Kocatepe TIp Dergisi The Medical Journal ofKocatepe 7: 49-57 / Eylul 2006 Afyon Kocatepe Universitesi

Hepatokarsinogenezis'in Erken Doneminde Demetoksiviridin ve l-a-Hidroksi -demetoksiviridinin

Antioksidan Savunma Sistemine Etkisi*

The Effects ofDemethoxyviridine and l-a-Hydroxy-demethoxyviridine on The Antioxidant Defence System in The Early Stage Hepato carcinogenesis

Cengi z M. OSTUNER I, lrfan DEGiRMENCi l , Hilmi bZDEN2

,

KIsmet clvt', Ismail KIRAN4

I Eskisehir Osmangazi Universitesi, TIp Fakultesi, Tibbi Biyoloj i Anabilim Dali, Eskisehir, 2Eskisehir Osmangazi Univers itesi, TIp Fakultesi, Anatomi Anabilim Dali, Eskisehir,

3 Inegol Devlet Hastanesi, Patoloj i Laboratuvan, Bursa, 4 Eskisehir Osmangazi Universitesi, Fen-Edebiyat Fakiiltesi, Kimya Bolumii, Eskisehir.

OZET: Bu cahsmada, 2 ayhk erkek Spraque-Dawley tiiril sr­canlarda hepatokarsinogenezisin erken safhasmda demetoksiviridin (DMV) ve ondan turetilmis l- n -hidroksi­demetoksiviridin ( l -a-hidroksi-DMV), nin antioksidan siste­mine diizeltici etkileri arastmldi. Bu amacla deney hayvanlan 10 gruba aynl di. Gruplar, kontrol (1.grup), yag (2.grup), Dimetil siilfoksit (DMSO) (3.grup), DMV (4.grup), l-a­hidroksi-DMV (S.grup), dietilnitrozamine (DEN) (6.grup), 2­asetilaminofloran (2-AAF) (7.grup), DEN+2-AAF (8.grup), DEN+2-AAF+DMV (9.grup) ve DEN+2-AAF+ I-a ­hidroksi-DMV olarak diizenlendi. Deneyin S. haftasmda, eter anestezisi altmda sicanlann karacigeri ahndi. Karaciger homojenatlan hazirlanarak, siiperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon peroksidaz (Gpx) ile katalaz enzim aktiviteleri ve malondialdehit (MDA) diizeyleri belirlendi. Karaciger doku preperatlan H&E boyama yontemi ile histopatolojik olarak degerlendirildi, Elde edilen tiim bulgularda kontrole gore tumor olusturuc u ajanlar dismdaki gruplarda fark goru lmez ken, DEN+2­AAF verilen grupta daha onemli diizeyde olmak iizere DEN, 2-AAF verilen gruplarda farkl ihk lar goz lendi . Dii­ze ltici etkisi oldugunu dii~ii n diigii mii z DMV ve l -a ­hidroksi-D MV ise MDA diizeyi dism da SOD % inhibisyo nu, Gpx ve katalaz aktiviteleri ni artIrarak, duzel ­tici etkisi oldugu belirlenirken histoloj ik olarak da hepa tosi t karyomegali, hepatosit sitomegali , iltihabi hiicre infiltrasyonu, nekroz ve prenoplastik fokuslarm olusumu­nu enge lledig i ortaya kondu. Sonuc olarak, her iki mantar metabolitinin de preneoplastik donernde antioks idan sistemi diizeltici etkisi

Yaztsma ve tipki basim ici n; Ars .Grv . Dr. Cengiz M. OSTONE R Eskisehir Osmangazi Oni versitesi , TIp Fakultes i, Tibbi Biyo loji Anabilim Dah , 26480 Esk isehir, (e-mail: custuner@ogu.edu .tr)

• Bu cah sma Eskisehir Osmangazi Oniversitesi Bilimse l Arastirma Projeleri Komisyonu tarafmdan desteklenmi stir (Proje No : 2004 110 12)

ortaya kondu, Fakat bu sonucu n daha da kesinlesebilrnesi ve preneopla stik donemi takip eden evrelerde ant ioksidan sisteme ne gibi etk ilerinin olabi leceg ini ortaya koya bilmek icin, heniiz cok yeni olan bu konuda , daha cok cahsmaya ihtiyac vardir. Anahtar Sdzcukler : Antioksida n enzimler, DMV, l-a­hidroksi-DMV, Hepatokarsinogenezis

ABSTRACT: In this study, the antioxidant activi tiy of demethoxyviridine (DMV) and its analogue l-u-hydroxy­demethoxyviridine ( l -a- hydroxy -DMV) were inves tigated on 2 month old male Spraque-Daw ley rats with having early stage hepatocarcino genesis. The animals were divided into 10 groups which are the contro l, olive oil, dimethyl sulfoxide (DMSO), DMV, l-a-hydroxy-DMV, diethyln itrosamine (DEN), 2-acetylaminoflourine (2 ­AAF), DEN + 2-AAF, DEN + 2-AAF + DMV and DEN + 2-AAF + l-u-hydroxy DMV induc ed male Spraque­Dawley rat. Liver tissues were removed under ether anastesia in 5th week of the study. Th is was followe d by the preparatio n of the liver tissues eva luated as histo pathologica lly with H&E staini ng and homogenates to study superoxi de dismutase dismutase (SO D) inhibitio n, glutathione pero xidase (Gpx), cata lase activity in addit ion to malond ialdehyde (M DA) level. There were no differences observed con tro l gro ups whereas DEN and 2-AAF treated grou ps showed differences but not as much as DEN+2-AAF treat ed group showed. Pathological studies were determined histologically for olive oil, DMSO, DMV and l -a -hydro xy-DMV induced groups, and found that there were no differences. The prenoplastic focus was found in DEN + 2-AAF treated group in studies carried out histopathologically with H&E staining. The result showe d not only DMV and I-a -hydroxy-DMV treate d groups has increased to SOD % inhibition, Gpx and catalase activities with exce ption of MDA level, but also they histologically prevented of hepatocyte caryomegaly, hepatocyte cytomegaly, inflammatory cell infiltration, necros and preneoplastic focus changes .

50 OSTUNER ve ark.

Finally, it was found that both fungi metabolites were to fully determine the effects on following stages after effective on antioxidant system in preneoplastic period of preneoplastic period . hepatocarcinogenesis, but there is a need for new studies Key Words: Antiooxidant enzymes, DMV , l-a-hidroksi­

DMV, Hepatocarcinogenesis

otms

Karaciger kanseri, kanser cesitleri arasmda en yaygm gruba girer. Bu kanserin olusurnunda, fenobarbital (FB), alkol, aflatoksin B I, hepatit B ve C virusleri gibi ajanlar yanmda dietilnitrozamin (DEN), 2-asetilaminofloran (2-AAF)'de etkilidir (1­3) . Karaciger tumoru olusturulmasmda kullandigi­rmz ksenobiyotiklerden DEN ve 2-AAF, fare , sican, hamster, tavsan, kopek, domuz ve maymun gibi hayvanlar icin karsinojeniktir (4-7). Kemirgenlere birlikte uygulanan DEN ve 2-AAF hepatokarsinogenezizi baslanr ve hepatositlerde preneoplastik baslangica neden olur (4,8-10). DEN'in indiikleyici, 2-AAF'nin ise promotor olarak mesane ve karacigerde tumor olusturucu etkiye sa­hip oldugu bildirilmistir (1,2,9, 11,12) .

DEN'in metabolitleri , DNA'ya bir ya da iki oksidasyon saglayan elektron ile kovalent baglana­rak tumor promotorlerinin baglanmasma aracihk eder (12). Tumor prornotoru bir siiperoksit anyonu indukleyicisi olarak gorev yaparak reaktif oksijen molekulleri ve hidrojen peroksit olusumunu saglar. Bunun sonucunda siiperoksit ve hidrojen peroksit bi­rikimi gerceklesir. Bu birikim, koruyucu antioksidan mekanizmanm azalmasuu ve yuksek oranda reaktif hidroksil radikali olusumunu saglar, Bunun sonu­cunda DNA'nm yapismda kopma ve deoksiriboz parcalanmasi ortaya cikar. Reaktif hidroksil radikal­leri aynca, lipid membran yag asitlerinin hidrojen atornlanm ayinr. Hidroperoksit radikalleri, hidrojen atomlan ile doymamis cok karbonlu yag asitlerinin karbonil gruplanyla birlesme saglayarak, Iipid­hidroperoksit duzenlenmesindeki zincir reaksiyo­nundan hidrojeni aymr. Bunun icin, superoksit ve hidroperoksit radikalleri lipit peroksidasyon (LPO)'nun artmasina neden olur ve hucre membrarunda hasar artrsi ortaya cikar (11 ,13) .

Promotor olarak fenobarbital (FB) ya da 2-AAF kullamlan hepatosit hiicrelerinin peroksizomlannda buyume ve sayica artis gozlenirken, peroksizomal yag as it oksidasyonu ve mikrozomal hidroksilasyon aktivitesinde artisa neden olur. Bunun sonucunda da; DNA hasan ve tumor olusumu ortaya cikar, Olusan hasann giderilmesinde, serbest radikallere karst, sa­vunma sistemindeki spesifik enzimler rol ahr (14,15). Bu spesifik enzimlerin kullamlnusryla; glutatyon peroksidaz (Gpx) ve siiperoksit dimutaz

Koca tepe Tip Dergis i, Cilt 7 No: 3. Eylii12 006.

(SOD) 'da azalma, katalaz ve malondialdehit (MDA)'da ise artis oldugu belirlenmistir (14 ,16-19). Yapilan bir cahsmada da DEN ve FB kullarnlarak tumor olusturuldugunda katalaz ekspresyonunun azaldigi bildirilmistir (19) . DEN ve FB uygulanan sicanlarla yapilan cahsmada karacigerde, histolojik olarak, preneoplastik fokus, nodiilIer ve hiperplastik kupffer hucrelerini belirlenrnistir (14) .

DMV ve I-a-hidroksi-DMV, wortmannin man­tanndan turetilmis mantar metabolitleridir. DMV, Nodulisporium hinnuleum mantanndan glukozlu or­tamda, I-a-hidroksi-DMV ise seyreltilmis hidroklo­rik asitli ortamda, DMV'nin aseton ile muamele edilmesiyle turetilrnistir (20,21). DMV ve Ia­hidroksi-DMV metabolitleri, onernli bir hucresel fonksiyon mediatoru olan PI-3 kinaz gibi bazi en­zimlerin aktivitelerini inhibe ederek, antitumor etki gosterirler (22-24) . Wortmannin ya da turevlerinin PI-3 kinazm aktivitesi iizerine etkisi arastmldigm­da, buyume faktor reseptorlerince ve p21 Ras onkogen protein kinazlarca aktif hale getirildigi gosterilmistir (21,25,26). PI-3 kinaz heterodimer bir yapida olup, 85 kDa (p85) diizenleyici ve 100 kDa katalitik subunit (pllO)'a sahiptir. PI-3 kinaz, hiicre mernbranm fosfolipid 'e ait myo-inositolu D-3-0H pozi syonununda fosforlar. Ayrn zamanda fosfotidil 4,5 fosfatin fosforlanmasmi saglayarak fosfotidil 3,4 ,5 fosfati olusturur, Fosfotidil 3,4,5 fosfat da PLC'yi aktive ederek PIP2'nin hidrolizini stimule ederek, diacilgliserol (DAG) ve inositol 1,4,5 trifosfot (lP3) donusumunu saglar (21,24,25) . Pankreatik p-hiicrelerinde, wortmanninin PI 3-kinazl inhibe ederek PLC'nin aktivitesini inhibe ettigi , boy­lece PIP2'nin hidrolizini engelleyerek, diacilgliserol (DAG) ve inositol 1,4,5 trifosfot (lP3) olusumunun engellendigi ortaya konmustur (24). Wortmanninin in vivo olarak, insan MCF-7 meme kanser hucreleri ve murine C3H kanser hucrelerinin biiyiimesini inhibe ettigi tespit edilmistir (26) .

Biz cahsmarmzda, Spraque-Dawley tiirii swan­larda hepatokarsinogenezisin erken safhasmda DMV ve ondan turetilmis l-a-hidroksi-DMV'in antioksi­dan sistemi uzerine diizeltici etkilerinin olup olma­digrrn ortaya koymayi amacladik.

51 Hepatokarsinogenezis 'in Erken Diineminde Demetoksiviridin ve l- a-Hidroksi -demetoksiviridinin Antioksidan Savunma Sistemine Etkisi / The Effects ofDemethoxyviridine and I- a-Hydroxy -demethoxyviridine

on The Antioxidant Def ence System in The Early Stage Hepatocarcinogenesis

GERE<;:: VE YONTEM

Cahsmarmzda, Eskisehir Osmangazi On iversi­tesi TIp Fakultesi T ibb i Biyoloji Anabilim Dalmda yetistirilen, 2 ayhk erkek Spraque-Dawley tiirti Sf­

canlar kull anrlrmstir . Spraque-Dawley sicanlar, ha­valandirma ve diger temizlik kurallanna dikkat ed i­lerek muhafaza ed ilmis yeterinee normal cesm e suy u ve pelet yem ile beslenrnistir.

D EN, sica nlara, 175 mg/kg olaeak sek ilde 0 .1 ml dimetil sulfok sitte (DMSO)'da cozundurulerek intraperiton al (i.p) olarak uy gulandi (1-3,27). 2-A AF 20 mg/kg oranmda 0 .1 ml saf zeytin yag: icerisinde gavajla uygulandi ( 1,8, II ,28-30). Esk isehir Osm an­gazi Uni vers itesi Fen Faktiltesi Biyokimya Bilim Dalmda uret ilen , DMV ve I-a-Hidroksi-DMV metabolitleri de 1.5mg/kg sica n olaeak seki lde 0.1 ml DMSO 'da cozunduru lerek intraperiton (i.p) o la­rak uygulandi (20,2 1).

Calismada 86 ade t 150-200 gr agirlrgmda 2 ay­hk Spraque-Dawley irki sican kullamldi , Doz ve de­ney gruplan tablo 1'de verildi . Turn gruplar, 8 si­candan olus urken sadeee 8. grupta prenopl astik go­runumun tam olarak belirlenebilmesi icin haftahk olarak sican sakr ifiye edilmistir, bu ned enle de bu grubun sica n say isi fazla tutulmustur ve son kalan 14 adet sicanda n da 8.g rup olusturulmustu r, Bes hafta­hk deney uygulamasi sonunda, sicanlardan eter anestezisi altmda karaciger ahndi . Sica nlarda n ah­nan karaci ger omekleri ikiye bolunerek bir kisrm ­86 °C 'de superoks it dismutaz (SO D), malindealdehit (M DA), katalaz ve glutatyon peroksid az (G px)' in spektrofotometrik olcumu saklandi. Diger bir kisrm da isik mikroskobide histopatolojik ineeleme icin notral formal ine ahndi.

SOD aktivi te olcurnu icin (Fluka®, USA ) kiti kull anildi . Superoksi t anyonlan (02) ,

Ksantin/Ksantin oks idaz sistemi tarafmdan olus turu­lup kromojen so lusyo n kullanilarak olcumu yapi ldi, Hiicresel glutatyon peroksidaz aktivite olcurnu icin (Calbiochem", USA) kiti kullaruldi. Kit indirekt ola­rak GPx aktivitesini olcer, GPx orta mda ki orga nik perok sit varhgmda redukte glutaty on GS H' I ok side glutatyona (GSSG) donusnlrur. Dah a soma disandan ort am a ek lenen NADPH ve glutatyon reduktaz (GR) ile oksi de glutatyon tekrar redukte glutatyona donu­sur, boyle ce GSH derisimi sabit tutulur. Olusan kim yasal tepkimede NADPH 'm NADP'ye donus­mesi esnas mda spektrofotometrede 340 nm dalga boyunda ab sorbanstaki aza lma izlenerek okside glutatyon olusum hizi olculmus ve GPx enz im akti­vites i he sapl anrmstir. Lipit perok sidasyonu son

urunlerinden bir tanesi olan MDA'nm tiyobarbiturik asi t (TBA) ile verdig i renk reaksiyonuna da yanmak­tadir. MDA olctimu icin Uehiama ve Mihara 1978 metodu uygulandi (3 1). Katalaz akti vitesi, amonyum mol ibdatla stabi l bir kompleks olusturan hidrojen peroksitin spektrofotometrik o larak degerlendirilme­si temeline dayanan olcumler sonueu belirlendi ve katalaz seviyesin in olcumu icin Goth 1991 metodu uygulandi (32).

Ha yvanlardan alm an karaciger omeklerinden her biri (karac ige rin tum lobl anndan rasgele omek­Ierne yontem iyle alm arak) tesp it icin % 10 tampon­lanrms notral formal in so lusyo nunda 24-48 saat br­rakildi, Orneklerden rutin parafin bloklama yapild ik­

tan soma 4flm 'lik kesitler alrndi. Hazirlanan prepa­ratlar hematoksilen-eozin bo yasi ile boyandi. Leiee Image Analiz sistemi kull arnl arak turn alanlar deger­lendirilip, goriintuler CCD kamera ile bilgisayara aktanldi . Patolojik skorl am a negatif ve pozitif belir­Ierne metoduna gore yapildi,

Elde edilen bulgular tek yonlu ANOVA varyans analizi ile p < 0.05 on em belirleyieisi secile­rek istatist iksel olarak degerl endirildi .

BULGULAR

SOD % inhibisyonu bakirmndan, kontrol gru­buna gore, 2, 3 ., 4 ., 5. ve 9. gruplarda fark bulunma­dt (P>0 .05 ). Bun a karsihk 6 ., 7. ve 8. gruplarda co k onernli du zeyde (p< 0.00 I) , 10. grupta ise one mli duzeyde (P<O.OI) aza lma bulundu (Tablo 2).

Gp x, bakmundan , kontrol grubuna gore, 2 ., 3., 4 ., 5., 7. ve 9. gruplard a fark bulunmadi (P>0.05). Buna karsilik, 6. ve 8. gruplard a cok onernli du zeyde azalma (p< 0.00 I ) ve 10. grupta ise onemli du zeyde artis (P<O.OI) bulundu (Tablo 3) .

MDA bakimmdan, kontrol grubuna gore, 2 ., 3., 4 . ve 5., gruplard a fark bulunmazken (P>0 .05 ), 6., 7., 8., 9. ve 10. gruplar arasmda cok onemli du zeyde arns (p< 0.00 I) bulundu (Tablo 4) .

Katala z, bakimtndan, kontrol grubuna gore, 2., 3., 4., 5. ve 9. gruplarda l ark bulunmazken (P>0.05), 10 grupla p < 0.1 diizey inde azalma ve 6., 7. ve 8. gruplarda ise cok onemli diizeyde azalma (p<O.OO l) bulundu (Tablo 5).

Cahs marmzda ki karaciger doku omekleri H& E patolojik degi sikl ikler negatif ve pozitif olarak de­gerlendirildi (Tablo 6) .

Cahsmarmzda turn gruplar, dejeneratif bulgu­lar , hepatosit karyomegali, hepatosit sitomega li ve iltih abi hilcre infiltrasyonu olusumu bakirmndan de­gerlendirilmi s olup I ., 2., 3., 4 ., 5. gruplard a

Kocatepe Tip Derg isi, Cilt 7 No: 3. E,l'liil 2006.

52 OSTONER ve ark.

dejeneratif bozukluklara rastlanmadi (Resim I) . 6. gruba ait dejeneratif bulgularda, hepatosit karyomegali, hepatosit sitomegalide de goruldu. 7.gruba ait, dejeneratif bulgular, hepatosit karyomegali , hepatosit sitomegali ol arak belirlendi . 8.gruba a it dejeneratif bulgular, hepatosit kary om ega li, hepatosit sitomegali ve iltihabi h ucre

infiltrasyonu o lusumu, nekroz ve preneoplastik fokus belirlendi (Resim 2) . 9 .gruba ait dejeneratif bulgular, hepatosit karyomegali ve iltihabi hiicre infiltrasyonu ol usumu goruldu. IO.gruba ait dejeneratif bu lg ular ise hepatosit karyomegali ve il ­tihabi hiicre infiltrasyonu o larak dejeneratif bozuk­

luklar belirlendi (Resim 3).

Tablo I . Deney gruplart ve uygulanan doz lar.

Grunlar n Biri nci doz ve d iger ru tin uygulama lar Ikincl uygulamala r I.Grup Kontrol

8 Su + Yem -

2.Grup Yag

8 0, I ml/kg gavaj

Su + Yem -

3. Grup DMSO

8 Su + Yem I. Haftada 0.1 ml DMSO i.p. olarak verildi

4.Grup DMV

8 Su + Yem DMV (1,5 mg/kg) DMSO'da cozundurule­rek 16., 23., ve 30. giinde bir kez i.p. ola­

rak verildi. 5.Grup

I-a -Hidroksi DMV

8 Su + Yem I-a -Hidroksi DMV ( 1,5 mg/kg) DMSO'da cozundurulerek 16., 23., ve 30. giinde bir

kez i.p. olarak verildi.

6.G ru p DEN

8 DEN , 175 mg/kg i.p

0.1 ml DMSO'da cozundurulerek uygulandi Su + Yem

-

7.Grup 2-AAF

8 Su + Yem

Deneyin baslamasmdan soma 7.,8. , ve 9. gunde 20 mg 2-AAF /kg oramnda

DMSO'd a cozundurulerek 0.1 ml Vag icinde zavaila verildi

8.Grup DEN + 2-AAF

14 DEN 175 mg/kg i.p.

0.1 ml DMSO'da cozundurulerek uygulandi Su + Yem

DEN uygulamasindan I hafta sonra 7.,8. ve 9. gunlerde 2-AAF 20 mg/kg oranmda 0.1 ml DMSO'da cozundurulerek 0.1 ml

vag icinde zavaila veri ldi

9.G rup DEN + 2-AA F +

DMV 8

DEN 175 mg/kg i.p. 0.1 ml DMSO'da cozundurulcrek uygulandi

Su + Yem

DEN uygulamasmdan I hafta soma 7.,8. ve 9. giinlerde 2-AAF 20 mg/kg orarunda

DMSO 'da cozundnrulerek 0.1 ml Vagicinde gavajla verildi ve DMV (\,5 mg/kg) 0.1 ml DMSO 'da cozundurulerek 16.,23., ve 30.

gtinde bir kez i.p, olarak verildi

IO.Gr up DEN + 2-AAF +

I-a-Hidroksi DMV

8 DEN 175 mg/kg i.p.

0.1 ml DMSO'da cozundurulerck uygulandi Su + Yem

DEN uygulamasmdan I hafta sonra 7., 8. ve 9. gunlerde 2-AAF 20 mg/kg oramnda 0.1 ml DMSO 'da cozundurulerek 0.1 ml Vag icinde gavajla verildi ve 1-a-Hidroksi DMV (\ ,5 mg/kg) DMSO 'da cozundurulerek 16., 23.,

ve 30. gunde bir kez i.p, olarak verildi.

Tablo 2. Kontrol ve deney gruplartntn SOD % inhibisyon degerleri ve bunla rin istatistikse l degerlendiriimeleri

Gruplar N SOD % inhi bisyo n I. Ko ntrol 8 87,00 ± 4,76 2.Zeytin Yag 8 82,28 ± 4,82 13. DMSO 8 82,57 ± 2,93 14. DMV 8 90,57 ± 1,90 Is. I-Hidroksi DMV 8 90,67 ± 0,53

16. DEN 8 7 1, 14 ± 6,09'"

7. 2-AAF 8 75,42 ± 1,90' "

Kocatepe ripDergisi, em 7No: 3, Eylii120 06.

53 Hepatokarsinogenezis 'in Erken Doneminde Demetoksiviridin ve l -a-Hidroksi -demetoksiviridinin Antioksidan Savunma Sistemine Etkisi / The Effects ofDemethoxyviridine and l -a-Hydroxy-demethoxyviridine

on The Ant ioxidant Def ence System in The Early Stage Hepatocarcinogenesis

Grunlar N SOD % inhibisvon S.DEN + 2-AAF 14 74,57 + 3,73'" 9. DEN + 2-AAF + DMV 8 82,14 ± 3,71 10. DEN + 2-AAF + I-a-Hidroksi DMV 8 79,00 ± 2,08"

•• P<O.O I · · ·P<O.OOl

Ta blo 3. Kontrol ve deney gruplarinm Gpx degerleri ve bunlann istatistiksel degerlendirilmeleri

Gruplar N Gpx (mUlml) 1. Kontrol 8 10,28 ± 2,56 2.Zeytin Yag 8 10,14 ± 1,79 3. DMSO 8 12,14 ± 2,54 4.DMV 8 12,57 ± 3,69 5. I-Hidroksi DMV 8 10,14±4,41 6. DEN 8 1,14 ± 0,89'" 7. 2-AAF 8 7,57 ± 1,14 S.DEN + 2-AAF 14 3,00± 1,41' " 9. DEN + 2-AAF + DMV 8 9, 14 ± 2,47 10. DEN + 2-AAF + l-a-Hidroksi DMV 8 15,85± 2,26" • • P<O.OI ••• P<O.OO I

Tablo 4. Kontrol ve deney gruplartntn MDA degerleri ve bunlartn istatistiksel degerlendirilmeieri

Gruplar N MDA (UI gr vas doku) 1. Kontrol 8 89,28 ± 3,25

87,14 ± 9,49 90,28 ± 14,87

~.Zeytin Yag 8 B. DMS O 8 ~.DMV 8 91,28 ± 6,10

94,14 ± 7,10 147,00 ± 9,81'"

129,14 ± 6,14' "

144,00 ± 12,17'"

~ . l-Hidroksi DMV 8 6. DEN 8 7.2-AAF 8 S.DEN + 2-AAF 14 9. DEN + 2-AAF + DMV 8 125,28 ± 10,48' "

10. DEN + 2-AAF + I-a-Hidroksi DMV 8 132,42 ± 16,09'" • • • P<O.OOI

Tablo 5. Kontrol ve deney gruplartntn katalaz degerleri ve bunlartn istatistiksel degerlendirilmeleri

Gr unlar N Katalaz (kUlml protein) 1. Kontrol 8 56,28 ± 5,85 ~ . Zeyti n Yag 8 57,71 + 3,35 ~. DMS O 8 58,42 ± 4,57 ft . DMV 8 58,42 ± 2,87 5. I-Hidroksi DMV 8 57,71 ± 2,42 6. DEN 8 24,85 ± 3,33''' ~ . 2-AAF 8 41,28 ± 1,60' " S.DEN + 2-AAF 14 29,28 ± 3,68'" 9. DEN + 2-AAF + DMV 8 53,00 ± 3,36 10. DEN + 2-AAF + I-a-Hidroksi DMV 8 47,00 ± 4,24'"

••• P<O.OO I

Kocatepe r ,p Dergisi, Ci/t 7 No: 3, Eylii/ 2006.

54 OSTONER ve ark.

Tablo 6. Negatijve pozitijbelirleme metoduna gore karacigerde patolojik skorlama

Gruplar Dejeneratif bulgular

Hepatosit karyomegali

Hepatosit sitomegali

iIt ihabi hiicre infiltrasyonu

Nekroz Pr eneoplastik fokus

I. Kontrol 0 (8) 0(8) 0(8) 0 (8) 0(8) 0 (8) ~ . Ze yt i n Vag 0(8) 0(8) 0(8) 0(8) 0(8) 0(8) ~. DMSO 0(8) 0 (8) 0 (8) 0(8) 0 (8) 0(8) ~ . DMV 0(8) 0(8) 0(8) 0(8) 0(8) 0(8) ~ . I-Hidroksi DMV 0 (8) 0(8) 0(8) 0(8) 0(8) 0(8) 6. DEN 12 (8) 12 (8) 8 (8) 0(8) 0(8) 0 (8) 7.2-AAF 8 (8) 8 (8) 8 (8) 0(8) 0(8) 0(8) 8.DEN + 2-AAF 56 (14) 56 (14) 13(1 4) 16 (14) 16(1 4) 56 (14) 9. DEN + 2-AAF + DMV 12 (8) 12 (8) 0(8) 4 (8) 0(8) 0(8) 10. DEN + 2-AAF + I-a-Hidroksi DMV

12 (8) 12 (8) 0(8) 4 (8) 0(8) 0 (8)

Resim I. Kontrol grubuna ail normal gorunumde karaci ­ger dokusu. H&E, Orj. Biiy.x I00

-"""'; • .1, #~ '_'~"' ,~ .. -:\' ,,',r . 'P' ,~.... ·~'~v~~',,~.~~L .. ~,:.,...... " . \ '·f i'iI!.. ~~••-..,:.:-.' " t'~ ..... ~ .. :~"" '~' ...., , ._'..... . '«-:Ii .,.-.~, .....'" ',''fE,'~:., ·1.---'..''''.., 1' ....... '-. .!i -.'- .". t .' .\ . :" ~~''-, -C~t... .~ ·,.:: ..... -,·i.:-;:l! ...·A~·... ~ ..,_., ',~

" " L'~~~.~~'-'~~.~);~ .. ~~~.·.:k~'r;i~·c::.::.;:f+' .·~t.l~·,··./, ..J}~~~~,.:.(/~-\i .. '. ~~~. ,.' ....-1" .11:-.... .......'" f,""'!''' ,........ ' .. '-,".*"'''·~'V'',·,~..,... .~~., ~..... r- " ~, ,~., \ ;-J .:.- • '/ ~~ <,~,~,:~~~~.~ .~~'1' i~;',".;.· ~:-~." ,'!

., .. ~ .;'-r......~.l\- .. , I ~_I ;i,"~'~ ( ; ; ~ . .' ~~. /I~~",~' .~: ,.' " 1 r , ..~. .

~vr ~ I ·".T"

:',:~.~~;r.J~".'~.'. '. ~ ..:',..... ,~ ,~ .... 1"!1~~ ~.,.. ,..:JIW". ~. . .' _ 1fijII' ~" T' r'; .~ .. , ............. ..... 'cJI'o-7' ';.f-.P •..... '..,,'~ ' "i¢~''' ........

- • .:.,J .. • ~ ~'" ,~-. ... ,J .. ":-~ ..... .;-;,.l1lI \~ .r" . .-::. . ~ ">' '')' . .' ,,,. , ",. ./'·'1 .••. l:'

.·'it ..c' ;', ~~r.,;t'1a ..·"·'~A·,':-".. ·.t ...' ..... ' ,. '- . *.~.~ . .,~. .~. "",,··L ~.~."';:" «-, ,0$Al~:.'~"~~:; r·,i ''(*':.r. ,~~.{. ,,-­.. 'I,;~'-; ....-~,~ -".: !;. .-. , ....::!.i~ • " ......,. ,-r'

tal ..,.:."., ,'" <.' -'~.....

.J,:....,~ )o,..... \."~: L~.:a...,.,.'.r:-:-~ ~-'lIr",;r" .'.

,I '

Resim 2. 8. Gruba ail dejeneratif bulgular, hepatosit karyomegali, hepatosit sitomegali ve iltihabi hiicre infiltrasyonu olusumu, H&E, Orj . Biiy.x100.

Resim 3. 8.Gruba ail preneoplastik fokus. H&E, Orj . Biiy.x200.

TARTJ ~MA

Bu bolumde, cahsmarruzda tumo r olusumuna et­kisi o lan DEN ve 2-AAF'nin birlikte sicanlara verilc­rek, bir mantar metaboliti olan DMV ve ondan turetil­mis l- a-hidroksi-D MV'n in SOD , Gpx, katalaz enzim aktiviteleri, MDA duzeyi ve histoloj ik olarak preneoplastik fokus, dejeneratif bulgular, hepatosit karyomegali, iltihabi hucre filtrasyonu ve nekroza olan etkileri yonunden sirasiyla tartisilacaknr.

SO D % inhibi syon u bakirnmdan, kon troI gruba go re, 2. (Yag), 3. (DMSO), 4. (DM V) ve 5. ( I-a­hidrok si- DMV) grup larda far k bulunmadi, Ancak, 6. (DEN), 7. (2 -AAF), 8. (DEN + 2-AAF) gru plarda co k onem li duzeyde, 10. (DEN+2-AAF+ I-a­hidroksi-DMV) gru pta ise onernli duzeyde azalma bulunurken, 9. (DEN +2-AAF+DMV) grubun ise

Kocatepe Tip Dergisi, a u 7 No: 3. Eylii12006.

55 Hepatokarsinogenezis 'in Erken Diineminde Demetoksiviridin ve l-a-Hidroksi -demetoksiviridinin Antioksidan Savunma Sistemine Etkisi / The Effects ofDemethoxyviridine and l -a-Hydroxy-demethoxyviridine

on The Antioxidant Defence System in The Early Stage Hepatocarcinogenesis

kontrol duzeyine yaklastigi ortaya kondu . Kontrole gore, 6., 7. ve 8. gruplann SOD % inhibisyonundaki azalmanm nedeni SOD enziminin aktivitesinin en­gellendigi ya da asm miktarda O2' radikalinin ure­tilmesi olabilir. Yine, kontrole oranla 10. grupta onemli diizeyde azalma, 9. grupta ise kontrol grubu­na yaklastiracak kadar SOD inhibisyonundaki azal­rna bize aktivitenin artngim gostermektedir. Yapilan cahsmalarda, DEN ve FB uygulanan sicanlann ka­racigerinde SOD aktivitesinde azalma belirlernisler­dir. Bu cahsma ile SOD'un savunma sistemi icin 90k onemli oldugunu ortaya konrnustur. SOD'un, antioksidan olarak gorev yaparak, zar ve sitozolde serbest radikallerin neden oldugu hasara karst sa­vunma yaptigi belirtilmistir. SOD'un oksijen radika­lini hidrojen peroksit haline donusturdugu, bu olusan hidrojen peroksiti de katalaz ve Gpx'm suya donus­turdugu bildirilmistir , Kanserli hucrelerde, normal hiicreye gore SOD miktannm daha yiiksek olmasi­nm nedeni olarak, tumor hiicrelerinde serbest oksi­jen radikallerinin asin derecede iiretilmesini (14) , DEN ve 2-AAF'nin sican karacigeri hiicrelerinde SOD aktivitesini arnrdrgi belirlemislerdir (29) . Bi­zim cahsmarmzda da azalma oldugu ortaya konrnus­tur. Ama ilk kez denenmeleri nedeniyle, DMV ve 1­a-hidroksi-DMV'nin etkilerini arasunlmasi acism­dan herhangi karsilastirma yapilamarrusnr.

Gpx diizeyinde, kontrol grubIan ve DEN+2­AAF+DMV veri len gruplar arasmda fark bulunmaz­ken DEN ve DEN2-AAF veri len gruplarda 90k onemli diizeyde azalma ve DEN+2-AAF+I-a­hidroksi-DMV verilen grupta ise onernli duzeyde ar­tis bulundu. Bu bulgular sonucunda Gpx 'in, DEN ve 2-AAF uygulanan gruplarda Gpx'in 90k onemli du­zeyde azaldigi, DMV'nin de l-a-hidroksi-DMV ka­dar olmasa da Gpx duzeyini artmci etkisinin oldugu belirlenmistir. Yapilan bir cahsrnada, DEN ve FB uygulanan sicanlarda, Gpx'in azaldigim, savunma sisteminde rol almasi nedeniyle bu azalmanm onem­Ii oldugu ortaya konmustur. SOD'un oksijen radika­lini hidrojen peroksit haline dontlsttlrdilgl], bu olusan hidrojen peroksiti de katalaz ve Gpx'm suya donus­tiirdiigii ortaya konmustur (14) . Bu cahsmada oldu­gu gibi bizim cahsmarmzda da , DEN ve 2-AAF'nin Gpx aktivitesini azalttigi belirlenmistir.

MDA diizeyinde, kontrol grubuna gore, 2., 3., 4. ve 5. gruplarda fark bulunmazken, 6., 7., 8. , 9. ve 10. gruplar arasmda 90k onemli diizeyde artis bu­lundu. Bu bulgulara gore DEN ve 2-AAF'nin LPO (Lipit Peroksidasyon)'nun ikinci iiriinii olan MDA'YI artirdrgr, ancak buna DMV ve l-a­hidroksi-DMV'nin artan bu degerleri istatistiksel

olarak kontrol grubuna yaklasnrmadigi tesbit edildi . Bu sonuca gore siiperoksit ve hidroperoksit radikal­leri LPO'nun artmasmi saglayarak, hucre zan hasa­nmn artisma neden olmuslardir, Koruyucu olarak ise, bu metabolitlerin herhangi bir etkisine rastlan­marmsur. Yapilan cahsmalarda, DEN ve FB ile olusturduklan hepatik tumor olusumu ile antioksi­danlar arasmdaki iliskiyi su sekilde aciklarmslardir; DEN'in metabolitleri DNA'ya bir ya da iki oksidasyon saglayan elektron ile kovalent baglana­rak tumor promotorlerinin baglanmasma aracihk eder. Tumor promotoru, bir siiperoksit anyonu in­diikleyicisi olarak gorev yaparak reaktif oksijen mo­lekulleri ve hidrojen peroksit olusumunu saglar. Bu­nun sonucunda siiperoksit ve hidrojen peroksit biri­kimi gerceklesir. Bu birikim, koruyueu antioksidan mekanizmanm azalmasmi, yuksek oranda reaktif hidroksil radikali olusumunu saglar. Olusan hidrok­sil radikallerinin deoksiribozda parcalanmalara do­layisiyla DNA kmklanna neden oldugu, reaktif hid­roksil radikallerinin, lipit membranda yer alan yag asitlerindeki hidrojen atomlanm ayirdigi, bu hidro­jen atomlan da doymamis 90k karbonlu yag asitleri­nin karbonil gruplanyla birleserek hidroperoksit ra­dikallerini olusturarak lipit-hidroperoksit olusumu sirasmda hidrojeni ayirdrgi ve bu durumun, superoksit ve hidroperoksit radikallerinin LPO arti­sma, dolayisiyla hiiere zannda hasara neden oldugu belirtilmistir (13). Yapilan farkh bir derlemede de MDA'nm lipit peroksidasyonunun ikinei iiriinii 01­dugunu ve onun belirleyieisi niteligini tasrdrgmi be­lirtmistir (17) . Yapilan bir cahsmada, sicanlara DEN ve FB uyguladiklan sicanlann karaciger doku hiiere­lerinde, radikal olusumu sonueunda olusan lipit peroksidasyonun ikinei nrunu olan MDA (malondialdehit)'da arns oldugunu belirtmislerdir (14) . Bu sonuclar, bizim cahsmarmzda tesbit ettigi­miz MDA duzeyinin artisi ile paralellik gostermek­tedir. DMV ve I-a-hidroksi-DMV metabolitlerinin, MDA duzeyine olan etkilerinin arastmldigi herhangi bir cahsmaya rastlayamadigirruzdan bunlarla ilgili karsilasurma yaprlamarmsnr.

Katalaz aktivitesinde, kontrol grubuna gore, prenoplastik fokus olusumuna neden olan DEN ve 2-AAF 'nin katalaz aktivitesini azalttigun ya da asm kullamm nedeni ile azaldigi, DMV'de daha fazla olmak nzere l-a-hidroksi-DMV'nin bu aktivasyonu artirarak, kontrol diizeyine yaklasnrdrgi belirlendi. Yapilan cahsmalarda, katalazm savunma sistemi icin 90k onemli oldugu ve toksik etki sonueunda olusan serbest oksijen radikallerini SOD ile beraber hidro­jen peroksite ve suya donusturdugu ve bunun sonu-

Kocatepe TIp Dergisi, Cilt 7 No: 3, Eyliil 2006

56 OSTONER ve ark.

cunda da Gpx'de de belirtildigi iizere, Gpx 'in bu olusan hidrojen peroksiti yakaladigi ve bunun sonu­cunda da katalaz ve diger enzim sistemlerinin bunla­n suya donusturdugumi (14) , sicanlara FB uygulan­diginda hepatosit sitozoliinde katalaz aktivitesinde azalma oldugunu (15) ortaya koymu slardir, Bizim cahsmarmzin sonuclan da bu cahsma ile paralellik gostermektedir. Ancak yapil an diger cahsmalarda, DEN ve 2-AAF uyguladiklan sicanlarda (16) ve hepatosit kiiltiiriine FB uygul adiklan cahsmalarda katalazda artis oldugu belirtilmistir (19). Bu sonuc­lar, bizim sonucumuz ile uyumlu degildir,

Histolojik olarak cahsmarruzda kontrol grupla­nna gore DEN ve 2-AAF verilen gruplarda patolojik bulgularm bulunmasi ve ozellikle preneoplastik fokuslann gorulmesi yapugirmz cahsmanm seyrinin dogru oldugunu gostermektedir. Bu patolojik bulgu­lar bize tumor olusumunun basladrgiru ve bu tumor olusumuna etkisini incelememiz nedeniyle daha ileri asamasmm beklenilmemesi gerektigini ve dogru zamanda DMV ve I-a-hidroksi-DMV uyguladigi­rrnzi gostermistir , Ozelliklede, DMV ve I-a­hidroksi-DMV uyguladigirruz gruplarda patolojik olarak bir diizelme olmustur. Yapilan cahsmalarda, wortmannini Swi ss T-hiicrelerine uyguladiklannda, PI 3-kinazl inhibe ederek tumor olusumunu etkiledi­gini ortaya koymuslardir (25) . Yapilan farkh bir ca­hsmada da , pankreatik p-hiicrelerinde wortmanninin, insiilin sekresyonunu inhibe ettigi tespit edilmis olup, sonucta wortmanninin PI 3­kinazi inhibe ederek PLC 'nin akti vitesini inhibe et­mektedir. Boylece PIP2 'nin hidrolizinin engellendi­gini ve dolayisiyla diacilgliserol (DAG) ve inositol 1,4,5 trifosfot (IP3) olusumunun engellendigi ortaya konmustur (24) . Farkh bir cah smada ise, wortmannin ve onun yapi sal analogu olan DMV'i Swiss 3T3 hiicrelerine uygularmslar , bu maddelerin PI 3- kinazi inhibe ederek PLC 'yi inaktive ett igi ve PIP/nin hidrolizini engelleyerek DAG ve IP3 akti­vitesini durdurdugunu bel irtmislerdir (22).

Sonuc olarak, her iki mantar metabolitinin preneoplastik donemde antioksidanlara karst etkili oldugu ortaya kondu. Fakat bu sonucun daha da ke­sinlesebilmesi ve preneoplastik donemi takip eden evrelerde, ne gibi etkilerinin olabilecegini ortaya koyabilmek icin , heniiz cok yeni olan bu konuda, yapilacak yeni cahsmalara ihtiyac vardir,

KAYNAKLAR

I. Kuroda H, Ohtsuru A, Futakuchi M, Kawa shita Y, Nagayama Y, Fukuda E, Namb a H, Shirai T, Kanematsu T, Yama shita S. Distinctive Gene Expression of Receptor-type Tyros ine kinase Families during Rat Hepatocarcinogene sis. Int J of Mol Med , 2002 ; 9: 473-480.

2. Thirunavukkarasu C, Sakthisekaran D. Effect of Diet ary Se lenite on N-N itrosodiethylamine-Induced And Phenobarbital Promoted Multi stage Hepatocarcinogenesis in Rat: Reflection in Some Minerals. Biomed icine & Pharmacotherapy , 2003 ; 57: 416-421.

3. Wood A, Sarma D, Archer M. Inheritance of Resistanc e to Promotion of Preneopl astic Liver Lesions in Copenhagen Rats. Exp Bioi Med, 200 1; 226(9): 83 1-835.

4. Ahn B, Han B, Kim D, Ohsh ima H. Immunohistochemical Locali zat ion of Indu cible Nitric Oxide Synthase and 3-Nitrotyrosine in Rat Liver Tumors Induc ed by N-Nitrosodiethylamine. Carcinogenesis, 1999 ; 20(7): 1337- 1344.

5. Barbason H, Mormont C, Ma ssart S, Bouzahzah B. Anti-Carcinogenic Actio n of Phenobarbital Given Simultaneously with Diethylnitrosamine in The Rat. Eur T Cancer Clin Onc ol, 1986; 22(9): 1073-1078.

6. Mitsum ori K, Onodera H, Shoda T, Une yama C, Imazawa T, Takegawa K, Yasuhara K, Watanabe T, Takahashi M. Liver Tumuour-promoting Effects of Oxfendazole in Rats. Food Chern. Toxi col , 1997; 35 : 799-806.

7. Thullberg M, Kraupp G.B, Hogberg J, Garberg P. Changes in Liver Fatty Acid-Binding Protein in Rat Enzyme-A ltered Foci. Cancer letters, 1998; 128:1-10 .

8. Arora A, Shukla Y. Induction of Preneoplastic Altered Hepatic Foci Following Dietary Sulphur Supplementation. Human & Exp erimental Tox ico logy, 2004 ; 23: 229-234 .

9. Barbi san L, Scolastici C, Miyamoto M, Salvodari D, Ribeiro L, Eira A, Camargo 1. Effects of Crude Extracts of Agaricus Blazei on DNA Damage and on Rat Liver Carcinoge nesis Indu ced by Diethylnitrosamine. Genet Mol Res, 2003; 2(3) : 295 ­308.

10. Barbi san S, Kaneno R, Rodrigue s M, Salvadori D, Moreira E, Barbisan L, Camargo J. Lymphoproliferative Response and T Lymphocyte Subsets in a Medium-Term Multi-Organ Bioassay for Carcinogenesis in Wistar rats. Cancer Letters, 2000 ; 154: 121-1 29.

II. Liu L, Gong L, Qi X, Cai Y, Wang H, Wu X, Xiao Y, Ren J. Altered Expression of Cytochrome P450 and Possible Correl ation with Preneoplastic Changes in

Ko catepe TIp Derg isi, CUI 7 No: 3, Eyliil 200 6.

.- ---...s..... .... ­

57 Hepatokarsinogenezis 'in Erken Diineminde Demetoksiviridin ve l- a-Hidroksi -demetoksiviridinin Antioksidan Savunma Sistemine Etkisi / The Effec ts of Demethoxy viridine and l-a-Hydroxy-demethoxyviridine

on The Antioxidant Def ence System in The Early Stage Hepatocarcinogenesis

Early Stage of Rat Hepatocarcinogenesis. Acta A2 Activity in Swiss 3T3 Cells. J Bioi Chern, 1995; Pharm acologica Sinica, 2005; 26(6): 737-7 44. 270 : 25352-25355.

12. Ma X, Ma X, Sui Y, Wang W L, Wang C. Signal 23. Cutler N, Heitm an J, Cardenas M. STT4 Is Essentia l Transduction of Gap Junctional Genes, Connexin 32, Phosphatidylinositol 4-Kinase That is a Target of Connexin 43 In Human Hepatocarcinogenesis. World Wortmannin in Sacc haro myces cerevisiae . J Bioi J Gas troenterol, 2003 ; 9(5) : 946-950. Chern, 1997; 272 (44): 2767 1-276 77.

13. Thi rynavukkarasu C, Sakthisek aran D. Stabili zation 24. Gao Z, Konr ad R, Co llins H, Matschin sky F, of Membrane Bound Enzy me Profiles by Sodium Rothenberg P, Wolf B. Wortmannin Inhibits Insulin Selenite in N-nitrosodiethylamine Induced and Secretion in Pancreatic Islets and ~-TC3 Cells Phenoba rbital Promoted Hepat ocarcinogenesis in Independent of Its Inhibit ion of Phosphat idylinositol Rats. Biomedicine & Pharm acotherapy, 2003; 57: 3-Kinase. Diabetes, 1996; 45 : 854-862.

117-123 . 25 . Norman B, Shih C, Toth J, Ray J, Dodge J, Joh nson 14. Banakar M, Paramasivan S, Chattopadhyay M, Datta D, Rutherford P, Schuitz R, Worzalla J, Vlah os C.

S, Chakraborty P, Chatterjee M, Kann an K, Studies on the Mec hanism of Phosphatidylinositol 3 ­Thyga rajan E. lu,25-Dihydrox yvitamin D3 Prevents Kinase Inhibi tion by Wortmann in and Related DNA Damage and Restores Antioxidant Enzymes in Analogs. J Med Chern, 1996; 39: 1106-1111 .

Rat Hepatocarcinogenesis Induc ed by 26. Lemk e L, Murrieta G, Taylor C, Powis G. Diethyln itrosamine and Promoted by Phenobarbital. Wortmannin Inhibits The Grow th of Mamm ary World J. Gastroenterol , 2004; 10(9) : 1268-12 75. Tumors Despite the Exis tence of A Nove l

15. Goeptar A, Groo t E, Scheerens H, Commandeu r J, Wortmannin-Insensitive Phosphatidylinositol-3­Vermeulen N. Cytotox icity of Mitomycin C and Kina se. Cancer Chemother Pharmacol, 1999; 44 : Adriamyc in in Freshly Isolated Rat Hepatocytes: The 491-497. Role of Cytochrome P450. Cancer Res, 1994 ; 27. Aydinlik H, Nguye n T, Moennikes 0 , Buchmann A, 54:24 11-24 18. Schwa rz M. Selective Pressure During Tumor

16. Abdellat if A, Altonsky A, Awa d M, Roberfroid M, Promotion by Phenobarbital Leads to Clonal Khan U. Peroxisomal Enzymes and 8­ Outgrowth of B-Caten in-Mutated Mouse Liver Hydroxydeoxyguanosine in Rat Liver Treated with Tumors. Oncogene, 200 I ; 20: 78 12-78 16. Perfluorooctanoic Acid. Disease Markers, 2003; 19: 28. Chakraborty T, Ghosh S, Datta S, Chakraborty P, 19-25. Chatterje e M. Vanad ium Supresses Sister- Chromatid

17. Conklin K. Dietary Polyun saturated Fatty Acids: Exchange and DNA-Protein Crosslink Formati on and Impact on Ca ncer Che motherapy and Radiation . Restores Antioxidant Status and Hepatocellular Altern Med Rev, 2002; 7( 1): 4-2 1. Archite cture dur ing 2-Acetylaminofluorene Induced

Experimental Rat Hepatocarcin ogenesis. J Exp Ther 18. Das S. Garlic- A Natural Source of Cancer Prevent ive One , 2003; 3:346-362. Compound s. As ian Pacific J. Cancer Prev, 2002; 3:

305-311 . 29. Finnberg N, Silins I, Stenius U, Hogberg J. Characterising The Role of MDM2 in 19. Fernand ez C, Sanz N, Alvarez A, Wolf A, Cascales Dieth ylnit rosamin e Induced Acute Liver Damage and M. The Effect of Non -Genotoxic Carcinogens, Devel opment of Pre-Neoplastic Lesions. Phenobarbital and Clofibrate, on The Relationship Carcinogenesis, 2004; 25 : 113-122 . between React ive Oxgen Species, Ant ioxidant

Enzy me Express ion and Apoptosis. Carcinogenesis, 30. Park D, Lee C, Sol M, Suh K, Yoon S, Kim J. 1998; 19: 1715-1 722. Expression and Localization of the Tran sforming

Growth Factor-b Type I Receptor and Smads in 20. Kiran i, Ilhan S, Akar T, Tur L, Erol E. Synthesis and Preneoplastic Lesions during Chemica l Evaluation of Demethoxyviridin Derivates as Hepatocarcinogenesis in Rats. J Korean Med Sci,Potential Antimic robials. Z. Naturforsch, 2005; 60 : 2003;18: 510-51 9. 686-692.

31. Uchiyma M, MIhara M. Determ ination of21. Pendl G, Prieschl E, Thumb W, Harrer N, Auer M, Malon aldeh yde Precursors in Tissues byBaumruker T. Effects of Phosphatidylinositol-3­Th iobarbituric Acid Test. Analytical Biochem, 1978; Kinase Inhibitors on Degranul ation and Gene 86, 279-286. Induction in Allergically Tr iggered Mouse Mast

Cells. Int Arch Allergy Immunol, 1997; 112: 392 ­ 32. Goth L. A Simple Method for Determination of Se­399 . rum Catalase Activity and Revision of Reference

Range. Clinica Chimica Acta, 1991; 196: 143- 152. 22. Cross M, Stewart A, Hodgkin M, Kerr D, Wakelam M. Wortmann in and Its Structura l Analogue Demethoxyvir idin Inhib it Stimul ated Phospholipase

Kocatepe Tip Dergisi, Cilt 7 No: 3. Eyliil 2006.