Zbl. Bakt. Hyg., LAbt. Orig. C 1, 124-132 (1980)

Institut fur Mikrobiologie der Universitat Hohenheim, Stuttgart 70, BundesrepublikDeutschland

Abbau von trans-Zimtsaure durch CWoridazon-abbauende

Bakterien

UWE TITTMANN, WILLI WEGST, RENATE BLECHER undFRANZ LINGENS 1

Received July 30, 1979

Summary

Degradation of trans-Cinnamic Acid by Chloridazone-degrading Bacteria

A chloridazone-degrading bacterium strain E incubated with trans-cinnamic acid accu­mulated cis-2.3-dihydro-2.3-dihydroxy-trans-cinnamic acid in the culture medium. Achloridazone-degrading bacterium strain N incubated with trans-cinnamic acid, accu­mulated 2.3-dihydroxy-trans-cinnamic acid in the culture medium. Each metabolite wasisolated in crystalline form and identified by a variety of conventional chemical techniques­Catechol-2.3-dioxygenase prepared from the strain E converted 2.3-dihydroxy-trans­cinnamic acid to the meta cleavage product. Cell extracts converted the yellow ring fissionproduct. The production of fumaric acid could be detected with high performance liquidchromatography and with fumarase.

Key words: Degradation - trans-Cinnamic acid - Aromatic compounds - ChIor­idazon-degrading bacteria.

Einleitung

Aus verschiedenen Bodenproben Europas, Afrikas, Nord- und 5udamerikas konn­ten Bakterien isoliert werden, die mit Chloridazon als einziger Kohlenstoffquellewachsen (Frohner et aI., 1970; Lingens et aI., 1977). Chloridazon, £ruher als "Pyra­zon" bezeichnet, (S-Amino 4-chlor-2-phenyl-2-H pyridazin-3-on) ist der Wirkstoffdes riibenselektiven Herbizids Pyramin®. Diese Verbindung wird von den Bakterienunter Verwendung des Benzolteils metabolisiert (de Frenne et aI., 1973; Haug et aI.,1973; Blabel et aI., 1976; Sauber et aI., 1977; Miiller et aI., 1977). Als weitere Sub­strate konnen auch Phenylpropionsaure und L-Phenylalanin verwertet werden

1 Herrn Professor Dr. Seefelder zum 60. Geburtstag gewidmet.

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(Lingens et aI., 1977). Ober den Abbauweg des L-Phenylalanins ist kiirzlich berichtetworden (Buck et aI., 1979a und b). Zur weiteren Charakterisierung der Bakterienwurde der Abbau der trans-Zimtsaure untersucht und mit den schon bekannten Ab­bauwegen verglichen.

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IoMaterial und Methoden

Cerate

Zur Ziichtung der Bakterien dienten Rundschiittelmaschinen der Fa. Braun, Me1sungen.Zellen und Enzymextrakte wurden mit einer Kiihlzentrifuge von Beckman zentrifugiert.Die Fraktionierung von Saulentrennungen erfolgte mit einem Ultrorac-Fraktionssammlerin Verbindung mit einem Uvicord II der Fa. LKB. Zur Registrierung wurde ein PhotometerPMQ III mit dem Schreiber Servogor S eingesetzt. Zur Hochdruckfliissigkeitschromato­graphie diente eine Anlage der Fa. Knauer, Berlin, bestehend aus zwei Hochdruckpumpen,einem Cradientensteuergerat, Dualdetektor, Schreiber und Edelstahlsaulen. UV-Spektrenwurden mit dem Spektrographen DMR 21 von Zeiss aufgenommen, die Massenspektrenmit dem Cerat Varian MAT 311, die CD-Spektren mit einem Jasco-Model J 500 A Spektro­polarimeter und die IR-Spektren mit einem Cerat von Leitz.

Chemikalien

0- und m-Cumarsaure lieferte die Fa. Fluka, Buchs, Schweiz. Zimtsaure und L-Phenyl­alanin, sowie samtliche Mineralsalze wurden von Merck, Darmstadt, bezogen. Chloridazonwurde von der BASF-Ludwigshafen zur Verfiigung gestellt. Alcoa, Aluminiumoxid A 305,stammte von der Aluminum Company of America. DEAE Cellulose DE 52 fiir die Saulen­chromatographie wurde von Whatman bezogen. Fumarase wurde von Boehringer-Mann­heim erhalten.

Bakterienstamme

Es wurden die Stamme E und N der Chloridazon-abbauenden Bakterien aus der Stamm­sammlung des Instituts verwendet.

Kulturmedien

Das Mineralsalzmedium A enthie1t in 1000 ml deion. Wasser:0,3 g KH2PO., 0,7 g Na2HPO. x 12 H20, 0,3 g (NH.)H2PO., 0,7 g (NH.)2HPO., 0,1 g(NH.)2S0., 0,05 g CaCl2 x 6 H20, 0,25 g MgSO. x 7 H20, 0,5 mg HsBO., 0,04 mg CuSO.x 5H20, 0,1 mgKI, 0,2mgFeCls x 6H20, 0,4 mg MnSO. x 4H20, 0,4mgZnSO. x 7H20,0,2 mg (NH.)6Mo,0 2., 0,1 mg Biotin und 0,03 mg Cyanocobalamin. Ais Kohlenstoffquellewurde 1,0 g L-Phenylalanin zugesetzt. Das Medium wurde bei 121 °C 20 min autoklaviert.

Das Mineralsalzmedium B enthie1t in 1000 ml deion. Wasser:0,875 g KH2PO., 0,125 g K2HPO" 0,5 g MgSO. x 7 H 20, 0,1 g NaCl, 0,1 g CaCl2 x 6H20,1,0 g (NH.lsSO., 0,5 mg HsBOs, 0,04 mg CuSO.. x 5 H 20, 0,1 mg KI, 0,2 mg FeCls x.6 H 20, 0,4 mg ZnSO. x 7 H 20, 0,2 mg (NH.).Mo70 .. x 4 H 20, 0,03 mg Cyanocobalamin.

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Das Medium wurde mit NaOH auf einen pH-Wert zwischen 6,8-7,0 eingesteIIt und20 min bei 121°C autoklaviert.

Zuchtungsbedingungen (a)

0,1 I Phenylalanin-Medium im 250 ml-Erlenmeyerkolben wurde mit einer Ose ZeIIenbeimpft und bei 30°C zwei Tage lang geschiittelt. Mit dieser Kultur wurden 2-I-Kolbenmit je 1 I Phenylalanin-Medium angeimpft und bei 30°C inkubiert. Die ZelIen wurdengegen Ende der log-Phase (OD.oo_6oo 0,7-0,9) bei 4 °C und 9000 x g in 30 min abzentrifu­giert. Zu "resting celIs"-Versuchen wurden frische, gegen Ende der logarithmischen Wachs­tumsphase geerntete ZeIIen verwendet. Die ZeIIen wurden in 1/10 Vol. Medium, bezogenauf das Volumen der Anzucht, resuspendiert. AIs C-QueIIe wurde in den "resting ceIIs"­Versuchen trans-Zimtsaure in einer Konzentration von 2 gil eingesetzt. Der pH-Wertwurde auf 7,5 eingestelIt. Die Ansatze wurden bei 30°C 4 Stunden geriihrt und beIiiftet.

Aufarbeitung der Kulturflussigkeiten (a)

Die "resting ceIIs"-Medien wurden im Rundverdampfer auf ein kleines Volumen ein­geengt. AusgefaIIene Salze wurden bei 4 °C und 9000 x g in 20 min abzentrifugiert. DieTrennung der Extrakte erfolgte an einer Sephadex-G-l0-Saule (100 x 2,5 cm). AIs Elutions­mittel diente Wasser. Die erhaltenen Fraktionen wurden diinnschichtchromatographisch,UV-spektroskopisch und mittels Hochdruckfliissigkeitschromatographie auf Metabolitenuntersucht.

Zuchtungsbedingungen (b)

Der Stamm N der Chloridazon-abbauenden Bakterien wurde 4 Tage lang auf 6 Petri­schalen (0,1 % Chloridazon in Mineralsalzmedium) vorgeziichtet. Die gesamte ZeIImassewurde dann auf 2 21-Erlenmeyerkolben iiberimpft, die jeweils 0,5 g Zimtsaure in 1 I Mi­neralsalzmedium enthielten. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen auf der SchiitteI­maschine bei 30°C war die Kulturfliissigkeit braun verfarbt, und der Test auf Brenz­katechinderivate (Arnow, 1937) verlief sehr stark positiv. Daraufhin wurden die ZeIIenabzentrifugiert und das Medium aufgearbeitet.

Aufarbeitung der Kulturflussigkeit (b)

Das Medium wurde am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedampft und derRiickstand mehrmals mit Athanol (96%) extrahiert. Die gesammelten Athanolausziigewurden auf 2-3 ml eingeengt und an eir;er Sephadex LH 20 Saule (2,5 x 100 cm) mitAthanol (96%) chromatographiert. Die Saulentrennung wurde wiederholt und die ent­sprechende Fraktion zur Trockene eingedampft.

Dunnschichtchromatographie

Die Diinnschichtchromatographie diente zur schneIIen Identifizierung der Metaboliten.Es wurden Fertigfolien (8 x 4 cm) von Macherey, Nagel u. Co. und Fertigplatten Kieselgel60 Fm von Merck AG verwendet. Zur Entwicklung dienten folgende Laufmittelsysteme(v:v):1. Chloroform/Eisessig 90: 10.2. Chloroform/Athanol/Aceton 74: 1 :25.

Die Substanzflecken wurden mit UV-Licht lokalisiert, die phenolischen Verbindungenmit diazotierter Sulfanilsaure (Krebs et aI., 1967) und oc-Diole mit Natrium-periodat­Reagenz (Cifonelli u. Smith, 1954) identifiziert.

Hochdruckflussigkeitschromatographie

Zur schnelIen Trennung der Metaboliten wurde eine Edelstahlsaule mit LichrosorbRP-8 (10 It) mit Methanol/Wasser/Eisessig in wechselndem Verhaltnis als Elutionsmittelverwendet.

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Zellaufschlu~ mit Alcoa

Die gefrorenen Zellen wurden in einem tiefgekiihlten Morser mit der 1,5fachen MengeAlcoa zerrieben. Es entstand ein zahfliissiger Brei, der in der 1,5 fachen Menge 0,01 M Phos­phatpuffer pH 7 aufgenommen wurde. Zellriickstande und Alcoa wurden im JA 20 Rotorder Firma Beckman 30 min bei 18000 Dpm abzentrifugiert. AIle Arbeiten wurden bei 4 °Cdurchgefiihrt.

Chromatographie mit DEAE-Cellulose

5 ml Rohextrakt wurden auf eine SauIe (1 cm x 20 cm) mit DEAE-CelIuIose aufgetra­gen. Die SauIe wurde mit 0,01 M KaIiumphosphatpuffer pH 7 gewaschen, bis die Extink­tion des EIuats bei 280 nm unter 0,1 gefallen war. AnschIieJlend wurde mit einem IinearenGradienten aus KaIiumphosphatpuffer pH 7 von 0,01-0,50 M eIuiert. Das GesamtvoIumendes Gradienten betrug 80 m!. Es wurden Fraktionen zu 50 Tropfen aufgefangen.

Enzymtest zur Ermittlung fumarsaurehaItiger Losungen:300 pI KaIiumphosphatpuffer 0,1 M, pH 7, wurden mit 100 pI Substratlosung versetzt.

Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 pI Fumarase (Kristallsuspension 1 :20 verdiinnt)gestartet. Der Dmsatz wurde durch Messung der Extinktion bei 240 nm verfoIgt.

Ergebnisse

Bildung und Isolierung von cis-2,3-Dihydro-2,3-dihydroxy-trans-zimtsiiure

Werden auf L-Phenylalanin gezogene Zellen von Chloridazon-abbauenden Bak-terien, Stamm E, unter "resting-cells"-Bedingungen mit Zimtsaure (1) inkubiert, sokann die Akkumulation einer Verbindung mit IX-Diol-Konstitution im Mediumnachgewiesen werden. Diese Verbindung wurde als cis-2,3-Dihydro-2,3-dihydroxy­trans-zimtsaure (2) identinziert. Durch Chromatographie an Sephadex G 10 lidssich (2) aus dem "resting-cells"-Medium in reiner Form erhalten.

cis-2,3-Dihydro-2,3-dihydroxy-trans-zimtsaure ergibt mit Na-periodat/Benzidinim Test auf IX-Diol-Gruppierungen auf der Dunnschichtplatte eine positive Reaktion.Nach Behandlung der Verbindung mit konz. HCI entsteht neben wenig 3-Hydroxy­zimtsaure bevorzugt 2-Hydroxyzimtsaure, wie sich UV-spektrophotometrisch unddurch Hochdruckflussigkeitschromatographie (HPLC) nachweisen laJSt. Die Bil­dung von 2-Hydroxyzimtsaure kann UV-spektrophotometrisch als Zeit-Reaktionverfolgt werden. Das UV-Maximum von (2) liegt bei 319 nm, gemessen in H 20 (mit0,5 n HCI angesauert).

Die Daten der Massenspektren, speziell der Feld-Desorptionsspektren, stimmenmit der Struktur von (2) uberein. Der Verlust von H20 (M+-18) spricht fur die Bil­dung der phenolischen Verbindung, die ihrerseits ein typisches Fragmentierungs­muster aufweist.

Massenspektrum

MS : m/e = 182 (46%; M+), 164 (53%; M+-H20), 146 (41 %; M+-H20-H20),136 (46%; M+-H20-CO), 119 (39%; M+-H20-COOH), 118 (100%; M+-H20­HCOOH), 107 (61% Aryl-CH?), 91 (93%; M+-H20-COOH-CO). FD-Massen­spektrum: m/e = 182 (M+) und 164 (M+-H20).

Die Verbindung (2) ist optisch aktiv, Abb. 2 zeigt das CD-Spektrum:Besonders ausgepragt ist eine spezif. positive Drehung, die unter EinflufS von konz.

HCI zeitlich abnimmt. Das gebildete Phenol (o-Cumarsaure) ist optisch inaktiv.CD-Spektrum: positive Drehung bei 325 nm und negative Drehung bei 252 nm.

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A

0,9

0,6

0,3

o

nm

salzsaurer Lasung

20r-----------------------,

a

10'-:4-:!-OO::-'--L..L--'::350~-'-..w'='300~-'-..w'='2~50,.J--4-:!-OO::-'--L..L-.L.3.1.50...l-.L.J......L.300.L,-1-.L..L.l-250!-L..J

Abb.2. CD-Spektrum von cis-2,3-Dihydro-2,3-dihydroxy-trans-zimtsaure a: in neutralerLasung und b: in salzsaurer Lasung (in Abhangigkeit von der Zeit).

Hochdruck(liissigkeitschromatographie (HPLC)

Ais Trennsystem wurde eine halbpraparative Edelstahlsaule Lichrosorb RP-8(10ft) mit den Abmessungen: ID = 8 mm, L = 250 mm verwendet. Zur Trennungvon 2- und 3-Hydroxyzimtsaure diente Methanol-Wasser-Eisessig 50: 50 :0.1 (v: v :v)

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als Elutionsmittel. Folgende Retentionszeiten wurden ermitte1t: 3-Hydroxyzimt­saure: 6,9 min und 2-Hydroxyzimtsaure : 9,0 min. bei 5,0 mllmin FlieBgeschwindig­keit. Zur Trennung von cis-2,3-Dihydro-2,3-dihydroxy-trans-zimtsaure (2) dienteMethanol-Wasser-Eisessig: 20: 80: 3 (v: v: v:) als Elutionsmittel. Die Retentionszeitfur (2) betrug: 4,9 min bei 3,0 mllmin FlieBgeschwindigkeit.

Bildung und Isolierung von 2,3-Dihydroxy-trans-zimtsaure

Bei der Inkubation von Chloridazon-abbauenden Bakterien, Stamm N, in Zimt­saure-Mineralsalzmedium B farbt sich die Kulturfliissigkeit nach 2-3 Tagen dunkel.Die Braun- bis Schwarzfarbung wird durch Zersetzungsprodukte VOn 2,3-Dihydroxy­zimtsaure hervorgerufen. Dieses Zwischenprodukt des Zimtsaureabbaus wird vonStamm N in groBer Menge (etwa 50 mg/l) akkumuliert. Durch Chromatographie anSephadex LH 20 wurde (3) in reiner Form erhalten.

1m Brenzkatechintest (Arnow, 1937) reagiert die Verbindung positiv. Bei derChromatographie auf Kiese1ge1-Dunnschichtplatten lauft die Verbindung Unter"Schwanzbildung". Nach mehrstundigem Liegen der Kiese1ge1platte farbt sich derSubstanzfleck hellbraun.

1m UV-Spektrum wurden folgende Maxima ermittelt (in Wasser):AI = 217 nm, All = 281 nm.Massenspektrum: m/e = 180 (56%; M+), 162 (84%; M+-H20), 134 (100%;

M+-H20-CO),78 (36%).Der endgultige Strukturbeweis konnte durch IR-Spektroskopie gewonnen werden:

Die VOn unS mikrobiell gewonnene Verbindung und die von Bohme u. Severin (1957)synthetisierte 2,3-Dihydroxy-zimtsaure ergaben identische IR-Spektren.

Isolierung des Metaspaltprodukts der 2,3-Dihydroxy-trans-zimtsaure

1 ml Rohextrakt (Stamm E, 20 mg Protein/ml) wurde mit 2 ml einer Lasung von2,3-Dihydroxy-trans-zimtsaure (1 mg/ml in 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0)versetzt. Sofort trat eine ge1borange Verfarbung auf. Nach 3 min wurde mit 0,5 nHCl auf pH 3.5 angesauert, dabei schlug die Farbe in hellge1b urn. AnschlieBendwurde mehrmals mit Essigester extrahiert. Beim Eindampfen der vereinigten Ex­trakte wurde ein gelboranges Pulver erhalten.

Nachweis der Fumarsaure als Produkt der enzymatischen Umsetzung des Meta­spaltprodukts

Durch Chromatographie an DEAE-Cellulose konnten aus Rohextrakt (Stamm E,20 mg Protein/ml) enzymatisch aktive Fraktionen erhalten werden, die das Meta­spaltprodukt der 2,3-Dihydroxy-trans-zimtsaure spalten. Diese Fraktionen wurdenzwischen 0,20 M und 0.22 M Pufferkonzentration e1uiert, die Catechol-2,3-dioxy­genase-Aktivitat zwischen 0.25 M und 0.30 M.

Fiir die enzymatische Umsetzung wurden zunachst 6 ml Catechol-2,3-dioxygenase­haltige Fraktionen des Eluats mit 200,u1 (NH4)2Fe(S04)2 (2 mg/ml) versetzt und5 min vorinkubiert. Zur Verringerung der Pufferkonzentration wurden 5 ml H20bidest. zugesetzt.

Die Reaktion wurde durch Zugabe VOn 2 ml 2,3-Dihydroxy-trans-zimtsaure(1 mg/ml) gestartet. Nach 5 min war das Substrat vallig umgesetzt und der Ansatzge1borange gefarbt. Nun wurden die Fraktionen, die das Metaspaltprodukt spalten

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konnen, zugesetzt. Nach 60 min war die enzymatische Reaktion, erkennbar an derEntfarbung des Ansatzes, beendet. Die Losung wurde auf pH 2.0 eingestellt undmehrmals mit Essigester extrahiert. Die Extrakte wurden zur Trockene eingeengtund mit etwas Wasser aufgenommen. Die Losung wurde mit Hochdruckfliissigkeits­chromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Lichrosorb-Ede1stahlsaule RP-18analysiert. Als Elutionsmittel diente Methanol/WasseriEisessiglAcetonitril im Ver­haltnis: 10:90:1:5. Es traten 3 Peaks auf, von denen der Hauptpeak die gleicheRetentionszeit zeigte wie Fumarsaure. Daraufhin wurde untersucht, ob der Essig­ester-Extrakt als Substrat fiir Fumarase dienen kann. Fumarase setzt bei pH 7.0Fumarsaure zu Apfelsaure urn und ist sehr spezifisch. Die Reaktion kann durchAbnahme der Extinktion bei 240 nm verfolgt werden. Sowohl der Extrakt als auchdas Eluat des Hauptpeaks der HPLC-Trennung konnte mit Fumarase umgesetztwerden. Bei der Spaltung des Metaspaltprodukts entsteht also Fumarsaure.

Diskussion

Der Stamm E der Chloridazon-abbauenden Bakterien akkumuliert bevorzugt diecis-2,3-Dihydro-2,3-dihydroxy-Verbindung des Chloridazons (de Frenne et a1.,1973). Dieser Stamm wachst nach einer Adaptationszeit auch auf Phenylalanin.

Bei der Inkubation von auf Phenylalanin geziichteten Zellen mit trans-Zimtsaurewird entsprechend cis-2,3-Dihydro-2,3-dihydroxy-trans-zimtsiiure akkumuliert. DerStamm N der Chloridazon-abbauenden Bakterien unterscheidet sich in einigen Eigen­schaften vom Stamm E. So wachst er ohne Adaptationserscheinungen etwa gleich gutauf Chloridazon und Phenylalanin. Er wandelt geeignete Verbindungen urn in dieBrenzkatechinderivate. Aus Phenylalanin entsteht auf diesem Wege 2,3-Dihydroxy­phenylalanin (Buck et a1., 1979a und b). Mit trans-Zimtsiiure wird 2,3-Dihydroxy­trans-zimtsaure gebildet. Diese Verbindung wird mit der Catechol-2,3-dioxygenaseaus Chloridazon-abbauenden Bakterien (Muller et al., 1977) in ein gelbes, ringoffe­nes Produkt umgewandelt. Dieses meta-Spaltprodukt wird durch einen Enzymroh­extrakt aus Chloridazon-abbauenden Bakterien weiter metabolisiert, wie das Ver­schwinden der gelben Farbe anzeigt. Als eines der zu erwartenden Spaltproduktekonnte Fumarsaure mit Hil£e der Hochdruckfliissigkeitschromatographie nach­gewiesen werden. Zur Bestatigung dieses Nachweises lieR sich erfolgreich die Um­setzung mit Fumarase heranziehen. Den gesamten Abbauweg der trans-Zimtsauredurch Chloridazon-abbauende Bakterien zeigt Abb. 3.

COOHI

HCIICHICOOH

COOH1

HCIICHo

COOHI

HCII

CH H -~OH~OH

H

2

COOH

HeIICH

~OHVOH

3

COOHI

HCII

yH /c=o ~rrr eOOH

~OH [H2~ COOH]VOH

4

Abb. 3. Abbau von trans-Zimtsaure.

Abbau von trans-Zimtsiiure durch Chloridazon-abbauende Bakterien 131

Ober den mikrobiellen Abbau der Zimtsaure durch einen Pseudomonas-Stamm istvon Coulson u. Evans (1959) berichtet worden. 1m Kulturmedium konnten 2-Hydro­xyphenylpropionsaure und 2,3-Dihydroxyphenylpropionsaure nachgewiesen wer­den. In einer weiteren Arbeit ist allsftihrlicher ein gleichartiger Abball durch einePseudomonas Spezies geschildert worden (Blakley u. Simpson, 1964). Zusiitzlich istnoch Phenylpropionsaure nachgewiesen worden.

Da 2-Hydroxyphenylpropionsaure im Gegensatz zur entsprechenden 3-Hydroxy­Verbindung nicht wachstumsaktiv war, wurde ein Abbauweg tiber die Zwischen­produkte Phenylpropionsaure, 3-HydroA)'phenylpropionsaure und 2,3-Dihydroxy­phenylpropionsaure postuliert. In Analogie zu den von uns geschilderten Ergebnissenkann vermutet werden, dag als eigentliches Zwischenprodukt cis-2,3-Dihydro-2,3­dihydroxyphenylpropionsaure auftritt. Aus dieser Verbindung entsteht bevorzugtund spontan 2-Hydroxyphenylpropionsaure. In diesem Abbauweg wird offensicht­lich die Seitenkette zunachst hydriert. In der von uns erstmals beschriebenen Abbau­moglichkeit flir trans-Zimtsaure gibt es keine Hinweise auf einen Hydrierungsvor­gang.

Dank: Herrn Professor Dr. H. Bohme, Marbllrg, danken wir fiir Oberlassllng von2,3-Dihydroxy-trans-zimtsaure als Vergleichssllbstanz. Dem Verband der chemischen In­dllstrie und der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir fiir Unterstutzllng llnsererArbeiten. Herr Dr. Spitzner und Herr Schwinger halfen uns durch Aufnahme der Massen­spektren.

Literatur

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