3. METODE PENELITIAN

3.1 Materi Penelitian

3.1.2 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari dua jenis yaitu bahan

untuk pembuatan kecap ikan kuniran dan bahan untuk menguji kecap ikan sesuai

dengan parameter yang diinginkan. Bahan yang digunakan dalam pembuatan kecap

ikan adalah ikan kuniran 5 kg, enzim papain dengan konsentrasi 5%, 8%, dan 11%,

serta garam dengan konsentrasi 5%. Bahan yang digunakan dalam pengujian kimia

adalah asam sulfit, petroleum ether, buffer asam asetat pH 7, biuret, kertas saring,

bovin serum albumin, tisu dan enzim papain komersial merk “Paya”.

3.1.3 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam pembuatan kecap antara lain ikan kuniran, pisau,

blender, baskom, sendok, kain blancu, timbangan digital, autoclave, centrifuge

Alat yang digunakan dalam analisa mutu kecap ikan adalah pisau, timbangan

digital, gelas ukur 100 ml, beaker glass 100ml, pipet volume 10 ml, bola hisap, beaker

glass 50 ml, washing bottle, spatula, sendok bahan, cuvet, centrifuge, alat destilasi,

alat ekstraksi goldfisch, oven vakum, desikator, cawan porselen, tanur pengabuan,

kertas saring whatman, spektofotometer, dan laptop

3.2 Metode Penelititan

3.2.3 Metode

Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimen. Penelitian ini

dilakukan dalam dua tahap yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama.

Perlakuan yang akan digunakan pada penelitian pendahuluan adalah lama fermentasi

dan konsentrasi enzim papain terhadap kualitas kecap ikan kuniran. Sedangkan

penelitian utama dilakukan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi enzim papain,

pengaruh lama fermentasi serta pengaruh interaksi antara keduanya terhadap

kualitas kecap ikan kuniran juga untuk mendapatkan konsentrasi enzim papain dan

lama fermentasi yang optimal untuk mendapatkan kualitas kecap ikan terbaik.

3.2.4 Variabel

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi enzim papain dan lama

fermentasi. Sedangkan variabel terikat penelitian ini adalah kadar protein, kadar abu,

kadar air, kadar lemak, rendemen, organoleptik, derajat keasaman (pH) dan total

asam amino

3.3 Penelitian Pendahuluan

Sebelum melakukan penelitian utama, terlebih dahulu dilakukan penelitian

pendahuluan. Penelitian pendahuluan dilakukan dalam dua tahap penelitian. Pada

Penelitian pendahuluan tahap pertama bertujuan untuk memperoleh lama fermentasi

yang optimum dengan menggunakan kadar protein terlarut sebagai parameternya.

Sedangkan pada penelitian pendahuluan tahap kedua bertujuan untuk memperoleh

konsentrasi enzim papain yang optimum dengan menggunakan kadar protein terlarut

sebagai parameternya.

3.3.1 Penelitian Pendahuluan Tahap 1

Penelitian pendahuluan tahap satu bertujuan untuk memperoleh lama

fermentasi yang optimum dengan menggunakan protein sebagai parameternya.

Penelitian pendahuluan tahap dua akan menjadi acuan untuk penelitian pendahuluan

tahap tiga. Menurut penelitian Kurniawan (2008) bahwa kadar protein tertinggi pada

kecap ikan lele didapatkan pada lama fermentasi 7 hari dan konsentrasi garam 5%

sebesar 17.95%. Oleh karena itu, lama fermentasi dan konsentrasi garam tersebut

dijadikan acuan untuk penelitian pendahuluan tahap dua dengan range lama

fermentasi yaitu 5, 7 dan 9 hari. Prosedur penelitian pendahuluan tahap satu dapat

dilihat pada Gambar 9.

Pada penelitian pendahuluan tahap satu didapatkan kecap ikan dengan kadar

protein terlarut tertinggi terdapat pada lama fermentasi 9 hari dengan nilai 2.74±0.11.

Sedangkan kadar protein terlarut terendah terdapat pada lama fermentasi 5 hari

dengan nilai 2.25±0.11. Artinya semakin lama proses fermentasi maka semakin tinggi

pula nilai kadar protein yang dihasilkan.

Adapun rata – rata kadar protein kecap ikan penelitian pendahuluan dapat

dilihat pada Tabel 7. Dan hasil analisis statistik penelitian pendahuluan ini dapat dilihat

pada Lampiran 1.

Daging Ikan Kuniran (Upeneus

sp.)

Pencucian dan penggilingan

Pencampuran garam 5%

Dimasukkan ke dalam botol hitam dan ditutup rapat

Difermentasi pada suhu kamar dengan lama waktu 5, 7 dan 9 hari

Sterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 115°C

Penyaringan

Kecap Ikan

Gambar 1. Alur Proses Penelitian Pendahuluan Tahap 1

Tabel 7. Data Kadar Protein Kecap Ikan

Lama Fermentasi Kadar Protein (%)

Kontrol 5 Hari

2.04±0.17 2.25±0.11

7 Hari 2.38±0.11 9 Hari 2.74±0.11

Sumber : Data Diolah (2017)

3.3.2 Penelitian Pendahuluan Tahap 2

Pada penelitian pendahuluan tahap dua bertujuan untuk memperoleh

konsentrasi enzim papain yang terbaik dengan menggunakan kadar protein terlarut

sebagai parameternya. Lama fermentasi yang digunakan merupakan hasil dari

penelitian pendahuluan tahap satu. Menurut penelitian Simanjorang et al., (2012)

bahwa penambahan enzim papain terbaik terdapat pada konsentrasi enzim papain

5% dengan nilai kadar protein terlarut sebesar 2.698%. Oleh karena itu, konsentrasi

tersebut dijadikan acuan untuk penelitian pendahuluan tahap dua dengan range

konsentrasi enzim papain sebesar 2%, 5% dan 8%. Alur proses penelitian

pendahuluan tahap dua dapat dilihat pada Gambar 10.

Daging Ikan Kuniran (Upeneus

sp.)

Pencucian dan penggilingan

Pencampuran enzim papain 2%, 5%, dan 8% dan garam 5%

Dimasukkan ke dalam botol hitam dan ditutup rapat

Difermentasi pada suhu kamar dengan lama waktu 9 hari

Sterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 115°C

Penyaringan

Kecap Ikan

Gambar 2. Alur Proses Penelitian Pendahuluan Tahap 2

Pada penelitian pendahuluan tahap dua ini didapat konsentrasi enzim papain

terbaik terdapat pada konsentrasi 8% dengan nilai kadar protein terlarut sebesar

4.01±0.12 sedangkan kadar protein terlarut terendah terdapat pada konsentrasi enzim

papain sebesar 2% dengan nilai kadar protein sebesar 3.22±0.07. Dalam penelitian

pendahuluan tahap dua ini didapat bahwa semakin tinggi konsentrasi enzim papain

maka semakin tinggi pula nilai kadar protein terlarut yang didapatkan. Menurut Kirk

dan Orthmer (1953) peningkatan kandungan protein dalam produk hidrolisat

disebabkan selama proses hidrolisis terjadi konversi protein yang bersifat tidak larut

menjadi senyawa nitrogen yang bersifat larut, selanjutnya terurai menjadi senyawa-

senyawa yang lebih sederhana, seperti peptida dan asam amino sehingga mudah

diserap oleh tubuh. Adapun kadar protein pada penelitian pendahuluan tahap tiga

dapat dilihat pada Tabel 8. Dan hasil analisis statistik penelitian pendahuluan ini dapat

dilihat pada Lampiran 2.

Tabel 8. Kadar Protein Penelitian Pendahuluan Tahap 2

Konsentrasi Enzim Kadar Protein (%)

Kontrol 2%

2.72±0.24 3.22±0.07

5% 3.67±0.10 8% 4.01±0.12

Sumber : Data Diolah (2017)

3.4 Penelitian Utama

Penelitian utama bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi enzim

papain dan lama waktu fermentasi terhadap kualitas kecap ikan kuniran serta

memperoleh konsentrasi enzim papain dan lama fermentasi yang optimum untuk

mendapatkan kualitas kecap ikan terbaik. Konsentrasi enzim papain yang digunakan

berdasarkan konsentrasi enzim papain terbaik pada penelitian pendahuluan tahap

dua dengan range 5%, 8% dan 11%. Sedangkan lama fermentasi yang digunakan

berdasar lama fermentasi terbaik dari penelitian pendahuluan tahap satu dengan

range 7 Hari, 9 Hari, dan 11 Hari.

3.4.1 Prosedur Penelitian Utama

Prosedur penelitian utama antara lain persiapan bahan baku yaitu ikan kuniran

segar dengan berat 5 kg di bersihkan dan di buang isi perut lalu dihaluskan dengan

blender. Ikan kuniran yang telah halus lalu mulai di beri berlakuan dengan masing –

masing penambahan enzim papain sebesar 5%, 8%, dan 11% dan diberi tambahan

garam sebesar 5%. Setelah itu dimasukkan ke dalam botol kaca hitam. Masing

masing dari perlakuan enzim tersebut lalu di fermentasi dengan lama waktu masing –

masing 7 Hari, 9 Hari dan 11 Hari. Setelah di dapat lama waktu yang sesuai, hasil dari

fermentasi tersebut lalu di autoklaf selama 15 menit dengan suhu 115°C. Setelah itu

di centrifuge dengan kecepatan 5000 rpm sehingga terpisah antara padatan dan

larutan. Kecap Ikan dianalisa kadar protein, kadar abu, kadar air, kadar lemak,

rendemen, derajat keasaman, profil asam amino dan uji organoleptik (hedonik aroma

dan warna).

3.4.2 Metode Pembuatan Kecap Ikan

3.5 Analisa Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan dua faktor yaitu konsentrasi enzim

(A) dan lama fermentasi (B). Suatu percobaan faktorial bila perlakuannya terdiri dari

kombinasi lengkap antar level (antar taraf) dari dua faktor atau lebih dan masing-

masing faktor terdiri dari dua taraf atau lebih. Pada faktor penambahan konsentrasi

enzim papain (A) terdapat 3 taraf yaitu konsentrasi enzim papain 5% (A1), 8% (A2),

dan 11% (A3) dan pada faktor lama waktu fermentasi (B) terdapat 3 taraf yaitu 7 hari

(B1), 9 (B2) dan 11 (B3) hari.

Rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap atau RAL

faktorial. Rancangan ini digunakan dalam penelitian dengan medium yang seragam.

Data kemudian diolah menggunakan ANNOVA (Analysis of Variance) pada taraf 5%

dan 1%. Jika ditemukan perbedaan yang nyata maka akan dilanjutkan dengan uji

Daging Ikan Kuniran (Upeneus

sp.)

Pencucian dan penggilingan

Pencampuran enzim papain 5%, 8%, 11% dan garam 5%

4%

Dimasukkan ke dalam botol hitam dan ditutup rapat

Difermentasi pada suhu kamar dengan lama waktu 7, 9 dan 11 hari untuk tiap-tiap konsentrasi

Sterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 115°C

Penyaringan

Kecap Ikan

Gambar 3. Alur Proses Pembuatan Kecap Ikan Secara Enzimatis

Tukey.

Adapun interaksi antara dua faktor dilakukan dengan 3 kali ulangan. Hal

tersebut sesuai dengan persamaan:

(n-1) (r-1) ≥ 15

Dimana :

n = perlakuan

r = ulangan

Sehingga banyaknya ulangan dapat dihitung sebagai berikut :

((3.3) – 1) (r -1) ≥ 15

(9 - 1) (r – 1) ≥ 15

8r – 8 ≥ 15

8r ≥ 20

r ≥ 2,875 ( 3 kali ulangan)

Metode pengujian data yang digunakan adalah analisa keragaman (ANOVA)

dimana jika terdapat pengaruh nyata atau sangat nyata maka akan dilanjutkan uji

Tukey dengan aplikasi Software SPSS 16. Model statistika yang digunakan dalam

penelitian sebagai berikut :

Yijk = µ + Ai + Bj + (AB)ij + εijk

Keterangan :

Yijk = Hasil pengamatan untuk faktor A taraf ke-I, faktor B taraf ke-j, pada

ulangan ke –k

µ = Rataan umum

Ai = Pengaruh faktor A pada taraf ke-i

Bj = Pengaruh faktor B pada taraf ke-j

(AB)ij = Interaksi antara A dan B pada faktor A taraf ke-I, faktor B taraf ke-j

εijk = Galat percobaan untuk faktor A taraf ke-I, faktor ke B taraf ke-j

pada ulangan ke-k

Model rancangan percobaan pada Penelitian Utama dapat dilihat pada tabel 8

dibawah ini :

Tabel 9. Rancangan Percobaan Penelitian

Perlakuan Perlakuan Kombinasi

Ulangan Rata – Rata A B 1 2 3

A1 A2 A3

B1 A1B1 A1B1.1 A1B1.2 A1B1.3 B2 A1B2 A1B2.1 A1B2.2 A1B2.3 B3 A1B3 A1B3.1 A1B3.2 A1B3.3 B1 A2B1 A2B1.1 A2B1.2 A2B1.3 B2 B3 B1 B2

A2B2 A2B3 A3B1 A3B2

A2B2.1 A2.B3.1 A3B1.1 A3B2.1

A2B2.2 A2B3.2 A3B1.3 A3B2.3

A2B2.3 A2B3.3 A3B1.3 A3B2.3

B3 A3B3 A3B3.1 A3B3.3 A3B3.3

Keterangan : A1B1 : Konsentrasi enzim papain 5% dengan lama fermentasi 7 hari A1B2 : Konsentrasi enzim papain 5% dengan lama fermentasi 9 hari A1B3 : Konsentrasi enzim papain 5% dengan lama fermentasi 11 hari A2B1 : Konsentrasi enzim papain 8% dengan lama fermentasi 7 hari A2B2 : Konsentrasi enzim papain 8% dengan lama fermentasi 9 hari A2B3 : Konsentrasi enzim papain 8% dengan lama fermentasi 11 hari A3B1 : Konsentrasi enzim papain 11% dengan lama fermentasi 7 hari A3B2 : Konsentrasi enzim papain 11% dengan lama fermentasi 9 hari A3B3 : Konsentrasi enzim papain 11% dengan lama fermentasi 11 hari

3.6 Parameter Uji Kecap Ikan

3.6.1 Analisis Rendemen

Analisis rendemen yaitu perbandingan antara berat produk setelah jadi

dengan berat adonan. Rendemen dapat dihitung dengan menimbang berat sampel

campuran semua bahan sebelum pengolahan menggunakan neraca analitik.

Ditimbang berat akhir yang dihasilkan setelah proses pemasakan dengan neraca

analitik (AOAC, 1990). Prosentase rendemen yan dihasilkan dihitung menggunakan

rumus :

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 (%)𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑘 =massa produk kecap

massa bahan baku × 100%

3.6.2 Analisis Kadar Protein terlarut

Analisis kadar protein terlarut secara cepat dan mudah dapat dilakukan

dengan menggunakan metode spektrofotomer dan reagen pereaksi biuret.

Spektrofotometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk mengukur

absorbansi suatu sampel. Spektofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia

analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara

kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya

(Khotimah et al., 2013). Namun sampel yang dapat dianalisa oleh alat ini adalah

sampel yang hanya memiliki warna. Sampel yang tidak memiliki warna harus dibuat

berwarna terlebih dahulu dengan reagen spesifik yang mampu menghasilkan

senyawa berwarna. Ditambahkan oleh Machin (2012) bahwa reagen biuret

mengandung CuSO4. Biuret dibentuk dengan pemanasan urea dan mempunyai

struktur mirip dengan struktur peptida dari protein. Prinsip reaksi biuret adalah reaksi

antara tembaga sulfat dalam alkali dengan senyawa yang berisi dua atau lebih ikatan

peptida seperti protein yang memberikan warna ungu biru yang khas. Fungsi reagen

biuret untuk membentuk senyawa kompleks sehingga yang langsung dapat

diidentifikasi. Reaksi biuret ini bersifat spesifk, artinya hanya senyawa yang

mengandung ikatan peptida saja yang akan bereaksi dengan pereaksi biuret.

Pada analisis protein terlarut dilakukan dengan metode biuret yang telah

mengalami modifikasi. Untuk kurva standar, larutan protein standar (larutan serum

albumin dengan konsentrasi 5 mg/ml) dimasukkan dalam tabung reaksi masing –

masing 0 (blanko), 0.10, 0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1 ml. Kemudian ditambahkan aquades

hingga volume total 4ml dan 6 ml pereaksi biuret ke dalam masing – masing tabung

reaksi dan di homogenkan. Lalu tabung reaksi disimpan pada suhu 37ºC selama 30

menit sampai terbentuk warna ungu sempurna dan pengukuran absorbansi dilakukan

dengan menggunakan spektrofotemeter pada panjang gelombang 540 nm. Kemudian

sampel kecap ikan diambil 3 ml. sampel tersebut kemudian diencerkan dengan

aquades hingga diperoleh 25 ml larutan sampel. Sampel kemudian disaring

menggunakan kertas saring halus didalam Erlenmeyer. Kemudian sampel di

sentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit. Supernatan diambil 4 ml

dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Lalu ditambahkan 6 ml pereaksi biuret pada

masing – masing tabung reaksi dan dihomogenkan. Setelah itu ukur absorbansi

dengan panjang gelombang 540 nm. Hasil absorbansi dimasukkan kedalam

persamaan Bovin Serum Albumin (BSA) dan dihitung kadar proteinnya (Wijaya dan

Yunianta, 2015).

3.6.3 Analisis Kadar Air

Analisis kandungan air dapat dilakukan dengan beberapa cara. Hal ini

tergantung pada sifat bahannya. Pada umumnya penentuan kadar air dilakukan

dengan mengeringkan bahan dalam oven pada suhu 105 – 110ºC selama 3 jam atau

sampai didapat berat yang konstan. Selisih berat sebelum dan sesudah pengeringan

adalah banyaknya air yang diuapkan. Untuk bahan – bahan yang tidak tahan panas,

seperti bahan berkadar gula tinggi, minyak, daging, kecap dan lain – lain pemanasan

dilakukan dengan oven vakum dengan suhu yang lebih rendah. Kadang – kadang

pengeringan dilakukan dengan H2SO4 pekat sebagai pengering sehingga mencapai

berat yang konstan (Winarno, 2004).

Analisis kada air dapat dilakukan dengan cara cawan porselen yang akan

digunakan dikeringkan terlebih dahulu dalam oven pada suhu 105-110oC selama 15

menit atau sampai berat konstan, kemudian cawan diletakkan ke dalam desikator

selama 30 menit dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan (A). Sampel

sebanyak 20 ml ditimbang dan diletakkan ke dalam cawan yang sudah dikeringkan

(B), kemudian dipanaskan ke dalam oven vakum pada suhu 60-70oC selama 50

hingga 60 menit. Setelah selesai, cawan tersebut didinginkan dalam desikator selama

30 menit dan setelah dingin ditimbang kembali (C). Tahap ini diulangi hingga dicapai

bobot yang konstan (AOAC, 1990). Kadar air dapat dihitung dengan rumus sebagai

berikut:

% Kadar air = B − C

B − A X 100 %

Keterangan :

A = Berat cawan kosong (gram)

B = Berat cawan dengan sampel sebelum dikeringkan (gram)

C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram)

3.6.4 Analisis Kadar Abu

Analisis kadar abu adalah mengoksidasikan senyawa organik pada suhu yang

tinggi yaitu sekitar 500-600°C dan melakukan penimbangan zat yang tersisa setelah

proses pembakaran tersebut. Waktu lamanya pengabuan tiap bahan berbeda-beda

dan berkisar antara 2-8 jam. Pengabuan dilakukan pada alat pengabuan yaitu tanur

yang dapat diatur suhunya. Pengabuan dianggap selesai apabila diperoleh sisa

pembakaran yang umumnya bewarna putih abu-abu dan beratnya konstan dengan

selang waktu 30 menit. Penimbangan terhadap bahan dilakukan dalam keadaan

dingin, untuk itu cawan berisi abu yang ada dalam tanur harus lebih dahulu dimasukan

ke dalam oven bersuhu 105°C agar suhunya turun menyesuaikan dengan suhu

didalam oven, barulah dimasukkan ke dalam desikator sampai dingin, barulah abunya

dapat ditimbang hingga hasil timbangannya konstan (Sudarmadji, 2007).

Analisis kadar abu dapat dilakukan dengan cawan yang akan digunakan

dikeringkan di dalam oven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu 100-105oC,

kemudian didinginkan ke dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang hingga

didapatkan berat yang konstan (A). Sampel basah ditimbang sebanyak 20 gram atau

ml dan diletakkan ke dalam cawan yang sudah dikeringkan, kemudian dipanaskan ke

dalam oven vakum pada suhu 60-70oC selama 50 hingga 60 menit hingga berat

konstan (B) kemudian sampel yang sudah kering dibakar menggunakan hotplate

sampai tidak berasap selama ± 20 menit. Dilanjutkan dengan pengaburan didalam

tanur dengan suhu 600oC sampai pengabuan sempurna (sesekali pintu tanur dibuka

sedikit agar oksigen masuk). Sampel yang sudah diabukan didinginkan ke dalam

desikator dan ditimbang. Tahap pembakaran dalam tanur diulangi hingga didapatkan

berat yang konstan (C) (AOAC, 1990). Kadar abu dapat dihitung dengan rumus

sebagai berikut:

% Kadar Abu = C−A

B−A X 100 %

Keterangan:

A = Berat cawan abu porselen kosong (gram)

B = Berat cawan abu porselen dengan sampel sebelum pengabuan (gram)

C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah pengabuan (gram)

3.6.5 Analisis Kadar Lemak

Pada analisis kadar lemak kecap ikan total dilakukan dengan metode

goldfisch yang telah di modifikasi menurut Sudarmadji et al., (2007), dapat dilakukan

dengan cara bahan ditimbang sebanyak 20 ml. Sampel basah ditimbang sebanyak 20

gram atau ml kemudian diletakkan ke dalam cawan yang kemudian dipanaskan ke

dalam oven vakum pada suhu 60-70oC selama 50 hingga 60 menit hingga berat

konstan dan menghasilkan residu berupa padatan. Residu yang berupa padatan

kemudian ditimbang sebanyak 2 gram. Kemudian dimasukkan dalam kertas saring

dan dimasukkan dalam timbel, yaitu pembungkus bahan yang terbuat alumina yang

porous. Dipasang bahan dan timbel pada sample tube, yaitu gelas penyangga yang

bagian wadahnya terbuka, tepat dibawah kondensor alat distilasi Goldfisch.

Dimasukkan petroleum-ether (maksimal 75 mililiter) dalam gelas piala khusus yang

diketahui beratnya. Dilakukan ekstraksi selama 3-4 jam. Ekstrak lemak dikeringkan

dalam oven dan ditimbang berat minyak dalam bahan. Kadar lemak dapat dihitung

dengan rumus berikut :

% Kadar lemak = (berat awal sampel+berat kertas saring)- berat akhir

berat awal sampel x 100%

3.6.6 Analisis Uji Organoleptik

Pengamatan organoleptik dari kecap ikan dengan dilakukan uji sensori

hedonik meliputi aroma dan warna. Jumlah panelis yang berpartisipasi adalah 15

panelis semi terlatih. Mereka dipilih berdasarkan keterkarikannya terhadap kecap

ikan. Pengujian menggunakan uji skala hedonik yang terdiri dari 7 nilai dengan 7

pernyataan yaitu sangat tidak suka (1), tidak suka (2), agak tidak suka (3), netral/ biasa

(4), agak suka (5), suka (6), dan sangat suka (7). Pengujian dilakukan dengan

menyodorkan secara acak 10 sampel (9 sampel hasil penelitian dengan perlakuan

yang berbeda-beda, dan 1 sampel kontrol) yang masing-masing telah diberi kode

yang berbeda-beda. Selanjutnya panelis diminta memberi penilaian terhadap sampel

sesuai dengan skala yang ada..

3.6.7 Analisis Uji Derajat Keasaman (pH)

Lakukan kalibrasi alat pH-meter dengan larutan penyangga sesuai instruksi

kerja alat setiap kali akan melakukan pengukuran. Untuk contoh uji yang mempunyai

suhu tinggi, kondisikan contoh uji sampai suhu kamar. Keringkan dengan kertas tisu

selanjutnya bilas elektroda dengan air suling. Bilas elektroda dengan contoh uji.

Celupkan elektroda ke dalam contoh uji sampai pH meter menunjukkan pembacaan

yang tetap. Catat hasil pembacaan skala atau angka pada tampilan dari pH meter

(AOAC ,1990).

3.6.8 Analisis Profil Asam Amino

Analisis asam amino ditentukan dengan menggunakan HPLC merk Shimadzu

RF 20A. Analisis asam amino menggunakan HPLC terdiri dari empat tahap, yaitu

tahap pembuatan hidrolisat protein, tahap pengeringan, tahap derivatisasi, dan tahap

injeksi serta analisis asam amino (AOAC, 1990).

1) Tahap pembuatan hidrolisat protein

Hal yang dilakukan pada tahap pembuatan hidrolisat protein adalah sampel

ditimbang sebanyak 3 mg dan dihancurkan. Sampel yang telah hancur dihidrolisis

asam menggunakan HCl 6 N sebanyak 10 mL yang kemudian dipanaskan dalam oven

pada suhu 110 ºC selama 24 jam. Sebelum dilaukan pemanasan, ditambahkan gas

N2 pada sampel untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar

tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan. Pemanasan dilakukan untuk

mempercepat reaksi hidrolisis.

2) Tahap pengeringan

Sampel disaring menggunakan kertas saring dan dikeringkan menggunakan

rotary evaporator pada suhu 85 ºC selama 30 menit. Hal ini dilakukan untuk

memisahkan pelarut dengan asam amino.

3) Tahap derivatisasi

Larutan derivatisasi dibuat dari campuran ortoftalaldehida (OPA) 50 mg,

metanol 4 mL, merkaptoetanol 0,025 mL, brij-30 30% sebanyak 0,050 mL, dan buffer

borat 1 M pH = 10,4. Pereaksi derivatisasi dibuat dengan mencampurkan satu bagian

larutan stok dengan dua bagian larutan buffer Kalium Borat pH 10,4. Proses

derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada

sampel. Sampel yang telah dikeringkan ditambahkan dengan 5 mL HCl 0,01 N

kemudian disaring menggunakan kertas milipore.

4) Tahap injeksi ke HPLC

Injeksi larutan standar diawali dengan pencampuran larutan stok dengan

larutan standar dan buffer borat (1:1). Sebanyak 5 μL larutan tersebut diinjeksi ke

HPLC dalam waktu 30 menit. Tahapan yang sama dilakukan pada sampel yaitu

dengan mencampurkannya dengan buffer borat (1:1) dan dilakukan pencampuran

dengan larutan stok. Campuran diinjeksi ke HPLC sampai pendeteksian semua asam

amino selesai. Kandungan asam amino pada bahan dihitung dengan rumus:

asam amino (%) = luas area sampel x C x FP x BM x 100% luas area standar x bobot sampel

Keterangan :

C = Konsentrasi standar asam amino (μg/mL)

FP = Faktor pengenceran

BM = Bobot molekul dari masing-masing asam amino (g/mol)

Kondisi alat:

Fase diam/ Stationer = Ultra techspere (Octadecyl-silica (ODS) / C18)

Laju alir = 1 mL/menit

Detektor = Flame Ionization Detector (FID) Flouresensi

Mobile Phase = Buffer A (Na-asetat dan Na-EDTA)

Buffer B (metanol 95% dan air 65 : 35)