การใชวธทางเคมในการลดขนาดและเตมหมซลเฟตในอลจเนตพอลเมอร

เพอการออกฤทธทางชวภาพ

โดย

นางสาวสวรรณ ทองมาล

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาจลชววทยา ภาควชาจลชววทยา

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2557

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

การใชวธทางเคมในการลดขนาดและเตมหมซลเฟตในอลจเนตพอลเมอร

เพอการออกฤทธทางชวภาพ

โดย

นางสาวสวรรณ ทองมาล

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาจลชววทยา ภาควชาจลชววทยา

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2557

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

CHEMICAL DEPOLYMERIZATION AND SULFATION OF ALGINATE POLYMER

FOR BIOACTIVITIES

By

Miss Suwannee Tongmalee

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree

Master of Science Program in Microbiology

Department of Microbiology

Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2014

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหวทยานพนธเรอง “การใชวธทางเคมในการลดขนาดและเตมหมซลเฟตในอลจเนตพอลเมอรเพอการออกฤทธทางชวภาพ” เสนอโดย นางสาวสวรรณ ทองมาล เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา

……...........................................................

(รองศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ) คณบดบณฑตวทยาลย

วนท..........เดอน.................... พ.ศ...........

อาจารยทปรกษาวทยานพนธ

อาจารย ดร.วรญ พลสวสด

คณะกรรมการตรวจสอบวทยานพนธ

.................................................... ประธานกรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.ธงชย เตโชวศาล)

............/......................../..............

.................................................... กรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.อรฤทย ภญญาคง)

............/......................../..............

.................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.วยา พทธวงศ) (อาจารย ดร.วรญ พลสวสด)

............/......................../.............. ............/......................../..............

ง

55313202: สาขาวชาจลชววทยา คาสาคญ : อลจเนตซลเฟต/การชะลอการแขงตวของเลอด/ความเปนพษตอเซลล/

การกระตนแมคโครฟาจ สวรรณ ทองมาล : การใชวธทางเคมในการลดขนาดและเตมหมซลเฟตในอลจเนต พอลเมอรเพอการออกฤทธทางชวภาพ. อาจารยทปรกษาวทยานพนธ : อ.ดร.วรญ พลสวสด. 105 หนา.

อลจเนตเปนพอลแซกคาไรดทผลตจากสาหราย ภายในโมเลกลประกอบดวยนาตาล 2

ชนดไดแก mannuronic acid (M) และ guluronic acid (G) โครงสรางของอลจเนตมลกษณะทคลายกบซลเฟตพอลแซกคาไรดทพบในธรรมชาต ซงเปนสารประกอบทมคณสมบตทสาคญในการออกฤทธทางชวภาพ ดงนนจงมการประยกตนาเอากระบวนการทางเคมอนไดแก กระบวนการไฮโดรไลซส, กระบวนการออกซเดชน และกระบวนการเตมหมซลเฟตมาใชในการปรบปรงโครงสรางอลจเนต ยนยนการแทนทของหมซลเฟตภายในโมเลกลอลจเนตซลเฟต (AS) และอนพนธ (HAS, OAS, PMS, PGS) ดวยการวเคราะหดวยเครอง FT-IR และวเคราะหปรมาณการแทนทของหมซลเฟต (DS) ซงอยในชวง 0.38-1.11 สาหรบการทดสอบคณสมบตการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดดวยวธ APTT พบวาสารผลตภณฑ (AS, HAS, OAS, PMS, PGS) มความสามารถยดระยะเวลาในการแขงตวของเลอดใหนานขน AS มประสทธภาพในการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดสงทสด ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร วดคา APTT ได 340.90 วนาท (10.02X) สาหรบการศกษาความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง พบวา สารทดสอบไมมความเปนพษตอเซลล L929 ทความเขมขน 1,000 ไมโครกรมตอมลลลตร และเซลลเมดเลอดขาวทความเขมขน 250 ไมโครกรมตอมลลลตร แตในขณะเดยวกนไมสามารถยบยงการเจรญของเซลลมะเรง (Hela cell) และสาหรบการศกษาความความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ พบวา สารผลตภณฑมความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ โดย PGS มประสทธภาพในการกระตนแมคโครฟาจไดดทสด วดปรมาณ NO ได 67.91 ไมโครโมลาร (μM) ทความเขมขน 500

ไมโครกรมตอมลลลตร

ภาควชาจลชววทยา บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ลายมอชอนกศกษา........................................ ปการศกษา 2557

ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธ ........................................

จ

55313202: MAJOR: MICROBIOLOGY

KEY WORD: SULFATED ALGINATE, ANTICOAGULANT, CYTOTOXICITY, ACTIVATED

MACROPHAGE

SUWANNEE TONGMALEE: CHEMICAL DEPOLYMERIZATION AND SULFATION

OF ALGINATE POLYMER FOR BIOACTIVITIES. THESIS ADVISOR: PH.D. WARANYOO

PULSAWAT. 105 pp.

Alginate is a natural polysaccharide which was produced from algae. It is linear

polysaccharide consisting of mannuronic acid (M) and guluronic acid (G). The structure is closely to

sulfated polysaccharides. In addition, sulfated polysaccharide shows a wide range of biological activities.

This research was aimed to modify alginate structure with chemical reactions such as hydrolysis,

oxidation and sulfation. The sulfation of alginate sulfate (AS) and derivatives (HAS, OAS, PMS, PGS)

were confirmed by FT-IR spectra and degree of substitution (DS) content. All of alginate sulfate and

derivatives content of DS content range was 0.38-1.11. According to AS and derivatives prolonged the

activated partial thromboplastin time (APTT) compared with the control. The highest anticoagulant

activity of AS was exhibited at approximately 340.90 seconds (10.02X of normal APTT) at concentration

of 100 microgram per milliliter. Furthermore, the toxicity on mouse fibroblast L929 cells and peripheral

blood mononuclear cells (PBMC) was not present at concentration of 1,000 microgram per milliliter and

250 microgram per milliliter of derivatives, respectively. This was true with the results of cytotoxicity of

cancer cell (Hela). In addition, the alginate sulfate and derivatives could stimulate macrophage. The

highest macrophage stimulation activity of PGS was obtained at 67.91 micro molar (μM) at concentration

of 500 microgram per milliliter.

Department of Microbiology Graduate School, Silpakorn University

Student's signature........................................ Academic Year 2014

Thesis Advisor's signature........................................

ฉ

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธฉบบนลลวงไดดวยดเนองจากความกรณาอยางยงของ ดร.วรญ พลสวสด อาจารยทปรกษาวทยานพนธทกรณาใหความร คาปรกษาและคาแนะนาทดในการทางานวจยมาโดยตลอด อกทงยงใหการสนบสนนทงงบประมาณ อปกรณและสารเคมตางๆทใชในงานวจยน ตลอดจนตรวจแกไขวทยานพนธใหมความสมบรณมากยงขน ผวจยขอกราบขอบพระคณเปนอยางสง

ขอขอบคณผชวยศาสตราจารย ดร. ธงชย เตโชวศาล ประธานกรรมการพจารณาหวขอ วทยานพนธทกรณาแนะนาและใหคาปรกษา รวมทงการการตรวจแกไขวทยานพนธ สงผลใหวทยานพนธสาเรจลลวงได

ขอขอบคณผชวยศาสตราจารย ดร.วยา พทธวงศ กรรมการสอบวทยานพนธ ทกรณาใหคาปรกษาแนะนาในการตรวจแกไขวทยานพนธจนเสรจสมบรณ

ขอขอบคณผชวยศาสตราจารย ดร.อรฤทย ภญญาคง กรรมการสอบวทยานพนธ ทกรณาใหคาปรกษาแนะนาในการตรวจแกไขวทยานพนธจนเสรจสมบรณ

ขอขอบคณบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ทใหเงนสนบสนนงานวทยานพนธจานวน 10,000 บาท และภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร ทใหโอกาสในการทางานวจยครงน รวมทงสนบสนนทงในดานสถานท อปกรณ และเครองมอในการทางานวจย ขอบคณคณาจารยทกทานของภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร ทคอยอบรมสงสอน ใหความร และแนะนาตางๆ ขอบคณคณกรพรรณ เศวตสวรรณกล นกวทยาศาสตรของภาควชาภาคจลชววทยาทคอยใหคาแนะนาในการใชเครองมอ อปกรณและสารเคมตางๆ ขอบคณพนงงานและเจาหนาทของภาควชาจลชววทยาทชวยตดตอประสานและชวยเหลอเรองตาง ๆ ทาใหงานวจยนสาเรจ

ขอขอบคณอรารกษ รมรน เพอน และนอง นกศกษาภาควชาจลชววทยา ทมนาใจชวยเหลอและเปนกาลงใจในการทานครงน ขอบคณบดา มารดา และญาตพนอง ทมสวนชวยสนบสนนและเปนกาลงใจในการทางานครงนจนสาเรจลลวงไปไดดวยด

ช

สารบญ

หนา บทคดยอภาษาไทย ............................................................................................................................... ง

บทคดยอภาษาองกฤษ .......................................................................................................................... จ

กตตกรรมประกาศ ................................................................................................................................ ฉ

สารบญตาราง ....................................................................................................................................... ฉ สารบญภาพ .......................................................................................................................................... ญ บทท

1 บทนา .........................................................................................................................................

ความเปนมาและความสาคญ.............................................................................................. 1

วตถประสงคของการวจย ................................................................................................... 2

สมมตฐานของการศกษา .................................................................................................... 3

ขอบเขตงานวจย ................................................................................................................. 3

2 วรรณกรรมทเกยวของ ...............................................................................................................

ประเภทนาตาล................................................................................................................... 4

ซลเฟตพอลแซกคาไรด ...................................................................................................... 5

อลจเนต .............................................................................................................................. 5

กระบวนการปรบขนาดโมเลกลพอลแซกคาไรด .............................................................. 9

กระบวนการเตมหมซลเฟต ................................................................................................ 12

กลไกการแขงตวของเลอด............................................................................................. .... 16

เซลลเพาะเลยง................................................................................................................... 21

ระบบภมคมกน.................................................................................................................. 24

3 วธดาเนนการวจย ......................................................................................................................

พอลแซกคาไรดทใชในการวจย ......................................................................................... 29

เซลลทใชทดสอบ .............................................................................................................. 29

สารเคมและอาหารเลยงเชอ ............................................................................................... 29

ซ

บทท หนา อปกรณและเครองมอทใชในการวจย ................................................................................ 32

วธดาเนนงานวจย ............................................................................................................... 34

กระบวนการปรบขนาดโมเลกลของอลจเนตดวย hydrochloric acid ......................... 34

กระบวนการปรบขนาดโมเลกลของอลจเนตดวย hydrogen peroxide ....................... 34

การแยกโมเลกล polymannuronic acid (PM) และ polyguluronic acid (PG)………... 35

กระบวนการเตมหมซลเฟต ........................................................................................ 36

การวเคราะหหาปรมาณซลเฟต .................................................................................. 36

การวเคราะหขนาดโมเลกลดวย % polyacrylamide gel (PAGE) ........................... 37

การทดสอบ activated partial thromboplastic time (APTT) ...................................... 37

การทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยงและเซลลมะเรง ..................................... 38

การทดสอบความเปนพษตอเมดเลอดขาว ................................................................. 38

การทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ .............................................. 39

4 ผลการวเคราะหขอมล ................................................................................................................

การปรบขนาดโมเลกลอลจเนต .......................................................................................... 40

การแยกโมเลกล polymannuronic acid (PM) และ polyguluronic acid (PG) ..................... 43

กระบวนการเตมหมซลเฟต ................................................................................................ 45

ผลการทดสอบคณสมบตการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด ...................................... 51

การทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง ...................................................................... 54

การทดสอบความเปนพษตอเซลลมะเรง ............................................................................ 61

การทดสอบความสามารถในการกระตนเซลลแมคโครฟาจ .............................................. 62

5 สรป อภปรายผล และขอเสนอแนะ ...........................................................................................

สรปผล ............................................................................................................................... 68

ขอเสนอแนะ ...................................................................................................................... 68

รายการอางอง ....................................................................................................................................... 69

ฌ

บทท หนา ภาคผนวก .............................................................................................................................................

ภาคผนวก ก อาหารเลยงเซลล................................................................................................ 77

ภาคผนวก ข การเตรยมสารเคม ............................................................................................. 79

ภาคผนวก ค กราฟมาตรฐานและวธการวเคราะห .................................................................. 82 ภาคผนวก ง ภาพจากการวเคราะหดวย PAGE ....................................................................... 87

ภาคผนวก จ ภาพจากการวเคราะหความเปนพษตอเซลล ...................................................... 90

ภาคผนวก ฉ ภาพจากการวเคราะหการกระตนแมคโครฟาจ.................................................. 96

ภาคผนวก ช ขอมลการทดลอง ............................................................................................. 100

ประวตผวจย……… ............................................................................................................................. 105

ญ

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1 สารเคมทใชในการปรบขนาดโมเลกลพอลแซกคาไรด ........................................................ 10

2 ชนดของสารทใชในการเตรยมเปน sulfating agent ในการเตมหมซลเฟต ........................... 13

3 ตวอยางยาและพอลแซกคาไรดทนามาประยกตใชเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด ......... 19 4 ปฏกรยาทใชในปรบขนาดโมเลกลอลจเนต ......................................................................... 40

5 การแยกโมเลกล polymannuronic acid (PM) และ polyguluronic acid (PG)........ ............. ... 43

6 การศกษาอทธผลของกระบวนการเตมหมซลเฟตตอ % yield และขนาดโมเลกล ................ 45

7 การศกษาปรมาณหมซลเฟตในโมเลกลอลจเนตและอนพนธอลจเนตซลเฟต ...................... 47

8 การทดสอบคณสมบตการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดโดยอลจเนตซลเฟต

และอนพนธ .................................................................................................................. 52

9 ความสมพนธของความเขมขนหมซลเฟตกบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 360 นาโนเมตร ............................................................................................................. 82

10 ความสมพนธความเขมขนของ nitrite กบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร ............................................................................................................. 84

11 การวเคราะหปรมาณซลเฟอรและคา DS .............................................................................. 100

12 การวเคราะหเปอรเซนตการอยรอดของเซลล L929 .............................................................. 101

13 การวเคราะหเปอรเซนตการอยรอดของเซลล L929 (ตอ) ..................................................... 102

14 การวเคราะหเปอรเซนตการอยรอดของเซลล PBMC ........................................................... 103

15 การวเคราะหปรมาณ NO ...................................................................................................... 104

ฎ

สารบญภาพ

ภาพท หนา 1 โครงสรางของอลจเนต ......................................................................................................... 6

2 การสรางพนธะไฮโดรเจนระหวางโมเลกล .......................................................................... 7

3 กลไกการเกดเจลของ calcium alginate ................................................................................. 8

4 กลไกการเกดปฏกรยาไฮโดรไลซสเมออยในสภาวะทเปนกรดและโครงสรางอลจเนต

หลงเกดปฏกรยาไฮโดรไลซส ...................................................................................... 11

5 โครงสรางของอลจเนตหลงจากเกดปฏกรยาออกซเดชน ..................................................... 12

6 ปฏกรยาการสงเคราะห alginate sulfates โดยใช chlorosulfonic acid กบ formamide .......... 14

7 ปฏกรยาการสงเคราะห alginate sulfates โดยการใช sodium bisulfite กบ sodium nitrite .... 15

8 กลไกการแขงตวของเลอด .................................................................................................... 17

9 โครงสรางของเฮพารน ......................................................................................................... 18

10 กลไกการยบยงการแขงตวของเลอดโดยเฮพารน .................................................................. 18

11 การทดสอบ Coagulation test ดวยวธ APTT และ PT ........................................................... 20

12 กลไกการวเคราะหดวยวธ MTT ........................................................................................... 23

13 กลไกการสงเคราะห NO ...................................................................................................... 25

14 โครงสรางของไลโปโปลแซกคาไรด ทประกอบดวย lipid A และ O-antigen ..................... 26

15 กลไกของไลโปโปลแซกคาไรดในการกระตนระบบภมคมกน ........................................... 27

16 กลไกการวเคราะหดวยวธ Griess assay ................................................................................ 28

17 การวเคราะหโครงสรางดวยเครอง FT-IR สาหรบอลจเนตเรมตน (A), โมเลกลของ

อลจเนตทผานการปรบขนาดดวยปฏกรยาไฮโดรไลซส (HA) และออกซเดชน (OA) .. 42

18 การวเคราะหโครงสรางดวยเครอง FT-IR สาหรบ PM และ PG ........................................... 44

19 โครงสรางทวเคราะหดวยเครอง FT-IR ของ alginate sulfate (AS),

hydrolyzed alginate sulfate (HAS), oxidized alginate sulfate (OAS) ,

polyguluronat sulfate (PGS) และ polymanuronate sulfate (PMS) .............................. 50

ฏ

ภาพท หนา 20 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารกบผลการทดสอบ APTT ................................. 53

21 ความสมพนธระหวางสารทดสอบทความเขมขน ไมโครกรมตอมลลลตร

กบเปอรเซนตการอยรอดของเซลล L929 เมอทาการเปรยบเทยบกบชดควบคม .......... 55

22 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทดสอบกบเปอรเซนตการอยรอดของ

เซลล L ก) alginate (A), ข) alginate sulfate (AS), ค) hydrolyzed alginate (HA),

ง) hydrolyzed alginate sulfate (HAS), จ) oxidized alginate (OA) และ ฉ) oxidized alginate sulfate (OAS) .............................................................................. 56

23 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทดสอบกบเปอรเซนตการอยรอด

ของเซลล L ก) polyguluronat (PG), ข) polyguluronat sulfate (PGS),

ค) polymanuronate (PM) และ ง) polymanuronate sulfate (PMS) ............................... 57

24 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทดสอบกบเปอรเซนตการอยรอด

ของเซลล PBMC ก) alginate (A), ข) alginate sulfate (AS), ค) hydrolyzed alginate (HA),

ง) hydrolyzed alginate sulfate (HAS), จ) oxidized alginate (OA) และ ฉ) oxidized alginate sulfate (OAS) .............................................................................. 59

25 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทดสอบกบเปอรเซนตการอยรอด

ของเซลล PBMC ก) polyguluronat (PG), ข) polyguluronat sulfate (PGS),

ค) polymanuronate (PM) และ ง) polymanuronate sulfate (PMS) ............................... 60

26 ความสมพนธระหวางสารทดสอบทความเขมขน1000 ไมโครกรมตอมลลลตร กบเปอรเซนตการอยรอดของเซลล Hela เมอทาการเปรยบเทยบกบชดควบคม ........... 61

27 ความสามารถในการกระตนเซลลแมคโครฟาจโดยการวดปรมาณ NO

ทผลตจากเซลล RAW 264.7 ......................................................................................... 64

28 ความสมพนธระหวางของสารทดสอบทความเขมขน 500 ไมโครกรมตอมลลลตร

ตอความสามารถในการกระตนเซลลแมคโครฟาจโดยการวดปรมาณ NO

ทผลตจากเซลล RAW264.7 .......................................................................................... 65

29 ความสมพนธระหวางสารทดสอบทความเขมขน 500 ไมโครกรมตอมลลลตร

กบเปอรเซนตการอยรอดของเซลลแมคโครฟาจ .......................................................... 67

30 กราฟมาตรฐานการวเคราะหหมซลเฟตทความยาวคลน 360 นาโนเมตร ............................. 83

31 กราฟมาตรฐานการวเคราะหปรมาณไนไตรททความยาวคลน 540 นาโนเมตร ................... 85

ฐ

ภาพท หนา 32 ขนาดโมเลกลอลจเนตและอนพนธอลจเนตซลเฟต โดยการใช PAGE 12% แถว:

(1) Marker, (2) A, (3) AS, (4) HA, (5) HAS, (6) OA และ (7) OAS ............................ 87

33 ขนาดโมเลกลอลจเนตและอนพนธอลจเนตซลเฟต โดยการใช PAGE 12% แถว:

(1) Marker, (2) PM, (3) PMS, (4) PG และ (5) PGS ..................................................... 88

34 การทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง (L929) บน 96 well microplate ของสารทดสอบ

ทความเขมขน 31.25, 62.5, 125, 250, 500 และ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร

ก) hydrolyzed alginate (HA), ข) hydrolyzed alginate sulfate (HAS),

ค) oxidized alginate (OA), ง) oxidized alginate sulfate (OAS) ................................... 90

35 การทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง (L929) บน 96 well microplate ของสารทดสอบ

ทความเขมขน 31.25, 62.5, 125, 250, 500 และ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) alginate (A), ข) alginate sulfate (AS) ...................................................................... 91

36 การทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง (L929) บน 96 well microplate ของสารทดสอบ

ทความเขมขน 31.25, 62.5, 125, 250, 500 และ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) polyguluronat (PG), ข) polyguluronat sulfate (PGS), ค) polymanuronate (PM)

ง) polymanuronate sulfate (PMS) ................................................................................ 92

37 การทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง PBMC บน 96 well microplate

ของสารทดสอบทความเขมขน, 62.5, 125 และ 250 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) hydrolyzed alginate (HA), ข) hydrolyzed alginate sulfate (HAS)

ค) oxidized alginate (OA), ง) oxidized alginate sulfate (OAS),จ) polyguluronat (PG)

ฉ) polyguluronat sulfate (PGS), ช) polymanuronate (PM)

ซ) polymanuronate sulfate (PMS) ............................................................................... 93

38 การทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง PBMC บน 96 well microplate

ของสารทดสอบทความเขมขน, 62.5, 125 และ 250 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) alginate (A), ข) alginate sulfate (AS) ...................................................................... 94

39 การทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน well microplate

ของสารทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) alginate sulfate (AS), ข) alginate (A) ...................................................................... 96

ฑ

ภาพท หนา

40 การทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน 96 well microplate

ของสารทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) oxidized alginate (OA), ข) oxidized alginate sulfate (OAS) ................................... 96

41 การทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน 96 well microplate

ของสารทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) hydrolyzed alginate (HA), ข) hydrolyzed alginate sulfate (HAS) .......................... 97

42 การทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน 96 well microplate

ของสารทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) polymanuronate (PM), ข) polymanuronate sulfate (PMS) ..................................... 97

43 การทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน 96 well microplate

ของสารทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) polyguluronat sulfate (PGS), ข) polyguluronat (PG) .............................................. 98

1

บทท 1

บทนา 1. ความเปนมาและความสาคญของปญหา

ซลเฟตพอลแซกคาไรดเปนสารประกอบทมโมเลกลขนาดใหญสามารถพบไดอยางแพรหลายในธรรมชาต ซงสามารถพบไดทงในสตว พช และจลนทรย สวนใหญแลวจะพบไดมากในสาหรายทะเล เชน fucans, fucoidans, carrageenans ฯลฯ ซลเฟตพอลแซกคาไรดแตละชนดมลกษณะโครงสรางและหนาทแตกตางกน ซลเฟตพอลแซกคาไรดทพบมคณสมบตการออกฤทธทางชวภาพ ไดแก anticoagulant, antibacterial, anticancer, anti-yeast ฯลฯ จากคณสมบตทมความหลากหลายของซลเฟตพอลแซกคาไรด จงทาใหเปนทสนใจของนกวทยาศาสตรในการศกษาคนควาเพอทจะผลตซลเฟตพอลแซกคาไรดใหมปรมาณมากพอสาหรบนามาประยกตใชในดานตางๆ โดยมทงวธการสกดโดยตรงมาจากจลนทรยทสามารถผลตซลเฟตพอลแซกคาไรดได พบวาปรมาณทไดนนมปรมาณนอยและมตนทนในการผลตทสง จงมการประยกตนาเอาอลจเนตซงเปนพอลแซกคาไรด ทสาหรายสามารถผลตไดงาย ราคาถก และมโครงสรางทใกลเ คยงกบ ซลเฟตพอลแซกคาไรดทพบในธรรมชาต มาผานกระบวนการทางเคมเพอปรบปรงโครงสรางของ

อลจเนต จากการศกษาวจยพบวาขนาดโมเลกล, สดสวนของนาตาลทเปนองคประกอบและปรมาณซลเฟตในสายอลจเนตซลเฟตเปนปจจยหรอมความเกยวเนองกบคณสมบตการออกฤทธทางชวภาพ กระบวนการทใชในการปรบปรงอลจเนตใหมขนาดสนลงสามารถทาไดโดยทงวธทางเคมและวธการใชเอนไซม ทงสองวธมขอไดเปรยบและขอจากดทแตกตางกน สาหรบการใชวธการทางเคมนน สารทใชมราคาถก หาไดงาย และสามารถใชไดกบพอลแซกคาไรดไดหลายชนด แตในกระบวนการตดสายพอลแซกคาไรดนนเปนไปแบบสมและไมสามารถควบคมตาแหนงในการตดได แตกตางจากวธการใชเอนไซม ทมความจาเพาะตอตาแหนงในการตดพนธะและชนดของ พอลแซกคาไรดทาใหการตดและขนาดโมเลกลของอลจเนตคงท ขอจากดของวธนคอเอนไซมมราคาแพง เปนสาเหตใหการเตรยมอลจเนตซลเฟตนยมใชวธการทางเคม วธการทางเคมหนงทใชในการทาใหสายพอลแซกคาไรดมขนาดสนลงโดยอาศยปฏกรยาออกซเดชน และปฏกรยาไฮโดรไลซสในการเขาไปทาลายพนธะไกลโคซดกททาหนาเชอมอยระหวางนาตาลในสายอลจเนต

2

โดยชนดของสารทนยมนามาใชไดแก hydrogen peroxide (H2O2) และ hydrochloric acid (HCl) เพอทาใหสายอลจเนตมขนาดสนลงแลว และอกปจจยทมความสาคญคอสดสวนของนาตาลทเปนองคประกอบ ภายในโมเลกลของอลจเนตมนาตาล guluronic acid (G) และ mannuronic acid (M) นาตาลทง 2 ชนดนมโครงสรางและคณสมบตการออกฤทธทางชวภาพแตกตางกน สามารถทาการแยกชนดของนาตาลโดยกระบวนการตกตะกอน หลงจากนนเขาสกระบวนการทมความสาคญเปนอยางมากไดแก กระบวนการซลเฟชน (sulfation) เปนวธในการเตมหมซลเฟตใหกบสายอลจเนต สามารถทาไดดวยวธการใช sulfating reagent ทเตรยมจาก formamide (CH3NO) กบ chlorosulfonic

acid (ClSO3H) สามารถทดสอบประสทธการเตมหมซลเฟตไดดวยการวเคราะหปรมาณซลเฟต และวเคราะหโครงสรางดวยเครอง FT-IR จากนนทาการทดสอบคณสมบตการออกฤทธทางชวภาพ เชน คณสมบตการเปนสารยบยงการแขงตวของเลอด โดยการทดสอบ activated partial thromboplastin

time (APTT), คณสมบตการเปนสารยบยงการเจรญของเซลลมะเรง, ทดสอบความเปนพษตอเซลลปกตและความเปนพษตอเมดเ ลอดขาว โดยการทดสอบ -( , -dimethylthiazol- -yl)- ,

-diphenyltetrazolium bromide (MTT) และคณสมบตการการกระตนการทางานของแมคโครฟาจ

โดยการทดสอบหาปรมาณไนตรกออกไซด (NO) การทดสอบคณสมบตทางชวภาพดงกลาวเปนการทดสอบแบบเบองตนของอลจเนตซลเฟตและอนพนธของอลจเนตซลเฟตเพอทจะไดมการพฒนาและปรบปรงประสทธภาพของอลจเนตซลเฟตและอนพนธของอลจเนตซลเฟตใหสามารถนาไปใชประโยชนในดานตางๆตอไป

2. วตถประสงคของการวจย

2.1 ศกษาและเปรยบเทยบกระบวนการลดขนาดพอลแซกคาไรดโดยอาศยปฏกรยา ออกซเดชนและไฮโดรไลซส

2.2 ศกษาประสทธภาพการเตมหมซลเฟตในสายพอลแซกคาไรดอลจเนตโดยใช

sulfating agent

2.3 ศกษาประสทธภาพการออกฤทธทางชวภาพในการชะลอการแขงตวของเลอด, การยบยงการเจรญของเซลลมะเรง, ความเปนพษตอเซลลเพาะเลยงและเซลลเมดเลอดขาว และความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ

3

3. สมมตฐานของการวจย 3.1 ปฏ ก รย าออก ซ เดชนและไฮโดรไลซส มผล ตอกระบวนการลดขนาด

พอลแซกคาไรด

3.2 sulfating agent มผลตอประสทธภาพการเตมหมซลเฟตในสายพอลแซกคาไรด อลจเนต

3.3 อลจเนตซลเฟตมประสทธภาพในการออกฤทธทางชวภาพใการชะลอการแขงตว

ของเลอด, ไมมความเปนพษตอเซลลเพาะเลยงและเซลลเมดเลอดขาว และมความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ

4. ขอบเขตการวจย

4.1 ทดสอบกระบวนการลดขนาดพอลแซกคาไรดโดยอาศยปฏกรยาออกซเดชนและ ไฮโดรไลซส

4.2 ทดสอบประสทธภาพการเตมหมซลเฟตในสายพอลแซกคาไรดอลจเนตโดยใช sulfating agent

4.3 ทดสอบประสทธภาพการออกฤทธทางชวภาพในการชะลอการแขงตวของเลอด, ยบยงการเจรญของเซลลมะเรง, ความเปนพษตอเซลลเพาะเลยงและเซลลเมดเลอดขาว และความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ

4

บทท 2

วรรณกรรมทเกยวของ

. ประเภทของนาตาล มอโนแซกคาไรด (Monosaccharide) เปนนาตาลโมเลกลเดยวทแตละอะตอมคารบอน

จะมหมไฮดรอกซล (OH) เชน นาตาลกลโคส (Glucose) นาตาลไรโบส (Ribose) เปนตน นาตาลทมจานวนคารบอนเทากนอาจมการจดหมธาตรอบ ๆ อะตอมคารบอนแตกตางกนทาใหเกดไอโซเมอรทเรยก อพเมอร (Epimer) เชน นาตาลกลโคส (Gluccose) เปนอพเมอรกนกบนาตาลแมนโนส (Mannose) และนาตาลกาแลคโตส (Galactose) และนอกจากนนาตาลแตละตวยงมไอโซเมอรทเรยก สเตอรโอไอโซเมอร (Stereoisomer) ได ไอโซเมอร เรยกเปนไอโซเมอรชนด D และ L ไอโซเมอร (D - and L- isomer) สาหรบ D - isomer จะมหมไฮดรอกซลของอะตอมคารบอนรองสดทายอยทางดานขวาของโมเลกล สวน L- isomer หมไฮดรอกซลจะอยทางดานซาย

ไดแซกคาไรด (Disaccharide) หรอนาตาลโมเลกลค เกดจากนาตาลโมเลกลเดยว 2

โมเลกล มาเชอมตอกนดวยพนธะไกลโคซดก (Glycosidic bond) นาตาลโมเลกลคทสาคญบางชนดไดแก มอลโทส (Maltose), เซลโลไบโอส (Cellobiose), แลคโตส (Lactose) และ ซโครส (Sucrose) เปนตน

พอลแซกคาไรด (Polysaccharide) เปนพอลเมอรของนาตาลโมเลกลเดยวตงแต 10

โมเลกลขนไปเชอมตอกนดวยพนธะไกลโคซดกเปนสายยาว และมคณสมบตเปนคอลลอยด พอลแซกคาไรดแบงไดเปน 2 ประเภท ตามชนดของมอนอเมอรองคประกอบไดแก

1. โฮโมพอลแซกคาไรด (Homopolysaccharide) เปนพอลแซกคาไรดเมอเกดการยอย

สลายแลวจะไดเปนมอนอเมอรเพยงชนดเดยว ไดแก แปง (Starch), เดกซทรน (Dextrin), ไกลโคเจน (Glycogen) และเซลลโลส (Cellulose) เปนตน

5

2. เฮเทอโรพอลแซกคาไรด (Heteropolysaccharides) เปนพอลแซกคาไรดเมอเกดการ

ยอยสลายแลวไดมอนอเมอร ตงแต 2 ชนดขนไปไดแก เพกตน (Pectin), อลจเนต และกม (gum)

2. ซลเฟตพอลแซกคาไรด

ซลเฟตพอลแซกคาไรดเปนพอลแซกคาไรดอกกลมทมความความสาคญ เนองจากมคณสมบตในการออกฤทธทางชวภาพทมความหลากหลาย เชน สารยบยงการเจรญของเซลลมะเรง, สารชะลอการแขงตวของเลอดและสารยบยงกระบวนการอกเสบ เปนตน ซลเฟตพอลแซกคาไรดสามารถพบไดทวไปไดในธรรมชาต ซงสามารถพบทงใน คน, สตว และพช แตสวนใหญมกพบในสาหรายทะเล เชน fucans, fucoidans, heparin, และ carrageenans เปนตน โครงสรางของ ซลเฟตพอลแซกคาไรดสวนใหญ ประกอบดวยหมคารบอกซลและหมซลเฟต ซงถอเปนปจจยทสาคญตอกระบวนการออกฤทธทางชวภาพ ปจจบนมการประยกตใชซลเฟตพอลแซกคาไรดในดานการแพทยอยางกวางขวาง สงผลใหการนาซลเฟตพอลแซกคาไรดทผลตไดเองในธรรมชาตมปรมาณไมเพยงพอตอการใช ดงนนจงมการประยกตนาเอาพอลแซกคาไรดมาปรบปรงโครงสรางดวยกระบวนการทางเคม สาหรบพอลแซกคาไรดทนามาประยกตใชมหลายชนด เชน แปง, เดกซทรนและเซลลโลส เปนตน อลจเนตเปนพอลแซกคาไรดทนามาใชในการสงเคราะหเปน ซลเฟตพอลแซกคาไรด เนองจากมคณสมบตหลายอยางทมความเหมาะสม เชน หาไดงาย, ราคาถก, ไมมความเปนพษและมโครงสรางทคลายกบซลเฟตพอลแซกคาไรดทพบในธรรมชาต

3. อลจเนต อลจเนตหรออลจนสามารถผลตไดจากจากสาหรายทะเลและแบคทเรย สาหรบ

สาหรายผลตอลจเนตเพอเปนองคประกอบของโครงสราง เชน ผนงเซลล ในขณะทแบคทเรยผลตอลจเนตแลวหลงออกมานอกเซลล เพอสรางไบโอฟลม ซงเปนชนปกปองแบคทเรยจากสภาวะไมเหมาะสม (Arlov, 2012: 1-84) สาหรายทะเลทสามารถผลตอลจเนตไดแก green algae, brown

algae, red algae และ blue-green algae เปนตน การผลตระดบอตสาหกรรม สวนใหญแลวสาหรายทะเลทใชในการสกดแยกอยในกลมของ brown algae ไดแก Macrocystis pyrifera มอลจเนตเปน

6

องคประกอบประมาณ 14-19% Laminaria cloustoni และ Laminaria digitata มอลจเนตเปนองคประกอบประมาณ 15-40% ทงนปรมาณทพบจะขนกบชนดของสาหราย, ฤดกาล และแหลงทสาหรายเจรญเตบโต (Lee and Mooney, 2012: 106-126) นอกจากนแลวยงมจลนทรยบางชนดทสามารถผลตอลจเนตได เชน Pseudomonas spp., Azotobacter vinelandii เปนตน (Gorin

and Spencer, 1966: 993-998) อลจเนตเปนพอลแซกคาไรดอยในกลมของพอลแซกคาไรดมโครงสรางเปนลกษณะเปนสายตรงไมมการแตกแขนง ภายในโมเลกลประกอบดวยพนธะ (1- 4 )

ไกลโคซดกระหวางนาตาล D-manuronic acid (M) และ L-guluronic acid (G) โครงสรางโมเลกลของ M และ G เปนเอพเมอรกนและมการจดเรยงตวทแตกตางกนในสวนของคารบอนตาแหนงท 5

ลกษณะการจดเรยงตวมความแตกตางกนภายในโมเลกล บรเวณทมการจดเรยงตวของ M เชอมตอกนดวยพนธะ β- , -glycosidic เปนสายยาว เรยกวา M-blocks หรอ PM สาหรบบรเวณทมการจดเรยงตวของ G เชอมดวยพนธะ α-1,4-glycosidic เปนสายยาว เรยกวา G-blocks หรอ PG และบรเวณทมการเรยงตวสลบการระหวาง M และ G เรยกวา MG blocks หรอ PMG ตามลาดบ ดงภาพท 1 (Sabra, Zeng, and Deckwer, 2001: 315–325)

ภาพท 1 โครงสรางของอลจเนต (alginate) ก) โครงสรางนาตาลทเปนองคประกอบ ข) ลกษณะ การ จดเรยงตวในรปแบบตางๆ

ทมา : Sabra, W., An Ping Zeng, and W.D. Deckwer. “Bacterial alginate: physiology, product

quality and process aspects.” Applied Microbial Biotechnol 56, 3-4 (2001): 315–325.

7

โครงสรางของ PM เกดจากการทโมเลกล M เชอมตอกนดวยพนธะไกลโคซดกทม ลกษณะเปน diequatorial linkages ภายในโมเลกลของ PM มการสรางพนธะไฮโดรเจนภายในสายโมเลกล ซงมกจะเกดบรเวณหมไฮดรอกซลของคารบอนตาแหนงท 2 หรอ 3 กบอะตอมของออกซเจนในวงนาตาล และยงมการสรางพนธะไฮโดรเจนระหวางสายของ PM บรเวณหม ไฮดรอกซลของคารบอนตาแหนงท 2 กบอะตอมของออกซเจนในวงนาตาลหรอหมคารบอกซลก สงผลใหลกษณะโครงสรางเปนแบบ ribbon like structure (Atkins and Nieduszynski, 1973:

1865-1878) แตสาหรบ PG ภายในโครงสรางเชอมตอกนดวยพนธะไกลโคซดกทมลกษณะเปน diaxial linkages และมการสรางพนธะไฮโดรเจนภายในสายโมเลกล บรเวณหมไฮดรอกซลของคารบอนตาแหนงท 2 กบหมคารบอกซล นอกจากนมการสรางพนธะไฮโดรเจนระหวางสายของ PG บรเวณหมไฮดรอกซลของคารบอนตาแหนงท 3 กบอะตอมของออกซเจนในวงนาตาล สวนใหญมกมโมเลกลนาเปนโมเลกลกลางในการสรางพนธะ สงผลใหมโครงสรางเปนแบบ flat ribbon like structure (Atkins and Nieduszynski, 1973: 1879-1887) ดงภาพท 2 แตสาหรบโครงสรางของ PGM หรอ PMG เชอมกนดวยพนธะไกลโคซดกแบบ axial-equatorial หรอ equatorial - axial (Draget, Smidsrød, and Skjåk-Bræk, 2005: 1-29)

ภาพท 2 การสรางพนธะไฮโดรเจนระหวางโมเลกล ก) PG และ ข) PM

ทมา : Atkins, E.D.T., and I.A. Kieduszynsi. “Structural Components of Alginic Acid. I. The

Crystalline Structure of Poly - -D-Mannuronic Acid. Results of X-Ray Diffraction and

Polarized Infrared Studies.” Biopolymers 12, 8 (1793): 1865-1878.

8

จากโครงสรางการจดเรยงตวทมความแตกตางกนสงผลตอคณสมบตทมความแตกตางกน เชน ความแขงแรงของพนธะและความยดหยนของโมเลกล พบวาภายในโมเลกลของ PG มพนธะแบบ

diaxial linkages ซงมความแขงแรงกวาแบบอนๆ สงผลใหโมเลกลของ PG สามารถทนทานตอสภาวะตาง ๆ เชน ความเปนกรด , ความรอนไดดกวา PMG และ PM (Aida et al., 2010: 296-302) แตในขณะเดยวกนสงผลใหโมเลกล PG มความยดหยนทนอยกวาโครงสรางแบบอนๆ (Atkins and

Nieduszynski, 1973: 1879-1887) และนอกจากนยงสงผลตอการเกดเจล เจลทเกดจากการรวมตวของ PG คณสมบตเปนเจลแขง เมออยในสภาวะทมความเขมขนของโลหะประจบวก (polyvalent

metal cation) เชน Ca2+ ซง โครงสรางของเจลมลกษณะคลายกลองไข (egg box) ในขณะท PM มแนวโนมทจะเกดเจลทออนนมดงภาพท 3

ภาพท 3 กลไกการเกดเจลของ calcium alginate (Egg-box model)

ทมา : Sabra, W., An Ping Zeng, and W.D. Deckwer. “Bacterial alginate: physiology, product

quality and process aspects.” Applied Microbial Biotechnol 56, 3-4 (2001): 315–325.

9

การละลายนาเปนคณสมบตอกขอทมความแตกตางกนระหวาง PM และ PG พบวา M มคา pKa

เทากบ . และ G มคา pKa เทากบ . การลด pH ของสารละลายสงผลตอการตกตะกอนของ PM และ PG จงสามารถนามาประยกตใชสาหรบกระบวนการในการแยก PM และ PG พบวาท pH

2.85 โมเลกลของ PG ไมสามารถละลายไดแตในขณะเดยวกน PM สามารถละลายได (Zhao et al.,

2007: 272-279) อลจเนตทผลตจาหนายเปนการคามหลายอนพนธจงมคณสมบตการละลายในนาทแตกตางกน เชน อนพนธ ของเกลอ Ca2+, K+, Na+, NH4

+และยงผลตในรปของ propylene glycol

alginate ซงไดจากปฏกรยาของ alginic acid กบ propylene oxide ภายใตความดน อนพนธเหลานจะละลายไดทงในนารอนและนาเยน อลจเนตเปนพอลแซกคาไรดทนามาประยกตใชในดานตาง ๆ

อลจเนตถกนาไปใชในผลตภณฑอาหารหลายชนดตงแตป ค.ศ. โดยเตมในอาหารกระปอง ใชเปนสารเพมความหนด สารเพมความคงตว ทาใหอมลชนคงตว สารทาใหเกดเจล เชน propylene

glycol alginate ใชในนาสลด (salad dressing) และเบยร เพราะมความสามารถละลายไดสงท pH ตา โซเดยมอลจเนตใชเปนสวนผสมในไสพายมะนาวทแชเยน เพอใหเกดความคงตวระหวางfreeze-thaw ใชเคลอบผวชนเนอปลากอนนาไปแชเยอกแขงเพอปองกนไมใหเกด freeze burn

กบชนเนอปลา ใชเปนสารเพมความคงตวใหกบไอศกรม, frozen dessert, sherbet, processed cheese

และใชเปนสารเพมความคงตวในผลตภณฑอาหาร เชน onion rings และ shrimp-like fish products

(Sabra, Zeng, and Deckwer, 2001: 315–325) สาหรบปจจบนมการนาไปใชการแพทยในหลาย ๆ ดาน ไดแก การใชอลจเนตในการกระตนระบบภมคมกน โดยการกระตนผานทางแมคโครฟาจ

(Ueno et al., 2012: 88-93) การนาอลจเนตมาปรบปรงโครงสรางเพอนาไปใชเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด (Fan et al., 2011: 1797-1803) การนาอลจเนตมาใชในการผลตแคปซลเพอนาไปใชในกระบวนการขนสงยา เนองจากมอลจเนตมลกษณะทเปนเจล และมความเขากนไดกบเนอเยอในรางกาย (Cong et al., 2014: 252-259) เปนตน

4. การปรบขนาดโมเลกลพอลแซกคาไรด พอลแซกคาไรดโดยทวไปจะมขนาดโมเลกลใหญดงนนจงตองมขนตอนในการปรบ

ขนาดโมเลกลใหมขนาดทเลกลงเพอใหเหมาะสมตอการนาไปใชในดานตางๆ โดยเฉพาะอยางยงการประยกตใชดานการแพทย กระบวนการทนามาใชในการปรบขนาดโมเลกลมดวยกนหลายวธ

10

เชน การใชสารเคมและการใชเอนไซม ซงทงสองวธมขอไดเปรยบและขอจากดทแตกตางกน สาหรบการใชวธการทางเคมนน สารทใชมราคาถก , หาไดงาย และสามารถใชไดกบ พอลแซกคาไรดไดหลายชนด แตในกระบวนการตดสายพอลแซกคาไรดนนเปนไปแบบสมและไมสามารถควบคมตาแหนงในการตดได แตกตางจากวธการใชเอนไซม ทมความจาเพาะตอตาแหนงในการตดพนธะและชนดของพอลแซกคาไรด ทาใหการตดและขนาดโมเลกลของอลจเนตคงท ขอจากดของวธนคอ เอนไซมมราคาแพงและมความจาเพาะตอสารตงตน ดงนนจงนยมใชวธการทางเคม มการรวบรวมไวดงในตารางท

ตารางท 1 สารเคมทใชในการปรบขนาดโมเลกลอลจเนต

วธการทางเคมทนยมใชในการทาใหสายพอลแซกคาไรดมขนาดสนลงโดยอาศย

ปฏกรยาไฮโดรไลซสและออกซเดชนในการเขาไปทาลายพนธะไกลโคซดกททาหนาเชอมอยระหวางโมเลกลของนาตาลในสายอลจเนต โดยชนดของสารทนยมนามาใชไดแก hydrochloric

acid (HCl) และ hydrogen peroxide (H2O2) ตามลาดบ โดยมขนตอนและตาแหนงในการตดท

พอลแซกคาไรด สารเคม เอกสารอางอง

alginate 90% formic acid

(100 องศาเซลเซยส, 6 ชวโมง)

chandia, Matsuhiro, and Vasquez, 2001:

81-87

alginate 0.5 M HCl

(100 องศาเซลเซยส, 8 ชวโมง) Yang et al., 2004: 115-121

alginate 0.3 M HCl

(100 องศาเซลเซยส, 2 ชวโมง)

(chandia, Matsuhiro, and Vasquez, 2001:

81-87)

alginate 0.25 M H2SO4

(100 องศาเซลเซยส, 4 ชวโมง) Chhatbar et al., 2009: 650-656

alginate NaIO4

(37 องศาเซลเซยส, 24 ชวโมง)

Gomez, Rinaudo and Villar, 2007: 296–

304

alginate 1.5% (w/v) H2O2

(50 องศาเซลเซยส, 5 ชวโมง) Li et al., 2010: 660-664

11

แตกตางกน สาหรบกระบวนการไฮโดรไลซสเปนอกวธทนยมนามาใชในการปรบขนาดโมเลกลของอลจเนต สารทนยมใชไดแก hydrochloric acid กระบวนการนเปนการเพมโปรตอนใหกบสวนของออกซเจน ทาใหเกดการทาลายพนธะระหวางออกซเจนกบคารบอนในตาแหนงท 1 ซงเปนการทาลายพนธะไกลโคซดกททาหนาทเชอมอยระหวางโมเลกลของนาตาล จากนนเกดการฟอรมตวเปน non-reducing end group และ carbonium-oxonium ion โครงสรางของ carbonium -

oxonium ion ไมเสถยรจงเขาทาปฏกรยากบโมเลกลนาเกดเปน reducing end group โดยกระบวนการปรบขนาดโมเลกลอลจเนตดวย hydrochloric acid เปนไปแบบสม (Pawar et al., 2012:

3279-3305)

ภาพท 4 กลไกการเกดปฏกรยาไฮโดรไลซสเมออยในสภาวะทเปนกรดและโครงสรางอลจเนตหลงเกดปฏกรยาไฮโดรไลซส

ทมา : Pawar, N. Siddhesh., and Kevin J. Edgar. “Alginate derivatization: A review of chemistry,

properties and Applications.” Biomaterials 33, 11(2012): 3279-3305.

12

สาหรบการใชกระบวนการออกซเดชนเขามาชวยในการลดขนาดโมเลกลของอลจเนต จากการศกษาไดมการใช hydrogen peroxide ในสภาวะทเปนกรด เกดการแตกตวของ hydrogen-

peroxide ไดเปน hydroxyl group ไปจบกบคารบอนตาแหนงท ของโมเลกลนาตาลปลายสาย

อลจเนต ทาใหเกดการเปดวงเปนหมแอลดไฮดและในขณะเดยวกนเกดการทาลายพนธะ ไกลโคซดก ทาหนาทเชอมอยระหวางโมเลกลของนาตาล ซงในการทาลายพนธะจะเปนไปในแบบสม ทาใหโมเลกลมขนาดเลกลงและเกดนาตาลรดวซทปลายสาย แตในสภาวะทมปรมาณ hydrogen - peroxide มากเกนไปจะทาใหเกดการออกซไดสหมแอลดไฮดใหกลายเปนหม คารบอกซลได (Li et al., 2010: 660-664)

ภาพท 5 โครงสรางของอลจเนตหลงจากเกดปฏกรยาออกซเดชน ทมา : Li, Xiaoxia. et al. “Preparation of low molecular weight alginate by hydrogen peroxide

depolymerization for tissue engineering.” Carbohydrate polymers 79, 3(2010):

660-664.

5. กระบวนการเตมหมซลเฟต

ซลเฟตพอลแซกคาไรดเปนสารทสามารถพบไดทวไปในธรรมชาต โดยสามารถพบได

ในสตว พช และจลนทรยนอกจากนยงมการสงเคราะหซลเฟตพอลแซกคาไรดขนมาดวยวธการทางเคม ซงประสทธภาพของซลเฟตพอลแซกคาไรดนนจะขนอยกบปรมาณและตาแหนงของซลเฟตในสายพอลแซกคาไรด ในกระบวนการเตมหมซลเฟตนนมปจจยทมความสาคญไดแก sulfating

agent มการรายงานไวดงในตารางท 2

13

ตารางท ชนดของสารทใชในการเตรยมเปน sulfating agent ในการเตมหมซลเฟต

พอลแซกคาไรด sulfating agent degree of

substitution (DS) เอกสารอางอง

alginate sulfates Na2SO3, NaNO2 1.87 Fan et al., 2011: 1797-1803

starch sulfates Na2SO3, NaNO2 2.14 Cui et al., 2007:91–98

alginate sulfates formamide, ClSO3H 0.38 – 0.87 Ronghuaet, Yumin and

Jianhong, 2003: 19-24

polyguluronate sulfates formamide, ClSO3H 1.53 Zhao et al., 2007: 272-279

lacquer polysaccharide SO3- pyridine, DMSO 0.57 – 1.57 Yang et al., 2002: 55-62

D-glucansulphates sulfuric acid, n-propanol 0.36 Wang et al., 2005: 93-99

pullulan sulfates SO3- pyridine, DMF 0.17 – 1.99 Alban, Schauerte, and

Franz, 2002: 267-276

chitin sulfates dimethyl sulfoxide, DMF 0.44 – 1.69 Nishimura et al., 1998:

427-433

curdlan sulfates

SO3- pyridine,

LiCl/Me2SO

1.7 - 2.2

Koumoto et al., 2004:

161-167

curdlan sulfates

SO3-pyridine, dimethyl

formamide 1.20

Alban and Franz., 2000:

377-388

14

สารทนยมใชกนอยางแพรหลายไดแก chlorosulfonic acid เปนวธทมประสทธภาพ ในการเตมหมซลเฟต จากการศกษาพบวาอลจเนตซลเฟตทสงเคราะหดวย formamide และ

chlorosulfonic acid พบวามการแทนทของหมซลเฟต (DS) เปน 1.41 เมอใชอลจเนตทเปนสารตงตน 10 กรมทาปฏกรยากบ chlorosulfonic acid และ formamide ปรมาตร 20 และ 80 มลลลตรตามลาดบ ใหความรอนทอณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 4 ชวโมง (Ronghuaet, Yumin, and

Jianhong, 2003: 19-24) พบวาวธดงกลาวเปนวธทมประสทธภาพในการเตมหมซลเฟตและมขนตอนในการเกดปฏกรยาทไมซบซอน มการใชอยางแพรหลายสาหรบการสงเคราะหอลจเนตซลเฟตและเปนวธทนามาใชในการศกษาครงน (ภาพท 6)

ภาพท 6 ปฏกรยาการสงเคราะห alginate sulfates โดยใช chlorosulfonic acid กบ formamide เปน

sulfating agent R = SO3Na

ทมา : Ronghuaet, Huang., Du Yumin, and Yang Jianhong. “Preparation and in vitro

anticoagulant activities of alginate sulfate and its quaterized derivatives.”

Carbohydrate polymers 52, 1 (2003): 19-24.

นอกจากนมการคดคน sulfating agent แบบอนๆ เชน sulfating agent ทเตรยมจากปฏกรยาระหวาง sodium bisulfite กบสารละลาย sodium nitrite ซงอตราสวนในการทาปฏกรยาเปน 4.25:1 ทอณหภม 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1.5 ชวโมง โดยลาดบขนตอนแสดงดงภาพท 7

15

ภาพท 7 ปฏกรยาการสงเคราะห alginate sulfates โดยการใช sodium bisulfite กบ sodium nitrite เปนsulfating agent

ทมา : Fan, Lihong. et al. “Synthesis and anticoagulant activity of sodium alginate sulfates.”

Carbohydrate polymers 83, 4 (2011): 1797-1803.

ตาแหนงการแทนทของหมซลเฟตในซลเฟตพอลแซกคาไรด สวนใหญมกมการแทนท

บรเวณคารบอนตาแหนงท 2, 3, 4 และ 6 สาหรบการแทนทของหมซลเฟต แตสาหรบกระบวนการแทนทของหมซลเฟตในโมเลกลอลจเนต พบวามการแทนทของหมซลเฟตในคารบอนตาแหนงท 2

และ 3 (Cong et al., 2014: 252-259) สาหรบตาแหนงการแทนทของหมซลเฟตไมมความแตกตางกนระหวาง PG และ PM แตพบวาโอกาสในการเขาแทนทของในโมเลกลของ PG และ PM

แตกตางกน สาหรบโมเลกลของ PG พบวามการแทนทของหมซลเฟตบรเวณคารบอนตาแหนงท 2

ประมาณ 81% และบรเวณคารบอนตาแหนงท 3 ประมาณ 77% ซงไมมความแตกตางกนระหวางการเขาแทนทของหมซลเฟตในโมเลกล PG (Zhao et al., 2007: 272-279) แตในโมเลกล PM การแทนทของหมซลเฟตในคารบอนตาแหนงท 2 และ 3 มความแตกตางเนองจากคารบอนตาแหนงท 2

มการจดเรยงตวอยใกลกบหมคารบอกซลทาใหเกดการสรางพนธะไฮโดรเจน สงผลกระทบตอการเตมหมซลเฟตในคารบอนท 2 ดงนนในโมเลกลของ PM สวนใหญมกมการเขาแทนทในบรเวณคารบอนตาแหนงท 3 (Li et al., 2013: 281-286)

16

6. กลไกการแขงตวของเลอด

การแขงตวของเลอดทผดปกตในรางกายอาจทาใหเกดอนตราย และทาใหมอาการ ตงแตไมรนแรง เชน อาการเจบปวด ไปจนถงอาการทรนแรง เชน โรคหลอดเลอดสมอง กลามเนอหวใจตาย และภาวะลมเลอดอดกนในปอด อาการเหลานสามารถรกษาไดดวยยาตานการแขงตวของเลอด ยาตานการแขงตวของเลอดเปนยาททาใหเลอดแขงตวชากวาปกต มวตถประสงคเพอปองกนการเกดกอนเลอดหรอลมเลอด ปจจบนยาทใชในการปองกนการแขงตวของเลอดสามารถแบงออกไดเปน กลมหลก ไดแก

.Vitamin K antagonists ยาในกลมนยบยงปจจยการแขงตวของเลอดหลายปจจยทขนกบวตามนเค ไดแก แฟคเตอร II, VII, IX, X ตวอยางยาในกลมนทรจกกนดคอ warfarin

. Factor Xa inhibitors ยาในกลมนยบยงแฟคเตอร X เปนสาคญ มอยดวยกน ประเภทคอ Unfractionated heparin (UFH) และ Low molecular weight heparin

(LMWH)

. Direct Thrombin III inhibitors ไดแก Hirudin

กลไกในการยบยงการแขงตวของเลอดสามารถเกดขนได 2 แบบไดแก Intrinsic

pathway และ Extrinsic pathway (ภาพท 8) การแขงตวของเลอดทงกลไกการแขงตวของเลอดผานทาง Intrinsic pathway และกลไกการแขงตวของเลอดผานทาง Extrinsic pathway เมอถกกระตนจะกอใหเกดการแขงตวของเลอดผาน common pathway มปจจยการแขงตวของเลอดทสาคญคอ Factor X เมอถกกระตนจะออกฤทธกระตน Factor II ใหทางานไปกระตน Factor I จนในทสดเกด Fibrin ขน และเมอรวมกบเกลดเลอดจะกระตนใหมการเกาะตวและการรวมตวกนกบเมดเลอดแดงจนในทสดเกด clot ขนในรางกายหรอในระบบทมเลอดไหลผาน ในขณะเดยวกนในรางกายคนกมระบบยบยงการแขงตวของเลอด (coagulation inhibitor) ททางานพรอมกนไปดวย ไดแก Antithrombin III, Heparin, Cofactor II, Protein C และ Protein S เปนตน ทสาคญคอ Antithrombin

III ซงยบยงการแขงตวของเลอดไดในหลาย ๆ ตาแหนงภายในรางกายไมวาจะเปนทตาแหนง Factor II, IX, X, XI และ XII ในภาวะปกต Antithrombin III จะไมทางานหรอทางานนอยมาก ดงนนเมอมเลอดออกหรอมเลอดผานตวกรองนอกรางกายจะมการกระตนการแขงตวของเลอดทา

17

ใหเกด clot ได เราสามารถทาให Antithrombin III นทางานมากขนไดโดยการใหสาร Heparin แกผปวยเพอใหเกดการยบยงการเกด clot ขนในระบบ (Spronk, Riemslag, and Cate, 2003:

1220-1228)

ภาพท 8 กลไกการแขงตวของเลอด

เฮพารนเปนสารยบยงการแขงตวของเลอดทมการใชกนอยางแพรหลาย เฮพารนเปน

พอลแซกคาไรดทมโครงสรางเปนเสนตรง จดอยในกลมของ glycosaminoglycan โครงสรางของ เฮพารนประกอบดวยนาตาลทเปนองคประกอบ 2 ชนดไดแก β-D-glucosamine (GlcN) และ β-D-glucuronic acid (GlcA) หรอ α-Liduronic acid (IdoA) นอกจากนภายในโครงสรางมหมซลเฟตเปนองคประกอบ ซงมพบวามการสรางพนธะกบออกซเจนในตาแหนงท 3 และ 6 สงผลใหมประจโดยรวมเปนประจลบ (ภาพท 9 ) เฮพารนทมการนามาใชในทางการแพทยแบงออกเปน 2 กลมซงจาแนกตามขนาดโมเลกลไดแก unfractioned heparin (UFH) และ low-molecular weight

heparin (LMWH) ขนาดโมเลกลของ UHF อยในชวง 3 - 30 kDa มคาเฉลยในชวง 12 - 15 kDaในสวนของ LMWH มขนาดโมเลกล 1 – 10 kDa มคาเฉลยในชวง 4 – 5 kDa (Arlov, 2012: 1-84)

18

ภาพท 9 โครงสรางของเฮพารน

กลไกในการยบยงการแขงตวของเลอดโดยเฮพารน พบวาเฮพารนจะจบกบ antithrombin III (AT3) ซงเปน alpha-globulin ททาหนาทยบยงการทางานของปจจยการแขงตวของเลอดตาง ๆ โดยเฉพาะอยางยง Factor X และ Factor II นอกจากนยงยบยง Factor อน ๆ ดวยไมวาจะเปน Factor IX, XI, XII (ภาพท 10)

ภาพท 10 กลไกการยบยงการแขงตวของเลอดโดยเฮพารน

19

ตารางท 3 ตวอยางยาและพอลแซกคาไรดทนามาประยกตใชเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด

ประเภทสาร ชอสาร APTT (s) กลไกการออกฤทธ เอกสารอางอง

ยา

heparin 500

(14 μg/ml)

antithrombin III (AT),

Xa, thrombin (IIa)

Arlov, 2012: 1-84

hirudin - antithrombin III Schmitz, Rothe and Dodt,

1991: 251-256

wafarin - II, VII, IX, X Hirsh et al., 2003: 1692–

1711

พอลแซกคาไรด fucoidans 238

(28 μg/ml)

VIII, IX, XI and XII Wang et al., 2010: 6-12

carrageenan 86.4

(-)

Xa Liang et al., 2014: 776-785

fucan 250

(100 μg/ml)

thrombin (IIa) Dore et al., 2013: 467–475

พอลแซกคาไรดซลเฟต

alginate sulfate 170

(75 μg/ml)

Xa, thrombin (IIa) Fan et al., 2011: 1797-1803

chitosan sulfates 160

(75 μg/ml)

Xa, thrombin (IIa) Fan et al., 2012: 31-37

cellulose sulfate 200.8

(22 μg/ml)

Xa, thrombin (IIa),

AT-III

Wang et al., 2007: 376-382

Coagulation test เปนกลมการทดสอบเพอประเมนการทางานของปจจยการแขงตวของเลอด ประกอบดวย 2 การทดสอบ คอ Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) และ Prothrombin

Time (PT) (ภาพท 11)

1. Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) เปนการทดสอบการทางานของ Coagulation factor XII, XI, IX, VIII, X, V, II, I โดยการเตม activator, phospholipid และ calcium

ใน citrated plasma และจบเวลาการเกด clot

20

2. Prothrombin Time (PT) เปนการทดสอบการทางานของ coagulation factor VII, X,

V, II, I โดยการเตม tissue thromboplastin และ calcium ใน citrated plasma และจบเวลาการเกด clot

ภาพท 11 การทดสอบ Coagulation test ดวยวธ APTT และ PT

จากการศกษาโครงสรางของอลจเนตซลเฟตพบวามลกษณะโครงสรางและฟงกชนท

คลายกบโมเลกลของเฮพารน จงมการประยกตนาอลจเนตซลเฟตมาใชเปนสารตานการแขงตวของเลอด หมซลเฟตทเตมเปนปจจยทมความสาคญตอเปนสารตานการแขงตวของเลอด เมอทดสอบ

อลจเนตซลเฟตทระดบความเขมขน 16.7 ไมโครกรมตอมลลลตร ใหคา APTT 266 วนาท มประสทธภาพเทยบไดกบการใชเฮพารนทความเขมขน 10 ไมโครกรมตอมลลลตร ใหคา APTT 125

วนาทและเมอเพมความเขมขนขนพบวาความสามารถในการยบยงการแขงตวของเลอดเพมขน เมอเพมความเขมขนเปน 33 และ 67 ไมโครกรมตอมลลลตร แตในทางกลบกนพบวาเมอนาไปทดสอบดวยวธ Thrombin Time (TT) และ PT พบวาไมมความแตกตางของกจกรรมการยบยงเมอเพมความเขมขนซงชใหเหนวาอลจเนตซลเฟตสามารถยบยงกระบวนการ intrinsic coagulation pathway ทาใหเลอดเกดการแขงตวไดชา (Ronghuaet, Yumin and Jianhong, 2003: 19-24) และนอกจากนย งพบวาขนาดโมเลกลและตาแหนงซลเฟต เปนอกปจจยทมความสาคญตอหมซลเฟต (Mestechkina and Shcherbukhin, 2010: 267-273)

21

7. เซลลเพาะเลยง Cell culture คอ เซลลเพาะเลยงภายใตสภาวะทเซลลเหลานนไมสามารถกลบมาเรยงตว

เปนเนอเยอไดอก โดยจะสญเสยคณสมบตและหนาทเดมของเนอเยอเปนเซลลเพาะเลยง สามารถแบงได 3 ชนด

1. Primary cell line เปนเซลลทแยกไดจากสงมชวต หรออวยวะของสงมชวตโดยตรง ม

คณสมบตเหมอนเซลลทอยในสงมชวต คอ มรปราง โครโมโซม เหมอนอวยวะตนกาเนดทก

ประการ เชน fibroblast cell และ epithelial cell เซลลชนดนมขอเสยคอ สามารถเพาะเลยงไดไมนานนก และมกตายหลงมการ subculture

. Diploid cell line มตนกาเนดจาก primary cell line เชน MRC- (Medical Research

Council ) จาก Human embryonic lung เปนเซลลทมความไวในการแยกเชอสง เหมาะกบการใช

เตรยมวคซน มขอเสยคอ สามารถ subculture ได 50-100 ครง จากนนเซลลจะตาย

3. Continuous cell line เปนเซลลทมคณสมบตแบงตวไดไมมสนสด สามารถ subcultureไดหลายรอยครง ซงมตนกาเนดจากการเปลยนแปลงของ diploid cell line ไปเปนเซลลมะเรง ซงเซลลนจะมขอเสยคอ เปนเซลลทมกกลายพนธไปจากเซลลปกตทาใหเซลลมคณสมบตทเปลยนไป ทาใหความไวในการแยกเชอลดลง และมคณสมบตเปนเซลลมะเรงจงไมนยม

เชน Vero cell, Hela cell

Cell culture ถกนามาใชในงานวจยทางดานเภสชวทยาและพษวทยา ซงกอนหนานอาศยเฉพาะสตวทดลองเทานน การทดลองโดยวธการทเกยวกบเซลลดงกลาวจดเปนการทดสอบในระดบหลอดทดลอง (in vitro test) ซงเปนการศกษาถงขอมลเบองตนหรอขอมลขนพนฐานในระดบเซลล เพอเปนแนวทางในการศกษาขนสงในสตวทดลอง (in vivo test) ตอไป สาหรบในการเลอกเซลลในการทดสอบนนตองคานงถงเปาหมายการออกฤทธของสารนน จาเปนทจะตองเขาใจกระบวนการเจรญพฒนาของเซลลและเนอเยอตางๆ รวมทงวถชวเคม (biochemical pathways) ทเกยวของ ในปจจบนจงไดมความพยายามพฒนาเซลลสาหรบการทดสอบ (cell model) ทเปนเซลลมนษย และเนองจากเซลลตนกาเนดจากการเหนยวนาของมนษย (human induced pluripotent stem

cells) มความสามารถในการเจรญพฒนาไปเปนเซลลชนดตางๆ ในรางกายไดทงหมด หากนาเซลลของผปวยมาผลตเปนเซลลตนกาเนดจากการเหนยวนากจะทาใหเราสามารถศกษากลไกและ

22

ขนตอนตางๆของการพฒนาการเกดโรคได ตวอยางเชน งานวจยทางดานเภสชวทยาทเนนไปในแงพษวทยานนเปนการศกษาถงขบวนการเมตาบอลซมซงรวมไปถงการกาจดยาหรอสารเคมทเขาสรางกายเนองจากขบวนการดงกลาวเปนหนาทของอวยวะตบและไต ดงนนการทดสอบในหลอดทดลองจงจาเปนตองใชเซลลทไดมาจากอวยวะนน โดยอาศยกระบวนการแยกเซลลจากอวยวะดงกลาวเพอนามาเลยงในหลอดทดลองและทาการทดสอบตอไป สาหรบสารทจะนามาใชเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด มการทดสอบความเปนพษกบเซลลหลายชนด เชน เซลลบผนงหลอดเลอดจากรก (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) (Liang et al., 2014: 776-785),

L929 cell (Mouse connective tissue fibroblast cells) เปนเซลลปกตทคดแยกมาจาก

เนอเยอ fibroblasts อนไดแก tendon, ligament และ skin ของหน จดเปนเซลลเพาะเลยงพวก Continuous cell line สามารถแบงตวไดไมมสนสด เปนเซลลทนยมนามาใชในการทดสอบหลายดาน เชน biocompatibility, drug cytotoxicity และการศกษา cell biology เปนตน (Theerakittayakorn and Bunprasert, 2011: 316-319)

PBMC (Peripheral blood mononuclear cells) เปนเซลลเมดเลอดขาวชนดนวเคลยสกลม ประกอบดวย ลมโฟไซต, โมโนไซต และแมคโครฟาจ มบทบาทสาคญในระบบภมคมกน

เซลลเหลานจะทาหนาทกาจดเชอโรค และนาเสนอแอนตเจนตอ T cells รวมทงหลงไซโตไคน (cytokines) ไดหลายชนดทาหนาทควบคมระบบภมคมกน มการแยก PBMC จากนาเลอดเพอนาไปใชในงานวจยดานภมคมกนวทยาอนๆ

เซลลมะเรงเปนกลมของเซลลทเจรญ (แบงตว) อยางผดปกต การทเซลลเปลยนสภาพ

ไปจากปกตจะไมอยในการควบคมวฏจกรการแบงตว รกรานเนอเยอขางเคยง หรออาจแพรกระจายไปยงทอน ๆ จงมคดคนสารชนดตางๆเพอทจะใชในการยบยงการเจรญของเซลลมะเรง Hela cell

เปนเซลลมะเรงปากมดลก ทไดมาจาก Henrietta Lacks ซงเสยชวตดวยโรคมะเรง และเนองจาก Hela cell เปนเซลลมะเรงจงสามารถเจรญพฒนา ไดอยางไมสนสดหากมการควบคมสภาวะแวดลอมอยางเหมาะสมและมอาหารหลอเลยงเพยงพอ มการประยกตนาเอาอลจเนตซลเฟตมาใชประโยชนในดานการเปนสารยบยงเซลลมะเรงดวย จากการศกษาพบวาอลจเนตซลเฟตทสงเคราะหดวย formamide และ chlorosulfonic acid ซงมขนาดโมเลกล 3.8 kDa และคา DS เปน 1.3 ทความเขมขน 50 และ 100 มลลกรมตอกโลกรม สามารถยบยงการเจรญของเซลลมะเรง Sarcoma 180 ได

23

70.4 และ 66.0 % ตามลาดบ แตไมสามรถยบยงการเจรญของเซลล FT210 ไดซงพบวาอลจเนตซลเฟตมผลในการยบยงการเจรญของเซลลมะเรงผานทางการการควบคมในสวนของ host –

mediated immune (Hu et al., 2004: 67-71) สาหรบในการทดสอบในครงนใชวธ MTT assay

(3-[4,5-dimethythiazol- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) เปนวธตรวจวดความมชวตของเซลลโดยไมตองใช hemacytometerโดยเซลลมชวต จะม mitochondrial dehydrogenase ทจะเปลยน

MTT ซงเปนสารละลายสเหลองใหเปน formazan ทมสมวงและไมลายนา (ภาพท 12) เมอละลายตะกอน formazan ดวยตวทาละลายทเหมาะสม เชน sodium dodecyl sulfate (SDS) หรอ dimethysulfoxide (DMSO) สามารถวดความเขมสทความยาวคลน 540 นาโนเมตร ปรมาณ dehydrogenase ในเซลลหนงๆจะคงท ดงนนปรมาณ formazan ทเกดขนจะเปนสดสวนโดยตรงกบจานวนเซลลมชวต จงสามารถใชเปนวธวดความมชวตของเซลล การเจรญของเซลล การศกษาการกระตนและยบยงเมตาบอลซมของเซลล อยางไรกตามการวดดวยวธนอาจมขอผดพลาดจากสภาวะการเลยงเซลล ซงอาจมผลตอปรมาณเอนไซมและการทางานของเอนไซม เซลลสงมชวตม mitochondrial dehydrogenase เปลยนสารละลาย MTT ทมสเหลอง ใหเปน formazan สมวง (กลยาณ, 2550: 55-68)

ภาพท 12 กลไกการวเคราะหดวยวธ MTT

24

8. ระบบภมคมกน

ระบบภมคมกน คอ ระบบหนงทรางกายสรางขนมาเพอปองกนอนตรายทจะเกดแก รางกาย ทงอนตรายทเกดจากสงตางๆ รวมทงจลนทรย ทกอโรคหรอเชอโรค เพอใหสขภาพรางกายสมบรณแขงแรง สามารถมชวตอยรอดอยางปกต ระบบนจะทางานรวมกบระบบนาเหลอง โดยระบบนาเหลองจะสรางเมดเลอดขาวชนดตางๆ ขนมา ระบบภมคมกนมหนาทหลกในการปกปองและกาจดสงแปลกปลอมทเขาสรางกาย รวมทงการตดเชอจลชพ การไดรบสารพษ ภาวะภมตานทานเนอเยอตนเอง (autoimmune) และเซลลมะเรง เมดเลอดขาวกลมทสาคญในระบบภมคมกน คอ บลมโฟไซตหรอบเซลล (B lymphocytes or B cell) และ ทลมโฟไซตหรอทเซลล (T lymphocyte or T cell) เซลลททาหนาทในระบบภมคมกนสรางมาจาก stem cells ทอยใน ไขกระดก แบงเปน

1. เซลลททาหนาทกนสงแปลกปลอม เชน macrophage, monocyte, neutrophil

2. เซลลทม granule จานวนมาก ไดแก eosinophil, basophil

3. เซลลเมดเลอดขาวขนาดเลกทเรยกวา เซลลลมโฟไซต (lymphocyte) ซงแบงเปน 2

ชนด คอ B cells และ T cells

การสรางสารอนมลอสระและการตอบสนองของเซลลภมคมกน เปนกระบวนการททา ใหเกดการอกเสบอยางตอเนองในโรคเรอรงตาง ๆ การตอบสนองของระบบภมคมกนเปนผลมาจากเซลลภมค มกนถกกระตนรวมกบการสรางสารไซโตไคน (cytokines) และอนมลอสระ (free

radicals) ระบบภมคมกนสามารถแบงได แบบ คอ ภมคมกนแตกาเนด (innate immunity) และภมคมกนแบบจาเพาะ (adaptive specific immunity) เมอเซลลไดรบบาดเจบหรอมสงแปลกปลอมเขามารบกวน จะเกดการตอบสนองของระบบภมคมกนทนทและเรมกระบวนการอกเสบ เปนการทางานรวมกนของภมคมกนแตกาเนดและภมคมกนแบบจาเพาะ (Parkin and Cohen, 2001:

1777-1789) การตอบสนองของภมคมกนแตกาเนดมความสาคญมาก เนองจากเปนดานแรกของกระบวนการปองกนรางกายและเรมกระบวนการอกเสบ แมคโครฟาจเปนเซลลหลกในภมคมกนแตกาเนดในการกาจดสงแปลกปลอม โดยเฉพาะสารพษและการตดเชอจลชพ เซลลแมคโครฟาจสามารถกาจดเชอโรคโดยการจบกน (phagocytosis) และปลดปลอยสารกอการอกเสบ เชน tumor-

necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1 (IL-1), interferon (IFN) รวมทงสรางอนมลอสระ

25

ไนตรกออกไซด (nitric oxide, NO) และอนพนธออกซเจน (reactive oxygen species, ROS) (Parkin

and Cohen, : - ) NO ถกสรางจากเซลลเยอบผนงหลอดเลอด เซลลแมคโครฟาจมหนาทสาคญในการทาใหหลอดเลอดขยายตว และมหนาทในการตอตานกระบวนการอกเสบ เพอปองกนการเกดการอกเสบทมากเกนไป นอกจากนยงพบวา NO มบทบาทในการทาลายเชอแบคทเรยไดดวย (พรยทธ, 2552: 1-27) โดยเฉพาะเมอเซลลแมคโครฟาจถกกระตนดวยเอนโดทอกซน (endotoxin) หรอ ไลโปโปลแซกคาไรด (lipopolysaccharide, LPS)

NO เปนกาซทเซลลหลายชนดในรางกายสามารถสรางขนมาได NO เกดจากการเปลยนแปลงของกรดอะมโน L-arginine ดวยเอนไซมไนตรกออกไซดซนเทส (nitric oxide

synthase, NOS) ใหเปนสารซทรลน (citrullin) และปลดปลอย NO ออกมา (Neill et al., 2008:

25-35) เอนไซม NOS แบงออกเปน 2 ชนด ตามการแสดงออกของเอนไซมและกลไกทควบคมการทางาน สาหรบชนดแรกเปน NOS ทแสดงออกในสภาวะปกตของรางกาย (constitutive form) และชนดทสองเปน NOS ทแสดงออกเมอเซลลถกเหนยวนาดวยสารพษ เอนโดทอกซน หรอสารกอการอกเสบ (inducible form) ในภาวะปกต เซลลแมคโครฟาจจะมการสราง NO ในปรมาณนอยมาก เมอ

ถกกระตนดวยเอนโดทอกซนหรอไซโตไคนจากการอกเสบจะเหนยวนาการสงเคราะหเอนไซม iNOS และสามารถเพมการสราง NO ออกมาในปรมาณมากในความเขมขนระดบ ไมโครโมลาร ซงสง กวาปกต 100-1000 เทา เพอทาลายเชอจลชพทแปลกปลอมเขามา ในขณะเดยวกน NO ใน

ปรมาณทเพมขนระดบน จะสามารถทาปฏกรยากบโมเลกลปกตภายในเซลล สงผลทาลายเซลล และเกดพษ

ภาพท 13 กลไกการสงเคราะห NO

26

ไลโปโปลแซกคาไรด (LPS) เปนเอนโดทอกซนทผลตมากจากผนงเซลลของแบคทเรย

แกรมลบมขนาโมเลกลประมาณ 100 kDa โครงสรางของ LPS ประกอบไปดวยสองสวนสาคญไดแก สวนทเปน hydrophobic lipid A และ hydrophilic polysaccharide (O-antigen) (ดงภาพท 14) สาหรบสวนทเปน lipid A จะเปนสวนทมความคลายกนแตสวนทเปน O-antigen จะมความแตกตางกน เชน ความยาวและองคประกอบ ขนอยกบชนดของแบคทเรยทสรางขน (Raetz and

Whitfield, 2002: 635-700)

ภาพท 14 โครงสรางของไลโปโปลแซกคาไรด ทประกอบดวย lipid A และ O-antigen

ทมา : Raetz, Christian R. H., and Chris Whitfield. “Lipopolysaccharide endotoxins.” Annual

Review of Biochemistry 71, (2002): 635-700.

LPS มความสามรถในการกระตนแมคโครฟาจ สงผลใหมการหลงไซโทไคนท เกยวของกบกระบวนการอกเสบ พบวา LPS จะเขาไปจบกบโปรตนทอยบนผวเซลล อนไดแก LPS

binding protein (LBP), cluster of differentiation 14 (CD14), Lymphocyte antigen 96 (MD-2) และ Toll-like receptor 4 (TLR4) เปนตน TLR4 เปนตวการในการกระตนระบบภมคมกนแตกาเนด ดงนนการจบกนระหวาง LPS และ TLR เปนตวรบ สงผลใหมการหลง pro-inflammatory cytokines

(TNF-α and IL1-β) และ interferons (Tan and Kagan, 2014: 212-223) (ดงภาพท 15)

27

ภาพท 15 กลไกของไลโปโปลแซกคาไรด ในการกระตนระบบภมคมกน ทมา : Takeda, Kiyoshi., and Shizuo Akira. “TLR signaling pathways.” Seminars in

Immunology 16, 1(2004): 3–9.

NO ถกนามาใชในการวเคราะหความสามารถในการกระตนระบบภมคมกน เนองจาก

เปนอนพนธอสระสถานะกาซทสามารถละลายไดทงในนาและไขมน NO มคณสมบตเปนสารสอกลางในกระบวนการอกเสบ โดยตางจากสารเคมสอกลางชนดอนตรงทม โครงสรางโมเลกลงายไมซบซอน (N=O) ไมมการเกบสะสม แตจะสรางขนเมอแมคโครฟาจไดรบการกระตน วธทใชในการวเคราะห NO คอ Griess assay เกดจากการปฏกรยาระหวาง Sulfanilamide กบ NO ไดเปนสารประกอบเ ชงซอน แลวทาปฏ ก รยา ตอกบ NED (N-(1-naphthyl)ethylenediamine

dihydrochlorid) ไดเปนสารในกลม Azo compound ใหสมวง สามารถวดความเขมสทความยาวคลน 540 นาโนเมตร (Bredt and Snyder, 1994: 175-195) (ดงภาพท 16)

28

ภาพท 16 กลไกการวเคราะหดวยวธ Griess assay

ทมา : Bredt, D.S., and S.H. Snyder. “Nitric oxide: A physiologic messenger molecule.”

Annual Review of Biochemistry 63, (1994): 175–95.

จากการศกษาพบวาอลจเนตมฟงกชนทคลายกบโมเลกล LPS จงมการประยกตนา อลจเนตมาใชในการเปนสารกระตนระบบภมคมกน พบวาขนาดโมเลกลและปรมาณ M/G เปนปจจยทสาคญ เมอทดสอบ ดวยวธ Griess assay เพอวเคราะหหาปรมาณ NO พบวา PM และ PG ทความเขมขน 400 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในการกระตนระบบภมคมกน (Ueno et

al., 2012: 88-93) ซงขนาดโมเลกลของ PG และ PM ซงมลกษณะเปนโอลโกแซกคาไรดทความเขมขน 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร มความสามารถในกากระตนใหมการหลง TNF-α, IL- β,

IL-1α และ IL-6, พบวา PG มขนาดโมเลกล 1.8 kDa มความสามารถสงกวา PM (Iwamoto et al.,

2005: 4423-4429) และนอกนหมซลเฟตเปนอกหนงปจจยมความสาคญตอการกระตนระบบ ภมกน (Jiang et al., 2013: 124-129)

29

บทท 3

วธดาเนนงานวจย

1. พอลแซกคาไรดทใชในการวจย

1.1 Sodium alginate ยหอ SIGMA-ALDRICH บรษท SIGMA-ALDRICH ผลตท

ประเทศเยอรมน

1.2 Lipopolysaccharide ยหอ SIGMA-ALDRICH บรษท SIGMA-ALDRICH ผลตท

ประเทศเยอรมน

2. เซลลทใชทดสอบ

4.1 Human cervical adenocarcinoma cell line (Hela)

4.2 Mouse connective tissue fibroblast cells (L929)

4.3 Mouse leukaemic monocyte macrophage (RAW 264.7)

4.4 Peripheral blood mononuclear cells (PBMC)

3. สารเคมและอาหารเลยงเชอ

3.1 สารเคม

3.1.1 Acetic acid (C2H4O2) ยหอ J.T.Baker บรษท BAKER

ANALYZED ผลตทประเทศสาธารณรฐประชาชนจน 3.1.2 Acetone (C3H6O) ยหอ RCILabscan บรษท RCI Labscan Limit

ประเทศไทย 3.1.3 Acrylamide (CH2:CH.CONH2) ยหอ GE Healthcare บรษท BANG TRADING ผลตทประเทศองกฤษ 3.1.4 Activated Partial Thromboplastin time (APTT) ยหอ Stago

3.1.5 Alcian blue (C56H68Cl4CuN16S4) ยหอ SIGMA-ALDRICH

บรษท SIGMA-ALDRICH ผลตทประเทศเยอรมน

30

3.1.6 Ammonium persulphate ((NH4)2S2O8) ยหอ UNIVAR บรษท Ajax

Finechem ผลตทประเทศออสเตรเลย 3.1.7 Barium chloride (BaCl2) ยหอ Fluka บรษท SIGMA-ALDRICH

ผลตทประเทศเยอรมน

3.1.8 Bromphenol blue (C19H10Br4O5S) ยหอ AMRESCO บรษท AMRESCO ผลตทอเมรกา 3.1.9 Boric acid (H3BO3) ยหอ UNIVAR บรษท Ajax Finechem

ผลตทประเทศออสเตรเลย 3.1.10 Calcium chloride (CaCl )

3.1.11 Chlorosulfunic acid (ClSO3H) ยหอ MERCK บรษท Merck KGaA ผลตทประเทศเยอรมน

3.1.12 Dimethylformamide (CH3)2NC(O)H ยหอ SIGMA-ALDRICH

บรษท SIGMA-ALDRICH ประเทศเยอรมน

3.1.13 Dimethyl sulfoxide (C2H6OS) ยหอ RCILabscan บรษท RCI

Labscan Limited ผลตทประเทศไทย 3.1.14 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide

(C18H16BrN5S, MTT) ยหอ molecular probes บรษท Life technologies ผลตทประเทศอเมรกา

3.1.15 Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) ยหอ Panreac บรษท

PANREAC QUIMICA SAU 3.1.16 Ethanol (C2H5OH) ยหอ Merck บรษท Merck KGaA ผลตท

ประเทศเยอรมน

3.1.17 Ethylenediaminetetraacetic acid (C10H16N2O8) ยหอ CARLO

ERBA บรษท Carlo Erba Reactifs ผลตทประเทศฝรงเศส 3.1.18 Ficoll-Paque ยหอ GE Healthcare บรษท BANG TRADING ผลตท

ประเทศองกฤษ

31

3.1.19 Formamide (HCONH2) ยหอ Fluka บรษท Fluka AG ผลตท ประเทศสวสเซอรแลนด 3.1.20 Fetal bovine serum ยหอ gibco บรษท life technologies ผลตท ประเทศอเมรกา 3.1.21 Gelatin ยหอ Fluka บรษท SIGMA-ALDRICH ผลตทประเทศ

เยอรมน

3.1.22 Glucose (C6H12O6) ยหอ DAEJUNG บรษท KOSDAQ ผลตท

ประเทศเกาหล 3.1.23 Hydrochloric acid (HCl) ยหอ AppliChem บรษท AppliChem

GMbH ผลตทประเทศเยอรมน 3.1.24 Hydrogen peroxide (H2O2) ยหอ UNIVAR บรษท Ajax Finechem

ผลตทประเทศออสเตรเลย 3.1.25 N-(1-Naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride ยหอ

SIGMA-ALDRICH บรษท SIGMA-ALDRICH ผลตทประเทศเยอรมน

3.1.26 N, N’-Methylenebisacrylamide (C7H10N2O2) ยหอ GE Healthcar

บรษท BANG TRADING ผลตทประเทศองกฤษ 3.1.27 N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (C6H16N2) ยหอ

SIGMA-ALDRICH บรษท SIGMA-ALDRICH ผลตทประเทศเยอรมน

3.1.28 O-Phosphoric acid ยหอ UNIVAR บรษท Ajax Finechem

ผลตทประเทศออสเตรเลย

3.1.29 Potassium bromide (KBr) ยหอ SIGMA-ALDRICH

บรษท SIGMA-ALDRICH ผลตทประเทศเยอรมน

3.1.30 Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ยหอ RANKEM

บรษท RFCL Limited ผลตทประเทศอนเดย

32

3.1.31 Potassium sulphate (K2SO4) ยหอ ALPHA บรษท ALPHA

CHEMIKA ผลตทประเทศอนเดย

3.1.32 Sodium hydrogen cabronate (NaHCO3) ยหอ MERCK บรษท Merck KGaA ผลตทประเทศเยอรมน

3.1.33 Sodium hydroxide (NaOH) ยหอ ALPHA บรษท ALPHA

CHEMIKA ผลตทประเทศอนเดย

3.1.34 Sodium lauryl sulfate (CH3 (CH2)11OSO3Na) ยหอ LOBA Chemie

บรษท labachemie ผลตทประเทศอนเดย

3.1.35 Sucrose (C12H22O11) ยหอ UNIVAR บรษท Ajax Finechem

ผลตทประเทศออสเตรเลย

3.1.36 sulfanilamide (C6H8N2O2S) ยหอ SIGMA-ALDRICH

บรษท SIGMA-ALDRICH ผลตทประเทศเยอรมน

3.1.37 Trichloroacetic acid (C2HCl3O2) ยหอ AnalaR NORMAPUR

บรษท VWR international ผลตทประเทศเยอรมน 3.1.38 Tris base (C4H11NO3) ยหอ SAFC บรษท SIGMA-ALDRICH ผลตทประเทศสวสเซอรแลนด

3.2 อาหารสาหรบเลยงเซลลและเชอทดสอบ

3.2.1 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ยหอ gibco บรษท life technologies ผลตทประเทศอเมรกา 3.2.2 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ยหอ gibco บรษท life technologies ผลตทประเทศอเมรกา

4. อปกรณและเครองมอทใชในการวจย

4.1 เครองสเปกโทรโฟโตมเตอร (spectrophotometer)

4.2 ตลามนารโฟว (Laminar flow) รน V-190 บรษท EHRET ผลตทประเทศเยอรมน

4.3 เครองวดความเปนกรด-ดาง (pH-meter) รน 713 pH meter บรษท Metrohm

33

ผลตทประเทศอเมรกา 4.4 หมอนงความดน (Autoclave) รน HA-240M N บรษท Hirayama ผลตทประเทศ

ญปน

4.5 เครองผสมสาร (Vorter mixture) รน KMC-13000V บรษท VISION ผลตท

ประเทศเกาหล 4.6 อางนาควบคมอณหภม (Water bath) รน Eco Temp TW 20 บรษท Julabo ผลตท

ประเทศองกฤษ 4.7 เครองชงละเอยดทศนยม 4 ตาแหนง รน BA210S บรษท Sartorius ผลตทประเทศ

เยอรมน

4.8 เครองชงละเอยดทศนยม 3 ตาแหนง รน L420S บรษท Sartorius ผลตทประเทศ

เยอรมน

4.9 เครองหมนเหวยงปรบความเยน (Refrigerated centrifuge) รน Z36HK ยหอ HERMLE ผลตทประเทศเยอรมน

4.8 ตอบฆาเชอลมรอน (Hot air Oven) บรษท MEMMWRT ผลตทประเทศเยอรมน 4.9 ตแชเยอกแขงอณหภมตา (Ultra- low Freezer) อณหภม -80 °C รน C85-3 บรษท SO-LOW ENVIRONMENTAL EQUIPMENT CINCINATT

ผลตทประเทศสาธารณรฐประชาชนจน

4.10 ตแชเยอกแขงอณหภมตา (Ultra- low Freezer) อณหภม -20 °C ยหอ MIRAGE

ผลตทประเทศญปน 4.11 ตเลยงเซลล (CO Incubator) ยหอ New Brunswick บรษท Scientific ผลตท

ประเทศเยอรมน

4.12 เครองฟลเรยรทรานสฟอรม อนฟราเรดสเปคโทรมเตอร (FTIR) รน Spectrum

100 ยหอ Perkin Elmer ผลตทประเทศอเมรกา 4.13 เครองกวนสารใหความรอน (hotplate) ยหอ Vigo ผลตทประเทศเยอรมน 4.14 เครองอเลคโตรโฟรซส (Gel Electrophoresis) ยหอ BIO RAD ผลตทประเทศ

อเมรกา 4.15 เครองเครองอานปฏกรยาบนไมโครเพลท (Microplate Reader) รน SPR-96 ยหอ SUNOSTIK ผลตทประเทศสาธารณรฐประชาชนจน

34

5. วธดาเนนงานวจย

5.1 กระบวนการปรบขนาดโมเลกลของอลจเนตโดยปฏกรยาไฮโดรไลซส ดวย hydrochloric acid (chandia, Matsuhiro, and Vasquez, 2001: 81-87)

ชงอลจเนต 1.000 กรม ดวยเครองชงละเอยดทศนยม 3 ตาแหนง จากนนนาอลจเนตไป

ละลายนากลนปรมาตร 90 มลลลตร เมออลจเนตละลายหมดแลว ใหคอยๆ เตม 3 M hydrochloric

acid (HCl) ปรมาตร 10 มลลลตรลงไป แลวผสมใหเขากน นาไปใหความทรอนอณหภม 100 องศาเซลเซยส พรอมกวนเปนเวลา 2 ชวโมง เมอครบเวลาทาการหยดปฏกรยาดวยนาแขง นามาตกตะกอนดวย 95% (v/v) ethanol ดวยอตราสวนปรมาตรของ ethanol: สารละลาย เทากบ 3:1 เปนเวลา 24 ชวโมง ตอมาทาการแยกตะกอนของอลจเนตทเกดขนดวยการปนเหวยงทความเรว 8000

รอบตอวนาท เปนเวลา 10 นาท ตะกอนอลจเนตทไดนาไปอบใหแหงทอณหภม 37 องศาเซลเซยส

เปนเวลา 24 ชวโมง ตะกอนของอลจเนตทผานการปรบขนาดโมเลกลเรยบรอยแลวมาละลายในนากลนปรมาตร 20 มลลลตร แลวนาไปกาจดเกลอดวยการใสลงในถงไดอะไลซสเปนเวลา 72 ชวโมง หลงจากนนทาการตกตะกอนซาดวย 95% (v/v) ethanol ดวยอตราสวนปรมาตร ethanol: สารละลาย เทากบ 3:1 เปนเวลา 24 ชวโมง แยกตะกอนของอลจเนตทเกดขนดวยการปนเหวยงทความเรว 8000

รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท สดทายนาตะกอนอลจเนตทไดนาไปอบใหแหงทอณหภม 37

องศาเซลเซยสเปนเวลา 24 ชวโมง แลวใสในโถดดความชน เพอนาไปใชตอในกระบวนตอไป

5.2 กระบวนการปรบขนาดโมเลกลของอลจเนตโดยปฏกรยาออกซเดชนดวย hydrogen peroxide (H2O2) (Li et al., 2010: 660-664)

ชงอลจเนต 1.000 กรม ดวยเครองชงละเอยดทศนยม 3 ตาแหนง จากนนนาอลจเนตไป

ละลายนากลนปรมาตร 90 มลลลตร เมออลจเนตละลายหมดแลว ใหคอยๆ เตม 30% (v/v)

hydrogen peroxide (H2O2) ปรมาตร 10 มลลลตรลงไป แลวคนใหเขากน นาไปใหความรอนทอณหภม 50 องศาเซลเซยส ผสมกบการกวนสารโดยใช magnetic stirrer bar เปนเวลา 2 ชวโมง เมอครบเวลาทาการหยดปฏกรยาดวยนาแขง นามาตกตะกอนดวย 95% (v/v) ethanol ดวยอตราสวนปรมาตร ethanol: สารละลาย เทากบ 3:1 เปนเวลา 24 ชวโมง ตอมาทาการแยกตะกอนของอลจเนตทเกดขนดวยการปนเหวยงทความเรว 8000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท ตะกอนอลจเนตทได

35

นาไปอบใหแหงทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง แลวใสในโถดดความชน เพอนาไปใชตอในกระบวนตอไป

5.3 การแยกโมเลกล polymannuronic acid (PM) และ polyguluronic acid (PG)

(Zhao et al., 2007: 273-274) (Yang et al., 2004: 116) ชงอลจเนต 3.000 กรม ดวยเครองชงละเอยดทศนยม 3 ตาแหนง จากนนนาอลจเนตไป

ละลายนากลนปรมาตร 90 มลลลตร เมออลจเนตละลายหมดแลวใหคอยๆ เตม 3 M hydrochloric

acid (HCl) ปรมาตร 10 มลลลตรลงไป แลวคนใหเขากน หลงจากนนนาใหความทรอนอณหภม 100 องศาเซลเซยส พรอมกวนโดยใช magnetic stirrer bar เปนเวลา 6 ชวโมง เมอครบเวลาทาการหยดปฏกรยาดวยนาแขง นาสารละลายทไดไปปนเหวยงทความเรว 8000 รอบตอวนาท เปนเวลา 10

นาท เพอทาการแยกสวนของอลจเนตและสารละลายกรดออกจากกน หลงจากนนนาตะกอนของอลจเนตไปละลายใน 20 มลลลตรของ 8% (w/v) sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) เมอละลายเปนเนอเดยวกนแลวนาไปปรบ pH ดวย 1M sodium hydroxide (NaOH) ใหมคา pH เทากบ 2.85 ตงทงไวเปนเวลา 30 นาทเพอใหเกดการตกตะกอนของ PG ทาการแยกตะกอน PG ทเกดขนดวยการปนเหวยงทความเรว 8000 รอบตอวนาท เปนเวลา 10 นาท นาสวนของสารละลายทเหลอจากการตกตะกอนมาทาการปรบ pH ใหเทากบ 1 เพอทาการตกตะกอนสวนของ PM แลวตงทงไวเปนเวลา 30 นาท เพอใหเกดการตกตะกอนของ PM หลงจากนนทาการแยกตะกอน PM ทเกดขนดวยการปนเหวยงทความเรว 8000 รอบตอวนาท สดทายนาตะกอน PG และ PM ทแยกไดไปทาการอบใหแหงทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง แลวใสในโถดดความชน เพอนาไปใชตอในกระบวนตอไป

5.4 กระบวนการเตมหมซลเฟต (Ronghua, Yumin, and Jianhong, 2003: 19-24)

ขนตอนการเตรยม Sulfating reagent เรมจากการเตม formamide ปรมาตร 8 มลลลตร ลงในเครองแกว ทแชอยในนาแขงพรอมกบกวนโดยใช magnetic stirrer bar ทงไวเปนเวลา 10

นาท แลวคอยๆเตม chlorosulfonic acid (ClSO3H) ปรมาตร 2 มลลลตร อยางชาๆ เมอเตมจนหมด ทงไวเปนเวลา 15 นาทเพอใหสารผสมเขากนเปนอยางด หลงจากนนทาการชงสารตวอยางทใชสาหรบการเตมหมซลเฟตปรมาณ 1.00 กรม คอยๆเตมสารตวอยางลงใน sulfating reagent แลว

36

ปลอยใหผสมใหเขากนเปนเวลา 10 นาท จากนนนามาใหความรอนทอณหภม 60 องศาเซลเซยสเปนเวลา 4 ชวโมง เมอครบเวลาทาการหยดปฏกรยาดวยการแชนาแขง ตอมาทาการเตม acetone

ปรมาตร 20 มลลลตรเพอลางสวนของสารทเหลอจากปฏกรยา ดดสวนของ acetone ทงใหหมดแลวเตมนาปรมาตร 20 มลลลตรเพอละลายสวนของตะกอนทเกดขน ทาการปรบ pH เปน 10 ดวย 2 M

sodium hydroxide (NaOH) หลงจากนนทาการตกตะกอนดวย 95% (v/v) ethanol ดวยอตราสวนปรมาตร ethanol: สารละลาย เทากบ 3:1 เปนเวลา 24 ชวโมง แยกตะกอนทเกดขนดวยการปนเหวยงทความเรว 8000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท นาไปอบใหแหง นามาละลายนากลนซาอกครงแลวเตมลงในนาไปกาจดเกลอดวยการใสลงในถงไดอะไลซสเปนเวลา 72 ชวโมงทแชในนา หลงจากนนทาการตกตะกอนซาดวย 95% (v/v) ethanol ดวยอตราสวนปรมาตร ethanol: สารละลาย เทากบ 3:1 เปนเวลา 24 ชวโมง แยกตะกอนของอลจเนตทเกดขนดวยการปนเหวยงทความเรว 8000

รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท สดทายนาตะกอนอลจเนตทไดนาไปอบใหแหงทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง แลวใสในโถดดความชนเพอนาไปใชตอในกระบวนตอไป

5.5 การวเคราะหหาปรมาณซลเฟต (Fan et al., 2011: 1797-1803)

นาตวอยางทตองการวเคราะหมาละลายนากลนและเจอจางใหมความเขมขนท เหมาะสม (มปรมาณซลเฟตในชวง 0-0.5 มลลกรมตอมลลลตร) ปรมาตร 0.25 มลลลตร ใสในหลอดทดลอง หลงจากนนเตมนากลนปรมาตร 1 มลลลตร, gelatin-barium chloride solution

(ประกอบดวย 5% (w/v) barium chloride (BaCl2), 5% (w/v) gelatine ) ปรมาตร 625 ไมโครลตรและ 8% (w/v) trichloroacetic acid (C2HCl3O2) ปรมาตร 350 ไมโครลตร) แลวเขยาเปนเวลา 1 นาท ทงไว 30 นาทเพอใหเกดปฏกรยาอยางสมบรณ นาสารละลายทไดไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 360 นาโนเมตร แลวนาไปเทยบกบกราฟมาตรฐานทเตรยมจาก potassium sulphate

(K2SO4) ทมความเขมขน 0 – 0.5 มลลกรมตอมลลลตร เพอวเคราะหปรมาณซลเฟอรในสารตวอยาง แลวนามาคานวณหาคา DS (degree of substitution) จากสมการ

DS =

198[S] = (3200-102[S])

37

5.6 การวเคราะหขนาดโมเลกลดวย 12% polyacrylamide gel (PAGE)

เรมตนขนตอนโดยการประกอบชดสาหรบเตรยมเจล แลวทาการเตรยมเจลสวนลาง

(separating gel) เปน polyacrylamide gel 12% มสวนประกอบดงน 40% acrylamide ปรมาตร 2.99

มลลลตร, 2% (w/v) bisacrylamide ปรมาตร 3.15 มลลลตร, 1.5 M Tris - hydrochloric acid pH 8.8

ปรมาตร 2.62 มลลลตร, นากลนปรมาตร 1.62 มลลลตร, 10% (w/v) ammonium persulphate

ปรมาตร 105 ไมโครลตร และ TEMED ปรมาตร 10.5 ไมโครลตร แลวปดทบดวย 95% ethanol ตงทงไว 30 นาทเพอใหเกดการแขงตวของเจล หลงจากนนเตรยมเจลสวนบน (stacking gel) เปน polyacrylamide gel 5% มสวนประกอบดงน 40% acrylamide ปรมาตร 477 ไมโครลตร, 2%

bisacrylamide ปรมาตร 503ไมโครลตร, 1.5 M Tris - hydrochloric acid pH 6.8 ปรมาตร 2.62

มลลลตร, นากลนปรมาตร 2.84 มลลลตร, 10% (w/v) ammonium persulphate ปรมาตร 52

ไมโครลตร และ TEMED ปรมาตร 10.5 ไมโครลตร เทสวนของเจลดานบนลงไปแทนทสวนของ ethanol ตงทงไว 30 นาทเพอใหเกดการแขงตวของเจล หลงจากนนนาสารละลายตวอยางผสมกบ loading dry แลวใสในแตละชองเจลสวนบน ทาอเลกโทรโฟรซสในบฟเฟอร TBE (1X) ท 100

โวลต นาน 3 ชวโมง จนกระทงสของ loading dry เคลอนทไปจนสดขอบลาง ปดกระแสไฟฟา แลวนาเจลไปยอมส alcian blue เปนเวลา 20 นาท แลวนาไปแชในลางในสารละลาย 2% (v/v) acetic

acid จนกระทงเจลใสและเหนแถบแบนสารตวอยาง สดทายนาไปแชในนากลน เพอนาไปวเคราะหหาขนาดโมเลกล

5.7 การทดสอบ Activated partial thromboplastic time (APTT)

เตรยมสารละลายทดสอบใหมความเขมขนเปน 20, 40, 60, 80 และ 100 ไมโครกรมตอ

มลลลตร ดดสารละลายทดสอบปรมาตร 50 ไมโครลตรผสมกบ citrated normal plasma 50

ไมโครลตร นาไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 นาท หลงจากนนเตม APTT reagent

ปรมาตร 50 ไมโครลตร ผสมใหเขากน และบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 นาท แลวเตม 0.025 M calcium chloride (CaCl2) ปรมาตร 50 ไมโครลตร และผสมใหเขากน นาไปใสในเครอง coagulation analyzer เพอบนทกเวลาทใชในการแขงตวของเลอด

5.8 การทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยงและเซลลมะเรง สาหรบการทดสอบเซลลเพาะเลยง เรมจากการเลยงเซลล L929 ในอาหาร Dulbecco’ s

Modified Eagle's Medium (DMEM) ทม 10% fetal bovine serum บมเลยงในตบมคารบอนไดออกไซด 5% ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง นาเซลลออกจากภาชนะ

38

เพาะเลยงดวยวธ trypsinization และนบจานวนเซลลโดยใช hemacytometer เจอจางเซลลดวยอาหารเลยงเซลลใหมความหนาแนน 1x105 เซลลตอมลลลตร บมเลยงเซลลตอใน 96 well plate

โดยใหมปรมาตรหลมละ 100 ไมโครลตร บมเลยงในตบมคารบอนไดออกไซด 5% ทอณหภม 37

องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง จากนนเปลยนไปเลยงในอาหารทมสารทดสอบปรมาตรหลมละ 10 ไมโครลตร โดยใหมความเขมขนเปน 31.25, 62.5, 125, 250, 500 และ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร สาหรบในหลมควบคมใหมความเขมขนของ DMSO 100% และหลมทไมมการเตมสาร นาไปบมเลยงในตบมคารบอนไดออกไซด 5% ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง ดดสวนของอาหารเกาทง แลวเตมอาหารทม MTT ความเขมขนเปน 0.5 มลลกรมตอมลลลตรปรมาตรหลมละ 100 ไมโครลตร บมในตบมตออก 4 ชวโมง ดดสวนของอาหารทง แลวเตม DMSO

100 ไมโครลตรเพอละลายตะกอน fromazan ทเกดขน หลงจากนนนาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร

5.9 การทดสอบความเปนพษตอเมดเลอดขาว (PBMC)

ทาการแยกเซลลเมดเลอดขาวจากผบรจาคสขภาพด โดยการเจาะเลอดจากหลอดเลอด

ดาลงในหลอด centrifuge tube ทผสมสารชะลอการแขงตวของเลอด ใชปเปตดดเลอดขนมา 10

มลลลตร คอยๆ ปลอยเลอดลงบน Ficoll-hypaque ปรมาตร 10 มลลลตร ทเตรยมไวใน centrifuge

tube ขนาด 50 มลลลตร อยางชาๆ จากนนนาไปปนทอณหภมหอง ความเรวรอบ 2500 รอบตอนาท เปนเวลา 30 นาท หลงจากการปนแยกจะทาใหสารในหลอดแยกออกมาเปนชน คอสวนสแดงดานลางซงจะประกอบดวยเมดเลอดแดง ถดขนมาเปนสวนของ Ficoll-hypaque ซงตอกบชนบางๆสขาวทประกอบดวย PBMC (peripheral blood mononuclear cell) และสวนนาใสดานบนสดเปนสวนของพลาสมา สวนของ PBMC จะถกเกบโดยใช pasture pipette จากนนเซลล PBMC จะถกลางดวยอาหาร PPMI 1640 เพอลางสวนของโปรตนและ Ficoll-hypaque ทปนเปอน แลวเตมอาหาร PPMI

1640 ลงไป 5 มลลลตร นาไปยอมดวยส trypan blue เพอนบจานวนเซลลทมชวต และคานวณจานวนเซลลทมชวตโดยใช hematocytometer จากนนปรบเซลลใหมความเขมขนเปน 3 x 105 เซลลตอมลลลตร บมเลยงเซลลตอใน 96 well plate โดยใหมปรมาตรหลมละ 50 ไมโครลตร แลวเตมอาหารทมสารทดสอบปรมาตรหลมละ 50 ไมโครลตร โดยใหมความเขมขนเปน 62.5, 125 และ 250

ไมโครกรมตอมลลลตร สาหรบในหลมควบคมใหมความเขมขนของ DMSO 20% (v/v) และหลมทไมมการเตมสารนาไปบมเลยงในตบมคารบอนไดออกไซด 5% ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง แลวเตมอาหารทม MTT ความเขมขนเปน 1 มลลกรมตอมลลลตรปรมาตรหลมละ

39

50 ไมโครลตร บมเลยงในตบมตออก 4 ชวโมง แลวเตม SDS-DMF 50 ไมโครลตรเพอละลายตะกอน fromazan ทเกดขน หลงจากนนนาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร

5.10 การทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ เลยงเซลล RAW 264.7 (Mouse leukaemic monocyte macrophage) ในอาหาร

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ทม 10% fetal bovine serum บมเลยงในตบมคารบอนไดออกไซด 5% ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง นาเซลลออกจากภาชนะเพาะเลยงดวยการเตม Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) แลวนาไปบมทอณหภม 37

องศาเซลเซยส ม 5% CO2 นาน 10 นาท เพอใหเซลลหลดงาย ทาการขดเซลลดวย cell scrapers นาสารละลายเซลลทไดไปทาการปนตกตะกอนเซลล นาตะกอนเซลลทไดไปละลายในอาหารเลยงเซลลและนบจานวนเซลลโดยใช hemacytometer เจอจางเซลลดวยอาหารเลยงเซลลใหมความหนาแนน 3x105 เซลลตอมลลลตร บมเลยงเซลลตอใน 96 well plate โดยใหมปรมาตรหลมละ 100

ไมโครลตร บมเลยงในตบมคารบอนไดออกไซด 5% ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24

ชวโมง หลงจากนนดดสวนของอาหารเกาทงและเปลยนไปเลยงในอาหาร (ไมม phenol red ) ทมสารทดสอบ ปรมาตรหลมละ 100 ไมโครลตร โดยใหมความเขมขนเปน 125, 250, 500 ไมโครกรมตอมลลลตร สาหรบในหลมควบคมใหมความเขมขนของ lipopolysaccharide (LPS) 1 ไมโครกรมตอมลลลตรและหลมทไมมการเตมสาร นาไปบมเลยงในตบมคารบอนไดออกไซด 5% ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง เมอครบเวลาดดสวนของอาหารทอยในแตละหลม ไปใสลงใน 96 well plate อนใหม หลงจากนนเตม Griess’s reagent (NED, Sulfanilamide, O-Phosphoric

acid) นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร แลวนาไปเทยบกบกราฟมาตรฐานทเตรยมจาก Sodium nitrite (NaNO2) เพอวเคราะหหาปรมาณ Nitrite (NO2

-) นาเซลลสวนทเหลอไปทดสอบความเปนพษเชนเดยวกบขอ 5.8

40

บทท 4

ผลการวเคราะหขอมลและอภปลายผล

1. การปรบขนาดโมเลกลอลจเนต

การปรบขนาดโมเลกลอลจเนตดวยกระบวนการทางเคม โดยการใช 2 สภาวะทม

ความแตกตางกน ไดแกปฏกรยาไฮโดรไลซส (0.3 M HCl ทอณหภม 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2

ชวโมง) และปฏกรยาออกซเดชน (3.0% (v/v) H2O2 ทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2

ชวโมง) จากนนทาการตกตะกอนดวย ethanol นาตะกอนทไดไปละลายนาอกครงเพอทาการทดสอบขนาดโมเลกลโดยใช PAGE และปรมาณตะกอนทเกดขนพบวาไดผลเปนดงตารางท 4

ตารางท 4 ปฏกรยาทใชในปรบขนาดโมเลกลอลจเนต

% yield = นาหนกสารทไดรบจากการปรบขนาด/นาหนกสารเรมตน

เมอใหเวลาในการเกดปฏกรยาทเทากน พบวาอลจเนตทผานการปรบขนาดดวยปฏกรยาไฮโดรไลซส ขนาดของโมเลกลมขนาดใหญและมปรมาณตะกอนเปนจานวนมากเมอเปรยบเทยบกบปฏกรยาออกซเดชน อาจเนองมาจากปฏกรยาออกซเดชนมความสามารถในการทาลายพนธะไกลโคซดกทเชอมระหวางโมเลกลของนาตาลทเปนองคประกอบไดรนแรงและมประสทธภาพมากกวาปฏกรยาไฮโดรไลซส เปนผลใหโมเลกลของนาตาลมขนาดทสนลง ยงถาใหปฏกรยาเกดมากขนโอกาสทสายอลจเนตจะถกออกซไดสจนกลายเปนนาตาลโมเลกลเดยวหรอนาตาลโมเลกลคกสงขน ซงนาตาลกลมนจะไมเกดการตกตะกอนดวย ethanol เปนสาเหตใหปรมาณตะกอนทไดนอยลง

ปฏกรยาเคม ขนาดโมเลกล( kDa) % yield

ไฮโดรไลซส

(0.3 M HCl, 100 องศาเซลเซยส, 2 ชวโมง)

< 27 52.55±0.04

ออกซเดชน

(3.0 %(v/v) H2O2, 50 องศาเซลเซยส, 2 ชวโมง)

< 20 36.92±0.03

41

กระบวนการปรบขนาดโมเลกลของอลจเนต พบวาทเวลา 2 ชวโมง โมเลกลของ อลจเนตทผานปฏกรยาไฮโดรไลซสและปฏกรยาออกซเดชน มขนาดโมเลกลตากวา 27 kDa และ 20 kDa จากขนาดเรมตนประมาณ 200 kDa พบวาทงสองปฏกรยาเหมาะสมในการปรบขนาดโมเลกล เนองจากมขนาดโมเลกลอยในชวง 8 – 30 kDa ซงเปนขนาดทเหมาะสมในการทจะนาไปใชในการเตมหมซลเฟต สาหรบทงสองกระบวนการทใชในการปรบขนาดโมเลกลเปนไปแบบสมไมมความจาเพาะในตาแหนงตดพนธะ แตรปแบบการจดเรยงตวของ M และ G เปนปจจยทมความสาคญ พบวาบรเวณทมการเรยงตวเปนแบบ M-M มโอกาสถกทาลายพนธะไดงายกวาบรเวณทมการจดเรยงตวเปนแบบ M-G และ G-G ตามลาดบ (Aida et al., 2010: 296-302) เนองจากภายในโมเลกลของ G-G สามารถเกดการสรางพนธะไฮโดรเจนระหวางหมคารบอกซลกบหม ไฮดรอกซลของคารบอนตาแหนงท 2 พนธะไฮโดรเจนบรเวณดงกลาวเปนพนธะทมความแขงแรง และนอกจากนพนธะไกลโคซดกทเชอมระหวาง G-G เปนแบบ diaxial link position สงผลใหโครงสรางของ G-G เปนโครงสรางทแขงแรงและเสถยรมากกวา (Atkins, and Nieduszynski, 1973:

1879-1887) M-M ในโครงสรางมการสรางพนธะไฮโดรเจนไดเชนเดยวกบ G-G แตเกดคนละตาแหนง สาหรบโมเลกลของ M-M มการสรางพนธะไฮโดรเจนระหวางหมไฮดรอกซลของคารบอนตาแหนงท 2 หรอ 3 กบอะตอมออกซเจนภายในวงนาตาล ในขณะทพนธะ ไกลโคซดกทเชอมเปนแบบ diequatorial link position สงผลใหโมเลกลของ M-M เกดการทาลายพนธะไดงาย (Atkins, and Nieduszynski, 1973: 1865-1878)

เมอวเคราะหหมฟงชนกทเปนองคประกอบของอลจเนตทผานการปรบขนาดโมเลกลดวยปฏกรยาไฮโดรไลซสกบของอลจเนตตงตนดวยเครอง FT-IR ไมมความแตกตางกนในขณะทปฏกรยาออกซเดชนพบพคทตาแหนง 1713 cm- เปนพคของหม คารบอกซล (ภาพท 17) เกดจากการปรบขนาดของโมเลกลอลจเจตโดยปฏกรยาออกซเดชนสงผลใหเกดการตดพนธะไกลโคซดกทเชอมระหวางโมเลกลของอลจเนตภายในสายพอลแซกคาไรด นอกจากนยงมการปรบโครงสรางของนาตาลทปลายสาย เกดจากการทโมเลกลของ hydrogen peroxide แตกตวเปนหมไฮดรอกซลอสระสรางพนธะกบคารบอนตาแหนงท 1 (C-1) ในโมเลกลนาตาลปลายสาย เกดการเปดวงของนาตาลไดเปนหมแอลดไฮด โดยสวนใหญหมแอลดไฮดจะเกดปฏกรยาออกซเดชนตอไปเปนหม คารบอกซลสงผลตอคณสมบตของนาตาลจากทเปนนาตาลรดวซเปลยนเปนนาตาลนอนรดวซ (non-reducing sugar) (Yang, Li and Guan, 2004: 115-121)

42

ภาพท 17 การวเคราะหโครงสรางดวยเครอง FT-IR สาหรบอลจเนตเรมตน (A), โมเลกลของ อลจเนตทผานการปรบขนาดดวยปฏกรยาไฮโดรไลซส (HA) และออกซเดชน (OA)

A OA HA

1713

43

2. การแยกโมเลกล polymannuronic acid (PM) และ polyguluronic acid (PG)

โมเลกลของอลจเนตมนาตาล guluronic acid (G) และ mannuronic acid (M) เปน

องคประกอบ นาตาลทง 2 ชนดนมโครงสรางและลาดบการเรยงตวทแตกตางกน สามารถทาการแยกชนดของนาตาลทง 2 ชนดไดดวยการตกตะกอนท pH 2.85 ทสภาวะดงกลาวนาตาลทง 2 ชนดละลายไดแตกตางกน เนองจากคา pKa ของ G และ M เปน 3.65 และ 3.38 ตามลาดบ (Zhao et al.,

2007: 272-279) ทสภาวะนโครงสรางทมลกษณะเปน polyguluronic acid (PG) ไมสามารถละลายไดจงเกดการตกตะกอนแยกชนออกมา สวน polymannuronic acid (PM) สามารถละลายไดในสภาวะดงกลาว แตจะเกดการตกตะกอนท pH 1 หลงจากนนนามาวเคราะหปรมาณตะกอน, ขนาดโมเลกล และโครงสรางดงทแสดงในตารางท 5

ตารางท 5 การแยกโมเลกล polymannuronic acid (PM) และ polyguluronic acid (PG)

% yield = นาหนกสารทไดรบจากการแยกโมเลกล/นาหนกสารเรมตน

ผลการวเคราะหพบวา %yield และขนาดโมเลกลของ PG สงกวา PM ทงนอาจเนองจาก M block จะมโอกาสถกทาลายพนธะไกลโคซดกไดงายกวาบรเวณ G block สงผลใหถกทาลายกลายเปนนาตาลโมเลกลเดยวหรอโมเลกลค ซงไมเกดการตกตะกอน และเมอนา PG และ PM

ทแยกไดไปวเคราะหหมฟงกชนดวย FT-IR ดงภาพท 18 พบพคสวนใหญมลกษณะทคลายกนไดแก พคท 3421, 1608 และ 1414 cm- พคของหม OH (stretching), COO- (asymmetric) และ COO- (symmetric) ตามลาดบ สาหรบ PG พบพคท 947, 903 และ 780 cm- แตในสวนของ PM พบพคท 888 และ 820 cm-1 โครงสรางของ PG และ PM ไดถกอธบายไวในหลายรายงานการวจย

Chandia, Matsuhiro, and Vasquez (2001: 81-87) พบพคโครงสรางของ PG บรเวณตาแหนง 947, 903 และ 780 cm- เปนพคของ α-1-4 linkage , α-L-gulupyranuronic acid และ guluronic acid ตามลาดบ สาหรบ PM พบพคบรเวณประมาณ 893 และ 822 cm-1 เปนพค β-mannuronic acid และ mannopyranuronic acid ตามลาดบ

พอลแซกคาไรด ขนาดโมเลกล (kDa) % yield

PG < 27 22.65±0.01

PM < 20 15.53±0.02

44

Leal et al (2008: 308-316) พบพคโครงสรางของ PG บรเวณ 903, 812 และ 781 cm- เปนพค α-L-guluronic acid ตามลาดบ สวนของ PM พบพคบรเวณ 888, 820 cm-1 เปนพค β-mannuronic acid และ mannuronic acid ตามลาดบ

Chandia et al (2004: 127-133) พบพคทแสดงลกษณะของ PG บรเวณ 947.4, 903.6,

809.9 และ 781.0 cm-1 สวนของ PM พบพคบรเวณ 889 และ 822 cm- เปนพค β-mannuronic acid

และ mannuronic acid ตามลาดบ

จากขอมลสามารถอธบายไดวา พคบรเวณประมาณ 947, 904, 812 และ 781 cm-1 เปนพคทแสดงลกษณะของ PG และสาหรบ PM มกพบพคบรเวณประมาณ 888 และ 820 cm -1 ซงแสดงลกษณะของ PM ซงมความสอดคลองกบโครงสรางของ PG และ PM ทแยกได

ภาพท 18 การวเคราะหโครงสรางดวยเครอง FT-IR สาหรบ PM และ PG

903

7807888820

A PM PG

45

3. กระบวนการเตมหมซลเฟต

DS (degree of substitution) เปนปจจยทมความสาคญตอคณสมบตการออกฤทธทาง ชวภาพ ดงนนจงมการเตมหมซลเฟตในโมเลกลของอลจเนตและอนพนธของอลจเนตอนไดแก hydrolyzed alginate (HA), oxidized alginate (OA), PM และ PG สาหรบขนตอนการเตมหมซลเฟตใช sulfating reagent ทเตรยมจาก formamide (CH3NO) กบ chlorosulfonic acid (ClSO3H) ไดผลการทดสอบเปนดงในตารางท 6 และตารางท 7

ตารางท 6 การศกษาอทธผลของกระบวนการเตมหมซลเฟตตอ % yield และขนาดโมเลกล

% yield = นาหนกสารทไดรบจากการเตมหมซลเฟต/นาหนกสารเรมตน

พอลแซกคาไรด/พอลแซกคาไรดซลเฟต % yield

ขนาดโมเลกล

( kDa)

alginate (A) 100.00±0.07 > 90

alginate sulfate (AS) 54.63±0.08 > 90

hydrolyzed alginate (HA) 52.53±0.08 < 10

hydrolyzed alginate sulfate (HAS) 13.86±0.10 < 30

oxidized alginate (OA) 36.89±0.09 < 10

oxidized alginate sulfate (OAS) 2.56±0.09 < 30

polyguluronate (PG) 22.67±0.11 < 20

polyguluronate sulfate (PGS) 10.13±0.06 < 30

polymanuronate (PM) 15.53±0.11 < 5

polymanuronate sulfate (PMS) 2.63±0.08 < 25

46

จากผลในตารางท 6 พบวาพอลแซกคาไรดซลเฟต อนไดแก AS, HAS, OAS, PGS และ PMS มปรมาณตะกอนสารทลดลงจากสารเรมตน หลงจากการเตมหมซลเฟต AS มปรมาณเทากบ

54.63% และสวนของ HAS, OAS, PGS และ PMS มปรมาณ 13.86, 2.56, 10.13 และ 2.63%

ตามลาดบ สาหรบกระบวนการเตมหมซลเฟตมสภาวะเปนกรด สงผลใหมการทาลายพนธะ ไกลโคซดกทเชอมระหวางโมเลกลของพอลแซกคาไรด จนกลายเปนนาตาลโมเลกลสายสนและถกกาจดออกในขนตอนการไดอะไลซสหรอไมสามารถตกตะกอนกลบมาได (Li et al., 2013: 281-286) สาหรบอตราการทาลายพนธะไกลโคซดก พบวา PM จะมโอกาสถกทาลายพนธะไกลโคซดกไดงายกวาบรเวณ PG เมอทาการเปรยบเทยบกนระหวาง AS, HAS และ OAS พบวา AS มปรมาณการถกทาลายพนธะทนอยกวา HAS และ OAS เนองมาจากขนาดโมเลกลเรมตนของ AS มขนาดโมเลกลทใหญกวาใน HAS และ OAS ดงนนโอกาสทจะถกทาใหมขนาดเลกจงนอยกวา สาหรบสวนของ PGS เกดการทาลายพนธะทนอยกวา PMS เนองจากพนธะภายในโมเลกล PG มความแขงแรงกวา PM แตในขนาดเดยวกนพบวาขนาดโมเลกลของพอลแซกคาไรดซลเฟตมขนาดทใหญขนเมอเทยบกบขนาดของโมเลกลสารเรมตน เชน HA และ HAS มขนาดโมเลกลเลกกวา 10 และ 30

kDa ตามลาดบ และมแนวโนมแบบเดยวกนใน OAS, PGS และ PMS เนองมาจากในกระบวนการเตมหมซลเฟตมการแทนทของหมซลเฟตเขาไปในโมเลกลนาตาลสงผลใหโมเลกลมขนาดใหญขน หรออาจเกดจากการทนาตาลโมเลกลสนถกกาจดในขนตอนไดอะไลซส (Li et al., 2013: 281-286) เมอนาพอลแซกคาไรดซลเฟตไปวเคราะหปรมาณซลเฟตดวยวธ barium sulfate nephelometry

ไดผลดงทแสดงไวในตารางท 7

47

ตารางท 7 การศกษาปรมาณหมซลเฟอรในโมเลกลอลจเนตและอนพนธอลจเนตซลเฟต

% sulful content คานวณไดจากการเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐาน

DS =

พอลแซกคาไรดพอลแซกคาไรด/ซลเฟต

% sulfur content DS

alginate (A) 0.58±0.08 0.04±0.01

alginate sulfate (AS) 11.43±0.03 1.11±0.01

hydrolyzed alginate (HA) 0.98±0.07 0.07±0.01

hydrolyzed alginate sulfate (HAS) 7.75±0.10 0.64±0.03

oxidized alginate (OA) 0.54±0.12 0.04±0.01

oxidized alginate sulfate (OAS) 5.09±0.08 0.38±0.01

polyguluronate (PG) 0.50±0.08 0.04±0.01

polyguluronate sulfate (PGS) 8.16±0.03 0.68±0.01

polymanuronate (PM) 0.59±0.05 0.04±0.01

polymanuronate sulfate (PMS) 6.67±0.11 0.52±0.01

198[S] (3200-102[S])

48

พบวาในสวนของสารตงตน (A, HA, OA, PG และ PM) ไมพบการแทนทของหม ซลเฟต พบการแทนทของหมซลเฟตในพอลแซกคาไรดซลเฟตและเมอนามาวเคราะหดวย FT-IR

พบพคทประมาณ 1250 และ 840 cm- เปนพคของ S=O (stretching) และ C-O-S (stretching)

ตามลาดบ พคดงกลาวไมพบในโมเลกลของสารตงตนดงแสดงในภาพท 19 มรายงานเกยวกบตาแหนงการแทนทของหมซลเฟตในโมเลกลอลจเนตและอนพนธ พบวาอาจจะมการแทนทของหมซลเฟตเขาทหมไฮดรอกซลของคารบอนตาแหนงท 2 (C-2) และ 3 (C-3) กระบวนแทนทของหมซลเฟตเปนไปแบบสม ( Fan et al., 2011: 1797-1803) เมอทาการเปรยบเทยบคา DS ระหวาง PGS

และ PMS พบวา PGS มคา DS เปน 0.68 สงกวาในสวนของ PMS ทมคา DS เปน 0.52 ทงนอาจเนองดวยโมเลกลของ PGS โอกาสในการเขาแทนทของหมซลเฟตมกพบไดทงในคารบอนตาแหนงท 2 (C-2) และ 3 (C-3) ( Zhao et al., 2007: 272-279) แตสาหรบในสวนของ PMS พบวาสวนใหญการแทนทของหมซลเฟตจะเกดในตาแหนงคารบอนท 3 (C-3) เพราะคารบอนตาแหนงท 2

(C-2) มกเกดการสรางพนธะไฮโดรเจน สงผลใหหมซลเฟตไมสามารถเขาไปแทนทในคารบอนตาแหนงท 2 (C-2) ได (Li et al., 2013: 281-286) และนอกจากนพบวาคารบอนตาแหนงท 1 (C-1)

บรเวณปลายสายมโอกาสเกดการแทนทของหมซลเฟต (Arlov, 2012: 49-52) สาหรบ AS, HA

และ OA ภายในโมเลกลมการจดเรยงตวของ M และ G เปนไดทงแบบ M-M, G-G และ M-G

กระบวนการเตมหมซลเฟตมสภาวะทเปนกรดสงผลใหเกดกระบวนการไฮโดรไลซสในการทาลายพนธะไกลโคซดก ซงโอกาสในการทาลายพนธะมกเกดไดงายในบรเวณ M-M, M-G และ G-G

ตามลาดบ ดงนนภายในโมเลกลของ AS, HAS และ OAS จงมกมการเรยงตวทเปน G-G, M-G และ M-M ตามลาดบ สาหรบในกระบวนการเตมหมซลเฟต PG มโอกาสในการเตมหมซลเฟตไดมากกวา PM ในสวนของ PMG พบวากระบวนการเตมหมซลเฟตมกเกดขนในโมเลกล G (Arlov.,

2012: 49-52) และนอกจากนพบวาโมเลกลขนาดใหญมปรมาณของหมไฮดรอกซลทสงและสามารถถกแทนทดวยหมซลเฟตไดมากขน (Alban, Schauerte, and Franz, 2002: 267-276) DS ทวเคราะหได พบวา AS มคา DS เทากบ 1.11 และมคาสงกวา HAS และ OAS มคาเทากบ 0.61 และ 0.38 ตามลาดบ จะเหนไดวา OAS มคา DS ตา อาจเนองดวยในกระบวนการออกซเดชนของ อลจเนตมสภาวะทรนแรง และรวดเรวกวากระบวนการไฮโดรไลซส ดงนนโมเลกลทไดจงมขนาดเลกโอกาสในการเขาแทนของหมซลเฟตจงนอย และนอกจากนพบวาคารบอนตาแหนงท 1 (C-1)

บรเวณปลายสายมการเปลยนแปลงจากหมไฮดรอกซลเปนหมคารบอกซล ซงไมสามารถเกดการแทนทของหมซลเฟตได ( Yang et al., 2005: 9-15) มการรายงานวจยเกยวกบการเตมหมซลเฟตในอลจเนตพบวา

49

Arlov (2012: 1-84) ทาการสงเคราะห polymanuronate sulfate (PMS) โดยการใช sulfating reagent ทเตรยมจาก formamide (CH3NO) กบ chlorosulfonic acid (ClSO3H) อณหภม 60

องศาเซลเซยส เปนเวลา 4 ชวโมง พบวา PMS ทสงเคราะหไดมปรมาณการแทนทของหมซลเฟต (DS) เทากบ 0.87

Arlov et al (2014: 2744-2750) ทาการการสงเคราะห polymanuronate sulfate (PMS)

และ polyguluronate sulfate (PGS) โดยการใช sulfating reagent ทเตรยมจาก formamide (CH3NO)

กบ chlorosulfonic acid (ClSO3H) อณหภม 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2.5 ชวโมงพบวา PMS และ PGS ทสงเคราะหไดมปรมาณการแทนทของหมซลเฟต (DS) เทากบ 0.89 และ 0.1 ตามลาดบ

เมอทาการเปรยบเทยบขอมลการสงเคราะหอลจเนตซลเฟตทมสภาวะคลายกน พบวาอลจเนตซลเฟตทสงเคราะหไดมปรมาณการแทนทของหมซลเฟตทตากวาทมรายงาน สาเหตทมผลตอคา DS มหลายปจจย เชน อตราสวนระหวางสารทใชเปน sulfating reagent , ขนาดโมเลกลและปรมาณนาตาลองคประกอบของสารตงตน และสภาวะทใชในการสงเคราะห เปนตน

50

ภาพท 19 โครงสรางทวเคราะหดวยเครอง FT-IR ของ alginate sulfate (AS), hydrolyzed alginate

sulfate (HAS), oxidized alginate sulfate (OAS) , polyguluronate sulfate (PGS) และ

polymanuronate sulfate (PMS)

1250

840

1243

840

826

1251 1257

895

1258

51

4. ผลการทดสอบคณสมบตการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด

APTT (Activated Partial Thromboplastin Time) เปนวธสาหรบการทดสอบคณสมบตการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด ทดสอบในสวนของ intrinsic และ common pathways ของกลไกการแขงตวของเลอด จากรายงานพบวา DS และ ขนาดโมเลกลเปนปจจยสาคญสาหรบการแสดงคณสมบตการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด และเมอทาการทดสอบคณสมบตของ

อลจเนตและอนพนธของอลจเนตซลเฟตไดผลดงตารางท 8

ผลการทดลองในตารางท 8 จากการนาอลจเนตซลเฟต (AS) และอนพนธ (HAS, OAS,

PGS, PMS) ไปทดสอบ APTT พบวาสารผลตภณฑทเตรยมไดมคณสมบตเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด แตประสทธภาพตากวา heparin (5 ไมโครกรมตอมลลลตร APTT เทากบ 174.3 วนาท) คาปกต APTT เทากบ 26-34 วนาท โดย AS ท 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ใหคา APTT เทากบ 340.90 วนาท (คดเปน 10.02X ของคาปกต) สาหรบ HAS, OAS, PGS และ PMS ท 100

ไมโครกรมตอมลลลตร จะใหคา APTT เทากบ 239.77, 161.33, 307.20 และ 184.50 ตามลาดบ (คดเปน 7.05X, 4.74X, 9.03X และ 5.42X ของคาปกต) ในสวนของ A, HA, OA, PG และ PM พบวาคา APTT มคาอยในชวง APTT ปกต แสดงวาสารดงกลาวไมมคณสมบตเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด ความเขมขนของสารมความสมพนธกบคา APTT แบบแปรผนตรง จากคา anticoagulant

activities ทวดได (APTT) มความสอดคลองสมพนธกบปรมาณซลเฟตทเปนองคประกอบของโมเลกลอลจเนต หรอ DS ซงเปนคาการแทนทของหมซลเฟตตอโมเลกลนาตาล จากตารางท 8

พบวาผลตภณฑอลจเนตซลเฟตทมคา DS สงขน ความสามารถในการชะลอการแขงตวของเลอดมคาเพมขน ในขณะท A, HA, OA, PG และ PM ในโมเลกลไมพบหมซลเฟต หลงการตรวจสอบพบวาไมมความสามารถในการชะลอการแขงตวของเลอด สาหรบโมเลกลของเฮพารนและอลจเนตซลเฟตมคาประจเฉลยของโมเลกลเปนลบสง อนเนองมาจากประจลบของหมซลเฟต เมอ DS มคาสงขนจะมความหนาแนนของประจลบเพมขน ซงจะไปยบยงการทางาน factor IIa และ Xaในระบบ intrinsic pathway (Tiozzo et al., 1993: 99–106) ตาแหนงของการเขาแทนทของหมซลเฟตเปนอกหนงปจจยทมความสาคญ มรายงานเกยวกบการแทนทของหมซลเฟตบรเวณคารบอนตาแหนงท 2 (C-2) และ 3 (C-3) ของโครงสรางทมลกษณะพนธะเปน α–linkages ของ galactan ทมลกษณะคลายกบอลจเนต โครงสรางทมลกษณะดงกลาวมความสามารถในการจบกนอยางจาเพาะกบ plasma proteinases (Mestechkina and Shcherbukhin, 2010: 267-273) สงผลตอกจกรรมการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด

52

ตารางท 8 การทดสอบคณสมบตการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดโดยอลจเนตซลเฟตและ

อนพนธ

*nomal APTT เปน 26-34 s

Polysaccharide

sulfate

% sulfur content DS Concentration

(μg/ml)

APTT

(sec)

AS

11.43

1.11

20 60.73±0.21

40 100.73±0.21

60 151.53±0.68

80 289.37±0.58

100 338.83±0.91

HAS

7.52

0.61

20 51.90±0.60

40 84.57±0.30

60 132.87±0.81

80 195.53±0.60

100 239.77±0.93

OAS

5.09

0.38

20 50.17±0.31

40 65.83±0.40

60 85.20±0.62

80 110.87±1.05

100 160.67±0.67

PGS

8.16

0.68

20 63.27±0.38

40 112.50±0.70

60 136.37±0.38

80 265.83±0.85

100 307.20±1.00

PMS

6.67

0.52

20 55.53±0.50

40 95.67±0.86

60 120.00±1.00

80 165.23±0.90

100 184.83±0.57

53

ภาพท 20 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารกบผลการทดสอบ APTT

ผลทไดจากการทดสอบ APTT ของ PGS และ PMS ซง PGS มคา APTT ทสงกวา PMS

อาจมสาเหตมาจากโครงสรางของ PGS มลกษณะเปน α – linkages และมการเขาแทนทของหมซลเฟตในตาแหนงคารบอนท 2 (C-2) และ 3 (C-3) แต PMS มลกษณะเปน β – linkages และมกมการเขาแทนทของหมซลเฟตในตาแหนงคารบอนท 3 (C-3) นอกจากปรมาณการแทนทของหมซลเฟตและตาแหนงการแทนท ขนาดโมเลกลเปนอกหนงปจจยทสงผลตอคณสมบตการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด มการรายงานเกยวกบความสมพนธระหวางขนาดโมเลกลกบกระบวนการแขงตวของเลอด ในกรณของ galactan sulfated มการปรบขนาดโมเลกลใหมขนาดประมาณ 15-45 kDa พบวาสามารถเขาจบกบ antithrombin ได แตโมเลกลนจะไมสามารถเขาจบกบ plasma inhibitor และ thrombin สงผลใหประสทธในการชะลอการแขงตวของเลอดลดนอยลง และพบวากระบวนการดงกลาวตองการขนาดโมเลกลทมขนาดมากกวา 45 kDa (Melo et al., 2004:

20824–20835) ลกษณะทคลายกนนเกดขนใน fucan sulfated ทมการปรบขนาดโมเลกลใหมขนาดประมาณ 45 เตตระแซกคาไรด สามารถเขาจบกบ heparin cofactor II (HC II) แตไมสามารถเขาจบกบ plasma inhibitor และ thrombin และเกดเปนสารประกอบ สาหรบขนาดโมเลกลทมความ

54

เหมาะสมในการเขาจบมขนาดประมาณ 100 เตตระแซกคาไรด (Pomin et al., 2005: 1376–1385) การลดขนาดโมเลกลสงผลใหกจกรรมการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดลดลงดวย และการทดสอบการปรบขนาดโมเลกลของซลเฟตพอลแซกคาไรดทมาจากสาหรายซงเรมตนมขนาด 725.4

kDa ใหมขนาดเหลอ 10.6-216.4 kDa พบวากจกรรมการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดลดลงอยางมาก (Mestechkina and Shcherbukhin., 2010: 267-273) ดงจะเหนไดจากผลการทดสอบตารางท 8 AS มขนาดโมเลกลทมขนาดใหญกวา HAS และ OAS มกจกรรมการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดทสงกวา มรายงานเกยวกบความสามารถของอลจเนตซลเฟตในการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอด ทดสอบความสามารถในการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดของ PGS ซงมคา DS 1.53 ขนาดโมเลกล 11.4 kDa และมการแทนทของหมซลเฟตบรเวณคารบอนตาแหนงท 2(C-2)

และ 3(C-3) ทดสอบคา APTT ทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตรได 200 วนาท (Zhao et

al., 2007: 272-279) สาหรบทดสอบความสามารถในการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดของ PMS มคา DS 0.87 ขนาดโมเลกล 31.4 kDa และมการแทนทของหมซลเฟตบรเวณคารบอนตาแหนงท 1(C-1), 2(C-2) และ 3(C-3) พบวาทความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร วดคา APTT ได 80 วนาท (Arlov, 2012:1-87) และการทดสอบความสามารถในการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดของ AS ทม DS เทากบ 1.87 ขนาดโมเลกลอยในชวง 14.9 – 2.46 kDa และมการแทนทของหมซลเฟตบรเวณคารบอนตาแหนงท 2(C-2) และ 3(C-3) ทความเขมขน 75 ไมโครกรมตอมลลลตร วดคา APTT ได 160 วนาท (Fan et al., 2011:1797 –1803) เมอเปรยบเทยบกบขอมลทมรายงานไว พบวาผลตภณฑอลจเนตซลเฟตทสงเคราะหไดมคา DS ทตา แตมคา APTT ทคอนขางสง อาจมาจากหลายสาเหต เนองจากกลไกทเกดขนในกระบวนการชะลอการแขงตวของเลอดยงไมทราบกลไกทแนชด อลจเนตซลเฟตและอนพนธสงเคราะหไดยงไมทราบโครงสรางและขนาดโมเลกลทแนนอน แตอาจเนองมาจากปรมาณการเขาแทนทของหมซลเฟตทตาแหนงท 2(C-2) และ 3(C-3) และขนาดโมเลกลทอยในชวงทมความเหมาะสมในการเขาจบกบโปรตน

5. การทดสอบความเปนพษตอเซลล

การทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง ไดแก L929 (Mouse connective tissue

fibroblast cells), Hela (Human cervical adenocarcinoma cell line) และ PBMC (Peripheral blood

mononuclear cell) ของอลจเนตซลเฟตและอนพนธ โดยวธ MTT assay เปนการทดสอบการทางานของไมโทคอนเดยในการรดวสสาร 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium

bromide (MTT) เซลลทมชวต มการทางานของไมโทคอนเดรยปกตสามารถผลตเอนไซม mitochondrial dehydrogenase และ cofactor เพอรดวซ MTT ใหกลายเปนผลก formazan ทมสมวง

55

ดงนนเมอนาสารละลาย MTT ไปบมในเซลลทตองการทดสอบ เซลลทไมโทคอนเดรยทางานปกตจะรดวซ MTT ใหเปน formazan สาหรบเซลลทตายแลวจะมลกษณะใสไมมส สวนเซลลทยงมชวตอยจะตดสมวง เมอเตม DMSO ลงไปละลาย formazan จะไดสารละลายสมวง นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตรดวยเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร

เมอนาสารตงตนอลจเนตและผลตภณฑทไดจากการสงเคราะหทงหมด 10 ชนด อน

ไดแก A, AS, HA, HAS, OA, OAS, PG, PGS, PM และ PMS ตามลาดบ ทดสอบความเปนพษตอเซลล L929 ทระดบความเขมขน 0 – 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร ทกความเขมขนของสารทดสอบมเปอรเซนตการรอดชวตของเซลลมากกวา 50% ทความเขมขนมากวา 31.25 ไมโครกรมตอมลลลตรของสารทดสอบทกชนด มผลทาใหเปอรเซนตการอยรอดของเซลลลดลงอยางมนยสาคญเมอเทยบกบกลมควบคม เปอรเซนตการอยรอดของเซลลแปรผกผนกบความเขมขนของสารทดสอบดงภาพท 22 และ 23 โดยทความเขมขนทสงสดคอ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร มเปอรเซนตการรอดชวตสงถง 86.56, 84.80, 83.88, 80.45, 83.77, 82.63, 85.22, 83.87, 88.83 และ 87.30% สาหรบ A, AS, HA, HAS, OA, OAS, PG, PGS, PM และ PMS ตามลาดบเมอเปรยบเทยบกบชดควบคม (negative control) ในขณะทเมอเตม DMSO เปนสารทมความเปนพษตอเซลลพบวา เปอรเซนตการรอดชวตมคาเทากบ 20% แสดงดงภาพท 21

ภาพท 21 ความสมพนธระหวางสารทดสอบทความเขมขน 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร กบเปอรเซนตการอยรอดของเซลล L929 เมอทาการเปรยบเทยบกบชดควบคม

56

ภาพท 22 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทดสอบกบเปอรเซนตการอยรอดของเซลล L929 ก) alginate (A), ข) alginate sulfate (AS), ค) hydrolyzed alginate (HA), ง)

hydrolyzed alginate sulfate (HAS), จ) oxidized alginate (OA) และ ฉ) oxidized alginate

sulfate (OAS)

ข) ก)

ค) ง)

จ) ฉ)

57

ภาพท 23 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทดสอบกบเปอรเซนตการอยรอดของเซลล L929 ก) polyguluronate (PG), ข) polyguluronate sulfate (PGS), ค) polymanuronate (PM) และ ง) polymanuronate sulfate (PMS)

ก) ข)

ค) ง)

58

การทดสอบเปอรเซนตการอยรอดของเซลล PBMC เปนเซลลเมดเลอดขาว ทาการ ทดสอบดวยสารทมความเขมขน 0, 62.5, 125 และ 250 ไมโครกรมตอมลลลตร พบวา A, HA และ OA ทความเขมขน 250 ไมโครกรมตอมลลลตร พบวาเปอรเซนตการอยรอดของเซลลแตกตางทางสถตเมอเทยบกบกลมควบคม (negative control) แสดงใหเหนวา A, HA และ OA ทความเขมขน 250 ไมโครกรมตอมลลลตรไมมความเปนพษตอเซลล แตสาหรบ AS, HAS, OAS, PG, PGS, PM

และ PMS ทความเขมขนมากกวา 125 ไมโครกรมตอมลลลตรของทกสารทดสอบ ทาใหเปอรเซนตการอยรอดของเซลลลดลงอยางมนยสาคญเมอเทยบกบกลมควบคลม อยางไรกตามเปอรเซนตการอยรอดของเซลลมคามากกวา 50% เมอเทยบกบชดควบคม เปอรเซนตการอยรอดของเซลลแปรผกผนกบความเขมขนของสารทดสอบ โดยมกราฟแสดงความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทดสอบกบเปอรเซนตการอยรอดของเซลลดงภาพท 24 และ 25

ผลการทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง L929 และเซลล PBMC พบวา เปอรเซนตการรอดชวตมแนวโนมทลดลงเมอเพมความเขมขนของสารทดสอบ ปจจยทนาจะมความสาคญตอความเปนพษตอเซลลคอ หมซลเฟตและตาแหนงการแทนทของหมซลเฟต ในกรณของ carrageenan มการแทนทของหมซลเฟตในคารบอนตาแหนงท 2, 4 และ 6 พบวา ความเปนพษตอเซลลของ carrageenan เกดจากโครงสรางทเปน double helices เขาจบกบไอออนทผวเซลล โดยผานทางหมซลเฟตและพนธะไฮโดรเจนในโครงสราง ตาแหนงของหมซลเฟตเปนอกหนงปจจยทอาจมความเปนพษตอเซลล การแทนทของหมซลเฟตในคารบอนตาแหนงท 6 เปนตาแหนงทมความเปนพษมากทสดเมอเทยบกบตาแหนงท 2 และ 4 เนองจากการแทนทของหมซลเฟตทตาแหนง 2 และ 4 ทาใหเกดการเปลยนแปลงรปแบบโครงสรางทใชในการเขาจบผวเซลล ความเปนพษตอเซลลลดนอยลง (Liang et al., 2014: 782-784) ในการแทนทของหมซลเฟตในโมเลกล อลจเนตและอนพนธมกมเขาแทนทในคารบอนตาแหนงท 2 และ 3 ซงสอดคลองกบขอมล ทกลาวไววาท 2 และ 3 มความเปนพษนอยกวาในตาแหนงท 6 สารผลตภณฑทสงเคราะหไดทกชนดพบวามเปอรเซนตการอยรอดของเซลลมากกวา 80%

59

ภาพท 24 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทดสอบกบเปอรเซนตการอยรอด ของเซลล PBMC ก) alginate (A), ข) alginate sulfate (AS), ค) hydrolyzed alginate (HA),

ง) hydrolyzed alginate sulfate (HAS), จ) oxidized alginate (OA) และ ฉ) oxidized alginate sulfate (OAS)

ก) ข)

ค) ง)

จ) ฉ)

60

ภาพท 25 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารทดสอบกบเปอรเซนตการอยรอด

ของเซลล PBMC ก) polyguluronate (PG), ข) polyguluronate sulfate (PGS), ค)

polymanuronate (PM) และ ง) polymanuronate sulfate (PMS)

ก) ข)

ค) ง)

61

6. การทดสอบความเปนพษตอเซลลมะเรง การทดสอบเปอรเซนตการอยรอดของเซลล Hela เปนเซลลมะเรงปากมดลก เมอทา

การทดสอบดวยสารทมความเขมขน 0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 และ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร เปอรเซนตการอยรอดของเซลลลดลงอยางมนยสาคญ ทความเขมขนของสารมากวา 31.25

ไมโครกรมตอมลลลตร แตเมอเทยบกบความเปนพษตอเซลลปกต พบวาความเปนพษตอเซลลมะเรงไมแตกตางจากเซลลปกตดงภาพท 26

ภาพท 26 ความสมพนธระหวางสารทดสอบทความเขมขน 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร กบเปอรเซนตการอยรอดของเซลล Hela เมอทาการเปรยบเทยบกบชดควบคม

จากรายงานวจยทผานมาพบวากลไกการยบยงการเจรญของเซลลมะเรงของซลเฟต พอลแซกคาไรดมหลายปจจยเขามาเกยวของ ไดแก ปรมาณการแทนทของหมซลเฟต, ขนาดโมเลกล, ตาแหนงการแทนท, ชนดของนาตาลทเปนองคประกอบและชนดของพนธะไกลโคซดก แตปจจยทมความสาคญมากทสดไดแก ปรมาณการแทนทของหมซลเฟต (Duart et al., 2001:

281-293) สาหรบกลไกการยบยงการเจรญของเซลลมะเรงอาจเกดจากการจบกนระหวางหมซลเฟตกบประจบวกของโปรตนบรเวณบนผวเซลล (Koyanagi et al., 2003: 173-179) มการศกษาความสามารถในการยบยงเซลลมะเรง HepG2 (human hepatocellular liver carcinoma cell line)

และ A549 (Human epithelial lung carcinoma cell line) โดยการใชซลเฟตพอลแซกคาไรดทสกดมาจาก Sargassum plagiophyllum พบวา ปรมาณซลเฟตเปนปจจยทสาคญ ซงการจบของหมซลเฟต

62

กบโมเลกลของโปรตนบนผวเซลล ทาให เ กดการเปลยนแปลงโครงสรางของซล เฟต พอลแซกคาไรด สงผลใหเกดการยบยงการเจรญของเซลลมะเรง (Suresh et al., 2013: 364-373)

และนอกจากนขนาดโมเลกลเปนอกปจจยทมความสาคญ พบวา fucoidan ทขนาดโมเลกลขนาดเลก (18.6 kDa) มความสามารถในการยบยงการเจรญของเซลล CCL39 (Bouhedja et al., 2000:

453-459) จากขอมลเบองตนจะเหนไดวามหลายปจจยทสงผลตอการยบยงการเจรญของเซลลมะเรง สาหรบซลเฟตพอลแซกคาไรดทสงเคราะหไดไมมความสามารถในการยบยงการเจรญการเจรญของเซลลมะเรง Hela อาจมสาเหตมาจากปรมาณการแทนทของหมซลเฟตทมปรมาณนอยหรอขนาดโมเลกลทไมเหมาะสมตอการเขาจบกบโปรตนบนผวเซลลล

7. การทดสอบความสามารถในการกระตนเซลลแมคโครฟาจ

สาหรบการทดสอบความสามารถในการกระตนเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 โดย

วธ Griess assay เปนการหาปรมาณของ nitric oxide (NO) ทแมคโครฟาจสรางขน มคณสมบตเปนสารสอกลางในกระบวนการอกเสบ โดยตางจากสารเคมสอกลางชนดอนตรงทมโครงสรางโมเลกลงายไมซบซอน (N=O) ไมมการเกบสะสมแตจะสรางขนเมอไดรบอนตรายและใชวธแพรไปออกฤทธทเซลลเปาหมาย NO ทถกสรางขนจะไปทาปฏก รยากบ sulfanilamide และ NED

(N- -napthylethylene diamine dihydrochloride) เปนองคประกอบทอยใน Griess reagent ไดเปน สารกลม azo dye เปนสารทใหสมวง โดยเซลลทไมถกกระตนจะไมมการสราง NO เมอทดสอบดวย Griess reagent จะใหสารละลายใสไมมส ระดบความเขมของ azo dye เปนตวบงชความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ

63

จากการทดสอบความสามารถในการกระตนเซลลแมคโครฟาจ R A W 2 6 4 . 7 ของ

อลจเนตซลเฟตและอนพนธ ใหเซลลไดสมผสกบสาร เพอทาหนาทเปนตวกระตนใหมการหลงสารสอกลางการอกเสบตางๆ รวมทง NO สาหรบการทดสอบใช LPS เปนสารกระตนการอกเสบ ทความเขมขน 1ไมโครกรมตอมลลลตร เมอวเคราะหปรมาณ NO พบวามคาเทากบ 44.17 ไมโครโมลาร ในขณะทสารผลตภณฑทงหมดทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร พบวามปรมาณ NO ทแมคโครฟาจสรางขน แตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถตเมอเทยบกบชดควบคม (negative control) ชใหเหนวาสารทดสอบสามารถกระตนเซลลแมคโครฟาจได และแปรผนตรงกบความเขมขนของสารทดสอบ ยกเวน A ทไมพบการกระตนแมคโครฟาจดงแสดงในภาพท 27 และ AS ทความเขมขน 500 ไมโครกรมตอมลลลตร เมอทาการเปรยบเทยบปรมาณ NO ของสารทดสอบทความเขมขน 500 ไมโครกรมตอมลลลตรพบวา AS, OA, OAS, HA, HAS, PG,

PGS, PM และ PMS มคา NO เปน 5.31, 20.19, 26.85, 36.61, 46.94, 39.54, 67.91, 27.67 และ 46.61

μM ตามลาดบดงภาพท 28 จากขอมลความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจทวดได (ปรมาณ NO) มความสอดคลองสมพนธกบปรมาณซลเฟตทเปนองคประกอบของโมเลกลอลจเนต หรอ DS

เปนคาการแทนทของหมซลเฟตตอโมเลกลนาตาล พบวาผลตภณฑอลจเนตซลเฟตและอนพนธ

(AS, HAS, OAS, PGS และ PMS) มความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจทสงขน เมอเทยบกบโมเลกลของสารตงตน (A, HA, OA, PG และ PM) ในโมเลกลไมมหมซลเฟต และเมอนาสารทดสอบความเปนพษตอเซลลแมคโครฟาจ พบวาไมมความเปนพษตอเซลลดงภาพท 29 กรณของอลจเนตพบวามความสามารถในการเขาจบกบประจบวกของกรดอะมโนทอยบนผวเซลล สงผลใหเกดการเปลยนแปลงโครงสรางทเหมาะสมตอการกระตนแมคโครฟาจ (Berven et al.,

2013: 30-44) สาหรบในกรณของอลจเนตซลเฟตพบวาหมซลเฟตเปนปจจยทสาคญ มรายงานอธบายเกยวกบการกาจดหมซลเฟตออกจากโมเลกลของ fucoidan พบวาความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจใหสราง NO ลดลง สาหรบกลไกในการกระตนแมคโครฟาจของหมซลเฟตยงไมแนชด อาจเนองมาจากกลไกในการกระตนแมคโครฟาจเกดโดยผานการเขาจบกนระหวางหมซลเฟตกบตวรบ ทมความจาเพาะตอกนบนผวเซลล เกดการกระตนไดหลายทาง สวนใหญมกมการกระตนผานทาง Toll – like receptor (TLR2 และ TRL4) ซง TLR receptor มบทบาททสาคญในการสงสญญาณเพอในชกนาใหเกดกระบวนการสราง cytokine (Jiang et al., 2013: 124-129)

64

ภาพท 27 ความสามารถในการกระตนเซลลแมคโครฟาจโดยการวดปรมาณ NO ทผลต จากเซลล RAW264.7

65

ภาพท 28 ความสมพนธระหวางของสารทดสอบทความเขมขน 500 ไมโครกรมตอมลลลตร

ความสามารถในการกระตนเซลลแมคโครฟาจโดยการวดปรมาณ NO ทผลตจาก เซลล RAW 264.7

จากขอมลการวเคราะหปรมาณ NO เพอทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ พบวามความสมพนธกบการแทนทของหมซลเฟต สาหรบโมเลกลของ AS มคา DS ทสงกวา HAS,

OAS, PGS และ PMS แตกลบมความสามรถในการกระตนแมคโครฟาจไดนอยกวาสารทดสอบตวอน แสดงใหเหนวามปจจยอนๆทมความสาคญตอกระบวนการกระตนแมคโครฟาจ จากรายงานพบวา ขนาดโมเลกลเปนอกหนงปจจยทมความสาคญ กรณของ PM และ PG พบวาขนาดโมเลกลทมขนาดประมาณ 2 kDa หรอในกลมของโอลโกแซกคาไรดมความสามารถในการกระตนระบบภมคมกนโดยผานทาง TRL (Iwamoto et al., 2005: 4423-4429) สาหรบการกระตนแมคโครฟาจใหมการหลง TNF-α ตองอาศยอลจเนตทมขนาดโมเลกลสงกวา 30 kDa (Ueno and Oda, 2014:

95-111) มรายงานเกยวกบขนาดโมเลกลของพอลแซกคาไรดจาก Porphyridium cruentum พบวาขนาดโมเลกลทมขนาดเลกสามารถกระตนระบบภมคมไดดกวาโมเลกลขนาดใหญ ซงขนาดโมเลกลทเหมาะสมอยในชวงโมเลกล 6.55 และ 256 kDa (Sun, Wang and Zhou, 2010: 1206–

1210)

66

เหตผลดงกลาวมความสอดคลองกบผลการทดสอบทได เนองจาก AS มขนาดโมเลกลทมากกวา 90

kDa ขนาดโมเลกลทใหญสงผลตอการเขากบตวรบ (receptor) บนผวเซลล ในขณะทโมเลกลของ HA, HAS, OA, OAS, PG, PGS, PM และ PMS มขนาดโมเลกลเลกกวา 36 kDa เปนชวงโมเลกลทมความเหมาะสมในการเขาจบกบตวรบ

ปรมาณและการจดเรยงตวของ M และ G เปนอกหนงปจจยทมความสาคญ เนองจาก

โมเลกลนาตาลทงสองมโครงสรางการจดเรยงตวทแตกตางกน จากรายงานทผานมาพบวา โมเลกลของ PM และ PG มความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจใหมการสราง NO โดยผานทางการเขาจบกบตวรบบนผวเซลล ซงตวรบมความจาเพาะตอ LPS และโครงสรางทมลกษณะคลายกน และเมอทาการเปรยบเทยบระหวาง PM กบ PG พบวา PG มความสามารถในการเขาจบกบตวรบไดดกวา PM แตกระบวนการเขาจบกบตวรบยงไมชดเจน (Ueno et al., 2012: 88-93) จากทกลาวมาเกยวกบกระบวนการเขาจบกบตวรบบนผวเซลล เกดจากการประจลบภายในโมเลกลของสารเขาจบกบประจบวกของโปรตนบนตวรบ ประจลบภายในโมเลกล PM และ PG ซงสวนใหญมาจากหม ไฮดรอกซลและหมคารบอกซลก (Berven et al., 2013: 30-44) สาหรบโครงสรางของ PM ทมลกษณะ ribbon-like chains เกดจากการสรางพนธะไฮโดรเจนระหวางโมเลกลของ PM เชน หม ไฮดรอกซลของคารบอนตาแหนงท 3(C-3) กบอะตอมออกซเจนภายในวงนาตาลทอยถดไป หรอ หมไฮดรอกซลของคารบอกซลกกบออกซเจนของคารบอนตาแหนงท 3(C-3) ทอยถดไป (Atkins

and Nieduszynski, 1973: 1884-1886) แตสาหรบโครงสรางของ PG ทมลกษณะ buckled chain และมโอกาสในการเกดพนธะระหวางโมเลกล PG เชน หมไฮดรอกซลของคารบอนตาแหนงท 2(C-2)

กบออกซเจนในหมคารบอกซลกของโมเลกลถดไป (Atkins and Nieduszynski, 1973:

1884-1886) การเกดพนธะไฮโดรเจนระหวางโมเลกลสงผลตอการจดเรยงตวและประจภายในโมเลกลของ PM และ PG จากขอมลจะเหนไดวาปจจยทสงผลคณสมบตในการกระตนแมคโครฟาจไดแก หมซลเฟต, ขนาดโมเลกล, ปรมาณ M ตอ G และ การจดเรยงตวของ M และ G จากขอมลทงหมดมความสอดคลองกบผลการทดสอบ ท PGS มความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจไดดทสด

ภาพท

29 คว

ามสม

พนธระห

วางสารท

ดสอบ

ทความ

เขมขน

500 ไม

โครกรม

ตอมล

ลลตร

กบเป

อรเซน

ตการอ

ยรอด

ของเซ

ลลแม

คโครฟา

จ เมอ

ทาการ

เป

รยบเท

ยบกบ

ชดคว

บคม

67

68

บทท 5

สรปผล และขอเสนอแนะ

สรปผล

การปรบขนาดโมเลกลของอลจเนตโดยการใชปฏกรยาเคม สภาวะทมความแตกตาง

กนซงไดแก ปฏกรยาไฮโดรไลซส และ ปฏกรยาออกซเดชน ทาใหขนาดโมเลกลอลจเนตตากวา 50

kDa ปฏกรยาออกซเดชนมความสามารถในการทาลายพนธะไกลโคซดกทเชอมระหวางโมเลกลของนาตาลทเปนองคประกอบไดรนแรงและมประสทธภาพมากกวาปฏกรยาไฮโดรไลซส และทาใหเกดการปรบโครงสรางของนาตาลทปลายสาย เกดการสรางหมคารบอกซล สาหรบกระบวนการเตมหมซลเฟต คา DS อยในชวง 0.38-1.11

อลจเนตซลเฟตและอนพนธของอลจเนตซลเฟตทเตรยมไดนนสามารถชะลอการแขง

ตวของเลอดใน intrinsic pathway (คา APTT) เทากบ 10.02 เทา และ 4.74 – 9.03 เทาของคาปกตและพบวา AS มประสทธในการเปนสารชะลอการแขงตวของเลอดสงทสด (APTT เปน 340.90

วนาทคดเปน 10.02X) และเมอนาสารทกชนดทระดบความเขมขน 0-1000 ไมโครกรมตอมลลลตรทดสอบความเปนพษตอเซลล L929 และความเขมขน 0-250 ไมโครกรมตอมลลลตรทดสอบความเปนพษตอเซลล PBMC พบเปอรเซนตการรอดชวตของเซลลอยในชวง 100-80% ในขณะเดยวกนทความเขมขนดงกลาวไมมความสามารถในการตานเซลลมะเรง Hela และสาหรบการทดสอบความสามารถในการกระตนระบบภมคมกน พบวาสารทดสอบมความสามารถในการกระตนระบบภมคมกน โดยการวดคา NO ทแมคโครฟาจสรางขนหลงจากถกกระตน และพบวา PGS มประสทธภาพสงทสดในการกระตนแมคโครฟาจ (NO เปน 67.91 ไมโครโมลาร) นอกจากนทกความเขมขนททดสอบไมมความเปนพษตอเซลลแมคโครฟาจ ขอเสนอแนะ

ในการศกษาทผานมาถงแมจะพบประสทธภาพในการเปนสารชะลอการแขงตวของ

เลอด และความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ ในลาดบตอมาควรศกษาในสวนโครงสรางและกลไกการออกฤทธการชะลอการแขงตวของเลอด และการกระตนแมคโครฟาจ เพอนาไปพฒนาปรบปรงใหมความจาเพาะเจาะจง และควรมการทดสอบคณสมบตการออกฤทธทางชวภาพอนๆ เชน ความสามารถในการยบยงเชอไวรส เปนตน เพอนาไปประยกตใชในทางวงการแพทยในอนาคต

69

รายการอางอง

อ.นพ.พรยทธ สทธไชยากล. ( ). “Acute and Chronic Inflammation.” เอกสารประกอบการ

สอนรายวชาหลกพยาธวทยาและนตเวชศาสตร ( ) คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร.

กลยาณจร ศรพงศพนธ. ( ). เทคนคพนฐานการเพาะเลยงเซลลสตว. พมพครงท . นครปฐม: ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวะกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร, 2547, 55-64.

Aida, Taku Michael. et al. (2010). “Depolymerization of sodium alginate under hydrothermal

conditions.” Carbohydrate Polymers 80, 1 (March): 296-302.

Alban, Susanne., and Gerhard Franz. (2000). “Characterization of the Anticoagulant Actions of a

Semisynthetic Curdlan Sulfate.” Thrombosis Research 99, 4(August): 377-388.

Alban, Susanne., A Schauerte, and Gerhard Franz. (2002) “Anticoagulant sulfated polysaccharide

: Part I. Synthesis and structure - activity relationships of new pullulan sulfates.”

Carbohydrate Polymers 47, 3 (February): 267-276.

Arlov, Øystein. (2012). “Heparin Analogs Created by Sulfation of Alginates Using a

Chemoenzymatic Strategy.” Department of Biotechnology, Norwegian University of

Science and Technology.

Atkins, E.D.T., and I.A. Kieduszynsi. (1973). “Structural Components of Alginic Acid. I. The

Crystalline Structure of Poly-p-D-Mannuronic Acid. Results of X-Ray Diffraction

and Polarized Infrared Studies.” Biopolymers 12, 8 (August): 1865-1878.

__________. (1973). “Structural Components of Alginic Acid. II. The Crystalline Structure of

Poly-a-L-Guluronic Acid. Results of X-Ray Diffraction and Polarized Infrared

Studies.” Biopolymers 12, 8 (August): 1879-1887.

70

Berven, Lise. et al. (2013). “Alginates induce legumain activity in RAW264.7 cells and accelerate

auto activation of prolegumain.” Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre 2,

1(July): 30-34.

Bredt, D.S., and S.H. Snyder. (1994). “Nitric oxide: A physiologic messenger molecule.” Annual

Review of Biochemistry 63, (July): 175–95.

Bouhedja, Ferial Haroun. et al. (2000). “Relationship between Sulfate Groups and Biological

activities of Fucans.” Thrombosis Research 100, 1(December): 453-459.

Chandia, N.P., B. Matsuhiro, and A.E. Vasquez. (2001). “Alginic acid in Lessonia trabeculate:

characterization by formic acid hydrolysis and FT-IR spectroscopy.” Carbohydrate

Polymers 46, 1 (September): 81–87.

Chandia, Nancy P. et al. (2004). “Alginic acids in Lessonia vadosa: Partial hydrolysis and elicitor

properties of the polymannuronic acid fraction.” Journal of Applied

Phycology 16, 2 (March): 127-133.

Chhatbar, Mahesh. et al. (2009). “Microwave assisted rapid method for hydrolysis of sodium

alginate for M/G ratio Determination.” Carbohydrate polymers 76, 4 (May):

650-656.

Cong, Qifei. et al. (2014). “Structure and biological activities of an alginate from Sargassum fusiforme, and its sulfated derivative.” International Journal of Biological

Macromolecules 69, (August): 252–259.

Cui, Dapeng. et al. (2007). “Synthesis and Optimization of the Reaction Conditions of Starch

sulfates in Aqueous Solution.” Starch/Stärke 59, 2(February): 91–98.

Dore, Celina Maria P. Guerra. et al. (2013). “A sulfated polysaccharide, fucans, isolated from

brown algae Sargassum vulgare with anticoagulant, antithrombotic, antioxidant and

anti-inflammatory effects.” Carbohydrate polymers 91, 1(January): 467-475.

Draget, Kurt Ingar., Olav Smidsrød, and Gudmund Skjåk-Bræ. (2005). “Alginates from Algae.”

Biopolymers Online, (January):1-30.

Duart, Marin E.R. et al. (2001). “Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum.” Carbohydrate Research 333, 4 (July) 281–293.

71

Fan, Lihong. et al. (2011). “Synthesis and anticoagulant activity of sodium alginate sulfates.”

Carbohydrate polymers 83, 4 (February): 1797-1803.

Fan, Lihong. et al. (2012). “Synthesis and anticoagulant activity of the quaternary ammonium

chitosan sulfates.” International Journal of Biological Macromolecules 50,

1(January): 31–37.

Frederiksen, James W. (2000). “Cardiopulmonary Bypass in Humans: Bypassing Unfractionated

Heparin.” The annals of thoracic surgery 70, 4(October): 1434-1443.

Gomez, C., G. M. Rinaudo, and M. Villar. (2007). “Oxidation of sodium alginate and

characterization of the oxidized derivatives.” Carbohydrate Polymers 67,

3(February): 296–304.

Gorin, P. A. J., and J. F. T. Spence. (1966). “Exocellular alginic acid from Azotobacter vinelandii.”

Canadian Journal of Chemistry 44, 9(May): 993-998.

Hirsh, Jack. (2003). “American Heart Association/American College of Cardiology Foundation

Guide to Warfarin Therapy.” Circulation Journals 107, 1(April): 1692-1711.

Hu, Xiaoke. et al. (2004). “Antitumour activities of alginate-derived oligosaccharides and their

sulphated substitution Derivatives.” European Journal of Phycology 39, 1(May):

67-71.

Iwamoto, Mami. et al. (2005). “Structure–activity relationship of alginate oligosaccharides in the

induction of cytokine production from RAW264.7 cells.” Federation of European

Biochemical Societies Letters 579, 20(August): 4423–4429.

Jiang, Zedong. et al. (2013). “Importance of sulfate groups for the macrophage-stimulating

activities of ascophyllan isolated from the brown alga Ascophyllum nodosum.”

Carbohydrate Research 380, (October): 124-129.

Koumoto, Kazuya. et al. (2004). “Low Mw sulfated curdlan with improved water solubility forms

macromolecular complexes with polycytidylic acid.” Carbohydrate Research 339,

1(January): 161-167.

Koyanagi, Satoru. et al. (2003). “Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and

antitumor activities.” Biochemical Pharmacology 65, 2(January): 173-179.

72

Leal, David. et al. (2008). “FT-IR spectra of alginic acid block fractions in three species of brown

seaweeds.” Carbohydrate Research 343, 4(February): 308-316.

Lee, Kuen Yong., and David J. Mooneya. (2012). “Alginate: Properties and biomedical

applications.” Progress in Polymer Science 37, 1(January): 106–126.

Li, Quancai. et al. (2013). “Preparation, characterization and antioxidant activities of

polymannuronic acid phosphate, H-phosphonate and sulfate.” International

Journal of Biological Macromolecules 62, (November): 281–286.

Li, Xiaoxia. et al. (2010). “Preparation of low molecular weight alginate by hydrogen peroxide

depolymerization for tissue engineering.” Carbohydrate polymers 79, 3(February):

660-664.

Liang, Wanai. et al.(2014).“Effects of sulfate group in red seaweed polysaccharides on

anticoagulant activity and cytotoxicity.” Carbohydrate polymers 101, (January):

776-785.

Melo, Fa´bio R. et al. “Antithrombin-mediated Anticoagulant Activity of Sulfated

polysaccharides.” The Journal of Biological Chemistry 279, 20 (May): 20824–

20835.

Mestechkina, N.M., and V.D. Shcherbukhin. (2010). “Sulfated polysaccharides and their

anticoagulant activity.” Applied biochemistry and microbiology 46, 3(May):

267-273.

Neill, Steven. et al. “Nitric oxide evolution and perception.” Journal of Experimental Botany 59,

1(November): 25-35.

Nishimura, Shin Ichiro. et al. (1998). “Regioselective syntheses of sulfated polysaccharides:

specific anti-HIV-1 activity of novel chitin sulfates.” Carbohydrate Research 306,

3(January): 427-433.

Painter, Terence. et al. (1968). “A computer study of the changes in composition-distribution

occurring during random depolymerisation of a binary linear heteropolysaccharide.”

Acta Chemica Scandinavica 22, 5: 1637-1648.

Parkin, Jacqueline., and Bryony Cohen. (2001). “An overview of the immune system.” The

Lancet 357, 9270(June): 1777-1789.

73

Pawar, N. Siddhesh., and Kevin J. Edgar. (2012). “Alginate derivatization: A review of chemistry,

properties and Applications.” Biomaterials 33, 11(April): 3279-3305.

Pomin, Vitor H. et al. (2005). “Mild acid hydrolysis of sulfated fucans: a selective 2-desulfation

reaction and an alternative approach for preparing tailored sulfated oligosaccharides”

Glycobiology 15, 12 (August): 1376–1385.

Raetz, Christian R. H., and Chris Whitfield. (2002). “Lipopolysaccharide endotoxins.” Annual

Review of Biochemistry 71, (April): 635-700.

Ronghuaet, Huang., Du Yumin, and Yang Jianhong. (2003). “Preparation and in vitro

anticoagulant activities of alginate sulfate and its quaterized derivatives.”

Carbohydrate polymers 52, 1 (April): 19-24.

Sabra, W., An Ping Zeng, and W.D. Deckwer. (2001). “Bacterial alginate: physiology, product

quality and process aspects.” Applied Microbial Biotechnol 56, 3-4(August):

315–325.

Schmitz, Thomas., Markus Rothe, and Johannes Dodt. (1991). “Mechanism of the inhibition of

α-thrombin by hirudin-derived fragments hirudin( 1 - 47) and hirudin (45 - 65).”

European Journal of Biochemistry 195, 1(March): 251-256.

Spronk, Henri M.H., Jose´ W.P. Govers-Riemslag, and Hugo ten Cate. (2003). “The blood

coagulation system as a molecular machine.” Bioessays 25, 12(December):

1220-1228.

Sun, Liqin., Ling Wang, and Yan Zhou. (2010). “Immunomodulation and antitumor activities of

different-molecular-weight polysaccharides from Porphyridium cruentum.”

Carbohydrate polymers 87, 2(January): 1206–1210.

Suresh, Veeraperumal. et al. (2013). “Separation, purification and preliminary characterization of

sulfated polysaccharides from Sargassum plagiophyllum and its in vitro anticancer

and antioxidant activity.” Process Biochemistry 48, 2(February): 364-373.

Takeda, Kiyoshi., and Shizuo Akira. (2004). “TLR signaling pathways.” Seminars in

Immunology 16, 1(February): 3–9.

74

Tan, Yunhao., and Jonathan C. Kagan. (2014). “A Cross-Disciplinary Perspective on the Innate

Immune Responses to Bacterial Lipopolysaccharide.” Molecular Cell 54, 2(April):

212–223.

Theerakittayakorn, Kasem., and Tanom Bunprasert. (2011). “Differentiation Capacity of Mouse

L929 Fibroblastic Cell Line Compare With Human Dermal Fibroblast.”

International Scholarly and Scientific Research & Innovation 5, 2(May):

316-319.

Tiozzo, Roberta. et al. (1993). “Effect of the desulfation of heparin on its anticoagulant and

antiproliferative activity.” Thrombosis Research 70, 1 (April): 99–106.

Ueno, Mikinori. et al. (2012). “Comparative study on antioxidative and macrophage-stimulating

activities of polyguluronic acid (PG) and polymannuronic acid (PM) prepared from

alginate.” Carbohydrate Research 352, (May): 88-93.

Ueno, Mikinori., and Tatsuya Oda. (2014). “Biological activities of alginate.” Advances in food

and nutrition research 72, (May):: 95-112.

Wang, Ya Jun. et al. (2005). “Novel process for preparation of (1 -3)-β-D-glucan sulphate by a

heterogeneous reaction and its structural elucidation.” Carbohydrate polymers 59,

1(January): 93-99.

Wang, Zhao Mei. et al. (2007). “Preparation and anticoagulation activity of sodium cellulose

sulfate.” International Journal of Biological Macromolecules 41, 4(October):

376–382.

Wang, Jing et al. (2010) “Potential antioxidant and anticoagulant capacity of low molecular

weight fucoidan fractions extracted from Laminaria japonica.” International

Journal of Biological Macromolecules 46, 1(January): 6–12.

Yang, Jianhong. et al. (2002). “Chemical modification, characterization and structure

anticoagulant activity relationships of Chinese lacquer polysaccharides.” Biological

Macromolecules 31, 1-3(December): 55-62.

Yang, Jianhong. et al. (2005). “The structure–anticoagulant activity relationships of sulfated

lacquer polysaccharide: Effect of carboxyl group and position of sulfation.”

International Journal of Biological Macromolecules 36, 1-2 (July): 9-15.

75

Yang, Zhao, Jin Ping Lia, and Hua-shi Guan. (2004). “Preparation and characterization of

oligomannuronates from alginate degraded by hydrogen peroxide.” Carbohydrate

Polymers 58, 2(November): 115–121. Zhao, Xia. et al. (2007). “Preparation of low-molecular-weight polyguluronate sulfate and its

anticoagulant and anti-inflammatory activities.” Carbohydrate polymers 69,

2(June): 272-279.

ภาคผนวก ก

77

ภาคผนวก ก อาหารเลยงเซลล

. อาหารเลยงเซลลเพาะเลยง

D-MEM (Gibco) 10.0 กรม 10% Fetal bovine serum 100.0 มลลลตร

Pennicillin 100.0 ยนตตอมลลลตร Streptomycin 100.0 ไมโครกรมตอมลลลตร 10% NaHCO3 1.5 มลลลตร

ผสมอาหาร D-MEM ชนดผงกบนาประมาณ 90% คนใหละลายแลวปรบ pH โดยใช 1M HCl และ 1M NaOH ใหได pH 7.2 ± 0.02 จากนนเตมสารทเหลอลงไปผสมใหเขากน แลวปรบปรมาตรดวยนาใหได 1000 มลลลตร กรองผานกระดาษกรองขนาด 0.22 ไมโครเมตร แบงใสขวด เกบไวท 4 องศาเซลเซยส

ภาคผนวก ข

79

ภาคผนวก ข

การเตรยมสารเคม 1. สารละลาย 3 M hydrochloric acid (HCl)

ตวง HCl 35% w/w ปรมาตร 26.29 มลลลตร เตมลงไปในนาทมปรมาตร 73.70

มลลลตร อยางชาๆ กวนใหเขากน

2. สารละลาย 8% (w/v) sodium hydrogen carbonates (NaHCO3)

เตรยมโดยการชง NaHCO3 8 กรม ละลายในนากลนปรมาตร 100 มลลลตร

3. สารละลาย 1M Sodium hydroxide

เตรยมโดยการชง NaOH 4 กรม ละลายในนากลนปรมาตร มลลลตร

4. การเตรยมสารเคมสาหรบใชในการวเคราะหปรมาณซลเฟต

4.1 สารละลาย gelatin-barium chloride

เตรยมโดยการชง barium chloride 0.5 กรม และ gelatin 0.5 กรม ละลายในนากลน

ปรมาตร 100 มลลลตร

4.2. สารละลาย 8% (w/v) trichloroacetic acid

เตรยมโดยการชง trichloroacetic acid ปรมาตร 8 กรม ละลายในนากลน ปรบ ปรมาตรเปน 100 มลลลตร

5. การเตรยมสารเคมสาหรบการวเคราะหขนาดโมเลกล

5.1 สารละลาย 1.5 M Tris - hydrochloric acid pH 8.8

เตรยมโดยการชง Tris base 18.17 กรม ละลายในนากลน 80 มลลลตร เตมกรด

hydrochloric acid เขมขนเพอปรบ pH เปน 8.8 แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร

5.2 สารละลาย 0.58 M Tris - hydrochloric acid pH 6.8

เตรยมโดยการชง Tris base 7.02 กรม ละลายในนากลน มลลลตร เตมกรด

hydrochloric acid เขมขนเพอปรบ pH เปน 6. แลวปรบปรมาตรเปน มลลลตร

5.3 สารละลาย 10% (w/v) ammonium persulphate

เตรยมโดยการชง ammonium persulphate 10 กรม ละลายในนากลน ปรมาตร 100

มลลลตร

80

5.4 loading dry

ละลาย sucrose ใน 1X TBE buffer ใหมความเขมขนเปน 2 M จากนนละลาย bromphenol blue ใหมความเขมขนเปน 0.2%(w/v)

5.5 สยอม

ชง Alcine blue 0.5 กรม ละลายใน 2% (v/v) acetic acid ปรมาตร 100 ml

6. Griess’s reagent

NED 0.01 กรม

Sulfanilamide 0.1 กรม

O-Phosphoric acid 0.5 มลลลตร H2O 9.5 มลลลตร

7. Hank, s Balanced Salt Solution (HBSS)

Sodium chloride 8.0 กรม

Potassium chloride 0.4 กรม Potassium dihydrogen phosphate 0.06 กรม

Disodium hydrogen phosphate 1.44 กรม D-Glucose 1.0 กรม

Sodium bicarbonate 0.35 กรม H2O 900 มลลลตร

ชงสวนประกอบตางๆดงทกลาว เตมนากลนปรมาตร 900 มลลลตร ผสมใหเขากนและปรบความเปนกรดดางใหอยในชวง 7.1-7.2 ดวย Sodium hydroxide ปรบปรมาตรใหเปน 1 ลตรดวยนากลน นาสารละลายบฟเฟอร ไปทาไรเชอดวยการกรองผานแผนกรองทมขนาดเสนผานศนยกลางของรขนาด 0.22 ไมครอน จากนนปดฝาขวดใหสนท

ภาคผนวก ค

82

ภาคผนวก ค. กราฟมาตรฐานและวธการวเคราะห

. การวเคราะหปรมาณซลเฟตดวยวธ barium sulfate nephelometry (Fan et al., 2011:

1797-1803)

การเตรยมสารละลายมาตรฐาน

1.1 เตรยมสารละลายมาตรฐานซลเฟตความเขมขน 0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 และ 0.5

มลลกรมตอลตร ใสหลอดทดลองหลอดละ 250 มลลลตร

1.2 เตมนากลนลงไปหลอดละ มลลลตร 1.3 เตม gelatin-barium chloride solution ลงไปหลอดละ ไมโครลตร 1.4 เตม % (v/v) trichloroacetic acid ลงไปหลอดละ 350 ไมโครลตร

1.5 เขยาเปนเวลา นาท แลวทงไว นาทเพอใหเกดปฏกรยาอยางสมบรณ 1.6 นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 36 นาโนเมตร

ตารางท 9 ความสมพนธของความเขมขนหมซลเฟตกบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 360 นาโนเมตร

ความเขมขนของหมซลเฟต (μg/ml) คา OD 360 nm

0.0 0.000

0.1 0.227

0.2 0.434

0.3 0.598

0.4 0.724

0.5 0.876

83

2. กราฟมาตรฐานการวเคราะหปรมาณซลเฟต

กราฟมาตรฐานทไดพบวามสมการเสนตรงเปน y = 0.5381x เมอแกน y คอคาความ

เขมขนของซลเฟต (มลลกรมตอมลลลตร) และ x คอคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 360 นาโนเมตร

ปรมาณซลเฟต (มลลกรมตอมลลลตร) = คาการดดกลนแสงท 360 นาโนเมตร x 0.5381

ภาพท 30 กราฟมาตรฐานการวเคราะหหมซลเฟตทความยาวคลน นาโนเมตร

84

3. การวเคราะหปรมาณ nitrite

การเตรยมสารละลายมาตรฐาน 3.1 เตรยมสารละลายมาตรฐาน nitrite ทความเขมขน 0, 3.125, 6.25, 12.5,

25 และ 50 ไมโครโมลาร 3.2 ถายลง 96 wells plate ปรมาตร 100 ไมโครมลลลตร

3.3 เตม Griess’s reagent ปรมาตร 100 ไมโครมลลลตร

3.4 นา 96 well plate ไปวดคา OD ท 540 นาโนเมตร

ตารางท 10 ความสมพนธความเขมขนของ nitrite กบคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร

ความเขมขนของ nitrite (μM) คา OD 540 นาโนเมตร 0.0 0.038

3.125 0.063

62.5 0.078

12.5 0.114

25 0.167

50 0.248

85

4. กราฟมาตรฐานการวเคราะหปรมาณไนไตรท

กราฟมาตรฐานทไดพบวามสมการเสนตรงเปน y = 0.0041x + 0.0519 เมอแกน x คอคา ความเขมขนของ nitrite μM และ y คอคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 540 นาโนเมตร

ปรมาณ nitrite (μM) = (คาการดดกลนแสงท 540 – 0.0519)/ 0.0041

ภาพท 31 กราฟมาตรฐานการวเคราะหปรมาณไนไตรททความยาวคลน 540 นาโนเมตร

ภาคผนวก ง

87

ภาคผนวก ง

ภาพจากการวเคราะหดวย PAGE

ภาพท 32 ขนาดโมเลกลอลจเนตและอนพนธอลจเนตซลเฟต โดยการใช PAGE % แถวท 1 marker (Prestained Protein Molecular Weight Marker)

แถวท 2 A (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดมากกวาประมาณ 90 kDa)

แถวท 3 AS (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดมากกวาประมาณ 90 kDa)

แถวท 4 HA (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดเลกกวาประมาณ 10 kDa)

แถวท 5 HAS (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดเลกกวาประมาณ 30 kDa)

แถวท 6 OA (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดเลกกวาประมาณ 10 kDa)

แถวท 7 OAS (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดเลกกวาประมาณ 30 kDa)

หมายเหต ประมาณขนาดโมเลกลดวยวธเปรยบเทยบความเขมของส

88

ภาพท 33 ขนาดโมเลกลอลจเนตและอนพนธอลจเนตซลเฟต โดยการใช PAGE % แถวท marker (Prestained Protein Molecular Weight Marker)

แถวท PM (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดเลกกวาประมาณ 5 kDa)

แถวท PMS (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดเลกกวาประมาณ 25 kDa)

แถวท PG (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดเลกกวาประมาณ 20 kDa)

แถวท PGS (ขนาดโมเลกลสวนใหญมขนาดเลกกวาประมาณ 30 kDa)

หมายเหต ประมาณขนาดโมเลกลดวยวธเปรยบเทยบความเขมของส

ภาคผนวก จ

90

ภาคผนวก จ

ภาพจากการวเคราะหความเปนพษตอเซลล

ภาพท 34 ผลการทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง (L929) บน 96 well microplate ของสาร ทดสอบทความเขมขน 31.25, 62.5, 125, 250, 500 และ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร

ก) hydrolyzed alginate (HA),

ข) hydrolyzed alginate sulfate (HAS)

ค) oxidized alginate (OA)

ง) oxidized alginate sulfate (OAS)

จ)ไมมการเตมสารทดสอบ (negative control) ฉ) เตม 100 % DMSO (positive control)

จ) ฉ)

91

ภาพท 35 ผลการทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง (L929) บน 96 well microplate ของสาร ทดสอบทความเขมขน 31.25, 62.5, 125, 250, 500 และ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) alginate (A)

ข) alginate sulfate (AS)

ค)ไมมการเตมสารทดสอบ (negative control) ง) เตม 100 % DMSO (positive control)

ค)

ง)

92

ภาพท 36 ผลการทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง (L929) บน 96 well microplate ของสาร

ทดสอบทความเขมขน 31.25, 62.5, 125, 250, 500 และ 1000 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) polyguluronate (PG)

ข) polyguluronate sulfate (PGS)

ค) polymanuronate (PM) ง) polymanuronate sulfate (PMS)

จ)ไมมการเตมสารทดสอบ (negative control) ฉ) เตม 100 % DMSO (positive control)

จ)

ฉ)

93

ภาพท 37 ผลการทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง PBMC บน 96 well microplate ของสาร

ทดสอบทความเขมขน, 62.5, 125 และ 250 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) hydrolyzed alginate (HA)

ข) hydrolyzed alginate sulfate (HAS)

ค) oxidized alginate (OA)

ง) oxidized alginate sulfate (OAS)

จ) polyguluronate (PG)

ฉ) polyguluronate sulfate (PGS)

ช) polymanuronate (PM) ซ) polymanuronate sulfate (PMS)

ฌ) ไมมการเตมสารทดสอบ (negative control) ญ) เตม 20% DMSO แทนสารทดสอบ (positive control)

ก) ข) ค) ง)

จ) ฉ) ช) ซ)

ฌ) ญ)

94

ภาพท 38 ผลการทดสอบความเปนพษตอเซลลเพาะเลยง PBMC บน 96 well microplate ของสาร

ทดสอบทความเขมขน, 62.5, 125 และ 250 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) alginate (A)

ข) alginate sulfate (AS)

ก) ข)

ภาคผนวก ฉ

96

ภาคผนวก ฉ

ภาพจากการวเคราะหการกระตนแมคโครฟาจ

ภาพท 39 ผลการทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน 96 well microplate ของสาร ทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) alginate sulfate (AS),

ข) alginate (A)

ค) ไมมการเตมสารทดสอบ (negative control) ง) เตม LPS 1 ไมโครกรมตอมลลลตรแทนสารทดสอบ (positive control)

ภาพท 40 ผลการทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน 96 well microplate ของสาร

ทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) oxidized alginate (OA)

ข) oxidized alginate sulfate (OAS)

ค) ไมมการเตมสารทดสอบ (negative control) ง) เตม LPS 1 ไมโครกรมตอมลลลตรแทนสารทดสอบ (positive control)

ก) ข)

ค) ง)

ก) ข)

ค) ง)

97

ภาพท 41 ผลการทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน 96 well microplate ของสาร

ทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) hydrolyzed alginate (HA)

ข) hydrolyzed alginate sulfate (HAS)

ค) ไมมการเตมสารทดสอบ (negative control) ง) เตม LPS 1 ไมโครกรมตอมลลลตรแทนสารทดสอบ (positive control)

ภาพท 42 ผลการทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน 96 well microplate ของสาร

ทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) polymanuronate (PM) ข) polymanuronate sulfate (PMS)

ค) ไมมการเตมสารทดสอบ (negative control) ง) เตม LPS 1 ไมโครกรมตอมลลลตรแทนสารทดสอบ (positive control)

ค)

ก) ข)

ง)

ก)

ค)

ข)

ง)

98

ภาพท 43 ผลการทดสอบความสามารถในการกระตนแมคโครฟาจ บน 96 well microplate ของสาร

ทดสอบทความเขมขน 100, 250 และ 500 ไมโครกรมตอมลลลตร ก) polyguluronate sulfate (PGS)

ข) polyguluronate (PG)

ก) ข)

ภาคผนวก ช

ภาคผนวก ช

ขอมลการทดลอง

ตารางท 11 การวเคราะหปรมาณซลเฟอรและคา DS

สาร ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 คาเฉลย SD

OD %S DS OD %S DS OD %S DS OD %S DS OD %S DS

A 0.032 0.57 0.04 0.037 0.66 0.04 0.028 0.50 0.03 0.032 0.58 0.04 0.00 0.08 0.01

AS 0.639 11.46 1.12 0.636 11.41 1.11 0.637 11.43 1.11 0.637 11.43 1.11 0.00 0.03 0.01

HA 0.050 0.90 0.06 0.056 1.00 0.06 0.058 1.04 0.07 0.055 0.98 0.06 0.00 0.07 0.01

HAS 0.421 7.55 0.62 0.425 7.62 0.62 0.432 7.75 0.64 0.426 7.64 0.63 0.01 0.10 0.03

OA 0.043 0.77 0.05 0.040 0.72 0.05 0.030 0.54 0.03 0.038 0.68 0.04 0.01 0.12 0.01

OAS 0.282 5.06 0.37 0.291 5.22 0.39 0.284 5.09 0.38 0.286 5.12 0.38 0.00 0.08 0.01

PG 0.031 0.56 0.04 0.037 0.66 0.04 0.028 0.50 0.03 0.032 0.57 0.04 0.00 0.08 0.01

PGS 0.452 8.11 0.68 0.454 8.14 0.68 0.455 8.16 0.68 0.454 8.14 0.68 0.00 0.03 0.01

PM 0.032 0.57 0.04 0.037 0.66 0.04 0.033 0.59 0.04 0.034 0.61 0.04 0.00 0.05 0.01

PMS 0.378 6.78 0.54 0.366 6.56 0.51 0.372 6.67 0.52 0.372 6.67 0.52 0.01 0.11 0.01

100

ตารางท การวเคราะหเปอรเซนตการอยรอดของเซลล L929

สาร ความเขมขนสาร (μg/ml)

31.25 62.5 125

1 2 3 คาเฉลย

SD 1 2 3 คาเฉลย SD 1 2 3 คาเฉลย SD

A 100.05 100.05 103.35 101.15 1.90 98.74 99.73 100.71 99.73 0.99 96.11 93.14 97.09 95.45 2.06

AS 102.69 102.36 102.69 102.58 0.19 97.75 99.73 99.73 99.07 1.14 98.74 99.73 99.40 99.29 0.50

HA 99.43 97.37 100.46 99.09 1.57 93.94 93.94 94.97 94.29 0.59 93.26 91.54 90.86 91.89 1.24

HAS 98.40 96.69 97.03 97.37 0.91 94.63 94.29 90.86 93.26 2.09 92.57 93.26 90.17 92.00 1.62

OA 101.14 103.20 104.91 103.09 1.89 99.43 99.09 98.74 99.09 0.34 98.40 99.09 94.97 97.49 2.20

OAS 99.43 100.46 99.77 99.89 0.52 97.37 98.06 98.74 98.06 0.69 95.66 94.97 99.09 96.57 2.20

PG 99.04 98.75 99.33 99.04 0.29 92.42 92.99 92.13 92.51 0.44 90.12 89.25 91.27 90.21 1.01

PGS 96.24 97.98 96.24 96.82 1.00 93.35 92.49 92.20 92.68 0.60 90.75 92.20 89.60 90.85 1.30

PM 99.62 99.90 101.06 100.19 0.76 92.97 92.97 93.55 93.17 0.33 92.40 91.24 92.40 92.01 0.67

PMS 98.65 98.08 100.67 99.13 1.36 92.88 90.00 92.31 91.73 1.53 91.73 92.02 90.00 91.25 1.09

101

ตารางท 13 การวเคราะหเปอรเซนตการอยรอดของเซลล L929 (ตอ)

สาร ความเขมขนสาร (μg/ml)

250 500 1000

1 2 3 คาเฉลย SD 1 2 3 คาเฉลย SD 1 2 3 คาเฉลย SD

A 95.12 91.83 90.84 92.59 2.24 87.55 88.54 87.55 87.88 0.57 87.88 85.57 86.23 86.56 1.19

AS 89.19 92.48 94.13 91.94 2.51 87.55 87.55 87.22 87.44 0.19 84.91 84.26 85.24 84.81 0.50

HA 89.49 93.26 89.83 90.86 2.09 85.71 84.69 83.66 84.69 1.03 85.03 82.63 84.00 83.89 1.20

HAS 98.40 96.69 97.03 97.37 0.91 94.63 94.29 90.86 93.26 2.09 92.57 93.26 90.17 92.00 1.62

OA 93.60 94.63 90.86 93.03 1.95 85.37 87.09 85.03 85.83 1.10 84.69 82.63 84.00 83.77 1.05

OAS 90.51 91.54 93.26 91.77 1.39 85.37 82.97 85.37 84.57 1.39 83.66 83.66 80.57 82.63 1.78

PG 88.68 88.68 90.12 89.16 0.83 86.37 87.52 87.52 87.14 0.66 85.22 85.80 84.64 85.22 0.58

PGS 86.71 89.60 89.60 88.63 1.67 86.71 84.97 84.39 85.36 1.20 80.92 82.66 83.24 82.27 1.20

PM 91.24 89.80 89.51 90.18 0.93 91.24 90.09 88.07 89.80 1.61 88.07 88.35 90.09 88.84 1.09

PMS 87.98 89.42 90.00 89.13 1.04 86.54 89.13 87.12 87.60 1.36 87.69 87.12 87.12 87.31 0.33

102

ตารางท 14 การวเคราะหเปอรเซนตการอยรอดของเซลล PBMC

สาร ความเขมขนสาร (μg/ml)

62.5 125 250

1 2 3 คาเฉลย SD 1 2 3 คาเฉลย SD 1 2 3 คาเฉลย SD

A 103.81 102.90 102.45 103.05 0.69 101.09 101.99 102.45 101.84 0.69 99.73 98.37 99.27 99.12 0.69

AS 102.45 103.35 102.45 102.75 0.52 102.45 100.18 100.63 101.09 1.20 97.91 97.46 98.82 98.07 0.69

HA 101.99 102.90 102.45 102.45 0.45 100.63 100.18 100.18 100.33 0.26 100.18 98.82 100.18 99.73 0.79

HAS 101.54 102.90 101.54 101.99 0.79 100.63 100.18 101.09 100.63 0.45 98.37 99.73 99.27 99.12 0.69

OA 102.45 103.35 101.99 102.60 0.57 101.99 101.99 101.54 101.84 0.21 101.54 100.63 101.09 101.09 0.37

OAS 102.45 101.99 101.99 102.15 0.26 99.73 100.18 101.09 100.33 0.69 99.27 98.82 98.82 98.97 0.26

PG 99.73 99.27 100.63 99.88 0.69 97.46 97.01 97.91 97.46 0.45 96.10 96.55 96.10 96.25 0.26

PGS 99.63 97.35 98.26 98.42 1.15 98.26 96.89 96.89 97.35 0.79 98.26 95.06 96.44 96.59 1.61

PM 99.27 101.09 99.73 100.03 0.94 98.37 100.18 98.82 99.12 0.94 98.82 97.01 97.46 97.76 0.94

PMS 100.18 102.45 101.09 101.24 1.14 99.27 98.37 97.46 98.37 0.91 95.65 95.19 96.55 95.80 0.69

103

ตารางท 15 การวเคราะหปรมาณ NO

สาร ความเขมขนสาร (μg/ml)

100 250 500

1 2 3 คาเฉลย SD 1 2 3 คาเฉลย SD 1 2 3 คาเฉลย SD

A -0.46 -0.71 -0.71 -0.63 0.14 -1.93 -1.68 -1.93 -1.85 0.14 -0.22 -0.46 0.02 -0.22 0.24

AS -0.22 -0.46 -0.46 -0.38 0.14 0.02 0.02 0.27 0.11 0.14 4.41 5.88 5.63 5.31 0.78

HA 7.34 6.61 7.83 7.26 0.61 21.24 22.46 22.46 22.06 0.70 35.88 37.59 36.37 36.61 0.88

HAS 13.44 13.44 13.44 13.44 0.00 26.12 27.34 26.37 26.61 0.65 45.39 48.56 46.85 46.93 1.59

OA 13.20 12.71 12.71 12.87 0.28 16.37 14.41 16.12 15.63 1.06 19.05 20.27 21.24 20.19 1.10

OAS 14.17 14.41 15.15 14.58 0.51 18.32 17.59 16.85 17.59 0.73 26.85 26.61 27.10 26.85 0.24

PG 11.24 10.76 10.51 10.84 0.37 23.20 21.98 22.46 22.54 0.61 39.78 39.78 39.05 39.54 0.42

PGS 41.49 41.24 42.22 41.65 0.51 53.93 52.95 52.71 53.20 0.65 65.63 69.78 68.32 67.91 2.10

PM 1.00 1.49 1.24 1.24 0.24 18.07 16.85 17.34 17.42 0.61 28.07 27.59 27.34 27.67 0.37

PMS 2.46 2.22 2.95 2.54 0.37 19.78 19.54 19.54 19.62 0.14 46.12 46.85 46.85 46.61 0.42

104

105

ประวตผวจย

ชอ – สกล นางสาวสวรรณ ทองมาล ทอย 114 หม 5 ต.กยบร อ.กยบร จ.ประจวบครขนธ 77150

ประวตการศกษา

พ.ศ. 2551-2555 วทยาศาสตรบณฑต สาขาจลชววทยา (เกยรตนยมอนดบหนง)

มหาวทยาลยศลปากร พระราชวงสนามจนทร จงหวดนครปฐม

พ.ศ. 2555-ปจจบน ศกษาตอระดบปรญญามหาบณฑต สาขาจลชววทยา บณฑตวทยาลย

มหาวทยาลยศลปากร พระราชวงสนามจนทร จงหวดนครปฐม

ประวตการทางาน

พ.ศ. 2556 ผชวยสอน 518202 ปฏบตการจลชววทยาทวไป 1(0-3-0)

ภาคการศกษาปท 1 ปการศกษา 2556

พ.ศ. 2557 ผชวยสอน 518202 ปฏบตการจลชววทยาทวไป 1(0-3-0)

ภาคการศกษาปท 1 ปการศกษา 2557

ผลงานทางวชาการ

1. Tongmalee, S. and Pulsawat, W. (2015) Synthesis and biological activity of

sulfated polymannuronic acid (PMS) and polyguluronic acid (PGS). Proceeding in the Burapha

University International Conference, 10-12 July 2015, Bangsaen Heritage Hotel, Bangsaen

Chonburi, Thailand.

2. Pulsawat, W. and Tongmalee, S. (2013) Synthesis and anticoagulant of

sulfatedalginate. Proceeding in the 5th International Conference on Fermentation Technology for

Value Added Agricultural Products, 21 - 23 August 2013, CENTARA Hotel & Convention Centre,

Khon Kaen, Thailand.

3. Pulsawat, W. and Tongmalee, S. (2012) Influences of chemical depolymeriztion

and sulfation methods on physicochemical properties and bioactivities of modified alginate. Poster

105

in the 25th International Conference on Green Biotechnology: Renewable Energy and Global Care,

29-30 November 2012, Sunee Grand Hotel and Convention Center, Ubon Ratchathani, Thailand