Upload
mariela-livia-morales
View
13
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA OLEORESINA DEL AJO
(Allium sativum)
LEONARDO CARDONA PAREJA
PAULA ANDREA GONZÁLEZ PATIÑO
DIRECTOR:
MELVIN AROLDO DURÁN
ASESOR:
GLORIA EDITH GUERRERO
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE QUÍMICA
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA OLEORESINA DEL AJO
(Allium sativum)
TRABAJO DE GRADO
Requisito final para optar al titulo de tecnólogo químico
Presentado por:
LEONARDO CARDONA PAREJA
PAULA ANDREA GONZÁLEZ PATIÑO
DIRECTOR:
MELVIN AROLDO DURÁN
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE QUÍMICA
NOTA DE ACEPTACIÓN DE TRABAJO DE GRADO
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA OLEORESINA DEL AJO
(Allium sativum)
Presentado por:
LEONARDO CARDONA PAREJA
PAULA ANDREA GONZÁLEZ PATIÑO
Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez realizada
la versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar:
La nota de ________________________________
Con la connotación: _________________________________
Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy:
Director:
Melvin Aroldo Durán _________________________________
Jurado:
Firma: _________________________________
Jurado:
Firma: _________________________________
DEDICATORIA
Dedicado a nuestras familias por su esmero en formarnos como
seres integrales, a nuestros más especiales y queridos amigos
quienes nos acompañaron en este proceso.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a todas aquellas personas que intervinieron en la realización de
este trabajo de grado, entre ellos el personal administrativo y docente, el
personal encargado de la sala de reactivos, almacén y demás dependencias de
la escuela de química, a los jurados por su disposición al calificar este trabajo
de grado, a nuestros amigos y compañeros, al grupo de investigación de
Oleoquímica, a nuestro director Melvin Aroldo Durán y muy especialmente a
nuestra asesora la doctora Gloria Guerrero.
CONTENIDO
Pág.
ÍNDICE DE TABLAS 8
ÍNDICE DE FIGURAS 9
RESUMEN 10
JUSTIFICACIÓN 12
OBJETIVOS 14
1. MARCO TEÓRICO 15
1.1 Generalidades del Ajo (Allium Sativum) 15
1.2 Química del ajo 17
1.3 Bioquímica del ajo 22
1.4 Metodologías de análisis 26
1.4.1 Análisis fisicoquímicos 26
1.4.2 Análisis microbiológicos 28
1.5 Métodos de extracción 30
1.5.1 Extracción soxhlet 30
1.5.2 Extracción en frío 31
1.6 Análisis instrumental 31
1.6.1 Métodos de separación cromatográfica 31
1.6.2 Espectrometría de masas 32
1.6.3 Cromatografia/Espectrometria de masas GC/MS 33
2. MARCO DE REFERENCIA 34
2.1 Las oleorresinas 34
2.1.1 Oleorresina de ajo 37
3. SECCIÓN EXPERIMENTAL 39
3.1 Material vegetal 39
3.2 Preparación de la muestra 39
3.3 Solventes utilizados 39
3.4 Extracción 39
3.5 Separación del extracto 40
3.6 Análisis fisicoquímicos 40
3.6.1 Materia seca 40
3.6.2 Cenizas 40
3.6.3 Índice de refracción 41
3.6.4 Índice de acidez 41
3.7 ANALISIS GC/MS 41
3.7.1 Preparación de la muestra 41
3.7.2 Condiciones de análisis 41
3.8 Análisis microbiológicos 42
3.8.1 Determinación de Mesófilos aerobios viables 42
3.8.2 Determinación de Mohos y Levaduras 43
3.8.3 Determinación de Coliformes totales 43
3.8.4 Determinación de Coliformes fecales 43
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 44
4.1 Extracción de la oleorresina 44
4.2 Análisis fisicoquímicos 49
4.2.1 Índice de acidez 49
4.2.2 Materia seca 49
4.2.3 Cenizas 50
4.2.4 Índice de refracción 51
4.3 ANÁLISIS GC/MS 51
4.4 Análisis microbiológicos 56
4.4.1 Analisis de Mesofilos, mohos y levaduras 56
4.4.2 Determinación de coliformes totales y coliformes fecales E-coli 57
5. CONCLUSIONES 61
6. RECOMENDACIONES 63
7. BIBLIOGRAFÍA 64
8. ANEXOS 69
8.1 Cromatograma de gases de volátiles en la oleorresina 69
8.2 Fragmentogramas de masas de las sustancias separadas por GC 70
8
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla No. 1: Composición nutritiva del ajo 20
Tabla No. 2: Compuestos azufrados del ajo 24
Tabla No. 3: Compuestos no azufrados del ajo 25
Tabla No. 4: Parámetros microbiológicos de las especias y sus derivados 36
Tabla No. 5: Extracción en frío con ajo blanco 47
Tabla No. 6: Extracción en frío con ajo rojo 47
TablaNo.7: Extracción soxhlet con ajo blanco 48
Tabla No. 8: Extracción soxhlet con ajo rojo 48
Tabla No. 9: Índice de acidez 49
Tabla No. 10: Materia seca 50
Tabla No. 11: Cenizas 50
Tabla No. 12: Índice de refracción y grados Brix 51
Tabla No. 13: Características de los picos cromatográficos 52
Tabla No. 14: Interpretación de los principales fragmentos de los
espectrode masas de cada una de las sustancias presentes en
el cromatograma 53
Tabla No. 15: Recuento de mohos y levaduras 56
Tabla No. 16: Recuento de mesófilos aerobios viables 57
Tabla No. 17: Determinación de Coliformes totales, prueba presuntiva
(sin desinfección previa del material vegetal) 58
Tabla No. 18: Determinación de Coliformes fecales (sin desinfección previa
del material vegetal) 59
Tabla No. 19: Determinación de Coliformes fecales, prueba presuntiva (con
desinfección previa del material vegetal) 59
Tabla No. 20: Determinación de Coliformes fecales (con desinfección previa
del material vegetal) 60
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura No. 1: Descomposición de la alicina en ajoenos 17
Figura No. 2: Efectos del procesado en la formación de diferentes
compuestos bioactivos del ajo 19
Figura No. 3: Diagrama de flujo de la extracción de la oleorresina 46
Figura No. 4: Degradación de la alicina en Ditiinas 56
10
RESUMEN
En los últimos años se ha incrementado la demanda de oleorresinas a nivel
mundial, a pesar de esto, en nuestro país la mayoría de especias se consumen
en forma molida a sin ningún tratamiento previo; desaprovechando las múltiples
ventajas que brindan las oleorresinas.
Por esta razón se desarrollo un método de extracción eficaz y eficiente para la
especia del ajo (Allium sativum). Eligiendo esta especia principalmente por su
fuerte demanda como condimento, por su rico aporte a nivel medicinal, como
nutriente y como agente antimicrobiano.
Para desarrollar el método se realizaron comparaciones entre dos tipos de
extracción:
-Extracción soxhlet: consiste en un método de extracción sólido-liquido, que
se utiliza generalmente para aislar los componentes lipídicos de una muestra,
por medio de un solvente apolar.
-Extracción en frío con agitación: consiste en un método de extracción
sólido-liquido, en el que ambas fases (sólida y liquida) se encuentran en
contacto directo, por lo que los componentes del sólido que son afines al
solvente quedaran disueltos en el mismo.
Se compararon el ajo morado y ajo blanco, así como tres clases de solvente
extractor: etanol 75%, hexano, y etanol 95%: hexano (1:1). Los solventes
fueron elegidos con el fin de probar el nivel de extracción de componentes del
ajo a diferentes polaridades. El único tratamiento previo que sufrió la muestra
fue la maceración y el volumen de solvente que se utilizó para cada ensayo fue
de 100 mL. Cada ensayo se hizo por triplicado y bajo las condiciones más
uniformemente posibles.
11
Para purificar la oleorresina extraída, el solvente fue evaporado en
rotaevaporador.
En conclusión el extracto que presentó las mejores características físicas y
mayor rendimiento es el obtenidos de la extracción en frió con agitación usando
como solvente etanol al 75% y como material vegetativo ajo blanco. Este
método de extracción mostró buena precisión.
Sobre esta oleorresina se aplicaron análisis posteriores para realizar una
caracterización química, estos fueron: Índice de refracción (ntD), materia seca,
cenizas y acidez. Se utilizo la cromatografía/espectrometría de masas GC/MS
para realizar el análisis de volátiles, encontrándose sustancias azufradas
importantes características del ajo, y para asegurar que cumpliera con la
resolución 4241 de 1991 del ministerio de salud pública colombiana se
realizaron las pruebas microbiológicas correspondientes a alimentos y
aplicables a oleorresinas, de esta se tienen: recuento de mohos y levaduras,
recuento de mesófilos aerobios viables, determinación de coliformes totales y
Determinación de Coliformes fecales.
Según los resultados obtenidos en la extracción de la oleorresina, las
características encontradas guardan consistencia con los reportes
bibliográficos, garantizando poder condimentante uniforme, las características
fisicoquímicas, microbiológicas adecuadas y fuerte esencia característica del
ajo.
El método de extracción de la oleorresina proporciona buen rendimiento en
extracto, lo que puede favorecer su implementación en la industria alimentaria.
12
JUSTIFICACIÓN
En Colombia el comercio de oleorresinas no ha tenido una amplia explotación a
pesar de contar con una gran y diversa gama de productos agrícolas, de los
cuales se podría tener un mejor aprovechamiento extrayendo este tipo de
derivados; caso contrario ha ocurrido en otros países tales como Estados
Unidos, Canadá, Reino Unido, Alemania, Francia, y Japón (1).
Las oleorresinas tomaron gran importancia a nivel industrial como especia para
alimentos a partir de 1960, desde entonces, este mercado ha evolucionado
ampliamente dándoles mayor uso y aumentando la variedad de oleorresinas
extraídas (1).
En nuestro país el comercio de las especias es poco tecnificado ya que estas
se consumen casi en su totalidad en forma molida o sin ningún tratamiento
previo, un ejemplo de esta situación es el ajo (Allium sativum) que a pesar de
tener un alto consumo, su producción se realiza con baja tecnificación y en no
muy amplias extensiones de terreno, debido en parte a que sus condiciones de
cultivo exigen temperaturas optimas promedio de 14 a 20 ºC y con baja
humedad relativa(2), lo que restringe en gran medida su producción en muchas
zonas del país, razón por la cual es necesario realizar grandes importaciones
de este producto, desde países pioneros en producción tecnificada que ofrecen
buenas ofertas de costos y un producto con características de alta calidad
física.
A nivel local, en Risaralda no existe producción agrícola de ajo; el producto
consumido en esta región proviene de dos fuentes: una es la producción
nacional (especialmente de ajo morado), la otra de importaciones
13
(especialmente de ajo blanco) de países con grandes producciones como la
China.
Teniendo en cuenta estos aspectos se observa la oportunidad de realizar un
mayor aprovechamiento a la cantidad importada y producida nacionalmente
mediante la extracción de su oleorresina, ya que este tipo de derivados ofrece
múltiples ventajas tales como ser 100% naturales, libres de residuos de
solventes y de residuos de pesticidas, de impurezas y materia extraña, exentos
de bacterias y enzimas, con alta uniformidad en su composición y siendo la
característica más importante el rendimiento económico, ya que dependiendo
de la concentración de la oleorresina, puede sustituir hasta 100 Kg. de producto
en polvo por 1 a 2 Kg. de oleorresina, también asegura una mayor durabilidad
del producto (1,3).
De aquí la pertinencia e importancia de extraer y caracterizar éste producto que
podría tener intereses comerciales debido a su fuerte demanda.
14
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Obtener la oleorresina del ajo (Allium sativum).
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar una metodología eficaz de extracción para la oleorresina del
ajo (Allium sativum).
Realizar análisis fisicoquímicos para determinar las propiedades
generales de la oleorresina.
Realizar análisis microbiológicos para determinar la inocuidad de la
oleorresina.
15
1. MARCO TEORICO
1.1 GENERALIDADES DEL AJO (Allium sativum)
Vegetal perteneciente a la familia de las liliáceas y a la
subfamilia de las Allioideas , la planta esta provista de hojas
largas, estrechas y planas en su mitad inferior, sus flores son de
color blanco-verdoso en forma de sombrilla ubicadas en el
nacimiento de las hojas superiores, los bulbos crecen
subterráneamente en la base del tallo.
Los bulbos constituyen una raíz redondeada y su conjunto es conocido como
“cabeza de ajo”, los dientes de ajo son de color blanco o
amarillento y están recubiertos por una serie de capas
delgadas, las cuales pueden variar de color según el tipo de
ajo (4,5).
Su nombre botánico Allium sativum procede de la palabra celta all, que significa
caliente o ardiente y sativum, término latino que significa cultivado. Esta planta
es originaria de Asia Central, desde allí se extendió hacia el Este hasta
alcanzar la China y hacia el Oeste en dirección a Europa (5). El comercio
europeo facilitó su distribución, lo que hizo del ajo un condimento básico en
muchos alimentos. Los españoles introdujeron el ajo en el continente
americano a finales del siglo XIX (5).
Existen diversas variedades de este vegetal, las más comunes identificados por
su cubierta son (5):
-Ajo blanco o común: es de mayor tamaño que el ajo morado,
es resistente y carnoso, de buena productividad y
conservación, tiene un sabor marcado y aroma persistente.
16
-Ajo rosado o morado: no se conserva en buen estado por
largos periodos de tiempo y son más precoses que el ajo
blanco.
-Ajo rojo: al igual que el ajo morado el color de su cubierta le da su
nombre. Está constituido por un solo diente gigante. Se conoce como ajo
macho.
La variedad que prevalece en todos los países es el ajo blanco, pero existen
otras variedades tales como: la italiana, chilena, californiana, española y
mexicana (6).
El cultivo del ajo requiere un clima templado para lograr su mejor
desarrollo, soporta temperaturas mas bajas que la cebolla, y
durante la formación del bulbo las temperaturas requeridas van
de 0 a 10 grados centígrados, requiere humedad relativa del 60-
70 %, el suelo mas apropiado es el franco-arcilloso con muy buen
drenaje y con un moderado contenido de materia orgánica, el pH óptimo del
suelo esta entre 6.5 a 6.6 y requieren buenas cantidades de abono, el manejo
inadecuado del nitrógeno produce acebollamiento de la planta (los bulbos no
adquieren solidez). Los dientes de ajo que se siembran deben haber cumplido
un proceso de desinfección pertinente y una hiemación. La madurez del ajo se
logra en un periodo de aproximadamente 6 meses y su cosecha se inicia
cuando las hojas de la planta comienzan a marchitarse y el tallo palidece. Las
plagas que mas atacan el cultivo son el piojo o candelilla (Thrips Tabaci) ,
Sclerotium sp, nemátodo del tallo y trozadores (grillos, gusanos, ácaros,
pulgones y hormiga arriera). Dentro de las enfermedades más comunes están
las manchas en las hojas, royas y pudrición de bulbos causados por hongos (2,6).
En Colombia el ajo se debe cultiva en terrenos entre 1700-3000 m.s.n.m., con
temperaturas que oscilen entre los 12 y 18 grados centígrados. Cundinamarca,
Boyacá, y Nariño son los departamentos con mayor producción de ajo en
17
Colombia, mientras que Antioquia, Cesar, Santanderes y Cauca son
productores menores (2).
1.2 QUÍMICA DEL AJO
El análisis de la composición química de la parte comestible del ajo arroja una
riqueza importante en hidratos de carbono (cerca del 30%) y proteínas
(aproximadamente el 6%), su riqueza mineral esta constituida por potasio,
fósforo, magnesio, zinc, yodo, y dentro del contenido vitamínico se destacan las
vitaminas del grupo B, como la B1, B3, B6 y con cantidades pequeñas de
vitamina C y E. Además están contenidas sales de selenio, azucares, lípidos,
saponósidos, terpenos, enzimas, flavonoides y otros compuestos fenólicos. Sin
embargo el contenido energético y nutritivo es marginal, ya que se consume en
muy baja cantidad (7).
Las cualidades químicas características del ajo y sus propiedades salutíferas
se deben en realidad a compuestos azufrados, de los cuales se destaca la
aliina, la cual por si misma constituye hasta un 0.24% del peso global del ajo.
Esta sustancia es poco olorosa y con mínimos efectos terapéuticos, sin
embargo, cuando se corta o machaca el ajo, la aliina entra en contacto con la
enzima alinasa (alrededor del 1% del diente del ajo), y se descompone dando
lugar al ácido 2-propensulfénico. El ácido 2-propensulfénico se dimeriza a su
vez con otra molécula de ácido 2-propensulfénico, dando lugar a la alicina, la
cual proporciona el olor característico del ajo, la alicina es muy reactiva y
produce derivados químicos denominados ajoenos y ditiinas (8,9).
CH2
S+
SCH2
O-
S+
SCH2
CH2
O-
S+
S
CH2
CH2
O-
CH2
S+
SS
CH2
O-
SS
CH2CH2
S+
O-
Alicina
Trans-ajoeno
Cis-ajoeno
Figura No. 1: Descomposición de la alicina en ajoenos(8)
18
La alicina, de fórmula molecular C6H10OS2 y peso molecular de 162.27 g/mol,
es un liquido amarillo de densidad 1.112 g/ml e índice de refracción a 20oC y
con la línea D del sodio de 1.561; Su pH esta cerca de 6.5, tiene solubilidad en
agua a 10oC de alrededor de 2.5% m/m, también es soluble en alcohol, éter y
benceno. Presenta inestabilidad en álcali caliente, pero es estable a ácidos. En
general tiene estabilidad limitada en solución (10).
Otros componentes sobresalientes son la alicina –ajoeno, trans-ajoeno, z-
ajoeno, cis-ajoeno, disulfuro de alilo y sulfuro de alilo (8,9).
Las investigaciones hechas hasta el presente han identificado alrededor de 30
componentes en el ajo con algún efecto beneficioso a la salud con una amplia
gama de actividades metabólicas (9).
En los extractos de ajo, el tipo y concentración de sustancias extraídas,
depende de factores como: grado de madurez del ajo, prácticas de producción
y cultivo, localización de la planta y condiciones de procesamiento. Así, las
propiedades biológicas y las características fisico-químicas pueden variar de
acuerdo a condiciones de pH (la aliinasa se inactiva en pH ácido), solvente
(aumento o disminución de la vida media de la alicina), el almacenamiento
tiene influencia sobre el incremento de componentes azufrados, por la posible
formación de S-alk(en)il-L-cistein sulfóxidos a partir de precursores con g-
glutámico. En general los compuestos azufrados generan una gran cantidad de
reacciones químicas características, las cuales producen muchos de los
efectos metabólicos (7).
El aceite esencial de ajo que se obtiene por arrastre de vapor no posee
propiedades bactericidas o antitrombóticas, pero si propiedades antioxidantes
(7).
19
VAPOR
100 ºC
ALCOHOL ET ILICO Y AGUA
25ºC
ALCOHOL ETILICO
<0 ºC
SS
CH2CH2
S+
SCH2
CH2
O-
S+
NH2CH2
O-
H
OHO
Alicina
Aliina
Disulfuro de dialilo
Figura No. 2: Efectos del procesado en la formación de diferentes compuestos bioactivos
del ajo (7)
Es de notar que la mayoría de los componentes azufrados del ajo no se
encuentran como tal en las células intactas, sino que se generan a partir de
varios de los componentes azufrados que se liberan cuando el ajo es cortado,
partido o macerado. La gran cantidad de reacciones químicas de unos
componentes con otros, generan así mismo una variedad amplia de sustancias;
entre estas reacciones se encuentra la formación de diferentes tiosulfinatos y
compuestos derivados, relacionados con el ácido sulfónico a partir de la
reacción entre la enzima aliinasa y precursores volátiles (S-alkenilcisteina
sulfóxido y ácido sulfónico). La descomposición de sulfinatos puede ocurrir por
diferentes vías metabólicas, una de las cuales combina dos moléculas de
alicina para formar tres moléculas de ajoeno. Por medio de degradaciones no
enzimáticos se producen otros compuestos azufrados como los tiosulfinatos,
cepenos, mono, di, tri y tetrasulfuros , tioles, tiofenos y anhídrido sulfuroso , a
partir de tiosulfinatos (7,8).
Los componentes sulfurados del ajo se han estudiado con detalle en fracciones
volátiles extraídas por diferentes métodos, implementando GC-MS, para la
identificación de diversas sustancias; sin embargo a las condiciones del análisis
(especialmente la temperatura) pueden ocurrir muy diversas reacciones de
degradación, por lo que no se detectan las sustancias originales de la muestra
en su totalidad. Para ello se han implementado otros métodos utilizado HPLC y
20
GCMS criogénico, evitando así las múltiples degradaciones de dichos
compuestos azufrados (11).
Tabla No. 1: Composición nutritiva del ajo (7)
Componentes Medida Promedio (en
100g de porción
comestible).
Variación
Ingredientes
principales
Agua
Proteínas
Lípidos
Carbohidratos
(utilizables)
Minerales
g
g
g
g
g
64.00
6.05
0.12
28.41
1.42
63.00 - 64.60
5.30 - 6.76
0.06 - 0.20
_______________
1.40 - 1.44
Minerales y
elementos traza
Calcio
Manganeso
Hierro
Cobre
Zinc
Níquel
Molibdeno
Aluminio
Fósforo
mg
g
mg
g
g
g
g
g
mg
mg
38.00
460.00
1.40
149.00
575.00
10.00
70.00
1.80
134.000
30.000
2.70
_______________
_______________
37.00-260.00
150.00-1000.00
______________
______________
______________
______________
______________
______________
340.00-630.00
21
Cloro
Yodo
Boro
Selenio
g
g
g
440.00
5.69
4.40-28.00
Vitaminas
Vitamina E
otal tocoferol
TAlfa-tocoferol
Vitamina B1
Vitamina B2
Nicotinamida
Vitamina C
g
g
g
g
g
g
mg
10.90
100.00
10.00
90.00
200.00
80.00
600.00
14.00
______________
______________
______________
______________
180.00-210.00
______________
______________
9.00-18.00
Acidos
Acido salicilico
Acidos grasos
Acido laúrico
Acido palmítico
Acido esteárico
Acido oleico
Acido linoleico
Acido linolénico
g
!
!!!!! g
mg
mg
mg
mg
100.00
500.00
24.00
Trazas
3.00
62.00
5.50
______________
_______________
_______________
Trazas
_______________
_______________
_______________
22
1.3 BIOQUÍMICA DEL AJO
Los efectos antimicrobianos del ajo son conocidos desde la antigüedad. La
sustancia activa mas importante es la alicina la cual tiene efectos inhibitorios
potentes sobre ciertas enzimas como las cistein-proteinasas y alcohol-
deshidrogenasas, las cuales cumplen papeles importantes en las infecciones
por hongos, bacterias y virus. La aliina también inhibe ciertas enzimas con
grupos tioles (azufrados), que influyen en la biosíntesis de colesterol. Este
hecho podría explicar el postulado efecto hipocolesterolémico del ajo y sus
saludables efectos cardiovasculares (12).
Numerosas investigaciones (5,12) han revelado diversos efectos tales como:
-Potente depurativo: propiedades antisépticas, fungicidas, bactericidas y
depurativas. Se ha recomendado en casos de parásitos intestinales,
disenterías e infecciones gastrointestinales. También se le atribuyen
propiedades para el tratamiento de congestiones e infecciones respiratorias.
-Efectos cardiovasculares: disminución de los niveles de colesterol y
triglicéridos sanguíneos provenientes del consumo de grasas saturadas, poder
antioxidante, incremento de la actividad tibrinolitica y acción antiagregante
plaquetaria, efectos hipotensores (vasodilatador) y benéficos efectos sobre la
elasticidad vascular.
-Prevención de tumores: inhibición de la bacteria Helicobacter pylori cuya
acción esta asociada a la aparición de ulcera gastroduodenal y cáncer gástrico.
Así mismo otras investigaciones indican que el consumo de ajo reduce
notablemente los riesgos de padecer cáncer de estomago y cáncer de colon.
- Actúa como estimulante del apetito: estimula las mucosas gastrointestinales
Por las investigaciones realizadas in vitro e in vivo (en animales), se ha
revelado que el ajo fresco y muchos de sus preparados poseen efecto
antioxidante, ya que sus componentes presentan múltiples efectos frente a la
inactivación y control de los radicales libres. Al parecer todos los componentes
23
del ajo presentan actividad antioxidante, pero los componentes con mayor
capacidad podrían ser S-alil-cisteína y alicina (13).
Cabe señalar que en las investigaciones realizadas sobre los beneficios
médicos de la ingesta de ajo, se han encontrado resultados contradictorios o no
congruentes, debido a que las condiciones de los ensayos y la presentación del
ajo no son las mismas en todos los casos, lo que modifica el contenido en
sustancias activas. Por este hecho se ha recomendado realizar más estudios y
bajo condiciones rigurosamente uniformes para confirmar los efectos reales de
los compuestos azufrados (7).
Se han realizado ensayos diversos para utilizar extractos etanólicos y acuosos
de ajo como aditivos en alimentos, que además de otorgar sabor, cumplan un
papel como conservante frente a la acción de microorganismos. Estudios sobre
la inhibición de Escherichia coli y Listeria innocua usando dichos extractos,
muestran resultados efectivos con concentración mínima letal (CML) para E-
coli y Listeria innocua de 0.25g de ajo/ml agua y 0.125 g de ajo/ml agua
respectivamente; así mismo una concentración mínima inhibitoria (CMI) para
ambos microorganismos de 0.25g de ajo/ml etanol (14).
Otra serie de microorganismos que presentan sensibilidad a la alicina son las
especies bacterianas: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
Klebsiella pneunoniae, Shigella dysenteriae, Enterococcus. También inhibe la
acción de hongos de especies de Candida, Crytococcus, Trichophyton,
Epidermophytom y Microsporum. La acción antiparasitaria se da en:
Entamoeba histolytica, Giardia lambia, Leishmania major, Leptomonas
colosoma. Los virus que presentan sensibilidad al ajoeno son citomegalovirus
humano, influenza B, virus del herpes simple tipo I y tipo II, el parainfluenza, y
el de la estomatitis vesicular (9).
24
Tabla No. 2: Compuestos azufrados del ajo (7)
Compuesto Posible actividad biológica
Aliína
Ajoeno (ajocisteína)
Hipotensora, hipoglucemiante
Previene la formación de coágulos,
ayuda a disolverlos.
Anti-inflamatorio, vasodilatador,
hipotensor, antibiótico
Alicina y Tiosulfinatos
Alil mercaptano
Antibiótica, antifúngica, antiviral
Hipocolesterolemiante, previene la
aterosclerosis, antitumora,
antidiabética, hipotensora
Sulfuro de dialilo y afines Hipocolesterolemiante. Aumento la
producción de enzimas
desintoxicantes. Anticancerígeno.
Previene los daños químicos del
DNA.
S-alil-cisteína y compuestos al
–glutámico
Hipocolesterolemiantes,
antioxidantes, quimioprotectores
frente al cáncer. Favorecen la
acción desintoxicante del hígado
frente a sustancias químicas.
25
Tabla No. 3: Compuestos no azufrados del ajo (7)
Compuesto Posible actividad biológica
Adenosina
Vasodilatadora, hipotensora,
miorelajante. Estimula la síntesis
de hormonas esteroídicas
Estimula la liberación de
glucagón
Fructanos (Escorodosa)
Fracción proteica F-4
Efectos cardiorotectores
Estimula el sistema inmune por
medio de macrófagos y células
esplénicas
Quercitina Estabiliza los mastocitos. Ejerce
por tanto efectos beneficiosos en
el asma y la alergia
Saponinas (Gitonina F,
Eurobósico B) Escordina
Hipotensoras. La Gitonina F es
antivírica, el Erubósito B
antifúngico
Hipotensora en conejos y perros.
Factor de crecimiento en dosis
elevadas. Incrementa la
utilización de la vitamina B1.
Antibacteriana
Selenio
Ácidos fenólicos
Antioxidantes. Antiinflamatorios.
Antivíricos y antibacterianos
26
1.4 METODOLOGÍAS DE ANÁLISIS
1.4.1 Análisis Fisico-químicos: la amplia utilización de extractos, aceites
esenciales y oleorresinas provenientes de diversas fuentes, en algunas
industrias como es el caso de la alimentaria, exige que dichos materiales sean
caracterizados, para concluir sobre aspectos como su identidad, composición
(pureza, autenticidad) y calidad (frescura, vida útil) (15).
-Índice de refracción (ntD): se define como el cociente entre el seno del
ángulo de incidencia y el seno del ángulo de refracción de la luz
monocromática al pasar del aire a un medio ópticamente más denso. El índice
de refracción depende de la composición de la muestra, la temperatura y la
longitud de onda de la radiación utilizada. Generalmente se mide a 20, 25 o 40
grados centígrados, tomando como referencia la línea D del sodio (589 nm), y
se realizan como mínimo dos mediciones de donde se toma la media, por lo
general con cuatro cifras decimales. Su utilidad radica en casos como la
identificación y caracterización de líquidos puros, grasas y aceites,
comprobación de la pureza de diversos alimentos, determinación del contenido
de agua en miel o en extractos de alimentos ricos en sacarosa (confituras, miel,
jarabe de almidón, zumos, etc.). Se denota ntD
(15,16).
-Materia seca: en un alimento la materia seca esta constituida por todos
aquellos componentes no volátiles del mismo, tales como: lípidos,
carbohidratos, proteínas y minerales entre otros. La determinación se realiza
por la pérdida de humedad o sustancias volátiles (ácido carbónico, alcoholes,
aceites etéreos) por medio de la elevación de la temperatura y con la eventual
utilización de vacío. Dependiendo del alimento se pueden utilizar otras
metodologías en las que se mide índice de refracción o densidad. El contenido
de humedad o material volátil es de vital importancia en alimentos ya que este
parámetro determina muchas de las características físicas del producto,
además de que el contenido de humedad por encima de ciertos niveles, influye
27
en posibles degradaciones de los constituyentes químicos o desarrollo de
microorganismos. Se expresa en % m/m (15,16).
-Cenizas: son el residuo resultante de la incineración, a ciertas condiciones, de
todo el contenido de material orgánico en la muestra. La combustión es
completa y el residuo corresponde al contenido total en minerales. Las cenizas
normalmente no son las mismas sustancias inorgánicas presentes en la
muestra original, debido a las perdidas por volatilización o a las interacciones
químicas entre los constituyentes. El valor principal de la determinación de
cenizas es que supone un método sencillo para determinar la calidad de
muchos alimentos. Se expresa en % m/m (15,16).
La reacción química verificada en esta prueba corresponde a la oxidación de
hidrocarburos, que en forma general es:
CnH2n+2 + (3n+1)/2 + O2 ------------> nCO2 + (n+1)H2o + calor
-Acidez: es la medida del contenido de sustancias con carácter ácido en una
matriz determinada. Su utilidad radica en que sirve como indicativo de pureza y
en ocasiones se puede concluir a partir de este resultado el nivel de
degradación o tratamiento de la muestra. La acidez se puede expresar como
los mg de KOH que son necesarios para neutralizar los ácidos presentes
(minerales, ácidos grasos u orgánicos) o como la cantidad de ácido oleico en la
muestra (15).
La base de esta prueba es la reacción ácido-base, en la cual el cambio de pH
produce el viraje del indicador utilizado:
H+ + OH- -----------> H2O
28
1.4.2 Análisis microbiológicos (17,18): los microorganismos son seres
ampliamente extendidos por el medio ambiente, encontrándose en el aire, el
suelo y el agua; bajo diversas condiciones de presión, ph, temperatura, etc. En
la industria alimentaria, los microorganismos (especialmente las bacterias) se
constituyen en uno de los mas importantes problemas a enfrentar, ya que la
inocuidad del alimento es necesaria para un consumo seguro.
Dentro de los factores que influencian el crecimiento bacteriano están:
- Alimento: fuente de energía y materiales estructurales.
- Temperatura: factor que determina la velocidad de crecimiento y
reproducción, ya que influye en las reacciones químicas y la acción de las
enzimas.
- Humedad: agua disponible para favorecer el crecimiento microbiano
(actividad de agua)
- Oxigeno: su necesidad se ve restringida al tipo de microorganismo, y por esto
existen las clasificaciones de aerobios estrictos, anaerobios estrictos, aerobios
facultativos y microaerobios
- pH: es un factor decisivo en el desarrollo de microorganismos, y el rango
aceptable para el desarrollo de estos depende del tipo de microorganismo, sin
embargo existe la tendencia a pH desde 6.8 a 7.5.
- Sustancias inhibidoras: determinadas sustancias (originales del producto o
adicionadas) resultan tóxicas para los microorganismos, afectando su
crecimiento y reproducción.
Las determinaciones más generales realizadas en alimentos son:
-Mesófilos aerobios viables: Dentro de este grupo se incluyen todas las
bacterias, mohos y levaduras, que se desarrollan a 30o centígrados y debido a
que esta temperatura es optima para muchas formas de vida libre, están muy
difundidos en el medio ambiente, la mayoría de estos microorganismos se
encuentran en todos los productos. Los resultados de su recuento reflejan la
29
calidad sanitaria del producto examinado, sus condiciones de manipulación y
condiciones higiénicas de la materia prima.
En general no son recomendables recuentos elevados (excepto en productos
obtenidos por fermentación). Un recuento bajo no asegura ni implica la
ausencia de patógenos o sus toxinas, así mismo un recuento alto no implica la
presencia de flora patógena, sin embargo puede significar la contaminación de
la materia prima o del producto en proceso, la inmediata alteración del producto
o la presencia de mesófilos patógenos (17,18).
-Mohos y Levaduras: los hongos constituyen un grupo amplio de organismos
unicelulares y pluricelulares, los cuales se alimentan mediante la absorción
directa de nutrientes. Los hongos, además de las bacterias, son causantes de
la descomposición y putrefacción de la materia orgánica. En su mayoría, los
hongos están constituidos por hifas (finas fibras que contienen protoplasma), a
menudo divididas en tabiques denominados septos; así mismo, la proliferación
de hifas forman el micelio. Se reproducen generalmente por esporas, son
acompañantes muy comunes de toda forma de vida, en algunas ocasiones
como parásitos patógenos (17,18). Las levaduras son a menudo difíciles de
reconocer, pueden tener efectos beneficiosos y perjudiciales. Un ejemplo de
esto son las fermentaciones producidas por levaduras en la fabricación de
alimentos (pan, cerveza, queso), además, de obtención de enzimas. También
pueden producir alteraciones de zumos de frutas, almíbares, miel, entre otros.
Se desarrollan mejor en medios abundantes en agua y en condiciones
aerobias; el rango de temperaturas de crecimiento es similar al de los hongos,
con un optimo entre los 25-30oC y un máximo entre los 35-47oC. Algunos tipos
especiales pueden crecer a 0oC o menos. En general el crecimiento se ve
favorecido por pH próximos a 4 - 4.5, su desarrollo se dificulta en medios
alcalinos y es lento en condiciones anaerobias (levaduras fermentativas) (17,18).
-Coliformes totales: son un grupo constituido por bacilos aerobios estrictos o
aerobios facultativos, gram-negativos no esporulados, que tienen la capacidad
30
de fermentar lactosa con formación de gas. Los géneros que se incluyen en
este grupo son: Escherichia, Aerobacter, Klebsiella, Enterobacter y
Paracolobactrum, así mismo las dos especies mas importantes son:
Escherichia coli (principalmente de origen intestinal) y Aerobacter aerogenes
(principalmente de origen vegetal). Su recuento es importante ya que las
bacterias Coliformes son perjudiciales al organismo, y su presencia se
considera como signo de mala calidad de la higiene de los procesos o los
manipuladores y/o contaminación cruzada. Su crecimiento inutiliza los
alimentos (17,18).
-Coliformes fecales (E-coli): Se considera en este grupo al bacilo de la
especie Escherichia coli, el cual forma parte de la flora intestinal del hombre y
de animales de sangre caliente, de cuyo tracto intestinal se aísla dicho
microorganismo. Es gram-negativo, con temperatura optima de crecimiento de
37o C (existe multiplicación entre 10oC y 40oC), y pH optimo de 7 a 7.5
(soportando pH del rango de 4 a 8.5). Es muy perjudicial para la salud humana
fuera de su hábitat usual (intestino), y su presencia en alimentos indica una
contaminación de origen fecal. Se puede destruir por pasteurización. También
pertenecen a este grupo la Salmonella y la Shiguella (17,18).
1.5 METODOS DE EXTRACCIÓN
1.5.1 Extracción soxhlet: consiste en un método de extracción sólido-liquido,
que se utiliza generalmente para aislar los componentes lipídicos de una
muestra, por medio de un solvente apolar. Es un método de extracción directa,
aplicable a alimentos en general, aunque con excepción de aquellos en los que
la grasa esta recubierta (como los productos lácteos), y para la obtención de la
fracción de grasa libre de la muestra para su posterior caracterización. Los
solventes mas utilizados para extraer la grasa libre son el éter dietílico o el éter
de petróleo, y para fines de cuantificación de grasa se requiere una muestra
anhidra, para no extraer además azucares y otros compuestos. El equipo esta
31
integrado por un extractor, un condensador especial de tipo bulbo y un matraz (15).
1.5.2 Extracción en frío: consiste en un método de extracción sólido-liquido,
en el que ambas fases (sólida y liquida) se encuentran en un contacto directo,
por lo que los componentes del sólido que son afines al solvente quedaran
disueltos en el mismo. La polaridad del solvente depende del tipo de
compuestos que se requiere extraer, el material sólido se encuentra
generalmente macerado para obtener una mayor superficie de contacto y el
proceso se cumple a temperatura ambiente. Se puede realizar con agitación o
sin ella (denominado precolación).
1.6 ANALISIS INSTRUMENTAL
1.6.1 Métodos de separación cromatográfica (15): los procedimientos
cromatográfícos en general, son procesos de separación que consisten en
obligar a la sustancia problema a sufrir una migración diferencial entre dos
fases: fase móvil y fase estacionaria. Durante la separación, la fase móvil
atraviesa la fase estacionaria. La fase estacionaria es un sólido (adsorbente o
sorbente) o un líquido. La fase móvil es un gas insoluble o un líquido inmiscible
con la fase estacionaria. Existe también una nueva variante denominada gas
supercrítico (fluido).
Los procedimientos cromatográficos se clasifican de acuerdo a los siguientes
principios:
-Según la constitución física del soporte
-Según la combinación de los diferentes tipos de fases
-Según el tipo de separación.
-Cromatografía de Gases CG: Se constituye en un procedimiento para la
separación de compuestos volátiles, los cuales fluyen en una corriente gaseosa
32
sobre o a través de una fase estacionaria fijada en el interior de un tubo largo y
fino, la cual puede ser un sólido adsorbente de empaquetamiento, o un líquido
viscoso no volátil que recubre las paredes internas de la columna. El gas
portador es un gas inerte (nitrógeno, helio, hidrogeno, argón), y transporta una
muestra representativa de la sustancia inyectada. Los diversos componentes
son retenidos o retrazados por la fase estacionaria con mayor o menor fuerza y
alcanzaran correspondientemente el final de la columna donde se encuentra el
detector. Los tiempos de flujo del gas portador son relativamente largos.
La GC permite realizar análisis tanto cualitativos, como cuantitativos de
sustancias que se volatilizan a temperaturas elevadas sin degradarse o de las
cuales se obtienen derivados volátiles reproducibles. La elección del modo de
inyección de la muestra, la temperatura de la columna y el tipo de detector,
determinan los resultados del procedimiento.
1.6.2 Espectrometría de masas MS(19): la MS es de las herramientas
analíticas quizá la de mayor aplicación, ya que es capaz de proporcionar
información acerca de la composición elemental de las muestras, estructura de
las moléculas orgánicas, inorgánicas y biológicas, composición cualitativa y
cuantitativa de mezclas complejas, estructura y composición de superficies
sólidas y relaciones isotópicas de átomos en las muestras, etc. En forma
general, la MS consiste en introducir una pequeña cantidad de muestra (igual o
inferior a un micromol) por medio de un sistema de entrada, donde los
componentes se convierten en iones gaseosos (muestras sólidas o líquidas),
en un proceso llamado volatilización. Por medio de una fuente de iones, los
átomos se convierten en iones, normalmente positivos, acelerados hacia el
interior del analizador de masas. El analizador de masas mide la relación
masa/carga de los iones del analito, así mismo el detector convierte el haz de
iones en una señal eléctrica que puede ser procesada y almacenada en la
memoria de un ordenador, mostrada o registrada de diferentes maneras. El
espectro de masas de un compuesto particular proporciona diversos tipos de
datos que son útiles para su identificación; en primer lugar el peso molecular y
33
en segundo la fórmula molecular. Además, el estudio de los modelos de
fragmentación que se pone en manifiesto en el espectro de masas proporciona
a menudo información sobre la presencia o ausencia de grupos funcionales.
Así mismo la identidad real de un compuesto se puede establecer mediante la
comparación de su espectro de masas con los de compuestos conocidos hasta
llegar a una total o muy cercana coincidencia. Con excepción del procesador
de señal y el dispositivo de lectura, el equipo en su interior debe conservar
bajas presiones (10-8 a 10-4 torr), ya que las partículas cargadas, incluyendo los
electrones, interaccionan con los componentes de la atmósfera, siendo como
consecuencia destruidos.
1.6.3 Cromatografía/espectrometría de masas GC/MS (19): una de las
mejores herramientas para el análisis de mezclas orgánicas y bioquímicas
complejas es la cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS),
método de análisis acoplado en el cual se toma el espectro de masas de cada
uno de los compuestos que salen de la columna cromatográfica; siendo éstos
guardados en un ordenador para su subsiguiente procesado. Así mismo, la
espectrometría de masas se puede acoplar a la cromatografía liquida para el
análisis de muestras que contienen componentes no volátiles. Es importante el
desarrollo de métodos para la eliminación del eluente antes de la introducción
de la muestra en el espectrómetro de masas, ya que la muestra está muy
diluida por el líquido o el gas portador en el interior de la columna.
34
2. MARCO DE REFERECIA
2.1 LAS OLEORRESINAS
Las oleorresinas son extractos que se obtienen a partir de especias y otros
vegetales (plantas aromáticas) mediante la extracción con solventes orgánicos.
Estos extractos tienen naturaleza oleosa y las sustancias volátiles y no volátiles
extraídas proporcionan al producto las características concentradas de olor,
sabor y/o color de la especie vegetal. Por tal razón son productos
preferentemente utilizados como condimento en los alimentos (18). Están
constituidas en general por una mezcla entre resina (principios aromatizantes
no volátiles, aceites grasos, ingredientes picantes) y aceite esencial, el cual
contiene principios odoríferos volátiles. Las proporciones en la mezcla
dependen fuertemente de la forma de extracción y de la planta o fruto de donde
provienen. Las oleorresinas son de muy diversa composición, ya que al lado de
los aceites esenciales existen otras sustancias orgánicas y aceites grasos; los
extractos gozan de una mayor estabilidad ya que sus resinas preservan de la
autooxidación a los aceites grasos (18,21).
Cuando se realiza la extracción, se debe seleccionar un solvente,
generalmente de punto de ebullición bajo, lo cual permita volver a separarlo en
forma sencilla (21).
Son varias las ventajas que posen las oleorresinas frente a vegetales crudos,
cuando se utilizan en alimentos (3):
-Económicamente es rentable ya que sustituye sobradamente al vegetal, en
cuanto a características de olor y/o sabor
-Son uniformes en sus características
-Son naturales en el sentido de que no poseen rastros de solventes o trazas de
pesticidas
35
-Presentan una alta pureza
-La inocuidad del producto es confiable
Existen básicamente dos tipos de oleorresinas (3):
-Oleorresina liposoluble: la que se considera en estado puro y proviene
directamente del proceso de extracción con el solvente orgánico. Está
preparada para su uso con otras materias oleosas o grasas.
-Oleorresina hidrosoluble: se utiliza especialmente en la industria alimentaria
(sopas, bebidas, conservas), y se consigue por la incorporación a la oleorresina
liposoluble de un polisorbato vegetal, que la vuelve soluble en agua.
En la actualidad se pueden encontrar gran cantidad de oleorresinas de diversos
vegetales, como pimienta, cilantro, chile, apio, ají, ajo, nuez moscada, capullo
de clavo, cebolla, etc., las cuales se usan especialmente para la fabricación de
alimentos. Su éxito radica en que la industria alimentaria durante los últimos
años, ha aumentado la fabricación de productos cárnicos y platos preparados,
con lo cual, las oleorresinas o extractos de especias han alcanzado cada vez
más relevancia (21).
Las especias naturales así como la tecnología aplicada para la extracción,
cumplen un papel esencial para la evaluación de los extractos de especias. El
contenido de aceites esenciales, es el único criterio de aplicación general para
el análisis de dichos extractos, los cuales se obtienen del extracto por medio de
una destilación continua de vapor de agua (21).
Una de las oleorresinas mas conocidas es la proveniente del pimentón
(Capsicum annuuum L.), la cual se ha obtenido por medio de extracción
soxhlet, comparando los resultados al utilizar diversos solventes apolares así
como las variables en la preparación del material previo a la extracción.
36
Los reportes muestran que se han aplicado análisis fisico-químicos básicos
como son índice de refracción, índices de acidez, saponificación, yodo y
peróxidos. Los análisis instrumentales aplicados han sido la medida del color
(ASTA-20), cromatografía en capa fina (TLC), HPLC y espectrometría de
masas (MS) (22,23).
Además de sus conocidas ventajas para su utilización en alimentos como
condimento y/o agentes con poderes antioxidantes, se han estudiado otros
usos en industrias como la farmacéutica, y en la tinción de telas (22).
La resolución 4241 de 1991 del ministerio de salud publica colombiana (24),
define aspectos básicos de sanidad y calidad de las características de las
especias o condimentos vegetales, contemplando que las oleorresinas de
especias solo pueden ser extraídas de la especia con solventes grado
alimenticio, tales como el hexano y el dicloro-etileno.
En general las condiciones microbiológicas que deben cumplir las especias y
los productos hechos a base de ellas son:
Tabla No. 4: Parámetros microbiológicos de las especias y sus derivados(24).
n m M C
NMP coliformes fecales 3 4 40 1
Esporaz clostridium sulfito reductor/g. 3 100 1.000 1
B. cereus/g 3 100 1.000 1
Hongos y levaduras 3 3.000 5.000 1
Las convenciones utilizadas son:
n = Número de muestras a examinar.
m = índice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad.
M = índice máximo permisible para identificar nivel aceptable de calidad.
c = Número máximo de muestras permisibles con resultados entre m y M.
37
Otras normas de generales calidad dictadas por la resolución son:
-Organolépticas: Las propias de cada especia o de sus mezclas.
-Genuinidad: En las especias puras y productos hechos a base de ellas, deberán identificarse los elementos histológicos característicos de cada una de ellas.
Para la incorporación de los extractos y oleorresinas se hace necesario diluirlas
previamente en una sustancia inocua formando emulsiones o dispersiones. Los
extractos se deben conservar protegidos del aire y la luz, así como de perdidas
de color y de procesos oxidativos (21).
Con la estandarización de extractos se puede asegurar un poder
condimentante uniforme, aunque existe la desventaja concerniente al cuidado
de los restos de solventes de extracción, como los hidrocarburos halogenados
que son muy tóxicos y no deben sobrepasar valores residuales de 30 ppm
(0.003%) (21).
2.1.1 LA OLEORRESINA DE AJO
La oleorresina de ajo se ofrece actualmente en el mercado de los derivados de
especias y condimentos. Los extractos de ajo tienen un modo de obtención un
poco diferente, ya que se realiza mediante extracción acuosa y se obtiene un
extracto consistente en azúcar, agua, sustancias minerales, nitrogenadas y
cierto contenido de aroma. El aroma proviene del aceite esencial, el cual se
encuentra en el bulbo de ajo en un 0.5%. Cuando se realiza una evaluación
objetiva del extracto, es importante tener en cuenta el contenido de agua,
azúcar y la composición de los azucares, así, como el contenido de sustancias
aromáticas y colorantes (21).
En los extractos de ajo, el contenido de aceites esenciales es en general muy
bajo, por lo cual la recuperación de dicho aceite por destilación de vapor de
agua y separación cromatográfica subsiguiente no resulta eficaz para su
38
estudio, como si lo es para los demás extractos. Aplicando modificaciones a
dicho método se pueden obtener resultados utilizables que permitan determinar
los componentes volátiles en su totalidad y los grupos individuales de
componentes en forma reproducible (21).
Referencias sobre la extracción de la oleorresina de ajo hablan de una
extracción sólido-liquido en frío, a 75% de etanol y agitación en el proceso,
con un tiempo total de 2 horas, obteniéndose de esta manera un rendimiento
promedio en oleorresina de 28.2% y un contenido en aceite volátil de 0.17%.
Así mismo, en este caso, se ha realizado una caracterización química y se
encontraron buenas propiedades sensoriales(25).
Por otra parte, ensayos de inhibición de microorganismos con componentes
activos del ajo, se han realizado con extractos etanólicos del mismo (14).
39
3. SECCIÓN EXPERIMENTAL
3.1 MATERIAL VEGETAL
Como materiales vegetales de ajo (Allium sativum) a utilizar, se seleccionaron
las variedades de ajo blanco y de ajo morado, por ser estas las mas
comúnmente encontradas en esta región. Los ajos utilizados fueron obtenidos
del comercio normal de vegetales, seleccionando frutos sanos, sin rastros de
plagas, con buen tamaño, dureza y humedad aparente adecuadas.
3.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Los dientes de ajo fueron desligados de la cabeza de ajo, y se les fue retirada
la serie de capas envolventes. Después de esto se procedió al pesaje de 25 g
de dientes de ajo, los cuales fueron macerados y trasladados cuantitativamente
al proceso de extracción.
3.3 SOLVENTES UTILIZADOS
Para las extracciones se usaron los siguientes solventes:
- hexano: 100 mL para cada extracción
- etanol acuoso al 75%: 100 mL para cada extracción
- una mezcla monofásica de hexano: etanol de 95% en proporción 1:1 en
volumen (50 mL de etanol mas 50 mL de hexano).
3.4 EXTRACCIÓN
-Extracción soxhlet: la muestra macerada fue envuelta en papel filtro (110mm
de diámetro de poro), y dispuesta dentro del extractor de 100 mL de capacidad.
40
El condensador utilizado fue de tipo bulbo y el matraz de 250 mL, se utilizó una
manta eléctrica de calentamiento y agua corriente para el condensador.
-Extracción en frío: la muestra macerada y el solvente fueron dispuestos dentro
de un erlenmeyer de 250 ml. La boca de los erlenmeyers fue cubierta con papel
aluminio y se implemento agitación magnética.
Se realizaron todos los procesos extractivos por triplicado con un tiempo de dos
horas cada uno, conjugando las dos variedades de ajo, los tres tipos de
solventes y los dos montajes de extracción.
3.5 SEPARACIÓN DEL EXTRACTO
Al finalizar el tiempo de extracción se comprimió el material vegetal para
recuperar el solvente permeado, luego fue filtrado para retirar partículas
pequeñas arrastradas; el filtrado fue trasladado cuantitativamente a balones
previamente tarados y luego sometido a la separación del solvente y el extracto
por rotaevaporación, utilizando para el fin un equipo de marca HEIDOLPH.
La temperatura de eliminación de solvente estuvo en el rango de 40oC a 45oC,
y las presiones de vacío dependieron del solvente a retirar. Después del
proceso de rotaevaporación, se secaron externamente los balones y
seguidamente fueron pesados junto con el extracto.
3.6 ANÁLISIS FISICO-QUÍMICOS
3.6.1 Materia seca: se utilizo el método gravimétrico, midiendo la masa del
residuo remanente de someter al calor seco de una estufa a 110oC, una masa
pesada de la muestra en una cápsula de porcelana previamente tarada, y
posteriormente la determinación del % de material seco.
3.6.2 Cenizas: Se realizo la cuantificación por el método gravimétrico del
contenido mineral, sometiendo una cantidad de muestra pesada a calcinación
41
controlada en una mufla, a una temperatura de 550ºC, utilizando un crisol con
tapa previamente tarado. El pesaje del residuo permite obtener el % de material
mineral presente en la muestra
3.6.3 Índice de refracción: realizado según Norma ICONTEC 289
3.6.4 Índice de acidez: realizado según la Norma ICONTEC 218, reportando
los resultados como % de ácido oleico
3.7 ANÁLISIS GC/MS
3.7.1 Preparación de la muestra: una muestra de dientes de ajo macerados
se colocó en contacto con etanol al 75% por un tiempo total de una hora,
aplicando agitación. Después de dicho periodo se realizó una filtración del
etanol, tomando una parte del mismo (alrededor de 25 mL), con los cuales se
realizaron extracciones sucesivas liquido-liquido con éter etílico (alrededor de
15 mL). Al final del proceso de extracción se seco el éter etílico con sulfato de
sodio anhidro, y con dicha muestra se realizó el análisis por GC-MS en el
equipo marca SHIMADZU modelo GCMS QP2010.
3.7.2 Condiciones de análisis:
" Temperatura del inyector: 250 oC
" Modo de inyección: Split
" Radio del Split: 1:10
" Temperatura inicial del horno de la columna: 35oC/5 min.
" Rata de cambio de temperatura en el horno: 10oC/min.
" Temperatura final del horno de la columna: 280oC/5 min.
" Gas portador: Helio
" Flujo total: 9.1mL/min.
" Tiempo de análisis: 34 min.
" Detector: espectrómetro de masas
" Modo de ionización: impacto electrónico (70ev)
42
3.8 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS (24,25)
Las metodologías de análisis para el estudio microbiológico de la oleorresina
de ajo, se basaron en los procedimientos indicados para determinaciones en
alimentos. La oleorresina, aunque fue extraída con un solvente de una
polaridad menor que la del agua, presenta una solubilidad adecuada en dicho
solvente, necesaria para poder realizar los análisis.
La muestra analizada se tomó directa e inmediatamente del balón, después de
terminada la rotaevaporación. Se pesó 1g de la oleorresina y se añadieron
9 mL de agua peptonada estéril (APE), y a partir de esta dilución 10-1 se
prepararon diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 para los diferentes análisis.
Los ensayos se realizaron por triplicado y en cámara de flujo laminar que
garantiza un ambiente estéril, así mismo se realizó un control del medio de
cultivo, para observar posibles contaminaciones del mismo. Dentro de los
procesos de preparación de los medios de cultivo y extracción de la
oleorresina, se tomaron las medidas pertinentes para evitar posibles
contaminaciones, como la desinfección del material de vidrio con hipoclorito de
sodio y uso de guantes para la manipulación. No se realizó desinfección de los
dientes de ajo a usar.
3.8.1 Determinación de Mesófilos aerobios viables: se utilizó el método
estándar de recuento en placa y siembra por profundidad. El medio de cultivo
utilizado fue el Agar Nutritivo Standadrd Plate Count (APHA), y la siembra se
realizó tomando 1 mL de cada una de las diluciones (10-1, 10-2, 10-3, 10-4),
vertiéndola en el fondo de la caja de petri y adicionando sobre esta el agar tibio
y líquido con una temperatura de 37oC. Se obtuvo una mezcla homogénea del
agar y la dilución con un movimiento leve en forma de 8. Cumplida la
solidificación del medio, se incubaron las cajas invertidas a 37oC por 24 horas
(incluyendo los controles del medio).
43
3.8.2 Determinación de Mohos y Levaduras: se realizó la preparación de
placas con Agar Saboraud. Se tomaron 0.1 mL de cada dilución (10-1, 10-2, 10-3
y 10-4), y se extendieron por medio de una varilla de jockey (rastrillo), sobre el
Agar solidificado. La incubación se cumplió a 25oC (temperatura ambiente),
por un tiempo de 8 días.
3.8.3 Determinación de Coliformes totales:
" Prueba presuntiva: para el análisis se utilizó el método del número más
probable empleando el medio líquido fluorocult. La siembra se realizó en
tubos de ensayo tapa rosca, en cuyo interior se dispuso una campana
invertida, adicionando a cada tubo 1 mL de las diluciones (10-1, 10-2,
10-3, 10-4). Los tubos se incubaron a 37oC por 24 horas, al final de las
cuales se observó la acumulación o no de gas (CO2) en el interior de la
campana.
" Prueba confirmativa: esta prueba se realizó, cuando los resultados de
la prueba presuntiva dieron positivo, con la acumulación de gas en la
campana. Se tomó 0.1 mL del tubo, y se sembró por superficie sobre el
agar Eosina Azul de Metileno (EMB), y la incubación de las cajas
invertidas se llevó a cabo a 37oC por 24 horas.
3.8.4 Determinación de Coliformes fecales: la presencia de E-coli se
determinó observando los tubos de la prueba presuntiva de coliformes totales,
a la luz UV. La presencia de fluorescencia azul indica que la bacteria está
presente. La fluorescencia se debe a que el cultivo microbiológico contiene el
sustrato fluorógeno 4-metilumbeliferil-#-D-glucurónido (MUG), el cual es
degradado por la enzima #- D- glucuronidaza altamente específica para E- coli;
Se libera el compuesto 4-metilumbeliferona, con fluorescencia azul verdosa al
ser iluminado con luz UV de 366 nm. (18)
44
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 EXTRACCIÓN DE LA OLEORRESINA
Se llevó a cabo la extracción de la oleorresina utilizando por separado el ajo
morado y el ajo blanco; los dos tipos de extracción: soxhlet y en frío con
agitación; y las tres clases de solvente extractor: etanol 75%, hexano, y la
mezcla etanol 95%-hexano (1:1). Las condiciones de extracción fueron
uniformes, para lograr obtener resultados precisos.
Los solventes fueron elegidos con el fin de probar el nivel de extracción de
componentes del ajo a diferentes polaridades, siendo el menos polar el hexano,
con polaridad media la mezcla de etanol-hexano, y polaridad mayor el etanol al
75%. Aunque la literatura habla de extracciones acuosas de la oleorresina (21),
no se consideraron como solvente extractor el agua o soluciones etanólicas
mas diluidas, ya que la eliminación del solvente es mas difícil (21).
Analizando en primer lugar las diferencias entre las formas de extracción en
cuanto a porcentaje de rendimiento, se observa que en las extracciones
realizadas en frío con agitación el mayor porcentaje se obtuvo con el ajo blanco
con un valor de 31.1774 % (tabla No. 5), en el caso de la extracción en soxhlet
el mayor porcentaje se presentó con el ajo morado con un valor de 14.3678 %
(tabla No. 8).
Respecto a los solventes de extracción, se nota que existe un aumento en el
porcentaje de rendimiento directamente proporcional al aumento de la
polaridad del solvente. En general se observan significativas diferencias entre
los porcentajes de rendimiento obtenidos con etanol al 75 % (polar) y los
obtenidos con hexano (apolar). Los porcentajes obtenidos con la mezcla
45
etanol-hexano tendieron a ocupar valores intermedios. Las mayores diferencias
de rendimientos se presentan en la tabla No.5, en donde el etanol al 75%
extrajo 29,0818 % más que el hexano, y 19,6098 % más que la mezcla etanol-
hexano.
Comparando las dos variedades de ajo, se observa que el ajo blanco presentó
un mejor rendimiento en la extracción en frío que en soxhlet, superándola en
17,5280 %, diferencia tomada entre los mayores porcentajes obtenidos en frío
(tabla No. 5) y en soxhlet (tabla No. 7). Caso contrario ocurrió con el ajo
morado, con el cual se obtuvo un mayor rendimiento en la extracción en
soxhlet, con un incremento en el porcentaje de 4,5322 % respecto a la mejor
extracción en frío (tabla No. 6). Se presentó una significativa diferencia entre
las mayores extracciones a nivel general comparando las dos variedades de
ajo, siendo la mejor para el ajo blanco de 31.1774 % (tabla No. 5) con
extracción en frío y para el ajo morado de 14.3678 % (tabla No. 8) con
extracción soxhlet.
Las características de los extractos fueron muy diferentes, con hexano solo se
recupero un extracto fluido traslucido, con la mezcla hexano-etanol el extracto
era más viscoso y opaco, pero con el etanol al 75% se recuperó un extracto
con una viscosidad mayor que el anterior y completamente opaco. Todos los
extractos presentaron coloraciones amarillas y el olor característico fue mayor
en el extracto en hexano, y muy similar ente los demás extractos.
Por cuestiones de tiempo y disponibilidad de recursos, el único parámetro
válido medible que se tomó en cuenta para la selección de la oleorresina a
analizar fue el porcentaje de rendimiento en extracto; las características físicas
aparentes y el aroma particular a ajo, fueron tomados como factores
secundarios complementarios de diferenciación cualitativa, pero no fueron
definitivos ya que no se realizó análisis alguno de estos aspectos en los
extractos por separado. Además, no se observaron las posibilidades de utilizar
otros solventes de extracción que presentaran inconvenientes de mayor
46
toxicidad como los organoclorados, con costos más elevados o que no
estuvieran reglamentados como solventes de grado alimenticio.
Teniendo en cuenta los anteriores aspectos, la oleorresina seleccionada para
los análisis de caracterización, fue la obtenida del ajo blanco, en frío y con
etanol al 75% como solvente extractor, por presentar el mayor porcentaje de
rendimiento (31.1774 %), buenas características físicas (viscosidad, aroma) y
precisión del método con una baja desviación estándar entre las extracciones
(0.1906).
En la figura siguiente se ilustra el proceso de extracción de dicha oleorresina:
ajo fresco pesaje de 25 g. de dientes maceración de los
de ajo sin cubierta dientes de ajo
análisis de la oleorresina separación del solvente extracción con 100 ml de etanol
y pesaje de la oleorresina 75%, agitación magnética por
2 horas.
Figura No. 3: Extracción de la oleorresina
47
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Tabla No. 5: Extracción en frío con ajo blanco
Tabla No. 6: Extracción en frío con ajo morado.
Solvente Ensayos
Masa ajo
(g)
Masa
oleorresina
(g)
Rendimiento
(%)
Promedio
(%)
Desviación
estándar
Etanol 75% 1 25,4682 7,8901 30,9802
2 25,1953 7,9014 31,3606 31,1774 0,1906
3 25,1740 7,8521 31,1913
Etanol:Hexano 1 25,4155 3,0798 12,1178
2 25,3341 2,8287 11,1656 11,5676 0,4931
3 25,1931 2,8769 11,4194
Hexano 1 24,9686 0,4982 1,9953
2 25,4780 0,5068 1,9892 2,0956 0,1791
3 24,8485 0,5721 2,3024
Solvente Ensayos
Masa ajo
(g)
Masa
oleorresina
(g)
Rendimiento
(%)
Promedio
(%)
Desviación
estándar
Etanol 75% 1 25,1055 2,4495 9,7568
2 25,6028 2,5642 10,0153 9,8356 0,1560
3 25,1915 2,4523 9,7346
Etanol:Hexano 1 25,2842 1,5205 6,0136
2 25,1436 1,8275 7,2683 7,4869 1,5938
3 25,1069 2,3045 9,1788
Hexano 1 25,2160 0,7409 2,9382
2 25,0345 0,7262 2,9008 2,8066 0,1964
3 25,1508 0,6491 2,5808
48
Tabla No. 7: Extracción soxhlet con ajo blanco
Tabla No. 8: Extracción soxhlet con ajo morado.
Solvente Ensayos
Masa ajo
(g)
Masa
oleorresina
(g)
Rendimiento
(%)
Promedio
(%)
Desviación
estándar
Etanol 75% 1 25,3795 3,5037 13,8052
2 25,3423 3,4569 13,6408 13,6494 0,1517
3 25,3181 3,4185 13,5022
Etanol:Hexano 1 25,2407 1,5559 6,1643
2 25,3108 1,3464 5,3195 5,5980 0,4904
3 25,0869 1,3322 5,3103
Hexano 1 25,0666 0,8344 3,3287
2 25,6245 0,6529 2,5480 2,8768 0,4047
3 25,3660 0,6985 2,7537
Solvente Ensayos
Masa ajo
(g)
Masa
oleorresina
(g)
Rendimiento
(%)
Promedio
(%)
Desviación
estándar
Etanol 75% 1 25,1211 3,6003 14,3318
2 25,3423 3,6554 14,4241 14,3678 0,0494
3 25,3181 3,6325 14,3474
Etanol:Hexano 1 25,0979 1,6305 6,4966
2 25,3675 1,3593 5,3584 6,5883 1,2782
3 25,0735 1,9833 7,9099
Hexano 1 25,1425 0,7373 2,9325
2 25,1732 0,7209 2,8638 2,8633 0,0694
3 25,1964 0,7039 2,7937
49
4.2 ANÁLISIS FISICO-QUÍMICOS
Como caracterización fisico-química general se aplicaron análisis básicos sobre
algunos aspectos del producto. Estos análisis fueron realizados teniendo en
cuenta los reportes existentes sobre evaluaciones objetivas de extractos de ajo
(21), exceptuando el índice de acidez y el índice de refracción.
4.2.1 Índice de acidez: acidez evaluada en esta prueba no se toma como un
indicativo de degradación como sucede con las sustancias de naturaleza
lipídica (grasas y aceites), sino como la presencia de sustancias que producen
acidez y que provienen específicamente del ajo. Posiblemente los
responsables de dicha acidez sean los glucolípidos, fosfolípidos y ácidos
sulfénicos, reportados en estudios de la composición en sustancias azufradas y
ácidos grasos en el ajo (26), y que en parte pueden alcanzar a estar presentes
dentro de la composición química de la oleorresina, ya que estas sustancias
pueden tener una solubilidad parcial en etanol al 75%, a las condiciones de
extracción.
Tabla No. 9: Índice de acidez
4.2.2 Materia seca: los sólidos totales dentro de la composición de la
oleorresina reflejan el grado alto de concentración de material sólido soluble o
en suspensión, que presentaron polaridad suficiente para quedar retenidos en
Ensayos % m/m ácido oleico
1 0,4700
2 0,4730
3 0,4650
Promedio 0,4690
Desviación estándar 0,0040
50
el solvente. Compuestos como, sustancias azufradas, carbohidratos, minerales,
son los que en forma mayoritaria se encuentran formando parte del material
seco total de la oleorresina. Así mismo, la pérdida de peso de debe a la
presencia de un muy buen contenido de sustancias volátiles, además del agua
de hidratación de compuestos, que no alcanza a ser extraída por rota-
evaporación,
Tabla No. 10: Materia seca
4.2.3 Cenizas: la determinación de cenizas en la oleorresina, muestra que bajo
las condiciones de extracción, el solvente es capaz de extraer una importante
cantidad de minerales presentes en el ajo, ya que este vegetal contiene dentro
de su composición de diversos minerales como fósforo y potasio.
Tabla No. 11: Cenizas
Ensayos % m/m Materia seca
1 80,5740
2 80,9260
3 80,9670
Promedio 80,8220
Desviación estándar 0,2160
Ensayos % m/m Cenizas
1 3,2210
2 3,2580
3 3,2590
Promedio 3,2460
Desviación estándar 0,0217
51
4.2.4 Índice de refracción: el índice de refracción se tomó como un parámetro
físico de caracterización de la oleorresina a la temperatura dada. Así mismo la
medida de los grados Brix (Brix refractométrico) representa la medida del % de
sólidos solubles en la muestra. Con estos parámetros se puede controlar en
forma sencilla la uniformidad alcanzada al obtener la oleorresina.
Tabla No. 12: Índice de refracción y grados Brix
Para los resultados obtenidos en estos análisis no se tienen patrones
cuantitativos de comparación, ya que no se encontraron reportes específicos
sobre el tema, solo los nombres de determinaciones generales aplicables de
acuerdo a la composición química. Tampoco se conoce de normas vigentes
para este tipo de derivados que regulen la caracterización fisico-química
realizada.
4.3 ANÁLISIS GC/MS
El análisis cromatográfico de los compuestos solubles en éter etílico, arrojó el
cromatograma de gases (anexo No. 1), en el cual se observa la presencia de 7
compuestos principales con picos bien definidos, siendo los picos mayoritarios
el tercero (tr =14.678) y cuarto (tr =14.984). Los espectros de masas de cada
sustancia (anexo No. 2) fueron comparados automáticamente con la biblioteca
de espectros de la base de datos del equipo. Los compuestos identificados de
esta manera con sus respectivos % de coincidencia de las rutas son los
Ensayos nD24 Brix
1 1,4755 74,00%
2 1,4755 74,00%
3 1,4750 73,90%
Promedio 1,4753 73,97%
Desviación estándar 0.236*10-3 0.0433
52
siguientes: Disulfuro de dialilo (84%), Trimetil Tiourea (77%), 3-vinil-[4H]-1,2-
Ditiina (91%), 2-vinil-[4H]-1,3-Ditiina (90%), Trisulfuro de dialilo (94%) y 4-metil-
2,6-di-ter-butil fenol (93%). El Tiopentanal no fue identificado por comparación
con la base de datos, ya que el % de coincidencia de la ruta fue de apenas un
67%, por lo que la interpretación de su fragmentograma de masas se llevo a
cabo comparándolo con sustancias anteriormente identificadas en estudios
similares previos de la composición química de volátiles en el ajo (11). Los
tiempos de retención se especifican en la tabla No. 13. La interpretación de los
fragmentos que justifican las sustancias propuestas se describen el la tabla No.
14.
Tabla No. 13: Características de los picos cromatográficos
Compuesto Pico tr Área % de área
Disulfuro de dialilo 1 12.88 1223021 4.95
Trimetil Tiourea 2 13.21 2871109 11.61
3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina 3 14.68 2871109 21.19
2-vinil-[4H]-1,3-Ditiina 4 14.98 11337822 45.86
Tiopentanal 5 15.92 735053 2.97
Trisulfuro de dialilo 6 16.03 2150657 8.70
4-metil-2,6-di-ter-butil
fenol 7 18.66 1167049 4.72
! 24722777 ! 100
53
Tabla No. 14: Interpretación de los principales fragmentos de los espectros de masas de cada una de las sustancias presentes en el cromatograma
Pico Catión Radical m/z
% abun
d Fragmento
Pérdida
1
disulfuro de dialilo
113 51
S+
$ HS %.
CH2S
S
CH2
+.
105 37 S+
CH2S
$C3H5 %.
m/z=146 (20%) % coincidencia de ruta: 84% 81 100
SH2+
S
CH3
$C5H5 %.
2 Trimetil Tiourea 103 21CH3
NH NH+
CH2
S
$CH3 %.
NH NCH3CH3
S
CH3 +.
85 16
CH3N
C+
NCH3
CH3
$ HS %.
m/z=118 (100%) % coincidencia de ruta: 77% 72 77
CH2N S
+
$H2N(CH3)2%.
3 3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina 111 100
S
+
$ HS %.
97 61
S+
$ CH2SH %.
SS
CH2
+.
m/z=144 (49%) % coincidencia de ruta: 91% 71 48
S+
CH2
$ C3H3S %.
54
4 2-vinil-[4H]-1,3-Ditiina 111 46CH2
S+
$ HS %.
S
SCH2
+.
97 17
S+
$ CH2SH %.
m/z=144 (38%) % coincidencia de ruta: 90% 72 100
SCH2
+
$ C3H4S %.
5
Tiopentanal
CH3S
+.
103 8
CH3SH
+
$ OH %.
OH2
72 100CH2 S
+
$ H2O %.
+
$ C2H6 %.
CH3SH
OH
+.
m/z=120 (90%) 55 35
+CH2C
+CH3
$ H2 %.
+ $H2SCOH%.
6
Trisulfuro de dialilo
CH2
S
SS
CH2 +.
113 67
CH3
S
SSH2
+
$ C5H5 %.
m/z=178 (4%) % coincidencia de ruta: 94% 73 100
S+
CH2H
$ C3H5S2 %.
55
7 4-metil-2,6-diterbutil fenol 205 100
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
CH3
$ CH3 %.
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
+.
91 5
C+
H
$ C8H17O %.
m/z=220 (31%) % coincidencia de ruta: 93% 57 17
CH2O
+H
$ C12H19 %.
En estudios realizados de los componentes del aroma en el ajo (11), aparecen
reportados los compuestos: Disulfuro de Dialilo, 3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina, 2-vinil-
[4H]-1,3-Ditiina y Trisulfuro de dialilo. En dicho estudio también aparece
reportado el tiopropanal, pero no el tipoentanal encontrado en la muestra.
Por otro lado no se han encontrado reportes exactos sobre la composición en
fenoles y sustancias nitrogenadas (14,22) diferentes a los aminoácidos en el ajo,
pero en la muestra se identificaron la trimetil tiourea y el 4-metil-2,6-di-ter-butil
fenol. Es de resaltar que la alicina, componente azufrado mas importante, no
se detectó en el análisis de forma directa; sin embargo, como en estudios
anteriores, se detectaron las sustancias: 3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina, 2-vinil-[4H]-1,3-
Ditiina en altas proporciones y otros compuestos azufrados, los cuales son el
resultado de una rápida degradación de la alicina a las condiciones del GC (11).
56
S+
SC H 2
CH 2
O-
H
SCH 2 O H
+
S
C H 2
S+
SC H 2
CH 2
O-
HS
O HCH 2
+ +
+S
C H 2
OH 2S
C H 2
OH
SCH 2
H
S
SC H 2
AlicinaÁcido 2 -propenosulfénico
Tioacroleina
SS
CH 2
2 -v in y l -4 H -1 ,3 -d i th i in e3 -v in y l -3 ,4 -d ih y d ro -1 ,2 -d i th i in e
Figura No. 4: Degradación de la alicina en Ditiinas(8)
4.4 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS
Los análisis microbiológicos básicos aplicados a la oleorresina de ajo, son los
que se realizan en forma general sobre alimentos para evaluar su inocuidad.
Se consideraron adecuados ya que la aplicación principal de la oleorresina de
ajo es como agente natural de sabor y/o olor en la industria alimentaria. Los
análisis fueron llevados a cabo bajo procedimientos estándar y con oleorresina
recién extraída. Las diluciones se llevaron desde 100 hasta 10-4 por la
incertidumbre en el nivel de contaminación de la muestra.
4.4.1 Análisis de Mesófilos, mohos y levaduras: como se observa en las
tablas No. 15 y 16, los resultados no muestran la presencia en la oleorresina
fresca de microorganismos mesófilos, mohos o levaduras.
Tabla No. 15: Recuento de mohos y levaduras:
Recuento (Ensayos)
Dilución 1 2 3
Recuento estándar en placa UFC/g
Pura 0 0 0 0
10-1 0 0 0 0
10-2 0 0 0 0
10-3 0 0 0 0
10-4 0 0 0 0
57
Tabla No. 16: Recuento de mesófilos aerobios viables
4.4.2 Determinación de coliformes totales y coliformes fecales E-coli: al
realizar el análisis de coliformes totales, en la prueba presuntiva, la
acumulación de gas en la campana invertida en casi todas las diluciones,
evidenció una alta contaminación en la oleorresina (tabla No. 17), razón
suficiente para obviar la prueba confirmativa. La determinación de coliformes
fecales-E-coli por fluorescencia UV, mostró un nivel importante de
contaminación de la oleorresina en todas las diluciones (tabla No. 18). El
recuento microbiológico para las dos pruebas anteriores se llevó a cabo de
acuerdo a la tabla estadística de número más probable (NMP) estandarizada (29), arrojó valores de recuento mayor a 1100, valor que sobrepasó la
normatividad vigente (24).
Esta alta contaminación se presentó, debido a que el material vegetal no fue
desinfectado en forma previa a la extracción, y su contaminación provino de su
forma propia de cultivo, almacenamiento, transporte y/o manipulación antes de
ser elegidos y tratados para el proceso de extracción. Teniendo presente que
el ajo no tiene propiedades bactericidas, sino propiedades bacteriostáticas, es
decir, no elimina los microorganismos sino que impide su crecimiento, la alta
contaminación indica que la carga contaminante superó el poder inhibitorio de
los componentes en la oleorresina. Este hecho no es evidencia de pérdida de
Recuento (Ensayos)
Dilución 1 2 3
Recuento estándar en placa UFC/g
Pura 0 0 0 0
10-1 0 0 0 0
10-2 0 0 0 0
10-3 0 0 0 0
10-4 0 0 0 0
58
poder inhibitorio en la oleorresina, ya que esto ocurre normalmente cuando
existe una desproporción en la relación carga contaminante y concentración de
compuestos inhibitorios en cualquier tipo de compuesto con estas propiedades.
Se procedió entonces a realizar un segundo análisis de coliformes, añadiendo
una desinfección de los dientes de ajo sin cubierta, utilizando una solución de
hipoclorito de sodio con un aporte de concentración de cloro disponible como
Cl2 de 150 ppm, por aproximadamente 5 minutos en tiempo de contacto (27,28) y
enjuague con agua destilada antes de realizar el proceso de extracción, y
conservando las mismas medidas higiénicas en los procedimientos de
extracción y sembrado de los anteriores análisis. En este caso, los resultados
mostraron una total eliminación de la contaminación en la oleorresina, al
presentarse una resultado negativo de presencia de coliformes en la prueba
presuntiva tanto a las 24 como al las 48 horas (tabla No. 19). Así mismo, no se
detectaron coliformes fecales a las 24 horas de la siembra microbiológica (tabla
No. 20). Bajo el método del NMP, el recuento arrojó un valor menor a 3, con lo
que se cumple la normatividad (24).
Tabla No. 17: Prueba presuntiva (sin desinfección previa del material vegetal)
Acumulación de gas
(Ensayos)
Dilución 1 2 3
Pura
10-1
10-2
10-3
10-4 x x
Recuento NMP >1100
59
Tabla No. 18: Determinación de Coliformes fecales (sin desinfección previa del material
vegetal)
Tabla No. 19: Prueba presuntiva (con desinfección previa del material vegetal)
Fluorescencia azul al UV (Ensayos)
Dilución 1 2 3
Pura
10-1
10-2
10-3
10-4
Recuento NMP >1100
Acumulación de gas
(Ensayos) Dilución 1 2 3
Pura x x x
10-1 x x x
10-2 x x x
10-3 x x x
10-4 x x x
Recuento NMP <3
60
Tabla No. 20: Determinación de Coliformes fecales (con desinfección previa del material
vegetal)
Fluorescencia azul al UV (Ensayos)
Dilución 1 2 3
Pura x x x
10-1 x x x
10-2 x x x
10-3 x x x
10-4 x x x
Recuento NMP <3
61
5. CONCLUSIONES
1. De acuerdo con la comparación de los resultados de las extracciones
efectuadas a diferentes condiciones, se encontró que el mayor
rendimiento de extracción de la oleorresina, se obtuvo en la realizada en
frío, con etanol al 75% y ajo blanco, con un rendimiento promedio de
31.18% y desviación de 0.1906, por lo cual el método presenta un buen
nivel de extracción, comparado con rendimientos en anteriores estudios
de extracción con etanol al 95% (25), además de buena precisión,
haciéndolo adecuado para próximos estudios de estandarización y
posibles aplicaciones industriales.
2. Siendo la oleorresina una mezcla compleja; el tipo y cantidad de análisis
a realizar se ven restringidos a determinaciones generales aplicadas a
alimentos. En este caso se determinaron la acidez con un valor de
0.469% en ácido oleico, 80.82% en materia seca, 3.25% en cenizas,
índice de refracción nD24 =1.4753 y grados brix (sólidos totales) de
73.97%, valores que sirven como referencia de sus características
físicas y químicas medibles en forma directa, los cuales pueden ser
tomados como referencia para posteriores estandarizaciones.
3. El análisis por GC-MS de la fracción volátil soluble en etanol al 75% y
separada en éter etílico, muestra la presencia, entre otros, de
importantes compuestos azufrados como los alil-sulfuros y las ditiinas,
compuestos responsables de la mayoría de las propiedades salutíferas
y organolépticas del ajo. Como es de suponer, la oleorresina contiene en
forma concentrada las sustancias de verdadero interés del ajo, por lo
que una pequeña fracción reemplaza ampliamente una cantidad
proporcionalmente mayor de dientes de ajo sin procesar, ofreciendo
62
ventajas en la rapidez al momento de su uso, mayor durabilidad y por su
completa dispersión no genera residuos sólidos insolubles. Teniendo en
cuenta lo anterior y conociendo que su extracción es razonablemente
económica, la relación costo-beneficio hace viable su obtención.
4. La evaluación de la inocuidad de la oleorresina recién extraída, muestra
importantes resultados al no presentar evidencia de microorganismos
mesófilos, mohos o levaduras, que puedan alterar fácilmente la
oleorresina. Por otro lado, la desinfección adecuada del material vegetal
garantiza la no presencia de coliformes totales y fecales. Estos
resultados aseguran que la oleorresina puede ser usada para el
consumo en forma segura.
5. En general, el método de extracción de la oleorresina proporciona un
buen rendimiento en extracto y no presenta grandes inconvenientes en
la manipulación, además, tiene características fisico-químicas,
microbiológicas y fuerte esencia característica del ajo, que pueden
favorecer su implementación en la industria alimentaria.
63
6. RECOMENDACIONES
1. Evaluar la composición y proporción de los azúcares presentes en la
oleorresina, mediante métodos adecuados, teniendo en cuenta a
complejidad química de la oleorresina.
2. Evaluar la posible presencia de sustancias lipídicas o aceite esencial en
la oleorresina de ajo.
3. Analizar fracciones de la oleorresina solubles en solventes de diversa
polaridad, para detectar más componentes químicos extraídos del ajo,
incluyendo sustancias minerales y compuestos azufrados.
4. Al realizar la extracción de la oleorresina con fines de obtener un
producto adecuado para su utilización en alimentos, se recomienda,
realizar una desinfección previa al material vegetal a utilizar, por su alta
exposición a las contaminaciones microbianas, tomando precauciones
respecto a la concentración del desinfectante y el tiempo de contacto,
con el fin de prevenir su absorción por parte del material vegetal.
5. Implementar un diseño de experimento en posteriores ensayos de
extracción, que garantice un mayor control matemático de las
condiciones de ensayo y de los valores obtenidos, lo cual permita tomar
determinaciones basados en varios parámetros medibles.
64
7. BIBLIOGRAFIA
1. SLESSOR, P.; ROBBINS, S.; Conviene ser prudentes al comercializar
aceites esenciales y oleorresinas de especias. En: Forum de comercio
internacional. Suiza: Centro de comercio Internacional UNCTAD/GATT, 6. Vol.
22 No. 3. Julio-Septiembre de 1986. Pág. 26-27, 31-32.
2. BALCAZAR, A.; Weber, G.; CAYCEDO, C.; DIAZ, F.; OLIVELLA, L. C.;
BEJARANO, E.; El Cultivo del Ajo. En: Revista del campo. No 34. El
Espectador. Bogota, Colombia, 1987. Pág. 6-7.
3. ALEXANDER, A. Oleorresinas. Farm Direct Foods Latinamerica S.A. de
C.V.; Última modificación 14 de diciembre, 2004. Consulta 5 de octubre, 2006.
Disponible en Website: http://www.fdfla.com/prod09.htm
4. OCOTLAN R., M.; Un alimento milagroso: El Ajo. Consulta 5 de
octubre/2006. Disponible en Website: http://ocotlanrodriguez.tripod.com/
5. ZUDAIRE, M.; YOLDI, G.; Ajo. Consumer.es EROSKI. Ultima fecha de
modificacion marzo 6 /2006. Consulta 5 de octubre/2006. Disponible en
Website: http://verduras.consumer.es/documentos/hortalizas/ajo/imprimir.php
6. OTERO, L. A.; Ajo. En: Revista ESSO Agrícola. ESSO Colombiana SA. Vol.
42 No. 1. Bogotá, Colombia, 1985. Pag 25-27
7. GARCIA G., L. J.; SANCHEZ M., F. J.; Revisión: Efectos cardiovasculares
del ajo (Allium sativum). ALAN. [online]. set. 2000, vol.50, no.3 [citado 21
Septiembre 2006], p.219-229. Disponible en la World Wide Web:
65
<http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-
06222000000300002&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0004-0622.
8. BLOCK, E.; Química del ajo y la cebolla. En: Investigación y Ciencia.
España: Prensa Científica, 5. NO 104. 1985. Pág. 86-92.
9. SANTOYO D., S.; Alimentos funcionales (Compuestos azufrados). Página de
docencia Universidad Autónoma de Madrid - Facultad de Ciencias. Madrid.
Curso académico 2004-2005. Citada el 5 octubre/2006. Documento PDF.
Disponible en Internet:
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/ssantoyo/funcionales/compuestosazuf
rados.pdf
10. Index Merck: an encyclopedia of chemicals and drugs. Ninth edition. Merck
& Co. 1976.
11. KIMBARIS, A.C.; SIATIS, A.G.; DAFERERA, D.J. ; TARANTILIS, P.A.;
PAPPAS, C.S.; POLISSIOU, M.G.; Comparison of distillation and ultrasound-
assited extraction methods for the isolation of sensitive aroma compounds from
garlic (Allium Sativum). Ultrasonics Sonochemistry, 13, 2006, p 54-60
12. LOZANO T., J. A.; La Alimentación (Vampiros, Ajos y…Moléculas). Ciencia
y Salud. España-Murcia. 24 de octubre/1997. Citado el 5 de octubre/2006.
Articulo 5.3.1. En laVerdad.es Website:
http://canales.laverdad.es/cienciaysalud/5_3_1.html
13. LOPEZ L., M.; El ajo: propiedades farmacológicas e indicaciones
terapéuticas. En: OFFARM. Vol. 26, No. 01. España, enero 01 de 2007. pag
78-81
14. HERNANDEZ P., L.; Actividad inhibitoria y letal de los extractos de ajo para
E. coli y L. innocua. Tesis Licenciatura. Ingeniería de Alimentos. Departamento
66
de Ingeniería Química y Alimentos, Escuela de Ingeniería, Universidad de las
Américas, Puebla. Diciembre 2003. Documento PDF. Disponible en Website:
http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lia/hernandez.
15. MATISSEC, R.; SCHNEPEL, F. M.; STEINER, G.; Análisis de los alimentos:
Grasas y sustancias acompañantes. Berlín, Alemania. 1992. Editorial: Springer-
Verlag. GMBH & Co., KG.
16. PEARSON, D.; Técnicas de laboratorio para el análisis de alimentos.
Editorial Acribia. Zaragoza, España. 1976. Cap 2.
17. FRAZIER, V. C.; WESTHOFF, D. C.; Microbiología de alimentos. Tercera
edicion. Editorial Acribia. Zaragoza, España 1985.
18. Manual de medios de Cultivo. Merck & Co. 1994.
19. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Principios de análisis
instrumental. Madrid, España 2001, quinta edición. Editorial McGraw-Hill.
Capitulo 20 pag 537-573
20. STANPAU, A.; Oleorresinas. Universidad de Murcia, España. Citado el 24
de octubre, 2006. Dosponible en Website: http://www.um.es/dp-produccion
animal/agrieco/Materialesagricultura1/sustancias%20toxicas%20(alumnos).doc
21. AREVALO C., H. A. Oleorresinas Componentes de las especias. En:
Alimentaria: Revista de tecnología e higiene de los alimentos. Vol. 6 No. 25.
Bogotá, Colombia. Año 1990. Pág. 26-30
22. CALDERON G., J.; FOREZ, J.; Obtención de la oleorresina de pimentón
rojo (Capsicum annuum L) y berenjena (Solanum melongena L) y su posible
uso industrial. Tesis Tecnologia Quimica. Facultad de tecnologia, Escuela de
Quimica. Universidad Tecnologica de Pereira. Pereira, Risaralda. 2006.
67
23. CARDONA, J. A. ; LOPERA, G. L.; MONTANA R., A. M.; MONTOYA V., A.
M.; PEÑA A., J. D.; GIL M., M.; BENAVIDES, J. F.; CAICEDO R., M. R.; RIOS,
L. A.; RESTREPO V, G. M.; Obtención de oleorresina de Pimentón. En: Vitae.
Universidad de Antioquia- Facultad de Química Farmacéutica. Medellín,
Colombia. 2006. Volumen 13, NO. 1. ISSN 0121-4004. Pág. 5-9
24. Resolución numero 4241 de 1991. “Por la cual se definen las
características de las especias o condimentos vegetales y se dictan normas
sanitarias y de calidad de estos productos y de sus mezclas”. Ministerio de
salud Pública. Bogota, Colombia. Abril 9 de 1991. Consulta 24 de
Octubre/2006. Disponible en Website:
http://www.invima.gov.co/version1/normatividad/alimentos/Resolucion%204241.
htm
25. BORGES, P.; PEDROSO, F.; FERNANDEZ, N. Obtención y caracterización
a escala piloto de oleorresina de ajo. En: Alimentaria: Revista de tecnología e
higiene de los alimentos. Nº 333. Año 2002. ISSN 0300-5755.
26. TSIAGANIS, M.C.; LASKARI, K.; MELISSARI, E.; Fatty acid composition of
Allium species lipids. Journal of food composition and analysis 19, 2006, p 620-
627
27. PIROVINI, M.E., GÜEMES D.R., PIAGENTINI A.M.; lavado desinfección
con soluciones cloradas: una etapa para mejorar la calidad microbiológica de
vegetales de hojas frescos cortados. Pirovani y Col. 2006. Universidad
Nacional del litoral, Argentina. Pag 23-28. Consulta 10 de abril del 2007.
Disponible en website:
http://www.ciad.mx/dtaov/XI_22CYTED/imagenes/files_pdf/brasil/maria.pdf
28. Uso adecuado del cloro en la desinfección poscosecha de frutas y
vegetales. CDA boletín técnico Nº 01, POSCOSECHA. Mayo 2003. Consulta
68
10 de abril del 2007. Disponible en website:
http://www.fintrac.com/docs/honduras/bt_01_poscosecha_cloro_05_03.pdf.
Consulta 10 de abril del 2007.
29. CAÑON P., F. A.; GARCÍA D., T. F.; Manual de técnicas para control de
calidad de alimentos para consumo humano. Ministerio de salud INVIMA,
anexo 16. Bogota, Colombia, 1998.
69
8. ANEXOS
8.1 CROMATOGRAMA DE GASES DE VOLÁTILES EN LA OLEORRESINA.
70
8.2 FRAGMENTOGRAMAS DE MASAS DE LAS SUSTANCIAS SEPARADAS
POR GC.
71
72
73