150 การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560

การพฒนาพนธขาว กข47 ใหทนตอน าทวมฉบพลน ตานทานตอเพลยกระโดดสน าตาลและโรคขอบใบแหง โดยใชเครองหมายโมเลกล

Improvement of RD47 Rice Variety for Submergence Tolerance, Brown Planthopper and Bacterial Blight Resistance

Using Marker Assisted Selection เปรมกมล มลนลตา1) เบญจวรรณ พลโคตร1) สนยม ตาปราบ2) ศรพร กออนทรศกด3) ศรภา กออนทรศกด3) ธระยทธ ตจนดา3)

Preamkamon Moonninta1) Benjawan Phonkhod1) Suniyom Taprab2) Siriporn Korinsak3) Siripar Korinsak3) Teerayut Toojida3)

Abstract RD 47 is high yielding photoperiod insensitive rice variety. It is popular variety cultivate in

irrigated area of lower northern Thailand. However, unfavourable situation such as flooding or bacterial blight disease and brown planthopper outbreak frequently caused yield loss in RD47 variety. This research aims to improve RD47 rice variety for submergence tolerance, brown planthopper and bacterial blight resistance using molecular marker assisted selection. This research was conducted in 2013 by setting two crosses. Cross one derived from RD47/Pin Kaset 1-BB-PY (carrying BB resistance gene; xa5, Xa21 and xa33). Cross two derived from RD47/Chai Nat 1-BPH-PY and Hawm Chonlasit-SUB-AROMA (carrying a submergence tolerance gene; Sub1, aroma gene; Badh2, BPH resistance gene; Bph3, qBph6 and qBph12). Introgression lines were developed through backcross breeding using MAS strategy. The BC4F2 population from cross one were screened using target markers including, PB7/PB8 (Xa21) PAxa5 (xa5) and RM7243/RM5509 (xa33). The results showed that six lines obtained bacterial blight resistance genes with homozygousgenotype. Meanwhile, BC4F1 population from cross three were screened using target markers including, RM10783 indel (Sub1) RM589 SSR24 (Bph3) RM225 RM50 (qBph6) RM277

1) ศนยวจยขาวพษณโลก อ.วงทอง จ.พษณโลก 65130 โทรศพท 0-5531-1184 Phitsanulok Rice Research Center, Wang Thong, Phitsanulok 65130 Tel. 0-5531-1184

2) กองวจยและพฒนาขาว กรมการขาว จตจกร กรงเทพฯ 10900 โทรศพท 0-2579-3693 Division of Rice Research and Development, Rice Department, Chatuchak, Bangkok 10900 Tel. 0-2579-3693 3 ) หนวยปฏบตการคนหาและใชประโยชนยนขาว มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จ.นครปฐม 73140 โทรศพท 0-3435-5195

Rice Gene Discover Unit, Kasetsart University, Kampangsan Campus, Nakhonpatom 73140 Tel. 0-3435-5195

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560 151

(qBph12)and aro-marker (badh2). The results showed that six lines obtained BPH resistance, submergence tolerance gene and aromarker gene. Further crossing between BC4F2 progenies from cross one and BC4F1 progenies from cross two were conducted for genes pyramiding. The results revealed that 18 F1 progenies obtained heterozygous genotype. The F2 segregating population was conducted and screened using molecular marker selection for homozygous lines. Outstanding result showed that PSL16348-MAS-1-MAS-310 obtained homozygous genotype of submergence tolerance (Sub1), BPH resistance gene (Bph3, qBph6 and qBph12) and BB resistance gene (xa5, Xa21 and xa33) . However, 128 lines of F2 were both heterozygous and homozygous genotype in different target genes. Nevertheless, we aim to select homozygous lines from F3 segregating population in next round.

Keywords: submergence tolerance, brown planthopper, bacterial blight, molecular marker assisted, RD47

บทคดยอ ขาวพนธ กข47 เปนพนธขาวไมไวตอชวงแสง เสถยรภาพดผลผลตสง ซงเกษตรกรนยมปลกในพนท

นาชลประทานภาคเหนอตอนลาง แตในสภาพทไมเหมาะสม เชน น าทวม การระบาดของเพลยกระโดด สน าตาล โรคขอบใบแหง ท าใหผลผลตลดลง งานวจยนจงมวตถประสงค เพอปรบปรงพนธขาว กข47 ใหทนตอน าทวมฉบพลน ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล และโรคขอบใบแหง โดยใชเครองหมายโมเลกลในการคดเลอก โดยงานวจยนเรมด าเนนการในป 2556 โดยการสรางแผนการผสมพนธ 2 ชดการผสม ชดท 1 เปนการผสมพนธ กข47 ใหมความตานทานตอโรคขอบใบแหงจากพนธ ปนเกษตร 1 มยนเปาหมายคอ xa5, Xa21 และ xa33 ชดการผสมท 2 เปนการผสมพนธสามทางระหวาง กข47 กบพนธหอมชลสทธ (ทนทานตอน าทวมฉบพลน Sub1 และมความหอม badh2) และ ชยนาท 1 (ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล Bph3, qBph6 และ qBph12) ซงใหลกษณะททนตอน าทวมฉบพลน มความหอม และตานทานตอเพลยกระโดด สน าตาล และน าประชากรจากชดการผสมท 1 และ 2 น ามาผสมพนธเพอสรางประชากรทมลกษณะทนตอน าทวมฉบพลน ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล โรคขอบใบแหง และใหมความหอม คอ ชดการผสมท 1 น าประชากร BC4F2 (Xa5, Xa21 และ Xa33) ลกษณะทางพนธกรรมแบบ Homozygous จ านวน 6 ตน เปนสายพนธแม ผสมกบชดการผสมท 2 ประชากรรน BC4F1 (Sub1, badh2, Bph3, qBph6 และ qBph12) ทมพนธกรรมแบบ Heterozygous จ านวน 6 ตน เปนสายพนธพอ ไดประชากรชวท 1 F1 จ านวน 368 ตน แลวคดเลอกตนทมยนเปาหมายครบทกต าแหนง (Sub1, badh2, Bph3, qBph6, qBph12, xa5, Xa21 และ xa33) ทมพนธกรรมแบบ Heterozygous ไดจ านวน 18 ตน และปลอยใหผสมตวเองสรางประชากร F2 แลวสามารถคดเลอกตนทมยนเปาหมายครบทกต าแหนง 1 ตน คอ สายพนธ PSL16348-MAS-1-MAS-310 และ

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

152 การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560

ตนทม ยนเปาหมายทงแบบ homozygous และ heterozygous จ านวน 128 ตน ปลอยใหผสมตวเอง สรางประชากรชวท 3 เพอคดเลอกสายพนธทมยนเปาหมายแบบ homozygous ตอไป ค าส าคญ: ทนตอน าทวมฉบพลน เพลยกระโดดสน าตาล โรคขอบใบแหง เครองหมายโมเลกล

ค าน า ขาวพนธ กข47 เปนพนธขาวไมไวตอชวงแสง สามารถปลกไดตลอดทงป มศกยภาพในการใหผล

ผลตขาวคอนขางสง อายเกบเกยวประมาณ 104-112 วน รบรองพนธในป พ.ศ. 2553 ใหผลผลตเฉลย 793 กโลกรมตอไร มลกษณะเดน คอ ใหผลผลตสง มเสถยรภาพทด คณภาพเมลดทางกายภาพด เปนขาวเจาเมลดเรยวยาว ทองไขนอย คณภาพการสดถงดมาก สามารถเปนขาวสาร 100 เปอรเซนตได คอนขางตานทานเพลยกระโดดสน าตาลดกวาขาวพนธ กข41 และคอนขางตานทานโรคไหมดกวาขาวพนธพษณโลก 2 แตยงมขอควรระวง เนองจากออนแอตอเพลยกระโดดสน าตาลชวชนดท 5 และเพลยกระโดด สน าตาลจากจงหวดนครปฐม ออนแอตอโรคขอบใบแหง และในปจจบนปญหาของสภาพแวดลอม เชน น าทวม การขาดแคลนน า การระบาดของโรคและแมลงรนแรงมากขน ซงพนธ ขาว กข47 ยงออนแอตอลกษณะดงกลาวท าใหสญเสยผลผลตไปมากกวา 30-40 เปอรเซนต ของผลผลตทควรจะไดรบ กรมการขาวไดรวมมอกบส านกงานพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงชาต (สวทช.) พฒนาพนธขาว กข47 ใหทนตอน าทวมฉบพลน และเพลยกระโดดสน าตาล แตยงคงลกษณะของพนธ กข47 โดยใชวธการผสมกลบซงเปนการปรบปรงพนธขาวทมลกษณะตาง ๆ ทดอยแลวแตยงขาดบางลกษณะ การน าเครองหมายโมเลกลเขามาชวยตดตามยนเปาหมายทตองการ สามารถน ามาตรวจสอบตดตามลกษณะทางพนธกรรมในระหวางขนตอนกระบวนการปรบปรงพนธ ไดอยางรวดเรว ถกตองแมนย า กอนด าเนนการทดลองเปรยบเทยบผลผลตและเขาสกระบวนการปรบปรงพนธตามมาตรฐานของกรมการขาวตอไป

อปกรณและวธการ

1. การผสมพนธขาว แบงชดการผสมออกเปน 2 ชด คอ ชดการผสมท 1 และ 2 เมอสรางสายพนธในแตละชดเรยบรอยจงน ามาผสมพนธกนเปนการผนวกยนรวมกน (Pyramid) (Fig.1) ชดการผสมท 1 การพฒนาพนธขาว กข47 ใหตานทานตอโรคขอบใบแหง

ท าการผสมพนธ โดยใชพนธ กข47 เปนพนธแม และใชพนธ ปนเกษตร 1 (Pin Kaset 1-PY-BB; พนธจากโครงการทไดรบการสนบสนนจาก สวทช.) ทไดรบการผนวกยนตานทานโรคขอบใบแหง (xa5, Xa21, xa33) เปนสายพนธพอ ใชวธการผสมกลบไปหา กข47 โดยผสมกลบถงชวท 4 (BC4F2) ในแตละชวจะตองปลกประมาณ 400 ตน คดเลอกตนทมยนเปาหมายโดยใชเครองหมายโมเลกลดงแสดงใน (Table 1) คดเลอก และน ามาผสมกลบจนถงชวท 3

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560 153

ชดการผสมท 2 การพฒนาพนธขาว กข47 ใหทนตอน าทวมฉบพลน และตานทานเพลยกระโดดสน าตาล ผสมพนธจากลกชวท 1 ของพนธหอมชลสทธ ทมยน Sub1 และ Badh2 และ ชยนาท 1 ทผนวกยน

ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล (Chai Nat 1-BPH-PY; Bph3RH, qBph6AB และ qBph12AB) ซงไดรบการสนบสนนจาก สวทช. กบพนธ ขาว กข47 และพฒนาโดยใชวธการผสมกลบไปหา กข47 จนถงชวท 4 (BC4F1) ในแตละชวจะตองปลกประมาณ 400 ตน คดเลอกตนทมยนเปาหมายโดยใชเครองหมายโมเลกลดงแสดงใน(Table 1) คดเลอก และน ามาผสมกลบจนถงชวท 4 2. การสกดดเอนเอ (DNA extraction)

เกบใบออนขาวอายประมาณ 3 สปดาห น ามาสกดดเอนเอโดยใชเทคนค DNA trapping ท หนวยปฏบตการคนหาและใชประโยชนยนขาว มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ดงน - ตดตวอยางใบขาวขนาดประมาณ 1 มลลเมตร ลงใน block น าไปบดใหละเอยดโดยใชเครอง tissue striker - ใส extraction buffer ปรมาตร 600 µ l เขยาใหเขากน โดยใชเครอง MixMate ความเรวรอบ 1,300 รอบตอนาท นาน 1 นาท ทงนความเรวรอบขนอยกบขนาดความสงของ block และปรมาณ buffer - บมตวอยางทได ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 ชวโมง เขยาทกๆ 20 นาท โดยใชเครอง MixMate ความเรวรอบ 700 รอบตอนาท นาน 1 นาท

- น าตวอยางออกจากเครอง incubate วางไวบนน าแขง 5 นาท เพอหยดการท างานของ enzyme จากนนเตมสาร neutralizer ปรมาตร 100 µl เพอจบ Protein อนๆ ทไมใช DNA ใหแยกออกแลวเขยาใหเขากนโดยใชเครอง MixMate ทความเรวรอบ 1,400 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท แลววางบนน าแขง 5 นาทแลวปนเหวยง (centrifuge) ทความเรวรอบ 4,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท - ถายตวอยางสวนใสลงใน block ใหม ประมาณ 400 µl เตม trapping buffer ปรมาตร 500 µl เพอใหดเอนเอ ตกตะกอน เขยาเบาโดยใชเครอง MixMate ทความเรวรอบ 400 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท จากนนปนเหวยงตวอยางทความเรวรอบ 2,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เทสวนใสทง - ลางตะกอนดวยการเตมสาร washing buffer I ปรมาตร 100 µ l เขยาใหเขากนดวยเครอง MixMate ความเรวรอบ 2,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท แลวเตม washing buffer I ปรมาตร 400 µl เขยาใหเขากนดวยเครอง MixMate ความเรวรอบ 1,500 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท แลวปนเหวยงทความเรวรอบ 2,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท จากนนเทสวนใสทง - ลางตะกอนดวยการเตมสาร washing buffer II ปรมาตร 100 µ l เขยาใหเขากนดวยเครอง MixMate ความเรวรอบ 2,000 รอบตอนาท เวลา 1 นาท แลวเตม washing buffer II ปรมาตร 400 µl เขยาใหเขากนดวยเครอง MixMate ความเรวรอบ 1,500 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท แลวปนเหวยงทความเรวรอบ 3,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท จากนนเทสวนใสทง - ตากตะกอนใหแหงโดยบมทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง หรอจนกวาตะกอนแหงสนท - เตม elution buffer 100 µl แลวเขยาใหเขากน บมทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

154 การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560

x

x

x

x

x

x

x

- ปนเหวยงทความเรวรอบ 4,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท ดงสวนใสใสหลอด 0.2 มลลลตร - น าดเอนเอทไดไปตรวจสอบค ณภาพและปรมาณ โดยใชเทคนค gel electrophoresis เปรยบเทยบกบดเอนเอมาตรฐาน

Fig.1 Breeding scheme for development of RD47 rice variety for submergence tolerance, brown planthopper and bacterial blight resistance using marker assisted selection

Hawm Chonlasit(Sub1)

Chai Nat 1

BPH-PY(Bph3+QBph6+QBph12)

F1 MAS RD47 (Heterozygous)

F1 RD47 MAS

BC1F1 RD47 MAS

RD47

MAS

BC4F1

RD47

BC4F1

RD47

MAS

MAS

Pin Kaset 1

BLB-PY (xa5, Xa21, xa33)

F1

BC1F1

BC4F2

MAS

MAS (Homozygous)

F1

F2 (Homozygous) MAS

Cross 1 Cross 2

pyramiding

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560 155

Table 1 DNA markers used for selection of certain genotype in breeding scheme

No. Markers Traits Chromosome Type of markers

Cross 1: RD47 carrying BB resistance genes 1. PB7/PB8 Bacterial blight (Xa21) 11 Gene specific marker

2. PAxa5 Bacterial blight (xa5) 5 Gene specific marker

3. RM5509- RM7243 Bacterial blight (xa33) 6 SSR marker

4. Waxy Waxy (Wxb) 6 SSR marker

5. SSIIa (SNP2340-41) Gelatinization temperature Gene specific marker

Cross 2: RD47 carrying a submergence tolerance gene (Sub1) and BPH resistance genes

1. R10783Indel Submergence (Sub1) 9 Gene specific marker

2. RM589 Brown planthopper (Bph3) 6 SSR marker

3. SSR24 Brown planthopper (Bph3) 6 SSR marker

4. SSR25 Brown planthopper (Bph3) 6 SSR marker

5. RM225 Brown planthopper (qBph6) 6 SSR marker

6. RM50 Brown planthopper (qBph6) 6 SSR marker

7. RM227 Brown planthopper(qBph12) 12 SSR marker

8. Aromarmarker Aroma (badh2) 8 Gene specific marker

การใชเครองหมายโมเลกลในการคดเลอกลกษณะเปาหมาย (marker assisted selection) น าตวอยางดเอนเอมาเพมปรมาณดเอนเอเปาหมาย โดยใชเทคนคปฏกรยาลกโซจ าลองตว (polymerase chain reaction; PCR) โดยคดเลอกลกษณะทสนใจดวยเครองหมายโมเลกลทจ าเพาะตอยน (specific gene marker) และไมโครแซทเทลไลท (SSR marker) ทมความใกลชด (flanking หรอ linkage) กบต าแหนงยนทสนใจ ซงมรายละเอยดของปฏกรยาลกโซจ าลองตวเอง (PCR) ดงตอไปน 1) เค รองหมาย PB7/PB8 R10783Indel RM5509 RM7243 RM589 SSR24 SSR25 RM225 RM50 RM277 และ badh2 เพมปรมาณดเอนเอโดยใช PCR reaction ปรมาตร 10 µl ประกอบดวย DNA template 20 ng, 1X PCR buffer, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mMdNTPs, 0.2 µM Forward primers, 0.2 µM Reward primers, 0.25 U Taq DNA polymerase เตม deionized water จนไดปรมาตรสดทาย 10 µl เพมปรมาณดเอนเอโดยใช PCR reaction ดงน อณหภม Pre-denaturation 94 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท 1 รอบ ตามดวยอณหภม denature 94 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท อณหภม annealing 55 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท และอณหภม extension 72 องศาเซลเซยส นาน 1 นาท จ านวน 35 รอบ และ long extension ท 72 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท น า PCR products มาแยกขนาดด เอน เอใน 1.2% Agarose gel electrophoresis (PB7/PB8) แ ล ะ 4.5% polyacrylamide gel electrophoresis (R10783 Indel RM5509 RM7243 RM586 SSR24 SSR25 RM225 RM50 RM277 และ badh2) 2) เครองหมาย PAxa5 เพมปรมาณดเอนเอโดยใช PCR reaction ปรมาตร 10 µl ประกอบดวย DNA template 20 ng, 1X PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mMdNTPs, 0.2 µM primer PAxa5F1 PAxa5F2

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

156 การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560

PAxa5R1 และ 0.1 µM primer PAxa5R2, 0.5 U Taq polymerase เต ม deionized water จน ได ป รม าตรสดทาย 10 µl เพมปรมาณดเอนเอโดยใช PCR reaction ดงน อณหภม Pre-denaturation 95 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท 1 รอบ ตามดวยอณหภม denature 95 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท อณหภม annealing 57 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท และอณหภม extension 72 องศาเซลเซยส นาน 1 นาท จ านวน 35 รอบ และ long extension ท 72 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท น า PCR products มาแยกขนาดดเอนเอใน 2.5% Agarose gel electrophoresis 3) เครองหมาย SSIIa เพมปรมาณดเอนเอโดยใช PCR reaction ปรมาตร 10 µl ประกอบดวย DNA template 20 ng, 1 PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.5X Enhancer, 0.2 mMdNTPs, 0.125 µM primer P, 0.125 µM primer Q, 0.25 µM primer TT, 0.25 µM primer GC และ 0.5 U Taq polymerase และเตม deionized water จนไดปรมาตรสดทาย10 µl เพมปรมาณดเอนเอโดยใช PCR reaction ดงน อณหภม Pre-denaturation 95 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท 1 รอบ ตามดวยอณหภม denature 95 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท อณหภม annealing 62 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท และอณหภม extension 72 องศาเซลเซยส นาน 1 นาท จ านวน 40 รอบ และ long extension ท 72 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท น า PCR products มาแยกขนาดดเอนเอใน 2.5% Agarose gel electrophoresis การคดเลอกลกผสมตรวจสอบโดยวธ SNP Genotyping ดวยเครอง Quant Studio เครองหมาย PAxa5 (xa5), PB7/PB8 (Xa21) และ Aroma marker (badh2) เพมปรมาณดเอนเอโดยใช PCR reaction ปรมาตร 5 µl ประกอบดวย DNA template 20 ng 1.5 µl, GT-express (2x) 2.5µl, Assay probe Primer (40x) 0.125 µl และเตม deionized water 0.875 µl จนไดปรมาตรสดทาย 5µl

ผลการทดลองและวจารณ

การผสมพนธขาว ชดการผสมท 1 สรางคผสมเพอเพมยนตานทานโรคขอบใบแหงในพนธ ขาว กข47 เรมผสมเพอสราง

ประชากร BC1F1 BC2F1 BC3F1 และ BC4F1 ในแตละชวท าการผสมไดจ านวนเมลด 374 1,912 1,964 และ 462 เมลด ตามล าดบ ปลกเพอคดเลอกตนทมยน xa5 (โดยใชเครองหมายโมเลกล Paxa5) Xa21(PB7/PB8), xa33 (RM7243 และ RM5509) และ Waxy (Wxb) โดยใชเครองหมายโมเลกลชวยในการคดเลอก (Marker-Assisted Selection, MAS) โดยในแตละชวปลกจ านวน 187 400 280 และ 385 ตน และสามารถคดเลอกได BC1F1

จ านวน 63 สายพนธ น าไปผสมกลบ 10 สายพนธ BC2F1 จ านวน 34 สายพนธ น าไปผสมกลบ 14 สายพนธ BC3F1 จ านวน 7 สายพนธ น าไปผสมกลบ และ BC4F1 จ านวน 12 สายพนธ ประชากรในแตละชวจาก BC1F1 ถง BC4F1 จะคดเลอกลกษณะพนธกรรมแบบ Heterozygous ดงภาพท 2 (A) และปลอยใหผสมตวเองเปนประชากรชวท BC4F2 และปลก จ านวน 2,000 ตน คดเลอกลกษณะพนธกรรมแบบ Homozygous สามารถคดเลอกได จ านวน 32 สายพนธ และน า 10 สายพนธไปผนวกยนสรางประชากรชวท 1 กบชดการผสมท 2

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560 157

ชดการผสมท 2 สรางคผสมเพอเพมยนทนตอน าทวมฉบพลน (Sub1) ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล (Bph3RH,qBph6AB และ qBph12AB) และความหอม (badh2) ในพนธขาว กข47 เรมผสมเพอสรางประชากร F1 BC1F1 BC2F1 BC3F1 และ BC4F1 ในแตละชวท าการผสมไดจ านวนเมลด 387 3,007 2,271 1,146 และ 1,085 เมลด ตามล าดบ ปลกคดเลอกยนทนน าทวมฉบพลน ตานทานเพลยกระโดดสน าตาลโดยใชเครองหมายโมเลกลชวยในการคดเลอก คดเลอกลกษณะพนธกรรมแบบ Heterozygous ดงภาพท 3 ปลกจ านวน 387 400 400 377 และ 400 ตน ในแตละชว และสามารถคดเลอกได F1 16 สายพนธ น าไปผสมกลบ BC1F1 จ านวน 10 สายพนธ BC2F1 จ านวน 9 สายพนธ BC3F1 จ านวน 4 สายพนธ และ BC4F1 จ านวน 6 สายพนธ และน าประชากรผสมกลบชวท BC4F1 จ านวน 6 สายพนธ ผสมกบประชากรชวท BC4F2 ของชดการผสมท 1

ชดการผสมพนธเพอผนวกยน ทนตอน าทวมฉบพลน ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล และโรคขอบใบแหง คณภาพขาวนม และมความหอม ไดน าตน BC4 จากชดการผสมท 1 และ 2 มาผสมพนธกนโดยให BC4F2 จากชดการผสมท 1 (ตานทานโรคขอบใบแหง เปนพนธแม) และ BC4F1 จากชดการผสมท 2 เปนพนธพอ ผสมพนธทงหมดจ านวน 30 คผสม สามารถเกบเกยวไดเมลด F1 จ านวน 349 เมลด และน ามาปลกทงหมด 349 สายพนธ สามารถคดเลอกตนทมยนเปาหมาย ทนตอน าทวมฉบพลน ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล โรคขอบใบแหง และคณภาพขาวนม และมความหอม ไดทงหมด 18 สายพนธ แตยงมลกษณะพนธกรรมแบบ Heterozygous ปลอยใหผสมตวเองเปนประชากร F2 แลวคดเลอกมา 5 ประชากรมาปลก จ านวน 3,000 สายพนธ ท าการคดเลอกไดทงหมด 129 สายพนธ ซงแบงออกเปน 12 กลมทมยนตางกน มตนทประกอบดวยทมยนเปาหมายทนตอน าทวมฉบพลน (Sub1) ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล (Bph3, qBph6, qBph12) โรคขอบใบแหง (xa5, Xa21, xa33) ครบทกต าแหนงจ านวน 1 ตน (Table 2-3)

Table 2 Twelve groups of F3 population differentiated by marker assisted selection Group DND marker Number of selected plants

1 Sub1 Bph3 qBph6 qBph12 xa5 Xa21 xa33 1 2 Sub1 Bph3 qBph6 qBph12 xa5 1 3 Sub1 Bph3 qBph6 xa5 6 4 Sub1 Bph3 qBph6 xa5 xa33 3 5 Sub1 Bph3 xa5 Xa21 xa33 2 6 Sub1 Bph3 xa5 Xa21 11 7 Sub1 Bph3 xa5 xa33 13 8 Sub1 Bph3 xa5 37 9 Sub1 xa5 Xa21 xa33 4 10 Sub1 xa5 Xa21 9 11 Sub1 xa5 xa33 7 12 Sub1 xa5 35

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

158 การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560

Table 3 Designation of selected lines from twelve groups differentiated by marker assisted selection

Group Designation

1 PSL16348-MAS-1-MAS-310

2 PSL16340-MAS-10-MAS-530

3 PSL16333-MAS-MAS-38, PSL16336-MAS-9-MAS-355(Aroma), PSL16336-MAS-9-MAS-357, PSL16336-MAS-9-MAS-359(Aroma), PSL16336-MAS-9-MAS-495, PSL16347-MAS-11-MAS-173

4 PSL16348-MAS-1-MAS-180 (Aroma), PSL16340-MAS-10-MAS-484, PSL16347-MAS-11-MAS-99

5 PSL16333-MAS-MAS-377, PSL16347-MAS-11-MAS-267

6 PSL16333-MAS-MAS-217, PSL16333-MAS-MAS-419, PSL16333-MAS-MAS-460, PSL16333-MAS-MAS-476(Aroma)(Waxy), PSL16336-MAS-9-MAS-81(Aroma), PSL16336-MAS-9-MAS-116, PSL16336-MAS-9-MAS-386(Aroma), PSL16336-MAS-9-MAS-477, PSL16347-MAS-11-MAS-6, PSL16347-MAS-11-MAS-49(Aroma), PSL16347-MAS-11-MAS-226

7 PSL16333-MAS-MAS-238(Aroma), PSL16333-MAS-MAS-288, PSL16333-MAS-MAS-486, PSL16336-MAS-9-MAS-258, PSL16336-MAS-9-MAS-488, PSL16336-MAS-9-MAS-505, PSL16340-MAS-10-MAS-240, PSL16340-MAS-10-MAS-376, PSL16340-MAS-10-MAS-545, PSL16347-MAS-11-MAS-151, PSL16347-MAS-11-MAS-188, PSL16347-MAS-11-MAS-271, PSL16347-MAS-11-MAS-306

8 PSL16348-MAS-1-MAS-107, PSL16348-MAS-1-MAS-123, PSL16348-MAS-1-MAS-303, PSL16333-MAS-MAS-287, PSL16333-MAS-MAS-300, PSL16333-MAS-MAS-423, PSL16333-MAS-MAS-426, PSL16333-MAS-MAS-430, PSL16333-MAS-MAS-447, PSL16333-MAS-MAS-507, PSL16333-MAS-MAS-573(Aroma), PSL16336-MAS-9-MAS-99(Aroma), PSL16336-MAS-9-MAS-118, PSL16336-MAS-9-MAS-157, PSL16336-MAS-9-MAS-188, PSL16336-MAS-9-MAS-192, PSL16336-MAS-9-MAS-237, PSL16336-MAS-9-MAS-243, PSL16336-MAS-9-MAS-318, PSL16336-MAS-9-MAS-322, PSL16336-MAS-9-MAS-368, PSL16336-MAS-9-MAS-434(Aroma), PSL16336-MAS-9-MAS-491, PSL16336-MAS-9-MAS-522(Aroma), PSL16336-MAS-9-MAS-524, PSL16336-MAS-9-MAS-586(Aroma), PSL16340-MAS-10-MAS-15, PSL16340-MAS-10-MAS-139, PSL16340-MAS-10-MAS-312, PSL16347-MAS-11-MAS-20, PSL16347-MAS-11-MAS-37(Aroma), PSL16347-MAS-11-MAS-45, PSL16347-MAS-11-MAS-88, PSL16347-MAS-11-MAS-105, PSL16347-MAS-11-MAS-109, PSL16347-MAS-11-MAS-177, PSL16347-MAS-11-MAS-248

9 PSL16333-MAS-MAS-376(Waxy), PSL16336-MAS-9-MAS-479(Waxy), PSL16340-MAS-10-MAS-324, PSL16340-MAS-10-MAS-400

10 PSL16348-MAS-1-MAS-112(Aroma), PSL16348-MAS-1-MAS-142, PSL16348-MAS-1-MAS-278, PSL16348-MAS-1-MAS-289, PSL16333-MAS-MAS-305(Waxy), PSL16333-MAS-MAS-349(Waxy), PSL16340-MAS-10-MAS-250, PSL16340-MAS-10-MAS-393, PSL16347-MAS-11-MAS-256(Waxy)

11 PSL16348-MAS-1-MAS-163, PSL16348-MAS-1-MAS-293, PSL16348-MAS-1-MAS-304, PSL16348-MAS-1-MAS-457, PSL16340-MAS-10-MAS-163, PSL16340-MAS-10-MAS-326, PSL16340-MAS-10-MAS-501

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560 159

Group Designation

12 PSL16348-MAS-1-MAS-29(Aroma), PSL16348-MAS-1-MAS-56, PSL16348-MAS-1-MAS-79, PSL16348-MAS-1-MAS-114, PSL16348-MAS-1-MAS-236(Aroma), PSL16348-MAS-1-MAS-308, PSL16348-MAS-1-MAS-320, PSL16333-MAS-MAS-263(Waxy), PSL16333-MAS-MAS-308(Waxy), PSL16333-MAS-MAS-341(Waxy), PSL16333-MAS-MAS-392(Waxy), PSL16333-MAS-MAS-461(Waxy), PSL16333-MAS-MAS-472(Waxy), PSL16333-MAS-MAS-494(Waxy), PSL16336-MAS-9-MAS-82(Aroma)(Waxy), PSL16336-MAS-9-MAS-8(Aroma), PSL16336-MAS-9-MAS-113(Aroma)(Waxy), PSL16336-MAS-9-MAS-275(Aroma)(Waxy), PSL16336-MAS-9-MAS-504(Waxy), PSL16336-MAS-9-MAS-560(Aroma)(Waxy), PSL16336-MAS-9-MAS-568(Waxy), PSL16340-MAS-10-MAS-103, PSL16340-MAS-10-MAS-129, PSL16340-MAS-10-MAS-261, PSL16340-MAS-10-MAS-267(Aroma), PSL16340-MAS-10-MAS-276(Aroma), PSL16340-MAS-10-MAS-311, PSL16340-MAS-10-MAS-394, PSL16340-MAS-10-MAS-459, PSL16340-MAS-10-MAS-476, PSL16340-MAS-10-MAS-477, PSL16340-MAS-10-MAS-494, PSL16340-MAS-10-MAS-542, PSL16340-MAS-10-MAS-571, PSL16347-MAS-11-MAS-112(Waxy)

(A) (B) (C)

Fig. 2 Allelic Discrimination Plots derived from QuantStudio 12K Flex Real Time PCR system; the SNP technology showing selected population using three DNA markers including, PAxa5; xa5 (A) R10783Indel; Sub1 (B) Aroma marker; Aroma; badh2 (C)

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

160 การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560

(A) (B)

(C)

(D)

Fig. 3 DNA patterns show the results of selected population using SSR marker including, RM589 (A) RM50 (B) RM225 (C) RM277 (D)

สรปผลการทดลอง

จากการพฒนาพนธขาว กข47 ใหทนตอน าทวมฉบพลน ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล และโรคขอบใบแหง การพฒนาประชากรแบงออกเปนสองชด ชดแรกเปนการผนวกยนตานทานโรคขอบใบแหง xa5, Xa21 และ xa33 เขาสพนธ กข47 ชดทสองเปนการผนวกยนทนตอน าทวมฉบพลน Sub1 ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล Bph3 qBph6 และ qBph12 เขาสพนธ กข47 ทงสองชดไดท าการปรบปรงพนธโดยวธผสมกลบจนถงประชากรชวท 4 น าประชากรทงสองชดการผสม คอ ชดการผสมท 1 ประชากรชวท 4 (BC4F2) และชดการผสมท 2 ประชากรชวท 4 (BC4F1) มาผสมค (double cross) สรางประชากรชวท 1 (F1) และคดเลอกโดยใชเครองหมายโมเลกล สามารถคดเลอกไดทงหมด 18 สายพนธ ทแสดงพนธกรรมแบบ heterozygous ในทกต าแหนงยนเปาหมาย ปลอยใหผสมตวเองสรางประชากรชวท 2 (F2) คดเลอกตนทมยนเขาคกนพนธกรรมแบบ homozygous ครบทกต าแหนง พบจ านวน 1 สายพนธ คอ PSL16348-MAS-1-MAS-310

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560 161

และสายพนธ ทมพนธกรรมแบบ homozygous และ heterozygous อกจ านวน 128 สายพนธ ทมยนไมครบทกต าแหนง (Table 3) ปลอยใหผสมตวเองสรางประชากรชวท 3 (F3) ปลกคดเลอกสายพนธ ทมพนธกรรมแบบ homozygous พรอมทงคดเลอกลกษณะทดทางการเกษตรในแปลงทดลอง และจะน าเมลดทไดไปประเมนลกษณะทนน าทวมแบบฉบพลน ตานทานเพลยกระโดดสน าตาล และโรคขอบใบแหงตอไป

ค าขอบคณ คณะผ วจยขอขอบพระคณผบงคบบญชาทกทานทไดใหค าปรกษา สนบสนน ตลอดจนอ านวยความสะดวกในการด าเนนงานวจยจนไดผลงานส าเรจในระดบหนง ขอขอบคณเจาหนาท พนกงานราชการ คนงานทดลองการเกษตร ลกจางทกทานทชวยปฏบตงานจนประสบผลส าเรจ ขอขอบคณหนวยปฏบตการคนหาและใชประโยชนยนขาวมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม ทไดใหการสนบสนนเครองมอวทยาศาสตร หองปฏบตการ และสถานทในการปฏบตงาน รวมถงการไดฝกอบรมแนะแนวการท าวจยน และขอขอบคณส านกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต ส านกงานพฒนาการวจยการเกษตร (องคการมหาชน)และศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต (ไบโอเทค) ทไดใหทนสนบสนนการพฒนางานวจย

เอกสารอางอง สรพร เกตงาม. 2546. เครองหมายโมเลกลในการปรบปรงพนธพช. วารสารวชาการ ม. อบ. 5(2): 37-58. องสนา อครพศาล. 2547. เทคนค Polymerase Chain Reaction (PCR). เอกสารโครงการจดอบรมเชง ปฏบต การเรอ ง “DNA Fingerprint and Detection of Genetical Modified Soybeans by the

Polymerase Chain Reaction”. โครงการยอยบณฑตศกษาและวจย สาขาเทคโนโลยชวภาพ เกษตร คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม. หนา 8-11.

Jairin, J., K. Phengrat, S. Teangdeerith, A. Vanavichit, T. Toojinda. 2007. Mapping of a broad- spectrum brown planthopper resistance gene, Bph3, on rice chromosome 6. Mol. Breed. 19: 35-44.

Jairin, J., S.Teangdeerith, P. Leelagud, J. Kothcharerk, K. Sansen, M. Yi, A. Vanavichit and T.Toojinda. 2009. Development of rice introgression lines with brown planthopper resistance and KDML105 grain quality characteristics through marker-assisted selection. Field Crop Res. 110(3): 263-271.

Korinsak, S., K. Sirithunya, and T. Toojinda. 2014. Identifying a source of a bactiral resistance gene Xa5 in rice variety ‘IR62266’ and development of functional marker ‘Paxa5’, the easy agarose based detection. Thai J. Genet. 7(3): 164-172.

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

162 การประชมวชาการขาวและธญพชเมองหนาว ครงท 34 พ.ศ. 2560

Korinsak, S., Sriprakhon, P. Sirithunya, J. Jairin, S. Korinsak, A. Vanavichit and T. Toojinda. 2009, Identification of microsatellite markers (SSR) linked to a new bacterial blight resistance gene xa33 (t) in cultivar ‘Ba7’. Maejo International J. of Sci. and Tech. 3(2): 235-248.

McCouch, S. and S.D. Tankslay. 1991. Development and use of restriction fragment length polymorphisms in rice breeding and genetic. Pp. 109-133. In. Rice biotechnology. Khush, G.S. and Toenniessen, G.H. (eds.) CAB International. Wallingford. Oxon, UK.

การประยกตใชเทคโนโลยการวเคราะหล าดบนวคลโอไทดยคใหม

Division

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent