3. Material und Methoden

3.1 Untersuchte Organismen Die für diese Arbeit verwendeten Kulturen wurden aus der Sammlung von Algenkulturen der

Universität Göttingen (SAG) bezogen. Die genauen Bezeichnungen der Spezies sind in

Tabelle 3-1 aufgeführt.

Spezies Ordnung (sensu LEEDALE 1967)

Stamm

Distigma curvatum PRINGSHEIM 1936 Eutreptiales SAG B 1216-1b

Khawkinea quartana (MOROFF) JAHN et MCKIBBEN 1937 Euglenales SAG 1204-9

Khawkinea sp.1) Euglenales ────

Lepocinclis ovata (PLAYFAIR 1921) CONRAD 1934 Euglenales SAG B 1244-5

Phacus smulkowskianus (ZAKRYS 1986) KUSBER 1998 Euglenales SAG 58.81

Gyropaigne lefèvrei BOURELLY et GEORGES 1951 Rhabdomonadales SAG B 227.80

Rhabdomonas gibba (SKUJA 1939) PRINGSHEIM nom. nud. Rhabdomonadales SAG B 1271-2

Rhabdomonas incurva (FRESENIUS) KLEBS 1883 Rhabdomonadales SAG B 235.80 Tab. 3-1: Übersicht über die in dieser Arbeit untersuchten Organismen. 1) : Isolat aus einer verunreinigten Kultur von Rhabdomonas spiralis.

3.2 Lichtmikroskopie Die lichtmikroskopischen Untersuchungen auf Reinheit der Kulturen wurden an einem

Olympus BH-Mikroskop mit Phasenkontrast durchgeführt. Zur Dokumentation wurde Alfo

Color Film (200 ASA) verwendet.

3.3 Elektronenmikroskopie (TEM) Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden an einem HITACHI H 500

Elektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die

Dokumentation erfolgte auf Agfa Scientia EM-Film. Von allen untersuchten Arten wurden

mindestens 30 Zellen betrachtet.

Material & Methoden

21

3.3.1 Fixierung, Entwässerung und Einbettung der Proben 103 - 107 Zellen wurden für 1 min bei 2700 x g abzentrifugiert und das Pellet 2 x in EM-Puffer

gewaschen. Die anschließende Fixierung erfolgte für 30 min in 5% Glutaraldehyd in EM-

Puffer, nachfolgend wurde mit 2% Osmiumtetroxid für 30 min nachfixiert. Nach 5 x 5

minütigem Waschen in EM-Puffer folgte eine ansteigende Entwässerungsreihe in Aceton (15,

30, 45, 60, 75, 90%; je 15 min). Danach wurden die Proben 3 x für 10 min in 100% Aceton

belassen und im Anschluß daran in das Epoxyharz Transmit überführt, wobei die Proben

zuerst in Aceton/Transmit (1/1, v/v) für 20 min bei RT stehengelassen wurden. Anschließend

wurden die Proben in Aceton/Transmit im Verhältnis (1/2, v/v) überführt und über Nacht

stehengelassen. Nach Absaugen des Aceton/Transmit-Gemisches und Zugabe von Transmit

(100%) wurde dreimal für 1 h im Exsikkator entgast. Nach Überführen in Kunststoffkapseln

(Beem) polymerisierten die Proben über Nacht in einem Trockenschrank bei 70°C aus.

EM Puffer: 50 mM KH2PO4 / Na2HPO4, 38.8 / 61.2 (v/v), pH: 7.2

3.3.2 Herstellung der Schnitte Ultradünnschnitte einer Dicke von 60 - 80 nm wurden an einem Ultramikrotom (Ultracut E,

Reichert) mit einem Diamantmesser (DuPont) hergestellt. Die Schnitte wurden anschließend

auf 200 mesh Nickelnetzchen (Plano) übertragen und jeweils für 15 s mit Kaliumpermanganat

(5%) und für 30 s mit Bleicitrat (2%) nachkontrastiert.

3.4 RNA Isolierung Wählt man Messenger RNA (mRNA) als Ausgangsmaterial für nachfolgende genetische

Arbeiten, so hat dies zum Vorteil, daß Introns, wie sie in der DNA vorliegen, hier nicht

vorhanden sind. Es gibt dabei die Möglichkeit, die Messenger RNA aus der Gesamt-RNA zu

isolieren, oder direkt Gesamt-RNA als Probenmaterial für eine nachfolgende Reverse

Transkription [! 3.9] einzusetzen. In dieser Reaktion wurden mit Hilfe spezieller Primer [!

3.8.1] die für die beiden Hauptproteine des Paraxonemalstabes (PAR 1 und PAR 2)

kodierenden Bereiche in komplementäre einzelsträngige DNA (cDNA) umgeschrieben.

Material & Methoden

22

3.4.1 Isolierung von Gesamt-RNA Gesamt-RNA wurde über eine Guanidinium-Isothiocyanat-Phenol-Chloroform-Fällung

isoliert (CHOMCZYNSKI & SACCI 1987, verändert nach SAMBROCK et al. 1989). Dafür wurden

50 mg Zellmaterial in flüssigem Stickstoff zermahlen, das Pulver in 2 ml Eppendorf-Gefäßen

mit 200 µl Extraktionspuffer + 20 µl Mercaptoethanol überführt und für 30 s kräftig gemischt.

Danach erfolgten Zugaben von 20 µl 2 M Natriumacetat (pH 4), 200 µl wassergesättigtem

Phenol und 80 µl Chloroform:Isoamylalkohol (24:1), wobei nach Hinzufügen der einzelnen

Chemikalien jeweils für 30 s gut durchmischt wurde. Zu beachten war hierbei, daß alle

Schritte möglichst schnell aufeinander folgten und daß die Zellen während des Mörserns nicht

antauten, da sonst eine Angriffsmöglichkeit für RNasen bestünde. Anschließend wurde für

15 min bei 5000 x g und 4°C abzentrifugiert, die obere wäßrige Phase abgenommen, mit

gleichem Volumen Isopropanol gut durchmischt und bei �20°C über Nacht inkubiert. Nach

Abzentrifugieren bei 4°C für 30 min bei 10000 x g wurde das RNA Pellet in 100 µl

Extraktionspuffer mit 10 µl Mercaptoethanol resuspendiert, dabei war in einigen Fällen ein

kurzes Erwärmen auf maximal 65°C notwendig, um die RNA vollständig zu lösen. Nach

Mischen mit gleichem Volumen Isopropanol, mindestens einstündiger Lagerung bei �20°C

und erneutem Abzentrifugieren bei 4°C für 30 min bei 10000 x g wurden auf das RNA Pellet

100 µl eiskalter 75%iger Ethanol gegeben, sofort wieder dekantiert und der Restalkohol in

einem Trockenschrank bei 30°C verdampft. Das nun weiß aussehende RNA Pellet wurde in

30 µl RNase freiem Wasser resuspendiert, wobei auch hier in einigen Fällen ein maximal

5 minütiges Erwärmen auf 65°C im Wasserbad notwendig war. Nach dem Aliquotieren wurde

die RNA bis zur weiteren Verwendung bei -83°C gelagert.

3.4.1.1 Lösungen zur RNA Isolierung Alle Lösungen wurden in RNase-freien Gefäßen angesetzt: dazu wurde Glasmaterial für die

Dauer von 15 h einer Temperatur von 180°C ausgesetzt und Plastikmaterial vor dem

Autoklavieren für 40 min mit UV Licht einer Wellenlänge von 254 nm bestrahlt. Die

Lösungen wurden ausschließlich mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem H2O nanopore

angesetzt. Von dieser RNasen hemmenden Substanz wurden 1 ml pro l H2O zugegeben und

vor dem nachfolgendem Autoklavieren für mindestens 6 h gerührt.

Wenn nicht anders beschrieben, wurden Chemikalien der Fa. Roth verwendet. Dieses gilt

ebenso für alle folgenden Protokolle dieser Arbeit.

Material & Methoden

23

• RNA Extraktionspuffer: → Lagerung bei Raumtemperatur

4 M Guanidinium-Isothiocyanat

25 mM Natriumcitrat (aus einer 1 M Stammlösung mit pH 7)

0.5 % Sarcosyl [N-Lauroylsarcosine; Sigma]

direkt vor der RNA Isolierung wird zum Extraktionspuffer hinzugefügt:

0.1 M ß-Mercaptoethanol [Merck] → Lagerung bei 4°C unter Lichtabschluß

• Wassergesättigtes Phenol (pH 4 - 4.5) → Lagerung bei 4°C unter Lichtabschluß

• Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) → Lagerung bei 4°C unter Lichtabschluß

• Isopropanol → Lagerung bei 4°C

• 2 M Natriumacetat, pH 4,

DEPC - behandelt und autoklaviert → Lagerung bei 4°C

• 75 % Ethanol → Lagerung bei -20°C

• Wasser, DEPC-behandelt und autoklaviert → Lagerung bei Raumtemperatur

3.4.2 RNA Isolierung mit dem RNeasy Kit Wenn mit weniger als 50 mg nur geringe Mengen an Ausgangsmaterial vorlagen, wurde die

Isolierung von RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) durchgeführt. Hierbei wird die RNA

mit einem Guanidin-Isothiocyanat Puffer lysiert und homogenisiert, anschließend an eine

Membran aus Silikagel gebunden, gewaschen und mit H2O eluiert.

Auf diese Weise können alle RNA Moleküle, die länger als 200 Nukleotide sind, isoliert

werden. Kleinere RNAs, wie die 5.8 S (~160 nt), die 5 S (~120 nt) und tRNAs (~90 nt)

werden unter den genannten Bedingungen nicht quantitativ gebunden. Da solche RNAs 15-

20% der Gesamt-RNA einer Zelle ausmachen, werden die anderen RNAs auf diese Weise

zugleich angereichert.

Die Isolierung wurde nach Angaben des Herstellers mit dem Protokoll "Isolierung aus

Pflanzen und Pilzen" durchgeführt; als Lysepuffer wurde Puffer RLT verwendet.

Material & Methoden

24

3.5 Elektrophoretische Trennung von RNA Da RNA extrem anfällig für einen Abbau durch die ubiquitär verbreiteten und zudem sehr

stabilen Ribonucleasen ist, müssen bei einer Elektrophorese Puffer- und Gelsysteme

verwendet werden, die RNasen inhibieren. Ferner müssen denaturierende Bedingungen

geschaffen werden, da die einzelsträngige RNA sonst intramolekulare und intermolekulare

Basenpaarungen zwischen kurzen Regionen komplementärer Sequenzen ausbilden würde,

was zu einer Faltung und damit zu einer veränderten Wanderungsgeschwindigkeit im Gel

führen würde. Daher werden zur Denaturierung der RNA Gele verwendet, in denen sowohl

im Probenauftragspuffer, als auch im Gel selber Formaldehyd enthalten ist (LEHRACH et al.

1977), das kovalent mit den Aminogruppen von Adenin, Guanin und Cytosin reagiert und so

die Bildung von Basenpaarungen verhindert. Die Gelelektrophoresen der RNA erfolgten in

Horizontalgelkammern mit einem Gelvolumen von 30 ml und einem maximalen

Probenvolumen von 20 µl. Vor dem Giessen der Gele wurden die Kammern für 60 min mit

3%igem H2O2 befüllt und anschließend mit DEPC-H2O gut gespült. Für ein 1%iges Gel

wurden 0.3 g Agarose mit 25.5 ml DEPC-H2O in der Mikrowelle aufgekocht und 1.5 ml

Formaldehyd sowie 3.0 ml 10x MEA-Puffer (MOPS-EDTA-NaAc) erst nach dem Abkühlen

auf ca. 60°C zugegeben und das Gel gegossen. Das Abkühlen ist erforderlich, um eine

Degradierung der im MEA-Puffer enthaltenen [3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure)] zu

verhindern, die zu einem Verlust der Pufferkapazität führen würde; es vermindert zugleich

auch die Entstehung von Formaldehyddämpfen.

Während des Aushärtens der Gele wurden die Proben auf Eis vorbereitet. Nach Zugabe von

drei Volumeneinheiten RNA-Cocktail zu einer Volumeneinheit RNA (5-25 µg) wurden die

Proben durchmischt, für 10 min bei 65°C denaturiert und bis zum Beladen der Gele auf Eis

gelagert. Der Gellauf erfolgte für 30 min bei 100 V und variabler Stromstärke. Als Laufpuffer

wurde 1 x MEA verwendet. Die Detektion erfolgte wie unter ! 3.7 beschrieben.

3.5.1 Lösungen für die elektrophoretische Trennung von RNA • MEA-Puffer 10 x:

0.2 M MOPS [3-(N-Morpholino)

-Propansulfonsäure)], pH 7.0

(41.8 g / l)

0.01 M EDTA (20 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0)

0.05 M Natriumacetat (6.8 g / l)

Material & Methoden

25

Nach Zugabe von ca. 900 ml DEPC-H2O wird der pH-Wertes mit KOH auf 7.0

eingestellt. Nach Auffüllen auf 1000 ml wird das Pufferkonzentrat für 30 min bei 121°C

autoklaviert und anschließend bei RT unter Lichtabschluß gelagert.

• RNA-Ladepuffer 10 x:

0.4 % (w/v) Bromphenolblau (2.5 mg / 10 ml)

0.4 % (w/v) Xylencyanol (2.5 mg / 10 ml)

1 mM EDTA (pH 8.0) (20 µl 0.5 M EDTA / 10 ml)

50 % (v/v) steriles Glycerin (5 ml / 10 ml)

50 % (v/v) DEPC-H2O (5 ml / 10 ml)

Vor der Zugabe von EDTA und Glycerin werden Bromphenolblau und Xylencyanol mit

DEPC-H2O zusammengegeben und über einen Filter mit einer Porenweite von 0.45 µm

abfiltriert. Die Lagerung des Puffers erfolgt bei 4°C.

• RNA-Cocktail [ausreichend zum Auftragen von maximal 195 µl RNA]:

500 µl Formamid

175 µl Formaldehyd

50 µl 10 x MEA

50 µl RNA-Ladepuffer 10 x

5 µl Ethidiumbromid (10 mg / ml)

Dieser Cocktail wird immer frisch angesetzt und bis zu seiner Verwendung unter

Lichtabschluß auf Eis belassen.

3.6 DNA Isolierung Die DNA Isolierungen für die SSU rDNA-Analysen wurden sowohl über klassische Phenol-

Extraktionen [!3.6.1], als auch mit dem DNeasy Mini Plant Kit (Qiagen) [!3.6.2]

durchgeführt.

3.6.1 DNA Isolierung durch Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol Extraktion Die DNA Isolierung durch Phenol Extraktion ist eine Methode, die dazu dient, Proteine aus

dem Gesamtzellextrakt der Organismen zu entfernen. Dazu werden Phenol oder Gemische

Material & Methoden

26

aus Phenol und Chloroform zu den Zellen gegeben, gut durchmischt und abzentrifugiert.

Durch die organischen Lösemittel werden die Proteine ausgefällt, während die Nucleinsäuren

sich in den wäßrigen Phasen befinden. RNA wird durch Zugabe von RNasen abgebaut, wobei

die entstehenden Ribonukleotide sich ebenfalls in den wäßrigen Phasen befinden. Die

Trennung der DNA von der Ribonukleotiden erfolgt über eine Ethanolpräzipitation. Ethanol

fällt in Gegenwart von einwertigen Kationen wie Na+ und bei einer Temperatur von -20°C

Nucleinsäuren sehr wirksam aus. Der DNA Niederschlag kann dann nach Abzentrifugieren

wieder in H2O gelöst werden, während die Ribonukleotide nicht präzipitieren und somit von

der DNA getrennt werden können.

Protokoll zur DNA Isolierung:

• 5-10 ml Zellkultur für 5 min bei 5000 x g abzentrifugieren und das Pellet in 0.5 ml TE-

Puffer aufnehmen.

• 0.5 ml Phenol hinzufügen, durch Auf- und Abpipettieren gut durchmischen und für

10 min bei 15000 x g abzentrifugieren.

•

•

obere wäßrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführen, 0.3 ml Phenol/Chloroform

(1:1) zugeben, gut durchmischen, für 10 min bei 15000 x g abzentrifugieren und den

Reaktionsschritt wiederholen.

obere Phase in neues Reaktionsgefäß überführen, 0.4 ml Chloroform/Isoamylalkohol

(24:1) zugeben, gut durchmischen und für 10 min bei 15000 x g abzentrifugieren.

• obere Phase in neues Reaktionsgefäß überführen, 55 µl 3M Natriumacetat pH 5.2

(Endkonzentration: 0.3M) und 1 ml Isopropanol zugeben, gut durchmischen und für

30 min bei 15000 x g zentrifugieren.

• Pellet in 1 ml 70% Ethanol aufnehmen, für 30 min bei -20°C lagern und anschließend für

5 min bei 15000 x g abzentrifugieren.

• Überstand mit der DNA abpipettieren und für 30 min in einer Vakuumzentrifuge

einengen.

• DNA in 20 µl TE-Puffer aufnehmen, aliquotieren und bei -20°C bis zur weiteren

Verwendung lagern.

Die wäßrigen Phasen sollten mit abgeschnittenen 1000 µl Spitzen abgenommen werden;

dadurch werden Scherkräfte vermindert, die ein Zerstückeln der DNA zur Folge hätten.

Material & Methoden

27

3.6.1.1 Lösungen zur DNA Extraktion

Bei der DNA Isolierung ist darauf zu achten, daß der pH-Wert des Phenols über 7.8 liegt, da

DNA bei niedrigeren pH-Werten zum großen Teil in die organische Phenolphase eindringt

und die Menge an isolierter DNA damit erheblich vermindert wird.

• Phenol Lagerung bei 4°C

• Phenol / Chloroform (24:1) Lagerung bei 4°C, die Lösung ist für 4 Wochen stabil

• Chloroform / Isoamylalkohol (24:1) Lagerung bei 4°C, die Lösung ist für 4 Wochen stabil

• 3 M Natriumacetat, pH 5.2 Lagerung bei 4°C nach 30 minütigem Autoklavieren

• TE-Puffer:

10 mM Tris - HCl (pH 7.4)

1 mM EDTA (pH 8.0)

Lagerung bei 4°C nach 30 minütigem Autoklavieren

3.6.2 DNA Isolierung mit dem DNeasy Kit Ein Teil der DNA Isolierungen erfolgte mit dem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Hierfür

wurden zunächst 5 - 10 ml Kultur für 5 min bei 5000 x g abzentrifugiert, die Zellen in

flüssigem Stickstoff durch Mörsern aufgebrochen und anschließend nach dem Protokoll des

Herstellers verfahren. Bei dieser Isolierung werden zuerst Proteine und Polysaccharide

ausgefällt und durch Zentrifugieren über eine "QIAshredder-Säule" zurückgehalten. Der

Durchfluß mit der DNA wird dann unter hohen Salzkonzentrationen an eine Membran aus

Silikagel gebunden, durch mehrere Waschschritte von restlichen Protein-, Polysaccharid- und

Salzanteilen befreit und anschließend mit einem Puffer geringen Salzgehaltes eluiert. Da im

Kit auch RNase A eingesetzt wird, ist gewährleistet, daß keine Ribonukleinsäuren mitisoliert

werden.

3.7 Elektrophoretische Trennung von DNA Die Gelelektrophoresen von DNA wurden in Horizontalgelkammern mit einem Gelvolumen

von 30 ml durchgeführt. Dazu wurden 1 - 1.2 % Agarose mit 1x Tris-Acetat-EDTA (TAE)-

Puffer in der Mikrowelle kurz aufgekocht, nach Abkühlen auf ca. 60°C mit 3 µl einer 1 %igen

Lösung von Ethidiumbromid versetzt und das Gel gegossen. Das Ethidiumbromid dient dabei

Material & Methoden

28

dem späteren Sichtbarmachen der Banden, da es in die DNA interkaliert und unter UV-Licht

fluoresziert. Nach 30 minütigem Auspolymerisieren wurden eine Volumeneinheit DNA mit

0.2 Volumeneinheiten 5 x Ladepuffer versetzt und die DNA für 30 min bei 100 V und

variabler Stromstärke aufgetrennt. Als Laufpuffer wurde 1 x TAE-Puffer verwendet, als

Längenstandard für den Bereich von 100 - 2072 bp ein 100 bp DNA Marker (GibcoBRL). Für

größere DNA-Fragmente, oder um quantitative Aussagen machen zu können, wurde ein 1kb

DNA Marker (GibcoBRL) eingesetzt, der einen Bereich von 500 bp - 12 kb umfaßt. Dieser

Marker enthält 10 % seiner gesamten DNA Menge in der 1636 bp - Bande; er wurde so

verdünnt, daß in 1.25 µl Marker insgesamt 10 ng DNA enthalten waren.

Die Detektion der DNA erfolgte mittels UV- Durchlichtapparatur mit angeschlossener CCD -

Kamera (Intas). Die Prints wurden mit einem Video-Graphic-Printer (Intas, Modell UP

890CE) auf UPP-110HA Superior Density Printing Paper (Sony®) erstellt.

3.7.1 Lösungen für die elektrophoretische Trennung von DNA • TAE-Puffer 50 x:

40 mM Tris 243.3 g / l

1 mM EDTA (Titriplex III) 18.62 g / l

Der pH-Wert wurde mit Eisessig (ca. 70 ml / l) auf 7.8 eingestellt, der Puffer für 30 min

bei 121°C autoklaviert und anschließend bei RT gelagert.

• DNA Ladepuffer 5 x:

100 mM Tris-Acetat pH 7.5

50 mM EDTA (Titriplex III)

15 % (w/v) Ficoll

0.5 % (w/v) SDS

0.05 % (w/v) Bromphenolblau

0.05 % (w/v) Xylencyanol

Der DNA Ladepuffer wurde für 30 min bei 121°C autoklaviert und anschließend bei RT

gelagert.

Material & Methoden

29

3.8 PCR Mit der von MULLIS et al. (1986) entwickelten Methode der Polymerase-Kettenreaktion

(polymerase chain reaction, PCR) werden selektiv bestimmte Abschnitte der DNA

exponentiell amplifiziert. Die eingesetzten Oligonukleotide [Primer] dienen in dieser

Reaktion als Startermoleküle. Der Abschnitt, den die Primer beidseitig flankieren, wird in

jedem Zyklus der Reaktion verdoppelt. Der Zyklus selber besteht aus drei Schritten:

1. Hitzedenaturierung der doppelsträngigen DNA bei 94°C, dabei wird die DNA in

Einzelstränge aufgespalten.

2. Anlagerung der Primer ("Annealing") an die DNA-Einzelstränge bei einer

primerspezifischen Temperatur.

3. Synthese des komplementären DNA-Doppelstranges (Extension) bei der optimalen

Arbeitstemperatur der DNA-Polymerase von 72 - 75°C.

Den Zyklen wird eine 3 minütige Denaturierungsphase vorangestellt, um sicherzustellen, daß

die gesamte eingesetzte DNA in einzelsträngiger Form vorliegt. Am Ende der PCR wird eine

5-10 minütige Extensionsphase angehängt, damit alle PCR Produkte vervollständigt werden

können.

Die Wahl der richtigen Annealingtemperatur ist dabei für das Ergebnis der PCR entscheidend.

Wird sie zu niedrig gewählt, so treten durch unspezifische Primerbindung häufig

Nebenprodukte auf; bei zu hohen Annealingtemperaturen hingegen ist es möglich, daß

überhaupt keine Bindung des Primers an die DNA-Matritze stattfindet, und damit kein PCR

Produkt entstehen kann. Die maximalen zu wählenden Annealingtemperaturen für Primer

berechnen sich nach folgender Formel:

Tm= [4°C x (C+G)+ 2°C x (A+T)]

Tm entspricht dabei der maximalen Annealingtemperatur, die sich aus der Summe der Anzahl

der einzelnen Basen im Primer, die dann mit einem spezifischen Faktor multipliziert werden,

zusammensetzt. Oberhalb dieser Temperaturen "schmelzen" die Primer, eine Bindung an das

Template (DNA oder RNA) ist nicht mehr gewährleistet. Die optimale Annealingtemperatur

muß für jede Zielsequenz empirisch ermittelt werden.

Auf der nächsten Seite sind zwei typische PCR-Protokolle zur Amplifizierung von

Paraxonemalstab-DNA und SSU rDNA aufgeführt.

Material & Methoden

30

PCR Bedingungen: Paraxonemalstab-DNA SSU rDNA Initiale Denaturierung 94°C 3 min 94°C 3 min 30 Zyklen: Denaturierung 94°C 1 min 94°C 1 min Annealing 46-53°C 1 min 48-52°C 1 min Extension 72°C 3 min 72°C 2 min Finale Denaturierung 72°C 10 min 72°C 10 min Schluß (endlos) 4°C 30 min 4°C 30 min

Die PCR wurde mit DNA Polymerasen verschiedener Hersteller durchgeführt, eine genaue

Zusammensetzung der PCR-Ansätze und die optimalen Annealingtemperaturen für die

einzelnen untersuchten Spezies befindet sich in Anhang 1.

3.8.1 Primerdesign Für das Erstellen von Primern wurden mit dem Programm ClustalX (THOMPSON et al. 1997)

Alignments mit bekannten Sequenzen von Paraxonemalstabgenen verschiedener

Trypanosomatiden und Euglena gracilis durchgeführt. Alle dort zu findenden

hochkonservierten Bereiche wurden anschließend nach den Vorgaben von RYCHLIK (1995 a,

b) auf geeignete Primeransatzstellen getestet. Mit Hilfe des Programms OLIGO V 4.0

(RYCHLIK & RHOADS 1989) wurden die neu konstruierten Primer auf ihre Qualität überprüft.

Die Primer PAR 9 (forward) und PAR 6 (reverse) umfassen ein 805 bp großes Fragment der

cDNA für Paraxialstabgene, das sowohl hochkonservierte als auch variable Bereiche enthält.

Als interne Kontrolle innerhalb einer "nested PCR" wurde der forward Primer PAR 5R

gewählt, dieser Primer bildet zusammen mit PAR 6 ein 323 bp großes Fragment, das

innerhalb des 805 bp Bereiches liegt.

Primersequenzen für die Gene des Paraxonemalstabes :

PAR 5R: 5'– GAR ATY GAC CGC AAC ATC –3'

PAR 9: 5'– ATC CAG AAG GCT GAT TTG GA –3'

R = A oder G S = C oder G Y = C oder T

PAR 6: 5'– CAA TCT TSA CCT CCT CYT –3'

Die Primer für die Gene der kleinen ribosomalen Untereinheit wurden freundlicherweise von

Ingo Busse (Universität Bielefeld) zur Verfügung gestellt. Mit den Primern AP 3 (forward)

Material & Methoden

31

(reverse) wurden zur Amplifikation des hinteren Teils der SSU rDNA verwendet. Die

Sequenzen, die mit diesen beiden Primerpaaren erhalten wurden, weisen einen überlappenden

Bereich von ca. 800 bp auf.

Primersequenzen für die SSU rDNA:

AP 3: 5'– TTT CAA GGA CTA AGC CAT GCA –3'

AP 5: 5'– CAA CTG GAG GGC AAG TCT GG –3'

AP 6: 5'– GTT GAG TCA AAT TAA GCC GCA –3'

AP 8: 5'– TCA CCT ACA GCW AAC TTG TTA CGA C–3' W = A oder T

Die Primer wurden von Ark Scientific und MWG Biotech bezogen.

3.9 RT-PCR Dient mRNA oder Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial für die PCR, so muß vor der

eigentlichen PCR eine Reverse Transkription [RT] durchgeführt werden. Die Reaktion wird

mit der RNA-abhängigen DNA-Polymerase Reverse Transkriptase durchgeführt, wobei als

Produkt eine zur eingesetzten RNA-Matrize komplementäre Einzelstrang-DNA

[complementary DNA, cDNA] gebildet wird. Diese cDNA wird dann in der nachfolgenden

PCR zur Doppelstrang-DNA ergänzt.

Die RT-PCR wurde entweder mit dem RT-PCR Access System (Promega) [! 3.9.1] oder mit

dem Reverse Transcription System (Promega) [! 3.9.2] durchgeführt.

3.9.1 RT-PCR mit dem Access RT-PCR System Das Access RT-PCR System (Promega) erlaubt die gleichzeitige Durchführung der Reversen

Transkription und der nachfolgenden PCR in einem Ansatz (MILLER & STORTS 1995). In

diesem System werden bereits zu Beginn die spezifischen Primer zugegeben, so daß keine

Gesamtmatrize der RNA erstellt, sondern nur der Bereich aufwärts des näher am 3' Ende der

RNA liegenden Primers in cDNA umgeschrieben wird. Nach dem Denaturieren der RNA und

der Reversen Transkriptase erfolgt in einer PCR die Anlagerung des zweiten Primers an die

einzelsträngige cDNA, die dann in der PCR zum Doppelstrang ergänzt, und nachfolgend

amplifiziert wird.

Material & Methoden

32

einzelsträngige cDNA, die dann in der PCR zum Doppelstrangergänzt, und nachfolgend

amplifiziert wird.

Als Reverse Transkriptase wird in diesem System die AMV RT [Avian Myeloblastosis Virus]

eingesetzt; die Tfl DNA Polymerase stammt aus Thermus flavus.

Die einzusetzende Menge an RNA sollte in einem Bereich von 10 pg bis 1 µg liegen.

RT-PCR Bedingungen: Synthese des ersten cDNA Stranges 48°C 45 min Denaturieren der RNA und der Reversen Transkriptase 94°C 2 min Synthese des zweiten cDNA Stranges und Amplifizieren der DNA 40 Zyklen: • Denaturierung 94°C 1 min

• Annealing 46-53°C 1 min • Extension 72°C 3 min

Finale Denaturierung 72°C 10 min Abkühlen 4°C 30 min

Die RT-PCR wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt, wobei die Volumina für

einen Ansatz jeweils halbiert wurden:

Bestandteile Volumen 1x Endkonzentration Nucleasefreies Wasser X µl AMV/Tfl 5x Reaktionspuffer 5.0 µl 1 x dNTP-Mix (jedes dNTP 10mM) 0.5 µl 0.2 mM Primer (forward) 50 pmol 1.0 µM Primer (reverse) 50 pmol 1.0 µM 25 mM MgSO4 1.0 µl 1.0 mM AMV Reverse Transkriptase (5 U/µl) 0.5 µl 0.1 U/µl Tfl DNA Polymerase (5 U/µl) 0.5 µl 0.1 U/µl RNA Isolat Y µl Endvolumen 25 µl

3.9.2 RT-PCR mit dem Reverse Transcription System Das Reverse Transcription System (Promega, A3500) trennt im Gegensatz zum Access RT-

PCR System den Vorgang der Reversen Transkription und der PCR voneinander. Hier

werden zuerst Oligo-(dT)-Primer an die Poly-(A)-Überhänge der mRNA angeheftet, die

gesamte cDNA synthetisiert, und danach das RNA Template denaturiert. Erst in einer

anschließenden PCR erfolgt die Anlagerung der für den gesuchten Genabschnitt spezifischen

Primer an die einzelsträngige cDNA. Als Reverse Transkriptase wurde AMV RT [Avian

Myeloblastosis Virus] eingesetzt (GOODMAN & MACDONALD 1979).

Dieses System hat den Vorteil, daß mit der vorliegenden cDNA und entsprechenden Primern

verschiedene Gene untersucht werden können. Stehen für die Reverse Transkription

Material & Methoden

33

allerdings nur geringe Mengen an RNA zur Verfügung, und möchte man ein Gen mit geringer

Kopienzahl untersuchen, so besteht der Nachteil darin, daß die Ziel-cDNA für dieses Gen

durch die finale Verdünnung und Aliquotierung nicht in allen Aliquots vorliegt.

Lagen nur geringe Mengen an RNA vor, so wurde die Originalvorschrift derart modifiziert,

daß während der Reversen Transkription die Oligo-(dT)-Primer durch die spezifischen Primer

für das gesuchte Gen ersetzt wurden. modifiziertes Protokoll des Reverse Transcription Systems für einen Ansatz:

Nukleasefreies Wasser 7.75 µl Reverse Transkription 10 x Reaktionspuffer 2.0 µl MgCl2, 25 mM 4.0 µl dNTP-Mix (jedes 10 mM) 2.0 µl Recombinant RNasin®Ribonuclease Inhibitor 0.5 µl Spezifischer Primer forward (50 pM/µl) 1.0 µl Spezifischer Primer reverse (50 pM/µl) 1.0 µl AMV Reverse Transkriptase (20 U/µl) 0.75 µl 1.0 µg RNA 1.0 µl

Die Reverse Transkription wurde 20 min bei einer Temperatur von 48°C durchgeführt, das

RNA Template dann 5 min bei 99°C denaturiert und die cDNA für 5 min bei 4°C gelagert.

Nach der Reaktion wurden 80 µl nucleasefreies H2O in den Ansatz pipettiert, dieser

aliquotiert und die Aliquots bis zur Verwendung in einer PCR bei -20°C gelagert. Als Vorlage

für einen PCR Ansatz wurden 10 µl dieser verdünnten cDNA eingesetzt.

3.10 Extraktion von DNA Fragmenten aus Agarosegelen Extraktionen von DNA Fragmenten aus Agarosegelen wurden immer dann durchgeführt,

wenn in PCR Produkten mehrere ähnlich stark fluoreszierende Banden auftraten, die im

Bereich der erwarteten Größe des gesuchten Produktes lagen. Da in diesem Fall nicht

eindeutig war, in welcher Bande sich ein Teilstück des gesuchten Gens befand, mußte für

weitere Analysen als erstes eine Trennung der Banden durchgeführt werden. Dazu wurde das

gesamte PCR Produkt auf ein 1.2 % iges Agarosegel (! 3.7) aufgetragen und die Laufzeit zur

besseren Auftrennung der eng beieinander liegenden Banden auf 40 bis 50 min erhöht.

Anschließend wurde das Gel unter UV-Licht betrachtet (UVIS, Fa. Desaga), die einzelnen

Banden mit sterilen Skalpellen ausgeschnitten und in vorher abgewogene Eppendorf-Gefäße

überführt. Auf 1 mg Gelstück wurden 5-50 µl H2O pipettiert, diese Mischung zum Lösen der

Material & Methoden

34

Agarose für 5 min in einem Wasserbad bei 65°C erwärmt und gut durchmischt. Die

Identifizierung der Bande, in der sich ein Stück DNA des gesuchten Gens befand, erfolgte

über eine nachfolgend durchgeführte PCR. Dabei wurden zum einen wieder die zuvor

verwendeten Primer eingesetzt und in einem weiteren Ansatz interne Primer, die ein kleineres

Teilstück des Gens umfaßten. Für diese PCR wurden 1-2 µl des DNA-Agarose-H2O

Gemisches eingesetzt.

3.11 Reinigen von PCR Produkten Die PCR Produkte wurden mit dem Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen) oder mit dem

E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit (Peqlab) nach Herstellerangaben gereinigt. Das Prinzip dieser

Reinigung beruht auf einer Bindung der DNA an eine Silikagel-Membran; durch

Waschschritte werden alle anderen Komponenten des PCR Ansatzes entfernt und die

gereinigte DNA kann anschließend in einem definierten Volumen H2O aufgenommen

werden.

3.12 Klonierung Alle Klonierungen wurden mit dem TOPOTM TA Cloning Kit, Version H, (Invitrogen)

durchgeführt, wobei chemisch kompetente Escherichia coli Zellen des Stammes TOP10F'

eingesetzt wurden. Die Plasmidvektoren im Kit (pCR 2.1-TOPO ) liegen linearisiert vor und

besitzen Thymidin Überhänge an den 3' - Enden (= T-tail Vektoren), an die das Enzym Topo-

isomerase I gebunden ist. Die Ligation des PCR Produktes in das Plasmid erfolgt über die

Bindung der von der Taq-Polymerase an die 3' - Enden des amplifizierten PCR Produktes

angehängten Poly (A) - Enden mit den Thymidin-Anhängen des Vektors und wird durch die

Topoisomerase I vermittelt (SHUMAN 1994). Die vom Hersteller empfohlenen Mengen für

einen Ligationsansatz wurden auf die Hälfte reduziert. Wenn die Konzentration des zu

klonierenden PCR Produktes unter 5 ng / µl DNA lag, wurde die Menge des gereinigten PCR

Produktes maximal auf das doppelte Volumen des vom Hersteller empfohlenen Wertes

erhöht.

In der nachfolgenden Transformation werden die Plasmide mittels Hitzeschock in die

Bakterienzellen importiert und anschließend wird deren Stoffwechsel durch Inkubation in

einem Nährmedium aktiviert.

Material & Methoden

35

Diejenigen Bakterien, die Plasmide aufgenommen haben, besitzen jetzt eine durch

β-Lactamase vermittelte Ampicillinresistenz und können über dieses Antibiotikum selektiert

werden.

Nur die Plasmide enthalten das lacZ-Gen, das für die β-Galactosidase kodiert. Die Expression

dieses Gens wird durch das Lactoseanalogon Isopropyl β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG)

induziert. Die β-Galactosidase spaltet nachfolgend 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-

Galactopyranosid (X-Gal) in den blauen Farbstoff 5-Brom-4-Chlorindigo und in die

Zuckerkomponente Allolactose. Das Einbringen von Fremd-DNA in die Plasmide geschieht

an einer definierten Stelle im lacZ-Gen und führt dazu, daß keine β-Galactosidase mehr

gebildet wird. Dadurch kann keine Spaltung von X-Gal erfolgen, und die Klone sind nicht

angefärbt. Die Kolonien der Bakterien, die ein Plasmid ohne Fremd-DNA aufgenommen

haben, sind dagegen dunkelblau gefärbt.

Pro Klonierung wurden auf zwei LB Amp+ Agarplatten je 40 µl IPTG (20 mg / ml) und X-Gal

(20 mg / ml) ausplattiert, die Platten für 30 min bei 37°C gelagert und anschließend je

50 - 150 µl der Transformationsansätze ausplattiert. Die Platten wurden abschließend für

12-16 h bei 37 °C inkubiert.

3.12.1 Lösungen für die Klonierung • Luria Bertani Medium (LB) (verändert nach SAMBROOK et al. 1989):

1.0 % (w/v) Trypton (Oxoid) 1.0 g / 100 ml

0.5 % (w/v) Hefeextrakt (Oxoid) 0.5 g / 100 ml

0.5 % (w/v) NaCl (Merck) 0.5 g / 100 ml Für LB Agarplatten wird hinzugefügt:

1.5 % (w/v) Agar (AppliChem) 1.5 g / 100 ml

Das LB Medium wird bei 121°C für 20 min autoklaviert und vor der Zugabe von

Ampicillin (Endkonzentration 100 µg / ml) auf 50°C heruntergekühlt, da Ampicillin bei

höheren Temperaturen zerfällt. Zur Herstellung von LB Amp+ Agarplatten sollte aus

diesem Grund ein steriler Magnetrührfisch vorliegen und die Agarlösung unter Rühren

abgekühlt werden, da diese ansonsten bereits partiell auspolymerisiert.

Ampicillin Stammlösung (50 mg / ml H2O) 200 µl / 100 ml

! Lagerung bei �20°C

Material & Methoden

36

• Isopropyl β-D-Thiogalactopyranosid

IPTG (20 mg / ml H2O) ! Lagerung bei �20°C

• 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Galactopyranosid

X - Gal (20 mg / ml Dimethylformamid) ! Lagerung bei �20°C unter Lichtabschluß

3.12.2 Flüssigkulturen Um für weitere Untersuchungen eine ausreichende Menge an amplifizierter DNA zur

Verfügung zu haben, erfolgte der Ansatz von Flüssigkulturen. Dazu wurde in zuvor für 6 h

bei 150°C sterilisierte Reagenzgläser 2 ml LB Medium gegeben, mit autoklavierten

Zahnstochern einige Zellen der zu untersuchenden Klone von den Agarplatten abgenommen

und zusammen mit dem Zahnstocher in das Medium überführt. Die Kulturen wurden

anschließend für 12-16 h bei 37°C und 200 rpm in einem Schüttler (Infors) inkubiert und bis

zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.

Um in der nachfolgenden Charakterisierung der Plasmide [! 3.12.3] eindeutige Aussagen

über das Vorhandensein eines Inserts machen zu können, wurden als Negativkontrolle

zusätzlich dunkelblau angefärbte Klone ohne Insert in Flüssigkultur genommen.

3.12.3 Charakterisierung der Plasmide Die Charakterisierung der Plasmide erfolgt durch Untersuchung auf ihre Größe (HILLIS et al.

1996). Mit organischen Lösemitteln werden die Bakterienzellen aufgebrochen, die DNA

durch Zentrifugieren von den anderen Zellbestandteilen abgetrennt und auf einem 1%igen

Agarosegel aufgetrennt. Plasmide mit einkloniertem Insert können aufgrund ihrer Größe von

Plasmiden ohne Insert unterschieden werden. Optional kann ein Längenstandard mit auf dem

Gel aufgetragen werden, wobei zu beachten ist, daß die Vektoren in einer �supercoiled�-

Konformation vorliegen und damit eine größere Laufstrecke zurücklegen als der linear

vorliegende Marker. Mit einiger Erfahrung kann aber trotzdem auf die ungefähre Größe der

einklonierten Fremd-DNA geschlossen werden, und Klone, in denen ein Insert unerwünschter

Größe vorliegt, auf diese Weise ausselektiert werden. Die Existenz solcher Klone beruht

darauf, daß während der PCR in geringen Mengen Nebenprodukte entstehen, deren

Material & Methoden

37

Konzentration allerdings häufig so gering ist, daß eine Detektion dieser Banden unter UV-

Licht nicht möglich ist.

Zur Charakterisierung der Plasmide wurden je 25 µl Flüssigkultur mit 25 µl PCI-Lösung

zusammengegeben und kräftig durchmischt. Nach Abzentrifugieren für 5 min bei 7000 x g

bildeten sich zwei Phasen, eine untere organische Phase mit aufliegenden ausgefällten

Proteinen und eine obere wäßrige Phase, in der sich die Nucleinsäuren befanden. Jeweils 5 -

10 µl der wäßrigen Phase wurden mit 1 - 2 µl 5x DNA-Ladepuffer [! 3.7.1] vermischt und

die Proben auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt.

• PCI: Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1)

Die Mischung wird stark geschüttelt und kurzzeitig bei 4°C gelagert. Es bilden sich 2

Phasen, wobei sich die wäßrige Phase über der zu verwendenden PCI-Phase befindet.

Die Lösung kann bei 4°C maximal 4 Wochen gelagert werden.

3.12.4 "Colony"-PCR zur Charakterisierung der Inserts Diese Methode wird durchgeführt, um sicherzustellen, daß es sich bei den Inserts auch

wirklich um die gesuchten Gene handelt und nicht um mögliche einklonierte

Verunreinigungen, die zufällig eine identische Größe aufweisen. In einer Colony-PCR

(CPCR) wird nicht die gereinigte DNA, sondern einige Klonzellen aus den Kolonien oder die

aus den Klonen angesetzten Flüssigkulturen als Ausgangsmaterial für die PCR eingesetzt.

Mit autoklavierten Zahnstochern wurden aus dem Zentrum der Kolonien einige Zellen

abgenommen und am Boden der PCR Gefäße abgeschabt. Alternativ wurden 20 µl

Flüssigkultur (! 3.12.2) direkt in ein PCR-Gefäß pipettiert, bei 10000 x g für 1 min

abzentrifugiert und 1 x mit H2O nanopore gewaschen. Dieses Bakterienpellet diente als Vorlage

für die PCR.

Die Amplifizierung wurde mit den Primern durchgeführt, mit denen das PCR Produkt für die

Klonierung erhalten wurde, zusätzlich wurden als Kontrolle interne Primer verwendet.

Unterschiede im Vergleich zu einer PCR mit DNA als Ausgangsmaterial bestehen in einer

verlängerten initialen Denaturierungsphase, die den Aufbruch der Bakterienzellen bewirkt

und in einer Reduzierung der Extensionszeit und Zyklenzahl, da das Template in hohen

Mengen vorliegt. In der Colony-PCR wurden sowohl die Mengen der verwendeten

Chemikalien als auch das Ansatzvolumen reduziert (= 12 µl / Ansatz).

Material & Methoden

38

Ein typisches Colony PCR Protokoll unter Verwendung der Red-Taq Polymerase (Sigma) ist

untenstehend angegeben:

Colony PCR PCR-Bedingungen Bestandteile für 2 Ansätze Initiale Denaturierung 94°C 10 min H2O nanopore 17.75 µl 25-35 Zyklen Red-Taq-PCR-Puffer 2.5 µl Denaturierung 94°C 1 min dNTP's 2.5 mM each 2.0 µl Annealing 50°C 1 min Primer forward (10 pM/µl) 0.5 µl Extension 72°C 2 min Primer reverse (10 pM/µl) 0.5 µl Finale Denaturierung 72°C 10 min Red-Taq-Polymerase 0.75 µl Abkühlen 4°C 30 min

2-8 µl der Colony PCR Produkte wurden anschließend mit 1-2 µl DNA-Ladepuffer (! 3.7.1)

vermischt und die Proben auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt.

3.12.5 Dauerhafte Aufbewahrung von Klonen Zur dauerhaften Aufbewahrung von Klonen wurden neue Flüssigkulturen angesetzt, wobei

das Ansetzen mit 40 µl einer gesättigten Flüssigkultur als Ausgangsmaterial wie in ! 3.12.2

beschrieben durchgeführt wurde.

Von den frischen Flüssigkulturen wurden je 850 µl mit 150 µl sterilem Glycerin vermischt

und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgt bei -83°C.

3.13 Isolierung von Plasmiden Die Isolierung der Plasmide erfolgte mit dem E.Z.N.A. ® Plasmid Miniprep Kit II (Peqlab).

Die Bakterien werden dabei, unter Zusatz von RNase A, über eine alkalische Lyse

aufgebrochen und das alkalische Lysat anschließend neutralisiert. Nach Abzentrifugieren von

bakteriellem Zelldebris wird der Überstand mit der Plasmid-DNA auf eine HiBind®-

Miniprepsäule geladen. In der Säule bindet die Plasmid-DNA an eine Silikamembran und

wird durch Zugabe eines Waschpuffers von Kontaminationen und Enzyminhibitoren

gereinigt. Im Anschluß an das Trocknen der Säule wird dann die gereinigte Plasmid-DNA in

H2O nanopore aufgenommen. Es wurde nach den Angaben des Herstellers verfahren, wobei

anstelle von Flüssigkulturen direkt bakterieller Rasen eingesetzt wurde.

Zur Isolierung von Plasmid-DNA für eine nachfolgende Sequenzierung wurden 100 - 200 µl

der Flüssigkulturen auf LB Amp+ Agarplatten ausgestrichen und für 12 - 16 Stunden bei

Material & Methoden

39

37°C inkubiert. Der gewachsene Bakterienrasen wurde mit einer sterilen Glaspipette

abgeschabt und laut Protokoll weiterverarbeitet.

3.14 Sequenzierung Die Sequenzierungen wurden mit einem Licor Sequenzierer von der Firma IIT Biotech /

Bioservice an der Universität Bielefeld durchgeführt, wobei eine enzymatische, nicht

radioaktive Didesoxy-Sequenzierung modifiziert nach SANGER et al. (1977) zur Anwendung

kam. Zuerst werden hierbei in einer Cycle-Reaktion Kopien der zu sequenzierenden DNA

hergestellt. Zusätzlich befinden sich dabei neben den dNTPs in geringen Mengen ddNTPs im

Reaktionsansatz. Deren Einbau in die DNA führt zum Abbruch der Reaktion, da dann in der

2-Desoxyribose keine 3' OH-Gruppe zur Bildung der nächsten Phosphodiesterbindung mehr

zur Verfügung steht. Die einzelnen ddNTPs sind mit unterschiedlichen Rhodaminen

fluoreszenzmarkiert, deren Strahlung dann während der Sequenzierung gemessen wird.

3.15 Restriktionsspaltungen Die Primer für die Gene, die für die beiden Hauptproteine des Paraxonemalstabes (PAR 1 und

PAR 2) kodieren, stammen aus hochkonservierten Bereichen, die innerhalb dieser beiden

Gene identisch sind. Eine Unterscheidung von par1 und par2 war somit nur mit Hilfe von

Restriktionsspaltungen möglich.

Nachdem von jedem untersuchten Organismus eine für ein PAR-Protein kodierende Sequenz

vorhanden war, wurden die Sequenzdaten aligniert (!3.17.4), um die Sequenz als für PAR 1

oder PAR 2 kodierend einordnen zu können. Anschließend wurden innerhalb des Alignments

konservierte Bereiche gesucht, an denen sich par1 und par2 unterscheiden lassen. Diese

Bereiche wurden dann auf potentielle Restriktionsenzymschnittstellen untersucht.

War von einer Art bereits ein par1 Genstück bekannt, so konnte das Bandenmuster, das sich

durch Spaltung mit einem bestimmten Restriktionsenzym für par1 ergäbe, berechnet werden.

Das mögliche Spaltungsmuster für das von dieser Art noch nicht vorhandenem par2 Gen

konnte anhand der bereits sequenzierten par2 Gene anderer Arten vorhergesagt werden.

Zur Unterscheidung von par1 und par2 wurden die Restriktionsenzyme Alw21I, BbsI, BclI,

BglII, EcoRI, HindIII, HinfI, NspI und PvuII herangezogen. Tabelle 3-2 zeigt eine Übersicht

der einzelnen Enzyme, ihrer spezifischen Schnittstellen sowie der verwendeten Puffer und

Bezugsquellen.

Material & Methoden

40

Enzym aus Schnittstelle (*) Puffer (10x) Firma Alw21I Acinetobacter

lwoffi RFL21 5'...G W G C W*C...3' 3'...C*W C G W G...5'

Buffer green Eurogentech

BbsI Bacillus laterosporus

5'...G A A G A C (N)2*...3' 3'...C T T C T G (N)6*...5'

NEB 2 New England Biolabs

BclI Bacillus caldolyticus

5'...T*G A T C A...3' 3'...A C T A G*T...5'

REACT 2 GibcoBRL

BglII Bacillus globigii

5'...A*G A T C T...3' 3'...T C T A G*A...5'

REACT 3 GibcoBRL

EcoRI Escherichia coli BS 5

5'...G*A A T T C...3' 3'...C T T A A*G...5'

H Boehringer Mannheim

HindIII Haemophilus influenzae Rd

5'...A*A G C T T...3' 3'...T T C G A*A...5'

Buffer green + DTT

Eurogentech

HinfI Haemophilus influenzae Rf

5'...G*A N T C...3' 3'...C T N A*G...5'

REACT 2 GibcoBRL

NspI Nostoc C 5'...R C A T G*Y...3' 3'...Y*G T A C R...5'

NEB 2 + BSA

New England Biolabs

PvuII Proteus vulgaris

5'...C A G*C T G...3' 3'...G T C*G A C...5'

REACT 6 GibcoBRL

Tab. 3-2: Übersicht über die Restriktionsenzyme, die zur Unterscheidung von par1 und par2 herangezogen wurden. Als Ausgangsmaterial für die Spaltungen dienten alle mit den Primern PAR 9 und PAR 6

erstellten Colony-PCR-Produkte (805 bp), die zusätzlich ein positives internes Kontroll-

produkt mit den Primern PAR 5R und PAR 6 zeigten. Dabei war es wichtig, auch Colony-

PCR-Produkte des bereits sequenzierten Klones einer Art mitzuspalten, da das theoretisch

berechnete Spaltungsmuster nicht immer mit dem im Versuch ermittelten übereinstimmen

muß. Abweichungen treten beispielsweise dann auf, wenn Schnittstellen methyliert vorliegen,

da einige Restriktionsenzyme dort nicht schneiden können.

Für Spaltungsansätze wurden jeweils 1 bis 5 µl Colony-PCR Produkt mit 1 bis 4 units Enzym

und 2 µl des jeweiligen Puffers zusammenpipettiert und mit H2Onanopore auf ein Endvolumen

von 20 µl aufgefüllt. Bei Spaltungen mit Hind III war eine Zugabe von Dithiothreitol auf eine

Endkonzentration von 1 mM notwendig (0.4 µl 50 mM DTT / 20 µl Ansatz). Bei Verwen-

dung von NspI wurden 2 µg BSA pro 20 µl Ansatz hinzugefügt (0.2 µl einer BSA

Stammlösung von 10 mg / ml).

Die Spaltungsansätze wurden für 60 min bei 37°C im Mastercycler (Eppendorf) inkubiert,

wobei die Temperatur des beheizbaren Deckels ebenfalls auf 37°C programmiert wurde.

Anschließend wurden 15-20 µl der Ansätze auf ein 1%iges Agarosegel (! 3.7) aufgetragen

und nach dem Gellauf ausgewertet.

Material & Methoden

41

3.16 Phylogenetische Rekonstruktion anhand morphologischer Merkmale Um eine kladistische Analyse anhand morphologischer Merkmale durchführen zu können,

müssen Merkmale gefunden werden, die durch eindeutige Merkmalszustände beschrieben

werden können.

3.16.1 Kladistische Analyse Für eine kladistische Analyse zur phylogenetischen Rekonstruktion werden diese

charakteristischen morphologischen Merkmale in eine Matrix transformiert und mit dem

Programm PAUP*4.0b4a (SWOFFORD 1998) ausgewertet. Dabei werden Apomorphien und

Plesiomorphien nicht definiert, eine Richtung ist somit nicht vorgegeben. Tabelle 3-3 zeigt

die berücksichtigten Merkmale und ihre jeweiligen Zustände:

Merkmale Merkmalszustand a Anzahl Geißeln 1: eine, 2: zwei b Ausprägung Geißeln 1: eine emergent + 1 PAR, 2: zwei emergent + 2 PARs c Stigma 1: vorhanden, 2: nicht vorhanden d Chloroplasten 1: vorhanden, 2: nicht vorhanden e Paramylon 1: vorhanden, 2: nicht vorhanden f Kinetoplast 1: vorhanden, 2: nicht vorhanden g Scroll 1: vorhanden, 2: nicht vorhanden h Pellikula 1: flexibel, 2: rigide, 3: flexibel + Organismen nicht metabol i Ernährungsmodus 1: osmotroph ohne Lichtperzeptionsorgan, 2: osmotroph mit

Lichtperzeptionsorgan, 3: phagotroph, 4: phototroph, 5: parasitär k SSU rDNA-Größe 1: unter 2700 nt, 2: über 2700 nt

Tab. 3-3: Zusammenstellung der Merkmale und ihrer Merkmalszustände, die in eine kladistische Analyse einfließen.

3.17 Phylogenetische Analyse und Rekonstruktion anhand molekularer Merkmale Zur phylogenetischen Rekonstruktion anhand molekularer Merkmale wurden SSU rDNA

Sequenzen und Paraxonemalstabsequenzen herangezogen. Wie in einer morphologischen

Matrix werden hier Nukleotide (Nukleotidpositionen) und ihre Zustände (ATCG─)

homologisiert.

Material & Methoden

42

3.17.1 Wahl der Außengruppe für die phylogenetische Rekonstruktion Phylogenetische Rekonstruktionen anhand molekularer Merkmale führen zu ungewurzelten

Stammbäumen, in denen über die evolutionäre Richtung der Merkmale keine Aussage

gemacht werden kann. Erst durch das sogenannte "Wurzeln" mit einer Außengruppe wird die

Richtung festgelegt. Die gewählte Außengruppe sollte daher von der zu untersuchenden

Innengruppe gut abgrenzbar sein, andererseits aber auch gemeinsame Merkmale mit dieser

aufweisen und somit in nicht zu entfernter Verwandtschaft mit ihr stehen.

Für die phylogenetische Rekonstruktion anhand der kleinen Untereinheit der ribosomalen

RNA wurden als Außengruppenvertreter neben den ebenso wie die Euglenida an der Basis

der Eukaryoten stehenden Physarum polycephalum (Physarida) und Dictyostelium discoideum

(Dictyosteliida) zusätzlich noch Arxiozyma telluris (Fungi), Chilomonas paramecium

(Cryptophyta), Marchantia polymorpha (Viridiplantae), Paramecium tetraurelia (Alveolata),

Proteromonas lacertae (Stramenopila) und Saccharomyces cerevisiae (Fungi) gewählt. Diese

Vertreter haben sich in phylogenetischen Rekonstruktionen als gut geeignet erwiesen (BUSSE

1999, PREISFELD et al. 2000b).

Die Wahl der Außengruppe bei den Analysen der beiden Paraxonemalstabgene erweist sich

als weitaus schwieriger. Paraxonemalstabsequenzen sind nur innerhalb der Euglenozoa

verfügbar. Die Kinetoplastida als Schwestergruppe der Euglenida sind nicht als Außengruppe

geeignet.

3.17.2 Formatierung von Sequenzdaten Die erhaltenen Sequenzdaten wurden im Internet mit Hilfe des BCM Search Launchers

(http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/SearchLauncher/, SMITH et al. 1996) unter der Option

"sequence utilities" (http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-util/seq-util.html) in ein für

weitere Programme kompatibles "fasta" Format überführt. Hier wurden die Sequenzen

gegebenenfalls auch revers und komplementär umgeschrieben, ebenso erfolgte unter der

Option "6 frame translation" die Transformation der Paraxonemalstabsequenzen in die sechs

möglichen Leseraster.

Material & Methoden

43

3.17.3 Überprüfen von Sequenzen Eine erste Überprüfung der Sequenzdaten erfolgte mit dem Internet Programm BLAST

(Basic local alignment search tool; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, ALTSCHUL et al.

1990) des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesa, MD, USA. Hier

werden die vom Benutzer eingegebenen Nucleinsäure- oder Proteinsequenzen mit bereits

vorhandenen Sequenzen der Datenbank GenBank des National Center for Biotechnology

Information (NCBI) verglichen, wobei als Resultat Sequenzen mit der höchsten

Übereinstimmung angezeigt werden.

Vor der Eingabe von Daten wurden störende Vektorreste sowie die spezifischen Primer

entfernt. Das Entfernen dieser Oligonukleotide war dabei notwendig, da das Programm

BLAST sonst bereits allein aufgrund der Primersequenzen eine große Ähnlichkeit zum

gesuchten Gen feststellen kann, auch wenn die eigentliche Sequenz nicht der des gesuchten

Gens entspricht.

3.17.4 Alignierung Die Homologisierung der Sequenzen (Alignierung) bildet die Basis der nachfolgenden

phylogenetischen Rekonstruktion. Da falsche Homologisierungen damit falsche

phylogenetische Rekonstruktionen zur Folge haben können, sollten die Alignments

überprüfbar sein. Im Falle der Gene, die für die Paraxonemalstabproteine kodieren, dürfen in

ein korrektes Nukleotid-Alignment keine einzelnen Lücken ("gaps") eingefügt werden, da es

sonst zu Leserasterverschiebungen kommen würde. Allenfalls dürfte in einer

Nukleotidsequenz eine durch drei teilbare Anzahl von gaps direkt hintereinander stehen, was

bedeuten würde, daß im entsprechenden Organismus an dieser Stelle im Protein mindestens

eine Aminosäure fehlte.

Die Sequenzen der kleinen Untereinheit der ribosomalen rRNA sind aufgrund ihrer

Sekundärstruktur sehr gut überprüfbar. Die Sekundärstruktur setzt sich aus variablen, oftmals

aus "loops" bestehenden Bereichen und aus hochkonservierten Helices zusammen. Da die

Sekundärstruktur der SSU rDNA von Euglena gracilis bekannt ist, kann über diesen

Vergleich das Alignment überprüft werden.

Material & Methoden

44

Für die Alignierung und eine nachfolgende phylogenetische Rekonstruktion wurden aus dem

Internet Programm "Entrez" (BENSON et al. 1999) DNA- und Protein- Vergleichssequenzen

heruntergeladen. Die Adressen der Seiten lauten:

http://www.ncbinlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.html

http://www.ncbinlm.nih.gov/Entrez/protein.html Die einzelnen Sequenzen der SSU rDNA und der Paraxonemalstabgene sind in den

Tabellen 3-4 und 3-5 aufgeführt.

SSU rDNA Accession Nr. Astasia longa

(Euglenida)

AF112871

Distigma curvatum (Euglenida) AF099081 Distigma proteus (Euglenida) AF106036 Euglena gracilis (Euglenida) M12677 Eutreptia viridis (Euglenida) AF157312 Gyropaigne lefèvrei (Euglenida) AF110418 Khawkinea quartana (Euglenida) U84732 Lepocinclis ovata (Euglenida) AF061338 Lepocinclis ovum (Euglenida) AF110419 Peranema trichophorum (Euglenida) U84733 U84734 Petalomonas cantuscygni (Euglenida) U84731 Phacus smulkowskianus (Euglenida) AF119118 Rhabdomonas gibba1) (Euglenida) AF247602 Rhabdomonas incurva1) (Euglenida) AF247601 Rhabdomonas intermedia (Euglenida) AF295020 Rhabdomonas spiralis (Euglenida) AF247599

Bodo caudatus (Kinetoplastida) X53910 Crithidia fasciculata (Kinetoplastida) Y00055 Cryptobia bullocki (Kinetoplastida) AF080224 Leishmania tarentolae (Kinetoplastida) X53916 Trypanosoma brucei (Kinetoplastida) M12676

Arxiozyma telluris (Fungi) Y15849 Chilomonas paramecium (Cryptophyta) L28811 Dictyostelium discoideum (Dictyosteliida) K02641 Marchantia polymorpha (Viridiplantae) X75521 Paramecium tetraurelia (Alveolata) X03772 Physarum polycephalum (Myxomycetes) X13160 Proteromonas lacertae (Stramenopila) U37108 Saccharomyces cerevisiae (Fungi) J01353 M27607

Tab. 3-4: Übersicht der in dieser Arbeit verwendeten Taxa für die phylogenetische Rekonstruktion anhand von Sequenzen der SSU rDNA. 1) : Im Rahmen dieser Arbeit neu ermittelte Sequenzen der SSU rDNA.

Material & Methoden

45

Taxa Bezeichnung der Taxa in dieser Arbeit

Originalbezeichnung Gen Protein

Accession Nr.

Distigma curvatum1) Distigma curvatum par1 PAR 1 AF188118 Gyropaigne lefevrei1) Gyropaigne lefevrei par1 PAR 1 AF263946 Khawkinea quartana1) Khawkinea quartana par1 PAR 1 AF296722 Khawkinea sp. 1) Khawkinea sp. par1 PAR 1 Lepocinclis ovata1) Lepocinclis ovata par1 PAR 1 AF296721 Phacus smulkowskianus1) Phacus smulkowskianus par1 PAR 1 AF188117 Trypanosoma brucei Trypanosoma brucei I pfrc PFR-C Z25827 Trypanosoma cruzi, strain esmeraldo

Trypanosoma cruzi par3a PAR 3 AF005194

Euglena gracilis Euglena gracilis pr40 PR40 AF044217 Khawkinea quartana1) Khawkinea quartana par2 PAR 2 AF263943 Khawkinea sp. 1) Khawkinea sp. par2 PAR 2 Lepocinclis ovata1) Lepocinclis ovata par2 PAR 2 AF263944 Phacus smulkowskianus1) Phacus smulkowskianus par2 PAR 2 AF296720 Leishmania mexicana mexicana NYC/BZ/62/M379

Leishmania mexicana pfr2c PFR-2C U45884

Trypanosoma cruzi, strain esmeraldo

Trypanosoma cruzi par2 PAR 2 M97548

Trypanosoma brucei Trypanosoma brucei I pfra PFR-A X14819 Trypanosoma brucei Trypanosoma brucei II p5.15 p5.15 L30155

Tab. 3-5: Überblick über die in dieser Arbeit verwendeten Paraxonemalstabsequenzen der einzelnen Arten. Der obere Blockteil der Tabelle zeigt die Taxa mit den Bezeichnungen der Gene und Proteine sowie der Accession-Nummern der Sequenzen von par1; im unteren Blockteil sind die Taxa und entsprechende Bezeichnungen der Gene und Proteine für die Sequenzen von par2 aufgeführt. 1) : Im Rahmen dieser Arbeit ermittelte Sequenzen von Paraxonemalstabgenen. 3.17.4.1 SSU rDNA Die Alignierungen der Sequenzen der SSU rDNA wurden unter folgenden Parametern mit

dem Internet-Programm ClustalW (THOMPSON et al. 1994; http://www2.ebi.ac.uk./clustalw/)

vorgenommen:

Pair gap: 0.05 Gap open: 20 End gaps: 20 Gap extention: 0.05 Gap distance: 0.05 Matrix: Blosum Die variablen Regionen wurden anschließend mit dem Programm Genedoc (NICHOLAS &

NICHOLAS 1997; http://www.psc.edu/biomed/genedoc/) entfernt und das Alignment mit dem

Programm ClustalX (THOMPSON et al. 1997, JEANMOUGIN et al. 1998; ClustalX ist frei

Material & Methoden

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erhältlich unter: ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalX/) unter folgenden Bedingungen

realigniert:

Pairwise Alignment Parameter Multiple Alignment Parameter Gap opening: 10.0 Gap opening: 10.0 Gap extension: 0.5 Gap extension: 0.5 DNA weight matrix: IUB DNA weight matrix: IUB DNA transition weight: 0.5 Eine Nachkorrektur erfolgte nochmals mit dem Programm Genedoc (NICHOLAS & NICHOLAS

1997). Das korrigierte Alignment der SSU rDNA Sequenzen ist in Anhang 2 aufgeführt.

3.17.4.2 Paraxonemalstab-Gene Die erhaltenen Sequenzdateien wurden manuell anhand der Ausdrucke aus den

Sequenzierungen überprüft, gegebenenfalls nachkorrigiert und anschließend mit dem

Progamm ClustalX (THOMPSON et al. 1997, JEANMOUGIN et al. 1998) mit bereits bekannten

Sequenzen von Paraxonemalstabgenen aligniert. Dabei werden die einzelnen Sequenzen nach

Bereichen der größtmöglichen Übereinstimmung untereinander angeordnet (homologisiert).

Eine Nachkorrektur des Alignments erfolgte auch hier mit dem Programm Genedoc

(NICHOLAS & NICHOLAS 1997), in dem Fehler des mit ClustalX erstellten Alignments

behoben werden konnten. Solche Fehler, die zu falschen Homologisierungen führen,

entstehen, wenn zu unterschiedliche oder zu wenige Sequenzen miteinander verglichen

werden. In Folge kann kein generelles Profil für die zu alignierenden Gene aufgebaut werden.

Ebenso ist es mit ClustalX nicht möglich, kurze Sequenzstücke, die aus verschiedenen

Teilbereichen eines Gens stammen, zusammen mit dem gesamten Gen korrekt zu alignieren.

Da mit dem Alignment-Algorithmus nach Bereichen größtmöglicher Übereinstimmung

gesucht wird, werden diese kurzen Stücke selbst dann völlig auseinandergerissen, wenn die

Parameter "gap opening" und "gap extension", mit denen das Strafmaß für ein Einfügen von

Lücken (gaps) im Alignment bestimmt werden kann, hoch eingestellt werden. Die

Alignierungen der PAR Sequenzen wurden mit den folgenden Parametern durchgeführt:

Pairwise Alignment Parameter Multiple Alignment Parameter Gap opening: 15.0 Gap opening: 15.0 Gap extension: 6.66 Gap extension: 6.66 DNA weight matrix: IUB DNA weight matrix: IUB DNA transition weight: 0.5

Das korrigierte Alignment der par-Sequenzen ist in Anhang 3 aufgeführt.

Material & Methoden

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3.17.5 Rekonstruktion von Stammbäumen Die phylogenetischen Analysen wurden mit den Programmen PAUP*4.0b4a (Phylogenetic

analysis using parsimony *and other methods; SWOFFORD 1998) und TreeCon 1.3b (VAN DE

PEER & DE WACHTER 1997) durchgeführt. Dabei wurden Maximum-Parsimony-, Maximum-

Likelihood- und Distanz-Verfahren eingesetzt. Die erhaltenen Cladogramme wurden

anschließend über das Programm TreeView (PAGE 1996; http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/

rod/treeview.html.) importiert.

3.17.5.1 Maximum-Parsimony Dem Maximum-Parsimony-Verfahren liegt die Annahme zugrunde, daß bei der Deutung

empirischer Befunde nur die einfachsten, sparsamsten Erklärungen wissenschaftlichen

Charakter besitzen (AX 1995). Mit diesem Verfahren wird die aus einem Datensatz zur Er-

stellung eines Stammbaumes erforderliche Anzahl an evolutionären Schritten minimiert. Der

optimale Stammbaum ist damit zugleich auch der �kürzeste� Baum. Mittels einer

heuristischen Suche wird ein möglicher kürzester Baum gefunden, und im Anschluß daran,

durch Austausch von Ästen ("branch swapping") versucht, eine noch sparsamere Topologie

zu erhalten.

Manchmal werden als Resultat mehrere kürzeste Bäume gefunden, was bedeutet, daß die

Anzahl an Schritten identisch ist, die Topologien sich aber unterscheiden. Diese Bäume

können dann gemeinsam in Form eines Consensus-Baumes dargestellt werden. Die in dieser

Arbeit gezeigten Consensus-Bäume wurden unter dem "strict consensus"-Kriterium erstellt,

dabei werden ausschließlich die Gruppierungen angezeigt, die in allen gefundenen kürzesten

Bäumen enthalten sind.

Maximum-Parsimony macht im Gegensatz zu Maximum-Likelihood- und Distanz-Verfahren

keine Annahmen über Evolutionsprozesse, die Daten werden als ungeordnet betrachtet und

Umwandlungen von Nukleotiden sind in jede Richtung erlaubt (FITCH 1971). Die folgenden

Parameter lagen der heuristische Suche nach dem optimalen Baum zugrunde [SSU rDNA und

PAR]: • Gaps are treated as missing • Multistate taxa interpreted as uncertainty • Starting trees obtained via stepwise addition • Addition sequence random, nreps = 100 • Branch-swapping algorithm: Tree-bisection-reconnection (TBR) • Steepest descent option not in effect • �Multrees� option in effect

Material & Methoden

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3.17.5.2 Modelle zur Sequenzevolution Modelle zur Sequenzevolution werden sowohl in Maximum-Likelihood- als auch in

Distanzverfahren zur Rekonstruktion der Phylogenese benutzt. Dabei dienen sie in ersteren

der Schätzung der Wahrscheinlichkeit für das Auftreten einer Substitution und in letzteren der

Schätzung der Anzahl von nicht beobachteten Mehrfachsubstitutionen. Die in dieser Arbeit

verwendeten Evolutionsmodelle, die unter dem Maximum-Likelihood-Kriterium eingesetzt

wurden, sind in Tabelle 3-6 aufgeführt.

Evolutionsmodell nst 1) basefreq 2) variant 3)

JC (JUKES & CANTOR 1969) 1 equal K2P (KIMURA 1980) 2 equal

F81 (FELSENSTEIN 1981) 1 empirical

F84 (FELSENSTEIN 1984) 2 empirical F84

GTR [Generelles zeitreversibles Modell], (LANAVE et al. 1984,

TAVARE 1986, RODRIQUEZ et al. 1990, YANG et al. 1994)

6 empirical

HKY (HASEGAWA et al. 1985) 2 empirical HKY Tab. 3-6: Evolutionsmodelle zur Berechnung von Stammbäumen unter dem Maximum-Likelihood-Verfahren mit dem Programm PAUP*4.0b4a (SWOFFORD 1998). 1): number of substitutions. 2): basefrequencies. equal: Häufigkeit der einzelnen Nukleotide wird mit je 0.25 angenommen; empirical: Mittlere Häufigkeit der einzelnen Nukleotide wird anhand des vorliegenden Datensatzes errechnet. 3): Da die einzustellenden Parameter der Evolutionsmodelle F84 und HKY identisch sind, muß hier noch weiter spezifiziert werden, um den gewünschten Algorithmus einzustellen.

In allen vorgestellten Modellen wird von gleicher Substitutionswahrscheinlichkeit pro

Zeiteinheit ausgegangen, dabei erfolgen die Substitutionen unabhängig voneinander und eine

homogene Sequenzevolution wird vorausgesetzt. Ebenso hat die Substitutionsrichtung keine

Bedeutung und die Evolution der Sequenzen verläuft ungerichtet.

Die Unterschiede betreffen die Substitutionsraten, wobei in den Modellen von JUKES &

CANTOR (1969) und FELSENSTEIN (1981) nur eine Substitutionsrate für alle Ereignisse

postuliert wird, während KIMURA (1980), FELSENSTEIN (1984) und HASEGAWA et al. (1985)

zwischen Transversionen und Transitionen unterscheiden. Im generellen zeitreversiblen

Modell (LANAVE et al. 1984, TAVARÉ 1986, RODRIQUEZ et al. 1990, YANG et al. 1994)

werden unterschiedliche Raten für alle theoretisch möglichen Substitutionen (A↔C, A↔G,

A↔T, C↔G, C↔T, G↔T) vorausgesetzt.

Material & Methoden

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3.17.5.3 Maximum-Likelihood Den Maximum-Likelihood-Verfahren liegen konkrete Evolutionsmodelle zugrunde, die

festlegen, in welchem Rahmen Veränderungen der Sequenzen ablaufen können. Mit dieser

Methode wird die Wahrscheinlichkeit bestimmt, mit der das jeweilige Modell die

beobachteten Daten erzeugt hat, es wird also abgeschätzt, mit welcher Wahrscheinlichkeit

Substitutionen auftraten. Mit Hilfe des jeweiligen Evolutionsmodelles (Tab. 3-6) werden

dabei alle möglichen Baumtopologien erzeugt und der Baum mit dem größten Maximum-

Likelihood (ML)-Wert angezeigt.

3.17.5.4 Distanzverfahren In Distanzverfahren werden jeweils zwei alignierte Sequenzen miteinander verglichen und die

Unterschiede (Substitutionen) gezählt. Die Zahl der beobachteten Unterschiede, dividiert

durch die Gesamtzahl an alignierten Positionen, wird dabei als die beobachtete Distanz (auch:

sichtbare Distanz, p-Distanz) definiert. Für alle möglichen Sequenzpaare werden die

beobachteten Distanzen berechnet, die bei einer Anzahl von y untersuchten Sequenzen gleich

½[y (y─1)] sind. Diese Distanzwerte werden dann in eine Matrix überführt und anhand eines

gewählten Evolutionsmodelles in evolutionäre Distanzen transformiert. In die Rekonstruktion

gehen damit ausschließlich Distanzen ein, die Merkmalszustände werden nicht berücksichtigt.

Mit der Neighbor-Joining Methode, die von SAITOU & NEI (1987) vorgestellt wurde, werden

Bäume gesucht, in denen die Summe aller Ecklängen (= Astlängen) minimiert wird. Das

Prinzip beruht also auf dem Finden von optimalen "Sequenznachbarn", um die Gesamtlänge

des Baumes zu minimieren. Als zwei optimale Sequenznachbarn gelten damit solche, deren

Unterschiede untereinander geringer sind, als zu einer dritten Sequenz. Die Suche danach

beginnt mit einem sternförmigen Baum ohne hierarchische Struktur. Sind von den y

Sequenzen alle ½[y (y─1)] Paare gebildet worden, wird das Paar mit der kleinsten Summe an

Astlängen zueinander festgesetzt und für dieses Paar eine neue mittlere Distanz errechnet.

Aus diesem Wert und den Distanzen der übrigen (y─2) Paare wird eine neue Matrix erstellt

und wiederum das Paar mit der nun kleinsten Summe an Astlängen gesucht, nach diesem

Prinzip wird solange vorgegangen, bis alle Sequenzpaare gefunden sind. Diese Methode setzt

keine ultrametrischen Distanzen voraus, die Taxa dürfen unterschiedliche Evolutionsraten

aufweisen.

Material & Methoden

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3.17.6 Basenzusammensetzung Extrem unterschiedliche Nukleotidzusammensetzungen führen in phylogenetischen

Rekonstruktionen oftmals zu Stammbäumen, in denen die Taxa eher durch eine ähnliche

Basenzusammensetzung zusammen angeordnet sind, als aufgrund genealogischer

Verwandschaft (OLSEN 1988, HASEGAWA & HASHIMOTO 1993, STEEL et al. 1993, SIMON et

al. 1994). Daher wurde für jede Art die Basenzusammensetzung ermittelt und mit einem χ2-

Test mit dem Programm PAUP*4.0b4a (SWOFFORD 1998) auf signifikante Heterogenität

überprüft.

3.17.7 Substitutionssättigung Bei Mehrfachsubstitutionen an der gleichen Sequenzposition ("multiple hit") erscheinen die

beobachteten Distanzen kleiner als die wirklichen evolutionären Distanzen.

Daher werden zur genauen Ermittlung der Substitutionssättigung Distanzen zwischen zwei

Sequenzen gegen die patristischen Distanzen aufgetragen. Beobachtete Distanzen sind dabei

die Unterschiede (Transversionen und Transitionen) zwischen zwei Sequenzen. Patristische

Distanzen entsprechen der Summe der Astlängen zwischen zwei Taxa in einem Maximum-

Parsimony-Stammbaum. Beim Auftragen der patristischen Distanzen gegen die beobachteten

Distanzen zeigt die Abweichung von der Winkelhalbierenden den Grad der Sättigung an.

Liegen die Werte unterhalb der Winkelhalbierenden, so ist die beobachtete Distanz kleiner als

die wirkliche evolutionäre Distanz, da im Maximum-Parsimony-Baum zur Erklärung der

Daten eine höhere Zahl an Evolutionsschritten angenommen werden muß, als tatsächlich

beobachtet wird.

Die Analysen zur Substitutionssättigung wurden mit dem Programm PAUP*4.0b4a

(SWOFFORD 1998) durchgeführt.

3.17.8 Sequenzdivergenz Große Sequenzdivergenzen, die durch hohe Substitutionsraten einzelner Taxa in der zu

untersuchenden Innengruppe entstehen, führen oftmals zu einem in der angelsächsischen

Literatur als "long branch attraction" bezeichnetem Phänomen (FELSENSTEIN 1978, 1988,

HENDY & PENNY 1989, NEI 1991, SWOFFORD et al. 1996, ZHARKIKH & LI 1993). In

Konsequenz werden solche schnell evolvierenden Taxa durch lange Äste im Stammbaum

Material & Methoden

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separiert oder an die Basis gestellt, wobei sie im Extremfall der Außengruppe zugeordnet

werden. Die Sequenzdivergenzen wurden über einen paarweisen Vergleich der Taxa mit

folgender Formel errechnet: Sequenzdivergenz = [(Transitionen+Transversionen) x 100] x [Anzahl alignierter Positionen]−1 Die Berechnung der Sequenzdivergenz wurde mit dem Programm PAUP*4.0b4a (SWOFFORD

1998) durchgeführt.

3.17.9 Bootstrap Test Das Bootstrap Verfahren, das von NEYMAN (1971) zum Testen phylogenetischer

Stammbäume vorgeschlagen wurde und von FELSENSTEIN (1985) umgesetzt wurde, gibt

Auskunft über die Wiederfindung der errechneten Stammbäume. Aus der dem Stammbaum

zugrundeliegenden Datenmatrix, die die Gesamtzahl der Merkmale widerspiegelt, werden

dabei nach dem Zufallsprinzip neue Datensätze erstellt, indem solange unabhängige

Einzelstichproben gezogen werden, bis die Gesamtzahl an Einzelstichproben wieder der der

ursprünglichen Matrix entspricht. Dadurch werden einige Merkmale aus dem

Originaldatensatz nicht mitberücksichtigt, während andere mehrfach vorliegen können. Die

anhand dieser neuen Datensätze (Pseudoreplikate, Bootstrapreplikate) erstellten Stammbäume

werden zu einem Consensusbaum zusammengefaßt, in dem prozentual angegeben ist, wie

häufig sich eine bestimmte Aufspaltung in Taxa innerhalb der Pseudoreplikate wiederfinden

läßt.

3.17.10 Decay Index (Bremer Index) Dieses Methode ist eine von BREMER (1988) entwickelte Alternative zum Bootstrap Test

innerhalb des Maximum-Parsimony (MP)-Verfahrens. Die Synonyme Decay-Index

(DONOGHUE et al. 1992) oder Support-Index (SI; BREMER 1994) haben sich in der Literatur

durchgesetzt und werden daher auch in dieser Arbeit verwendet. Über die Ermittlung der

Decay-Indizes wird geprüft, wieviele Schritte zusätzlich in einen MP-Baum eingefügt werden

müssen, um ein bestimmtes Monophylum nicht mehr zu erhalten; somit wird indirekt die

Anzahl der dieses Monophylum stützenden Autapomorphien ermittelt. Ist z.B. nach einer

heuristischen Suche der sparsamste Baum mit 1300 Schritten angegeben und benötigt man

Material & Methoden

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1300 + n Schritte um eine im sparsamsten Baum vorhandene monophyletische Gruppierung

nicht mehr zu erhalten, wird der Wert n (= Decay Index) als Unterstützung für diese Gruppe

angegeben.

3.17.11 "Concatenated data sets" Bei der unter dem Begriff "concatenated data sets" bekannten Methode werden gleichzeitig

mehrere Datensätze analysiert. Die Theorie dieses Verfahrens beruht darauf, daß Datensätze

einzelner Gene oftmals nicht hinreichend informativ sind, um eine komplette Auflösung der

Taxa innerhalb einer Rekonstruktion zu erreichen. Sind für die zu untersuchende Gruppe von

Organismen mehrere unterschiedliche Gensequenzen bekannt, so müssen diese Sequenzen

innerhalb des Alignments in Blöcken so hintereinander gestellt werden, daß sie wieder

homologisierbar sind. Die concatenated trees wurden mit den Datensätzen der Gene der SSU

rDNA und der beiden par-Gene erstellt. Dabei wurden die drei Einzelalignments in das

Programm BioEdit V4.8.8 (http://www.mbio.ncsu.edu/RNaseP/info/programs/BIOEDIT/

bioedit.html) importiert und dort in Blöcken angeordnet. Nach Umschreiben in ein Nexus-

Format wurde der zusammengesetzte Datensatz innerhalb des Programmes PAUP*4.0b4a

(SWOFFORD 1998) mit Hilfe unterschiedlicher Rekonstruktionsverfahren analysiert. Da in den

drei Blöcken jeweils ein unterschiedlich hoher Informationsgehalt vorlag, mußte vorher eine

Wichtung durchgeführt werden. Dazu wurden für jeden Einzeldatensatz innerhalb des

Programmes PAUP*4.0b4a (SWOFFORD 1998) alle informativen Merkmale bestimmt und in

Relation zueinander gesetzt: Blöcke im zusammengesetzten Datensatz

SSU rDNA

par1

par2

Position

1-984

985-1789

1790-2594 informative Merkmale

191

161

151

151 dividiert durch informative Merkmale

0.791

0.938

1 Anhand dieser Wichtung (Befehlszeile: weights 791:1-984,938:985-1789,1000:1790-2594)

wurde dann mit dem Programm PAUP*4.0b4a (SWOFFORD 1998) eine Rekonstruktion

unter dem Maximum-Parsimony Verfahren durchgeführt. Alle Parsimony uninformativen

Merkmale wurden zuvor aus der Analyse ausgeschlossen.