Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 24 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren 2. Gaschromatographie 2.1 Einleitung/Messprinzip Als Gaschromatographie (GC) bezeichnet man alle Varianten der Chromatographie, bei denen als mobile Phase ein Gas eingesetzt wird. Meist wird ein inertes Gas verwendet, das mit den Analyten und der stationären Phase nicht in Wechselwirkung tritt, und einzig als Transportmittel für die Analyten durch die Säule dient. Die stationäre Phase ist entweder fest oder flüssig, wobei flüssige Phasen weitaus häufiger verwendet werden. GC ist eine sehr leistungsfähige Trennmethode (d.h., hohe Auflösung) vor allem für Substanzen, die bei Temperaturen bis ca. 300°C – 350°C einen genügend hohen Dampfdruck über der stationären Phase besitzen. GC wird routinemässig mit vielen verschiedenen Detektionsmethoden gekoppelt, was zusammen mit der häufig eingesetzten Automation wesentlich zur weiten Verbreitung der Methode beigetragen hat. In vielen Fällen ist GC vorgeschrieben als Referenzmethode, z.B. in Lebensmittel-, Pharma- und Umweltanalysen. 2.2. Apparatur Eine übliche GC-Apparatur besteht aus einer Gasversorgung (die mobile Phase, (a)), einer Gasflussregulierung (b), einer Injektionseinheit (c), einer Trennsäule (d), einer Temperaturregelung der GC-Kolonne (Ofen, (e)) und einem Detektor (f). Siehe Figur.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Datenerfassung und -speicherung

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 25 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Temperaturgradienten Neben der Auswahl der stationären Phase (Kap. 2.4.2) ist die Änderung der Temperatur, bei dem das chromatographisches Experiment durchgeführt wird, eine der wichtigsten Parameter, die in der Praxis zur Verbesserung der Auflösung verwendet wird. Um Peakform und Retentionszeit zu optimieren wird häufig ein Temperaturprogramm angewendet.

2.3 Mobile Phase Als mobile Phase (=Trägergas) werden meist inerte Gase eingesetzt wie He oder N2. Bei speziellen Detektoren werden auch andere Gase verwendet, wie H2 (siehe Kap.2.5). Die Wahl des Trägergases beeinflusst (aufgrund unterschiedliche Diffusionsgeschwindigkeiten der Analyten im Trägergas, siehe van-Deemter-Gleichung) u.a. die theoretische Bodenhöhe H. Um möglichst tiefe Nachweisgrenzen zu erzielen, muss grosser Wert auf die Reinheit des Trägergases gelegt werden. Organische Verunreinigungen im Trägergas können ein konstantes, erhöhtes Untergrundsignal im Detektor verursachen. Spuren von O2 können zudem bei höheren Temperaturen die stationäre Phase zerstören. Neben dem Einsatz von hochreinem Trägergas (z.B. 99.999% reinem He) werden auch Gasfilter wie gepackte Aktivkohlekolonnen zur zusätzlichen Reinigung des Trägergases eingesetzt.

____ Detektorsignal --- Temperaturverlauf

Zeit

isothermes Temeraturprogramm

Gradienten- temperaturprogramm

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 26 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Proben werden in gasförmiger, flüssiger oder fester Form über ein spezielles Einlass-System auf die Trennsäule aufgebracht (Injektor). Falls die Probe fest oder flüssig ist, muss der Injektor speziell geheizt werden, um die Analyten in die Gasphase zu überführen, wo sie mit dem Trägergasstrom in die Kolonne gelangen. Die Probe kann auch direkt auf den Anfang der Kolonne aufgetragen werden (on-column injection). 2.4 Stationäre Phase Die stationären Phasen, die in der GC verwendet werden, können in mehrere Kategorien eingeteilt werden. Zum einen unterscheidet man zwischen festen und flüssigen stationären Phasen, zum anderen wird zwischen gepackten Säulen und Kapillarsäulen unterschieden. Querschnitt durch eine (a) gepackte Säule und eine (b) Kapillarsäule (a) (b) Vergleich zwischen Kapillarsäule und gepackter Säule: Kapillarsäule Gepackte Säule Länge (m) 10-100 1-5 Innendurchmesser der Säule (mm) 0.1 – 0.5 1-4 Theoretische Böden/m 2000 - 4000 500 – 1000 Probemengen < 10 ng ng - mg

Partikelgrösse ca. 0.1mm

Filmdicke 0.1-5µm

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 27 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Gepackte Säulen werden heute immer seltener für analytische Zwecke eingesetzt, da sie deutlich geringere Trennleistungen aufweisen als Kapillarsäulen. Gepackte Säule Kapillarsäule

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 28 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren 2.4.1 Feste stationäre Phase Gaschromatographie mit festen stationären Phasen wird nur in sehr speziellen Fällen eingesetzt., z.B. in der Analyse von sehr flüchtigen gasförmigen Substanzen, wie Edelgase, CO2, NO2, Halogene, CH4 oder andere kleine organische Moleküle. Der Verteilungskoeffizient beruht hier auf der Adsorption der Analyten an der Oberfläche der stationären Phase. Es findet aber keine Diffusion in die stationäre Phase statt. Als feste Phasen werden meist sogenannte Molekularsiebe (poröse Aluminium-Silikatkörner) oder Polymere eingesetzt mit relativ gut definierten Porengrössen von wenigen Å Grösse. Es können entweder gepackte oder Kapillarsäulen verwendet werden.

Trennung eines flüchtiges Gasgemisches mit einer PLOT-Säule (Porous Layer Open Tubular Column). Stationäre Phase: Molekularsieb, 5µm dick, mit 5 Å Porengrösse, Säule: 30m x 0.53mm.

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 29 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren 2.4.2 Flüssige stationäre Phase In den meisten Fällen werden für die Gas-(Flüssig-)Chromatographie Kapillarsäulen verwendet, wobei die flüssige stationäre Phase folgende Kriterien erfüllen sollte:

physikalisch stabil (tiefer Dampfdruck)über den gewünschten Temperatur-Bereich chemisch stabil über den gewünschten Temperatur-Bereich (keine Zersetzung) chemisch inert (keine chemische Reaktionen mit den Analyten) richtige Selektivität für die Zielanalyten (spezifische Wechselwirkung)

Am häufigsten werden Materialien auf der Basis von Polysiloxan verwendet. Durch verschiedene Seitengruppen am Polysiloxangerüst können die Trenneigenschaften der stationären Phase stark beeinflusst werden. Der Hauptunterschied zwischen den verschiedenen stationären Phasen ist deren Polarität. Es gibt auch, sehr spezielle Phasen, die z.B. zur Trennung von Enantiomeren verwendet werden. Querschnitt durch eine Kapillarsäule

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 30 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Beispiele von häufig verwendeten flüssigen stationären Phasen:

Polysiloxane

O Si O

R

R

Si

R

R

R

R= Methyl, Phenyl, Cyanopropyl, Trifluoropropyl

In apolaren stationären Phasen findet eine Trennung hauptsächlich anhand des Siedepunktes statt (tief siedende Sunstanzen eluieren früh).

2. Polyethylenglykole (Carbowax) (polare Phase)

HO-CH2-CH2-O- CH2-CH2-O- CH2-CH2-OH n

Die Temperaturstabilität eines Säulenmaterials wird wesentlich von seiner Flüchtigkeit bestimmt. Bei höheren Temperaturen wird oft einer erhöhter Untergrund des Detektorsignals beobachtet (Säulenbluten genannt), was auf langsames Verdampfen und/oder Zersetzten der stationären Phase zurückzuführen ist.

In diesem Beispiel ist signifikantes Säulenbluten ab einer Temperatur von 270°C zu beobachten.

zunehmende Polarität

300°C

100°C 270°C Säulenbluten

Ofen: von 100°C auf 300°C mit 15°/min, dann für 12min bei 300°C

Zeit

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 31 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Bei einer neuen Säule kann das bluten oft durch langes ausheizen bei hoher Temperatur erniedrigt werden (Konditionieren einer Säule).

Normale Säulenmaterialien sind stabil bis ca. 300°C, durch Polymerisation der Polysiloxane kann die Flüchtigkeit und somit die Temperaturstabilität der stationären Phase erhöht werden. Mit Peroxyden können benachbarte Si-R Gruppen vernetzt werden

-Si-CH3 + H3C-R-

!

ROOH" # " " -Si-CH2-CH2-R-

vor konditionieren nach konditionieren

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 32 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Retentionsindex Kovats hat einen allgemeinen Parameter entwickelt um die Identifizierung der Substanzen in einem Chromatogramm zu vereinfachen. Die Retentionszeiten der n-Alkane dienen als Referenzpunkte. Die Zahl deren Kohlenstoffatomen x100 bilden die X-Achse. Die Indizes sind für die n-Alkane immer gleich. Für andere Substanzen sind die Indizes von der stationären Phase und Temperatur abhängig, aber reproduzierbar.

500 600 700 800

Zahl der C-atome X 100

+ „Eich“-Substanzen

O unbekannter Analyt

x100

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 33 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren 2.5 Detektoren Für die Messung der eluierenden Substanzen stehen in der GC eine Vielzahl von Detektoren zur Verfügung, die ans Ende der Chromatographiesäule gekoppelt werden. Ideale Detektoreigenschaften

Empfindlich Grosser dynamischer Bereich Linear Stabil Reproduzierbar Kurze Ansprechzeit Entweder sehr selektiv, oder völlig unselektiv Probe wird nicht zerstört

Flammenionisationsdetektor (FID)

Luft

Wasserstoff

Säule

Der FID ist wahrscheinlich der meist verwendete GC-Detektor. Die organischen Moleküle in der Probe, werden in der H2-reichen Teil der Flamme zu CH4 reduziert und dann im O2-reichen Teil oxidiert, wobei sie ionisiert werden. Der Ionenstrom wird oberhalb der Flamme

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 34 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren gemessen und ist proportional zur Menge Kohlenstoffatome, die in der Probe waren. Es werden Ionenströme im Nanoamperebereich gemessen. Eigenschaften eines FID:

- Unempfindlich auf nicht-organische Stoffe. - 10-13 g/s unteres Limit - 10-5 g/s oberes Limit (grosser dynamischen Bereich) - Robust, einfache Bauweise - Probe wird zerstört

Elektroneneinfangdetektor (Electron Capture Detector, ECD)

Säule

+-

beta-Emitter

Das Trägergas wird von β-Teilchen (e-) ionisiert. Als β-Quelle wird meist 63Ni eingesetzt. Die Elektronen und Ionen wandern zu den entsprechenden Elektroden, und erzeugen einen Strom. Falls ein Analytmolekül ein freies Elektron aufnimmt, kommen weniger Elektronen an der Elektrode an, und erzeugen einen kleineren Strom. Die viel grösseren Analyt-Ionen wandern aufgrund ihrer geringeren Diffusionsgeschwindigkeit nicht bis zur Messelektrode. Deshalb werden Moleküle mit elektronegativen Gruppen, wie Halogene, Peroxyde, Chinone oder Nitroverbindungen gut detektiert. Wenig elektronegative Moleküle werden schlecht detektiert, wie Amine, Alkohole oder reine Kohlenwasserstoffe. Diese Selektivität macht ECD besonders geeignet für die Analyse z.B. von halogenierten Pestiziden.

Ionenwolke

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 35 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD)

Heizstrom

Messelement

Säule

Die Wärmeleitfähigkeit von organischen Verbindungen ist typischerweise 6-10 Mal kleiner als diejenige von He oder H2. Das Gas überträgt somit weniger Wärme und die Temperatur des Messelements sinkt ab. Ein Wärmeleitfähigkeitselement leidet unter externen Effekten, vor allem Wärme von ausserhalb des Detektors. Dies kann behoben werden durch verwenden von zwei identische Elementen, eines am Ende der Säule, das von den Analyten durchströmt wird und eines durch das nur Trägergas strömt. Das Detektorsignal entspricht dann der Differenz der beiden Messelemente. Eigenschaften:

- Nachweisgrenze: 10-8 g/s, Dynamischer Bereich: 105 (rel. unempfindlich) - Universell - Relativ einfach und robust - Probe wird nicht zerstört. Dies erlaubt den WLD auch zu präperativen Zwecken einzusetzen.

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 36 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Spektroskopische Detektionsmethoden z. B. Atomemissionsdetektor

Säule

Ar

RF Spule

Spiegel

Gitter

Verbindungen, die aus der Säule eluieren werden in der sehr heissen Plasma-„Flamme“ (bis 10 000° C) verbrannt, wodurch eine vollständige Atomisierung erfolgt. Die Atome werden angeregt, und fluoreszieren bei charakteristischen Wellenlängen. Somit können bestimmte Elemente selektiv und simultan beobachtet werden und man bekommt mehrere element-selektive Chromatogramme. Solche spektroskopische Methoden sind eher exotische GC-Detektoren.

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 37 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Massenspektrometer (MS) Beispiel eines Elektronenstoss Ionisations - MS: Die Kopplung von GC mit MS ist von grosser praktischer Bedeutung. Die detaillierte Information, die mit MS gewonnen werden kann, erlaubt in vielen Fällen die genaue Identifikation der eluierenden Substanzen. Quadrupol-MS oder Ionenfallen (Ion trap) sind die üblichsten MS-Varianten, die mit GC gekoppelt werden. Da für die MS-Analyse tiefe Drücke (<10-6 Torr) nötig sind, muss das ständig nachfliesende Trägergas mit leistungsfähigen Pumpen in der Ionenquelle entfernt werden.

Filamentdraht: Emission von e - Elektronen

Eintritt der Ionen ins MS

Massenseparator (MS)

Ionisation der Analyten

Analyten treten in die Ionenquelle des MS ein

Ende der GC-Kolonne

Detektor

Ionenquelle

Pumpe

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 38 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Total Ion Chromatogram/Current (TIC):

Alle Ionen in einem grossen Massenbereich (z.B. zwischen m/z 50 –500) werden kurz hintereinander gemessen. Somit kann das ganze Fragmentierungsmuster erfasst werden, was nötig ist zur Identifizierung von Substanzen.

Single/Selected Ion Monitoring (SIM):

Nur ein oder einige wenige m/z werden gemessen - das resultierende Chromatogramm ist extrem spezifisch und es werden tiefere Nachweisgrenzen erreicht. Diese Detektionsmethode v.a. zur Quantifizierung im Spurenbereich eingesetzt.

MS-MS:

Ein Ion wird aus einem ersten Massenspektrometer selektiert und weitergeleitet, wo es durch weitere Stösse fragmentiert wird. Die resultierenden Fragmente werden darauf in einem zweiten Massenspektrometer gemessen. Somit können detaillierte Struktur-Informationen von einzelnen Ionen gewonnen werden. Dies ist eine wichtige Methode zur Strukturaufklärung von unbekannten Substanzen.

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 39 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren 2.6 Derivatisierungen Eine der grössten Limitierungen der GC ist, dass die zu analysierenden Verbindungen einen genügend grossen Dampfdruck über der stationären Phase haben müssen, damit sie durch die Säule transportiert werden können und nicht irreversibel in der Säule sitzen bleiben. Sehr schwerflüchtige oder sehr polare Verbindungen können meist nicht direkt mit GC analysiert werden. Viele polare Verbindungen kann man jedoch mit geeigneten chemischen Reaktionen in flüchtigere Derivate umwandeln, und sie so der GC zugänglich machen. Beispiele von Derivatisierungen Carbonylverbindungen (Aldehyde, Ketone) Es sind mehrere Derivatisierungsreagenzien kommerziell erhältlich, wie z.B. PFBHA (O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxyamin) das mit Carbonylen zu den entsprechenden flüchtigeren Oximen reagieren.

F CH2

FF

F F

O NH2 +

C

R

R

F CH2

FF

F F

O

N

O C

R

R

Silylierung (Alkohole, Carbonsäuren) Mit Silylierungsreaktionen werden OH-Gruppen in die entsprechenden Silylderivate verwandelt. Z.B. reagieren Alkohole mit BSTFA (N,O-bis (trimethylsilyl)-trifluoro-acetamid) zu Trimethylsilyl -Alkoholen.

HO R+

F3C

C

O

Si(CH3)3

N

Si(CH3)3

RO

Si(CH3)3 + Rest

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, 40 Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren Wann ist GC ungeeignet ? GC ist u.a. bei folgenden Situationen eine ungeeignete Trennmethode

GC-Problem mögliche Alternative

thermisch labile Substanzen (Zersetzungstemperatur < Elutionstemperatur im GC)

- HPLC Substanz- eigenschaften

zu wenig flüchtig, z.B. zu polar

- derivatisieren - HPLC

zu viele Analyten in der Probe (ungenügende Auflösung)

- verbesserte Probenvorbereitung (z.B. Reinigung) - Herstellung/Sammeln der Probe verbessern - selektiveren Detektor

Proben- eigenschaften

zu viel „Dreck“ in der Probe (ungenügende Auflösung, Injektor, Säule verschmutzen)

- verbesserte Probenvorbereitung (z.B. Reinigung)