คมอ การเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและ

อณนตวทยาศาสตรทางสตว

ISBN 978-974-682-377-7

นายสตวแพทยณชย ศราธพนธ

กลมวจยและพฒนาเทคโนโลยชวภาพการปศสตว

ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว

กรมปศสตว กระทรวงเกษตรและสหกรณ

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและ อณนตวทยาศาสตรทางสตว

นายสตวแพทยณชย ศราธพนธ

กลมวจยและพฒนาเทคโนโลยชวภาพการปศสตว

ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว

กรมปศสตว กระทรวงเกษตรและสหกรณ

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและ อณนตวทยาศาสตรทางสตว รหสมาตรฐานสากลประจ าหนงสอ : ISBN 978-974-682-377-7

จดท าโดย : ณชย ศราธพนธ กลมวจยและพฒนาเทคโนโลยชวภาพการปศสตว ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว กรมปศสตว กระทรวงเกษตรและสหกรณ

เลขทะเบยนผลงานวชาการ 57(2)-0208-012

พมพครงท 1 พ.ศ. 2556

สงวนลขสทธตาม พ.ร.บ. ลขสทธ พ.ศ. 2527

พมพท บรษท นวธรรมดาการพมพ (ประเทศไทย) จ ากด

ค าน า การเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตวเปน

สวนส าคญของเจาหนาททปฏบตงานในการเกบตวอยางและตรวจตวอยาง

เนองจากตามประมวลกฏหมายวธพจารณาความอาญามาตรา ๑๓๑ ไดบญญต

เกยวกบอ านาจของพนกงานสอบสวนวา ใหพนกงานสอบสวนมอ านาจในการ

รวบรวมพยานหลกฐานทกชนดเทาทสามารถท าได เพอประสงคจะทราบ

ขอเทจจรงและพฤตการณตางๆ อนเกยวกบความผดทถกกลาวหาประกอบกบ

มาตรา ๑๓๑/๑ ก าหนดให ในกรณจ าเปนตองใชพยานหลกฐานทางวทยาศาสตร

เพอพสจนขอเทจจรงตามมาตรา ๑๓๑ พนกงานสอบสวนมอ านาจในการตรวจ

พสจน บคคล วตถ หรอ เอกสารใดๆ โดยวธวทยาศาสตรกสามารถท าได โดย

อาจขอความรวม มอจากหนวยงานทมความเชยวชาญในการนนๆ ในคมอเลมนจะ

ประกอบดวยชนดของตวอยาง การเกบตวอยาง การสงตวอยาง การรบตวอยาง

การสกดดเอนเอ การตรวจตวอยางดเอนเอ การวเคราะหผล ตลอดจนการรายงาน

ผลเพอใหผมหนาทเกยวของในการตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทาง

สตวใชเปนคมอในการปฏบตงานไดอยางถกตองและมคณภาพ

ขอขอบคณเจาหนาทกลมวจยและพฒนาเทคโนโลยชวภาพการปศสตว ท

มสวนชวยเหลอท าใหหนงสอเลมนส าเรจดวยด

ณชย ศราธพนธ กนยายน 2556

สารบญ

หนา บทท 1 ชนดตวอยาง 1

บทท 2 การเกบตวอยาง 3

บทท 3 การสงตวอยาง 7

บทท 4 การรบตวอยง 9 บทท 5 การสกดดเอนเอ 10 บทท 6 การตรวจตวอยางดเอนเอ 20

-การตรวจหาชนดสตวของตวอยาง 22

-การตรวจอตลกษณลายพมพดเอนเอ 23

บทท 7 การวเคราะหผลการตรวจความเปนพอ แม ลก 27

บทท 8 การรายงานผล 30

บรรณานกรม 31

ภาคผนวก 32

บทท 1 ชนดตวอยาง

ในปจจบน ดเอนเอเทคโนโลยสามารถใชแยกความแตกตางระหวางบคคล

ไดจากตวอยางทมชวตและตายแลวยกเวน บคคลทเปนแฝดแบบ identical twin

ดเอนเอสามารถสกดไดจากตวอยางหลายชนดเชน เลอด ในเลอดสดมดเอนเอ

30,000 นาโนกรมตอมลลลตร คราบเลอดมดเอนเอ 200 นาโนกรมตอตาราง

เซนตเมตร หรอ 2 นาโนกรมตอตารางมลลเมตร น ากาม ในน ากามหนงมลลลตรม

ดเอนเอ 25,000 นาโนกรม หรอ 0-3,000 นาโนกรมในส าลท swab จากชองคลอด

หลงรวเพศ ในน าลายมดเอนเอ 5,000 นาโนกรมตอมลลลตร ในรากขน (ทรวง

เอง) มดเอนเอ 1-12 นาโนกรมตอเสน

เลอดสดผสมสารปองกนเลอดแขง เลอดแหง

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 1

ขนหางสตว รากขนหางสตว

น าเชอแชแขง น าเชอสตว

ชนเนอแหง กระดก

2 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

บทท 2 การเกบตวอยาง

การเกบตวอยางส าหรบตรวจทางอนตวทยาศาสตรทางสตว สามารถเกบตวอยางหรอวตพยานไดจากสตวในขณะทมชวต สตวทตายไดตงตอไปน สตวทมชวต การเกบตวอยางเลอด

- บงคบสตวใหอยนง - ใชส าลชบแอลกอฮอล 70% ท าความสะอาดทบรเวณล าคอสตว - ใชเขมเจาะเลอด เบอร 18G ขนาด 1.5 นว พรอมกบไซรงคขนาด 10 หรอ

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 3

20 ซ.ซ. ทใหมสะอาดปราศจากเชอ ดดเลอดเลอด - บรรจเลอดทนทหลงจากดดจากสตวลงในหลอดเกบเลอดทมสารปองกน

การแขงตวของเลอดชนด EDTA, Citrate หรอ Heparin ประมาณ 5 ซ.ซ. - กลบหลอดเลอดขน-ลง ผสมเลอดกบสารปองกนการแขงตวของเลอดให

เปนเนอเดยวกน - เขยนหมายเลข/ชอสตว บนหลอดเกบเลอด รวบรวมหลอดเกบเลอดใน

ถงซปพลาสตค ใสในกลองโฟมทมน าแขงสงหองปฏบตการ

ตวอยางเลอด เกบรวบรวมในกลองโฟม ทมน าแขงแช

4 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

การเกบตวอยางขนสตว

บงคบสตวใหอยนงจบหางสตวดวยมอซาย มอขวาท าความสะอาดขนหาง

ดงขนหางครงละประมาณ 10 ว ว

ตดขนหางยาวประมาณ 3 นว เกบในถงซป เขยนชอ/หมายเลขสตว อาย เพศ

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 5

สตวทตาย

ใชส าลทสะอาดซบเลอดบรเวณบาดแผลทงไวใหแหงในรม เกบใสซองปดผนก

ชนเนอสดขนาดประมาณ 10 กรม กระดกสด ใหเกบใสถงพลาสตค แชน าแขง สวนชนเนอ แหง ใหเกบใสถงพลาสตค เขยนรายละเอยด ใสซองปดผนก สงหองตรวจทางปฏบตการ

6 คมอการเกบตวอยางเพอตรวอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

บทท 3 การสงตวอยาง

การสงตวอยางตรวจทางหองปฏบตการอณนตวทยาศาสตรทางสตว ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว มแผนผงดงน

- หลงจากต ารวจพสจนหลกฐานเกบตวอยาง (วตถพยาน) แลวใหน าสง

ตวอยาง โดยเจาหนาทต ารวจผรบผดชอบท าหนงสอจากตนสงกด เรยนอธบดกรมปศสตวเพอขอความอนเคราะหตรวจตวอยาง

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 7

- อธบดกรมปศสตวพจารณา รบทราบและแจงส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตวใหด าเนนการตรวจวเคราะห

- เจาหนาทต ารวจน าสงตวอยาง มายงหนวยอณนตวทยาศาสตรทางสตว ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว พรอมหนงสอสงตวอยางทมรายละเอยดตวอยางและลายเซนรบรองของผบงคบบญชาหนวยงานทจดสง (ตวอยางตองน าสงโดยเจาหนาท โดยตรง ไมรบตวอยางทางไปรษณย)

แผนทตงหนวยอณนตวทยาศาสตรทางสตว ในศนยราชการกรมปศสตว ปทมธาน

8 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

บทท 4 การรบตวอยาง

การรบตวอยาง มขนตอนด าเนนงานดงตอไปน - หองปฏบตการหนวยอณนตวทยาศาสตรทางสตว ตรวจรบตวอยาง (วตถ

พยาน) โดยตรวจสอบชนด สภาพ จ านวนตวอยาง - หล ง จ ากน น ผ ส ง ต ว อย า ง เ ซ นหน ง ส อส ง ต ว อย า ง เ จ า หน าท

หองปฏบตการเนหนงสอรบตวอยาง และถายรปวตถพยาน - เจาหนาทหองปฏบ ตการจะส า เนาเอกสารตรวจรบ 1

ว - เจาหนาทหองปฏบตการบนทกรายละเอยดตวอยาง ตามหลกเกณฑ

หองปฏบตการฯ และเกบตวอยางไวรอการตรวจวเคราะห

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 9

บทท 5 การสกดดเอนเอ

ขนตอนการสกดดเอนเอจากเลอดสด ( Whole Blood) ดวย AxyPrep

Blood Genomic DNA Miniprep Kit

10 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

Add AP1 Buffer 500 µl Mix by vortex

Spindown ดดสวนใสใสใน Miniprep Column ทรองดวย 2.0 ml Micro. Tube

ปนทความเรว 6000 rpm 1 นาท

ทงสวนใสดานลาง Add W1A Buffer 700 µl ใน Miniprep Column

ทรองดวย 2.0 ml Micro.Tube

Incubate ทอณหภมหอง 2 นาท ปนทความเรว 6000 rpm 1 นาท

ทงสวนใส Add W2 Buffer 800 µl ใน Miniprep Column ทรองดวย 2.0 ml Micro.Tube

ปนทความเรว 12000 rpm 1 นาท

ปนทความเรว 12000 rpm 1 นาท

เตม TE buffer 100 µl ใน Miniprep Column ทรองดวย

1.5 ml Micro.Tube Incubate ทอณหภมหอง 1 นาท ปนทความเรว 12000 rpm 1 นาท

ดด Whole Blood 200 µl ใส 1.5 ml Micro. Tube

Genomic DNA Store at -20C

ขนตอนการสกดดเอนเอจากเนอเยอ (Tissue) ดวย Genomic DNA Extraction Kit (Tissue)

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 11

ตดชนเนอปรมาณ 40-60 mg ใสในหลอด 1.5 ml Micro.

Tube เตม GT Buffer 200 µl Mix by vortex ,

Spindown เตม Proteinase K(10mg/ml) 20 µl Mix by vortex , Spindown

Incubate ทอณหภม 60°C ขามคน , เขยาหลอดทก 10 นาท

เตม GB Buffer 200 µl Mix by vortex , Spin down

Incubate ทอณหภม 70°C เปนเวลา 20 นาท เขยาหลอดทก 5 นาท หรอจนกระทงสารละลายใส

เตม Ethanol 200 µl Mix by vortex , Spindown

วาง GD Column ใน Collection Tube และน าสารลายลายทงหมดใสใน GD Column

Centrifuge ท 13,000 rpm เปนเวลา 2 นาท

ทงสวนใสและเตม W1 Buffer 400 µl ใน GD Column และปนตกตะกอน

ดวย Centrifuge ท 13,000 rpm เปนเวลา 30 วนาท

ทงสวนใสและเตม Wash Buffer 600 µl ใน GD Column และปนตกตะกอน

ดวย Centrifuge ท 13,000 rpm เปนเวลา 30 วนาท

12 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

Centrifuge ท 13,000 rpm เปนเวลา 3 นาท เพอให Column แหง

เตม Elution Buffer (Preheat) 100 µl ใน GD Column ทรองดวยหลอด 1.5 ml Micro.

Tube Incubate ทอณหภมหอง 2นาท ปนทความเรว 13,000 rpm 30 วนาท

Genomic DNA Store at - 20°C

ขนตอนการสกดดเอนเอจากรากขนดวยวธ Salt-Out

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 13

ตดขนหางสวนรากขนจ านวน 20 เสน ใส 1.5 ml Micro. Tube

เตมสารละลาย Buffer B µl เขยา

หลอด

เตมสารละลาย 10% SDS จ านวน 50 µl และ proteinase K ว µl

เขยาหลอด (vortex) และบมไวทอณหภม 56 ๐ซ นานขามคน

เตมสารละลายเกลอ 5.3 M NaCl ว 7 µl ผสมใหเขากนดวยการ pipetting

น าไปปนเหวยงทความเรบรอบ 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท

ดดสวนใสดานบนลงใน 1.5 ml Micro. Tube ใหม

เตม absolute ethanol ว ml

น าไปปนเหวยงทความเรบรอบ 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 3 นาท

ดดสวนใสทง เหลอตะกอนดเอนเอไว

เตม 70% ethanol ว ml เขยา (vortex)

น าไปปนเหวยงทความเรบรอบ 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 3 นาท

14 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

ดดสวนใสทง เหลอตะกอนดเอนเอไว

ท าการระเหย 70% ethanol ทอณหภมหอง

ละลายตะกอนดเอนเอดวยสารละลาย TE buffer จ านวน 100 ul

ท าความสะอาดขนดวยแอลกอฮอ 70% แสดงจ านวนเสนของขนหาง

ใชกรรไกรตดขนหางดานทเปนรากขน ใสสารละลาย Buffer B, 10% SDS และproteinase K

เขยาและปนใหรากขนรวมกนทกนหลอด ดงแสดงในภาพขางบน

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 15

ยอยตวอยางขนหางคางคนทอณหภม 56 O ซ. เตมสารละลาย 5.3 M NaCl

เขยาหลอดตวอยาง 30 วนาท น าหลอดตวอยางไปปนท 13,000 รอบ/นาท นาน 15

ดดเกบสวนใสขางบน น าไปใสในหลอดตวอยางใหม และเตม Abs. ethanol ทเยน

16 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

เตม absolute ethanol เพอตกตะกอนดเอนเอ ปดฝาหลอดแลวเขยาดวยมอ

น าหลอดตวอยางไปปนทความเรวรอบ 13,000 รนสวนใสทง

ดดเกบสวนใสขางบน น าไปใสในหลอดตวอยางใหม และเตม Abs. ethanol ทเยน

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 17

ละลายตะกอนดเอนเอดวย สารละลาย TE buffer

การตรวจสอบดเอนเอ โดยวธ Gel Electrophoresis ดวย 1.5% Agarose gel

และยอมดเอนเอดวยอธเดยมโบรไมด ดผลดวยเครอง Gel Documentation

(Alpha Imager3400)

ดดตวอยางดเอนเอจ านวน 1 ไมโครลตร ผสมกบสทม ethidium bromide ใสลงไปหลม 2%

วนอะกาโรส ปลอยกระแสไฟฟา เพอใหชนสวนดเอนเอเคลอนทไป

18 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

A B

[A] แถบ Genomic DNA Lane M : 100 bp marker; Lane 1: DNA เลอดแฉะ(PN82);

Lane 2 : DNA เลอดปนอนงค (PN83) ; Lane 3 - 12 : DNA คราบเลอดคลาว (PN84/1 –

PN84/10) [B] แถบ Genomic DNA Lane M : 100 bp marker; Lane1–5 : DNA ชนเนอ

คลาว (PN85/1 – PN85/5) Lane 6 - 7 : DNA กระดกสดคลาว; Lane 8 - 9 : DNA กระดก

แหงคลาว; Lane 10 : เลอดทองกวาว

จ านวนรากขนหางตงแต 10 ว ว

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 19

บทท 6

การตรวจตวอยางดเอนเอ

ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ไดรบขอความอนเคราะห จาก

เจาหนาทต ารวจใหตรวจวตถพยานโดยใชวธชวโมเลกลอยางตอเนอง ซงถอไดวา

ผลการตรวจพสจนดงกลาวเปนความเหนของพยานผเชยวชาญ ตามประมวลวธ

พจารณาความอาญา มาตรา ๒๔๓ และสามารถใช เปนพยานหลกฐาน

ประกอบการพจารณาในคดได

อณนตวทยาศาสตร เปนวทยาการการน าเอาเทคโนโลยดเอนเอมาใช

ตรวจอตลกษณของบคคล เพอประกอบกบทางนตศาสตร เนองจากในบคคลสอง

คนมดเอนเอจ านวน 99 เปอรเซนตทเหมอนกน และอกหนงเปอรเซนตทแตกตาง

กน ซงการตรวจดเอนเอจ านวนหนงเปอรเซนตน จะเสยคาใชจาย และเวลามาก

นกวทยาศาสตรจงพฒนาวธการตรวจดเอนเอทแตกตางระหวางบคคลโดยอาศย

คณสมบตของดเอนเอชนดแซทเทลไลท ตวอยางเชน ถามการเรยงล าดบเบส 4

เบส ไดแก AATG ซ าๆ กน เมอมการเรยงตวซ ากน 2-5 ชด เรยกวาไมรโครแซท

เทลไลท ถาซ ากน 9-80 ชด เรยกวา มนแซทเทลไลท และทส าคญคอ ไมโครแซท

เทลไลทดเอนเอ ยงคงสภาพเดมในขณะทดเอนเอสวนอนเสอมสภาพแลว ใน

ตวอยางทเกาเชน รากขน กระดก ฟน

20 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

นวเคลยสทอยในเซลลสลายตวไป แตดเอนเอในไมโตคอนเดรยสามารถน าไปตรวจ

ทางหองปฏบตการได เนองจากในเซลลหนงมไมโตคอนเดรยประมาณ 1,000 อน

ดเอนเอในไมโตคอนเดรย สามารถน ามาพสจนชนดสตว และสายสมพนธทางแม

ได เนองจากลกไดรบไมโตคอนเดรยจากแมเทานน ในขณะทเซลลไขปฏสนธกบตว

อสจ

ตวอสจขณะเขาไปผสมกบเซลลไข ไดอะแกรมองคประกอบของเซลลของสตว

[A] ไดอะแกรมดเอนเอในนวเคลยสและไมโตคอนเดรย ประกอบดวยเบส 4 เบสยดเกาะกน

เปนดเอนเอสายค [B] การเรยงล าดบเบสของสายดเอนเอทม 4 เบสซ าๆกน ในสายดเอนเอ

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 21

การตรวจหาชนดสตวของตวอยาง

บางครงวตถพยานไมสามารถจ าแนกชนดของสตวไดจากสถานทเกดเหต

จ าเปนตองพสจนทราบชนดของสตวจากวตถพยานเพอประกอบกบส านวนคด

ชนดตวอยาง ไดแก รากขน ชนเนอสด หรอแหง สามารถน ามาสกดดเอนเอ และ

ตรวจหาชนดของสตวไดโดยใชแทคนคพซอาร เชน Allelic specific PCR และ

PCR-RFLP เปนตน

รากขน เนอสด เนอแหง

แสดงผลการตรวจหาชนดสตวดวยเทคนค PCR-RFLP

22 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

การตรวจอตลกษณลายพมพดเอนเอ

การตรวจลายพมพดเอนเอ (DNA Fingerprint) ของกระบอ

ในการตรวจลายพมพดเอนเอ (DNA Fingerprint) ของกระบอ

มขนตอนและวธการดงน

1. น าดเอนเอทสกดไดมาท าการตรวจลายพมพดเอนเอ โดยการเพมจ านวนดเอนเอดวยเทคนค Multiplex PCR ดวยเครองหมายดเอนเอชนดไมโคร

แซทเทลไลท จ านวน 10 ต าแหนง คอ INRA006, CSSM47, RM004, BM1706, MAF65, CSSM38, CSSM42, CSSM19, INRA189 และ D5S2 ซงไดแบงเปน 2 กลม ดงน

กลมท 1 Multiplex 6 primers คอ INRA006, CSSM47,

RM004, BM1706, MAF65, CSSM38

กลมท 2 Multiplex 4 primers คอ CSSM42, CSSM19, INRA189 และ D5S2

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 23

PCR Mixture

Concentration Final Concentration 1 Reaction

PCR Buffer 10 X 1X 2 µl dNTP 2 mM 0.2 mM 2 µl MaCl2 50 mM 3 mM 1.2 µl

Primer Mix 5 µM 0.1 µM 0.4 µl Taq Polymerase 5U/ µl 0.1 U 0.4 µl

DDW - - 13 µl Template Genomic Genomic 1 µl

Total Volume - - 20 µl

Thermal Condition

2. ตรวจสอบผล Multiplex PCR โดยวธ Gel Electrophoresis ดวย 2%

Agarose gel และยอมดวยเอธเดยมโบรไมด ดภายใตแสง UV ดวยเครอง

Gel Documentation (Alpha Imager3400)

24 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

Step Temp. Time Cycle Initiation Denaturation 94°C 5 min. 1 Denature 94°C 30 sec.

30 Annealing 58°C 30 sec. Extention 72°C 1 min. Final Extention 72°C 60 min. 1 Hold 4°C Hold infinity

แถบชนสวนดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดเอนเอดวยปฏกรยามลตเพลกพซอาร

3. PCR Product ตรวจวเคราะหเปรยบเทยบขนาดดเอนเอ จ านวน10

ต าแหนง ดวยเครองตรวจวเคราะห 3130 Genetic Analyzer และ

วเคราะหดวยโปรแกรม Gene Mapper

แสดงขนาดชนสวนดเอนเอจากเครองตรวจวเคราะห

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 25

ใบประกาศนยบตรรบรองลายพมพดเอนเอ (DNA fingerprint) ของกระบอพอพนธ

26 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

บทท 7 การวเคราะหผล

การวเคราะหขอมลขนาดชนสวนดเอนเอ ทไดจากปฏกรยาลกโซโพลเมอ

เรสดวยเครองหมายไมโครแซทเทลไลท จ านวน 10 ค ในหนงตวอยาทตรวจจะได

ชนสวนดเอนเอ (Allele) จ านวน 2 ชน ถาชนสวนดเอนเอทมขนาดเทากน เรยกวา

Homozygote ถามขนาดไมเทากนเรยกวา Heterozygote ดงนนลายพมพดเอนเอ

ของสตวแตละตว จะมขนาดของชนสวนดเอนเอของแตละ เครองหมายไม

เหมอนกน จงเกดเปนลายพมพดเอนเอของสตวแตละตว

การตรวจความเปนพอ แม ลก

ในการตรวจความเปนพอ-แม-ลกของสตว โดยใชเครองหมายไมโครแซท

เทลไลท เชน โค มา เปนตน ในตางประเทศมชดน ายาส าเรจรปจ าหนาย สวนการ

ตรวจในกระบอ ณชย และคณะ (2555) ไดพฒนาชดตรวจความเปนพอ-แม-ลกใน

กระบอปลกไทยซงมความเชอมนสงถง 99.98 เปอรเซนต เมอใชไมโครแซทเทล

ไลท จ านวน 10 เครองหมาย

ตารางผล ว วเคราะห ว ไปได (0-1) ระหวางเครอญาตในกระบอปลกไทย

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 27

การวเคราะหความเปนพอ-แม-ลก นนอาศยกฎเกณทวา ชนสวนดเอน

ของลกขางหนงของโครโมโซมไดมาจากพอ และอกขางหนงมาจากแม โดยทขนาด

ชนสวนดเอนเอจากการวดขนาดตองแตกตางกนมากกวา 1 เบส การวนจฉยความ

เปนพอ-แม-ลกกนนน ลกจะไดรบชนสวนดเอนเอจากพอและแมครบทง 10

เครองหมาย สวนความสมพนธระหวางพอกบลก หรอ แมกบลก นน ลกจะไดรบ

ชนสวนดเอนเอจากพอ หรอแมตงแต 8-10 เครองหมาย

แสดงประวตเครอญาต (Pedigree) ว

ตารางแสดงการวเคราะหความสมพนธทางเครอญาตของกระบอ ทเปนแม-ลกกนซงลกไดรบ

ชนสวนดเอนเอจากแมมาครบทง 10

28 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

ตารางแสดงการวเคราะหความสมพนธทางเครอญาต (แม-ลก) ในกรณพพาทสทธโคหลงฝง ผลการวเคราะหโคจ านวน 3 ตว ซงลกโคไดรบชนสวนดเอนเอจากแมตวหนงมาครบทง 11 และจากแมโคทสงสยอกตวหนงมาไมครบทง 11 เครองหมาย

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 29

บทท 8

การรายงานผล

เมอหองปฏบตการตรวจและวเคราะหผลเสรจแลว จะพมพรายงานผลใหหวหนาหนวยฯ ตรวจสอบความถกตอง และเจาหนาทของหนวยฯ รางหนงสอสงรายงานผลถงหนวยงานทสงตวอยาง โดยอธบดกรมปศสตวเปนผลงนาม

30 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

บรรณานกรม

ณชย ศราธพนธ กลยา เกงวกยกรรม สายใจ ชนสข และ ณฐนนท ศรรตนธญญะกล 2555 การตรวจความเปนพอ-แม-ลกในกระบอปลกไทยโดย microsatellite markers บทคดยอ: การประชมวชาการแหงชาตมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ครงท 9, 362

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 31

ภาคผนวก สวนประกอบสารละลายทใชในการสกดดเอนเอดวยวธ Salt-Out Buffer A NH4Cl 1.875 g Tris-HCl 0.25 g Double distilled water 500 ml Adjust pH 7.2, autoclave, and store at 4oC Buffer B Stock Solution 100 mM KCl 300 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 100 ml 10 mM MgCl2 200 ml TE buffer 10 mM Tris HCl, pH 7.5 1 mM EDTA

32 คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

ประวตผเขยน

ชอ : ณชย ศราธพนธ

ชอเดม : สชาต ศราธพนธ

นพพร ศราธพนธ

วน เดอน ป เกด : 22 ลาคม 2499

จงหวด : สพรรณบร

การศกษา : วท.บ., สพ.บ. (มหาวทยาลยเกษตรศาสตร)

Ph.D. (Hokkaido University, Japan)

สถานทท างาน : 2524-2529 ว และชนสตรโรคสตวภาคตะวนออก เฉยงเหนอ ต.ทา พระ อ. เมอง จ. ขอนแกน

2530-2549 สถาบนสขภาพสตวแหงชาต แขวงลาดยาวเขตจตจกร กรงเทพมหานคร

2550-ปจจบน ส านกเทคโนโลยชวภาพการผลตปศสตว ต.บางกะด อ. เมอง จ. ปทมธาน

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว 33

คมอการเกบตวอยางเพอตรวจอตลกษณและอณนตวทยาศาสตรทางสตว

ISBN 978-974-682-377-7