = 8)

Sergantys alergine astma su ankstyba obstrukcija (n = 7)

Sergantys alerginiu rinitu (n = 13 )

Sveiki asmenys (n = 8)

–24 val.

+7 val.

+24 val.

–24 val.

+7 val.

+24 val.

–24 val.

+7 val.

+24 val.

–24 val.

+7 val.

+24 val.

Eeozinofilai, me-diana (IQR), ×106/ml

0,08 (0,05)*#

0,44 (0,24)*#†

0,65 (0,28)*#†

0,11 (0,04)*#

0,54 (0,28)*#†

0,63 (0,32)*#†

0,03 (0,04)

0,07 (0,02) *†

0,08 (0,03) *†

0,02 (0,2)

0,02 (0,2)

0,02 (0,2)

Neutrofilai, mediana (IQR), ×106/ml

0,85 (0,30)

1,04 (0,40)*†#

1,27 (0,44)*†#

0,87 (0,24)

1,0 (0,83)*

1,19 (0,48)*#

0,71 (0,23)

0,81 (0,27)

0,88 (0,39)

0,81 (0,28)

0,73 (0,11)

0,75 (0,22)

Limfocitai, mediana (IQR), ×106/ml

0,08 (0,02)

0,10 (0,04)*

0,12 (0,09)*†#

0,11 (0,03)*

0,09 (0,08)

0,12 (0,06)*#

0,07 (0,05)

0,09 (0,04)

0,08 (0,03)

0,07 (0,04)

0,07 (0,03)

0,07 (0,01)

Bendras ląstelių kiekis mediana (IQR), ×106/ml

2,25 (0,64)

3,2 (0,25)*#†

3,59 (1,53)*#†

2,68 (0,9)#

2,61 (1,73)*

3,41 (1,65)*#

2,0 (0,74)

2,43 (0,52)

2,51 (0,69) †

2,17 (0,45)

2,01 (0,58)

2,18 (0,45)

*p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis, †p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu.

58

Vertinant kvėpavimo takų uždegimą tirta IL-17 ir IL-5 koncentracija indukuotų skreplių supernatante. Reikšmingai didesnė IL-17 ir IL-5 koncentracija IS nustatyta sergantiems alergine astma ir alerginiu rinitu nei sveikiems asmenimis (p < 0,05) (5.6.1 pav. A ir B). Praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos IL-17 ir IL-5 koncentracijos padidėjo reikšmingai visose sergančių alerginėmis kvėpavimo ligomis grupėse lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,05). Bronchų provokacija alergenu sukėlė IL-17 ir IL-5 koncentracijų padidėjimą IS, ženklesnį sergančių alergine astma grupėje, lyginant su sergančiais alerginiu rinitu (p < 0,05).

5.6.1 pav. Citokinų koncentracija indukuotuose skrepliuose prieš ir po

bronchų provokacijos alergenu sergant alergine astma, alerginiu rinitu ir sveikiems asmenims: IL-17(A); IL-5 (B).

Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 8); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 13); AA – sergantys alergine astma asmenys (n = 15); *p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis, †p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu.

Reikšmingai didesnė IL-17 ir IL-5 koncentracija IS nustatyta sergantiems alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, lyginant su sveikais asmenimis (p < 0,05) (5.6.2 pav.). Praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos, IL-17 ir IL-5 koncentracijos padidėjo reikšmingai visose sergančių alerginėmis kvėpavimo ligomis grupėse, lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,05). Sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje, lyginant su kitu sergančių alergine astma pogrupiu, praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, nustatytos didesnės IL-17 ir IL-5 koncentracijos (p < 0,05).

59

5.6.2 pav. Citokinų koncentracija indukuotuose skrepliuose prieš ir po bronchų provokacijos alergenu sergant alergine astma su ankstyva bei

ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, alerginiu rinitu ir sveikiems asmenims: IL-17 (A); IL-5 (B).

Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 8); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 13); AA (ankstyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva bronchų obstrukcija (n = 7); AA (ankstyva ir vėlyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija (n = 8); *p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis, †p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,05– lyginant su sergančiais alerginiu rinitu; $p < 0,05 – lyginant su sergančiais alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija.

Sergantiems alergine astma asmenims, kuriems bronchų provokacija alergenu sukėlė ankstyva bei ankstyvą ir vėlyva bronchų obstrukciją, pra-ėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu nustatomas didesnis eozino-filų kiekis periferiniame kraujyje, lyginant su sveikai asmenimis (p < 0,05) (5.6.3 lentelė). Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija kraujyje eozinofilų kiekis padidėjo reikšmingai, lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,05). Neutrofilų ir limfocitų kiekio periferiniame kraujyje pokyčių bronchų provokacija alergenu nesukėlė nei vienoje iš tiriamųjų grupių.

60

5.6.3 lentelė. Periferinio kraujo ląstelių sudėties palyginimas sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, alerginiu rinitu ir sveikų asmenų grupėse prieš ir po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu

Požymis

Sergentys alergine astma su ankstyva obstrukcija (n = 7)

Sergantys alergine astma su ankstyva ir vėlyva

obstrukcija (n = 8)

Sergantys alerginiu rinitu (n = 13)

Sveiki asmenys (n = 8)

–24 val.

+7 val.

+24 val.

–24 val.

+7 val.

+24 val.

–24 val.

+7 val.

+24 val.

–24 val.

+7 val.

+24 val.

Eozinofilai, mediana (IQR), ×109/l

0,25 (0,10)*

0,23 (0,20)

0,28 (0,15)*

0,25 (0,44)

0,24 (0,45)

0,40 (0,30)*†

0,16 (0,29)

0,21 (0,35)

0,21 (0,58)†

0,16 (0,12)

0,16 (0,14)

0,14 (0,19)

Neutrofilai, mediana (IQR), ×109/l

2,89 (1,14)

3,70 (0,71)

2,68 (0,52)

3,55 (1,87)

3,01 (1,67)

2,58 (1,93)

3,50 (1,34)

3,43 (1,16)

3,54 (1,79)

3,69 (1,48)

3,56 (1,00)

3,06 (1,50)

Limfocitai, mediana (IQR), ×109/l

2,23 (0,61)

2,22 (0,92)

1,95 (0,33)

1,60 (0,55)

2,12 (0,66)

1,84 (0,21)

2,06 (0,59)

1,94 (0,86)

1,80 (0,68)

1,71 (0,60)

1,80 (0,54)

1,71 (0,55)

*p < 0,05 lyginant su sveikais asmenimis; †p < 0,05 lyginant su pradiniais duomenimis.

61

Th17 limfocitų kiekis periferiniame kraujyje ir IL-17 koncentracija serume prieš bronchų provokaciją alergenu buvo reikšmingai didesnė visų sergančių alerginėmis kvėpavimo ligomis asmenų grupėse, lyginant su sveikais asmenimis (p < 0,05) (5.6.3 pav. A ir C). Th17 limfocitų ir IL-17 kiekis sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija grupėje padidėjo reikšmingai lyginant su pradiniais duomenimis 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu ir tuo metu buvo didesnis nei sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje, sergančių alerginiu rinitu bei sveikų asmenų grupėse (p < 0,05). Th2 limfocitų kiekis periferiniame kraujyje ir IL-5 koncentracija serume prieš bronchų provo-kaciją alergenu buvo reikšmingai didesnė abiejuose sergančių alergine astma pogrupiuose bei sergantiems alerginiu rinitu lyginant su sveikais asmenimis (p < 0,05) (5.6.3 pav. B ir D). Th2 limfocitų kiekis padidėjo reikšmingai praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,05), o sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje šių ląstelių padidėjimas nustatytas tik praėjus 24 val. (p < 0,05). Reikšmingas IL-5 koncentracijos serume padidėjimas nu-statytas praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu visų sergančių alerginėmis kvėpavimo ligomis grupėse, lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,05).

62

5.6.3 pav. Periferinio kraujo T limfocitų pagalbininkų ir citokinų kiekis prieš ir po bronchų provokacijos alergenu, sergant alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, alerginiu rinitu ir

sveikiems asmenims: Th17(A); Th2(B); IL-17 (C); IL-5 (D). Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 8); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 13); AA (ankstyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva bronchų obstrukcija (n = 7); AA (ankstyva ir vėlyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ir ankstyva, ir vėlyva bronchų obstrukcija (n = 8); *p < 0,05–lyginant su sveikais asmenimis, †p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu; $p < 0,05 – lyginant su sergančiais alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija.

63

Siekiant įvertinti galimą ryšį tarp kvėpavimo takų ir sisteminio užde-gimo sergant alergine astma, ieškota reikšmingų sąsajų tarp uždegimo žy-menų kiekio periferiniame kraujyje (IL-17, IL-5, Th17 limfocitų, Th2 limfo-citų, eozinofilų, neutrofilų) ir IS (IL-17, IL-5, eozinofilų, neutrofilų, limfocitų). Prieš bronchų provokaciją alergenu, sergančių alergine astma grupėje, reikšmingų sąsajų tarp uždegimo ląstelių ir citokinų periferiniame kraujyje bei IS nenustatyta. Praėjus 7 val. po bronchų provokacijos aler-genu, nustatyta reikšminga teigiama sąsaja tarp serumo ir IS IL-5 koncent-racijos (r = 0,593, p = 0,02). Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos aler-genu, reikšminga teigiama sąsaja nustatyta tarp periferinio kraujo Th2 limfocitų ir serumo IL-5 (r = 0,799, p = 0,01), IS IL-5 koncentracijos (r = 0,449, p = 0,01), eozinofilų kiekio IS (r = 0,754, p = 0,01). Th17 limfocitų kiekis periferiniame kraujyje reikšmingai teigiamai siejosi su IL-17 kon-centracija serume (r=0,649, p=0,009) ir IS (r = 0,583, p = 0,022) (5.6.4 pav.). IS IL-17 koncentracija reikšmingai teigiamai siejosi su IL-17 koncentracija serume (r = 0,536, p = 0,039), o IL-17 koncentracija IS tei-giamai siejosi su neutrofilų kiekiu (r = 0,549, p = 0,034). Reikšmingų sąsajų tarp IL-5 ir neutrofilų ar IL-17 ir eozinofilų periferiniame kraujyje ir IS nerasta nei prieš, nei po bronchų provokacijos alergenu.

64

5.6.4 pav. Sąsajos tarp vietinio ir sisteminio uždegimo žymenų

(Th17 limfocitų, neutrofilų, IL-17) sergant alergine astma praėjus 24 val. po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu

Alergine astma sergančių (n = 15): A – Th17 limfocitų kiekis periferiniame kraujyje reikšmingai teigiamai siejasi su IL-17 koncentracija indukuotuose skrepliuose (●) (r = 0,583, p = 0,022) ir serume (Δ) (r = 0,649, p = 0,009); B –indukuotų skreplių IL-17 koncentracija teigiamai siejasi su IL-17 koncentracija serume (r = 0,536, p = 0,039); C – IL-17 koncentracija teigiamai siejasi su neutrofilų kiekiu indukuotuose skrepliuose (r = 0,549, p = 0,034); r – Spearman koreliacijos koeficientas; p – reikšmingumo lygmuo.

5.7. Sergančiųjų alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija periferinio kraujo citokinų ir uždegimo

ląstelių kiekis bei jų tarpusavio sąsajos

Sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje bei sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija po-grupyje, nustatytas reikšmingai didesnis Th17 limfocitų kiekis lyginant su sveikais asmenimis (1,3 ± 0,2 ir 1,5 ± 0,4 proc. vs. 0,5 ± 0,2 proc., p < 0,001 abiem atvejams) (5.7.1 pav. A). Abiejuose sergančių alergine astma pogru-piuose nustatytas reikšmingai mažesnis Th1 limfocitų kiekis periferiniame kraujyje nei sveikiems asmenims (10,0 ± 2,3 proc. bei 9,2 ± 2,4 proc. vs. 12,0 ± 1,5, p < 0,05 abiem atvejams) (5.7.1 pav. B). Reikšmingai didesnis

65

Th2 limfocitų kiekis nustatytas sergantiems alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija bei sergantiems alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija lyginant su sveikais asmenimis (3,7 ± 0,4 proc. bei 3,7 ± 1,1 proc. vs. 1,6 ± 0,1 proc., p < 0,001 abiem atvejams) (5.7.1 pav. C).

5.7.1 pav. T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijos sergančių

alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, alerginiu rinitu ir sveikų asmenų periferiniame kraujyje:

Th17(A), Th1 (B), Th2(C) limfocitai. Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 20); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); AA (ankstyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva bronchų obstrukcija (n = 16); AA (ankstyva ir vėlyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija (n = 14).

66

Norėdami patikslinti sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija vietinio ir sisteminio uždegimo savybes, ieškojome są-sajų tarp uždegimo ląstelių ir žymenų bei plaučių funkcijos ir padidinto nespecifinio bronchų reaktyvumo metacholinui. Th17 limfocitų kiekis periferiniame kraujyje prieš bronchų provokaciją alergenu reikšmingai teigiamai siejosi su metacholino Log PD20 vertėmis (r=–0,713; p=0,004) sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje (5.7.2 pav.). Sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje tokia sąsaja buvo statistiškai nepatikima.

5.7.2 pav. Sąsaja tarp Th17 limfocitų kiekio periferiniame kraujyje ir

metacholino PD20 sergant alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija.

r – Spearman koreliacijos koeficientas; p –reikšmingumo lygmuo.

Sergant alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obst-rukcija, nustatyta reikšmingai didesnė IL-17 koncentracija serume, lyginant su sveikais asmenimis (4,1 ± 1,9 pg/ml bei 3,9 ± 1,9 pg/ml vs. 1,1 ± 1,5 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejams) (5.7.3 pav. A). IL-8 koncentracija serume sergantiems alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija buvo reikšmingai didesnė nei sveikiems asmenims (18,5 ± 2,3 pg/ml ir 18,3 ± 4,1 pg/ml vs. 9,6 ± 1,5 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejams). Sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija serume, lyginant su sergančiais alerginiu rinitu, nustatyta reikšmingai didesnė IL-8 koncentracija (p < 0,001 abiems atvejams) (5.7.3 pav. B). Reikšmingai didesnė IL-5 koncentracija serume nustatyta sergantiems alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų

67

obstrukcija lyginant su sveikais asmenimis (46,1 ± 2,7 pg/ml ir 46,8 ± 2,7 pg/ml vs.16,8 ± 1,3 pg/ml, p < 0,001 abiems atvejams), o taip pat su sergančiais alerginiu rinitu (p < 0,001 ir p < 0,05, atitinkamai) (5.7.3 pav. C).

5.7.3 pav. Citokinų koncentracija sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, sergančių alerginiu rinitu

ir sveikų asmenų periferinio kraujo serume: IL-17 (A), IL-8 (B), IL-5 (C). Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 20); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); AA (ankstyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva bronchų obstrukcija (n = 16); AA (ankstyva ir vėlyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva ir vėlyva bronchų obstruk-cija (n = 14).

68

Po bronchų provokacijos alergenu sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija periferiniame kraujyje nustatytas reikšmingai didesnis Th17 limfocitų kiekis praėjus 7 val. (1,7 ± 0,6 proc. ir 2,7 ± 0,9 proc. vs. 0,5 ± 0,2 proc., p < 0,001) ir 24 val. (1,9 ± 0,3 proc. ir 2,9 ± 0,6 proc. vs. 0,5 ± 0,2 proc., p < 0,001) po bronchų provokacijos su D. pterony-ssinus alergenu, lyginant su sveikais asmenimis (5.7.4 pav. A). Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija periferiniame kraujyje, nustatytas reikšmingai didesnis Th17 limfocitų kiekis, lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,001). Sergančių alerginė astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija grupėje, praėjus 7 val. ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, nustatytas reikšmingai didesnis šių ląstelių kiekis lyginant su sergančiais alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija (p < 0,01) bei sergančiais alerginiu rinitu (p < 0,05), o taip pat su pradiniais duomenimis (p < 0,001).

Praėjus 7 val. po bronchų provokacijos alergenu sergantiems alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija, lyginant sveikais asmenimis, stebimas reikšmingas Th1 limfocitų kiekio sumažėjimas (9,2 ± 1,9 proc. vs. 12,0 ± 1,9 proc., p < 0,001) (5.7.4 pav. B). Sergantiesiems alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, lyginant sveikais asmenimis, stebimas šių ląstelių kiekio sumažėjimas praėjus ir 7 val. (10,0 ± 2,9 proc. vs. 12,0 ± 1,9 proc., p < 0,05), ir 24 val. (9,1 ± 1,3 proc. vs. 12,0 ± 5,2 proc.; p < 0,01) po bronchų provokacijos alergenu.

Sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupėse, lyginant sveikais asmenimis, nustatytas reikšmingai didesnis Th2 limfocitų kiekis praėjus 7 val. (4,3 ± 1,1 proc. ir 4,9 ± 1,2 proc. vs. 1,7 ± 0,1 proc., p < 0,001 abiem atvejais) ir 24 val. (5,6 ± 0,8 proc. ir 5,3 ± 1,1 proc.vs. 1,6 ± 0,1 proc., p < 0,001 abiem atvejais) po bronchų provokacijos alergenu (5.7.4 pav. C). Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija periferiniame kraujyje nustatytas reikšmingas Th2 limfocitų kiekio padidėjimas, lyginant su pradiniais duomenimis (p < 0,001). Sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija grupėje, praėjus 7 val. ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, nustatytas reikšmingai didesnis šių ląstelių kiekis, lyginant su pradiniams duomenimis (p < 0,01 ir p < 0,001, atitinkamai). Po provokacijos abiejų sergančių astma pogrupiuose – su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva obstrukcija – nustatytas reikšmingai didesnis Th2 limfocitų kiekis, lyginant su alerginiu rinitu: 7 val. (4,3 ± 1,1 ir 4,9 ± 1,2 proc. vs. 2,9 ± 0,2 proc., p < 0,05 ir p < 0,001 atitinkamai) ir 24 val. (5,6 ± 0,8 ir 5,3 ± 1,1 proc. vs. 3,8 ± 0,2 proc., p < 0,001 ir p < 0,01, atitinkamai).

69

Sveikų asmenų grupėje T limfocitų pagalbininkių subpopuliacijų poky-čių po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu – nenustatyta.

5.7.4 pav. Bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu sukelti

T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijų pokyčiai sergantiems alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, alerginiu

rinitu ir sveikiems asmenims: Th17 (A), Th1 (B), Th2 (C) limfocitai. Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 20); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); AA (ankstyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva bronchų obstrukcija (n = 16); AA (ankstyva ir vėlyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asme-nys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ir ankstyva, ir vėlyva bronchų obstrukcija (n = 14); *p < 0,01; **p < 0,01; ***p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis; †p < 0,001; ††p < 0,01; †††p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, # p < 0,001; ##p < 0,01; ###p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu.

Vertindami T limfocitų subpopuliacijų santykių pokyčius bei jų skirtu-mus tarp sergančių alergine astma asmenų pogrupių, stebime ženklų Th17/ Th1 bei Th17/Th2 limfocitų santykių padidėjimą praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, ryškesnį sergančiųjų alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje (5.7.1 lentelė). Tuo tarpu sergančių

70

alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje, praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, nustatytas ženklesnis lyginant su sergan-čiais alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija Th17/Th2 santykio padidėjimas.

5.7.1 lentelė. Sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija periferinio kraujo T limfocitų pagalbininkų subpopu-liacijų santykis.

Požymis –24 val. +7 val. +24 val.

Serg

anty

s ale

rgin

e as

tma

(n=3

0)

su ankstyva obstrukcija (n = 16) Th17/Th1 Th17/Th2 Th1/Th2

0,13 ± 0,06* 0,36 ± 0,07

2,61 ± 0,16*

0,18 ± 0,04* 0,38 ± 0,13

2,08 ± 0,49*#

0,21 ± 0,07*† 0,34 ± 0,10†*$ 1,61 ± 0,30*#†

su ankstyva ir vėlyva obstrukcija (n=14) Th17/Th1 Th17/Th2 Th1/Th2

0,14 ± 0,06* 0,39 ± 0,19

2,47 ± 1,05*

0,28 ± 0,14*#† 0,46 ± 0,17*† 1,89 ± 0,70*#†

0,33 ± 0,10*#$† 0,54 ± 0,18*# 1,64 ± 0,36*#†

Sveiki asmenys (n=20) Th17/Th1 Th17/Th2 Th1/Th2

0,04 ± 0,01 0,32 ± 0,21 7,11 ± 3,86

0,04 ± 0,02 0,30 ± 0,14 7,36 ± 2,17

0,05 ± 0,04 0,34 ± 0,10 7,95 ± 5,29

Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR) ; *p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis; †p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu; $p < 0,05 – lyginant su sergančiais alergine astma, kuriems po bronchų provokacijos alergenu išsivystė ankstyva bronchų obstrukcija.

Ištyrus periferinio kraujo ląstelių sudėtį matome, kad abiejuose sergančių alergine astma pogrupiuose nustatytas didesnis eozinofilų kiekis procentais, lyginant su sveikais asmenimis (5.7.2 lentelė). Praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu reikšmingai didesnis absoliutus ir santykinis eozinofilų kiekis nustatytas abiejuose sergančių alergine astma pogrupiuose, lyginant su sveikais asmenimis. Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, lyginant su pradiniais duomenimis, nustatytas reikšmingas eozinofilų kiekio padidėjimas vertinant absoliučiais ir santykiniais dydžiais sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje. O sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje 24 val. po bronchų provokacijos alergenu nustatomas reikšmingai didesnis santykinis eozinofilų kiekis, lyginant su sergančiais alerginiu rinitu. Bronchų provokacija alergenu sveikų asmenų periferinio kraujo ląstelių sudėties nepakeitė.

71

5.7.2 lentelė. Sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija periferinio kraujo ląstelių sudėtis.

Požymis –24 val. +7 val. +24 val. Sergantys alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija (n = 16) Leukocitai, ×109l Eozinofilai, proc. Eozinofilai, ×109l Neutrofilai, proc. Neutrofilai, ×109l Limfocitai, proc. Limfocitai, ×109l

6,0 (1,3) 5,1 (1,7)* 0,3 (0,1)

60,3 (12,2) 3,7 (1,0)

29,3 (10,6) 1,8 (0,0)

5,9 (1,4) 5,3 (2,1)* 0,3 (0,2)*

60,3 (12, 2) 3,6 (1,5) 29,1(9,1) 1,7 (0,4)

6,4 (1,8) 6,5 (2,4)* † 0,3 (0,1)* † 58,0(11,4) 3,7 (1,6)

29,4 (8,5) 1,9 (0,8)

Sergantys alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija (n = 14) Leukocitai, ×109l Eozinofilai, proc. Eozinofilai, ×109l Neutrofilai, proc. Neutrofilai, ×109l Limfocitai, proc. Limfocitai, ×109l

5,9 (3,2) 5,5 (4,2)* 0,3 (0,4)

62,3 (9,7) 3,7 (2,2)

24,8 (9,8) 1,5 (0,7)

5,5 (2,5) 5,4 (3,2)* 0,3 (0,3)* 62,7 (7,9) 3,2 (1,5)

24,5 (8,6) 1,5 (0,8)

6,1 (2,8) 6,3 (3,4)*# 0,3 (0,3)* 60,3 (7,9) 3,4 (2,0)

30,2 (10,2) 1,9 (0,7)

Sveiki asmenys (n = 20) Leukocitai, ×109l Eozinofilai, proc. Eozinofilai, ×109l Neutrofilai, proc. Neutrofilai, ×109l Limfocitai, proc. Limfocitai, ×109l

5,4 (1,7) 2,9 (2,0) 0,1 (0,1)

55,1 (12,8) 3,1 (1,2)

32,2 (8,7) 1,6 (0,9)

5,4 (1,5) 3,2 (1,4) 0,1 (0,1)

59,4 (3,4) 3,0 (1,0)

29,8 (8,1) 1,6 (0,3)

5,3(1,8) 3,3 (1,2) 0,2 (0,1)

60,0 (5,7) 3,3 (1,1)

30,0 (8,0) 1,7 (0,6)

Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); *p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis; †p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,05 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu.

Norėdami nustatyti sisteminio uždegimo tarp sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija bei sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupiuose skirtumus, ieškojome periferinio kraujo citokinų ir uždegimo ląstelių tarpusavio sąsajų. Sergantiems alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija nustatoma reikšminga teigiama sąsaja tarp Th2 limfocitų, IL-5 bei eozinofilų, tuo tarpu kitame sergančių astma pogrupyje – tarp Th2 limfocitų ir IL-5 kiekio periferiniame kraujyje (5.7.3 lentelė). Th17 limfocitų kiekis reikšmingai teigiamai siejosi su bendru limfocitų kiekiu sergančiųjų alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje. Praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, abiejų sergančių alergine astma pogrupiuose nustatyta reikšminga

72

teigiama sąsaja tarp Th2 limfocitų, IL-5 ir eozinofilų kiekio. Praėjus 7 val. po bronchų provokacijos alergenu, sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje reikšmingai teigiamai siejosi Th17 limfocitų, IL-17, eozinofilų, neutrofilų kiekis periferiniame kraujyje. Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje, nustatyta reikšminga teigiama sąsaja tarp Th17 ir IL-17 bei neutrofilų kiekio periferiniame kraujyje, tuo tarpu sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje tokių sąsajų nenustatyta.

5.7.3 lentelė. Sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija periferinio kraujo citokinų ir uždegimo ląstelių tarpusavio sąsajos prieš ir po bronchų provokaciją alergenu.

IL-5 (pg/ml)

IL-8 (pg/ml)

IL-17 (pg/ml)

Eozino-filai

(proc.)

Neutrofilai (proc.)

Limfo-citai

(proc.)

–24

val. Th2

lim

foci

tai

(pro

c.)

AA (A)

r=0,583; p=0,018

r=–0,121; p=0,656

r=–0,142; p=0,600

r=–0,441; p=0,088

r=0,742; p=0,056

r=–0,561; p=0,064

AA (V)

r=0,788; p=0,001

r=–0,091; p=0,785

r=–0,048; p=0,869

r=0,802; p=0,001

r=0,541; p=0,066

r=–0,647; p=0,062

SA r=–0,479; p=0,063

R=0,098; p=0,682

r=0,359; p=0,120

r=–0,044; p=0,853

r=–0,017; p=0,945

r=0,422; p=0,064

Th1

7 lim

foci

tai

(pro

c.)

AA (A)

r=–0,366; p=0,164

r=–0,139; p=0,607

r=–0,010; p=0,907

r=–0,017; p=0,950

r=–0,459; p=0,073

r=0,698; p=0,003

AA (V)

r=–0,104; p=0,724

r=0,058; p=0,845

r=0,313; p=0,092

r=0,247; p=395

r=–0,335; p=0,241

r=0185; p=0,526

SA r=–0,004; p=0,987

r=–0,033; p=0,889

r=0,023; p=0,923

r=0,357; p=0,123

r=–0,102; p=0,667

r=–0,375; p=0,103

+7 v

al. Th2

lim

foci

tai

(pro

c.)

AA (A)

r=0,689; p=0,003

r=0,078; p=0,775

r=0,195; p=0,469

r=0,502; p=0,048

r=–0,069 p=0,801

r=–0,119; p=0,660

AA (V)

r=0,667; p=0,009

r=–0,056; p=0,850

r=0,311; p=0,279

r=0,661; p=0,010

r=0,139; p=0,636

r=–0,144; p=0,623

SA r=–0,218; p=0,365

r=0,157; p=0,509

r=–0,028; p=0,908

r=–0,108; p=0,649

r=0,081; p=0,736

r=–0,216; p=0,360

Th1

7 lim

foci

tai

(pro

c.)

AA (A)

r=–0,398; p=0,127

r=–0,007; p=0,980

r=–0,397; p=0,128

r=–0,746; p=0,001

r=0,142; p=0,601

r=–0,106; p=0,695

AA (V)

r=–0,034; p=0,907

r=–0,596; p=0,054

r=0,617; p=0,019

r=0,066 p=0,019

r=0,572; p=0,032

r=–0,322; p=0,262

SA r=–0,210; p=0,375

r=0,432; p=0,057

r=–0,163; p=0,493

r=–0,094; p=0,694

r=0,123; p=0,606

r=–0,212; p=0,370

73

5.7.3 lentelės tęsinys.

IL-5 (pg/ml)

IL-8 (pg/ml)

IL-17 (pg/ml)

Eozino-filai

(proc.)

Neutrofilai (proc.)

Limfo-citai

(proc.)

+24

val.

Th2

lim

foci

tai

(pro

c.)

AA (A)

r=0,477; p=0,042

r=0,281; p=0,292

r=–0,369; p=0,160

r=0,757; p=0,001

r=0,082; p=0,762

r=–0,184; p=0,495

AA (V)

r=0,769; p=0,001

r=0,233; p=0,423

r=0,378; p=0,182

r=0,685; p=0,007

r=0,140; p=0,633

r=–0,200; p=0,494

SA r=0,145; p=0,542

r=–0,494; p=0,067

r=0,058; p=0,808

r=0,157; p=0,509

r=0,091; p=0,704

r=–0,143; p=0,548

Th1

7 lim

foci

tai

(pro

c.)

AA (A)

r=0,265; p=0,322

r=–0,041; p=0,879

r=–0,181; p=0,503

r=–0,058; p=0,832

r=–0,441; p=0,088

r=0,356; p=0,417

AA (V)

r=–0,170; p=0,561

r=0,252; p=0,384

r=0,785; p=0,001

r=0,137; p=0,642

r=0,606; p=0,022

r=–0,362; p=0,203

SA r=0,308; p=0,186

r=–0,030; p=0,899

r=0,235; p=0,319

r=–0,242; p=0,304

r=–0,057; p=0,813

r=0,020; p=0,934

SA – sveiki asmenys (n = 20); AA (A) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva bronchų obstrukcija (n = 16); AA (V) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija (n = 14); r – Spearman koreliacijos koeficientas; p – reikšmingumo lygmuo.

Sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija serume, lyginant su sveikais asmenimis, nustatyta reikšmingai didesnė IL-17 koncentracija: praėjus 7 val. (7 ± 1,4 ir 8,8 ± 1,9 pg/ml vs. 1,9 ± 1,2 pg/ml, p < 0,001, abiem atvejams) bei 24 val. (28,9 ± 1,8 ir 12,4 ± 2,8 pg/ml vs. 2 ± 1,9 pg/ml, p < 0,001, abiems atvejams) po bronchų provoka-cijos alergenu (5.7.5 pav. A). Po bronchų provokacijos alergenu praėjus 24 val., sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje, o praėjus 7 val. ir 24 val. – sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje, lyginant su pradiniais duomenimis, nustatyta reikšmingai padidėjusi serumo IL-17 koncentracija (p < 0,001). Sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje, praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, nustatyta reikšmingai padi-dėjusi IL-17 koncentracija serume, lyginant su kitu sergančių alergine astma pogrupiu (p < 0,001), o taip pat ir sergančiais alerginiu rinitu (p < 0,001).

74

Sergantiesiems alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bron-chų obstrukcija lyginant sveikais asmenimis stebimas reikšmingas IL-8 koncentracijos serume padidėjimas: praėjus 7 val. (18,7 ± 2,6 ir 21 ± 4,2 pg/ml vs. 10,1 ± 1,3 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejams) bei 24 val. (20,1 ± 2 ir 26,4 ± 2,7 pg/ml vs. 9,3 ± 1,8 pg/ml, p < 0,001 abiem atvejams) po bron-chų provokacijos alergenu (5.7.5 pav. B). Reikšmingas IL-8 koncentracijos padidėjimas lyginant su pradiniais duomenimis nustatytas sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje praėjus 7 ir 24 val. (p < 0,01 abiem atvejams), o sergančiųjų alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje – praėjus 24 val. (p < 0,001) po bronchų pro-vokacijos alergenu. Sergančių alergine astma su ankstyva bronchų obstruk-cija pogrupyje nustatytas didesnis IL-8 kiekis, lyginant su sergančiais aler-gine astma su ankstyva bronchų obstrukcija bei sergančiais alerginiu rinitu, praėjus 7 (p < 0,01 ir p < 0,05, atitinkamai) ir 24 val. (p < 0,001 abiem atvejams) po bronchų provokacijos alergenu.

Reikšmingai didesnė IL-5 koncentracija serume nustatyta sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupiuose, lyginant su sveikais asmenimis, praėjus 7 val. (51,9 ± 1,4 ir 54,6 ± 4,4 pg/ml vs. 16,7 ± 2,3 pg/ml, p < 0,001 visiems atvejams) ir 24 val. (51,4 ± 2,1, 67,5 ± 2,7 pg/ml ir 71,6 ± 5 pg/ml vs. 17,6 ± 1,9 pg/ml, p < 0,001 visiems atvejams) po bronchų provokacijos (5.7.5 pav. C). Abiejuose sergančių alergine astma pogrupiuose, lyginant su sergančių alerginiu rinitu grupe, praėjus 7 val. ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu nustatyta reikšmingai didesnė IL-5 koncentracija (p < 0,001). Reikšmingas IL-5 kon-centracijos padidėjimas sergančiųjų alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, lyginant su kitu sergančiųjų alergine astma pogrupiu, nustatytas praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu (p < 0,05 ir p < 0,01, atitinkamai). Reikšmingas IL-5 koncentracijos padidėjimas, lygi-nant su pradiniais duomenimis, nustatytas sergančiųjų alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupyje praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu (p < 0,01 abiem atvejais), o taip pat ir sergančiųjų alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija pogrupyje (p < 0,01 ir p < 0,001, atitinkamai).

Sveikų asmenų grupėje IL-5, IL-8, IL-17 koncentracija po bronchų pro-vokacijos su D. pteronyssinus alergenu nekito.

75

5.7.5 pav. Bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu sukelti

citokinų koncentracijos serume pokyčiai sergantiems alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, alerginiu rinitu ir

sveikiems asmenims: IL-17 (A), IL-8 (B), IL-5 (C).

Duomenys pateikti: mediana ± tarpkvartilinis plotis (IQR); SA – sveiki asmenys (n = 20); AR – asmenys, sergantys alerginiu rinitu (n = 30); AA (ankstyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ankstyva bronchų obstrukcija (n = 16); AA (ankstyva ir vėlyva obstrukcija) – sergantys alergine astma asmenys, kuriems po bronchų provokacijos išsivystė ir ankstyva, ir vėlyva bronchų obstrukcija (n = 14); *p < 0,001; **p < 0,01; ***p < 0,05 – lyginant su sveikais asmenimis, †p < 0,001; ††p < 0,01; †††p < 0,05 – lyginant su pradiniais duomenimis, #p < 0,001; ###p < 0,001 – lyginant su sergančiais alerginiu rinitu; $p < 0,001; $$p < 0,01; $$$p < 0,05 – lyginant su sergančiais alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija.

76

6. REZULTATŲ APTARIMAS

6.1. 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų bei interleukino-17 reikšmė sergant alergine astma

Atliekant šį mokslinį tyrimą vertintas kvėpavimo takų ir sisteminis uždegimas sergant alergine astma, analizuoti pagrindiniai šio uždegimo mechanizmo komponentai – T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijos. Šio tyrimo metu buvo tirtos Th17, Th1 ir Th2 limfocitų subpopuliacijos, o sisteminis imuninis atsakas į alergeną vertintas analizuojant šių T limfocitų subpopuliacijų dydžius periferiniame kraujyje. Išskirtinis tyrimo modelis, bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu, leido įvertinti dinamiš-kus T limfocitų subpopuliacijų pokyčius vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimo metu.

Vietinio kvėpavimo takų imuninio atsako ypatumai vertinti analizuojant indukuotų skreplių citokinų ir uždegimo ląstelių sudėtį bei šių uždegimo žymenų pokyčius, nustatytus po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu. Nustatytos sąsajos tarp šių humoralinių ir ląstelinių uždegimo žy-menų indukuotuose skrepliuose ir periferiniame kraujyje teigia apie kvėpa-vimo takų uždegimo ligos sisteminius pokyčius.

Atlikto tyrimo rezultatai patvirtino T limfocitų pagalbininkų subpopu-liacijų kiekybinius pokyčius sergant alergine astma, lyginant su sveikais asmenimis. Nustatytos vyraujančios Th2 ir Th17 limfocitų subpopuliacijos bei bronchų provokacijos alergenu sukelti jų kiekybiniai pokyčiai sergančių alergine astma periferiniame kraujyje. Naujas ir išskirtinai reikšmingas tyri-mo rezultatas yra tas, kad ženkliausi Th17 limfocitų kiekio pokyčiai nusta-tomi vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimo metu ir yra būdingi asme-nims, kuriems bronchų provokacija su alergenu sukelia ankstyvą ir vėlyvą bronchų obstrukciją.

Svarbus mūsų tyrimo radinys yra uždegimą skatinančio citokino IL-17 koncentracijos kvėpavimo takuose ir periferinio kraujo serume pokyčiai. Šio citokino biologinis vaidmuo siejamas su neutrofiliniu kvėpavimo takų uždegimu, sunkesne astmos eiga. Bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu sukeltas IL-17 koncentracijos indukuotų skreplių supernatante ir periferinio kraujo serume padidėjimas vėlyvos fazės kvėpavimo takų užde-gimo metu bei uždegimo ląstelių kvėpavimo takuose sudėties pokyčiai nuro-do IL-17 svarbą uždegimo sergant alergine astma vystymuisi.

Vertindami vietinius ir sisteminius vėlyvos fazės kvėpavimo takų užde-gimo sergant astma ypatumus nustatėme, kad ženkliausi Th17 limfocitų ir IL-17 kiekio pokyčiai stebimi sergančiųjų alergine astma pogrupyje, kuriems

77

bronchų provokacija alergenu sukelia ankstyvą ir vėlyvą bronchų obstruk-ciją. Šis radinys galėtų būti svarbus aiškinant astmos išsivystymą bei išski-riant šį klinikinį astmos fenotipą iš kitų tarpo.

Šio tyrimo metu nustatėme padidėjusį Th17 limfocitų kiekį sergančių alergine astma periferiniame kraujyje, lyginant su sveikais asmenimis. Ap-žvelgiame kitų mokslininkų skelbiamus duomenis. Zhao su bendraautoriais nustatė, kad IL-17 gaminančios ir išskiriančios ląstelės cirkuliuoja sergančių alergine astma periferiniame kraujyje, be to, jų kiekis yra susijęs su aler-ginės ligos sunkumu [200]. Milovanovic su bendradarbiais nustatė padidintą IL-17 išskiriančių ląstelių kiekį sergant alerginėmis ligomis ir nustatė tiesioginį šio citokino stimuliuojantį poveikį B ląstelėms ir IgE gamybai [120]. IL-17 ir jį gaminančių T limfocitų reikšmę alerginės astmos eigai įžvelgia ir kiti tyrėjai. Albano su bendraautoriais tyrė vaikus, sergančius alergine astma, kuriems periferinio kraujo T limfocituose nustatė didesnę viduląstelinio IL-17A ir transkripcijos veiksnio RORγt, bet mažesnę Foxp3 (angl. forkhead box P3) raišką T limfocituose, kartu su padidėjusiu IL-17A serume kiekiu [7]. Šis Th17 limfocitų ir Treg limfocitų santykio nuokrypis Th17 limfocitų imuninio atsako naudai parodo uždegimą skatinančio imuni-nio atsako įsigalėjimą sergant alergine astma. Ne tik sergantiems alergine astma, bet ir sergantiems alerginiu rinitu periferinio kraujo mėginiuose nu-statomi IL-17 išskiriantys T limfocitai. Ciprandi su bendraautoriais nustatė didesnį kiekį šių IL-17 išskiriančių CD4+ T limfocitų sergančių alerginiu rinitu periferiniame kraujyje, kuomet stimuliavo periferinio kraujo ex vivo mėginius su D. farinae alergeno ekstraktu [38]. Lygindamas alergine ir nealergine astma sergančiuosius Hashimoto su bendraautoriais nustatė, kad tik sergančių alergine astma periferinio kraujo T limfocitai, paskatinti D. farinae alergeno, gamina ir išskiria didesnį kiekį IL-17, lyginant su sergan-čiais nealergine astma [73]. Tyrėjai pastebi, kad mechanizmas, reguliuo-jantis šių limfocitų diferenciaciją, yra skirtingas nuo to, kuris reglamentuoja kitų T limfocitų subpopuliacijų, t. y. Th1 ir Th2 limfocitų vystymąsi.

Kaip ir tikėjomės, alergine astma ir alerginiu rinitu sergančių pacientų periferiniame kraujyje nustatytas didesnis Th2 limfocitų kiekis lyginant su sveikais asmenimis. Žinoma, kad ši T limfocitų pagalbininkų subpopuliacija yra viena svarbiausių ląstelių astmos patogenezėje. Ji gamina eilę citokinų bei chemokinų, dalyvaujančių lėtinio neinfekcinio uždegimo kvėpavimo takuose ir visame organizme vystymesi. Šie rezultatai patvirtina jau ilgą laiką įsitvirtinusią nuostatą, kad alerginė astma yra vyraujančio Th2 limfo-citų imuninio atsako liga [78]. Th1 limfocitai ir jų išskiriami mediatoriai ilgą laiką laikyti svarbiais alerginį uždegimą slopinančiais veiksniais. Tačiau yra tyrimai, siejantys citokino IFN-γ kiekį su nealergine astma ir/arba

78

sunkesne ligos eiga [179]. Mes nustatėme mažesnį Th1 limfocitų kiekį ser-gantiems alergine astma, lyginant su sergančiais alerginiu rinitu bei sveikais asmenims.

Duomenys rodo, kad sergant astma T limfocitų pagalbininkų subpopu-liacijų kiekybinė sudėtis ir jų tarpusavio santykis gali būti pakitę. Norėdami įsitikinti, kuri T limfocitų pagalbininkų subpopuliacija vyrauja sergant aler-gine astma, kaip ji susijusi su patofiziologiniais ir patomorfologiniais ligos mechanizmais, įvertinome visų šių subpopuliacijų kiekį bei tarpusavio santykį. Be to, tyrėme su šiomis ląstelėmis susijusių citokinų koncentraciją serume. Šiuos duomenis aptarsime vėliau.

Tyrimo metu sergantiesiems alergine astma bei alerginiu rinitu nusta-tėme reikšmingai mažesnį nei sveikų asmenų Th1 ir Th2 limfocitų santykį, kuris reiškia vyraujantį Th2 bei sumažėjusį Th1 limfocitų kiekį ir, galimai, funkciją. Šie mūsų nustatyti pakitimai antrina tyrėjams, aprašiusiems hipo-tezę apie darnią Th1 ir Th2 pusiausvyrą, kurios sutrikimas skatina alerginių ligų vystymąsi [6,40]. Dėl padidėjusio Th17 kiekio, sergantiems alergine astma nustatėme didesnį Th17/Th1 limfocitų santykį (lyginant su sveikais asmenimis). Nepakito tik Th17/Th2 limfocitų santykis, nes sergantiesiems alergine astma ir alerginiu rinitu nustatytas kiekvienos iš šių subpopuliacijų kiekio padidėjimas periferiniame kraujyje. Duomenys rodo, kad Th17 lim-focitų subpopuliacija greta Th2 limfocitų yra ne mažiau reikšminga alergi-nės astmos patogenezės dalyvė.

Th17 limfocitai yra vieni pagrindinių citokinų – IL-17 bei IL-22 – šalti-nių [122]. Ištyrėme, kad sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu asmenų serume, lyginant su sveikais asmenimis, yra padidėjusi IL-17 koncentracija. Šis atradimas nebuvo staigmena mūsų tyrimo grupei, nes daugelis tyrėjų yra apibūdinę IL-17 reikšmę alerginių kvėpavimo takų patogenezėje. Reikia pa-žymėti, kad svarbiausi IL-17 koncentracijos pokyčiai nustatomi sergančių kvėpavimo takuose ir yra susiję su tam tikru astmos fenotipu, kaip antai sunkios eigos astma ar neutrofiliniu kvėpavimo takų uždegimu pasižyminčia liga. Padidėjusi IL-17 koncentracija serume nustatyta ir kitų mokslininkų atliktame tyrime. Ciprandi su bendraautoriais ištyrė sergančiuosius žieda-dulkių sukeltu vidutinio sunkumo alerginiu rinitu [37]. Tyrimas, atliktas augalų žydėjimo sezono metu, nustatė reikšmingą IL-17 koncentracijos se-rume padidėjimą, susijusį su klinikinių požymių išreikštumu, suvartotų vaistų gausa bei periferinio kraujo eozinofilų kiekiu. Tyrėjai drąsiai teigia, kad serumo IL-17 koncentracijos pokyčių matavimas gali būti naudojamas ne tik alerginei ligai nustatyti, bet ir jos sunkumui klasifikuoti. Panašias mintis išdėsto Agache su bendradarbiais,. Jie ne tik nustatė padidėjusią seru-mo IL-17 koncentraciją, susiejo ją su ligos sunkumu, bet ir įvertino IL-17

79

kaip prognostinio žymens, reikšmingesnio nei jau žinomi astmos rizikos veiksniai (nesteroidinių vaistų nuo uždegimo vartojimas, rūkymas, nutuki-mas, lėtinis rinosinusitas, kraujo eozinofilija ar plaučių funkcijos rodikliai), reikšmę astmos klinikinei eigai [3]. Didesnė IL-17 koncentracija nustatyta sergantiesiems sunkios eigos alergine astma lyginant su lengvos/vidutinio sunkumo eigos astma, o IL-17 koncentracija serume, didesnė nei 20 pg/ml, yra nepriklausomas sunkios eigos astmos rizikos veiksnys. Mūsų atliktame tyrime IL-17 koncentracijos serume skirtumų tarp sergančių alerginiu rinitu ir alergine astma asmenų nenustatyta. Nors alerginė astma galėtų būti vertinama kaip sunkesnė alerginė kvėpavimo takų liga, plačiai apimanti ir apatinius smulkiuosius kvėpavimo takus. Tačiau teigti, kad šie rezultatai prieštarauja minėtai nuomonei, negalime. Dauguma tyrime dalyvavusių asmenų sirgo lengvu nuolatiniu alerginiu rinitu ir intermituojančia bei lengva/vidutine nuolatinės eigos alergine astma [27,133]. Nei vienas, sergantis sunkios eigos astma, nebuvo įtrauktas į šį tyrimą. Kita vertus, vienas iš tyrimo tikslų buvo įvertinti alergeno sukeltus IL-17 koncentracijos pokyčius ir susieti juos su kitais humoraliniais ir ląsteliniais uždegimo žymenimis bei klinikiniais alerginės kvėpavimo ligos variantais. Šios tyrimo dalies rezultatai bus aptariami vėliau.

Atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad serumo IL-5 koncentracija bei pe-riferinio kraujo eozinofilų kiekis skiriasi tarp sergančių sergant alergine astma, alerginiu rinitu ir sveikų asmenų. IL-5 – svarbus citokinas, koordi-nuojantis ir skatinantis eozinofilų brendimą, chemotaksį, aktyvumą bei slopinantis jų apoptozę [1,158]. Nors visų grupių tiriamųjų IL-5 koncent-racija serume buvo didesnė nei sveikų asmenų, ji reikšmingai didesnė tik sergant alergine astma. Be to, padidėjusi IL-5 koncentracija serume reikš-mingai teigiamai susijusi su Th2 limfocitų kiekiu periferiniame kraujyje. Visai neseniai mokslininkai teikė daug vilčių IL-5 blokuojančio vaisto panaudojimui alerginei astmai gydyti. Tačiau, Flood-Page su bendradarbiais konstatavo, kad anti-IL-5 gydymas nėra toks efektyvus, kaip manyta ankščiau, ląstelių priklausomos uždegimo fazės ar bronchų padidinto reaktyvumo gydymui sergant astma, nepaisant to, kad eozinofilų kiekį krau-jotakoje ar kvėpavimo takuose sumažinti gali reikšmingai [56]. Tai rodo, kad IL-5 galbūt nėra toks reikšmingas ar vienintelis eozinofilų judėjimo ir veiklos reguliatorius, arba, atvirkščiai, eozinofilai nėra vienintelės ir svar-biausios ląstelės lėtinio kvėpavimo takų uždegimo vystymuisi sergant aler-gine astma [136].

Kaip jau minėta, astma apibūdinama kaip lėtinio neinfekcinio uždegimo sukelta liga, kurios patogenezėje vienas svarbiausių – Th2 limfocitų imu-ninis atsakas bei eozinofilinis uždegimas. Tačiau šį nusistovėjusį supratimą

80

apie eozinofilinio uždegimo egzistavimą paneigia moksliniai tyrimai, rodan-tys, kad kitos ląstelės ir mediatoriai gali pakeisti bronchų gleivinėje ir visa-me organizme vykstančius patologinius procesus. Vis garsiau diskutuojama apie neutrofilų svarbą vėlyvos fazės arba nuolatiniam uždegimui sergant astma. Peržvelgus mokslinius tyrimus, vertinusius neutrofilų reikšmę, tik nedaugelis iš jų rado padidėjusį šių ląstelių kiekį periferiniame kraujyje [182] bei nurodė padidintą jų aktyvumą [144]. Tačiau nepalyginti gausesni tyrimai parodo jų buvimą kvėpavimo takuose sergant astma. IL-8 – svar-biausiais neutrofilų judėjimą skatinantis mediatorius, kurį gamina ir išskiria ir patys aktyvuoti neutrofilai, ir Th17 limfocitai [146]. IL-8 yra susijęs su neutrofilų kiekio uždegimo židinyje padidėjimu taip pat dėl savo neutrofilų apoptozę mažinančio efekto [51]. Nustatėme didesnę IL-8 koncentraciją sergančių alerginėmis kvėpavimo ligomis pacientų serume, lyginant su svei-kais asmenimis, tačiau periferinio kraujo neutrofilų kiekis visų tirtųjų asme-nų grupėse buvo panašus.

Įvertinę skreplių indukcijos procedūros eigą bei palyginę duomenis su analogiškų tyrimų duomenimis, pastebėjome, kad mūsų tyrime tik 46 procentai tiriamųjų asmenų sugebėjo atkosėti reikiamą kokybiškų skreplių kiekį. Majewski atliktame tyrime tai pavyko padaryti didesnei daliai tiria-mųjų [115]. Tačiau mes neilginome indukcijos trukmės ir nenaudojome di-desnės koncentracijos NaCl tirpalo, žinodami jo neigiamą poveikį plaučių funkcijai (FEV1) ir mėginių kokybei. Yra nustatyta, kad kartojama skreplių indukcija keičia kvėpavimo takų ląstelių sudėtį, padidina jame neutrofilų kiekį [175]. Mūsų atliekama skreplių indukcija buvo gerai toleruojama visų tyrime dalyvavusių asmenų, nustatyti nedideli FEV1 pakitimai (ne daugiau 10 proc.). Pritariame pasaulio mokslininkams, kad indukuotų skreplių tyri-mas yra saugus ir informatyvus metodas vertinantis astma sergančių asmenų kvėpavimo takų uždegimą net esant sunkesnei astmai [44,174].

Vertindami sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu asmenų užde-gimą kvėpavimo takuose pastebėjome indukuotų skreplių ląstelių sudėties ir uždegimo žymenų koncentracijų skirtumus. Nustatytas didesnis bendras ląs-telių ir eozinofilų kiekis indukuotuose skrepliuose sergant alergine astma leidžia manyti, kad šių tiriamųjų kvėpavimo takuose vyksta aktyvesnis lėtinis neinfekcinis uždegimas nei sergant alerginiu rinitu. Visus šiuos po-kyčius kvėpavimo takuose lydi uždegimo žymenų ir ląstelių pokyčiai sisteminėje kraujotakoje. Šis sisteminis uždegimas pasižymi analogiškais uždegimo žymenų pokyčiais, tiesa, ne tokiais ženkliais kaip kvėpavimo takuose.

Kaip ir tikėjomės, alergine astma sergančių pacientų indukuotuose skrepliuose nustatyta didesnė IL-17 koncentracija nei sergant alerginiu rini-

81

tu o taip pat ir sveikiems asmenims.Literatūros duomenys teigia, kad nors IL-17 gali būti išskiriamas įvairių ląstelių, aktyvuoti Th17 limfocitai yra svarbiausias šio citokino šaltinis [146]. Šios ląstelės gali būti randamos bronchų biopsijos medžiagoje sergant ir kitomis plaučių ligomis, kaip antai cistinė fibrozė [172]. Eustace vadovaujami mokslininkai nustatė padidėjusią IL-17A raišką smulkiųjų kvėpavimo takų pogleivio ląstelėse (limfocituose, neutrofiluose, makrofaguose) sergant lėtine obstrukcine plaučių liga [55]. Padidėjusį Th17 limfocitų kiekį bronchų biopsijoje sunkios astmos paūmė-jimo metu nustatė dar dvi mokslininkų grupės [147,188]. Žinodami skati-nantį IL-17 poveikį kvėpavimo takų neutrofilinio uždegimo vystymusi, ana-lizavome uždegimo ląstelių kiekybinę sudėtį, tačiau neutrofilų kiekio skirtumų sergančių alergine astma indukuotų skreplių mėginiuose, lyginant su sveikais asmenimis, prieš bronchų provokaciją nenustatėme.

Tyrimo rezultatais įrodėme, kad ne tik Th2 limfocitai, IL-5 ir eozinofi-linis uždegimas yra svarbūs astmos patogenezės veikėjai. Kitos ląstelės, kaip antai Th17 limfocitai ir IL-17 dalyvauja vietinio ir sisteminio lėtinio neinfekcinio uždegimo sergant alergine astma vystymesi.

6.2. Bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu sukelti vietinio ir sisteminio uždegimo pokyčiai sergant

alergine astma

Planuojant tyrimą ir modeliuojant jo eigą atkreipėme dėmesį į tai, kad sergantiems alergine astma ir alerginiu rinitu būdingas ligos simptomų atsiradimas ar paūmėjimas po kontakto su alergenu. Tyrimą suplanavome taip, kad galėtume išryškinti ir įvertinti alergeno sukeltus Th17 limfocitų imuninio atsako ypatumus, sugretinti juos su patofiziologiniais ligos požy-miais (klinikiniais simptomais ir plaučių funkcijos pakitimais). Numatėme ištirti alergeno sukeltus Th17 limfocitų pokyčius bei įvertinti šios limfocitų subpopuliacijos svarbą nulemiant vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimo vystymąsi. Tyrimui pasirinkome bronchų provokacijos su namų dulkių erkės D. pteronyssinus alergenu modelį. Viena iš šio alergeno pasirinkimo priežasčių yra didelis įsijautrinimo šiuo alergenu dažnis sergančių alerginėmis kvėpavimo ligomis tarpe. Nors bronchų provokacija alergenu nėra natūralusis ligos paūmėjimas, visgi šis tyrimo modelis yra laikomas vertingu alerginės astmos patogenezės tyrimu, leidžiančiu ištirti imuninės sistemos atsaką į alergeną, uždegimo ląstelių ir mediatorių veikimą anksty-vos ir vėlyvos uždegimo fazės metu. Mokslininkai pastebėjo, kad D. ptero-nyssinus alergeno savybės yra susijusios su vėlyvos fazės uždegimo išsivys-tymu [74]. Bronchų provokacija specifiniu alergenu yra naudingas, tačiau ir

82

gana sudėtingas tyrimo metodas. Ravensberg vadovaujama tyrėjų grupė sau-gumo dėlei rekomenduoja įvertinti alergeno savybes bei tiksliai apskaičiuoti jo koncentraciją. Bronchų provokacijai naudotiną alergeno dozę siūloma įvertinti pagal nespecifinio bronchų reaktyvumo bei odos jautrumo šiam alergenui tyrimų rezultatus [151]. Van der Veen su bendraautoriais priešta-rauja, jog ne bronchų jautrumas nespecifiniam dirgikliui, bet alergeno savy-bių įvertinimas yra svarbūs numatant plaučių funkcijos sutrikdymo galimy-bę [183]. Be to, yra nuomonių, kad alergeno tipas nulemia plaučių funkcijos sutrikimo pobūdį: sugebėjimą sukelti vien tik ankstyvą arba ankstyvą ir po jos sekančią vėlyvą bronchų obstrukciją. Alvare-Puebla nuomone, vėlyva alerginio uždegimo fazė priklauso ir nuo alergeno savybių, ir nuo ekspozi-cijos laiko [12]. Įvertinus visas šias skirtingas nuomones, bronchų provoka-cijai pasirinkome skirtingų koncentracijų D. pteronyssinus alergeno ekstrak-tą. Reikia pasakyti, kad tyrimas, nors ir sukėlė alerginės ligos simptomus bei plaučių funkcijos pokyčius, buvo pakankamai saugus ir gerai toleruojamas. Svarbu pažymėti, kad visiems tiriamiesiems bronchų provokacijos alergenu sukeltas ankstyvas plaučių funkcijos pakitimas savaime sugrįžo į pradinį lygį per valandą. Nei vienam iš tiriamųjų asmenų šis tyrimas nesukėlė ligos paūmėjimo, nepareikalavo papildomo gydymo. Taigi bronchų provokacija alergenu yra naudingas astmos patogenezės tyrimo modelis, gerai toleruoja-mas ir saugus tiriamajam asmeniui [64].

Vyrauja nuomonė, kad Th2 limfocitų imuninis atsakas yra svarbiausias alerginių kvėpavimo ligų patogenezėje [105,108,153,197]. Šiame tyrime nustatėme skaitlingesnę šių Th2 limfocitų subpopuliaciją sergantiems alergi-ne astma, lyginant su sveikais asmenimis. Be to Th2 limfocitų kiekis spar-čiai didėjo praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos. Akivaizdu, kad alergeno įkvėpimas sukėlė ne tik Th2 limfocitų pokyčius: nustatytas dides-nis IL-5 ir eozinofilų kiekis sergančiųjų alergine astma periferiniame krau-jyje. Vertindami sisteminį alergeno sukeltą Th2 limfocitų imuninį atsaką pastebėjome, kad praėjus 7 val., o dar labiau – praėjus 24 val. reikšmingai teigiamai siejosi tarpusavyje Th2 limfocitų, IL-5 bei eozinofilų kiekis sergančių alergine astma periferiniame kraujyje. D. pteronyssinus alergeno įkvėpimas sergantiems alergine astma asmenims sukelia vietinį uždegimą pasireiškiančiu IL-5 ir eozinofilų kiekio padidėjimu, kuris atsiranda anks-čiau ne sisteminiai pokyčiai ir yra ženklesni nei sergant alerginiu rinitu. Praėjus 7 val. po bronchų provokacijos nustatytos IL-5 koncentracijos indu-kuotuose skrepliuose ir serume sąsajos, o praėjus 24 val. reikšmingai teigiamai siejosi Th2 limfocitų, IL-5 ir eozinofilų kiekis sergančiųjų aler-gine astma periferiniame kraujyje bei IL-5 koncentracija ir eozinofilų kiekis indukuotuose skrepliuose, tuo patvirtindami su Th2 limfocitais susijusio

83

imuninio atsako dominavimą alerginių kvėpavimo ligų ir, svarbiausia, alerginės astmos patogenezėje.

Gausūs eksperimentiniai alerginės astmos tyrimai naudojant gyvūnų modelius leidžia prognozuoti, kad įkvėptas D. pteronyssinus alergenas sti-muliuoja ne tik Th2 limfocitų subpopuliacijos pokyčius sergant alergine astma. Norėdami įsitikinti, ar bronchų provokacija alergenu sukelia sistemi-nius ir vietinius Th17 limfocitų imuninio atsako pakitimus sergant alergine astma, nustatėme Th17 limfocitų kiekį periferiniame kraujyje bei IL-17 kon-centraciją serume ir indukuotų skreplių supernatante.

Mūsų atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu sukelia Th17 limfocitų kiekio periferiniame kraujyje padidėjimą sergantiems alerginėmis kvėpavimo ligomis. Šis pokytis yra ženklesnis sergantiems alergine astma praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provo-kacijos, lyginant su sergančiais alerginiu rinitu, sveikais asmenims bei pra-diniais duomenimis. Palyginti gautus rezultatus galime tik su eksperimen-tiniais tyrimais, kadangi atitinkamų duomenų sergantiems alergine astma vos keletas. Wilson su bendradarbiais atliktame eksperimentiniame alergi-nės astmos modelyje nustatyta, kad alergeno patekimas per kvėpavimo takus sukelia tik nežymų Th2 limfocitų, bet ryškų Th17 limfocitų imuninį atsaką, IL-17 kiekio kvėpavimo takuose pagausėjimą, neutrofiliją bei padi-dintą bronchų reaktyvumą. Tuo tarpu intraperitoninis įjautrinimas ir provo-kacija sukelia tik Th2 limfocitų atsaką, eozinofiliją, bet nepadidina bronchų reaktyvumo [198]. Be to, teigiama, kad IL-17 ar Th2 limfocitų citokinai kiekvienas atskirai nesukelia padidėjusio bronchų reaktyvumo, o veikdami kartu skatina eozinofilų ir neutrofilų priplūdimą į kvėpavimo takus bei padidintą kvėpavimo takų reaktyvumą. Eksperimentiniame alerginės astmos tyrime McKinley nustatė, kad pelėms padidintas bronchų reaktyvumas glau-džiai susijęs su Th17 limfocitų imuniniu atsaku [118]. Dar vienas eksperi-mentinis astmos modelis, aprašytas Whitehead, parodė, kad įsijautrinimas per kvėpavimo takus patekusiu alergenu sukelia T reguliacinių limfocitų bei T limfocitų efektorių imuninį atsaką, o pastarųjų veikla sukelia IL-17 pagau-sėjimą bei padidintą nespecifinį bronchų reaktyvumą. Po ilgalaikės provo-kacijos IL-17 kiekis ir bronchų reaktyvumas sumažėja net esant dideliam kiekiui IL-17 išskiriančių T limfocitų kiekiui plaučių audinyje. Tyrėjai tai aiškina padidėjusiu T reguliacinių limfocitų aktyvumu, jų išskiriamų citoki-nų IL-10, TGF-β, IL-35 bronchų reaktyvumą sumažinančiu poveikiu [196].

Šio tyrimo metu parodėme, kad bronchų provokacija alergenu sukelia IL-17 koncentracijos indukuotų skreplių supernatante padidėjimą sergant alergine astma lyginant su sveikais asmenimis. IL-17 koncentracijos padi-dėjimas kvėpavimo takuose nustatytas ir sergantiesiems alerginiu rinitu

84

asmenims, kurie neturi klinikinių apatinių kvėpavimo takų alerginio užde-gimo požymių. Šie rezultatai pritaria „vieningų kvėpavimo takų teorijai“ ir sisteminio atsako sergant alerginėmis kvėpavimo ligomis egzistavimui. Semik-Orzech paskelbė panašių tyrimų rezultatus, kurie parodė nosies provokacijos sukeltą IL-17 gamybą apatiniuose kvėpavimo takuose asme-nims, nesergantiems astma [161].

Ženkliausiais IL-17 koncentracijos padidėjimas periferinio kraujo seru-me buvo nustatytas sergantiems alergine astma praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu. Be to, praėjus 24 val. po bronchų provokacijos aler-genu sergantiems alergine astma, nustatomos padidėjusių IL-17 koncentra-cijos ir IL-8, Th17 limfocitų ir neutrofilų kiekio periferiniame kraujyje tarpusavio sąsajos. Tuo tarpu sergantiems alerginiu rinitu tokių sąsajų nenu-statyta. Tai galima paaiškinti faktu, kad viršutinių ir apatinių kvėpavimo ta-kų alerginio uždegimo išsivystymo mechanizmai yra panašūs, tačiau skiriasi savo pažeidimo intensyvumu, yra labiau išreikšti sergant alergine astma.

Žinodami, kad IL-17 skatina nespecifinio imuniteto mechanizmus ir sukelia neutofilinį kvėpavimo takų uždegimą, mes tyrinėjome indukuotų skreplių ląstelių sudėtį. Nustatėme bronchų provokacijos su D. pteronys-sinus alergenu sukeltus indukuotų skreplių ląstelių sudėties pakitimus: padidėjusį bendrą ląstelių kiekį, limfocitų, eozinofilų, ir, kas labai įdomu, neutrofilų kiekį sergantiesiems alergine astma asmenims. Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos, reikšmingai siejosi IL-17 kiekis indukuotuose skrep-liuose su IL-17, neutrofilų bei Th17 kiekiu periferiniame kraujyje. Kiti auto-riai teigia, kad IL-17 sergančių alergine indukuotuose skrepliuose yra glau-džiai susijęs su svarbiausiu neutrofilų chemoatraktantu, IL-8 [33]. Šiame tyrime nustatėme padidėjusį IL-8 kiekį indukuotų skreplių supernatante sergant alergine astma, tačiau reikšmingų sąsajų tarp IL-8 ir kitų tirtų uždegimo ląstelių, tame tarpe ir neutrofilų, nenustatėme.

Atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad D. pteronyssinus alergenas sukelia Th17 limfocitų ir IL-17 kiekio periferiniame kraujyje ir indukuotuose skrepliuose padidėjimą sergantiems alergine astma, kuris yra susiję su vietiniu ir sisteminiu vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimu.

6.3. Alerginės astmos, pasireiškiančios ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija po kontakto su alergenu, imuninio atsako ypatumai

Pradėdami tyrimą mes iškėlėme hipotezę, kad Th17 limfocitai bei IL-17 yra svarbūs alerginės astmos patogenezės dalyviai, susijęs su skirtingais alerginės astmos vystymosi mechanizmai ir patofiziologiniais ligos ypatu-mais. Todėl ypatingai svarbus radinys buvo sergančių alergine astma, ku-

85

riems bronchų provokacija su alergenu sukėlė ankstyvą ir vėlyvą bronchų obstrukciją, vietinio ir sisteminio uždegimo savitumai, pasižymintys dides-niu (lyginant su kitu sergančiųjų alergine astma pogrupiu) Th17 limfocitų ir IL-17 kiekiu praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos.

Vienas iš tyrimo tikslų buvo palyginti alerginės astmos su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija po kontakto su alergenu pasireiš-kiančius klinikinius fenotipus. Ne visiems sergantiesiems alergine astma bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu sukėlė ankstyvą ir po jos sekančią vėlyvą bronchų obstrukciją. Mūsų tyrime ankstyva ir vėlyva bron-chų obstrukcija nustatyta 47 procentams sergančių alergine astma asmenų. Vėlyvos bronchų obstrukcijos metu antrą–septintą valandą po provokacijos alergenu maksimalus FEV1 sumažėjimas šios grupės asmenims buvo nuo 15 proc. iki 62 proc. Yra nemažai tyrimų, aiškinančių ankstyvos ir vėlyvos bronchų obstrukcijos išsivystymo mechanizmų skirtumus, tačiau atsakymas vis dar nerastas. Gauvreau su bendradarbiais ištyrė, kad eozinofilų ir neutro-filų kiekio kvėpavimo takuose padidėjimas, o makrofagų – sumažėjimas yra išskirtinis asmenims, kuriems išsivysto ankstyva ir vėlyva bronchų obstruk-cija [62]. Eozinofilų kiekio padidėjimą, kaip skiriamąjį vėlyvos bronchų obstrukcijos bruožą, mini savo tyrime ir Dorman [48]. Muratov mano, kad T limfocitų IFN-γ ir IL-4 raiška nulemia izoliuotos ankstyvos ar ankstyvos ir vėlyvos bronchų obstrukcijos pasireiškimą [130]. Mūsų tyrimo duomenys nustatė Th17 limfocitų ir IL-17 kiekio padidėjimą sergantiems alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, tačiau pasta-rajame pogrupyje Th17 limfocitų ir IL-17 kiekybiniai pokyčiai buvo ženk-lesni. Reikia pastebėti, kad sergantiesiems alergine astma Th2 limfocitų sub-populiacija padidėjo tolygiai ir nesiskyrė tarp alerginės astmos pogrupių.

Nustatėme reikšmingai padidėjusį IL-17 kiekį indukuotuose skrepliuose praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos sergančių alergine astma su ankstyva bei sergančių alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija pogrupiuose, lyginant su sveikais asmenimis ir pradiniu IL-17 kiekiu. Šis padidėjimas buvo ryškesnis asmenims, kuriems po bronchų pro-vokacijos išsivystė ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, lyginant su kitu sergančių alergine astma pogrupiu. Pastebėta, kad IL-17 koncentracija indu-kuotuose skrepliuose yra susijusi su padidintu bronchų jautrumu metacho-linui [15] ir astmos sunkumu [3,35,170]. O Th17 limfocitai siejami su neu-trofilinio ir makrofagų uždegimo kvėpavimo takuose reguliacija sergant alergine astma [8,111]. Ieškodami išskirtinių alerginės astmos su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija ypatumų, siekėme įvertinti uždegimo ląstelių bei humoralinių žymenų sąsajas su svarbiausiu patofiziologiniu šios ligos pasi-reiškimu – padidėjusiu bronchų reaktyvumu. Yra nemažai tyrimų, kuriuose

86

parodomas glaudus eozinofilų ir padidinto bronchų reaktyvumo ryšys [149, 192], kiti tyrėjai – jokių sąsajų su eozinofilais ar kitomis uždegimo ląste-lėmis nestebi [43]. Eksperimentinių alerginės astmos tyrimų duomenys teigia, kad Th2 ir Th17 limfocitų veikimas kartu yra susijęs su padidintu kvėpavimo takų reaktyvumu [186, 198]. Mūsų tyrimo duomenimis, sergan-čiųjų alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija grupėje, skirtingai nei sergant alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija, Th17 limfocitų kiekis periferiniame kraujyje prieš bronchų provokaciją reikšmin-gai siejosi su padidintu bronchų reaktyvumu.

Pastarųjų metų tyrimai diskutuoja apie neutrofilų svarbą specifiniame alergeno sukeltame uždegime. Sergančių alergine astma su ankstyva bei ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija indukuotuose skrepliuose, greta padidėjusio eozinofilų kiekio nustatėme didesnį neutrofilų skaičių praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu. Daugelis tyrėjų analizavo šio neutrofilinio kvėpavimo takų uždegimo sergant astma mechanizmą. Švedi-jos mokslininkų grupė, vadovaujama Linden tyrimuose su gyvūnais nustatė, kad svarbiausias neutrofilų susitelkimui kvėpavimo takuose yra netiesio-ginis IL-17 stimuliuojantis poveikis struktūrinėms kvėpavimo takų – epite-lio, lygiųjų raumenų – ląstelėms ir fibroblastams [103]. Laan su bendraauto-riais nustatė, kad IL-17 skatina neutrofilų chemoatraktanto IL-8 išskyrimą iš žmogaus bronchų epitelio ląstelių in vitro, ir, priešingai, anti-IL-17 sumaži-na IL-8 išsiskyrimą [102]. Tyrėjai pastebi, kad IL-17 per se neutrofilų migracijos neskatina. Dragon su bendraautoriais aprašė dar vieną neutrofilų pagausėjimo kvėpavimo takuose priežastį – IL-17 antiapoptotinį efektą [50]. Aiškėja, kad Th17 ir IL-17 yra ir nespecifinio, ir specifinio imuninio atsako sergant alergine astma dalyviai. Eksperimentiniame alerginės astmos mode-lyje Wang su bendraautoriais nustatė ovalbuminu įsijautrinusioms pelėms ilgalaikės provokacijos alergenu sukeltus neutrofilų ir makrofagų kvėpa-vimo takuose kiekio ir funkcijos padidėjimą. Tuo tarpu ūminė šio alergeno ekspozicija buvo susijusi su dramatišku eozinofilų kiekio padidėjimu. Th17 limfocitų diferenciacijai reikalingų citokinų kiekis ir RORγt raiška pagausė-jo tik lėtinės, ilgalaikės provokacijos ovalbuminu metu [191]. Tyrėjai teigia, kad eozinofilų kiekio sumažėjimas, o makrofagų ir neutrofilų padidėjimas, sąlygoti ilgalaikės ovalbumino provokacijos, gali būti susiję su Th17 limfo-citų veikla. Kitas tyrimas, patvirtinantis aktyvuotų CD4+ T atminties T lim-focitų, išskiriančių IL-17, ir neutrofilų genezės bei judėjimo ryšį, yra atliktas Hellings su bendraautoriais [76]. Jie nustatė ilgalaikio ovalbumino įkvėpimo (juo įsijautrinusioms pelėms) sukeltą padidėjusią IL-17 iRNR raišką plaučių audinyje bei neutrofilų kiekio padidėjimą. Ir atvirkščiai, anti-IL-17 mAk, suleisti prieš provokaciją, ženkliai sumažino neutrofilų priplūdimą į uždegi-

87

mo židinį, tuo pačiu padidindami IL-5 kiekį BAL skystyje ir serume ir su-keldami ryškesnį eozinofilinį uždegimą. Yra ir priešinga nuomonė, aprašyta Schnyder [160], kad IL-17 sumažina alerginį atsaką blokuodamas chemo-kinų išskyrimą iš dendritinių ląstelių. Tiesa, neutrofilų veikimas alerginių kvėpavimo takų ligų patogenezėje vis dar vertinamas prieštaringai. Mora su bendradarbiais įrodė, kad sergančių alergine astma pacientų periferiniame kraujyje yra neutrofilai, turintys savo paviršiuje FcεRI, tuo tarpu kai sveiki neturi [127]. FcεRI turintys neutrofilai gali kontaktuoti su IgE [156], o aktyvinti išskiria neutrofilų chemoatraktantą, IL-8 [125, 126].

Uždegimo ląstelių ir citokinų periferiniame kraujyje analizė parodė, kad, sergantiems alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, periferiniame kraujyje reikšmingai teigiamai siejos Th17 limfocitų, IL-17 ir neutrofilų kiekis, tuo tarpu sergantiems alergine astma su ankstyva bronchų obstrukcija tokių są-sajų nenustatyta. Būtent šie sisteminiai uždegimo mediatorių ir ląstelių savi-tumai išskiria astmos su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija fenotipą iš kitų sergančių alerginėmis kvėpavimo ligomis tarpo. Svarbu pažymėti, kad abiejuose alergine astma sergančiųjų pogrupiuose nustatėme reikšmingas tarpusavio sąsajas tarp periferinio kraujo Th2 limfocitų, IL-5 ir eozinofilų.

Apibendrinę galime teigti, kad bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu sukelia vietinį ir sisteminį Th17 limfocitų imuninį atsaką, susijusį su vėlyvąja kvėpavimo takų uždegimo faze ir skirtingais klinikiniais astmos fenotipais.

88

IŠVADOS

1. Sergantiesiems alergine astma nustatytas didesnis Th17 limfocitų, o taip pat ir Th2 limfocitų kiekis, mažesnis Th1 limfocitų kiekis periferiniame kraujyje. T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijų kiekybinė sudėtis tarp sergančių alergine astma bei alerginiu rinitu nesiskyrė. Tačiau, ser-gantiesiems alergine astma nustatytas sumažėjęs Th1/Th2 santykis, ly-ginant su sergančiais alerginiu rinitu bei sveikais asmenimis.

2. Sergančiųjų alergine astma indukuotų skreplių supernatante nustatyta didesnė IL-17 koncentracija, lyginant su sergančiais alerginiu rinitu bei sveikais asmenimis. Tuo tarpu kraujo serume IL-17 koncentracija tarp sergančių alergine astma bei alerginiu rinitu nesiskyrė. Sergantiesiems alergine astma padidėjusi IL-17 koncentracija serume reikšmingai tei-giamai siejasi su Th17 limfocitų kiekiu periferiniame kraujyje. Sergan-čių alerginiu rinitu ir sveikų asmenų grupėse tokių sąsajų nenustatyta.

3. Bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu sergantiesiems aler-gine astma sukelia ženklų Th17 ir Th2 limfocitų kiekio periferiniame kraujyje padidėjimą, lyginant su sergančiais alerginiu rinitu bei sveikais asmenimis. Sergantiesiems alergine astma padidėjęs Th17 limfocitų kiekis nustatytas praėjus 24 valandoms po bronchų provokacijos, reikš-mingai teigiamai siejosi su IL-17 ir IL-8 kiekiu periferiniame kraujyje.

4. Bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu sergantiesiems aler-gine astma sukelia IL-17 koncentracijos padidėjimą indukuotų skreplių supernatante bei periferinio kraujo serume. Abiejose sergančiųjų asme-nų grupėse, praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, ste-bimas padidėjęs eozinofilų kiekis indukuotuose skrepliuose, tačiau tik sergantiesiems alergine astma praėjus 24 val. po bronchų provokacijos nustatytas neutrofilų kiekio padidėjimas. Taip pat tik alerginės astmos grupėje, praėjus 24 val. po bronchų provokacijos alergenu, IL-17 kiekis indukuotuose skrepliuose reikšmingai teigiamai siejosi su indukuotų skreplių neutrofilų bei IL-17 ir Th17 limfocitų kiekiu periferiniame kraujyje, tuo tarpu IL-5 koncentracija – su eozinofilų kiekiu indukuo-tuose skrepliuose bei IL-5 ir Th2 limfocitų kiekiu periferiniame krau-jyje.

89

5. Sergantiesiems alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstruk-cija, lyginant su sergančiaisiais alergine astma su ankstyva bronchų ob-strukcija, praėjus 7 ir 24 val. po bronchų provokacijos su D. pterony-ssinus alergenu nustatyta didesnė IL-17 koncentracija indukuotuose skrepliuose bei padidėjęs Th17 limfocitų ir IL-17 kiekis periferiniame kraujyje. Praėjus 24 val. po bronchų provokacijos, Th17 limfocitų kie-kis sergančiųjų alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstruk-cija periferiniame kraujyje reikšmingai teigiamai siejosi su IL-17 bei neutrofilų kiekiu, tuo tarpu sergantiesiems alergine astma su tik anksty-va bronchų obstrukcija tokių sąsajų nenustatyta.

90

DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ

Šio mokslinio tyrimo rezultatai suteikia naujos informacijos apie aler-ginės astmos patogenezę.

Įdiegėme bronchų provokacijos specifiniu alergenu metodiką ir nusta-tėme, kad tai yra pakankamai saugus ir informatyvus tyrimo metodas, lei-džiantis įvertinti kvėpavimo takų uždegimo pobūdį ir patofiziologines ligos savybes. Tyrimo metu parodėme, kad sergantys alergine astma skiriasi reak-cija į simptomus provokuojantį veiksnį: bronchų provokacija su D. ptero-nyssinus alergenu sukelia ankstyvą arba ankstyvą ir vėlyvą bronchų obstruk-ciją. O šių dviejų klinikinių astmos fenotipų skiriamuoju bruožu galėtų būti Th17 limfocitų imuninio atsako pokyčiai.

Tyrimo metu nustatėme, kad Th17 limfocitų kiekis periferiniame krau-jyje ir IL-17 koncentracija serume bei indukuotuose skrepliuose yra didesnis sergant alergine astma, lyginant su sveikais asmenimis. O įkvėptas D. ptero-nyssinus alergenas sukelia Th17 limfocitų bei IL-17 kiekio padidėjimą, susijusį su vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimu. Pastarajam būdingas ne tik eozinofilų, bet ir neutrofilų kiekio padidėjimas kvėpavimo takuose. Kadangi neutrofilai yra žinomi vėlyvos fazės uždegimo, kvėpavimo takų remodeliacijos bei sunkios eigos astmos patogenezės veikėjai, galimybė mo-deliuoti Th17 imuninį atsaką, sumažinti IL-17 uždegimą skatinantį poveikį bei neutrofiliją gali būti reikšmingas astmos naujo gydymo būdo paieškai.

91

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS

1. Adamko DJ, Odemuyiwa SO, Vethanayagam D, Moqbel R. The rise of the phoenix: the expanding role of the eosinophil in health and disease. Allergy 2005;60:13-22.

2. Adomaitienė D, Janulevičiūtė, N., Kazakevičius, R., Vaičiuvėnas, V. Klinikinės imunologijos įvadas. Kaunas: Šviesa; 2001.

3. Agache I, Ciobanu C, Agache C, Anghel M. Increased serum IL-17 is an independent risk factor for severe asthma. Respir Med 2010; 104:1131-7.

4. Agarwal S, Misra R, Aggarwal A. Interleukin 17 levels are increased in juvenile idiopathic arthritis synovial fluid and induce synovial fibroblasts to produce proinflammatory cytokines and matrix metalloproteinases. J Rheumatol 2008;35:515-9.

5. Aggarwal S, Ghilardi N, Xie MH, de Sauvage FJ, Gurney AL. Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17. J Biol Chem 2003;278:1910-4.

6. Akdis M, Verhagen J, Taylor A, Karamloo F, Karagiannidis C, Crameri R, et al. Immune responses in healthy and allergic individuals are characterized by a fine balance between allergen-specific T regulatory 1 and T helper 2 cells. J Exp Med 2004;199:1567-75.

7. Albano GD, Di Sano C, Bonanno A, Riccobono L, Gagliardo R, Chanez P, et al. Th17 immunity in children with allergic asthma and rhinitis: a pharmacological approach. PloS one 2013;8(4):e58892.

8. Alcorn JF, Crowe CR, Kolls JK. TH17 cells in asthma and COPD. Annu Rev Physiol 2010;72:495-516.

9. Allakhverdi Z, Comeau MR, Jessup HK, Yoon BR, Brewer A, Chartier S, et al. Thymic stromal lymphopoietin is released by human epithelial cells in response to microbes, trauma, or inflammation and potently activates mast cells. J Exp Med 2007;204:253-8.

10. Almqvist C, Egmar AC, Hedlin G, Lundqvist M, Nordvall SL, Pershagen G, et al. Direct and indirect exposure to pets - risk of sensitization and asthma at 4 years in a birth cohort. Clin Exp Allergy 2003;33:1190-7.

11. Almqvist C, Worm M, Leynaert B, working group of GALENWPG. Impact of gender on asthma in childhood and adolescence: a GA2LEN review. Allergy 2008;63:47-57.

12. Alvarez-Puebla MJ, Olaguibel-Rivera JM, Urbiola-Marcilla E, Garcia BE, Tabar-Purroy AI. Determinants of allergen-induced late bronchial responses in mild asthmatics. Chest 2001;119:120-7.

13. Amin K, Ludviksdottir D, Janson C, Nettelbladt O, Bjornsson E, Roomans GM, et al. Inflammation and structural changes in the airways of patients with atopic and nonatopic asthma. BHR Group. Am J Respir Crit Care Med 2000;162:2295-301.

14. Bancroft. J.D. C, H.C. Manual of histological techniques. Edinburgh; New York: Churchill Livingstone; 1984.

15. Barczyk A, Pierzchala W, Sozanska E. Interleukin-17 in sputum correlates with airway hyperresponsiveness to methacholine. Respir Med 2003;97:726-33.

16. Bateman ED, Hurd SS, Barnes PJ, Bousquet J, Drazen JM, FitzGerald M, et al. Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J 2008;31:143-78.

92

17. Batten M, Li J, Yi S, Kljavin NM, Danilenko DM, Lucas S, et al. Interleukin 27 limits autoimmune encephalomyelitis by suppressing the development of interleukin 17-producing T cells. Nat Immunol 2006;7:929-36.

18. Baur X, Huber H, Degens PO, Allmers H, Ammon J. Relation between occupational asthma case history, bronchial methacholine challenge, and specific challenge test in patients with suspected occupational asthma. Am J Ind Med 1998;33:114-22.

19. Bentley AM, Meng Q, Robinson DS, Hamid Q, Kay AB, Durham SR. Increases in activated T lymphocytes, eosinophils, and cytokine mRNA expression for interleukin-5 and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor in bronchial biopsies after allergen inhalation challenge in atopic asthmatics. Am J Respir Cell Mol Biol 1993;8:35-42.

20. Berry M, Morgan A, Shaw DE, Parker D, Green R, Brightling C, et al. Pathological features and inhaled corticosteroid response of eosinophilic and non-eosinophilic asthma. Thorax 2007;62:1043-9.

21. Bettelli E, Carrier Y, Gao W, Korn T, Strom TB, Oukka M, et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature 2006;441:235-8.

22. Bloemen K, Verstraelen S, Van Den Heuvel R, Witters H, Nelissen I, Schoeters G. The allergic cascade: review of the most important molecules in the asthmatic lung. Immunol Lett 2007;113:6-18.

23. Bonay M, Neukirch C, Grandsaigne M, Lecon-Malas V, Ravaud P, Dehoux M, et al. Changes in airway inflammation following nasal allergic challenge in patients with seasonal rhinitis. Allergy 2006;61:111-8.

24. Bousquet J, Chanez P, Lacoste JY, Barneon G, Ghavanian N, Enander I, et al. Eosinophilic inflammation in asthma. The New England journal of medicine 1990;323:1033-9.

25. Bousquet J, Heinzerling L, Bachert C, Papadopoulos NG, Bousquet PJ, Burney PG, et al. Practical guide to skin prick tests in allergy to aeroallergens. Allergy 2012;67:18-24.

26. Bousquet J, Khaltaev N, Cruz AA, Denburg J, Fokkens WJ, Togias A, et al. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma (ARIA) 2008 update (in collaboration with the World Health Organization, GA(2)LEN and AllerGen). Allergy 2008;63:8-160.

27. Bousquet J, Van Cauwenberge P, Khaltaev N, Aria Workshop G, World Health O. Allergic rhinitis and its impact on asthma. The Journal of allergy and clinical immunology 2001;108:S147-334.

28. Bradding P, Holgate ST. Immunopathology and human mast cell cytokines. Crit Rev Oncol Hematol 1999;31:119-33.

29. Bradley BL, Azzawi M, Jacobson M, Assoufi B, Collins JV, Irani AM, et al. Eosinophils, T-lymphocytes, mast cells, neutrophils, and macrophages in bronchial biopsy specimens from atopic subjects with asthma: comparison with biopsy specimens from atopic subjects without asthma and normal control subjects and relationship to bronchial hyperresponsiveness. J Allergy Clin Immunol 1991;88:661-74.

30. Braun-Fahrlander C, Riedler J, Herz U, Eder W, Waser M, Grize L, et al. Environmental exposure to endotoxin and its relation to asthma in school-age children. N Engl J Med 2002;347:869-77.

93

31. Braunstahl GJ, Kleinjan A, Overbeek SE, Prins JB, Hoogsteden HC, Fokkens WJ. Segmental bronchial provocation induces nasal inflammation in allergic rhinitis patients. Am J Respir Crit Care Med 2000;161:2051-7.

32. Braunstahl GJ, Overbeek SE, Kleinjan A, Prins JB, Hoogsteden HC, Fokkens WJ. Nasal allergen provocation induces adhesion molecule expression and tissue eosinophilia in upper and lower airways. J Allergy Clin Immunol 2001;107:469-76.

33. Bullens DM, Truyen E, Coteur L, Dilissen E, Hellings PW, Dupont LJ, et al. IL-17 mRNA in sputum of asthmatic patients: linking T cell driven inflammation and granulocytic influx? Respir Res 2006;7:135.

34. Burbach GJ, Heinzerling LM, Edenharter G, Bachert C, Bindslev-Jensen C, Bonini S, et al. GA(2)LEN skin test study II: clinical relevance of inhalant allergen sensitizations in Europe. Allergy 2009;64:1507-15.

35. Chakir J, Shannon J, Molet S, Fukakusa M, Elias J, Laviolette M, et al. Airway remodeling-associated mediators in moderate to severe asthma: effect of steroids on TGF-beta, IL-11, IL-17, and type I and type III collagen expression. J Allergy Clin Immunol 2003;111:1293-8.

36. Chaudhry A, Rudra D, Treuting P, Samstein RM, Liang Y, Kas A, et al. CD4+ regulatory T cells control TH17 responses in a Stat3-dependent manner. Science 2009;326:986-91.

37. Ciprandi G, De Amici M, Murdaca G, Fenoglio D, Ricciardolo F, Marseglia G, et al. Serum interleukin-17 levels are related to clinical severity in allergic rhinitis. Allergy 2009;64:1375-8.

38. Ciprandi G, Filaci G, Battaglia F, Fenoglio D. Peripheral Th-17 cells in allergic rhinitis: New evidence. Int Immunopharmacol 2010;10:226-9.

39. Clifford RD, Howell JB, Radford M, Holgate ST. Associations between respiratory symptoms, bronchial response to methacholine, and atopy in two age groups of schoolchildren. Arch Dis Child 1989;64:1133-9.

40. Coffman RL. Origins of the T(H)1-T(H)2 model: a personal perspective. Nat Immunol 2006;7:539-41.

41. Cohn L, Elias JA, Chupp GL. Asthma: mechanisms of disease persistence and progression. Annu Rev Immunol 2004;22:789-815.

42. Comhair SA, Xu W, Ghosh S, Thunnissen FB, Almasan A, Calhoun WJ, et al. Superoxide dismutase inactivation in pathophysiology of asthmatic airway remodeling and reactivity. Am J Pathol 2005;166:663-74.

43. Crimi E, Spanevello A, Neri M, Ind PW, Rossi GA, Brusasco V. Dissociation between airway inflammation and airway hyperresponsiveness in allergic asthma. Am J Respir Crit Care Med 1998;157:4-9.

44. de la Fuente PT, Romagnoli M, Godard P, Bousquet J, Chanez P. Safety of inducing sputum in patients with asthma of varying severity. Am J Respir Crit Care Med 1998;157:1127-30.

45. de Meer G, Janssen NA, Brunekreef B. Early childhood environment related to microbial exposure and the occurrence of atopic disease at school age. Allergy 2005;60:619-25.

46. Denburg JA, Sehmi R, Saito H, Pil-Seob J, Inman MD, O'Byrne PM. Systemic aspects of allergic disease: bone marrow responses. The J Allergy Clin Immunol 2000;106:S242-6.

47. Djukanovic R, Roche WR, Wilson JW, Beasley CR, Twentyman OP, Howarth RH, et al. Mucosal inflammation in asthma. Am Rev Respir Dis 1990;142:434-57.

94

48. Dorman SC, Efthimiadis A, Babirad I, Watson RM, Denburg JA, Hargreave FE, et al. Sputum CD34+IL-5Ralpha+ cells increase after allergen: evidence for in situ eosinophilopoiesis. Am J Respir Crit Care Med 2004;169:573-7.

49. Douwes J, Gibson P, Pekkanen J, Pearce N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax 2002;57:643-8.

50. Dragon S, Saffar AS, Shan L, Gounni AS. IL-17 attenuates the anti-apoptotic effects of GM-CSF in human neutrophils. Mol Immunol 2008;45:160-8.

51. Dunican A, Grutkoski P, Leuenroth S, Ayala A, Simms HH. Neutrophils regulate their own apoptosis via preservation of CXC receptors. J Surg Res 2000;90:32-8.

52. Ebina M, Takahashi T, Chiba T, Motomiya M. Cellular hypertrophy and hyperplasia of airway smooth muscles underlying bronchial asthma. A 3-D morphometric study. Am Rev Respir Dis 1993;148:720-6.

53. Elias JA. Airway remodeling in asthma. Unanswered questions. Am J Respir Crit Care Med 2000;161:S168-71.

54. Eriksson J, Bjerg A, Lotvall J, Wennergren G, Ronmark E, Toren K, et al. Rhinitis phenotypes correlate with different symptom presentation and risk factor patterns of asthma. Respir Med 2011;105:1611-21.

55. Eustace A, Smyth LJ, Mitchell L, Williamson K, Plumb J, Singh D. Identification of cells expressing IL-17A and IL-17F in the lungs of patients with COPD. Chest 2011;139:1089-100.

56. Flood-Page PT, Menzies-Gow AN, Kay AB, Robinson DS. Eosinophil's role remains uncertain as anti-interleukin-5 only partially depletes numbers in asthmatic airway. Am J Respir Crit Care Med 2003;167:199-204.

57. Fossiez F, Djossou O, Chomarat P, Flores-Romo L, Ait-Yahia S, Maat C, et al. T cell interleukin-17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines. J Exp Med 1996;183:2593-603.

58. From the Global Strategy for Asthma Management and Prevention. Global Initiative for Asthma (GINA) 2012. Available from: http://www.ginasthma.org/.

59. Gaga M, Lambrou P, Papageorgiou N, Koulouris NG, Kosmas E, Fragakis S, et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clin Exp Allergy 2000;30:663-9.

60. Galli SJ, Tsai M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol 2010;40:1843-51.

61. Galli SJ, Tsai M, Piliponsky AM. The development of allergic inflammation. Nature. 2008;454:445-54.

62. Gauvreau GM, Evans MY. Allergen inhalation challenge: a human model of asthma exacerbation. Contrib Microbiol 2007;14:21-32.

63. Gauvreau GM, O'Byrne PM, Boulet LP, Wang Y, Cockcroft D, Bigler J, et al. Effects of an Anti-TSLP Antibody on Allergen-Induced Asthmatic Responses. N Engl J Med 2014.

64. Gauvreau GM, Watson RM, Rerecich TJ, Baswick E, Inman MD, O'Byrne PM. Repeatability of allergen-induced airway inflammation. J Allergy Clin Immunol 1999;104:66-71.

65. Gibson PG, Simpson JL, Saltos N. Heterogeneity of airway inflammation in persistent asthma : evidence of neutrophilic inflammation and increased sputum interleukin-8. Chest. 2001;119:1329-36.

95

66. Gounni AS, Lamkhioued B, Koussih L, Ra C, Renzi PM, Hamid Q. Human neutrophils express the high-affinity receptor for immunoglobulin E (Fc epsilon RI): role in asthma. FASEB J 2001;15:940-9.

67. Grimbaldeston MA, Metz M, Yu M, Tsai M, Galli SJ. Effector and potential immunoregulatory roles of mast cells in IgE-associated acquired immune responses. Curr Opin Immunol 2006;18:751-60.

68. Guerra S, Sherrill DL, Martinez FD, Barbee RA. Rhinitis as an independent risk factor for adult-onset asthma. J Allergy Clin Immunol 2002;109:419-25.

69. Hales BJ, Hazell LA, Smith W, Thomas WR. Genetic variation of Der p 2 allergens: effects on T cell responses and immunoglobulin E binding. Clin Exp Allergy. 2002;32:1461-7.

70. Hammad H, Chieppa M, Perros F, Willart MA, Germain RN, Lambrecht BN. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nat Med 2009;15:410-6.

71. Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, Turner H, Murphy TL, Murphy KM, et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol 2005;6:1123-32.

72. Hart PH. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunol Cell Biol 2001;79:149-53.

73. Hashimoto T, Akiyama K, Kobayashi N, Mori A. Comparison of IL-17 production by helper T cells among atopic and nonatopic asthmatics and control subjects. Int Arch Allergy Immunol 2005;137:51-4.

74. Hatzivlassiou M, Grainge C, Kehagia V, Lau L, Howarth PH. The allergen specificity of the late asthmatic reaction. Allergy. 2010;65:355-8.

75. Heinzerling LM, Burbach GJ, Edenharter G, Bachert C, Bindslev-Jensen C, Bonini S, et al. GA(2)LEN skin test study I: GA(2)LEN harmonization of skin prick testing: novel sensitization patterns for inhalant allergens in Europe. Allergy. 2009;64:1498-506.

76. Hellings PW, Kasran A, Liu Z, Vandekerckhove P, Wuyts A, Overbergh L, et al. Interleukin-17 orchestrates the granulocyte influx into airways after allergen inhalation in a mouse model of allergic asthma. Am J Respir Cell Mol Biol 2003;28:42-50.

77. Henness S, Johnson CK, Ge Q, Armour CL, Hughes JM, Ammit AJ. IL-17A augments TNF-alpha-induced IL-6 expression in airway smooth muscle by enhancing mRNA stability. J Allergy Clin Immunol 2004;114:958-64.

78. Holgate ST, Polosa R. The mechanisms, diagnosis, and management of severe asthma in adults. Lancet. 2006;368:780-93.

79. Holgate ST, Polosa R. Treatment strategies for allergy and asthma. Nat Rev Immunol 2008;8:218-30.

80. Hoshino H, Lotvall J, Skoogh BE, Linden A. Neutrophil recruitment by interleukin-17 into rat airways in vivo. Role of tachykinins. Am J Respir Crit Care Med 1999;159:1423-8.

81. Howarth PH, Wilson J, Djukanovic R, Wilson S, Britten K, Walls A, et al. Airway inflammation and atopic asthma: a comparative bronchoscopic investigation. Int Arch Allergy Appl Immunol 1991;94:266-9.

82. Infante-Duarte C, Horton HF, Byrne MC, Kamradt T. Microbial lipopeptides induce the production of IL-17 in Th cells. J Immunol 2000;165:6107-15.

96

83. Ito K, Chung KF, Adcock IM. Update on glucocorticoid action and resistance. J Allergy Clin Immunol 2006;117:522-43.

84. Ivanov, II, McKenzie BS, Zhou L, Tadokoro CE, Lepelley A, Lafaille JJ, et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 2006;126:1121-33.

85. Iwakura Y, Nakae S, Saijo S, Ishigame H. The roles of IL-17A in inflammatory immune responses and host defense against pathogens. Immunol Rev 2008;226:57-79.

86. Yao Z, Fanslow WC, Seldin MF, Rousseau AM, Painter SL, Comeau MR, et al. Herpesvirus Saimiri encodes a new cytokine, IL-17, which binds to a novel cytokine receptor. Immunity 1995;3:811-21.

87. Ye P, Rodriguez FH, Kanaly S, Stocking KL, Schurr J, Schwarzenberger P, et al. Requirement of interleukin 17 receptor signaling for lung CXC chemokine and granulocyte colony-stimulating factor expression, neutrophil recruitment, and host defense. J Exp Med 2001;194:519-27.

88. Ying S, Meng Q, Corrigan CJ, Lee TH. Lack of filaggrin expression in the human bronchial mucosa. J Allergy Clin Immunol 2006;118:1386-8.

89. Ying S, O'Connor B, Ratoff J, Meng Q, Mallett K, Cousins D, et al. Thymic stromal lymphopoietin expression is increased in asthmatic airways and correlates with expression of Th2-attracting chemokines and disease severity. J Immunol 2005;174:8183-90.

90. Jayaram L, Pizzichini MM, Cook RJ, Boulet LP, Lemiere C, Pizzichini E, et al. Determining asthma treatment by monitoring sputum cell counts: effect on exacerbations. Eur Respir J 2006;27:483-94.

91. Kay AB. The role of eosinophils in the pathogenesis of asthma. Trends Mol Med 2005;11:148-52.

92. Kay AB, Ali FR, Heaney LG, Benyahia F, Soh CP, Renz H, et al. Airway expression of calcitonin gene-related peptide in T-cell peptide-induced late asthmatic reactions in atopics. Allergy. 2007;62:495-503.

93. Kariyawasam HH, Aizen M, Barkans J, Robinson DS, Kay AB. Remodeling and airway hyperresponsiveness but not cellular inflammation persist after allergen challenge in asthma. Am J Respir Crit Care Med 2007;175:896-904.

94. Karjalainen EM, Lindqvist A, Laitinen LA, Kava T, Altraja A, Halme M, et al. Airway inflammation and basement membrane tenascin in newly diagnosed atopic and nonatopic asthma. Respir Med 2003;97:1045-51.

95. Kips JC, Fahy JV, Hargreave FE, Ind PW, in't Veen JC. Methods for sputum induction and analysis of induced sputum: a method for assessing airway inflammation in asthma. Eur Respir J Suppl 1998;26:9S-12S.

96. KleinJan A, Willart M, van Nimwegen M, Leman K, Hoogsteden HC, Hendriks RW, et al. United airways: circulating Th2 effector cells in an allergic rhinitis model are responsible for promoting lower airways inflammation. Clin Exp Allergy 2010;40:494-504.

97. Kobayashi T, Okamoto S, Hisamatsu T, Kamada N, Chinen H, Saito R, et al. IL23 differentially regulates the Th1/Th17 balance in ulcerative colitis and Crohn's disease. Gut. 2008;57:1682-9.

98. Koga C, Kabashima K, Shiraishi N, Kobayashi M, Tokura Y. Possible pathogenic role of Th17 cells for atopic dermatitis. J Invest Dermatol 2008;128:2625-30.

97

99. Kotaniemi-Syrjanen A, Vainionpaa R, Reijonen TM, Waris M, Korhonen K, Korppi M. Rhinovirus-induced wheezing in infancy--the first sign of childhood asthma? J Allergy Clin Immunol 2003;111:66-71.

100. Krisiukėnienė A, Šitkauskienė B, Malakauskas K, Sakalauskas R. Indukuotų skreplių sudėties savybės sergant alergine ir nealergine astma. Medicina. 2005;41:196-202.

101. Kusel MM, de Klerk NH, Kebadze T, Vohma V, Holt PG, Johnston SL, et al. Early-life respiratory viral infections, atopic sensitization, and risk of subsequent development of persistent asthma. J Allergy Clin Immunol 2007;119:1105-10.

102. Laan M, Cui ZH, Hoshino H, Lotvall J, Sjostrand M, Gruenert DC, et al. Neutrophil recruitment by human IL-17 via C-X-C chemokine release in the airways. J Immunol 1999;162:2347-52.

103. Laan M, Lotvall J, Chung KF, Linden A. IL-17-induced cytokine release in human bronchial epithelial cells in vitro: role of mitogen-activated protein (MAP) kinases. Br J Pharmacol 2001;133:200-6.

104. Langrish CL, Chen Y, Blumenschein WM, Mattson J, Basham B, Sedgwick JD, et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med 2005;201:233-40.

105. Larche M, Robinson DS, Kay AB. The role of T lymphocytes in the pathogenesis of asthma. J Allergy Clin Immunol 2003;111:450-63; quiz 64.

106. Lau S, Falkenhorst G, Weber A, Werthmann I, Lind P, Buettner-Goetz P, et al. High mite-allergen exposure increases the risk of sensitization in atopic children and young adults. J Allergy Clin Immunol 1989;84:718-25.

107. Lavinskiene S, Jeroch J, Malakauskas K, Bajoriuniene I, Jackute J, Sakalauskas R. Peripheral blood neutrophil activity during Dermatophagoides pteronyssinus-induced late-phase airway inflammation in patients with allergic rhinitis and asthma. Inflammation. 2012;35:1600-9.

108. Leigh R, Ellis R, Wattie JN, Hirota JA, Matthaei KI, Foster PS, et al. Type 2 cytokines in the pathogenesis of sustained airway dysfunction and airway remodeling in mice. Am J Respir Crit Care Med 2004;169:860-7.

109. Leynaert B, Bousquet J, Neukirch C, Liard R, Neukirch F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. J Allergy Clin Immunol. 1999;104:301-4.

110. Li MO, Wan YY, Flavell RA. T cell-produced transforming growth factor-beta1 controls T cell tolerance and regulates Th1- and Th17-cell differentiation. Immunity. 2007;26:579-91.

111. Linden A, Dahlen B. Interleukin-17 cytokine signalling in patients with asthma. Eur Respir J 2014.

112. Liu L, Jarjour NN, Busse WW, Kelly EA. Enhanced generation of helper T type 1 and 2 chemokines in allergen-induced asthma. Am J Respir Crit Care Med 2004;169:1118-24.

113. Lommatzsch M, Julius P, Kuepper M, Garn H, Bratke K, Irmscher S, et al. The course of allergen-induced leukocyte infiltration in human and experimental asthma. J Allergy Clin Immunol 2006;118:91-7.

114. Lotvall J, Ekerljung L, Lundback B. Multi-symptom asthma is closely related to nasal blockage, rhinorrhea and symptoms of chronic rhinosinusitis-evidence from the West Sweden Asthma Study. Respir Res 2010;11:163.

98

115. Majewski S, Cichocki P, Stepnicka-Bindemann M, Gorski P. Asthma control, quality of life and successful sputum induction. Arch Med Sci 2011;7:840-3.

116. Masoli M, Fabian D, Holt S, Beasley R, Global Initiative for Asthma P. The global burden of asthma: executive summary of the GINA Dissemination Committee report. Allergy. 2004;59:469-78.

117. McGeachy MJ, Bak-Jensen KS, Chen Y, Tato CM, Blumenschein W, McClanahan T, et al. TGF-beta and IL-6 drive the production of IL-17 and IL-10 by T cells and restrain T(H)-17 cell-mediated pathology. Nat Immunol 2007;8:1390-7.

118. McKinley L, Alcorn JF, Peterson A, Dupont RB, Kapadia S, Logar A, et al. TH17 cells mediate steroid-resistant airway inflammation and airway hyperresponsiveness in mice. J Immunol 2008;181:4089-97.

119. Miller MR, Hankinson J, Brusasco V, Burgos F, Casaburi R, Coates A, et al. Standardisation of spirometry. Eur Respir J 2005;26:319-38.

120. Milovanovic M, Drozdenko G, Weise C, Babina M, Worm M. Interleukin-17A promotes IgE production in human B cells. J Invest Dermatol 2010;130:2621-8.

121. Minai-Fleminger Y, Levi-Schaffer F. Mast cells and eosinophils: the two key effector cells in allergic inflammation. Inflamm Res 2009;58:631-8.

122. Miossec P, Korn T, Kuchroo VK. Interleukin-17 and type 17 helper T cells. N Engl J Med 2009;361:888-98.

123. Molet S, Hamid Q, Davoine F, Nutku E, Taha R, Page N, et al. IL-17 is increased in asthmatic airways and induces human bronchial fibroblasts to produce cytokines. J Allergy Clin Immunol 2001;108:430-8.

124. Monteseirin J. Neutrophils and asthma. J Investig Allergol Clin Immunol 2009;19:340-54.

125. Monteseirin J, Chacon P, Vega A, El Bekay R, Alvarez M, Alba G, et al. Human neutrophils synthesize IL-8 in an IgE-mediated activation. J Leukoc Biol 2004;76:692-700.

126. Monteseirin J, Vega A, Chacon P, Camacho MJ, El Bekay R, Asturias JA, et al. Neutrophils as a novel source of eosinophil cationic protein in IgE-mediated processes. J Immunol 2007;179:2634-41.

127. Mora J, Riggs EK, Fu J, MacGlashan DW, Jr., Fox SA, Yu B, et al. Expression of the high affinity IgE receptor by neutrophils of individuals with allergic asthma is both minimal and insensitive to regulation by serum IgE. Clin Immunol 2009;132:132-40.

128. Morgenstern V, Zutavern A, Cyrys J, Brockow I, Koletzko S, Kramer U, et al. Atopic diseases, allergic sensitization, and exposure to traffic-related air pollution in children. Am J Respir Crit Care Med 2008;177:1331-7.

129. Mosmann TR, Coffman RL. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 1989;7:145-73.

130. Muratov V, Barck C, Bylin G, Kallstrom E, Hallden G, van Hage M, et al. Allergen challenge alters intracellular cytokine expression. Scand J Immunol 2005;62:161-7.

131. Nakae S, Saijo S, Horai R, Sudo K, Mori S, Iwakura Y. IL-17 production from activated T cells is required for the spontaneous development of destructive arthritis in mice deficient in IL-1 receptor antagonist. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:5986-90.

132. Nakajima H, Iwamoto I, Tomoe S, Matsumura R, Tomioka H, Takatsu K, et al. CD4+ T-lymphocytes and interleukin-5 mediate antigen-induced eosinophil infiltration into the mouse trachea. Am Rev Respir Dis 1992;146:374-7.

99

133. National Heart Lung and Blood Institute. Global initiative for asthma : global strategy for asthma management and prevention. Rev. 2002. ed. Bethsda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service; 2002.

134. Niedbala W, Wei XQ, Cai B, Hueber AJ, Leung BP, McInnes IB, et al. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells. Eur J Immunol 2007;37:3021-9.

135. Nurieva R, Yang XO, Martinez G, Zhang Y, Panopoulos AD, Ma L, et al. Essential autocrine regulation by IL-21 in the generation of inflammatory T cells. Nature. 2007;448(7152):480-3.

136. O'Byrne PM. The demise of anti IL-5 for asthma, or not. Am J Respir Crit Care Med 2007;176:1059-60.

137. Ober C, Hoffjan S. Asthma genetics 2006: the long and winding road to gene discovery. Genes Immun. 2006;7:95-100.

138. Oppmann B, Lesley R, Blom B, Timans JC, Xu Y, Hunte B, et al. Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine, IL-23, with biological activities similar as well as distinct from IL-12. Immunity. 2000;13:715-25.

139. Ordonez CL, Khashayar R, Wong HH, Ferrando R, Wu R, Hyde DM, et al. Mild and moderate asthma is associated with airway goblet cell hyperplasia and abnormalities in mucin gene expression. Am J Respir Crit Care Med 2001;163:517-23.

140. Ordonez CL, Shaughnessy TE, Matthay MA, Fahy JV. Increased neutrophil numbers and IL-8 levels in airway secretions in acute severe asthma: Clinical and biologic significance. Am J Respir Crit Care Med 2000;161:1185-90.

141. Ouyang W, Kolls JK, Zheng Y. The biological functions of T helper 17 cell effector cytokines in inflammation. Immunity. 2008;28:454-67.

142. Paggiaro PL, Chanez P, Holz O, Ind PW, Djukanovic R, Maestrelli P, et al. Sputum induction. Eur Respir J Suppl 2002;37:3s-8s.

143. Pakhale S, Doucette S, Vandemheen K, Boulet LP, McIvor RA, Fitzgerald JM, et al. A comparison of obese and nonobese people with asthma: exploring an asthma-obesity interaction. Chest. 2010;137:1316-23.

144. Park HS, Jung KS. Enhanced neutrophil chemotactic activity after bronchial challenge in subjects with grain dust-induced asthma. Ann Allergy Asthma Immunol 1998;80:257-62.

145. Pelikan Z. Delayed asthmatic response to bronchial challenge with allergen-mediators, eicosanoids, eosinophil and neutrophil constituents in the blood and urine. Respiration 2011;82:225-36.

146. Pelletier M, Maggi L, Micheletti A, Lazzeri E, Tamassia N, Costantini C, et al. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood 2010;115:335-43.

147. Pene J, Chevalier S, Preisser L, Venereau E, Guilleux MH, Ghannam S, et al. Chronically inflamed human tissues are infiltrated by highly differentiated Th17 lymphocytes. J Immunol 2008;180:7423-30.

148. Pichavant M, Charbonnier AS, Taront S, Brichet A, Wallaert B, Pestel J, et al. Asthmatic bronchial epithelium activated by the proteolytic allergen Der p 1 increases selective dendritic cell recruitment. J Allergy Clin Immunol 2005;115:771-8.

100

149. Pizzichini E, Pizzichini MM, Efthimiadis A, Evans S, Morris MM, Squillace D, et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. Am J Respir Crit Care Med 1996;154:308-17.

150. Plaschke P, Janson C, Norrman E, Bjornsson E, Ellbjar S, Jarvholm B. Association between atopic sensitization and asthma and bronchial hyperresponsiveness in swedish adults: pets, and not mites, are the most important allergens. The J Allergy Clin Immunol 1999;104:58-65.

151. Ravensberg AJ, van Rensen EL, Grootendorst DC, de Kluijver J, Diamant Z, Ricciardolo FL, et al. Validated safety predictions of airway responses to house dust mite in asthma. Clin Exp Allergy 2007;37:100-7.

152. Renzi PM, Yang JP, Diamantstein T, Martin JG. Effects of depletion of cells bearing the interleukin-2 receptor on immunoglobulin production and allergic airway responses in the rat. Am J Respir Crit Care Med 1996;153:1214-21.

153. Robinson DS, Hamid Q, Ying S, Tsicopoulos A, Barkans J, Bentley AM, et al. Predominant TH2-like bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma. N Engl J Med 1992;326:298-304.

154. Roche WR, Beasley R, Williams JH, Holgate ST. Subepithelial fibrosis in the bronchi of asthmatics. Lancet 1989;1:520-4.

155. Rosenwasser LJ. Current understanding of the pathophysiology of allergic rhinitis. Immunol Allergy Clin North Am 2011;31:433-9.

156. Saffar AS, Alphonse MP, Shan L, Hayglass KT, Simons FE, Gounni AS. IgE modulates neutrophil survival in asthma: role of mitochondrial pathway. J Immunol 2007;178:2535-41.

157. Salo PM, Arbes SJ, Jr., Jaramillo R, Calatroni A, Weir CH, Sever ML, et al. Prevalence of allergic sensitization in the United States: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) 2005-2006. J Allergy Clin Immunol 2014.

158. Sanderson CJ. Interleukin-5, eosinophils, and disease. Blood 1992;79:3101-9. 159. Schnyder-Candrian S, Togbe D, Couillin I, Mercier I, Brombacher F, Quesniaux V,

et al. Interleukin-17 is a negative regulator of established allergic asthma. J Exp Med 2006;203:2715-25.

160. Schnyder B, Lima C, Schnyder-Candrian S. Interleukin-22 is a negative regulator of the allergic response. Cytokine 2010;50:220-7.

161. Semik-Orzech A, Barczyk A, Wiaderkiewicz R, Pierzchala W. Interleukin 17 and RANTES levels in induced sputum of patients with allergic rhinitis after a single nasal allergen challenge. Ann Allergy Asthma Immunol 2009;103:418-24.

162. Sergejeva S, Ivanov S, Lotvall J, Linden A. Interleukin-17 as a recruitment and survival factor for airway macrophages in allergic airway inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol 2005;33:248-53.

163. Shaaban R, Zureik M, Soussan D, Neukirch C, Heinrich J, Sunyer J, et al. Rhinitis and onset of asthma: a longitudinal population-based study. Lancet 2008;372:1049-57.

164. Shaw DE, Berry MA, Hargadon B, McKenna S, Shelley MJ, Green RH, et al. Association between neutrophilic airway inflammation and airflow limitation in adults with asthma. Chest 2007;132:1871-5.

165. Simpson JL, Grissell TV, Douwes J, Scott RJ, Boyle MJ, Gibson PG. Innate immune activation in neutrophilic asthma and bronchiectasis. Thorax 2007;62:211-8.

101

166. Soroosh P, Doherty TA. Th9 and allergic disease. Immunology. 2009;127:450-8. 167. Soumelis V, Reche PA, Kanzler H, Yuan W, Edward G, Homey B, et al. Human

epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP. Nat Immunol 2002;3:673-80.

168. Stein RT, Sherrill D, Morgan WJ, Holberg CJ, Halonen M, Taussig LM, et al. Respiratory syncytial virus in early life and risk of wheeze and allergy by age 13 years. Lancet 1999;354:541-5.

169. Stewart GA, Kollinger MR, King CM, Thompson PJ. A comparative study of three serine proteases from Dermatophagoides pteronyssinus and D. farinae. Allergy 1994;49:553-60.

170. Sun YC, Zhou QT, Yao WZ. Sputum interleukin-17 is increased and associated with airway neutrophilia in patients with severe asthma. Chin Med J (Engl) 2005;118:953-6.

171. Sur S, Crotty TB, Kephart GM, Hyma BA, Colby TV, Reed CE, et al. Sudden-onset fatal asthma. A distinct entity with few eosinophils and relatively more neutrophils in the airway submucosa? Am Rev Respir Dis 1993;148:713-9.

172. Tan HL, Regamey N, Brown S, Bush A, Lloyd CM, Davies JC. The Th17 pathway in cystic fibrosis lung disease. Am J Respir Crit Care Med 2011;184:252-8.

173. Tanaka J, Watanabe N, Kido M, Saga K, Akamatsu T, Nishio A, et al. Human TSLP and TLR3 ligands promote differentiation of Th17 cells with a central memory phenotype under Th2-polarizing conditions Clin Exp Allergy 2009;39:89-100.

174. ten Brinke A, de Lange C, Zwinderman AH, Rabe KF, Sterk PJ, Bel EH. Sputum induction in severe asthma by a standardized protocol: predictors of excessive bronchoconstriction. Am J Respir Crit Care Med 2001;164:749-53.

175. Teran LM, Carroll MP, Frew AJ, Redington AE, Davies DE, Lindley I, et al. Leukocyte recruitment after local endobronchial allergen challenge in asthma. Relationship to procedure and to airway interleukin-8 release. Am J Respir Crit Care Med 1996;154:469-76.

176. Thomas WR, Smith WA, Hales BJ, Mills KL, O'Brien RM. Characterization and immunobiology of house dust mite allergens. International archives of allergy and immunology. 2002;129:1-18.

177. Toosi S, Bystryn JC. Potential role of interleukin-17 in the pathogenesis of bullous pemphigoid. Med Hypotheses 2010;74:727-8.

178. Toren K, Olin AC, Hellgren J, Hermansson BA. Rhinitis increase the risk for adult-onset asthma--a Swedish population-based case-control study (MAP-study). Respir Med 2002;96:635-41.

179. Truyen E, Coteur L, Dilissen E, Overbergh L, Dupont LJ, Ceuppens JL, et al. Evaluation of airway inflammation by quantitative Th1/Th2 cytokine mRNA measurement in sputum of asthma patients. Thorax 2006;61:202-8.

180. Turner H, Kinet JP. Signalling through the high-affinity IgE receptor Fc epsilonRI. Nature 1999;402:B24-30.

181. Uddenfeldt M, Janson C, Lampa E, Rask-Andersen A. Sensitization to pets is a major determinant of persistent asthma and new asthma onset in Sweden. Ups J Med Sci 2013;118:111-21.

182. Upham JW, Denburg JA, O'Byrne PM. Rapid response of circulating myeloid dendritic cells to inhaled allergen in asthmatic subjects. Clin Exp Allergy 2002;32:818-23.

102

183. Van Der Veen MJ, Jansen HM, Aalberse RC, van der Zee JS. Der p 1 and Der p 2 induce less severe late asthmatic responses than native Dermatophagoides pteronyssinus extract after a similar early asthmatic response. Clin Exp Allergy 2001;31:705-14.

184. van Hamburg JP, Asmawidjaja PS, Davelaar N, Mus AM, Colin EM, Hazes JM, et al. Th17 cells, but not Th1 cells, from patients with early rheumatoid arthritis are potent inducers of matrix metalloproteinases and proinflammatory cytokines upon synovial fibroblast interaction, including autocrine interleukin-17A production. Arthritis Rheum 2011;63:73-83.

185. Vega A, Chacon P, Alba G, El Bekay R, Martin-Nieto J, Sobrino F. Modulation of IgE-dependent COX-2 gene expression by reactive oxygen species in human neutrophils. J Leukoc Biol 2006;80:152-63.

186. Wakashin H, Hirose K, Maezawa Y, Kagami S, Suto A, Watanabe N, et al. IL-23 and Th17 cells enhance Th2-cell-mediated eosinophilic airway inflammation in mice. Am J Respir Crit Care Med 2008;178:1023-32.

187. Wan H, Winton HL, Soeller C, Taylor GW, Gruenert DC, Thompson PJ, et al. The transmembrane protein occludin of epithelial tight junctions is a functional target for serine peptidases from faecal pellets of Dermatophagoides pteronyssinus. . Clin Exp Allergy 2001;31:279-94.

188. Wang YH, Wills-Karp M. The potential role of interleukin-17 in severe asthma. Curr Allergy Asthma Rep 2011;11:388-94.

189. Wang J, Visness CM, Calatroni A, Gergen PJ, Mitchell HE, Sampson HA. Effect of environmental allergen sensitization on asthma morbidity in inner-city asthmatic children Clin Exp Allergy 2009;39:1381-9.

190. Wang JY. The innate immune response in house dust mite-induced allergic inflammation. Allergy Asthma Immunol Res 2013;5:68-74.

191. Wang Q, Li H, Zhang Z, Yao Y, Zhou J. Prolonged ovalbumin challenge facilitates Th17 polarization in sensitized mice. Inflamm Res 2010;59:561-9.

192. Wardlaw AJ, Brightling C, Green R, Woltmann G, Pavord I. Eosinophils in asthma and other allergic diseases. Br Med Bull 2000;56:985-1003.

193. Waser M, von Mutius E, Riedler J, Nowak D, Maisch S, Carr D, et al. Exposure to pets, and the association with hay fever, asthma, and atopic sensitization in rural children. Allergy 2005;60:177-84.

194. Weidinger S, O'Sullivan M, Illig T, Baurecht H, Depner M, Rodriguez E, et al. Filaggrin mutations, atopic eczema, hay fever, and asthma in children. J Allergy Clin Immunol 2008;121:1203-9 e1.

195. Wenzel SE. Asthma: defining of the persistent adult phenotypes. Lancet 2006;368:804-13.

196. Whitehead GS, Wilson RH, Nakano K, Burch LH, Nakano H, Cook DN. IL-35 production by inducible costimulator (ICOS)-positive regulatory T cells reverses established IL-17-dependent allergic airways disease. J Allergy Clin Immunol 2012;129:207-15.

197. Williams CM, Rahman S, Hubeau C, Ma HL. Cytokine pathways in allergic disease. Toxicol Pathol 2012;40:205-15.

198. Wilson RH, Whitehead GS, Nakano H, Free ME, Kolls JK, Cook DN. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med 2009;180:720-30.

103

199. Zhang H, Cardell LO, Bjorkander J, Benson M, Wang H. Comprehensive profiling of peripheral immune cells and subsets in patients with intermittent allergic rhinitis compared to healthy controls and after treatment with glucocorticoids. Inflammation 2013;36:821-9.

200. Zhao Y, Yang J, Gao YD, Guo W. Th17 immunity in patients with allergic asthma. Int Arch Allergy Immunol 2010;151:297-307.

201. Zhou L, Chong MM, Littman DR. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity 2009;30:646-55.

202. Zhu J, Yamane H, Paul WE. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annu Rev Immunol 2010;28:445-89.

203. Ziolkowska M, Koc A, Luszczykiewicz G, Ksiezopolska-Pietrzak K, Klimczak E, Chwalinska-Sadowska H, et al. High levels of IL-17 in rheumatoid arthritis patients: IL-15 triggers in vitro IL-17 production via cyclosporin A-sensitive mechanism. J Immunol. 2000;164:2832-8.

104

DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS

Straipsniai leidiniuose, įtrauktuose į Mokslinės informacijos instituto duomenų bazę: 1. Bajoriuniene I, Malakauskas K, Lavinskiene S, Jeroch J, Sakalauskas

R. Th17 response to Dermatophagoides pteronyssinus is related to late-phase airway and systemic inflammation in allergic asthma. Int Immunopharmacol 2013;17:1020–7.

2. Bajoriuniene I, Malakauskas K, Lavinskiene S, Jeroch J, Gasiuniene E, Vitkauskiene A, et al. Peripheral blood Th17 cells and neutrophils in Dermatophagoides pteronyssinus-induced early- and late-phase asthmatic response. Medicina 2012;48:442–51.

3. Bajoriuniene I, Malakauskas K, Lavinskiene S, Jeroch J, Gasiuniene E, Vitkauskiene A, et al. Response of peripheral blood Th17 cells to inhaled Dermatophagoides pteronyssinus in patients with allergic rhinitis and asthma. Lung 2012;190:487–95.

Konferencijų tezės: 1. Bajoriūnienė I, Lavinskienė S, Malakauskas K, Sakalauskas R. Inter-

leukino 17 koncentracijos pokyčiai alergine astma sergančių ligonių indukuotuose skrepliuose ir serume po bronchų provokacijos specifiniu alergenu. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ir Lietuvos pulmonologų ir alergologų draugijos konferencijos "Pulmonologija, alergologija ir klinikinė imunologija 2013". Mokslinės tezės. Kaunas (Lietuva). 2013;12:32.

2. Bajoriūnienė I, Malakauskas K, Lavinskienė S, Jeroch J, Sakalauskas R. Th17 imuninis atsakas yra susijęs su vėlyvos fazės kvėpavimo takų ir sisteminiu uždegimu sergant alergine astma. VI nacionalinė dokto-rantų mokslinė konferencija „Mokslas – sveikatai“. Konferencijos pra-nešimų tezės. Kaunas (Lietuva). 2013;8:58–59.

3. Bajoriūnienė I, Malakauskas K, Lavinskienė S, Jeroch J, Sakalauskas R. Th17 response to inhaled Dermatophagoides pteronyssinus is related to late-phase airway and systemic inflammation in patients with allergic asthma. 11th ERS lung science conferece "Early origins and mecha-nisms of chronic lung disease". Estoril (Portugalija). 2013;82, PP101.

4. Bajoriūnienė I, Lavinskienė S, Gasiūnienė E, Malakauskas K, Sakalauskas R. Alergine astma sergančių ligonių periferinio kraujo Th17 kiekio ir IL-17 koncentracijos pokyčiai išsivysčius vėlyvajai

105

bronchų obstrukcijai po provokacijos alergenu. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ir Lietuvos pulmonologų ir alergologų draugijos konferencijos "Pulmonologija, alergologija ir klinikinė imunologija 2012". Mokslinės tezės. Kaunas (Lietuva).2012;10:73–74.

5. Bajoriūnienė I, Lavinskienė S, Gasiūnienė E, Sakalauskas R, Malakauskas K. Periferinio kraujo Th17 kiekio ir IL-17 koncentracijos serume pokyčiai sergantiesiems alerginėmis kvėpavimo ligomis po bronchų provokacijos specifiniu alergenu. V nacionalinė doktorantų mokslinė konferencija „Mokslas – sveikatai“ .Konferencijos tezių rinkinys. Kaunas (Lietuva). 2012;4:36/75.

6. Bajoriūnienė I, Malakauskas K, Lavinskienė S, Jeroch J, Gasiūnienė E, Vitkauskienė A, Sakalauskas R. Peripheral blood Th17 cells and serum IL-17 levels in patients with D. pteronyssinus-induced late-phase asthmatic response. 22nd European Respiratory Society Annual Congress. Vienna (Austrija). 2012, P2312.

7. Bajoriūnienė I, Lavinskienė S, Gasiūnienė E, Vitkauskienė A, Malakauskas K, Sakalauskas R. Interleukino 17 koncentracijos pokyčiai iškvėpiamo oro kondensate ir kraujo serume po provokacijos specifiniu alergenu sergant alerginėmis kvėpavimo takų ligomis. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ir Lietuvos pulmonologų ir alergologų draugijos konferencijos "Pulmonologija, alergologija ir klinikinė imunologija 2011". Mokslinės tezės. 2011; 2:26.

8. Bajoriūnienė I, Malakauskas K, Lavinskienė S, Gasiūnienė E, Jeroch J, Vitkauskienė A, Sakalauskas R. Late-breaking abstract: Interleukin 17 expression and peripheral blood neutrophils chemotaxis in patients with allergic rhinitis and asthma challenged with D. pteronyssinus. 21st European Respiratory Society Annual Congress Amsterdam (Olandija). 2011;38:604s.

Kitos publikacijos: 1. Bajoriūnienė I, Malakauskas K, Sakalauskas R. 17 tipo T ląstelės pa-

galbininkės ir jų reikšmė alerginės astmos patogenezėje. Pulmonologija, imunologija ir alergologija: PIA. Kaunas 2013;2(13):34–36.

2. Bajoriūnienė, I, Malakauskas K, Lavinskienė S, Jeroch J, Gasiūnienė E, Jackutė J, Vitkauskienė A, Sakalauskas R. Alerginė astma: nauji moksliniai tyrimai ir šiuolaikinis gydymas. Lietuvos gydytojo žurnalas. Kaunas, 2011; 9(43): 71–73.

106

PADĖKA

Dėkoju visiems, kurie padėjo man sėkmingai įvykdyti doktorantūros studijas.

Nuoširdžiai dėkoju mokslinio darbo vadovui LSMU MA Pulmonolo-gijos ir imunologijos klinikos prof. dr. Kęstučiui Malakauskui už žinias, vertingas konsultacijas ir nuoseklų bei konstruktyvų vadovavimą atliekant mokslinį tiriamąjį darbą.

Nuoširdžiai dėkoju LSMU MA Pulmonologijos ir imunologijos kli-nikos vadovui prof. dr. Raimundui Sakalauskui už suteiktą galimybę atlikti disertacinį darbą, už puikias darbo ir technines sąlygas mokslinio tiriamojo darbo įgyvendinimui.

Dėkoju Pulmonologijos ir imunologijos klinikos gydytojoms Elvyrai Draugelienei, Editai Gasiūnienei už pagalbą atliekant bronchų provokacijos mėginius; slaugytojoms Inesai Jermalavičienei, Linai Ignatavičienei už pa-galbą atliekant plaučių funkcijos mėginius ir rūpestingą pacientų priežiūrą.

Dėkoju LSMU MA Laboratorinės medicinos klinikos vadovei prof. dr. Astrai Vitkauskienei, laboratorinės medicinos gydytojoms dr. Daivai Urbonienei ir Vaidai Didžiariekienei už pagalbą atliekant praktinę mokslinio darbo dalį.

Dėkoju biologei ir LSMU MA Pulmonologijos ir imunologijos klinikos doktorantei Simonai Lavinskienei už pagalbą atliekant laboratorinius ty-rimus.

Dėkoju LSMU MA Pulmonologijos ir imunologijos klinikos Alergolo-gijos ir klinikinės imunologijos sektoriaus vadovei, prof. dr. Brigitai Šit-kauskienei už vertingus patarimus atliekant mokslinį darbą, atidžias moks-linių publikacijų recenzijas ir kritines pastabas bei nuoširdų palaikymą.

Dėkoju LSMU Mokslo centro vadovei doc. dr. Ingridai Ulozienei ir centro darbuotojoms už visapusišką pagalbą.

Dėkoju LSMU Mokslo fondui už materialinę paramą darbo priemonių įsigijimui.

Dėkoju Lietuvos mokslo tarybai už paskirtą doktoranto stipendiją už akademinius pasiekimus.

Nuoširdžiausiai dėkoju savo šeimai, išmokinusiai mane dirbti ir siekti tikslo, lydėjusiai supratimu ir meile.

107