D. No: ZV-3046-KK-10.R15

25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analysis Kit

User Manual

ZV-3046-0200-10

200

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

2

Contents 1. INTENDED USE ........................................................................................................................................ 3

2. SUMMARY AND EXPLANATION ........................................................................................................ 3

3. IVD SYMBOLS............................................................................................................................................ 4

4. TEST PRINCIPLE...................................................................................................................................... 4

5. WARNINGS AND PRECAUTIONS ...................................................................................................... 4

6. STORAGE AND STABILITY .................................................................................................................. 5

7. MATERIALS SUPPLIED ......................................................................................................................... 5

8. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED ............................................................................. 6

9. PROCEDURE NOTES .............................................................................................................................. 7

10. PRE-SETUP INSTRUCTIONS ............................................................................................................... 7

11. LIMITATIONS OF PROCEDURE ......................................................................................................... 8

12. SAMPLE PRETREATMENT .................................................................................................................. 8

13. QUALITY CONTROL ................................................................................................................................ 9

14. CALCULATION OF RESULTS ............................................................................................................... 9

15. INTERPRETATION OF RESULTS .................................................................................................... 10

16. EXPECTED VALUES ............................................................................................................................. 10

17. LC-MS/MS PARAMETERS ................................................................................................................. 11

18. ANALYTICAL PERFORMANCE ........................................................................................................ 13

19. SAMPLE CHROMATOGRAM ............................................................................................................. 14

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

3

1. INTENDED USE

Quantitative HPLC analysis kit for 25-hydroxy metabolites of Vitamin D2 and D3 in

human serum samples.

2. SUMMARY AND EXPLANATION

Vitamin D, commonly known as the “sunshine vitamin”, is essential for maintaining

calcium metabolism and bone health. The major physiologic function of Vitamin D is

to maintain the blood calcium and phosphorus levels within the normal range in order

to maintain metabolic functions that are essential for most life processes, Vitamin D3

and Vitamin D2 are metabolized to 25-OH-Vitamin D3 and 25-OH-Vitamin D2 in the

liver by the 25-OHase enzyme. The quantitation of these metabolites is widely used

for determining of vitamin D status in human. The Vitamin D status has a clinical

significance in a variety of disorders which related to hormones. The measurements

of the serum concentration of 25-OH-Vitamin D3 and 25-OH-Vitamin D2 have been

used for differential diagnosis of hypocalcemic and hypercalcemic metabolic bone

disorders.

The analysis of these metabolites is considered to be difficult. Some reasons of the

difficulties are given below.

- The low concentrations of 25-OH Vitamin D metabolites in serum (level of μg/L).

- The low stability in the presence of light and heat.

- The presence of other metabolites which have chemical similarity.

- The large amount of other related neutral lipids (such as cholesterol)

25-OH Vitamin D2-D3 HPLC Analysis Kit was developed for rapid, automated,

sensitive and reliable quantitative detection of the 25-OH Vitamin D2-D3

concentrations in human serum samples and it gives results in 2 minutes. Main

methods and procedures that have been selected are based on EN ISO 13485 and

98/79/EC.

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

4

3. IVD SYMBOLS

Conformite European

Manufacturer

In vitro diagnostic

Order number

Lot number

Sufficient for <N> Tests

Temperature limits

4. TEST PRINCIPLE

The 25-hydroxyvitamin D metabolites are extracted from human serum samples

using an organic extraction solution after deproteinization step. Separation was made

with an isocratic elution on Zivak 25-OH Vitamin D HPLC column and measured by

Tandem mass spectrometer system.

5. WARNINGS AND PRECAUTIONS

For in-vitro diagnostic use only.

For professional use only.

Read the instructions carefully, before you start.

In case of damage of the kit package, please contact Zivak or your supplier.

Do not use expired kits and components.

Please check the lot number and expiry date before start.

Protective gloves and goggles should be worn.

Please take any necessary precautions to prevent infection with blood borne

pathogens while working with biological fluids. Appropriate bio-safety

precautions and disposal of bio-hazardous wastes should be followed.

Please check the labels on reagent bottles. Reagents of this kit contain hazardous

material may cause eye and skin irritations.

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

5

6. STORAGE AND STABILITY

This analysis kit can be shipped at room temperature.

Serum controls, calibrators and reagent 2 must be stored at 2-8 °C until

reconstitution.

After arrival, mobile phases and reagent 1 must be stored at room temperature.

After reconstitution serum calibrators and controls must be stored at -20 °C.

All components are guaranteed until expiry date when stored at recommended

temperatures and used as described in these instructions.

7. MATERIALS SUPPLIED

Order No Volume Symbol Component

ZV-3046-02R1-10 3 x 45 mL

Reagent 1, Contains aqueous buffer

ZV-3046-02R2-10 3 x 45 mL

Reagent 2, Contains Internal Standard

ZV-3046-02MP-10 1 x 0.5 L

Mobile Phase A, Contains organic solvent

ZV-3046-02MT-10 1 x 0.5 L

SPE Buffer, Contains organic solvent

ZV-3046-02WB-10 2 x 1 L

Wash Solution

ZV-4027-KK-10 1 x 1 pc

User Guide

R1

R2

WB

KK

MA

MB

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

6

8. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Materials listed in the table below are required and should be ordered separately.

Order No Volume Symbol Component

ZV-3046-02S1-10 1 x 3 mL

Lyophilized, Serum Calibrator Level-1

ZV-3046-02S2-10 1 x 3 mL

Lyophilized, Serum Calibrator Level-2

ZV-3046-02S3-10 1 x 3 mL

Lyophilized, Serum Calibrator Level-3

ZV-3046-02S4-10 1 x 3 mL

Lyophilized, Serum Calibrator Level-4

ZV-3046-02S5-10 1 x 3 mL

Lyophilized, Serum Calibrator Level-5

ZV-3046-02S6-10 1 x 3 mL

Lyophilized, Serum Calibrator Level-6

ZV-3046-02K1-10 1 x 3 mL

Lyophilized, Serum Control Level-1

ZV-3046-02K2-10 1 x 3 mL

Lyophilized, Serum Control Level-2

ZV-3046-02C1-10 1 x 1 pc 25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analytical Column

ZV-3046-CSPE-10 1 x 1 pc 25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS Trap Column Cartridge

ZV-3046-02C2-10 1 x 1 pc 25-Hydroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS Trap Column Holder

ZS-9020-0001-00 200 – 1000 µL pipette

ZS-9007-0500-00 200 – 1000 µL pipette tips

ZS-2ML-8-1001 2 x 100 pc 2 mL glass vial

ZS-9004-0100-00 2 x 100 pc 2 mL glass vial caps pre-slit

Distilled or deionized water

Calibrator Level 1

Calibrator

Level 2

Calibrator Level 3

Calibrator

Level 4

Control Level 1

Control Level 2

Calibrator Level 5

Calibrator Level 6

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

7

9. PROCEDURE NOTES

Any inappropriate handling of samples or modification of the test procedure may

influence the results. The indicated pipetting volumes, temperatures and pre-

treatment steps have to be performed strictly according to the instructions. Use

calibrated pipettes and devices only.

Once the test has been started, all steps should be completed without interruption.

Make sure that required reagents, materials and devices are prepared ready at the

appropriate time.

Leave aside all reagents to reach room temperature (18-25 °C) and gently swirl each

vial of liquid reagent before use. Mix reagents without foaming.

Avoid contamination of reagents, pipettes and tubes. Use new disposable plastic

pipette tips for each reagent, standard or specimen. Do not interchange the vial caps.

Always keep vials closed when not been used. Do not re-use vials.

10. PRE-SETUP INSTRUCTIONS

Instrument Setup

• Purge HPLC pumps with 5000 µL/min flow rate after connecting mobile phase A

and SPE buffer. Purge pumps until there are no air bubbles inside the tubing lines.

• Connect wash solution into system and purge syringe pumps until there are no air

bubbles in tubing lines.

• Make sure the bottle of mobile phase is closed well, otherwise components

of the mobile phase could evaporate; this alters the retention times.

• Wait for 15 minutes for conditioning after activating method.

Valve Connections

Injection Valve

Switching Valve

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

8

Preparation of Calibrators

• Add 3 mL of deionized water to each serum calibrator and dissolve.

• After preparation, they must be aliquoted into 450 µL volumes and stored at -

20°C.

Preparation of Controls

• Add 3 mL of deionized water to each serum control and dissolve.

• After preparation, they must be aliquoted into 450 µL volumes and stored at -

20°C.

11. LIMITATIONS OF PROCEDURE

Specimen collection and storage have a significant effect on the test results. Serum

samples from earlier days must be kept frozen before the analysis.

12. SAMPLE PRETREATMENT

Sample Pretreatment (Manual)

Take 400 µL of patient sample (or calibrators and controls) into the sample preparation tube.

Add 450 µL Reagent 1 and vortex for 10 seconds.

Add 400 µL Reagent 2 and vortex for 10 seconds.

Centrifuge at 5000 rpm x 3 minutes.

0.5 mL Take the upper phase to vial.

Inject 50 µL to LC-MS/MS system.

Prepared samples are stable for 24 hours at 2-4 °C temperature.

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

9

Sample Pretreatment (Automated)

If Calibrator/Control will be analyzed, take 400 µL of calibrator/control sample into glass vial and put vials into related tray on instrument.

Place serum samples into system tray on Zivak Multitasker Full Automated Sample Preparation and Injection System.

Analysis will automatically start after clicking Start button on software.

Injections, calculations and reporting done automatically by instrument.

Prepared samples are stable for 24 hours at 2-4 °C temperature.

13. QUALITY CONTROL

The test results are only valid if the test has been performed by following the

instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good

Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All standards and kit

controls must be found within the acceptable ranges as stated on the QC (Quality

Control) Certificate. If the criteria are not met, the run is not valid and should be

repeated.

Each laboratory should use known samples as further controls. In case of any

deviation, the following technical issues should be proven.

Expiry dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation

conditions and washing methods. It is recommended to participate at appropriate

quality assessment trials.

14. CALCULATION OF RESULTS

Results of Vitamin D2 and D3 will be calculated by the ratio between compound peak

area to Internal Standard area. A linear calibration curve will created with these ratios

from each calibrator levels. Calculation formula is given below.

𝐷3 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =𝐷3 𝐴𝑟𝑒𝑎

𝐼𝑆 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐷3 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =

𝐷3 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡

𝐼𝑆 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡

𝐷2 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =𝐷2 𝐴𝑟𝑒𝑎

𝐼𝑆 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝐷2 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =

𝐷2 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡

𝐼𝑆 𝐴𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡

Sample signals above the highest control level have to be confirmed by a reference

method.

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

10

15. INTERPRETATION OF RESULTS

Various societies recommend different Cut-Off values for repetition of the

measurement and the application of confirmatory assays. Depending on the

application of patient samples from different populations, it is highly recommended

that each laboratory establishes its own range of normal values and that this

distribution of values is coordinated with the recommendations of the responsible

society of this geographic region.

The results themselves should not be the only reason for any therapeutic

consequences. They have to be correlated to other clinical observations and

diagnostic tests.

16. EXPECTED VALUES

These reference ranges represent clinical decision values, based on the 2011 Institute

of Medicine report, that apply to males and females of all ages, rather than population-

based reference values. Population reference ranges for 25-OH-VitD vary widely

depending on ethnic background, age, geographic location of the studied populations,

and the sampling season.

<10 ng/mL Severe

deficiency Could be associated with osteomalacia or rickets

10-19 ng/mL Mild to

moderate deficiency

May be associated with increased risk of osteoporosis or secondary hyperparathyroidism

20-50 ng/mL Optimum

levels

Optimum levels in the healthy population; patients with bone disease may benefit from higher levels within this range

51-80 ng/mL

Increased risk of

hypercalciuria

Sustained levels >50 ng/mL 25OH-Vitamin D along with prolonged calcium supplementation may lead to hypercalciuria and decreased renal function

>80 ng/mL Toxicity possible

80 ng/mL is the lowest reported level associated with toxicity in patients without primary hyperparathyroidism who have normal renal function. Most patients with toxicity have levels >150 ng/mL. Patients with renal failure can have very high 25-OH-Vitamin D levels without any signs of toxicity, as renal conversion to the active hormone 1.25-OH-Vitamin D is impaired or absent

It is recommended that each laboratory establishes its own range of normal values.

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

11

17. LC-MS/MS PARAMETERS

Instrument Zivak Tandemgold LC-MS/MS System

Column Zivak 25-Hidroxyvitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analytical Column

Injection Volume

50 µL

Ionization Mode

APCI Positive

CID Gas 2.4 mTorr

API Nebulizing Gas

55 psi

Vaporizer Gas 15 psi

Vaporizer Gas Temperature

350 °C

Drying Gas 25 psi

Drying Gas Temperature

300 °C

Spray Chamber Temperature

60 °C

SIM Width 1.5 amu

Scan Time 0.600 seconds

Corona Current 10 µA

Shield Voltage 600 V

Detector Voltage

1600 V

Pump Program

Time (min)

Flow Rate (µL/min)

%A %B

1 00.00 700 50 50

2 02.00 700 50 50

Online SPE Valve Program

Time (min)

Position

1 00.00 Load

2 00.40 Inject

3 01.80 Load

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

12

MS Scan Parameters

No Analyte Retention

Time (min) First Mass

(m/z)

Second Mass (m/z)

Capillary (eV)

CE

1 25-OH Vitamin D3 1.06 (+) 383.3 257.3 80 V 16 V

2 25-OH Vitamin D2 1.11 (+) 395.3 269.2 80 V 18 V

3 IS 1.06 (+) 389.3 263.3 80 V 16 V

Multitasker Method Parameters

Parameter Barcode Reading

Sample Adding

Reagent Adding (R1)

Reagent Adding (R2)

Centrifuge Sample

Injection

Process Type Parallel Serial Parallel Parallel Parallel Serial

From

Tray Sample

Tray Sample

Tray LR LR

Analysis Tray

Analysis Tray

Vial 1 1 1 2 1 1

Needle Height - 7 0 0 0 1.3 mm

Quantity - 500 650 µL 650 µL - 60 µL

Use Detection - Active Passive Passive - Active

Search Limit - 10 - - - 0

Shake Passive - Passive Passive - Passive

To

Tray - Analysis

Tray Analysis Tray

Analysis Tray

- -

Vial - 1 1 1 - -

Needle Height - 15 17 18 - -

Amount - 400 450 µL 400 µL - -

Washing

Wash Place - 1. Wash C 2. Wash A

1. Wash B 2. Wash A

1. Wash B 2. Wash C 3. Wash A

-

1. Wash C 2. Injection

Valve 3. Wash A

Syringe Pump - Reagent Syringe

Reagent Syringe

Reagent Syringe

- Reagent Syringe

Volume x Count - 1. 1000 x 2 2. 500 x 2

1. 10000 x 1 2. 500 x 1

1. 10000 x 1 2. 500 x 1 3. 500 x 1

- 1. 3000 x 1 2. 1000 x 1 3. 1000 x 1

Aspirate Port - I6 I6 I6 - I6

Dispense Port - 1. O4 2. O1

O1 1. O1 2. O4 3. O1

- 1. O4 2. O1 3. O1

Syringe Speeds

Syringe Pump - Reagent Syringe

Reagent Syringe

Reagent Syringe

- XCalibur

Aspirate Speed / Wait / Port

- 18 / 1500 /

I1 13 / 3000 /

I2 13 / 3000 /

I5 - 16 / 1500

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

13

Dispense Speed / Wait / Port

- 14 / 1500 /

O1 14 / 3000 /

O1 14 / 3000 /

O1 - 18 / 1500

Waste Before

Quantity - - 10000 10000 - -

To - - Wash B Wash B - -

Air Segment

Quantity - 20 20 20 - 20

Selection - At First At First At First - At First and

Last

Centrifuge

Run Time - - - - 1 min -

Speed - - - - 5000 RPM -

Vortex - - - - Active -

V. Run Time - - - - 1 min -

V. Speed - - - - 1000 RPM -

Purge Before

Wash Place Syringe P. Volume Repeat Aspirate P. Dispense P.

Wash A Reagent Syringe

1000 2 I6 O1

Batch

Parameter Value Batch Active

Batch Count 108

18. ANALYTICAL PERFORMANCE

No Analyte Accuracy

(%)

Intra-assay Precision

(%CV)

Inter-assay Precision

(%CV)

1 25-OH

Vitamin D3 94.7 2.16 2.74

2 25-OH

Vitamin D2 96.4 4.60 4.74

No Analyte LOD

(µg/L) LOQ

(µg/L) Linearity

(R2)

1 25-OH

Vitamin D3 1.48 4.90 0.993

2 25-OH

Vitamin D2 1.06 3.50 0.992

Analytical Specificity (Cross Reactivity): No cross-reactivity was found with the typical substances tested.

D. No: ZV-3046-KK-10.R15

14

19. SAMPLE CHROMATOGRAM

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analiz Kiti

Kullanım Kılavuzu

ZV-3046-0200-10

200

2-8 °C

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

2

İçindekiler 1. KULLANIM AMACI .................................................................................................................................. 3

2. ÖZET VE AÇIKLAMA .............................................................................................................................. 3

3. IVD SEMBOLLERİ .................................................................................................................................... 3

4. TEST PRENSİBİ ........................................................................................................................................ 4

5. UYARILAR VE ÖNLEMLER .................................................................................................................. 4

6. SAKLAMA VE DAYANIKLILIK ............................................................................................................ 4

7. KİT İÇERİĞİ ................................................................................................................................................ 5

8. KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER ............................................................. 6

9. ÇALIŞMA NOTLARI ................................................................................................................................. 6

10. TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR .............................................................................................................. 7

11. YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR.......................................................................................................... 8

12. NUMUNE HAZIRLIĞI .............................................................................................................................. 8

13. KALİTE KONTROL .................................................................................................................................. 9

14. SONUÇLARIN HESAPLANMASI ......................................................................................................... 9

15. SONUÇLARIN YORUMLANMASI..................................................................................................... 10

16. BEKLENEN DEĞERLER ...................................................................................................................... 10

17. LC-MS/MS PARAMETRELERİ ......................................................................................................... 11

18. ANALİTİK PERFORMANS .................................................................................................................. 13

19. ÖRNEK KROMATOGRAM .................................................................................................................. 14

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

3

1. KULLANIM AMACI

Serum ve plazma numunelerinde Vitamin D2 ve D3’ün 25-hidroksivitamin

metabolitlerinin LC-MS/MS yöntemi ile kantitatif analizi.

2. ÖZET VE AÇIKLAMA

Vitamin D, halk arasında ‘güneş ışığı vitamini’ olarak bilinen, kalsiyum metabolizması

ve kemiklerin sağlığı açısından çok önemli olan bir maddedir. Vitamin D’nin en önemli

fizyolojik fonksiyonu yaşamsal faaliyetler için gerekli olan kalsiyum ve fosforun

kandaki seviyesini belirli limitler içinde tutmaktır. Vitamin D2 ve D3 karaciğerde 25-

hidroksilaz enzimi tarafından sırasıyla 25-OH Vitamin D2 ve D3’e metabolize

edilmektedir. Bu metabolitlerin miktar tayini yaygın olarak insan kanındaki vitamin

D miktarını tespit etmek için kullanılmaktadır. Vücuttaki Vitamin D durumu

hormonlara bağlı olan birçok hastalık için klinik anlamda önem taşır. 25-OH-Vitamin

D3 ve 25-OH-Vitamin D2 serumdaki konsantrasyonlarının miktarı hipokalsemik ve

hiperkalsemik gibi metabolik kemik hastalıklarının ayrıcı tanısında kullanılır.

Bu metabolitlerin analizi aşağıdaki bazı nedenlerden dolayı oldukça zordur.

- Serumdaki düşük 25-OH Vitamin D metabolit konsantrasyonu(μg/L seviyesinde).

- Işık ve sıcaklık etkisi altında düşük kararlılık.

- Benzer kimyasal özelliklere sahip başka metabolitlerin varlığı.

- Kolesterol gibi doğal yağların fazla miktarda bulunması

25-Hidtoksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analiz Kiti ile serumdaki 25-OH

Vitamin D2-D3 metabolit konsantrasyonlarının ölçümü hızlı, hassas ve güvenilir bir

biçimde 2 dakikada sonuç alacak şekilde yapılabilmektedir. Kullanılan yöntem ve

prosedürler EN ISO 13485 ve 98/79/EC direktiflerine dayanmaktadır.

3. IVD SEMBOLLERİ

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

4

Conformite European

Üretici firma

In vitro diagnostic

Sipariş kodu

Lot numarası

<N> Test için yeterli

Sıcaklık aralığı

4. TEST PRENSİBİ

25-hidroksivitamin D metabolitleri, deproteinizasyon adımından sonra bir organik

ekstraksiyon çözeltisi kullanılarak insan serum örneklerinden ekstrakte edilir. Daha

sonra, bu metabolitlerin Zivak 25-OH Vitamin D UHPLC kolonu kullanarak izokratik

ayırımı sağlanır ve ölçümü tandem kütle spektrometresi ile yapılır.

5. UYARILAR VE ÖNLEMLER

Sadece in-vitro tanı amaçlı kullanım içindir.

Yalnızca profesyonel kullanım içindir.

Başlamadan önce talimatları dikkatli bir şekilde okuyun.

Kit paketinin hasar görmesi durumunda lütfen Zivak veya tedarikçiniz ile temasa

geçin.

Süresi geçmiş kitleri ve bileşenleri kullanmayın.

Başlamadan önce lot numarası ve son kullanma tarihini kontrol edin.

Koruyucu eldiven ve gözlük takılmalıdır.

Biyolojik sıvılarla çalışırken kan yoluyla bulaşan patojenlerle bulaşmayı önlemek

için lütfen gerekli tedbirleri alın. Uygun biyogüvenlik önlemleri alınmalı ve

biyolojik tehlikeli atıkların atılması prosedürü takip edilmelidir.

Lütfen reaktif şişeleri üzerindeki etiketleri kontrol edin. Bu kitin reaktifleri

tehlikeli madde içerdiğinden göz ve cilt tahrişlerine neden olabilir.

6. SAKLAMA VE DAYANIKLILIK

• Bu analiz kiti oda sıcaklığında saklanabilir.

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

5

• Reaktif 2, Serum kalibratör ve kontrolleri 2-8 °C’de saklanmalıdır.

• Serum kalibratör ve kontrolleri saf su ile çözüldükten sonra -20 °C’de

saklanmalıdır.

• Diğer bileşenler oda sıcaklığında saklanmalıdır.

• Tüm bileşenler, tavsiye edilen sıcaklıklarda depolandığında ve bu talimatlarda

açıklandığı gibi kullanıldığı takdirde son kullanma tarihine kadar garanti

kapsamındadır.

7. KİT İÇERİĞİ

Sipariş Kodu Miktar Sembol Bileşen

ZV-3046-02R1-10 3 x 45 mL

Reaktif 1, Sulu tampon içerir

ZV-3046-02R2-10 3 x 45 mL

Reaktif 2, İnternal standart içerir

ZV-3046-02MP-10 1 x 0,5 L

Mobil Faz A, Organik çözücü içerir

ZV-3046-02MT-10 1 x 0,5 L

SPE Buffer, Organik çözücü içerir

ZV-3046-02WB-10 2 x 1 L

Yıkama Solüsyonu

ZS-2ML-8-1001 2 x 100 adet 2 mL cam vial

ZS-9004-0100-00 2 x 100 adet 2 mL kesikli cam vial kapağı

ZV-3046-KK-10 1 x 1 adet

Kullanım Kılavuzu

R1

R2

MA

SPE

WB

KK

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

6

8. KİT İÇERİĞİ DIŞINDA GEREKLİ OLAN MALZEMELER Aşağıdaki tabloda yer alan ürünler ayrıca sipariş edilmelidir.

Sipariş Kodu Miktar Sembol Bileşen

ZV-3046-02S1-10 1 x 3 mL

İyofilize, Serum Kalibratör Level-1

ZV-3046-02S2-10 1 x 3 mL

İyofilize, Serum Kalibratör Level-2

ZV-3046-02S3-10 1 x 3 mL

İyofilize, Serum Kalibratör Level-3

ZV-3046-02S4-10 1 x 3 mL

İyofilize, Serum Kalibratör Level-4

ZV-3046-02K1-10 1 x 3 mL

İyofilize, Serum Kontrol Level-1

ZV-3046-02K2-10 1 x 3 mL

İyofilize, Serum Kontrol Level-2

ZV-3046-02C1-10 1 x 1 adet 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analitik Kolon

ZV-3046-CSPE-10 1 x 1 adet 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS Trap Kolon Kartuşu

ZV-3046-02C2-10 1 x 1 adet 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS Trap Kolonu Tutucu

ZS-9020-0001-00 200 – 1000 µL pipet

ZS-9007-0500-00 200 – 1000 µL pipet ucu

Bidistile veya deiyonize su

9. ÇALIŞMA NOTLARI

Numunelerin uygunsuz şekilde taşınması veya test prosedürünün değiştirilmesi

sonuçları etkileyebilir. Belirtilen pipetleme hacimleri, sıcaklık ve ön işlem

basamakları kesinlikle talimatlara uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Kalibre edilmiş

pipetleri ve cihazları kullanın.

Test başladıktan sonra, tüm basamaklar kesintisiz tamamlanmalıdır. Gerekli

reaktiflerin, materyallerin ve cihazların uygun zamanda hazır olduğundan emin olun.

Calibrator Level 1

Calibrator

Level 2

Control Level 1

Control Level 2

Calibrator Level 3

Calibrator

Level 4

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

7

Oda sıcaklığına (18-25 °C) erişmek için tüm reaktifleri bir kenara bırakın ve

kullanımdan önce sıvı reaktifin her şişesini hafifçe döndürün. Reaktifleri köpürmeden

karıştırın.

Reaktiflerin, pipetlerin ve tüplerin kirlenmesini önleyin. Her reaktif, standart veya

numune için yeni atılabilir plastik pipet uçları kullanın. Şişe kapaklarını

değiştirmeyin. Kullanılmadığı zamanlarda tüpleri daima kapalı tutun. Tüpleri tekrar

kullanmayın.

10. TEST ÖNCESİ HAZIRLIKLAR

Cihazın Hazırlanması

• HPLC pompalarına mobil faz ve SPE buffer bağlandıktan sonra 5000 µL/dak akış

hızı ile yıkama verilir. Hatlarda hava kabarcığı kalmayana kadar yıkama işlemine

devam edilir.

• Yıkama sıvısı sisteme bağlanır ve şırınga pompalarının hatlarında hava kabarcığı

kalmayana kadar yıkama verilir.

• Mobil faz şişesinin iyi kapalı olduğundan emin olun, aksi takdirde mobil faz

bileşenleri buharlaşabilir; Bu, alıkonma sürelerini değiştirir.

• Metot aktif edildikten sonra sistemin şartlanması için 15 dakika beklenmelidir.

Valf Bağlantısı

Enjeksiyon Valfi

Değiştirme Valfi

Kalibratörlerin Hazırlanması

• Serum kalibratör numuneleri 3 mL distile su eklenip çözülür.

• Hazırlanan kalibratörler 450 µL’lik hacimlere bölünerek -20 °C’de saklanmalıdır.

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

8

Kontrollerin Hazırlanması

• Serum kontrol numuneleri 3 mL distile su eklenip çözülür.

• Hazırlanan kontroller 450 µL’lik hacimlere bölünerek -20 °C’de saklanmalıdır.

11. YÖNTEMDEKİ KISITLAMALAR

Numune toplama ve saklama koşulları test sonuçları üzerinde önemli bir etkiye

sahiptir. Daha sonraki günlerde çalışılacak serum numuneleri analiz yapılana kadar

dondurulmuş olarak saklanmalıdır.

12. NUMUNE HAZIRLIĞI

Numune Hazırlığı (El ile)

400 µL kalibratör, kontrol veya hasta numunesi 2 mL’lik cam viallere alınır.

Üzerine 450 µL Reaktif 1 eklenir ve 10 saniye vortekslenir.

Üzerine 400 µL Reaktif 2 eklenir ve 10 saniye vortekslenir.

10000 rpm x 3 dakika santrifüj edilir.

Üst faz 0.5 mL’lik plastik viale alınır.

LC-MS/MS sistemine 50 µL enjeksiyon verilir.

Hazırlanmış numune 2-4 °C ‘de 24 saat boyunca stabildir.

Numune Hazırlığı (Otomatik)

Kalibratör/Kontrol çalışılacak ise, 400 µL kalibratör veya kontrol numunesi 2 mL’lik cam viallere alınır ve cihaz üzerindeki ilgili tablaya yerleştirilir.

Serum tüpüne alınmış hasta numunesi Zivak Multitasker Tam Otomatik Numune Hazırlama ve Enjeksiyon Sistemi üzerindeki yerine yerleştirilir.

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

9

Yazılım üzerinde Başlat butonuna tıklandığında analizler otomatik olarak başlayacaktır.

Enjeksiyonlar, hesaplamalar ve raporlama cihaz tarafından otomatik olarak yapılır.

Hazırlanmış numune 2-4 °C ‘de 24 saat boyunca stabildir.

13. KALİTE KONTROL

Test sonuçları ancak verilen test talimatlarına uyulduğu takdirde geçerlidir.

Kullanıcılar çalışırken GLP(Good Laboratory Practice) veya diğer kurumlar

tarafından belirlenmiş olan kurallara ve standartlara bağlı kalmalıdır.

Bütün standart ve kontrol değerleri kalite kontrol sertifikasında belirtilen aralıklarda

olmalıdır. Değerler bu aralıkların dışında kaldığı takdirde analiz geçerli değildir ve

tekrarlanmalıdır.

Her laboratuvar daha ileri aşama kontroller için değeri bilinen numuneleri

kullanmalıdır. Bu değerlerden sapma olması halinde reaktiflerin son kullanma tarihi,

saklama koşulları, kullanılan pipetlerin doğruluğu, cihazlar, inkübasyon koşulları ve

yıkama metotları gibi teknik detayların doğruluğundan emin olunmalıdır.

Ayrıca uygun dış kalite kontrol programına üye olunması önerilir.

14. SONUÇLARIN HESAPLANMASI

Elde edilen analitlerin alanlarının iç standart alanına oranı ile Vitamin D2 ve D3

sonuçları hesaplanır. Her bir seviye kalibratörde yapılan bu oranlama üzerinden

lineer kalibrasyon eğrisi oluşturularak sonuçlar hesaplanır. Hesaplamalar için

kullanılan denklemler aşağıda belirtilmiştir.

𝐷3 𝐴𝑙𝑎𝑛 𝑂𝑟𝑎𝑛𝚤 =𝐷3 𝐴𝑙𝑎𝑛

𝐼𝑆 𝐴𝑙𝑎𝑛 𝐷3 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟 𝑂𝑟𝑎𝑛𝚤 =

𝐷3 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟

𝐼𝑆 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟

𝐷2 𝐴𝑙𝑎𝑛 𝑂𝑟𝑎𝑛𝚤 =𝐷2 𝐴𝑙𝑎𝑛

𝐼𝑆 𝐴𝑙𝑎𝑛 𝐷2 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟 𝑂𝑟𝑎𝑛𝚤 =

𝐷2 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟

𝐼𝑆 𝑀𝑖𝑘𝑡𝑎𝑟

En yüksek kontrol seviyesinin üstündeki örnek sinyaller bir referans yöntemi ile teyit

edilmelidir.

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

10

15. SONUÇLARIN YORUMLANMASI

Farklı toplumlarda farklı Cut-Off değerleri belirlenmelidir. Farklı toplumlardaki hasta

numuneleri için yapılan çalışmalara bağlı olarak, her laboratuvarın kendi normal

değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir ve bu değerlerin dağılımı o coğrafi

bölgedeki sorumlu kurumun önerdiği değerler ile uyumlu olmalıdır.

Tanı ve tedavi aşamalarında bu analizlerin sonuçları klinik gözlemler ve tanı testleri

ile desteklenmelidir.

16. BEKLENEN DEĞERLER

Burada belirtilen referans aralıkları, popülasyona dayalı referans değerlerini değil,

her yaştan erkek ve kadın için geçerli olan 2011 Institute of Medicine raporuna dayalı

klinik karar değerlerini temsil eder. 25-OH-Vitamin D için popülasyon referans

aralıkları, etnik köken, yaş, incelenen popülasyonların coğrafi konumu ve örnekleme

mevsimine bağlı olarak büyük farklılıklar göstermektedir.

<10 ng/mL Çok düşük Osteomalazi veya raşitizm ile ilgili olabilir

10-19 ng/mL Düşük Osteoporoz veya sekonder hiperparatiroidizm riski ile ilişkili olabilir

20-50 ng/mL Normal Sağlıklı popülasyondaki optimum düzeyler; kemik hastalığı olan hastalar bu aralık içinde daha yüksek düzeylerde yararlanabilir

51-80 ng/mL Artan

Hiperkalsüri riski

50 ng/mL üzeri 25OH-Vitamin D ve uzun süreli kalsiyum takviyesi ile devam eden seviyeler hiperkalsüriye ve böbrek fonksiyonlarında azalmaya neden olabilir

>80 ng/mL Olası

toksisite

80 ng/mL, primer hiperparatiroidizm olmayan, normal böbrek fonksiyonlarına sahip hastalarda toksisite ile ilişkili olarak bildirilen en düşük seviyedir. Toksisiteye sahip hastaların çoğunda >150 ng/mL düzeyi gözlenir. 1.25-OH-Vitamin D aktif hormon böbrek dönüşümü bozulmuş veya mevcut olmadığı için, böbrek yetmezliği olan hastalar toksisite belirtileri göstermeden çok yüksek 25-OH-Vitamin D düzeylerine sahip olabilirler.

Her laboratuvarın kendi normal değerlerini belirlemesi önemle tavsiye edilir.

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

11

17. LC-MS/MS PARAMETRELERİ

Cihaz Zivak Tandemgold LC-MS/MS Sistemi

Kolon Zivak 25-Hidroksivitamin D2-D3 Serum LC-MS/MS APCI Analitik Kolonu

Enjeksiyon Miktarı

50 µL

İyonizasyon Modu

APCI Pozitif

CID Gaz 2,4 mTorr

API Nebulizing Gaz

55 psi

Vaporizer Gaz 15 psi

Vaporizer Gaz Sıcaklığı

350 °C

Drying Gaz 25 psi

Drying Gaz Sıcaklığı

300 °C

Spray Chamber Sıcaklığı

60 °C

SIM Width 1,5 amu

Tarama Zamanı

0,600 saniye

Corona Akımı 10 µA

Shield Voltajı 600 V

Dedektör Voltajı

1600 V

Pompa Programı

Zaman (dak)

Akış (µL/dak)

%A %B

1 00,00 700 50 50

2 02,00 700 50 50

Online SPE Valf Programı

Zaman (dak)

Pozisyon

1 00,00 Load

2 00,40 Inject

3 01,80 Load

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

12

MS Tarama Parametreleri

No Analit Alıkonma

Zamanı (dk)

Birincil Kütle (m/z)

İkincil Kütle (m/z)

Capillary (eV)

CE

1 25-OH

Vitamin D3 1,06 (+) 383,3 257,3 80 V 16 V

2 25-OH

Vitamin D2 1,11 (+) 395,3 269,2 80 V 18 V

3 IS 1,06 (+) 389,3 263,3 80 V 16 V

Multitasker Metot Parametreleri

Parametre Barkod Okuma

Numune Ekleme

Reaktif Ekleme (R1)

Reaktif Ekleme (R2)

Santrifüj Numune

Enjeksiyonu

İşlem Tipi Paralel Seri Paralel Paralel Paralel Seri

Nereden

Tabla Numune Tablası

Numune Tablası

LR LR Analiz Tablası

Analiz Tablası

Tüp 1 1 1 2 1 1

İğne Yüksekliği - 7 0 0 0 1,3 mm

Miktar - 500 650 µL 650 µL - 60 µL

Sıvı Bulma - Aktif Pasif Pasif - Aktif

Arama Limiti - 10 -

- - 0

Shake Pasif - Pasif Pasif - Pasif

Nereye

Tabla - Analiz Tablası

Analiz Tablası

Analiz Tablası

- -

Tüp - 1 1 1 - -

İğne Yüksekliği - 15 17 18 - -

Miktar - 400 450 µL 400 µL - -

Yıkama

Yıkama Yeri - 1. Yıkama C 2. Yıkama A

1. Yıkama B 2. Yıkama A

1. Yıkama B 2. Yıkama C 3. Yıkama A

-

1. Yıkama C 2. Enjeksiyon

Valfi 3. Yıkama A

Şırınga Pompası - Reaktif

Şırıngası Reaktif

Şırıngası Reaktif

Şırıngası -

Reaktif Şırıngası

Miktar x Tekrar - 1. 1000 x 2 2. 500 x 2

1. 10000 x 1 2. 500 x 1

1. 10000 x 1 2. 500 x 1 3. 500 x 1

- 1. 3000 x 1 2. 1000 x 1 3. 1000 x 1

Çekme Portu - I6 I6 I6 - I6

Basma Portu - 1. O4 2. O1

O1 1. O1 2. O4 3. O1

- 1. O4 2. O1 3. O1

Şırınga Hızları

Şırınga Pompası - Reaktif

Şırıngası Reaktif

Şırıngası Reaktif

Şırıngası -

Enjeksiyon Şırıngası

Çekme Hız / Bekleme / Port

- 18 / 1500 /

I1 13 / 3000 /

I2 13 / 3000 /

I5 - 16 / 1500

Basma Hız / Bekleme / Port

- 14 / 1500 /

O1 14 / 3000 /

O1 14 / 3000 /

O1 - 18 / 1500

Önce At

Miktar - - 10000 10000 - -

Nereye

- - Yıkama B Yıkama B - -

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

13

Hava Kabarcığı

Miktar - 20 20 20 - 20

Seçim - Başta Başta Başta - Başta ve Sonda

Santrifüj

Çalışma Süresi - - - - 1 dakika -

Hız - - - - 5000 RPM -

Vorteks - - - - Aktif -

V. Çalışma Süresi - - - - 1 dakika -

V. Hız - - - - 1000 RPM -

Önce Yıka

Yıkama Yeri

Şırınga P. Miktar Tekrar Çekme P. Basma P.

Yıkama A Reaktif

Şırıngası 1000 2 I6 O1

Grup

Parametre Değer Grup Aktif

Grup Sayısı 8

18. ANALİTİK PERFORMANS

No Analit Doğruluk

(%)

Gün içi Tekrarlanabilirlik

(%CV)

Günler arası Tekrarlanabilirlik

(%CV)

1 25-OH

Vitamin D3 94,7 2,16 2,74

2 25-OH

Vitamin D2 96,4 4,60 4,74

No Analit LOD

(µg/L) LOQ

(µg/L) Doğrusallık

(R2)

1 25-OH

Vitamin D3 1,48 4,90 0,993

2 25-OH

Vitamin D2 1,06 3,50 0,992

Analitik Seçicilik (Çapraz reaksiyon): Analitler arasında çapraz reaksiyon veya bir interferans etkisi gözlenmemiştir.

D. No: ZV-3046-KK-10.R14

14

19. ÖRNEK KROMATOGRAM