วิธีมาตรฐาน ส าหรับการ ...e-library.dmsc.moph.go.th/ebooks/files/m_4.pdfเล มท 4 Volume IV ว ธ มาตรฐานส า หร

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร

Standard Methodsfor Food Analysis

เลมท 4

Volume IV

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 4 Standard Methods for Food Analysis Volum

e IV

กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสขwww.dmsc.moph.go.th

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 4Standard Methods for Food Analysis, Volume IVรหส : DMScBQSF-201601-A

พมพครงท 1 : กรกฎาคม 2559 จานวน 1,000 เลม

ISBN: 978-616-11-2979-8

สงวนลขสทธ

จดพมพเผยแพรโดย

กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข อ.เมอง จ.นนทบร

http://www.dmsc.moph.go.th

โทรศพท/โทรสาร 0 2951 1021

http://dmsc2.dmsc.moph.go.th/webroot/BQSF/Index.htm

พมพท

โรงพมพชมนมสหกรณการเกษตรแหงประเทศไทย จากด สาขา 4

44/16-17 ถนนเลยงเมองฯ ตาบลตลาดขวญ อาเภอเมองนนทบร จงหวดนนทบร 11000

โทรศพท 0-2525-4807-9

โทรสาร 0-2525-4855

คาปรารภ

การวเคราะหคณภาพอาหารทางหองปฏบตการของกรมวทยาศาสตรการแพทย เพอนาผล

การวเคราะหไปใชในการกากบดแล ควบคมคณภาพอาหารใหไดมาตรฐานตามขอกาหนดกฎหมาย และ

ใชเปนหลกฐานทางคดในกรณทคณภาพอาหารไมเปนไปตามมาตรฐานกาหนด หรอเมอเกดปญหาความ

ขดแยง ดานคณภาพความปลอดภยอาหาร ทงในระดบประเทศ และตางประเทศ ดวยเหตน การพฒนา

วธวเคราะหอาหารของประเทศไทยใหเปนวธมาตรฐานเดยวกน จงมความจาเปนอยางยงในการสราง

ความเชอถอ และการยอมรบในระดบนานาชาต

สานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร เปนหนวยงานในสงกดกรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข ทไดรบการรบรองตามมาตรฐานสากล ISO 9001:2015, ISO/IEC 17043:2010,

ISO/IEC 17025:2005 และเปนหองปฏบตการอางองดานการตรวจสอบรบรองคณภาพและความปลอดภย

ของอาหาร มอานาจหนาทในการกาหนดมาตรฐานการตรวจวเคราะห และพฒนาคณภาพหองปฏบตการ

จงไดจดทาวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหารอยางตอเนองมาแลวจานวน 3 เลม เลมนเปนเลมท

4 มการกาหนดวธมาตรฐานเพมขนทงดานเคม จลชววทยา กายภาพ และชวโมเลกล เพอใหหนวยงาน

ในสงกดกรมวทยาศาสตรการแพทย หองปฏบตการภาครฐและเอกชน ผประกอบการอาหาร สถาบน

การศกษา และหนวยงานทเกยวของ นาไปใชเปนวธมาตรฐาน และอางองในการวเคราะหคณภาพ

ความปลอดภยอาหารของประเทศไทยตอไป

(นายแพทยอภชย มงคล)

อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

25 เมษายน 2559

สารบญ

หนา

วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 9

นยามและคายอ 11

รหสวธ 13

DMSc F 1055: การวเคราะหปรมาณไนโตรเจนและโปรตน 15

ในผลตภณฑปรงรสทไดจากการยอยโปรตนของถวเหลอง

โดย Kjeldahl method

DMSc F 1056: การวเคราะหปรมาณความชนในเนย 23

DMSc F 1057: การวเคราะหปรมาณของแขงไมรวมไขมนในเนย 27

DMSc F 1058: การตรวจวเคราะหไขมนในเนยโดยการคานวณ 31

DMSc F 1059: การวเคราะหปรมาณไขมนในครม 33

DMSc F 1060: การวเคราะหปรมาณไขมนในกะทและผลตภณฑ 37

DMSc F 1061: การวเคราะหของแขงทงหมดในกะทและผลตภณฑ 41

DMSc F 1062: การทดสอบนามนแรในนามนและไขมน 45

DMSc F 1063: การวเคราะหปรมาณไอโอดนในเกลอบรโภค 47

ทเสรมไอโอเดต โดยวธไตเตรชน

DMSc F 1064: การตรวจวเคราะหสารเคมกลมเบตาอะโกนสต 51

ในเนอสตวและตบโดยเทคนค Enzyme linked

immunosorbent assay (ELISA)

DMSc F 1065: การตรวจวเคราะหแรคโตพามนในเนอสตวและตบ 61

โดยเทคนค Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

DMSc F 1066: การตรวจวเคราะหสารปฏชวนะคลอแรมเฟนคอล 67

ตกคางในอาหาร โดยเทคนค Enzyme linked

immunosorbent assay (ELISA)

DMSc F 1067: การตรวจวเคราะหสารเคมกลมเบตาอะโกนสต 75

(brombuterol, clenbuterol, ractopamine และ salbutamol)

ในเนอสตวและตบ โดยเทคนค LC-MS/MS

DMSc F 1068: การตรวจวเคราะหสารปฏชวนะคลอแรมเฟนคอล 87

ในเนอสตว โดยเทคนค LC-MS/MS

วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 95

นยามและคายอ 97

รหสวธ 97

DMSc F 2020: วธตรวจวเคราะห Shigella spp. ในอาหาร 99

DMSc F 2021: วธตรวจวเคราะห Escherichia coli O157 ในอาหาร 121

DMSc F 2022: วธตรวจวเคราะห Enterobacteriaceae ในอาหาร 133

DMSc F 2023: วธตรวจวเคราะห Enterococci ในอาหาร 139

DMSc F 2024: วธตรวจวเคราะห mesophilic lactic acid bacteria 151

ในอาหาร โดยเทคนคการนบโคโลนทอณหภม 30 C

DMSc F 2025: วธตรวจวเคราะห Vibrio cholerae ในนาและนาแขง 161

วธมาตรฐานทางกายภาพสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 175

รหสวธ 176

DMSc F 3003: การวเคราะหสงแปลกปลอมชนดเบา (ภายนอก) 177

ในเมลดธญพชและเมลดพช

หนา

หนา

วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 181

รหสวธ 182

DMSc F 4010: Construct-specific method for detection 183

of DNA Sequences from Genetically modified

GTS 40-3-2 (Roundup Ready® soya beans)

by means of Polymerase Chain Reaction


of DNA Sequences from genetically modified

Bt11 maize by means of Polymerase Chain Reaction


of DNA Sequences from genetically modified Event176

(Bt176) maize by means of Polymerase Chain Reaction


of DNA Sequences from genetically modified T25

maize by means of Polymerase Chain Reaction

DMSc F 4014: Event-specific method for detection of DNA Sequences 207

from genetically modified MON810 maize by means of

Polymerase Chain Reaction

ภาคผนวก

รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 1 213



วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหาร

ของกรมวทยาศาสตรการแพทย

คณะผจดทา

1. นางกนกพร อธสข ผเชยวชาญเฉพาะดานมาตรฐานของอาหาร

(นกวทยาศาสตรการแพทย)

2. นางนภาภรณ ลกษณสมยา นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

3. นางสาวสวรรณ ธรภาพธรรมกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

4. นางกญญา พกสน นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

5. นางสาวปษยา แสงวรฬห นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

6. นางสาวจตผกา สนทดรบ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

7. นางสาวอรณ ดนดล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

8. นางสาวกรรณกา จตตยศรา นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

11

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 4กรมวทยาศาสตรการแพทย

นยามและคายอ (Definition and Abbreviation)

1. “H2O” หมายถง นากลน (distilled water) ยกเวนทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ

2. สารเคม (reagents) ทงหมดเปน reagent grade ยกเวนทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ

3. กรด และดาง หมายถง กรด และดาง ทมความเขมขนดงในตาราง ยกเวนทกาหนดไวเฉพาะ

ในวธนนๆ

ความเขมขน

Sulfuric acid 95.0-98.0% H2SO4

Hydrochloric acid 36.5-38.0% HCl

Nitric acid 69.0-71.0% HNO3

Fuming nitric acid ≥ 90% HNO3

Acetic acid ≥ 99.7% CH3COOH

Hydrobromic acid 47.0-49.0% HBr

Ammonium hydroxide 28-30% NH3

Phosphoric acid ≥ 85% H3PO4

4. การใชสญลกษณ (ตวเลข + ตวเลข) หลงชอของสารเคม เชน HCl (1+2) หมายถง สารผสม

ระหวาง HCl 1 หนวยปรมาตร กบ H2O 2 หนวยปรมาตร

5. คายอทใช และคาเตม แสดงในตาราง

AAS Atomic absorption spectrometer

Ac acetyl, CH3CO-

diam. diameter

FAAS Flame atomic absorption spectrophotometer

g gram

g gravity in centrifuging

GC Gas Chromatograph

GFAAS Graphite furnace atomic absorption spectrophotometer

HPLC High performance liquid chromatograph

hr hour

id inner diameter or dimension

Abbreviation Word/คาเตม

12



kg kilogramL literLC Liquid Chromatographm Meter, milli – as prefixM MolarMe Methyl, CH3-

MeOH Methanol, CH3OHmg milligrammin minuteml millilitermm millimeterMS Mass spectrometerMW molecular weightMΩ megaohmN Normalng nanogram-OAc acetate-OCN cyanateod outer diameter or dimensionppm part per millionrpm round per minuteppb part per billionv/v Volumeper volumew/v Weight per volumew/w Weight per weightwt Weightµg Microgram (10-6 g)µL Microliter (10-6 L)µm Micron, micrometer (10-6 m)/ per% percent> more than< less than≥ equal to and more than≤ equal to and less than

13


Method รหสวธ ชนดอาหาร สารทตองการวด หนา Type

DMSc F 1055 ผลตภณฑปรงรสทไดจากการยอย ปรมาณไนโตรเจน I 15

โปรตนของถวเหลอง และโปรตน (Nitrogen contents

and protein)

DMSc F 1056 เนย ความชน (moisture) I 23

DMSc F 1057 เนย ของแขงไมรวมไขมน I 27

(Non fat solid)

DMSc F 1058 เนย ไขมน (Fat) I 31

DMSc F 1059 ครม ไขมน (Fat) I 33

DMSc F 1060 กะท และผลตภณฑ ไขมน (Fat) I 37

DMSc F 1061 กะท และผลตภณฑ ของแขงทงหมด I 41

(Total solids)

DMSc F 1062 นามนและไขมน นามนแร (Mineral oil) III 45

DMSc F 1063 เกลอบรโภคทเสรมไอโอเดต ไอโอดน (Iodine) II 47

DMSc F 1064 เนอสตว ตบ สารเคมกลมเบตาอะโกนสต III 51

(Beta Agonists - Screening

test by ELISA technique)

DMSc F 1065 เนอสตว ตบ แรคโตพามน (Ractopamine - III 61

Screening test by ELISA

technique)

DMSc F 1066 เนอสตว นม ไข และนาผง คลอแรมเฟนคอล III 67

(Chloramphenicol - Screening

test by ELISA technique)

DMSc F 1067 เนอสตว ตบ บรอมบวเทอรอล III 75

เคลนบวเทอรอล แรคโตพามน

และซาลบวเทอมอล

(Brombuterol, Clenbuterol,

วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย

14


Ractopamine and Salbutamol

- Quantitative analysis

by LC-MS/MS)

DMSc F 1068 เนอสตว นม ไข เนยแขง และนาผง คลอแรมเฟนคอล III 87

(Chloramphenicol -

Quantitative analysis

by LC-MS/MS)

Method รหสวธ ชนดอาหาร สารทตองการวด หนา Type

15


DMSc F 1055: การวเคราะหปรมาณไนโตรเจนและโปรตนในผลตภณฑ

ปรงรสทไดจากการยอยโปรตนของถวเหลอง

โดย Kjeldahl method

Determination of nitrogen contents and protein

in seasoning soy sauce by the Kjeldahl method

1. ขอบขาย (Scope)

ใชวเคราะหปรมาณไนโตรเจนและโปรตนในผลตภณฑปรงรสทไดจากการยอยโปรตนของ

ถวเหลอง เชน ซอสปรงรส ซอว ซอวหวาน

2. เอกสารอางอง (Reference)

2.1 AOAC Official Method 991.20 Nitrogen (Total) in Milk. IDF-ISO-AOAC Method.

2.2 ISO 1871: 2009 (E), Food and Feed Products- General guidelines for the determination

of nitrogen by the Kjeldahl method.

2.3 AOAC Official Method 936.15 Standard Solution of Hydrochloric Acid.

2.4 นภาภรณ ลกษณสมยา และ จนตนา กจเจรญวงศ. การประเมนความถกตองของวธวเคราะห

โปรตนในผลตภณฑปรงรสทไดจากการยอยโปรตนของถวเหลองโดยการเปรยบเทยบผล

ระหวางหองปฏบตการทมความเชยวชาญ. ว กรมวทย พ 2558 ฉบบพเศษ 1: 67-74.

3. หลกการ (Principle)

โปรตนในตวอยางถกยอยใน H2SO4 ใช CuSO4.5H2O เปน catalyst และ K2SO4 ชวยเพมจดเดอด

ของ K2SO4 ไนโตรเจนจะถกเปลยนไปเปนเกลอแอมโมเนยม เตม NaOH มากเกนพอ และ

กลนดวยไอนา NH3 ถกจบไวใน H3BO3 วเคราะหปรมาณไนโตรเจนโดยการไทเทรตดวย

หลกการเดยวกนสามารถดาเนนการได 2 วธ คอ Traditional method และ Block digestion/Steam

distillation method

4. เครองมอและอปกรณ (Apparatus)

Traditional method

4.1 เครองชงละเอยด (analytical balance) ทมความละเอยด 0.0001 g

4.2 Digestion flasks – Kjeldahl flask ขนาด 500 หรอ 800 ml

16


4.3 Distillation flasks – Kjeldahl flask ขนาด 500 หรอ 800 ml ทมจกยาง สามารถตอกบ

trap ทปองกน NaOH ลนระหวางการกลน และตอกบ condenser ใช graduated Erlenmeyer

titration flask ขนาด 500 ml เกบ distillate

4.4 Digestion/distillation system – Traditional apparatus สามารถควบคมอณหภมได

4.5 Titration buret – Class A ขนาด 50 ml หรอ Automatic titrator provided with a pH meter

ทสามารถวดคา pH ในชวง 4-7

Block digestion/Steam distillation method


4.2 Digestion block – Aluminium alloy block หรอเครองมออนทเทยบเทา ทสามารถปรบและ

ควบคมอณหภมได พรอมทงอปกรณวดอณหภม

4.3 Digestion tubes ขนาด 250 ml

4.4 Distillation unit – ใชสาหรบ steam distillation สามารถตอไดกบ digestion tubes

ขนาด 250 ml และ distillation titration flasks ขนาด 500 ml

4.5 Distillation titration flask – graduated Erlenmeyer titration flask ขนาด 500 ml

4.6 Titration buret – Class A ขนาด 50 ml หรอ Automatic titrator provided with a pH meter

ทสามารถวดคา pH ในชวง 4-7

5. สารเคม (Reagent)

สารเคมทกชนดเปนระดบ AR grade หรอเทยบเทา ยกเวนทระบไวเปนอยางอน

5.1 H2SO4 ความเขมขน 95-98% Nitrogen free

5.2 Copper catalyst solution - CuSO4.5H2O Nitrogen free เตรยมเปนสารละลาย 0.05 g/ml H2O

5.3 K2SO4 Nitrogen free (หรอใช Kjeldahl catalyst tablets สาเรจรปแทน catalyst ในขอ 5.2

และ 5.3)

5.4 Sodium hydroxide solution - 50% (w/w) nitrate free NaOH (ความเขมขนและปรมาณ

เปลยนแปลงไดตามคาแนะนาของผผลต)

5.5 Boiling chips – Mesh size 10

5.6 Methyl red/ Bromocresol green indicator solution – ละลาย methyl red 0.2 g ใน 95%

ethanol และปรบปรมาตรดวย 95% ethanol ครบ 100 ml ละลาย bromocresol green 1 g

ใน 95% ethanol และปรบปรมาตรดวย 95% ethanol ครบ 500 ml ผสมสารละลาย

ทงสองชนดเขาดวยกน

17


5.7 Boric acid solution - 4% with indicator ละลาย H3BO3 40 g ดวยนา เจอจางจนครบปรมาตร

1 L เตม indicator (5.6) 3 ml สารละลายนจะมสสมออน (1-4% สาหรบ Block digestion)

5.8 0.1000 M Hydrochloric acid standard solution – เตรยมเอง หรอใชสารละลายทมใบรบรอง

ความเขมขน 0.0995-0.1005 M และใชคา 0.1000 M ในการคานวณ

5.8.1 ปเปต conc. HCl 8.6 ml ใสลงใน volumetric flask ขนาด 1 L ซงมนาอยประมาณ

600 ml ปรบใหครบปรมาตร 1 L ดวย H2O ผสมใหเขากน

5.8.2 standardization 0.1000 M HCl: ชง anh. Na2CO3 (อบท 120°C เปนเวลา 3 hr และ

เกบใน desiccator) ประมาณ 0.25 g ลงใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml ละลาย

ดวย H2O (ใช H2O ทตมใหเดอดเพอไล CO2 และทงใหเยนทอณหภมหอง) ประมาณ

80 ml เตม methyl red indicator ประมาณ 5 หยดจะไดสารละลายสสมออน นาไป

ไทเทรตกบ 0.1000 M HCl ทเตรยมไวจนกระทงสของสารละลายเปลยนจากสของ

reference solution เลกนอย (reference solution: H2O ทปราศจาก CO2 80 ml

เตม methyl red indicator 5 หยด) นาไปตมใหเดอดเบา ๆ บน hot plate นานประมาณ

2 min ทงใหเยนทอณหภมหองแลวนาไปไทเทรตตอกบ 0.1000 M HCl จนกระทง

สของสารละลายเปลยนเปนสสม บนทกปรมาตรรวมของ 0.1000 M HCl ทใช

ไทเทรต คานวณความเขมขนทแนนอนของ 0.1000 M HCl จากสมการ

M = [(W × 1000) / (V × 52.994)]

โดย M = Molarity ของ HCl (mole/L)

W = นาหนกของ anh. Na2CO3 (g)

V = ปรมาตรของสารละลาย 0.1000 M HCl ทใชไทเทรต (ml)

52.994 = นาหนกสมมลของ Na2CO3

5.9 Ammonium sulfate - 99.9% (NH4)2SO4

5.10 Tryptophan หรอ lysine hydrochloride - 99% C11H12 N2O2 หรอ C6H15Cl N2O2

5.11 Sucrose - Nitrogen free

6. การเตรยมตวอยาง (Sample preparation)

สมตวอยางมาประมาณ 2-3 หนวย เทผสมลงในภาชนะสะอาด ใหไดปรมาตรรวมประมาณ

200-300 ml คนหรอกวนหรอเทกลบไปมา ใหตวอยางเปนเนอเดยวกน

18


7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure)

Traditional method

7.1 ชงตวอยางทผานการเตรยมใหเปนเนอเดยวกนแลวใสใน beaker ประมาณ 1-2 g (ปรมาณ

ไนโตรเจน 0.005-0.2 g)

7.2 ถายตวอยางลงใน digestion flask ใช H2O ประมาณ 25 ml rinse ตวอยางทตดอยทคอขวด

ลงไปใน flask เตม K2SO4 15.00 g, CuSO4.5H2O solution 1 ml และ boiling chips 8-10 ชน

ลงใน digestion flask แลวปดจก และวเคราะห blank โดยใช H2O แทนตวอยาง

7.3 Digestion burner setting – ปรบตง heater โดยใช flask ทม H2O ประมาณ 250 ml เตม

boiling chips 3-4 ชน ตงความรอนใหสามารถทาใหนาเดอดไดภายในเวลา 5-6 min

7.4 Digestion – ยอยตวอยาง โดยใชความรอนตาไมใหเกดฟองลนออกจากคอของ Kjeldahl

flask เปนเวลาประมาณ 20 min หรอจนกวามควนขาวเกดขน หลงจากนนเพมความรอน

ประมาณครงหนงของความรอนทไดทดลองไวในขอ 7.3 ประมาณ 15 min แลวเพม

ความรอนเทากบความรอนทไดทดลองไวในขอ 7.3 จนกระทงไดตวอยางมสเขยวอมฟา

จาง ๆ และใส ตมใหเดอดตอไปอก 1-1.5 hr หลงจากนน ทงใหเยนทอณหภมหอง ประมาณ

25 min เตม H2O 300 ml แกวง flask เพอใหสารละลายผสมกน ทงใหเยนทอณหภมหอง

กอนนาไปกลน ขนตอนนสามารถเกบไวไดโดยปดจกใหแนน

7.5 Distillation – เปดนาหลอเยน เตม H3BO3 solution ทม indicator 50 ml ลงใน graduated

Erlenmeyer titration flask ขนาด 500 ml ตอ flask รองรบ distillate โดยใหปลายของ tube

ทตอจากปลายของ condenser จมอยใน H3BO3 solution คอย ๆ เตม 50% NaOH 75 ml

อยางระมดระวงโดยเทลงขาง ๆ flask ชา ๆ หามแกวง ชนของ NaOH จะอยขางใต ประกอบ

flask เขากบ condenser ทนท หลงจากนน เขยาอยางแรงเพอใหสารละลายผสมกน ให

ความรอนจนกระทง NH3 ถกกลนออกมา (≥ 150 ml distillate หรอ ≥ 200 ml total volume)

ระหวางกลนตองเฝาดตลอดเวลา เนองจากอาจเกดการ bump ทจดน เมอการกลนสมบรณ

ยก receiving flask ออก หยดใหความรอน ไทเทรต H3BO3 solution ดวย 0.1000 M HCl

จนกระทงจดยตเปนสชมพ บนทกปรมาตร HCl ทใช

Block digestion/Steam distillation method

7.1 ชงตวอยางประมาณ 0.1-5 g ใสลงใน digestion tube ทม K2SO4 12 g, CuSO4.5H2O solution

1 ml (หรอใช Kjeldahl catalyst tablets) เตม H2SO4 20 ml (หรอตามคาแนะนาของผผลต)

และวเคราะห blank โดยใช H2O แทนตวอยาง

19


7.2 นา digestion tube วางลงใน tube rack วาง heat shields แลวสวม exhaust manifold ลงบน

ปากของ digestion tube ใหปดพอด ยก rack ไปวางบน digestion block 180-230 C เปดระบบ

ดดควน (ในกรณทใชนาเปนตวดดควนใหตอสายจาก exhaust manifold ไปยงกอกนาท

เตรยมไว และเปดนา) ยอยจนกระทงเกดควนสขาว (ประมาณ 30 min) เพมอณหภมของ

digestion block 410-430 C ยอยจนไดตวอยางสเขยวอมฟาจาง ๆ และใส (clear with light

blue-green color) และยอยตวอยางใหเดอดตออกประมาณ 1 hr (เวลาทใชในการยอย

ทงหมดประมาณ 1.75-2.5 hr)

7.3 ยก tube rack ออกจากเครองยอย โดยยงม exhaust manifold สวมอย ตงหลอดยอยใหเยนลง

ถงอณหภมหอง (ประมาณ 25 min) เตม H2O 85 ml แกวงเบา ๆ เพอใหสารในหลอดยอย

ผสมกน ตองทงใหเยนกอนนาไปกลน (blank ใหเตม H2O 100 ml)

ขอควรระวง

หลงจากทงใหเยนแลวของเหลวทไดควรใสไมมตะกอน หรอมตะกอนเพยงเลกนอย

ทกนของหลอดยอย การเกดตะกอนแสดงวาปรมาณ H2SO4 ทเหลออยในหลอดยอยนอย

เกนไป ซงอาจมผลทาใหปรมาณโปรตนทวเคราะหไดนอยกวาความเปนจรง

การเกดตะกอนอาจเปนผลมาจากการใชเวลาในการยอยนานเกนไปหรอการดดของ

exhaust manifold ในสวนของ scrubber unit แรงเกนไป

ถาเกดตะกอนในหลอดยอยใหอนหลอดยอยใน block digestor จนกระทงตะกอนละลาย

ในกรณทมความจาเปนตองตงหลอดยอยทยงไมวเคราะหคางคน ใหเตมนาลงในหลอด

ยอยประมาณ 20 ml เพอปองกนการตกตะกอนของสารในหลอด

7.4 วางหลอดยอยในเครองกลน เตม 50% NaOH 65 ml ทาการกลน เกบ distillate ใน diatillation

titration flask ทม H3BO3 50 ml กลนจนได distillate ประมาณ 150 ml (รวมปรมาตรทงหมด

200 ml)

7.5 ไทเทรต distillate ทไดดวย 0.1000 M HCl ถงจดยตเหนเปนสชมพ บนทกปรมาตรของ HCl

8. การคานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results)

8.1 คานวณปรมาณไนโตรเจนจากสตร

ไนโตรเจน (g/100 g) =

14.007 × M × (VA- VB) × 100

1000 × W

โดย VA = ปรมาตรของ HCl ทใชในการไทเทรตตวอยาง (ml)

VB = ปรมาตรของ HCl ทใชในการไทเทรต blank (ml)

20


M = Molarity ของ HCl solution

W = นาหนกของตวอยาง (g)

8.2 คานวณปรมาณโปรตนจากสตร

โปรตน (g/100 g) = ไนโตรเจน × 6.25

โดย 6.25 คอ factor ในการคานวณปรมาณไนโตรเจนเปนปรมาณโปรตนทงหมดใน

ซอสปรงรส

8.3 ในการวเคราะห 2 ซา (duplicate) ปรมาณโปรตนในตวอยาง 100 g ควรตางกนไมเกนเกณฑ

ดงน

8.3.1 ตวอยางทมโปรตน ตงแต 10 กรมตอ 100 กรม คาตางกนไมเกน 0.5 กรมตอ

100 กรม

8.3.2 ตวอยางทมโปรตน ตงแต 4 กรมตอ 100 กรม แตไมถง 10 กรมตอ 100 กรม

คาตางกนไมเกน 0.2 กรมตอ 100 กรม

8.3.3 ตวอยางทมโปรตนนอยกวา 4 กรมตอ 100 กรม คาตางกนไมเกน 0.1 กรมตอ 100 กรม

8.4 รายงานปรมาณโปรตนในหนวย กรมตอ 100 กรม (g/100 g) ทศนยม 2 ตาแหนง และแสดง

factor ทใชในการเปลยนไนโตรเจนเปนโปรตน

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)

9.1 ทดสอบประสทธภาพการยอย (digestion efficiency)

ชง lysine monohydrochloride 0.1 g (หรอ tryptophan 0.18 g) และ sucrose 0.67g พรอมสาร

ตาง ๆ ทาการยอย กลน และไทเทรต เชนเดยวกบตวอยาง recovery ทไดควรมคาระหวาง

98-101% โดย lysine monohydrochloride มไนโตรเจน = 15.34% และ tryptophan

มไนโตรเจน = 13.72% ถาคา recovery ทไดตากวา 98% ใหทดสอบการสญเสยไนโตรเจน

ในขอ 9.3

9.2 ทดสอบประสทธภาพการกลนและการไทเทรต

ชง ammonium sulfate (อบท 102 C นาน 3 hr เกบใน desiccator) 0.12 g ลงในหลอดยอย

นาไปกลนและไทเทรต recovery ทไดควรมคาอยในชวงระหวาง 99-101% (ammonium

sulfate มไนโตรเจน = 21.2%) ถา % recovery นอยกวา 99% แสดงวามการสญเสยไนโตรเจน

ในขนตอนการกลนหรอความเขมขนของกรดทใชในการคานวณนอยกวาทควรเปน

21


9.3 ทดสอบการสญเสยไนโตรเจน (nitrogen loss)

ชง ammonium sulfate (อบท 102 C นาน 3 hr เกบไวใน desiccator) 0.12 g, sucrose 0.67 g

ใสสารตาง ๆ ทาการยอย กลน และไทเทรต เชนเดยวกบตวอยาง recovery ทไดควรมคา

อยระหวาง 99-101% ถา % recovery ไดตามเกณฑ โดยผลการทดสอบประสทธภาพ

การยอยไมไดตามเกณฑ แสดงวาเวลา และอณหภมทใชในการยอยไมเหมาะสม

การคานวณ

recovery (%) =

ไนโตรเจนทวเคราะหได (%) × 100

ไนโตรเจนของสารมาตรฐานทใช (%) × ความบรสทธของสารมาตรฐาน

10. รายละเอยดอน

10.1 ผล Collaborative study แสดงเปนปรมาณโปรตน (N × 6.25)

Sample Sample Sample Sample Sample 1 2 3 4 5

Laboratories remaining after eliminating outliers 11(0) 10(1) 10(1) 11(0) 10(0)

(outlier)

Mean value, g/100g 10.26 11.76 5.93 8.85 1.82

Repeatability standard deviation, Sr, g/100g 0.16 0.08 0.06 0.05 0.03

Repeatability relative standard deviation, 1.60 0.71 0.94 0.57 1.72

RSDr, %

Repeatability limit, r (=2.8Sr), g/100g 0.46 0.23 0.16 0.14 0.09

Reproducibility standard deviation, SR, g/100g 0.21 0.16 0.09 0.13 0.07

Reproducibility relative standard deviation, 2.06 1.39 1.49 1.44 3.78

RSDR, %

Reproducibility limit, R (=2.8SR), g/100g 0.59 0.46 0.25 0.36 0.19

22


10.2 ถา blank มสชมพกอนการไทเทรต แสดงวาอาจเกดขอผดพลาด เชน titration vessel

ไมสะอาด ใหเปลยน blank ใหม

10.3 สาเหต และการแกไขขอผดพลาดตาง ๆ ทอาจเกดขน

10.3.1 ขนตอนการยอย

สงทเกดขน สาเหต การแกไข

เกดฟองมาก - ตวอยางมนาตาลหรอไขมนสง - เตม antifoam เชน silicone

- ปรมาณของตวอยางมากเกนไป - ลดปรมาณตวอยาง

หลงการยอยมตะกอนดา - เวลา และ/หรออณหภมในการยอย - ปรบอณหภมและเวลา

ไมเหมาะสม ในการยอย

- catalyst ทใชไมเหมาะสม - ใชปรมาณตวอยาง กรด และ

ชนดของ catalyst ใหเหมาะสม

หลงการยอยเกดผลก - มการสญเสยกรด - ลดความแรงของการดดควน

จานวนมาก - ใชปรมาณตวอยาง กรด และ

ชนดของ catalyst ใหเหมาะสม

10.3.2 ระหวางการกลน และการไทเทรต

สงทเกดขน สาเหต การแกไข

% recovery ของการกลน - มการสญเสยแอมโมเนย - ตรวจสอบอปกรณเครองมอ

และการไทเทรตตากวา บรเวณทมการรวได

เกณฑกาหนด - ปรมาณ H3BO3 ไมเพยงพอ - เพมความเขมขนหรอปรมาตร

ของ H3BO3

- การกลนยงไมสมบรณ - เพมเวลาในการกลน

- ความเขมขนของกรดไมถกตอง - ตรวจสอบความถกตองของ

ความเขมขนของกรด

- คาของ blank สงเกนไป - ทา blank ซา

% recovery ของการกลน - ความเขมขนของกรดไมถกตอง - ตรวจสอบความถกตองของ

และการไทเทรตสงเกนไป ความเขมขนของกรด

- เกดการปนเปอนเนองจากไอของ - หลกเลยงการกลนในบรเวณ

แอมโมเนย ทมไอของแอมโมเนย

23


DMSc F 1056: การวเคราะหปรมาณความชนในเนย

Determination of moisture content in butter


ใชวเคราะหปรมาณความชนในเนย


ISO 3727-1/IDF 80-1:2001, 1st edition, 2001-12-15. Part 1: Butter-Determination of moisture

content (Reference method)


ตวอยางถกทาใหแหงทอณหภมและเวลาทกาหนด นาหนกทหายไปคอความชน



4.2 ตอบรอน (drying oven) ซงสามารถปรบตงอณหภมไดท 102 ± 2 C

4.3 อางนารอน (water bath)

4.4 โถดดความชนพรอมสารดดความชน (desiccator with desiccant)

4.5 ถวยอะลมเนยม (flat bottom aluminium dish) od ≥ 5 cm

4.6 quartz sand หรอ acid washed sea sand ขนาด 100 - 315 µm

5. สารเคม

-

6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)

6.1 การสมตวอยาง ตวอยางทมขนาดใหญใหตดแบงเปน 4 สวน เกบสองสวนทอยตรงขามกน

(จนไดตวอยางประมาณ 250 g) ใสในขวดแกวปากกวาง ปดฝาใหสนท หอขวดแกวดวย

24


กระดาษเพอกนแสง ตวอยางทมขนาดเลกใหเกบในภาชนะบรรจเดมประมาณ 50-100 g

หรอใสในขวดปากกวาง เกบรกษาในตเยนทอณหภม 2-8 C

6.2 นาตวอยางทเกบไวออกจากตเยน หลอมเนยโดยแชในอางนารอนทอณหภม ≤ 39 C

(อณหภมเหมาะสมอยทประมาณ 24-30 C) ขณะหลอมใหเขยาขวดบอย ๆ เอาออกจาก

อางนารอน เขยาขวดอยางแรง แลวตงทงไวจนอณหภมลดลงถงอณหภมหอง


7.1 เตรยมถวยอะลมเนยม : เขยนรหสบนถวยอะลมเนยมทมทรายอยประมาณ 10 g พรอมแทง

แกว อบในตอบรอนท 102 ± 2 C เปนเวลา 2 hr เอาออกจากตอบรอน เกบในโถดดความชน

ทนท ทงไวใหเยน (ประมาณ 30 min) ชงนาหนก (W1)

7.2 ชงตวอยางประมาณ 5 g ใสในถวยอะลมเนยมทเตรยมไว (7.1) บนทกนาหนก (W2) คลก

ตวอยางกบทรายใหเขากน และเกลยใหทวถวยอะลมเนยม นาไปอบในตอบรอนท 102 ± 2 C

เปนเวลา 2 hr เอาออกจากตอบรอน เกบในโถดดความชนทนท ทงไวใหเยน (ประมาณ

30 min) ชงนาหนก และ อบอกครงละ 30 min จนไดนาหนกคงท (W3)

7.3 วเคราะห blank โดยปฏบตตามขอ 7.1 และ 7.2 แตไมตองใสตวอยาง


8.1 การคานวณ

ปรมาณความชน (รอยละของนาหนก) = (W2- W3 - WB) × 100/W

เมอ W1 = นาหนกของถวยอะลมเนยม แทงแกวและทราย หลงอบ (g)

W2 = นาหนกของถวยอะลมเนยม แทงแกว ทรายหลงอบและตวอยางกอนอบ (g)

W3 = นาหนกของถวยอะลมเนยม แทงแกว ทราย และตวอยางหลงอบ (g)

WB = นาหนกของสารทเหลออยจากการวเคราะห blank เทากบ WB2 - WB1 (g)

W = นาหนกของตวอยาง (g) = W2 - W1

8.2 รายงานปรมาณความชนในหนวย รอยละของนาหนก หรอกรมตอ 100 กรม (g/100g)

ทศนยม 2 ตาแหนง

25



วเคราะห 2 ซา (duplicate) ทกตวอยาง ปรมาณความชนในตวอยาง 100 g ตางกนไมเกน 0.1g


10.1 นาหนกคงท หมายถงนาหนกทไดจากการอบ 2 ครง ตดตอกนตางกนไมเกน 0.001 g หรอ

เมอนาหนกทชงไดเพมขน และใหใชนาหนกของคาทนอยกวาในการคานวณ

10.2 ใหใช tong หรอสวมถงมอทสะอาดจบถวยอะลมเนยม

10.3 ในการวเคราะหนใช quartz sand หรอ acid washed sea sand ขนาด 100-315 µm

แทนการใช Pumice stone, granular, with diameter between 0.8 mm and 8 mm

27


DMSc F 1057: การวเคราะหปรมาณของแขงไมรวมไขมนในเนย

Determination of non-fat solids content in butter


ใชวเคราะหปรมาณของแขงไมรวมไขมนในเนย


ISO 3727-2/IDF 80-2: 2001, 1st edition, 2001-12-15. Part 2: Butter-Determination of non-fat

solids content (Reference method)


สกดไขมนออกจากตวอยางทไดระเหยนาออกแลว สวนทเหลออยคอของแขงไมรวมไขมน

ในกรณ เนย (butter) หรอเนยจด (unsalted butter) ของแขงไมรวมไขมน คอธาตนานมไมรวมไขมน






4.5 ถวยอะลมเนยม (flat bottom aluminium dish) od ≥ 5 cm

4.6 filter crucible ทาจาก sintered glass (fritted glass crucible, gooch) pore diameters 16 to 40 µm

(No.3) with suction flask



5.1 Petroleum ether (boiling range 30-60 C)

5.2 10% NH4OH

5.3 conc. H2SO4

28


5.4 cleaning solution: ละลาย Sodium dichromate (Na2Cr2O7) 92 g หรอ Potassium

dichromate (K2Cr2O7) ใน H2O 458 ml คอย ๆ เตม H2SO4 800 ml คนดวยแทงแกว

(ควรเตรยมในตดดควนเพราะอาจมไอรอนเกดขน)


6.1 การสมตวอยาง ตวอยางทมขนาดใหญใหตดแบงเปน 4 สวน เกบสองสวนทอยตรงขามกน

(จนไดตวอยางประมาณ 250 g) ใสในขวดแกวปากกวาง ปดฝาใหสนท หอขวดแกวดวยกระดาษ

เพอกนแสง ตวอยางทมขนาดเลกใหเกบในภาชนะบรรจเดมประมาณ 50-100 g หรอ

ใสในขวดปากกวาง เกบรกษาในตเยนทอณหภม 2-8 C

6.2 นาตวอยางทเกบไวออกจากตเยน หลอมเนยโดยแชในอางนารอนทอณหภม ≤ 39 C (อณหภม

เหมาะสมอยทประมาณ 24-30 C) ขณะหลอมใหเขยาขวดบอยๆ เอาออกจากอางนารอน

เขยาขวดอยางแรง แลวตงทงไวจนอณหภมลดลงถงอณหภมหอง


7.1 การเตรยมถวยกระเบอง แทงแกว และ fritted glass crucible อบถวยกระเบอง แทงแกว และ

fritted glass crucible ในตอบรอนทอณหภม 102 ± 2 C เปนเวลา 1 hr เอาออกจาก

ตอบทงใหเยนลงจนถงอณหภมหองใน desiccator (ประมาณ 30-45 min) ชงนาหนกถวย

กระเบองพรอมแทงแกว และ fritted glass crucible (W0)

7.2 ชงนาหนกถวยกระเบองและแทงแกวในขอ 7.1 (W1)

7.3 ชงตวอยางประมาณ 5 g ลงในถวยกระเบองทเตรยมไวในขอ 7.2 บนทกนาหนก (W2)

ตงบนอางนารอนโดยคนตวอยางเสมอๆ เปนเวลา 30 min อบตวอยางในตอบรอนทอณหภม

102 ± 2 C เปนเวลา 30 min ทงใหเยนลงจนถงอณหภมหอง

7.4 เตม petroleum ether ทอน (ประมาณ 25 C) 15 ml ลงในตวอยางในขอ 7.3 เพอละลาย

ไขมนแลวใชแทงแกวคนให petroleum ether สมผสกบสารในถวย (ดวา petroleum ether

ละลายไขมนจนหมด) เท petroleum ether ทละลายไขมนลงใน fritted glass crucible

(ใช suction ชวยในการกรอง)

7.5 ทาซาในขอ 7.4 อก 4 ครง หรอมากกวา จนสงเกตวาไมมไขมนตดอยทถวยกระเบอง

เทสารในถวยกระเบองลงใน fritted glass crucible จนหมด

7.6 ลางสงทตดอยใน fritted glass crucible ดวย petroleum ether ทอนประมาณ 25 ml

(ไมใช suction)

7.7 อบถวยกระเบองพรอมแทงแกว และ fritted glass crucible ในตอบท 102 ± 2 C เปนเวลา

30 min ทงใหเยนใน desiccator ชงนาหนก

29


7.8 ทาซาในขอ 7.7 จนไดนาหนกคงท (W3)

7.9 ทา blank โดยทาเชนเดยวกบตวอยางแตไมตองใชตวอยาง คาทไดจะตองนอยกวา 0.0004 g

หมายเหต : อบจนไดนาหนกคงท หมายถง เมอนาไปอบซาทสภาวะเดมนาน 30 min นาหนกท

ไดจากการอบ 2 ครงตดตอกน ตองตางกนไมเกน 0.001 g หรอไดนาหนกเพมขน และใหใชนาหนก

ของคาทนอยในการคานวณ



ปรมาณของแขงไมรวมไขมน =

(W3 – W0) × 100

(W2 – W

1)

เมอ W0 = นาหนกถวยกระเบองพรอมแทงแกวและ fritted glass crucible

W1 = นาหนกถวยกระเบองพรอมแทงแกว

W2 = นาหนกถวยกระเบองพรอมแทงแกว และตวอยาง

W3 = นาหนกถวยกระเบองพรอมแทงแกวและ fritted glass crucible ทมสาร

ทเหลออย

8.2 รายงานปรมาณ ของแขงไมรวมไขมน และธาตนานมไมรวมไขมน ในหนวยรอยละโดย

นาหนก และรายงานทศนยม 2 ตาแหนง


วเคราะห 2 ซา (duplicate) ทกตวอยาง ปรมาณของแขงไมรวมไขมนในตวอยาง 100 g ตางกน

ไมเกน 0.15 g


10.1 การลาง fritted glass crucible

fritted glass crucible ใหมทยงไมเคยใชงาน : ลางโดยการ suction ดวย HCl ทรอน และลางดวย

H2O ใหสะอาด อาจจะลางโดยกลบดานของ crucible ดวย

10.2 กอนทาการวเคราะห แชใน cleaning solution ประมาณ 1 hr แลวลางใหสะอาดดวย H2O

(โดยแชใน H2O และลาง 2-3 ครง อาจจะลางโดยใช suction ชวย และลางโดยกลบดาน

fritted crucible) เผา fritted glass crucible ในเตาเผาทอณหภมประมาณ 500 C หลงจาก

ทงใหเยน แลวลางใน H2O อก 2-3 ครง ทงใหแหง

30


10.3 หลงการวเคราะห ลาง fritted glass crucible ทนท โดยมขนตอนดงน

10.3.1 เอาสารตกคาง (ตะกอนตาง ๆ ) ทอยใน fritted glass crucible ออกใหหมด (อาจใช

แปรงถเพยงเบา ๆ มฉะนน fritted อาจเสยหายได และลางดวยนาประปา)

10.3.2 แช fritted glass crucible ใน conc H2SO4 โดยแชไวคางคน

10.3.3 ลาง fritted glass crucible โดยแชใน H2O, dil NH4OH (ประมาณ 10%) และ

ใน H2O ตามลาดบ

10.3.4 ลางดวย H2O โดยใช suction 3 ครง

10.3.5 เผาในเตาเผาท 500 C เปนเวลา 5 hr ทงใหเยนและนามาลางดวย H2O อก 3 ครง

โดยการ suction

10.3.6 ทงไวใหแหง เกบไวในทปลอดจากฝนและแมลง เพอปองกนการปนเปอน

31


DMSc F 1058: การตรวจวเคราะหไขมนในเนยโดยการคานวณ

Determination of fat in butter


เพออธบายวธการคานวณปรมาณไขมนในเนย โดยคานวณจากปรมาณความชน และปรมาณ

ของแขงไมรวมไขมน


ISO 3727-3. IDF 80-3, 1st edition, 2003-02-01. Part 3: Butter-Calculation of fat content


สกดไขมนออกจากตวอยางทไดระเหยนาออกแลว สวนทเหลออยคอของแขงไมรวมไขมน

คานวณปรมาณไขมนในตวอยาง โดยการนาปรมาณนา และของแขงไมรวมไขมนลบ

ออกจาก 100


-


-


-


วเคราะหปรมาณความชนตามวธของ ISO 3727-1. IDF 80-1 และวเคราะหปรมาณของแขงไมรวม

ไขมนตามวธของ ISO 3727-2. IDF 80-2 ในตวอยาง นามาคานวณปรมาณไขมน

32




ไขมน (รอยละโดยนาหนก) = 100 – M – SNF

เมอ M = ปรมาณความชน (รอยละโดยนาหนก)

SNF = ของแขงไมรวมไขมน (รอยละโดยนาหนก)

8.2 รายงานผลปรมาณไขมน หนวยเปนรอยละโดยนาหนก ทศนยม 2 ตาแหนง

33


DMSc F 1059: การวเคราะหปรมาณไขมนในครม

Determination of fat content in milk


ใชวเคราะหปรมาณไขมนในครม โดยใชหลกการ Roese-Gottlieb


ISO 2450: 2008(E)/IDF16: 2008(E). Cream - Determination of fat content - Gravimetric

method (Reference method)


หลงจากทากรดในนมใหเปนกลาง (neutralization) และละลายโปรตนในนม (casein) ดวย

ammonia solution เตม alcohol เพอปองกนการเกด emulsion ระหวางการสกด ไขมนจะถกสกด

ออกจากตวอยางโดย diethyl ether และ petroleum ether หลงจากระเหย ether ออกแลวอบไขมน

ใหแหง คานวณปรมาณไขมนในหนวยรอยละโดยนาหนก หลกการนเรยกวา Roese-Gottlieb principle


4.1 เครองชง (analytical balance) ทมความละเอยด 0.0001 g

4.2 ตอบรอน (hot air oven) ซงสามารถปรบตงอณหภมไดท 102 ± 2 C


4.4 Mojonnier type fat-extraction flasks ชนดมจกปดททาดวยวสดทไมมผลตอ solvent

ทใชในการวเคราะห เชน PTFE

4.5 ถวยระเหย (evaporating dish) ขนาดความจประมาณ 125 ml



5.1 Ammonia solution ความเขมขนประมาณ 25% [p20 (NH3) = 910 g/l]

5.2 Petroleum ether, boiling range 30-60 C

34


5.3 Diethyl ether ชนดไมมสาร peroxide

5.4 Ethanol ความบรสทธไมนอยกวา 94% โดยปรมาตร

5.5 Potassium iodide (KI) 10%


6.1 การสมตวอยาง ใหสมตวอยางมาประมาณ 2-3 หนวย เทผสมลงในภาชนะทสะอาด (ใหได

ตวอยาง ประมาณ 200-300 ml) คนใหเขากน ปดปากขวดใหสนท เกบในตเยนทอณหภม

2-8 ºC

6.2 การเตรยมตวอยาง นาตวอยางทสมไวออกจากตเยน อนตวอยางในอางนารอนทอณหภม

35-40 ºC (ยกเวนตวอยางครมเปรยว) ทงใหเยนลงทอณหภมหอง แลวจงพลกขวดกลบ

ไปมา หรอคน หรอกวนตวอยางดวยวสดทสะอาด เพอใหตวอยางเปนเนอเดยวกน


7.1 การเตรยมถวยระเหย อบถวยระเหยในตอบรอนทอณหภม 102 ± 2 C เปนเวลา 1 hr

เอาออกจากตอบ ทงใหเยนลงจนถงอณหภมหอง ชงในโถดดความชน (ประมาณ 1 hr)

ชงนาหนก (W1)

7.2 ชงตวอยางประมาณ 1-5 g (ใหมไขมนระหวาง 0.3-0.6 g) ลงใน beaker บนทกนาหนก

ทแนนอน (W) ถายตวอยางลงใน extracting flask โดยใชนารอนประมาณ 5-10 ml เตม

ammonia solution 2 ml ผสมใหเขากน เตม ethanol 10 ml ผสมใหเขากน

7.3 สกดไขมนออกจากตวอยางครงท 1 โดยการเตม diethyl ether 25 ml ปดจก เขยาอยางแรง

ประมาณ 1 min เตม petroleum ether 25 ml ปดจก เขยาอยางแรงประมาณ 1 min ตงทงให

แยกชน เทชน organic solvent ลงในถวยระเหย ระเหย solvent ออกจากไขมนโดยตงถวย

ระเหยบนอางนารอนทอณหภมประมาณ 40-60 C

7.4 เตม ethanol 5 ml ลงใน extracting flask สกดไขมนออกจากตวอยางครงท 2 โดยการเตม

diethyl ether 15 ml ปดจก เขยาอยางแรงประมาณ 1 min เตม petroleum ether 15 ml ปดจก

เขยาอยางแรงประมาณ 1 min ตงทงใหแยกชน เทชน organic solvent ลงในถวยระเหย

ใบเดม ระเหย solvent ออกจากไขมนโดยตงถวยระเหยบนอางนารอนทอณหภมประมาณ

40-60 C



35




7.6 อบถวยระเหยทมไขมนในตอบทอณหภม 102 ± 2 C จนไดนาหนกคงท (ประมาณ 1 hr)

ตงทงใหเยนจนถงอณหภมหองชงในโถดดความชน (ประมาณ 1 hr) ชงนาหนก (W2)

7.7 วเคราะห blank โดยใช H2O 10 ml แทนตวอยาง นาหนกของสารทเหลออยในถวยระเหย

(WB) ควรนอยกวา 0.001 g


8.1 คานวณปรมาณไขมนจากสตร

ปรมาณไขมน (รอยละโดยนาหนก) = (W2- W1-WB) × 100/W

เมอ W1 = นาหนกของถวยระเหย (g)

W2 = นาหนกของถวยระเหยทมไขมนอย (g)

WB = นาหนกสารทเหลออย ทไดจากการวเคราะห blank = WB2-WB1 (g)


8.2 รายงานปรมาณไขมนในหนวย กรมตอ 100 กรม (g/100 g) หรอรอยละของนาหนก ทศนยม

2 ตาแหนง


วเคราะห 2 ซา (duplicate) ในทกตวอยาง


10.1 ในการวเคราะห 2 ซา (duplicate) ปรมาณไขมนในตวอยาง 100 g ควรตางกนไมเกนเกณฑ

ดงน

10.1.1 ตวอยางทมไขมน ไมเกน 20 g/100 g คาตางกนไมเกน 0.1 g/100 g

10.1.2 ตวอยางทมไขมน มากกวา 20 g/100 g คาตางกนไมเกน 0.4 g/100 g

10.2 ทดสอบ peroxide ใน diethyl ether โดยการปเปต diethyl ether 10 ml ลงใน cylinder ชนด

ทมจกปดซงผานการ rinse ดวย diethyl ether เตมสารละลาย 10% KI 1 ml เขยา และตงทงไว

ประมาณ 1 min จะตองไมเกดสเหลองในชนของ diethyl ether ทดสอบเมอเปดใชงาน

ครงแรก ทดสอบครงตอไปสปดาหละ 1 ครง

36


10.3 อบถวยระเหยจนไดนาหนกคงทหมายถง เมอนาถวยระเหยไปอบซาทสภาวะเดมนาน

30 min นาหนกทไดจากการอบ 2 ครงตดตอกน ตางกนไมเกน 0.001 g และใหใชนาหนก

ของคาทนอยกวาในการคานวณ

10.4 ether เปนสารทระเหยงาย และมอนตรายตอผวเคราะห จงควรทาการวเคราะหในตดดควน

และเนองจากสารทงสองตดไฟงาย จงควรทาในทไมมเปลวไฟอยใกล

10.5 ไขมนทสกดไดจะตองใส ไมมสงอนเจอปน

37


DMSc F 1060: การวเคราะหปรมาณไขมนในกะทและผลตภณฑ

Determination of fat content in coconut milk and products


ใชวเคราะหปรมาณไขมนในกะทและผลตภณฑ ตามมาตรฐานโคเดกซ (CODEX STAN

240-2003: Codex standard for aqueous coconut products - coconut milk and coconut cream)

ไดแก กะทชนดเจอจาง (light coconut milk) กะท (coconut milk) ครมกะท (coconut cream)

และกะทผง (coconut powder) โดยใชหลกการ Roese-Gottlieb

2. เอกสารอางอง (Reference).

2.1 ISO 1211: 2010 (E)/IDF1: 2010 (E). Milk - Determination of fat content - Gravimetric

method (Reference method)

2.2 Lakshanasomya N, Danudol A, Ningnoi T. Method performance study for total solids

and total fat in coconut milk and products. Journal of Food Composition and Analysis 2012;

24: 650-655.


หลงจากทาตวอยางใหเปนกลาง (neutralization) และละลายโปรตนในนม (casein) ดวย ammonia

solution เตม alcohol เพอปองกนการเกด emulsion ระหวางการสกด ไขมนจะถกสกดออกจาก

ตวอยางโดย diethyl ether และ petroleum ether หลงจากระเหย ether ออกแลวอบไขมนใหแหง

คานวณปรมาณไขมนในหนวยรอยละโดยนาหนก หลกการนเรยกวา Roese-Gottlieb principle



4.2 ตอบรอน (hot air oven) ซงสามารถปรบตงอณหภมไดท 102 ± 2 C


4.4 Fat-extraction flasks ชนดมจกปดททาดวยวสดทไมมผลตอ solvent ทใชในการวเคราะห

เชน PTFE

4.5 ถวยระเหย (evaporating dish) ขนาดความจประมาณ 125 ml

38




5.1 Ammonia solution ความเขมขนประมาณ 25% [p20 (NH3) = 910 g/l]

5.2 Petroleum ether, boiling range 30-60 C

5.3 Diethyl ether ชนดไมมสาร peroxide

5.4 Ethanol ความบรสทธไมนอยกวา 94% โดยปรมาตร

5.5 Potassium iodide (KI) 10%


6.1 กะทผงใหสมตวอยางจากสวนตางๆ ของภาชนะบรรจใหไดประมาณ 250 g เกบในขวดแกว

ปากกวาง ปดฝาขวดใหแนน กวน คน ผสมจนเปนเนอเดยวกน

6.2 กะทชนดเหลวใหสมตวอยางมาประมาณ 2-3 หนวย เทผสมลงในภาชนะทสะอาด (ใหได

ตวอยาง ประมาณ 200-300 ml) คนใหเขากน นาไปตรวจวเคราะหทนท


7.1 การเตรยมถวยระเหย อบถวยระเหยในตอบรอนทอณหภม 102 ± 2 C เปนเวลา 1 hr เอาออก

จากตอบ ทงใหเยนลงจนถงอณหภมหองชงในโถดดความชน (ประมาณ 1 hr) ชงนาหนก (W1)

7.2 ชงตวอยาง กะทชนดเจอจาง 6 g หรอกะท 3 g หรอครมกะท 2 g หรอกะทผง 1 g (ใหม

ไขมนระหวาง 0.3-0.6 g) ลงใน beaker บนทกนาหนกทแนนอน (W) ถายตวอยางลงใน

extracting flask โดยใชนารอนประมาณ 4-9 ml (ใหไดปรมาตรรวม 10 ml) เตม ammonia

solution 2 ml ผสมใหเขากน เตม ethanol 10 ml ผสมใหเขากน





7.4 เตม ethanol 5 ml ลงใน extracting flask สกดไขมนออกจากตวอยางครงท 2 โดยการเตม

diethyl ether 15 ml ปดจก เขยาอยางแรงประมาณ 1 min เตม petroleum ether 15 ml ปดจก

เขยาอยางแรงประมาณ 1 min ตงทงใหแยกชน เทชน organic solvent ลงในถวยระเหย

ใบเดม ระเหย solvent ออกจากไขมนโดยตงถวยระเหยบนอางนารอนทอณหภมประมาณ

40-60 C

39






7.6 อบถวยระเหยทมไขมนในตอบทอณหภม 102 ± 2 C จนไดนาหนกคงท (ประมาณ 1 hr)

ตงทงใหเยนจนถงอณหภมหองชงในโถดดความชน (ประมาณ 1 hr) ชงนาหนก (W2)

7.7 วเคราะห blank โดยใช H2O 10 ml แทนตวอยาง นาหนกของสารทเหลออยในถวยระเหย

(WB) ควรนอยกวา 0.001 g


8.1 คานวณปรมาณไขมนจากสตร

ปรมาณไขมน (รอยละโดยนาหนก) = (W2- W1-WB) × 100/W

เมอ W1 = นาหนกของถวยระเหย (g)

W2 = นาหนกของถวยระเหยทมไขมนอย (g)

WB = นาหนกสารทเหลออย ทไดจากการวเคราะห blank = WB2-WB1 (g)


8.2 รายงานปรมาณไขมนในหนวย กรมตอ 100 กรม (g/100 g) หรอ รอยละของนาหนก ทศนยม





10.1 ในการวเคราะห 2 ซา (duplicate) ปรมาณไขมนในตวอยาง 100 g ควรตางกนไมเกน 0.5 g

(นากะทชนดเจอจาง), 1.0 g (นากะท) 1.0 g (ครมกะท) และ 0.5 g (กะทผง)

10.2 ทดสอบ peroxide ใน diethyl ether โดยการปเปต diethyl ether 10 ml ลงในกระบอกตวง

ชนดทมจกปดซงผานการ rinse ดวย diethyl ether เตมสารละลาย 10% KI 1 ml เขยา

กระบอกตวง และตงทงไว 1 min จะตองไมเกดสเหลองในชนของ diethyl ether ทดสอบ

เมอเปดใชงานครงแรก ทดสอบครงตอไปสปดาหละ 1 ครง

40


10.3 อบถวยระเหยจนไดนาหนกคงทหมายถง เมอนาถวยระเหยไปอบซาทสภาวะเดมนาน

30 min นาหนกทไดจากการอบ 2 ครงตดตอกน ตางกนไมเกน 0.001 g และใหใชนาหนก

ของคาทนอยกวาในการคานวณ

10.4 ether เปนสารทระเหยงาย และมอนตรายตอผวเคราะห จงควรทาการวเคราะหในตดดควน

และเนองจากสารทงสองตดไฟงาย จงควรทาในทไมมเปลวไฟอยใกล

10.5 ไขมนทสกดไดจะตองใส ไมมสงอนเจอปน

10.6 ผล collaborative study

Light Coconut Coconut milk coconut milk Coconut milk cream powder

Test material

Laboratories remaining after 15 13 16 16 13 - 13 14eliminating outliers

Mean value, % 5.88 8.28 16.85 21.83 23.02 - 42.90 42.44

Repeatability standard 0.03 0.16 0.76 0.23 0.28 - 0.11 0.17deviation, Sr, %

Repeatability relative standard 0.59 1.88 4.49 1.04 1.22 - 0.26 0.41 deviation, RSDr, %

Repeatability limit, r (=2.8Sr),% 0.10 0.44 2.12 0.63 0.79 - 0.31 0.49

Reproducibility standard 0.16 0.15 0.89 0.74 0.46 - 0.34 0.40deviation, SR, %

Reproducibility relative standard 2.70 1.77 5.30 3.40 2.02 - 0.80 0.94deviation, RSDR, %

Reproducibility limit, 0.44 0.41 2.50 2.08 1.30 - 0.97 1.11R (=2.8SR), %

41


DMSc F 1061: การวเคราะหของแขงทงหมดในกะทและผลตภณฑ

Determination of total solids content in coconut milk

and products


ใชวเคราะหปรมาณของแขงทงหมดในกะทและผลตภณฑ ตามมาตรฐานโคเดกซ (CODEX STAN

240-2003: Codex standard for aqueous coconut products - coconut milk and coconut cream)

ไดแก นากะทชนดเจอจาง (light coconut milk) นากะท (coconut milk) ครมกะท (coconut cream)

และกะทผง (coconut powder)


2.1 ISO 6731: 2010(E)/IDF 21: 2010(E); Milk, cream and evaporated milk - Determination

of total solids content (Reference method)

2.2 Lakshanasomya N, Danudol A, Ningnoi T. Method performance study for total solids

and total fat in coconut milk and products. Journal of Food Composition and Analysis

2012; 24: 650-655.


ระเหยนาออกจากตวอยางดวยอางนารอน และทาตวอยางใหแหงในตอบรอนทอณหภม 102 ± 2 C

สารทเหลออยคอของแขงทงหมด

4. เครองมอ (Apparatus)





4.5 ถวยอะลมเนยมชนดมฝาปด (flat bottom aluminum dish) ขนาดเสนผานศนยกลาง ≥ 5 cm

42



-


6.1 กะทผงใหสมตวอยางจากสวนตางๆ ของภาชนะบรรจ ใหไดประมาณ 250 g เกบในขวดแกว

ปากกวาง ปดฝาขวดใหแนน กวน คน ผสมจนเปนเนอเดยวกน

6.2 กะทชนดเหลวใหสมตวอยางมาประมาณ 2-3 หนวย เทผสมลงในภาชนะทสะอาด (ใหได

ตวอยาง ประมาณ 200-300 ml) คนใหเขากน นาไปตรวจวเคราะหทนท


7.1 เตรยมถวยอะลมเนยม : เขยนรหสบนถวยอะลมเนยมทแหงและสะอาด นาไปอบพรอมฝา

โดยเปดฝาขณะอบ ในตอบรอนท 102 ± 2 C เปนเวลา 1.5 hr ปดฝาถวยอะลมเนยมและ

เอาออกจากตอบรอน เกบในโถดดความชนทนท ทงไวใหเยนจนถงอณหภมหองชง

(ประมาณ 30 min) ชงนาหนก (W1)

7.2 ชงตวอยางนากะทชนดเจอจาง 5 g หรอนากะท 3 g หรอครมกะท 2 g หรอกะทผง 1 g

ใสในถวยอะลมเนยมทเตรยมไว บนทกนาหนกทแนนอน (W) แลวนาไประเหยใหแหง

บนอางนารอน (ยกเวนตวอยางกะทผงไมตองนาไประเหย) อบถวยอะลมเนยมพรอมตวอยาง

โดยเปดฝาขณะอบในตอบรอนทอณหภม 102 ± 2 C เปนเวลา 2 hr ปดฝาถวยอบ เอาออก

จากตอบรอนเกบในโถดดความชนทนท ทงไวใหเยน (ประมาณ 30 min) ชงนาหนก

อบซาอกครงละ 30 min จนไดนาหนกคงท (W2)



ปรมาณของแขงทงหมด (รอยละของนาหนก) = (W2- W1) × 100 / W

เมอ W1 = นาหนกของถวยอะลมเนยมหลงอบ (g)

W2 = นาหนกของถวยอะลมเนยมและตวอยางหลงอบ (g)


8.2 รายงานปรมาณของแขงทงหมดในหนวยรอยละของนาหนก ดวยทศนยม 2 ตาแหนง

43





10.1 นาหนกคงท หมายถง นาหนกทไดจากการอบ 2 ครงตดตอกน ตางกนไมเกน 0.001 g

และใหใชนาหนกของคาทนอยกวาในการคานวณ

10.2 หามจบถวยอะลมเนยมทอบแลวดวยมอเปลา ใหใช tong หรอสวมถงมอทสะอาด

10.3 ในการวเคราะห 2 ซา (duplicate) ปรมาณของแขงทงหมดในตวอยาง 100 g ตางกนไมเกน

0.1 g (นากะทชนดเจอจาง), 0.5 g (นากะท) 1.0 g (ครมกะท) และ 0.3 g (กะทผง)

10.4 ผล collaborative study

Light Coconut Coconut milk coconut milk Coconut milk cream powder

Test material

Laboratories remaining after 16 16 14 17 15 - 17 17eliminating outliers

Mean value, % 8.84 10.57 20.90 27.01 28.93 - 98.82 99.25

Repeatability standard 0.02 0.03 0.12 0.49 0.21 - 0.04 0.10deviation, Sr, %

Repeatability relative standard 0.21 0.30 0.60 1.83 0.74 - 0.04 0.10deviation, RSDr, %

Repeatability limit, r (=2.8Sr), % 0.05 0.09 0.35 1.38 0.6 - 0.12 0.28

Reproducibility standard 0.04 0.11 0.22 0.60 0.33 - 0.21 0.31deviation, SR, %

Reproducibility relative standard 0.50 1.05 1.06 2.24 1.12 - 0.21 0.32deviation, RSDR, %

Reproducibility limit, 0.12 0.31 0.62 1.69 0.91 - 0.59 0.88R (=2.8SR), %

45


DMSc F 1062: การทดสอบนามนแรในนามนและไขมน

Qualitative Test of Mineral Oil in Oils and Fats


ใชในการทดสอบการปนเปอนของนามนแรในนามนและไขมน ทมนามนแรปนเปอนมากกวา

รอยละ 0.5


AOAC Official Method 945.102 Oil (Mineral) in Fats A. Qualitative test


นามนและไขมนเมอถกทาปฏกรยา saponification จะละลายไดดในนาเปนสารละลายใส หาก

มการปนเปอนของนามนแรในนามนและไขมน สารละลายทไดจะไมใส


4.1 เครองชงทมความละเอยด 0.01 g หรอ 0.001 g

4.2 เตาไฟฟา (hot plate)

4.3 beaker ขนาด 25 และ 250 ml

4.4 condenser

4.5 cylinder ขนาด 25 ml

4.6 Erlenmeyer flask with glass stoppered ขนาด 125 ml

4.7 micropipette ขนาด 100 – 1,000 µl พรอม tip



5.1 KOH solution (3+2): ผสม KOH 3 g และ H2O 2 ml ละลายเปนเนอเดยวกน

5.2 Ethanol (absolute)

46



6.1 ตวอยางทเปนนามน (oils) ใหควาภาชนะบรรจกลบไปกลบมาประมาณ 10 ครง

6.2 ตวอยางทเปนไขมน (fats) ใหสมตวอยางลงใน beaker ประมาณ 100 g นาไปอนใหหลอม

เปนเนอเดยวกนแลวนาไปทดสอบในขณะทยงหลอม


7.1 ปเปตตวอยาง 1 ml ลงใน Erlenmeyer flask with glass stoppered ขนาด 125 ml

7.2 เตม KOH solution 1 ml และ ethanol (absolute) 25 ml แกวงเบาๆ ใหเขากน นาไปตอ

เขากบ condenser ทไมไดตอกบสายนาหลอเยน วางบนเตาไฟฟาใหความรอนจนสารละลาย

เรมเดอด จบเวลาของการ reflux ประมาณ 5 นาท โดยแกวง flask เปนระยะ ๆ เพอใหเกด

ปฏกรยาอยางสมบรณ

7.3 ถอด flask ออก เตมนาลงไป 25 ml แกวงผสมใหเปนเนอเดยวกน จากนนสงเกตความใส

ของสารละลาย


รายงาน พบ หรอไมพบ


9.1 ทา blank ตามวธทดสอบโดยไมมตวอยาง หากสารละลายไมใสใหทบทวนวธการทดสอบ

และสารเคมทใช

9.2 จดหาตวอยางทงทพบและไมพบการปนเปอนของนามนแรเพอทาเปน QC sample สาหรบ

การตรวจสอบวธทดสอบ

47


DMSc F 1063: การวเคราะหปรมาณไอโอดนในเกลอบรโภคทเสรมไอโอเดต

โดยวธไตเตรชน

Determination of Iodine in Iodated Salt by Titration


ใชเปนวธตรวจวเคราะหปรมาณไอโอดนในเกลอบรโภคทเสรมไอโอเดต


Assessment of iodine deficiency disorders and monitoring their elimination: a guide for

programme managers. 3rd ed. Geneva: World Healh Organization; 2007. Annex 1 Titration

method for determining salt iodate and salt iodine content.


ไอโอเดตในเกลอบรโภคทเสรมไอโอดนดวย potassium iodate (KIO3) จะถกรดวซดวยไอโอไดด

เกดเปนไอโอดนอสระในสภาวะทเปนกรด ซงสามารถวเคราะหปรมาณไอโอดนอสระได

โดยการไทเทรตดวยสารละลายมาตรฐาน 0.005 M ของ sodium thiosulfate (Na2S2O3)โดยม

นาแปง เปน indicator ดงสมการ

IO3- + 5 I- + 6 H+ 3 I2 + 3 H2O

2 Na2S2O3 + I2 2 NaI + Na2S4O6



4.2 นาฬกาจบเวลา

4.3 เตาไฟฟา (hot plate)

4.4 อปกรณ

4.4.1 beaker ขนาด 50 ml และขนาดอนทจาเปน

4.4.2 buret ขนาด 10, 25 และ 50 ml

4.4.3 cylinder ขนาด 50 และ 100 ml

48


4.4.4 Erlenmyer flask ขนาด 125 ml

4.4.5 glass bead

4.4.6 Iodine flask ชนดใส ไมมส ขนาด 250 ml

4.4.7 pipette ขนาด 1, 2, 5 และ 25 ml

4.4.8 volumetric flask ขนาด 100, 500 ml และ 1 L


สารเคมทกชนดเปน AR grade หรอเทยบเทา

5.1 hydrochloric acid, HCl (37%)

5.2 starch, soluble

5.3 sulfuric acid, H2SO4 (96 - 98%)

5.4 sodium chloride, NaCl (99.9%)

5.5 H2O ทตมเดอดแลว ปดฝา และตงไวใหเยนทอณหภมหอง (เตรยมใหม ๆ)

5.6 potassium iodide, KI

5.7 sodium carbonate, Na2CO3

5.8 การเตรยมสารเคม

5.8.1 1 M HCl: เจอจาง HCl 10 ml ดวย H2O ปรบปรมาตรใหครบ 100 ml

5.8.2 0.1 M HCl: เจอจาง 1 M HCl 10 ml ดวย H2O ปรบปรมาตรใหครบ 100 ml

5.8.3 NaCl, saturated solution: ละลาย NaCl ใน beaker ทม H2O 100 ml กวนขณะเตม

NaCl ปรมาณมากเกนพอจนเกลอไมละลาย วาง beaker บน hot plate ใหความรอน

จน NaCl ละลายหมด วางใหเยนทอณหภมหอง รนเฉพาะสวนทใสลงในขวดทสะอาด

(เกบไวใชไดนาน 12 เดอน)

5.8.4 starch solution ใชเปน indicator

ชง starch 1 g ลงใน beaker ขนาด 100 ml เตม H2O 10 ml วาง beaker บน hot plate

ใหความรอนและกวนจนแปงละลาย เตม NaCl, saturated solution จนมปรมาตร

รวมประมาณ 100 ml มลลลตร (เกบไวใชไดนาน 1 เดอน)

5.8.5 0.005 M Na2S2O3: สามารถเตรยมโดยตรงหรอเตรยมจาก 0.1 M Na2S2O3

5.8.5.1 0.1 M sodium thiosulfate: ชง Na2S2O3 .5 H2O ประมาณ 25 – 26 g และ

Na2CO3 0.2 g ถายลงใน volumetric flask ขนาด 1 L และปรบปรมาตรดวย

H2O ทตมเดอดและเยนแลวใหมๆ (5.5)

49


5.8.5.2 การ Standardization: ชง K2Cr2O7 ทผานการอบท 100 C นาน 2 hr

นาหนก 0.20 – 0.23 g (บนทกนาหนกแนนอน, W) ลงใน Iodine flask

ขนาด 250 ml ละลายดวย H2O ทตมเดอดและเยนแลวใหมๆ (5.5) 80 ml

ทม KI 2 g ละลายอย แลวเตม 1 M HCl 20 ml ปดจกใหแนน และแกวงขวด

K2Cr2O7 ใหละลาย วางไวในทมดนาน 10 min และไทเทรตทนท ดวย

0.1 M Na2S2O3 จนสารละลายเปลยนเปนสเหลองออนๆ เตม starch solution

1 ml ไทเทรตตอจนสมวงนาเงนจางหายไป (เขยาแรงๆ ขณะไทเทรต)

บนทกปรมาตร Na2S2O3 ทใช (V)

ความเขมขนของสารละลายมาตรฐาน Na2S2O3 (M) =

W × 1000

V × 49.032

เมอ W คอ นาหนก K2Cr2O7

V คอ ปรมาตรของ Na2S2O3 ทใชไทเทรต

5.8.5.3 0.005 M Na2S2O3: ปเปต 0.1 M Na2S2O3 25 ml ลงใน volumetric flask

ขนาด 500 ml และปรบปรมาตรดวย H2O ทตมเดอดและเยนแลวใหม ๆ (5.5)

5.8.6 2 N H2SO4: ปเปต H2SO4 15 ml ลงใน volumetric flask ขนาด 250 ml ทม H2O

ประมาณ 200 ml ผสมใหเขากน วางไวใหเยนและปรบปรมาตรใหครบดวย H2O

5.8.7 10 % KI: ละลาย KI 100 g ใน H2O ทตมเดอดและเยนแลวใหม ๆ (5.5) 1 L เกบใน

ทเยน และปองกนแสง (เกบไวใชไดนาน 1 เดอน)

5.9 สารมาตรฐาน

5.9.1 sodium thiosulfate pentahydrate, Na2S2O3 .5 H2O

5.9.2 potassium dichromate, K2Cr2O7 (primary standard, purity ≥ 99.9%)

5.9.3 potassium iodate, KIO3 ( purity ≥ 95.5%)

5.10 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน Iodine (จาก KIO3) 200 µg/ml (เตรยมใหมทกครง): ชง KIO3

0.0169 g ลงใน beaker ละลายดวย H2O ทตมเดอดและเยนแลวใหมๆ (5.5) และถายลงใน

volumetric flask ขนาด 50 ml ปรบปรมาตรดวย H2O ทตมเดอดและเยนแลวใหมๆ (5.5)


สมตวอยางเกลอ ประมาณ 200 g ถาตวอยางเปนเมดหยาบ บดใหละเอยดและผสมใหเปนเนอ

เดยวกน เกบในขวดปดสนท

50


7. ขนตอนการวเคราะห (Procedure)

7.1 ชงตวอยาง 10 g ลงใน beaker ขนาด 50 ml ถายลงใน Iodine flask ละลายดวย H2O 50 ml

เขยาหรอกวนจนตวอยางละลายหมด

7.2 เตม 2 N H2 SO4 ปรมาตร 1 ml เตม 10% KI 5 ml ปดจก แกวงขวดใหสารละลายเขากนด

และวางในทมด จบเวลานาน 10 min

7.3 นามาไทเทรตทนทดวย 0.005 M Na2S2O3 จนสารละลายเปนสเหลองออน จงเตม starch

soltion 1 ml ถามไอโอดนจะเกดสนาเงน ไทเทรตตอพรอมเขยา ทาเชนนจนสารละลาย

ไมมส บนทกปรมาตร 0.005 M Na2S2O3 ทใชไป (V) คานวณปรมาณไอโอดนโดย 1 ml

ของ 0.005 M Na2S2O3 สมมลกบ 0.1058 มลลกรม ไอโอดน



ไอโอดน (mg/kg) =

V × M × 0.1058 × 1,000

W × 0.005

เมอ V คอ ปรมาตรของ 0.005 M Na2S2O3 ทใชไทเทรต

M คอ ความเขมขนทแนนอนของสารละลายมาตรฐาน Na2S2O3

W คอ นาหนกตวอยาง

8.2 รายงานผล ปรมาณไอโอดน หนวยเปน มลลกรมตอกโลกรม ทศนยม 1 ตาแหนง


9.1 วเคราะห spiked sample ทระดบ 20 และ 40 mg/kg กอนเรมวเคราะหตวอยาง เกณฑยอมรบ

recovery อยระหวาง 80-110%

9.2 วเคราะหซา (duplicate analysis) ทกตวอยาง เกณฑยอมรบ RPD นอยกวาหรอเทากบ 10%

9.3 วเคราะห control sample (รอยละ 10 ของจานวนตวอยางทวเคราะห) นามาสราง control chart

51


DMSc F 1064: การตรวจวเคราะหสารเคมกลมเบตาอะโกนสตในเนอสตวและตบ

โดยเทคนค Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

Determination of ß ß-agonists in animal tissue and liver

by ELISA


ใชเปนวธตรวจวเคราะหสารเคมกลม ß ß-agonists ในเนอสตวและตบ ซงสารกลม ß-agonists

ประกอบดวย salbutamol, clenbuterol, bromobuterol, cimbuterol, mapenterol, mabuterol,

tulobuterol, clenpenterol, clenproperol, carpenterol, terbutaline และ cimaterol โดยชดตรวจ

แจงวามการศกษาคา cross-reactivity ดงน

salbutamol 100%

clenbuterol 100%

bromobuterol 100%

cimbuterol 75%

mapenterol 70%

mabuterol 60%

tulobuterol 50%

clenpenterol 50%

clenproperol 50%

carbuterol 40%

terbutaline 40%

cimaterol 10%

ß-agonists cross-reactivity

การตรวจวเคราะหโดยเทคนค ELISA นเปนวธการตรวจเบองตน ม limit of detection (LOD)

เทากบ 0.5 µg/kg และ limit of quantitation (LOQ) เทากบ 1.0 µg/kg

ในกรณทตองการนาผลไปใชในทางกฎหมาย ตองมการตรวจเพอยนยนผลการวเคราะห

โดยเครองมอ LC-MS/MS

52



A microtitre plate based competitive enzyme immunoassay for analysis and screening of urine,

faeces, feed, bile, tissue, plasma, hair and choroid/retina samples. Arnhem, The Netherlands.

Euro-Diagnostica B.V.5061BAG1p[19]09.05


เปนวธ immunoassay ทอาศยความจาเพาะระหวางสารทเปน antigen กบ specific antibodies

ตอสารชนดนน ๆ โดยใชเทคนคทเรยกวา competitive enzyme linked immunosorbent assay

ซงปรมาณ ß-agonists ในตวอยาง และ ß-agonists ในรปของ enzyme conjugate จะแยงกนจบ

กบ

specific antibodies ทตรงบนผว microtitre plate จากนนตรวจหาปรมาณโดยเตม substrate

chromogen ทาใหสารละลายเกดส ในลกษณะผกผนกบปรมาณของ ß-agonists ในตวอยาง

ซงสามารถคานวณปรมาณไดโดยเปรยบเทยบกบ calibration curve

วธนอางองวธ Liquid extraction method สาหรบ muscle samples ของชดตรวจ ß-agonists - EIA

(Euro-Diagnostica B.V.5061BAG1p[19]09.05) สาหรบตวอยางเนอสตว เพมขนตอนการทาให

บรสทธ (clean up) โดยใช SPE: Waters Oasis HLB extraction cartridges 3 cc/60 mg และได

แสดงขอมลผลการทดสอบความใชไดโดยหองปฏบตการเดยว (Single laboratory method

validation) ในขอ 10.3


4.1 ชดตรวจ ß-agonists-EIA ประกอบดวย

4.1.1 microtitre plate (12 แถว แถวละ 8 หลม) coated ดวย antibodies to rabbit IgG พรอม

ใชงาน

4.1.2 zero standard solution พรอมใชงาน standard salbutamol solution ความเขมขน

0.062, 0.125, 0.250, 0.500, 1.000 และ 2.000 ng/ml จานวน 6 ขวด พรอมใชงาน

4.1.3 standard salbutamol solution ความเขมขน 100 ng/ml พรอมใชงาน

4.1.4 lyophilised conjugate (horseradish peroxidase conjugated salbutamol)

4.1.5 lyophilised antibody

4.1.6 substrate solution (peroxide/TMB) พรอมใชงาน (12 ml)

4.1.7 dilution buffer พรอมใชงาน (20 ml)

4.1.8 stop solution พรอมใชงาน (15 ml)

53


4.1.9 concentrated rinsing buffer (30 ml, กอนใชตองเจอจาง 20 เทา ดวย H2O)

4.2 การเกบรกษาชดตรวจ ß-agonists-EIA

4.2.1 เกบในตเยนอณหภม 2-8 C และในทมด เมอใชเสรจแลวตองกลบไปเกบในตเยน

ทนท

4.2.2 นา microtitre plate ออกมาใชเทาทตองการ เกบ microtitre plate ทเหลอในถงทปด

สนททนท และไมจบทพนผวดานลางของ microtitre plate

4.2.3 ไมเปดถงทบรรจ microtitre plate ทนทหลงจากทนาออกจากตเยน ควรปลอยใหม

อณหภมเทากบอณหภมหองกอนเพอปองกนการเกดการควบแนนของนา (condensa

tion) ใน microtitre plate

4.2.4 หลงจากละลาย (reconstitute) lyophilised conjugate และ lyophilised anti-clenbuterol/

salbutamol antibodies แลว เกบในตเยนอณหภม 2-8 C ในทมด จะมอายการใชงาน

1 สปดาห หากเกบ reconstituted conjugate หลงจากใชงานเสรจแลว ทนทในตแชแขง

อณหภมนอยกวา -20 C จะมอายการใชงาน 1 ป

4.2.5 substrate solution และ standard solution สามารถเกบไดในตเยนอณหภม 2-8 C และ

มอายการใชงาน ตามทกาหนดในฉลาก

4.2.6 substrate/chromogen solution เปนสารทไวตอแสง ควรเกบรกษาในทมดหลกเลยงแสง

การใชควรทาในทมด และรวดเรว

4.2.7 หลงจากนาชดตรวจ ß-agonists-EIA ออกจากตเยน ควรปลอยใหมอณหภมเทากบ

อณหภมหองกอนนามาใช

4.2.8 ไมนาสารเคมทเหลอในแตละ lot มาผสมกน เพอนามาใชตอ

4.2.9 เมอสงเกตเหน chromogen solution เปลยนเปนสฟา หรอคา O.D. ของ zero standard

ท 450 nm นอยกวา 0.8 แสดงวาชดตรวจชดนนไมควรนามาใชตอไป

4.3 ความปลอดภย (Safety)

4.3.1 stop reagent เปน 0.5M sulfuric acid ควรหลกเลยงการสมผสผวหนง

4.3.2 substrate เปนสาร tetramethylbenzidine (TMB) ควรหลกเลยงการสดดม

4.3.3 สารทใชสวนมากเปน biological materials ควรระมดระวงการสมผสทางผวหนง

และทางเดนหายใจ

4.3.4 ไมใชปากในการดดสาร

4.4 เครองมอ

4.4.1 เครองชงทมความละเอยดอยางนอย 0.01 g

4.4.2 microplate reader พรอม filter 450 nm

4.4.3 automated strip washer

54


4.4.4 เครองบดเนอ

4.4.5 centrifuge สามารถทาความเรวได 3,000 รอบตอนาท (rpm)

4.4.6 nitrogen evaporator-temperature-controlled heating box

4.4.7 SPE vacuum manifold

4.4.8 vortex mixer

4.4.9 incubator หรอ water bath อณหภม 37 C และ 55 C

4.4.10 ตเยน ทสามารถควบคมอณหภมท 4 C ได

4.4.11 pH meter และ pH paper

4.5 อปกรณอน

4.5.1 multichannel pipette ขนาด 10-200 µl (8/12 channel)

4.5.2 autopipetteขนาด 10-100 µl และ 100-1000 µl

4.5.3 screw cap centrifuge tube ขนาด 30 และ 35 ml

4.5.4 screw cap test tube ขนาด 10 และ 20 ml

4.5.5 screw cap vial ขนาด 5 ml

4.5.6 microcentrifuge tube ขนาด 1.5 ml

4.5.7 volumetric flask ขนาด 100 และ 200 ml

4.5.8 parafilm


สารเคมทกชนดเปน AR grade หรอเทยบเทา ยกเวนทระบไวเปนอยางอน

5.1 acetic acid

5.2 calcium chloride, CaCl2

5.3 disodium hydrogen phosphate, Na2HPO4

5.4 Helix pomatic juice (Merck Art No. 4114)

5.5 hydrochloric acid, HCl

5.6 isobutyl alcohol

5.7 methanol, MeOH (HPLC grade)

5.8 potassium chloride, KCl

5.9 potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4

5.10 pronase E (Sigma)

5.11 sodium acetate

55


5.12 sodium carbonate

5.13 sodium chloride, NaCl

5.14 sodium dihydrogen phosphate, NaH2PO4

5.15 sodium hydroxide, NaOH

5.16 trizma base [tris (hydroxymethyl) amino methane] (Sigma)

5.17 tween 20

5.18 solid phase extraction, SPE: Waters Oasis HLB extraction cartridges 3 cc/60 mg

5.19 วธเตรยมสารละลาย

5.19.1 tris buffer pH 8: ชง trizma base 24.2 g และ CaCl2 14.7 g ละลาย trizma base

และ CaCl2 รวมกน ดวย H2O ปรบ pH โดยใช pH meter ใหได pH 8 (ปรบ pH

โดยใช HCl เขมขน) จากนนปรบปรมาตรเปน 1,000 ml ดวย H2O

5.19.2 dilution buffer: ชง Na2HPO4 1.15 g, KH2PO4 0.2 g, NaCl 30.0 g และ KCl

0.2 g แลวละลายสารทงหมดรวมกนดวย H2O เตม tween 20 ปรมาตร 0.5 ml

จากนนปรบปรมาตรเปน 1,000 ml ดวย H2O

5.19.3 rinsing buffer: เจอจาง concentrated rinsing buffer ดวย H2O 20 เทา กอนนา

มาใช

5.19.4 0.2 M acetate buffer pH 4.8: ชง sodium acetate 16.4 g ละลายดวย H2O

ปรบ pH โดยใช pH meter ใหได pH 4.8 (ปรบ pH โดยใช acetic acid) จากนน

ปรบปรมาตรเปน 1 L ml ดวย H2O

5.19.5 1 M sodium carbonate: ชง sodium carbonate 10.599 g ละลายดวย H2O

จากนนปรบปรมาตรเปน 100 ml ดวย H2O

5.20 สารมาตรฐาน (อยในชดตรวจ)

5.20.1 standard solution ความเขมขน 100 ng/ml

5.20.2 standard solution ความเขมขน 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 และ 2.0 ng/ml


6.1 ตวอยาง นาหนกอยางนอย 300 g ตดสวนทเปนไขมนออก หนเปนชนเลก ๆ จากนนบด

ใหละเอยดดวยเครองบดเนอ

6.2 ชงตวอยางทบดละเอยด นาหนก 1.0 g ใสใน centrifuge tube ขนาด 35 ml สวนทเหลอ

เกบไวเปน reserved portion เกบทอณหภมตากวา -15 C

56



7.1 การสกด - เนอสตว

7.1.1 ละลาย pronase E 1.25 mg ดวย tris buffer (pH 8) 4 ml แลวเตมลงในหลอดตวอยาง

แลวนาไปบม (incubate) ใน incubator หรอ water bath ทอณหภม 55 C นาน 16-18 hr

(overnight)

7.1.2 เมอครบเวลา นาหลอดตวอยางมาตงทงไวใหมอณหภมเทากบอณหภมหอง และ

นาไปปนผสมดวย vortex mixer เปนเวลาอยางนอย 30 sec แลว centrifuge หลอด

ตวอยางท 3,000 rpm นาน 10 min

7.1.3 ปเปตสารละลายสวนใสปรมาตร 2 ml ใสลงใน centrifuge tube ขนาด 20 ml

ปรบ pH ใหได pH 9.4 ± 0.2 โดยเตม 10 M NaOH (ประมาณ 1-2 หยด)

7.1.4 เตม isobutyl alcohol ปรมาตร 4 ml นาไปปนผสมดวย vortex mixer นาน 30 sec

แลวตงทงไวจนสารละลายแยกชน (ประมาณ 30 min)

7.1.5 ปเปตสารละลาย isobutyl alcohol (ชนบน) ปรมาตร 2 ml ใสใน screw cap vial

ขนาด 5 ml แลวนาไประเหยจนแหงดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 60 C

7.1.6 ละลายตะกอน (residue) ดวย H2O ปรมาตร 3 ml และนาไปปนผสมดวย vortex mixer

นาน 30 sec นาไปวเคราะหตอในขนตอนการทาใหบรสทธ (7.3)

7.2 การสกด – ตบ

7.2.1 เตม 0.1 M HCl 5 ml ลงในหลอดตวอยางแลวนาไปปนดวย vortex mixer นาน 1 min

และนาตวอยางไป centrifuge ทอณหภม 4 C ความเรว 3,000 rpm นาน 10 min

7.2.2 ปเปตสารละลายสวนใส 2 ml ใสลงใน centrifuge tube ขนาด 30 ml เตม 0.2 M acetate

buffer (pH 4.8) 2 ml และ Helix pomatia juice 20 µl นาไป incubate ใน incubator

หรอ water bath ท 37 C นาน 16-18 hr (overnight)

7.2.3 เมอครบเวลา นาหลอดตวอยางมาตงทงไวใหมอณหภมเทากบอณหภมหอง และ

นาไปปนดวย vortex mixer เปนเวลาอยางนอย 30 sec ปรบ pH ใหได 9.8 ± 0.2

โดยเตม 1 M sodium carbonate 250 µl และเตม 1 M NaOH (ประมาณ 1-2 หยด)

เตม isobutyl alcohol 4 ml นาไปปนดวย vortex mixer นาน 30 sec แลว centrifuge

ท 3,000 rpm นาน 5 min

7.2.4 ปเปตสารละลาย isobutyl alcohol (ชนบน) ปรมาตร 2 ml ใสใน screw cap test tube

ขนาด 10 ml แลวนาไประเหยจนแหงดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 50 C

7.2.5 ละลายตะกอน (residue) ดวย dilution buffer 500 µl และปนดวย vortex mixer

นาน 30 sec นาไปตรวจวเคราะหตอในขนการตรวจหาปรมาณ (7.4)

57


7.3 การทาใหบรสทธ – เนอสตว

7.3.1 เตรยม SPE vacuum manifold และ SPE ใหพรอมใช โดยปรบ flow rate ประมาณ

2 ml/min

7.3.2 ลาง SPE ดวย MeOH ปรมาตร 2 ml และ H2O ปรมาตร 5 ml

7.3.3 ถายสารทสกดไดจากขอ 7.1 ทงหมด ลงใน SPE (ทง eluate)

7.3.4 ลาง screw cap vial ดวยสารละลายผสม MeOH/H2O (10%) ปรมาตร 5 ml และ

ถายลงใน SPE (ทง eluate)

7.3.5 ชะ (elute) SPE ดวย MeOH ปรมาตร 3 ml เกบ eluateใน screw cap test tube

ขนาด 10 ml

7.3.6 ระเหย eluate ดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 60 C จนแหง

7.3.7 ละลาย residue ดวย dilution buffer 500 µl และปนผสมดวย vortex mixer 30 sec

นาไปตรวจวเคราะหตอในขนตอนการหาปรมาณ (7.4)

7.4 การหาปรมาณ

7.4.1 นา microtitre plate ออกมาเทาทจะใช ทเหลอเกบใสถงพลาสตกปดใหสนทเกบไว

ในตเยน

7.4.2 ปเปต zero standard 100 µl ลงในหลม 2 ซา (well A1, A2) ใชเปน blank ปเปต zero

standard 50 µl ลงในหลม 2 ซา (well B1, B2) ปเปตสารมาตรฐานทมาในชดตรวจ

50 µl แตละความเขมขน (0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 และ 2.0 ng/ml) 2 ซา (well C1,

2 ถง H1, 2) ปเปตสารตวอยางทสกดได 50 µl ลงในหลม 2 ซา

7.4.3 ผสม lyophilised conjugate ดวย dilution buffer 4 ml แลวปเปต conjugate 25 µl

ใสลงในหลมททดสอบทกหลม ยกเวนหลม A1 และ A2

7.4.4 ผสม lyophilised antibody ดวย dilution buffer 4 ml แลวปเปต antibody 25 µl


7.4.5 ใช parafilm ปด microtitre plate แลว เขยา plate เบา ๆ ในแนวนอน ประมาณ 1 min

นา plate ไปบม (incubate) ในตเยนอณหภม 4 C (2 C ถง 8 C ) นาน 1 hr

7.4.6 เมอครบเวลา เทสารละลายใน microtitre plate ทง และลาง microtitre plate ดวย

rinsing solution 3 ครง ครงละ 300 µl ดวย automated strip washer ทา plate ใหแหง

โดยควา plate ลงบนกระดาษเนอนมและไมมขน เคาะ plate จนแนใจวาไมมหยดนา

เกาะใน plate

7.4.7 ปเปต substrate solution 100 µl ลงในทกหลม เขยา plate เบา ๆ ในแนวนอน ประมาณ

1 min ปด microtiter plate ดวย parafilm แลวบม (incubate) ทอณหภมหอง (ประมาณ

20-25 ) ในทมด นาน 30 min

58


7.4.8 เมอครบเวลา ปเปต stop solution 100 µl ลงในทกหลม เขยา plate เบา ๆ ในแนวนอน

ประมาณ 1 min และนาไปอานคาการดดกลนแสง (absorbance value) ทความยาวคลน

450 nm ทนท


8.1 หาคาเฉลยของ optical density (O.D.) ของ well A1, A2 (blank)

8.2 หาคาเฉลยของ O.D. ของ well B1, B2 (zero standard)

8.3 นา O.D. well A1, A2 (blank) ลบออกจากคาเฉลยของ O.D. ทอานไดจากทกหลม (ทงสาร

มาตรฐานและตวอยาง)

% maximal absorbance =

O.D. standard (สารมาตรฐานหรอ ตวอยาง) × 100

O.D. zero standard

8.4 สราง calibration curve ระหวาง % maximum absorbance (หรอ %B/Bo) บนแกน Y กบ log

ของความเขมขนของสารมาตรฐาน salbutamol บนแกน X

8.5 ปรมาณ ß-agonist ทตรวจพบ คานวณไดจากความสมพนธของ % maximum absorbance

และความเขมขนของสารมาตรฐาน โดยตวอยางเนอสตวใช multiplying factor เทากบ 0.5

และตวอยางเนอสตวใช multiplying factor เทากบ 0.4

8.6 รายงาน สารเคมกลมเบตาอะโกนสต ทตรวจพบ หนวย ไมโครกรมตอกโลกรม ทศนยม



9.1 การควบคมคณภาพขนตอนการหาปรมาณ (Assay)

9.1.1 O.D. ของ zero standard ท 450 nm ตองไมนอยกวา 0.8

9.1.2 คา Correlation coefficient, r ของ calibration curve ตองมคามากกวาหรอเทากบ 98

9.1.3 วเคราะหตวอยาง 2 ซา (duplicate well) ทกตวอยาง ถาผลการวเคราะหไมสอดคลองกน

หรอตรวจพบปรมาณสารกลม ß-agonists ทมปรมาณสงกวาคา LOQ แตปรมาณ

ทตรวจพบมความแตกตางกน (% RPD > 30) ตวอยางนน ตองลง plate ใหม

9.2 การควบคมคณภาพผลวเคราะห

9.2.1 วเคราะห method blank ทกครงททาการวเคราะห โดยคา method blank ทอานได

ตองนอยกวาคา LOD

59


9.2.2 กอนใชงานทก Lot ของ SPE โดยผาน H2O ทเตม standard salbutamol ทระดบ

1.0 ng/ml คานวณ % recovery (เกณฑยอมรบอยในชวง 80-120%)

9.2.3 วเคราะห duplicate sample (สกด 2 ซา) อยางนอยรอยละ 10 ของตวอยาง กรณ

duplicate sample ตรวจพบปรมาณสารกลม ß-agonists มปรมาณสงกวาคา LOQ

ใหคานวณ %RPD โดย % RPD ตองนอยกวา 30

9.2.4 วเคราะห spiked sample ทระดบ 2.5 µg/kg โดยใช negative sample อยางนอย

1 ตวอยาง ใน 1 ชดของการวเคราะห คานวณ % recovery (เกณฑยอมรบอยในชวง

60-120 %)


10.1 ประกาศของสานกงานคณะกรรมการอาหารและยา เรอง หลกเกณฑ เงอนไข และวธ

การตรวจวเคราะหการปนเปอนสารเคมบางชนดในอาหาร ลงวนท 18 สงหาคม พ.ศ. 2549

กาหนดวาจะตองใชวธการตรวจวเคราะหไดอยางนอยตาถงระดบ 1 µg/kg

10.2 เมอตองการนาผลการวเคราะหไปดาเนนคดทางกฎหมาย ตองตรวจยนยนดวยเทคนคอน

เชน การตรวจวเคราะหโดยใชเครองมอ LC-MS/MS

10.3 ผลการตรวจสอบความใชได (Method validation) ของวธ โดยหองปฏบตการฝายสารกาจด

ศตรพชและยาสตวตกคาง สานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร ใน matrix เนอหม

ดาเนนการเมอพฤศจกายน 2547

10.3.1 การทดสอบความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐาน (standard curve) ชวงความเขมขน

ของสารมาตรฐาน 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 และ 2.0 ng/ml ไดคา Correlation

coefficient, r เทากบ -0.9933

10.3.2 การยนยนคา Limit of Detection (LOD) ทระดบความเขมขน 0.5 µg/kg ทาการ

ทดสอบโดยเตมสารมาตรฐาน clenbuterol และ salbutamol ลงในตวอยางเนอหม

ชนดละ 10 ตวอยาง ผลตรวจพบทกตวอยาง

10.3.2 การยนยนคา Limit of Detection (LOD) ทระดบความเขมขน 0.5 µg/kg ทาการ

ทดสอบโดยเตมสารมาตรฐาน clenbuterol และ salbutamol ลงในตวอยางเนอหม

ชนดละ 10 ตวอยาง ผลตรวจพบทกตวอยาง

60


Sample No.

ปรมาณทพบ (µg/kg)

clenbuterol salbutamol

1 0.50 0.43

2 0.57 0.42

3 0.52 0.49

4 0.42 0.53

5 0.54 0.52

6 0.62 0.47

7 0.64 0.47

8 0.78 0.54

9 0.73 0.61

10 0.52 0.50

10.3.3 การยนยนคา Limit of Quantitation (LOQ) ทาการทดสอบโดยเตมสารมาตรฐาน

clenbuterol และ salbutamol ทระดบความเขมขน 1.0 µg/kg ลงในตวอยางเนอหม

ชนดละ 7 ซา

สารมาตรฐาน

% Recovery % RSD

คาตาสด-คาสงสด Mean ± SD


% Recovery % RSD

คาตาสด-คาสงสด Mean ± SD

Clenbuterol 89.5 – 129.6 110.5 ± 13.6 12.3

Salbutamol 94.8 – 115.8 105.2 ± 6.3 6.0

Clenbuterol 72.8 – 97.1 80.5 ± 8.7 10.8

Salbutamol 80.1 – 109.9 89.1 ± 10.1 11.4

10.3.4 Accuracy และ Precision ทาการทดสอบโดยเตมสารมาตรฐาน clenbuterol

และ salbutamol ทระดบความเขมขน 2.5 µg/kg ลงในตวอยางเนอหม ชนดละ 7 ซา

61


DMSc F 1065: การตรวจวเคราะหแรคโตพามนในเนอสตวและตบโดยเทคนค

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

Determination of Ractopamine in animal tissue and liver

by ELISA


ใชเปนวธตรวจวเคราะหสารแรคโตพามน (Ractopamine) ในเนอสตวและตบ โดยชดตรวจแจง

วามการศกษาคา cross-reactivity ดงน

ractopamine 100%

clenbuterol < 0.1%

fenoterol < 0.1%

ritodrine < 0.1%

salbutamol < 0.1%

salmeterol < 0.1%

isoxsuprine < 0.1%

cross-reactivity


เทากบ 0.5 µg/kg และ limit of quantitation (LOQ) เทากบ 1.0 µg/kg

ในกรณทตองการนาผลไปใชในทางกฎหมาย ตองมการตรวจเพอยนยนผลการวเคราะห

โดยเครองมอ LC-MS/MS


A competitive enzyme immunoassay for screening and quantitative analysis of ractopamine

in various matrices. Arnhem, The Netherlands. Euro-Diagnostica B.V.5061RACT[11]01.15

62




ตอสารชนดนน ๆ โดยใชเทคนคทเรยกวา competitive enzyme linked immunosorbent assay

ซงปรมาณ Ractopamineในตวอยาง และ Ractopamine ในรปของ enzyme conjugate จะแยงกน

จบกบ specific antibodies ทตรงบนผว microtitre plate จากนนตรวจหาปรมาณโดยเตม substrate

chromogen ทาใหสารละลายเกดส ในลกษณะผกผนกบปรมาณของ Ractopamine ในตวอยาง

ซงสามารถคานวณปรมาณไดโดยเปรยบเทยบกบ calibration curve


4.1 ชดตรวจ RACTOPAMINE-ELISA ประกอบดวย

4.1.1 microtitre plate (12 แถว แถวละ 8 หลม) coated ดวย specific antibodies (rabbit

anti-ractopamine) พรอมใชงาน

4.1.2 zero standard solution พรอมใชงาน standard ractopamine solution ความเขมขน

0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 และ 2.0 ng/ml จานวน 6 ขวดพรอมใชงาน

4.1.3 standard ractopamine solution ความเขมขน 100 ng/ml พรอมใชงาน

4.1.4 lyophilised conjugate (horseradish peroxidase conjugated ractopamine)


4.1.6 dilution buffer พรอมใชงาน (20 ml)



4.2 การเกบรกษาชดตรวจ RACTOPAMINE ELISA

4.2.1 เกบในตเยนอณหภม 2-8 C และในทมด เมอใชเสรจแลวตองกลบไปเกบในตเยนทนท

4.2.2 นา microtitre plate ออกมาใชเทาทตองการ เกบ microtitre plate ทเหลอในถงท

ปดสนททนท และไมจบทพนผวดานลางของ microtitre plate


อณหภมเทากบอณหภมหองกอนเพอปองกนการเกดการควบแนนของนา (condensation)

ใน microtitre plate

4.2.4 หลงจากละลาย (reconstitute) lyophilised conjugate แลว เกบในทมด จนกวาจะ

ใชงาน และเกบ reconstituted conjugate หลงจากใชงานเสรจแลว ทนทในตแชแขง

อณหภมนอยกวา -20 C มอายการใชงานตามทระบบนฉลาก

4.2.5 substrate solution และ standard solution สามารถเกบไดในตเยนอณหภม 2-8 C

และมอายการใชงาน ตามทระบบนฉลาก

63




4.2.7 หลงจากนาชดตรวจ RACTOPAMINE ELISA ออกจากตเยน ควรปลอยใหมอณหภม

เทากบอณหภมหองกอนนามาใช







4.3.3 สารทใชสวนมากเปน biological materials ควรระมดระวงการสมผสทางผวหนงและ

ทางเดนหายใจ









4.4.7 vortex mixer

4.4.8 ตเยนทสามารถควบคมอณหภมท 4 C ได

4.4.9 เครองเขยา ใชกบ screw cap centrifuge tube ขนาด 30 ml




4.5.3 screw cap centrifuge tube ขนาด 30 ml

4.5.4 screw cap test tube ขนาด 10 ml



4.5.7 parafilm

64



5.1 acetonitrile, HPLC grade


5.2.1 dilution buffer : เจอจาง concentrated dilution buffer ดวย H2O 4 เทา กอนนามาใช

5.2.2 rinsing buffer: เจอจาง concentrated rinsing buffer ดวย H2O 20 เทา กอนนามาใช





6.1 ตวอยาง นาหนกอยางนอย 300 g ตดสวนทเปนไขมนออก หนเปนชนเลก ๆ จากนน

บดใหละเอยดดวยเครองบดเนอ

6.2 ชงตวอยางทบดละเอยด นาหนก 1.0 g ใสใน centrifuge tube ขนาด 35 ml สวนทเหลอ

เกบไวเปน reserved portion เกบทอณหภมตากวา -15 C


7.1 การสกด

7.1.1 ชงตวอยาง 1 g ใสใน centrifuge tube ขนาด 30 ml เตม acetonitrile 4 ml ลงในหลอด

ตวอยาง นาไปปนดวย vortex mixer นาน 1 min แลวนาไปเขยาดวยเครองเขยา

30 min แลวนาไป centrifuge ทอณหภม 20-25 C และความเรว 5,000 rpm นาน

10 min

7.1.2 ปเปตสารสกดสวนใส ปรมาตร 1 ml ใสลงใน test tube ขนาด 10 ml ระเหยสารสกด

จนแหงดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 50 C

7.1.3 ละลาย residue ดวย dilution buffer 500 µl และ นาไปปนดวย vortex mixer นาน

1 min จากนนปเปตสารสกดทได 50 µl เจอจางดวย dilution buffer 50 µl นาไปปน

ดวย vortex mixer อกครง นาน 1 min สารละลายทไดไปตรวจวเคราะหตอในขน

การตรวจหาปรมาณ


7.2.1 นา microtiter plate ออกมาเทาทจะใช ทเหลอเกบใสถงพลาสตกปดใหสนทเกบไว

ในตเยน

65


7.2.2 ปเปต zero standard 100 µl ลงในหลม 2 ซา (well A1, A2)

ปเปต zero standard 50 µl ลงในหลม 2 ซา (well B1, B2)

ปเปตสารมาตรฐานทมาในชดตรวจ 50 µl แตละความเขมขน (0.063, 0.125, 0.25,

0.5, 1.0 และ 2.0 ng/ml) 2 ซา (well C1, 2 ถง H1, 2)

ปเปตสารตวอยางทสกดได 50 µl ลงในหลม 2 ซา



7.2.4 ผสม lyophilised antibody ดวย dilution buffer 4 ml แลวปเปต antibody 25 µl ใสลง

ในหลมททดสอบทกหลม ยกเวนหลม A1 และ A2

7.2.5 ใช parafilm ปด microtiter plate แลว เขยา plate เบา ๆ ในแนวนอน ประมาณ 1 min

นา plate ไปบม (incubate) ในตเยนอณหภม 4 C (2 C ถง 8 C) นาน 1 hr

7.2.6 เมอครบเวลา เทสารละลายใน microtiter plate ทง และลาง microtiter plate ดวย

rinsing solution 3 ครง ครงละ 300 µl ดวย automated strip washer ทา plate ใหแหง

โดยควา plate ลงบนกระดาษเนอนมและไมมขน เคาะ plate จนแนใจวาไมมหยดนา

เกาะใน plate



20-25 C) ในทมด นาน 30 min



450 nm ทนท




8.3 นา O.D. well A1, A2 (blank) ลบออกจากคาเฉลยของ O.D. ทอานไดจากทกหลม (ทงสาร

มาตรฐานและตวอยาง)

% maximal absorbance =

O.D. standard (หรอตวอยาง) × 100

O.D. zero standard

66



ของความเขมขนของสารมาตรฐาน ractopamine บนแกน X

8.5 ปรมาณ ractopamine ทตรวจพบ คานวณไดจากความสมพนธของ % maximum absorbance

โดยม multiplying factor เทากบ 5

8.6 รายงานปรมาณ Ractopamine ทตรวจพบ หนวยไมโครกรมตอกโลกรม ทศนยม 1 ตาแหนง




9.1.2 คา Correlation coefficient, r ของ calibration curve ตองมคามากกวาหรอเทากบ 0.98


หรอตรวจพบปรมาณ Ractopamine ทมปรมาณสงกวาคา LOQ แตปรมาณทตรวจพบ

มความแตกตางกน (% RPD > 30) ตวอยางนน ตองลง plate ใหม


9.2.1 วเคราะห method blank ทกครงททาการวเคราะห โดยคา method blank ทอานไดตอง

นอยกวาคา LOD

9.2.2 วเคราะห duplicate sample (สกด 2 ซา) อยางนอยรอยละ 10 ของตวอยาง กรณ

duplicate sample ตรวจพบปรมาณ Ractopamine มปรมาณสงกวาคา LOQ ใหคานวณ

% RPD โดย % RPD ตองนอยกวา 30


1 ตวอยางใน 1 ชดของการวเคราะห คานวณ % recovery (เกณฑยอมรบอยในชวง

60-120%)


10.1 ประกาศของสานกงานคณะกรรมการอาหารและยา เรอง หลกเกณฑ เงอนไข และวธการ

ตรวจวเคราะหการปนเปอนสารเคมบางชนดในอาหาร ลงวนท 18 สงหาคม พ.ศ. 2549

กาหนดวาจะตองใชวธการตรวจวเคราะหไดอยางนอยตาถงระดบ 1.0 µg/kg



67


DMSc F 1066: การตรวจวเคราะหสารปฏชวนะคลอแรมเฟนคอลตกคาง

ในอาหาร โดยเทคนค Enzyme linked immunosorbent

assay (ELISA)

Determination of chlormphenicol residue


ใชเปนวธตรวจวเคราะหสารปฏชวนะคลอแรมเฟนคอล (chloramphenicol; CAP) ตกคางในเนอสตว

นม ไข และนาผง โดยวธ Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) โดยชดตรวจแจงวา

มการศกษาคา cross-reactivity ดงน

chloramphenicol 100%

chloramphenicol-glucoronide 65%

chloramphenicol-base < 1%

thiamphenicol < 1%

florphenicol < 1%

สารปฏชวนะ Cross-reactivity


เทากบ 0.05 µg/kg และ limit of quantitation (LOQ) เทากบ 0.1 µg/kg ในกรณทตองการ

นาผลไปใชในทางกฎหมาย ตองมการตรวจเพอยนยนผลการวเคราะห โดยเครองมอ LC-MS/MS


A microtitre plate based competitive enzyme immunoassay for screening and quantitative

analysis of chloramphenicol in various matrices. Arnhem, The Netherlands. Euro-Diagnostica

B.V. 5091CAP[21]07.10

68




ตอสารชนดนน ๆ โดยใชเทคนคทเรยกวา competitive enzyme linked immunosorbent assay ซง

ปรมาณ CAP ในตวอยาง และ CAP ในรปของ enzyme conjugate จะแยงกนจบกบ specific

antibodies ทตรงบนผว microtiter plate จากนนตรวจหาปรมาณโดยเตม substrate chromogen

ทาใหสารละลายเกดสในลกษณะผกผนกบปรมาณของ CAP ในตวอยาง ซงสามารถคานวณปรมาณ

ไดโดยเปรยบเทยบกบ calibration curve


4.1 ชดตรวจ chloramphenicol EIA ประกอบดวย

4.1.1 microtitre plate (12 แถว แถวละ 8 หลม) coated ดวย antibodies to rabbit IgG

พรอมใชงาน

4.1.2 zero standard solution พรอมใชงาน

4.1.3 standard chloramphenicol solution ความเขมขน 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 และ

2.0 ng/ml จานวน 6 ขวด พรอมใชงาน

4.1.4 standard chloramphenicol solution ความเขมขน 100 ng/ml พรอมใชงาน

4.1.5 lyophilised conjugate (peroxidase conjugated chloramphenicol)

4.1.6 lyophilised anti-chloramphenicol antibodies




4.2 การเกบรกษาชดตรวจ chloramphenicol-EIA

4.2.1 เกบในตเยนอณหภม 2-8 C และในทมด เมอใชเสรจแลวตองกลบไปเกบในตเยนทนท

4.2.2 นา microtiter plate ออกมาใชเทาทตองการ เกบ microtitre plate ทเหลอในถงทปด

สนททนท และไมจบทพนผวดานลางของ microtitre plate


อณหภมเทากบอณหภมหองกอนเพอปองกนการเกดการควบแนนของนา (condensation)

ใน microtitre plate

4.2.4 หลงจากละลาย (reconstitute) lyophilised conjugate และ lyophilised antibodies แลว

เกบในตเยนอณหภม 2-8 C ในทมด lyophilised conjugate จะมอายการใชงาน 6 เดอน

สวน lyophilised antibodies จะมอายการใชงาน 2 เดอน หากเกบ reconstituted

69


conjugate หลงจากใชงานเสรจแลวทนท ในตแชแขงอณหภมนอยกวา -20 C จะมอาย

การใชงาน 1 ป

4.2.5 substrate solution และ standard solution สามารถเกบไดในตเยนอณหภม 2-8 C

และมอายการใชงาน ตามทกาหนดในฉลาก



4.2.7 หลงจากนาชดตรวจ chloramphenicol-EIA ออกจากตเยน ควรปลอยใหมอณหภม

เทากบอณหภมหองกอนนามาใช







4.3.3 สารทใชสวนมากเปน biological materials ควรระมดระวงการสมผสทางผวหนง

และทางเดนหายใจ









4.4.7 vortex mixer

4.4.8 ตเยนทสามารถควบคมอณหภมท 4 C ได

4.4.9 เครองเขยา ใชกบ screw cap centrifuge tube ขนาด 30 ml





70


4.5.4 screw cap test tube ขนาด 10 ml



4.5.7 parafilm

4.5.8 กระดาษกรอง Whatman No. 2 ขนาด od 125 mm


5.1 สารเคมทกชนดเปน AR grade หรอเทยบเทา ยกเวนทระบไวเปนอยางอน

5.1.1 ethyl acetate, HPLC grade

5.1.2 hexane


5.2.1 dilution buffer: เจอจาง concentrated dilution buffer ดวย H2O 4 เทา กอนนามาใช

5.2.2 rinsing buffer: เจอจาง concentrated rinsing buffer ดวย H2O 20 เทา กอนนามาใช





6.1 ใชตวอยางอาหาร นาหนกอยางนอยประมาณ 300 g หรอปรมาตรอยางนอยประมาณ 500 ml

6.2 เนอสตวและผลตภณฑ ใชเฉพาะสวนเนอตดหนงและมนออก หนเปนชนเลก ๆ บดให

ละเอยดดวยเครองบดเนอ

6.3 นม

6.3.1 นมผง ชงตวอยาง 10 g ละลายดวย H2O 100 ml กาจดไขมนออก โดยนาตวอยางไป

centrifuge ทอณหภม 4 C ความเรว 3,000 rpm นาน 15 min และกรองดวย

กระดาษกรอง

6.3.2 นานม นาตวอยางไป centrifuge ทอณหภม 4 C ความเรว 3,000 rpm นาน 15 min

และกรองดวยกระดาษกรอง

6.4 ไขเปดและไขไก 10 ฟอง ไขนกกระทา 30 ฟอง ใชทงไขแดงและไขขาวตใหเขากน

71




7.1.1 เนอสตวและผลตภณฑ

7.1.1.1 ชงตวอยาง 3 g ใสใน centrifuge tube ขนาด 30 ml เตม ethyl acetate 6 ml

ลงในหลอดตวอยาง นาไปปนดวย vortex mixer นาน 1 min แลวนาไปเขยา

ดวยเครองเขยา 10 min แลวนาไป centrifuge ทความเรว 3,000 rpm นาน

10 min

7.1.1.2 ปเปตสารสกดสวนใส ปรมาตร 4 ml ใสลงใน test tube ขนาด 10 ml ระเหย

สารสกด จนแหงดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 50 C

7.1.1.3 ละลาย residue ดวย hexane 1 ml และ dilution buffer 1 ml และนาไปปน

ดวย vortex mixer นาน 1 min จากนนทาใหแยกชนโดยนามา centrifuge

ทความเรว 3,000 rpm นาน 10 min กรณเกด emulsion ไมแยกชน นาหลอด

ตวอยางแชใน water bath ทอณหภม 80 C ประมาณ 5 min หรอจนกวาจะเหน

สารสกดแยกชน จากนนนาตวอยางไป centrifuge ทความเรว 3,000 rpm

นาน 10 min อกครงหนง

7.1.1.4 ดดสารสกดสวนใสชนลาง (dilution buffer) ใสใน microcentrifuge tube

ขนาด 1.5 ml สารละลายทไดไปตรวจวเคราะหตอในขนการตรวจหาปรมาณ

7.1.2 นม และไขผง

7.1.2.1 ปเปตตวอยางทแยกไขมนออกแลว ปรมาตร 3 ml ใสใน centrifuge tube

ขนาด 30 ml เตม ethyl acetate 9 ml ลงในหลอดตวอยาง นาไปปนดวย

vortex mixer 1 min นาไปเขยาดวยเครองเขยานาน 10 min แลวนาไป

centrifuge ทความเรว 3,000 rpm นาน 10 min

7.1.2.2 ปเปตสารสกดสวนใสปรมาตร 6 ml ใสใน test tube ขนาด 10 ml ระเหย

สารละลายทไดจนแหงดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 50 C

7.1.2.3 ละลาย residue ดวย hexane 400 µl และ dilution buffer 200 µl นาไปปนดวย

vortex mixer นาน 1 min จากนนทาใหแยกชนโดยนามา centrifuge ทความเรว

3,000 rpm นาน 10 min



7.1.3 นาผง

7.1.3.1 ชงตวอยางนาหนก 3 g ใสใน centrifuge tube ขนาด 30 ml เตม H2O 3 ml

นาไปปนดวย vortex mixer นาน 1 min

72


7.1.3.2 เตม ethyl acetate 6 ml ลงในหลอดตวอยาง นาไปปนดวย vortex mixer

นาน 1 min นาไปเขยาดวยเครองเขยานาน 10 min แลวนาไป centrifuge

ทความเรว 3,000 rpm นาน 10 min

7.1.3.3 ปเปตสารสกดสวนใส 4 ml ใสใน test tube ขนาด 10 ml ระเหยสารละลาย

ทไดจนแหงดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 50 C

7.1.3.4 ละลาย residue ดวย hexane 1 ml และ dilution buffer 1 ml นาไปปนดวย

vortex mixer นาน 1 min จากนนทาใหแยกชนโดยนามา centrifuge ทความเรว

3,000 rpm นาน 10 min



7.1.4 ไข

7.1.4.1 ชงตวอยาง 1 g ใสใน centrifuge tube ขนาด 30 ml เตม ethyl acetate 6 ml

ลงในหลอดตวอยาง นาไปปนดวย vortex mixer นาน 1 min นาไปเขยาดวย

เครองเขยานาน 10 min แลวนาไป centrifuge ทความเรว 3,000 rpm นาน

10 min

7.1.4.2 ปเปตสารสกดสวนใส 3 ml ใสใน test tube ขนาด 10 ml ระเหยสารละลาย

ทไดจนแหงดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 50 C ละลาย residue ดวย

hexane 1 ml และ dilution buffer 500 µl นาไปปนดวย vortex mixer

นาน 1 min จากนนทาใหแยกชนโดยนามา centrifuge ทความเรว 3,000 rpm

นาน 10 min




7.2.1 นา microtiter plate ออกมาเทาทจะใช ทเหลอเกบใสถงพลาสตกปดใหสนทเกบไว

ในตเยน

7.2.2 ปเปต zero standard 100 µl ลงในหลม 2 ซา (well A1, A2) ใชเปน blank

ปเปต zero standard 50 µl ลงในหลม 2 ซา (well B1, B2)

ปเปตสารมาตรฐานทมาในชดตรวจ 50 µl แตละความเขมขน (0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5

และ 2.0 ng/ml) 2 ซา (well C1,2 ถง H1,2)

ปเปตสารตวอยางทสกดได 50 µl ลงในหลม 2 ซา



73


7.2.4 ผสม lyophilised antibody ดวย dilution buffer 4 ml แลวปเปต antibody 25 µl ใสลง

ในหลมททดสอบทกหลม ยกเวนหลม A1 และ A2

7.2.5 ใช parafilm ปด microtiter plate แลวเขยา plate เบา ๆ ในแนวนอน ประมาณ 1 min

นา plate ไปบม (incubate) ในตเยนอณหภม 4 C (2 C ถง 8 C ) นาน 1 hr

7.2.6 เมอครบเวลา เทสารละลายใน microtiter plate ทง และลาง microtiter plate ดวย rinsing

solution 3 ครง ครงละ 300 µl ดวย automated strip washer ทา plate ใหแหงโดยควา

plate ลงบนกระดาษเนอนมและไมมขน เคาะ plate จนแนใจวาไมมหยดนาเกาะ

ใน plate



20-25 C) ในทมด นาน 30 min



450 nm ทนท




8.3 นา O.D. well A1, A2 (blank) ลบออกจากคาเฉลยของ O.D. ทอานไดจากทกหลม

(ทงสารมาตรฐานและตวอยาง)

% maximal absorbance = O.D. standard (หรอ ตวอยาง) × 100

O.D. zero standard


ของความเขมขนของสารมาตรฐาน CAP บนแกน X

8.5 ปรมาณ CAP ทตรวจพบ คานวณไดจากความสมพนธของ % maximum absorbance

และความเขมขนของสารมาตรฐาน โดยม multiplying factor ดงน

เนอสตว 2 นม 1

ไข 1

นาผง 2

ชนดตวอยาง multiplying factor

74


8.6 รายงานปรมาณ Chloramphenicol ทตรวจพบ หนวย ไมโครกรมตอกโลกรม ทศนยม





9.1.2 คา Correlation coefficient, r ของ calibration curve ตองมคามากกวาหรอเทากบ 0.98


หรอตรวจพบปรมาณ CAP ทมปรมาณสงกวาคา LOQ แตปรมาณทตรวจพบมความ

แตกตางกน (% RPD > 30) ตวอยางนน ตองลง plate ใหม


9.2.1 วเคราะห method blank ทกครงททาการวเคราะห โดยคา method blank ทอานไดตอง

นอยกวาคา LOD

9.2.2 วเคราะห duplicate sample (สกด 2 ซา) อยางนอยรอยละ 10 ของตวอยาง กรณ duplicate

sample ตรวจพบปรมาณสารกลม ß-agonists มปรมาณสงกวาคา LOQ ใหคานวณ

RPD โดย RPD ตองนอยกวา 30


1 ตวอยางใน 1 ชดของการวเคราะห คานวณ % recovery (เกณฑยอมรบอยในชวง

60-120%)



ตรวจวเคราะหการปนเป อนสารเคมบางชนดในอาหาร ลงวนท 18 สงหาคม 2549




75


DMSc F 1067: การตรวจวเคราะหสารเคมกลมเบตาอะโกนสต (brombuterol,

clenbuterol, ractopamine และ salbutamol) ในเนอสตว

และตบ โดยเทคนค LC-MS/MS

Determination of ß-agonists (brombuterol, clenbuterol,

ractopamine and salbutamol) in animal meat and liver

by LC-MS/MS


ใชเปนวธตรวจวเคราะห (และตรวจยนยน) สารเคมกลมเบตาอะโกนสต 4 ชนด ไดแก brombuterol,

clenbuterol, ractopamine และ salbutamol ในเนอสตว และตบ โดยเทคนค LC-MS/MS โดยมคา

LOD และ LOQ ดงน


2.1 Williams LD, Churchwell MI, Doerge DR. Multiresidue confirmation of ß-agonist in

bovine retina and liver using LC-ES/MS/MS. Journal of Chromatography B. 2004;

813: 35-45.

2.2 Commission Decision of 12 August 2002 (2002/657/EC) Official Journal of the European

Communities L 221, 17.8.2002: 8-36.


สาร brombuterol, clenbuterol, ractopamine และ salbutamol จะถกสกดออกจากตวอยาง ดวย

0.01 M HCl จากนนนาสารทสกดไดไปทาใหบรสทธดวยวธ solid-phase extraction โดยผาน

เนอสตว ( µµ/kg) ตบ (µ/g/kg)

LOD LOQ LOD LOQ analyte

brombuterol 0.3 0.5 0.5 1.0

clenbuterol 0.3 0.5 0.5 1.0

ractopamine 0.3 0.5 0.5 1.0

salbutamol 0.3 0.5 0.5 1.0

76


extraction cartridges-MCX mode ระเหยสารทสกดได (eluate) จนแหง ละลาย residue ดวย

สารละลายผสมของ 5% MeOH ใน 0.1% formic acid จากนนตรวจชนดและปรมาณโดยเครองมอ

LC-MS/MS คานวณปรมาณจาก calibration curve ท plot ระหวาง peak area ratio ของสาร

มาตรฐาน และ internal standard กบ concentration ratio ของสารมาตรฐาน และ internal

standard โดยใช clenbuterol-d9 เปน internal standard สาหรบทดสอบสาร brombuterol

และ clenbuterol ractopamine-d6 เปน internal standard สาหรบทดสอบสาร ractopamine

และ salbutamol-d3 เปน internal standard สาหรบทดสอบสาร salbutamol วธนอางองวธของ

Williams LD และคณะ โดยปรบเพมนาหนกตวอยาง จาก 200 mg เปน 1 g และใช SPE: mix mode

MCX 3cc แทน 1cc และไดแสดงขอมลผลการทดสอบความใชได โดยหองปฏบตการเดยว

(Single laboratory method validation) ในขอ 10.2



4.1.1 เครองชง อานคาไดละเอยดอยางนอย 0.01 g

4.1.2 เครองชง (analytical balance) ทมความละเอยด 0.0001 g


4.1.4 centrifuge สามารถทาความเรวได 5,500 rpm

4.1.5 homogenizer

4.1.6 refrigerator centrifuge


4.1.8 SPE vacuum manifold

4.1.9 vortex mixer

4.1.10 pH meter

4.1.11 LC-MS/MS system ประกอบดวย

- binary pump: Agilent 1100 series

- autosampler: Agilent 1100 series

- microvacuum degasser: Agilent 1100 series

- thermostatted column compartment: Agilent 1100 series

- triple quadrupole mass spectrometer: API 4000

77




4.2.2 test tube ขนาด 10 ml

4.2.3 glass funnel

4.2.4 glass microfibre filters ขนาด od 55 mm

4.2.5 membrane filters ชนด cellulose nitrate ขนาด od 47 mm, 0.45 µm

4.2.6 filtering device for HPLC eluents

4.2.7 micro-spin filter 0.45 µm PVDF (Alltech Cat No. 24144)

4.2.8 HPLC vials สชา ขนาด 2 ml

4.2.9 Oasis MCX 3cc (60 mg) extraction cartridges (Waters Corp., Part No. 186000254)


5.1 สารเคมทกชนดเปนระดบ AR grade หรอเทยบเทา ยกเวนทระบไวเปนอยางอน

5.1.1 methanol, MeOH (HPLC grade หรอเทยบเทา)

5.1.2 acetonitrile, CH3CN (HPLC grade หรอเทยบเทา)

5.1.3 ammonium hydroxide, NH4OH

5.1.4 ammonium acetate, NH4OAc

5.1.5 hydrochloric acid, HCl

5.1.6 formic acid, HCOOH

5.1.7 glacial acetic acid, CH3 COOH


5.2.1 10 mM NH4OAc pH 5: ชง NH4OAc 0.771 g ละลายดวย H2O แลวปรบ

pH 5.00 ± 0.05 โดยใช glacial acetic acid จากนนปรบปรมาตรเปน 1,000 ml

ดวย H2O

5.2.2 5% NH4OH in MeOH: ปเปต NH4OH 5 ml ลงใน MeOH และปรบปรมาตรเปน

100 ml ดวย MeOH

5.2.3 1 M HCOOH: ปเปต HCOOH 3.9 ml ลงใน H2O และปรบปรมาตรเปน 100 ml

5.2.4 0.01 M HCl: ปเปต HCl 0.9 ml ลงใน H2O และปรบปรมาตรเปน 1,000 ml

5.2.5 mobile phase A, 0.1% HCOOH ใน H2O: ปเปต HCOOH 1.0 ml ลงใน H2O และ

ปรบปรมาตรเปน 1,000 ml แลวกรองผาน membrane filter ชนด cellulose nitrate

ขนาด od 47 mm, 0.45 µm ดวย filtering device for HPLC eluents

78


5.2.6 5% MeOH in mobile phase A: ปเปต MeOH 5 ml แลวปรบปรมาตรเปน 100 ml ดวย

mobile phase A

5.3 สารมาตรฐาน (standards)

5.3.1 brombuterol hydrochloride ความบรสทธมากกวา 99%

5.3.2 clenbuterol hydrochloride ความบรสทธมากกวา 98.5%

5.3.3 ractopamine hydrochloride ความบรสทธมากกวา 96.0%

5.3.4 salbutamol free base ความบรสทธมากกวา 99.5%

5.3.5 internal standard

5.3.5.1 salbutamol-d3 ความเขมขน 100 mg/l

5.3.5.2 clenbuterol-d9 ความเขมขน 100 mg/l

5.3.5.3 ractopamine-d6 hydrochloride

5.3.6 การเตรยมสารมาตรฐาน เนองจากสารมาตรฐานอยในรป salt base จะตองคานวณ

ปรมาณตาม formula และความบรสทธของสารมาตรฐานแตละตว ตวอยาง เชน

ractopamine hydrochloride ม HCl 1 โมเลกล MW เทากบ 337.8 และมความบรสทธ 96%

ดงนน ถาตองการชงนาหนก 10 mg ตองชง (337.8 × 10) × 100 = 11.68 mg

301.2 × 96

5.5 การเตรยม stock standard solution ความเขมขน 200 µg /ml: ชงสารมาตรฐานประมาณ

10 mg โดยใชเครองชงความละเอยดอยางนอย 0.1 mg คานวณนาหนกทตองชงตามขอ 5.3.6

ละลาย และปรบปรมาตรเปน 50 ml ดวย MeOH เกบในตเยน 2-8 C มอายการใชงาน 1 ป

5.6 การเตรยม mixed working standard solution (brombuterol, clenbuterol, ractopamine

และ salbutamol)

5.6.1 mixed working standard solution ความเขมขน 1 µg/ml: ปเปต stock standard

solution brombuterol, clenbuterol, ractopamine และ salbutamol ความเขมขน

200 µg/ml ชนดละ 250 µl ปรบปรมาตรเปน 50 ml ดวย MeOH เกบในตเยน 2-8 C

มอายการใชงาน 4 เดอน

5.6.2 mixed working standard solution ความเขมขน 100 ng/ml: ปเปต mixed working

standard solution (5.6.1) 1 ml ปรบปรมาตรเปน 10 ml ดวย MeOH เกบในตเยน

2-8 C มอายการใชงาน 4 เดอน

5.6.3 mixed working standard solution ความเขมขน 10 ng/ml: ปเปต mixed working

standard solution (5.6.2) 1 ml ปรบปรมาตรเปน 10 ml ดวย MeOH เกบในตเยน

2-8 C อายการใชงาน 4 เดอน

79


5.7 การเตรยม stock internal standard ractopamine-d6 hydrochloride ความเขมขน 100 µg/ml:

ละลาย internal standard ractopamine-d6 1 mg และปรบปรมาตรเปน 10 ml ดวย MeOH

5.8 การเตรยม intermediate internal standard salbutamol-d3 solution ความเขมขน 10 µg/ml:

ปเปต stock internal standard salbutamol-d3 solution 1ml ปรบปรมาตรเปน 10 ml ดวย

MeOH เกบในตเยน 2-8 C อายการใชงานตามสารตงตน

5.9 การเตรยม intermediate internal standard clenbuterol-d9 solution ความเขมขน 10 µg/ml:

ปเปต stock internal standard clenbuterol-d9 solution 1 ml ปรบปรมาตรเปน 10 ml ดวย

MeOH เกบในตเยน 2-8 C อายการใชงานตามสารตงตน

5.10 การเตรยม intermediate internal standard ractopamine-d6 solution ความเขมขน 10 µg/ml:

ปเปต stock internal standard ractopamine-d6 1 ml ปรบปรมาตรเปน 10 ml ดวย MeOH

เกบในตเยน 2-8 C อายการใชงานตามสารตงตน

5.11 การเตรยม mix working internal standard solution ความเขมขน 100 ng/ml ปเปต intermediate

internal standard clenbuterol-d9, ractopamine-d6, salbutamol-d3 ความเขมขน 10 µg/ml

ชนดละ 500 µl ปรบปรมาตรเปน 50 ml ดวย MeOH เกบในตเยน 2-8 C มอายการใชงาน

4 เดอน


6.1 ตวอยางเนอสตวและตบ นาหนกอยางนอย 300 g ตดสวนทเปนไขมนออก หนเปนชนเลกๆ

จากนนบดใหละเอยดดวยเครองบดเนอ

6.2 ชงตวอยางเนอสตว และตบทบดละเอยด นาหนก 1.0 g ใสใน screw cap centrifuge tube

ขนาด 50 ml



7.1.1 เตม mix working internal standard solution (5.11) ปรมาตร 30 µl และ 0.01 M HCl

ปรมาตร 3 ml ในหลอดตวอยาง แชหลอดตวอยางในอางนาแขง จากนนปนผสมดวย

homogenizer ประมาณ 30 sec

7.1.2 ลางหวปน homogenizer ดวย 0.01 M HCl ประมาณ 2 ml รวมใสในหลอดตวอยาง

จากนนปนดวย vortex mixer ประมาณ 1 min

7.1.3 นาตวอยางทไดไป centrifuge ท 4 C ความเรว 5,500 rpm ประมาณ 15 min

7.1.4 กรองสารละลายสวนใสดวย glass microfibre filters ใสลงใน test tube ขนาด 10 ml

80


7.2 การ clean-up

7.2.1 เตรยม Oasis MCX 3cc (60 mg) extraction cartridges ตอเขากบ SPE vacuum manifold

7.2.2 activate cartridges ดวย 5% NH4OH/MeOH 2 ml และ MeOH ปรมาตร 2 ml

ตามลาดบโดยปรบ flow rate ประมาณ 2 ml/min และ equilibrate cartridges ดวย

10 mM NH4OAc buffer pH 5 2 ml

7.2.3 ถายสารสกดทไดทงหมดลงใน cartridge (ทง eluate) ลาง (rinse) test tube ดวย 10

mM NH4OAc buffer pH 5 ปรมาตร 2 ml และถายลง cartridge (ทง eluate) แลว

ลาง test tube ดวย 1 M HCOOH ปรมาตร 2 ml และถายลง cartridge (ทง eluate)

7.2.4 ปลอยให cartridge แหง โดย vacuum ประมาณ 30 sec แลว ลาง cartridge ครงสดทาย

ดวย MeOH ปรมาตร 2 ml (ทง eluate)

7.2.5 ชะ (elute) cartridge ดวย 5%NH4OH/MeOH ปรมาตร 2 ml เกบ eluate ใน test tube

ขนาด 10 ml แลว ระเหย eluate จนแหง ดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 40-45 C

7.2.6 ละลาย residue ดวยสารละลาย 5% MeOH ใน mobile phase A ปรมาตร 500 µl

จากนน นาไปปนดวย vortex mixer 30 sec แลว ถายสารละลายตวอยางใส micro-spin

filters ชนด PVDF นาไป centrifuge ทความเรว 5,500 rpm นาน 10 min

7.2.7 เทสารละลายทกรองไดใสใน HPLC vials สชา ขนาด 2 ml นาไปวเคราะหตอโดย

เครองมอ LC-MS/MS (ถาไมสามารถตรวจวเคราะหโดยเครอง LC-MS/MS

ไดในทนท ใหเกบตวอยางทสกดไดไวในตเยน ทอณหภม 5 ± 3 C ไดไมเกน 2 สปดาห)

7.3 การสราง calibration curve (matrix-matched calibration curve)

7.3.1 ชง matrix blank นาหนก 1 g ใสใน screw cap centrifuge tube ขนาด 50 ml จานวน

7 หลอด สกด (ไมตองเตม internal standard) และ clean up จากนนเตมสารละลาย

มาตรฐาน brombuterol, clenbuterol, ractopamine, salbutamol และ internal standard

ทง 3 สาร ความเขมขนตางๆ ดงตาราง

7.3.2 สราง calibration curve ระหวาง peak area ratio (peak area of standard/peak area of

internal standard) กบ concentration ratio (concentration of standard/ concentration

of internal standard)

81


7.4 การหาปรมาณดวยเครองมอ LC-MS/MS

7.4.1 สภาวะเครองมอ LC

analytical column: Zorbax SB C-18 (150 mm × 3 mm, 5 µm)

guard column: Zorbax SB-C18 (12.5 mm × 4.6 mm, 5µm)

mobile phase: A - 0.1% formic acid, B - CH3CN

flow rate: 0.6 ml/min

injection volume: 10 µl

column temperature: 25 C

gradient LC mobile phase

ความเขมขน ปรมาตร ปรมาตร standard ทใช (µl) (ng/g) internal standard 100 ng/ml (µl) 10 ng/ml 100 ng/ml

0.0 30 - - 0.5 30 50 - 1.0 30 100 - 2.0 30 200 - 3.0 30 - 30 5.0 30 - 50 10.0 30 - 100

0.0 95 5

3.0 – 5.0 80 20

5.5 – 6.5 50 50

8.0 – 11.0 5 95

12.5 - 15.0 95 5

time (min) % mobile phase A % mobile phase B

7.4.2 สภาวะเครองมอ MS

ionization mode: ESI (turbo spray) positive

scan type: MRM

ion spray voltage 5500 eV

82


temperature 500 C

collision gas: nitrogen 5 psig

curtain gas (CUR) 20 psig

ion spray nebulizer gas (GS-1) 52 psig

TIS Heater Gas (GS-2) 58 psig

entrance potential (EP) 10 V

MS/MS fragmentation conditions

brombuterol 367.3 ± 0.5 212.1 ± 0.5 (secondary) 293.1 ± 0.5 (primary)

clenbuterol 277.2 ± 0.5 168.2 ± 0.5 (tertiary) 132.2 ± 0.5 (secondary) 203.1 ± 0.5 (primary)

ractopamine 302.3 ± 0.5 106.9 ± 0.5 (secondary) 164.0 ± 0.5 (primary)

salbutamol 240.3 ± 0.5 222.3 ± 0.5 (secondary) 148.1 ± 0.5 (primary)

clenbuterol-d9 286.1 ± 0.5 203.8 ± 0.5 (primary)

ractopamine-d6 308.3 ± 0.5 168.1 ± 0.5 (primary)

salbutamol-d3 243.4 ± 0.5 151.2 ± 0.5 (primary)

component precursor ion product ion (m/z) (m/z)

หมายเหต การคานวณปรมาณ clenbuterol ในกรณทพบสญญาณรบกวน ใหใช mass 168.2 ± 0.5

เปน mass ยนยน



คานวณความเขมขนของสารทตรวจพบจาก calibration curve

ปรมาณของสารทตรวจพบ, CA (µg/kg) = (Y - b) × CIS

a

83


โดย CA = conc. of analyte

Y = peak area ratio

b = intercept ของ calibration curve

a = slope ของ calibration curve

CIS = conc. of internal standard

8.2 รายงานปรมาณทตรวจพบ หนวยเปนไมโครกรมตอกโลกรม ทศนยม 1 ตาแหนง

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)9.1 สราง calibration curve ระหวาง peak area ratio กบ concentration ratio ทกครงททาการ

วเคราะห โดยคา Correlation coefficient, r ของ calibration curve ตองมคามากกวาหรอ

เทากบ 0.98

9.2 ทดสอบ method blank และ matrix blank ทกครง ททาการวเคราะห

9.3 คานวณ % Relative intensities ของ analyte ion intensities ratio กบ standard ion

intensities ratio เพอยนยนการตรวจพบ โดย % Relative intensities ตองนอยกวาหรอ

เทากบ ± 20%

% Relative intensities = (ranalyte - rstd) × 100

rstd

โดย ranalyte = ratio ของ secondary ion intensities ตอ primary ion intensities

ของ analyte

rstd = ratio ของ secondary ion intensities ตอ primary ion intensities

ของ standard

rstd = คาเฉลยของ rstd ทกความเขมขนของ calibration curve

9.4 วเคราะห spiked matrix ทระดบความเขมขน 2.5 µg/kg เพอประเมน % Recovery ทกครง

ททาการวเคราะห โดย % Recovery ตองอยในเกณฑยอมรบ ชวง 50-120%

9.5 วเคราะห duplicate sample ทกครง ททาการวเคราะห กรณตวอยางมจานวนมาก วเคราะห

10% ของจานวนตวอยาง กรณตรวจพบ ปรมาณสงกวาคา LOQ ใหคานวณ Relative Percent

Difference (RPD) โดย RPD ตองนอยกวาหรอเทากบ 25%



ตรวจวเคราะหการปนเปอนสารเคมบางชนดในอาหาร ลงวนท 18 สงหาคม พ.ศ.2549

กาหนดวาจะตองใชวธการตรวจวเคราะหไดอยางนอยตาถงระดบ 1 µg/kg

84


10.2 ผลการตรวจสอบความใชได (Method validation) ของวธ โดยหองปฏบตการฝายสารกาจด

ศตรพชและยาสตวตกคาง สานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร ใน matrix เนอหม

และตบหม ดาเนนการเมอเมษายน 2558

10.2.1 การทดสอบความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐาน (calibration curve: matrix

matching) ชวง concentration ratio ของ 0.17, 0.33, 0.66, 1.0, 1.7 และ 3.3 ซงเทากบ

ความเขมขนของสารมาตรฐาน 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 และ 10.0 µg/kg ไดคา

Correlation coefficient, r มากกวา 0.98

10.2.2 การยนยนคา Limit of Detection (LOD) ทระดบความเขมขน 0.3 µg/kg ในเนอหม

และความเขมขน 0.5 µg/kg ในตบหม ทาการทดสอบโดยเตมสารมาตรฐาน

brombuterol, clenbuterol, ractopamine และ salbutamol ลงในตวอยางเนอหม

และตบหม ชนดละ 10 ตวอยาง ผลตรวจพบทกตวอยาง โดยคา signal-to-noise

ratio (S/N ratio) มากกวา 3 และ % Relative intensities นอยกวา ± 20%


brombuterol, clenbuterol, ractopamine และ salbutamol ทระดบความเขมขน

0.5 µg/kg ลงในตวอยางเนอหม 10 ซา

Brombuterol 85.5 - 99.4 92.5 ± 4.24 4.58Clenbuterol 98.4 - 100.2 99.4 ± 0.69 0.69Ractopamine 100.6 - 107.4 105.1 ± 2.32 2.21Salbutamol 95.2 - 100.2 97.3 ± 1.84 1.89

สารมาตรฐาน %RSD

คาตาสด - คาสงสด Mean ± SD

% Recovery


brombuterol, clenbuterol, ractopamine และ salbutamol ทระดบความเขมขน

1.0 µg/kg ลงในตวอยางตบหม 10 ซา

Brombuterol 63.0 - 72.3 69.2 ± 3.20 4.62Clenbuterol 101.00 - 106.0 103.1 ± 1.79 1.74Ractopamine 100.0 - 108.0 102.4 ± 2.22 2.17Salbutamol 101.0 - 105.0 102.8 ± 1.32 1.28

สารมาตรฐาน %RSD

คาตาสด – คาสงสด Mean ± SD

% Recovery

85


10.2.5 Accuracy และ Precision ทาการทดสอบโดยเตม สารมาตรฐาน brombuterol,

clenbuterol, ractopamine และ salbutamol ทระดบความเขมขน 1.0, 2.5, 5.0

และ 10.0 µg/kg ลงในตวอยางเนอหม 10 ซา

Brombuterol 1.0 86.9 - 99.6 93.6 ± 4.52 4.83

2.5 80.5 - 95.6 88.4 ± 4.81 5.44

5.0 88.8 - 97.0 91.9 ± 2.62 2.85

10.0 83.5 - 98.4 88.4 ± 5.14 5.81

Clenbuterol 1.0 98.4 - 104.0 100.6 ± 1.81 1.80

2.5 95.2 - 101.6 98.0 ± 1.88 1.92

5.0 95.2 - 100.2 98.5 ± 1.89 1.92

10.0 98.2 - 101.0 99.6 ± 0.86 0.86

Ractopamine 1.0 97.4 - 102.0 100.4 ± 1.73 1.72

2.5 95.6 - 99.6 97.5± 1.50 1.54

5.0 95.0 - 100.0 97.9 ± 1.69 1.72

10.0 97.8 - 101.0 99.4 ± 0.91 0.92

Salbutamol 1.0 97.6 - 103.0 99.8 ± 1.61 1.61

2.5 96.0 - 99.6 97.6 ± 1.34 1.37

5.0 97.6 - 100.4 98.8 ± 0.92 0.93

10.0 97.3 - 101.0 99.4 ± 1.06 1.06


Spiked level % Recovery %RSD

(µg/kg) คาตาสด - คาสงสด Mean ± SD

86


10.2.6 Accuracy และ Precision ทาการทดสอบโดยเตม สารมาตรฐาน brombuterol,

clenbuterol, ractopamine และ salbutamol ทระดบความเขมขน 2.5, 5.0

และ 10.0 µg/kg ลงในตวอยางตบหม 10 ซา


Spiked level % Recovery %RSD

(µg/kg) คาตาสด - คาสงสด Mean ± SD

Brombuterol 2.5 94.4 - 104.0 99.4 ± 3.09 3.11

5.0 80.5 - 95.6 88.4 ± 4.81 5.44

10.0 95.0 - 103.0 100.9 ± 2.28 2.26

Clenbuterol 2.5 96.0 - 102.4 98.4 ± 1.80 1.83

5.0 96.8 - 100.4 99.7 ± 1.03 1.03

10.0 99.4 - 101.0 100.2 ± 0.56 0.55

Ractopamine 2.5 94.0 - 101.2 97.9 ± 2.60 2.65

5.0 97.4 - 100.6 99.8 ± 0.94 0.94

10.0 97.8 - 102.0 100.3 ± 1.28 1.28

Salbutamol 2.5 96.0 - 100.0 97.1 ± 1.36 1.40

5.0 97.4 - 100.8 99.4 ± 1.16 1.17

10.0 100.0 - 102.0 100.9 ± 0.74 0.73

87


DMSc F 1068: การตรวจวเคราะหสารปฏชวนะคลอแรมเฟนคอลในเนอสตว

โดยเทคนค LC-MS/MS

Determination of chloramphenicol in animal meat

by LC-MS/MS


ใชเปนวธตรวจวเคราะห (และตรวจยนยน) สารปฏชวนะคลอแรมเฟนคอล (chloramphenicol CAP)

ในเนอสตวและตบ โดยเทคนค LC-MS/MS โดยมคา LOD เทากบ 0.03 µg/kg และ LOQ เทากบ

0.05 µg/kg


2.1 Hammack W, Carson MC, Neuhaus BK, Hurlbut JA, Nochetto C, Stuart JS, et al.

Multilaboratory validation of a method to confirm chloramphenicol in shrimp and crabmeat

by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J AOAC International 2003; 86 (6):

1135-1143.

2.2 Commission Decision of 12 August 2002 (2002/657/EC) Official Journal of the European

Communities L 221, 17.8.2002: 8-36.


CAP จะถกสกดออกจากตวอยางดวย ethyl acetate และถกดงไขมนออกดวย hexane จากนน

เมอระเหยชน organic solvent จนแหง ละลาย residue ดวยสารละลายผสมของ methanol: H2O

(1:1) จากนนตรวจหาปรมาณโดยเครองมอ LC-MS/MS คานวณปรมาณจาก calibration curve

ท plot ระหวาง peak area ratio ของสารมาตรฐาน และ internal standard และ concentration ratio

ของสารมาตรฐาน และ internal standard



4.1.1 เครองชง อานคาไดละเอยดอยางนอย 0.01 g

4.1.2 เครองชง (analytical balance) ทมความละเอยด 0.0001 g

88



4.1.4 centrifuge สามารถทาความเรวได 3,000 rpm

4.1.5 homogenizer

4.1.6 shaker


4.1.8 vortex mixer

4.1.9 rotary evaporator

4.1.10 LC-MS/MS system, ประกอบดวย

- binary pump: Agilent 1100 series

- autosampler: Agilent 1100 series

- micro vacuum degasser: Agilent 1100 series

- thermostatted column compartment: Agilent 1100 series

- triple quadrupole mass spectrometer: API 4000


4.2.1 screw cap centrifuge tube ขนาด 15 และ 50 ml

4.2.2 micro-spin filter 0.45 µm PVDF (Alltech Cat No. 24144)

4.2.3 micro pipette ขนาด 20-200 µl และ 100-1000 µl

4.2.4 volumetric flask ขนาด 10, 50,100 ml และ 1 L

4.2.5 round bottomed flask ขนาด 125 ml

4.2.6 separatory funnel ขนาด 125 ml

4.2.7 glass funnel

4.2.8 membrane filters ชนด PVDF ขนาด od 47 mm, 0.45 µm

4.2.9 filtering device for HPLC eluents

4.2.10 HPLC vials สชา ขนาด 2 ml


5.1 สารเคมทกชนดเปนระดบ AR grade หรอเทยบเทา ยกเวนทระบไวเปนอยางอน

5.1.1 methanol, MeOH (HPLC grade หรอเทยบเทา)

5.1.2 acetonitrile, CH3CN (HPLC grade หรอเทยบเทา)

5.1.3 ethyl acetate, EtOAc (HPLC grade หรอเทยบเทา)

5.1.4 hexane

89


5.1.5 formic acid, HCOOH

5.1.6 sodium chloride, NaCl

5.1.7 sodium sulfate anhydrous


5.2.1 4% NaCl solution: ละลาย NaCl 4 g ดวย H2O และปรบปรมาตรเปน 100 ml

5.2.2 mobile phase A, 0.1% HCOOH ใน H2O: ปเปต HCOOH 1.0 ml ลงใน H2O

และปรบปรมาตรเปน 1,000 ml แลวกรองผาน membrane filters ขนาด 47 mm,

0.45 µm ดวย filtering device for HPLC eluents

5.3 สารมาตรฐาน (Standards)

5.3.1 chloramphenicol ความบรสทธมากกวา 98.5%

5.3.2 internal standard deuterated chloramphenicol, CAP-d5 ความเขมขน 100 µg/ml

หรอเทยบเทา

5.4 การเตรยมสารมาตรฐาน

5.4.1 การเตรยม stock standard solution ความเขมขน 1 mg/ml: ชงสารมาตรฐานประมาณ

10 mg ใชเครองชงความละเอยดอยางนอย 0.1 mg ละลายและปรบปรมาตรเปน 10 ml

ดวย MeOH เกบในตเยน 2-8 C มอายการใชงาน 1 ป

5.4.2 การเตรยม intermediate standard solution ความเขมขน 10 µg/ml: ปเปต stock standard

solution 500 µl ปรบปรมาตรเปน 50 ml ดวย MeOH เกบในตเยน 2-8 C มอาย

การใชงาน 4 เดอน

5.4.3 การเตรยม working standard solution ความเขมขน 100 ng/ml: ปเปต intermediate

standard solution 500 µl ปรบปรมาตรเปน 50 ml ดวย MeOH เกบในตเยน 2-8 C

มอายการใชงาน 4 เดอน

5.4.4 การเตรยม intermediate internal standard CAP-d5 solution ความเขมขน 10 µg/ml:

เจอจาง stock internal standard CAP-d5 1 ml ปรบปรมาตรเปน 10 ml ดวย MeOH

เกบในตเยน 2-8 C อายการใชงานตามสารตงตน

5.4.5 การเตรยม working standard CAP-d5 solution ความเขมขน 100 ng/ml: ปเปต

intermediate standard CAP-d5 solution 500 µl ปรบปรมาตรเปน 50 ml ดวย MeOH

เกบในตเยน 2-8 C มอายการใชงาน 4 เดอน

90



6.1 เนอสตวเฉพาะสวนเนอ นาหนกประมาณ 300-500 g หนเปนชนเลกๆ จากนนบดใหละเอยด

ดวยเครองบดเนอ

6.2 ชงตวอยางเนอสตวทบดละเอยดนาหนก 10.0 g ใชเครองชงความละเอยดอยางนอย 0.01 g

ใสใน screw cap centrifuge tube ขนาด 50 ml



7.1.1 เตม working internal standard CAP-d5 ความเขมขน 100 ng/ml ปรมาตร 50 µl

ลงในตวอยางทเตรยมไว ตงไวประมาณ 15 min

7.1.2 สกดดวย EtOAc 20 ml โดยนาไปปนดวย vortex mixer ประมาณ 1 min หรอจนกวา

ตวอยางจะแตกละเอยด (กรณตวอยางแตกตวยากใช homogenize ดวย homogenizer

นานประมาณ 30 sec) เขยาตอดวย shaker นาน 10 min

7.1.3 นาตวอยางทไดไป centrifuge ท 3,000 rpm นาน 5 min ดดชน EtOAc ใสใน

round bottomed flask ขนาด 125 ml

7.1.4 นาสวนตะกอนนามาเตม EtOAc 20 ml นาไปปนดวย vortex mixer ประมาณ 1 min

แลว centrifuge ท 3,000 rpm นาน 5 min ดดชน EtOAc รวมลงใน round bottomed flas

7.1.5 ระเหย EtOAc ทไดจนแหงดวย เครอง rotary evaporator ทอณหภม 40-45 C

7.1.6 ละลาย residue ดวย MeOH 2 ml และถายสารละลายทไดลงใน separatory funnel

ขนาด 125 ml เตม 4% NaCl 25 ml เขยาประมาณ 30 sec เตม hexane 20 ml

เขยาประมาณ 1 min ตงทงใหแยกชน และทงชน hexane (ชนบน) ชน aqueous

นามาสกดซาอก 1 ครง ดวย hexane 20 ml

7.1.7 ชน aqueous นามาสกดตอดวย EtOAc 15 ml เขยาประมาณ 1 min วางทงใหแยก

ชน กรอง EtOAC ทไดผาน sodium sulfate anhydrous ลงใน screw cap centrifuge tube

ขนาด 15 ml ระเหยชน EtOAc จนแหงดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 40-45 C

7.1.8 สกดชน aqueous อกครงดวย EtOAc 15 ml เขยาประมาณ 1 min วางทงใหแยก

ชนกรอง EtOAc ทไดผาน sodium sulfate anhydrous รวมลงใน screw cap centrifuge tube

และลาง sodium sulfate anhydrous ดวย EtOAc 1-2 ครง ครงละประมาณ 1 ml ระเหย

ชน EtOAc จนแหงดวย nitrogen evaporator ทอณหภม 40-45 C

7.1.9 ละลาย residue ดวย MeOH: H2O (1:1) 1.0 ml ถายสารละลายตวอยางใส micro-spin filters

ชนด PVDF นาไป centrifuge ท 3,000 rpm นาน 5 min เทสารละลายทกรองได

ใสใน HPLC vials สชา ขนาด 2 ml นาไปวเคราะหปรมาณโดยเครอง LC-MS/MS

91


7.2 สราง calibration curve ระหวาง peak area ratio (peak area of standard / peak area of internal

standard) กบ concentration ratio (concentration of standard/ concentration of internal

standard) โดยใชปรมาตรของ standard และ internal standard ตามตาราง แลวปรบปรมาตรเปน

5 ml ดวย MeOH: H2O (1:1)

0.5 250 25

1.0 250 50

2.0 250 100

5.0 250 250

10.0 250 500

20.0 250 1,000

ความเขมขน ปรมาตร (µl) ปรมาตร (µl) (ng/ml) internal standard 100 ng/ml ทใช standard 100 ng/ml ทใช

7.3 การหาปรมาณดวยเครองมอ LC-MS/MS

7.3.1 สภาวะเครองมอ LC

analytical column: clipeus C-18 (150 mm × 3.0 mm, 5 µm) หรอเทยบเทา

solvent A: 0.1% HCOOH acid in H2O

solvent B: CH3CN

flowrate: 0.6 ml/min

injection volume: 10 µl

column temperature: 30 C

gradient LC mobile phase

0.0 90 10

1.5 - 2.5 60 40

5.0 - 7.5 20 80

8.0 - 10.0 90 10

time (min) % mobile phase A % mobile phase B

92


7.3.2 สภาวะเครองมอ MS

ionization mode: ESI (turbo spray) negative

ion spray voltage: -3500 eV

temperature TEM: 500 C

collision gas: nitrogen 5 psig

curtain gas (CUR) 16 psig

ion spray nebulizer gas (GS-1) 52 psig

TIS heater gas (GS-2) 58 psig

Entrance potential (EP) -10 V

MS/MS fragmentation conditions



คานวณความเขมขนของสารทตรวจพบจาก calibration curve

ปรมาณของสารทตรวจพบ, CA (µg/kg) = (Y - b) × CIS

a

โดย CA = conc. of analyte

Y = peak area ratio

b = intercept ของ calibration curve

a = slope ของ calibration curve

CIS = conc. of internal standard

8.2 รายงานปรมาณทตรวจพบ หนวยเปนไมโครกรมตอกโลกรม ทศนยม 1 ตาแหนง

CAP 321.0 ± 0.5 256.7 ± 0.5 (secondary) 151.7 ± 0.5 (primary)

CAP-d5 326.6 ± 0.5 156.7 ± 0.5 (primary)

component precursor ion product ion (m/z) (m/z)

93



9.1 สราง calibration curve ระหวาง peak area ratio กบ concentration ratio ทกครงททาการ

วเคราะห โดยคา Correlation coefficient, r ของ calibration curve ตองมคามากกวาหรอ

เทากบ 0.98

9.2 ทดสอบ method blank และ matrix blank ทกครงททาการวเคราะห

9.3 คานวณ % Relative intensities ของ analyte ion intensities ratio กบ standard ion intensities

ratio เพอยนยนการตรวจพบ โดย % Relative intensities ตองนอยกวาหรอเทากบ ± 20%

% Relative intensities = (ranalyte - rstd) × 100

rstd

โดย r analyte = ratio ของ secondary ion intensities ตอ primary ion intensities ของ analyte

r std = ratio ของ secondary ion intensities ตอ primary ion intensities ของ standard

r std = คาเฉลยของ rstd ทกความเขมขนของ calibration curve

9.4 วเคราะห spiked matrix ทระดบความเขมขน 0.25 µg/kg เพอประเมน % Recovery

ทกครง ททาการวเคราะห โดย % Recovery ตองอยในเกณฑยอมรบ ชวง 60-120%

9.5 วเคราะห duplicate sample ทกครง ททาการวเคราะห กรณตวอยางมจานวนมาก วเคราะห

10% ของจานวนตวอยาง กรณตรวจพบ ปรมาณสงกวาคา LOQ ใหคานวณ Relative Percent

Difference (RPD) โดย RPD ตองนอยกวาหรอเทากบ 25%



ตรวจวเคราะหการปนเปอนสารเคมบางชนดในอาหาร ลงวนท 18 สงหาคม พ.ศ. 2549


วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหาร



วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหาร



1. นายทนงพนธ สจจปาละ ผเชยวชาญเฉพาะดานสขลกษณะการผลต


2. นางลดาพรรณ แสงคลาย นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

3. นางดวงดาว วงศสมมาตร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

4. นางสาวอรารตน วฒกรภณฑ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

5. นางอชฌา สจจปาละ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

6. นางลดาวลย จงสมานกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

7. นางสาวอารณ ศรพรหม นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

8. นางสาวปทมา แดงชาต นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

9. นางสาวมณฑนา พนธบวหลวง นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

10. นายสมภพ วฒนมณ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

11. นางสาวกรณา ตรสมทธ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

12. นางสาวณฐกานต ตยศวาพร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

13. นางปยมาศ แจมศร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

97


นยามและคายอ (Definition and Abbreviation)

1. อาหาร หมายถง อาหารทคนสามารถบรโภคได และใหหมายความรวมถงเครองดม ยกเวน

ทกาหนดไวเฉพาะในวธนน ๆ

2. นา หมายถง นาสาหรบอปโภคและบรโภค รวมทงนาในสงแวดลอมแตไมรวมนาเสย

3. Dilution หมายถง การเจอจางของตวอยาง

4. นากรอง หมายถง นาทมคณสมบตเทยบเทานากลน หรอ deionized water

5. คายอทใช และคาเตม แสดงในตาราง

วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย


CFU colony forming unit

MPN most probable number

H2S hydrogen sulfide

DMSc F 2020 อาหาร Shigella spp. I 99

DMSc F 2021 อาหาร Escherichia coli O157 I 121

DMSc F 2022 อาหาร Enterobacteriaceae I 133

DMSc F 2023 อาหาร Enterococci I 139

DMSc F 2024 อาหาร mesophilic lactic acid bacteria I 151

DMSc F 2025 นาและนาแขง Vibrio cholerae I 161

Method รหสวธ ชนดอาหาร รายการ หนา Type

99


DMSc F 2020: วธตรวจวเคราะห Shigella spp. ในอาหาร

Analytical method of Shigella spp. in food


วธนใชในการตรวจวเคราะห Shigella spp. ในอาหาร ครอบคลมการตรวจหา (detection)


ISO 21567:2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for

the detection of Shigella spp.

3. นยามศพทและคายอ (Terms and abbreviation)

3.1 Shigella spp. = Shigella species

3.2 S. sonnei = Shigella sonnei

3.3 S. dysenteriae = Shigella dysenteriae

3.4 S. boydii = Shigella boydii

3.5 S. flexneri = Shigella flexneri

3.6 E. coli = Escherichia coli


Shigella spp. เปนแบคทเรยในกล ม Enterobacteriaceae ตดสแกรมลบ รปทอน ขนาด

2-4 µm × 0.5 µm แตมกพบรปราง cocco-bacillary ทมขนาดสนกวา ไมเคลอนท ไมสรางกาซ

จากนาตาลกลโคส (glucose) ไมสราง H2S หรอ decarboxylate lysine ไมใชนาตาลแลคโตส

(lactose) ท 24 ชวโมง และแบงเปน 4 serogroups คอ A, B, C, D

การตรวจหา (detection) แบงเปน 3 ขนตอน ดงน

4.1 การเพมปรมาณเชอ (enrichment) ใชอาหารเลยงเชอ Shigella broth ทเตม novobiocin

0.5 µg/ml บมในสภาวะไรออกซเจนท 41.5 ± 1 C 16-20 ชวโมง

4.2 การแยกเชอ (isolation) บนอาหารเลยงเชอชนดแขง (selective agar) ทมความจาเพาะ

(selectivity) 3 ระดบแตกตางกนดงน MacConkey agar ระดบตา XLD agar ระดบปานกลาง

และ Hektoen enteric agar ระดบสงสด บมท 37 ± 1 C 20-24 ชวโมง

100


4.3 การตรวจยนยน (confirmation) นาโคโลนทมลกษณะเฉพาะและโคโลนทสงสย ตรวจยนยน

ทางชวเคมและนาเหลองวทยา

5. อาหารเลยงเชอและสารเคม (Culture media and reagents): ภาคผนวก 1

5.1 อาหารเลยงเชอ

5.1.1 Bromocresol purple broth

5.1.2 Christensen’s citrate agar

5.1.3 Hektoen enteric (HE) agar

5.1.4 L-Lysine decarboxylase medium

5.1.5 MacConkey agar

5.1.6 Mucate broth

5.1.7 Nutrient agar (NA)

5.1.8 L-Ornithine decarboxylase medium

5.1.9 Semi-solid nutrient agar

5.1.10 Shigella broth

5.1.11 Sodium acetate agar

5.1.12 Triple sugar iron (TSI) agar

5.1.13 Tryptone/DL-tryptophan medium

5.1.14 Urea agar (Christensen’s medium)

5.1.15 Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar

5.2 สารเคม

5.2.1 Antisera of Shigella species

5.2.2 β-Galactosidase reagent

5.2.3 Kovac’s indole reagent

5.2.4 Saline solution



6.1.1 เครองนงทาลายเชอ (autoclave) 121 ± 3 C

6.1.2 ตอบเพาะเชอแบบไรออกซเจน (anaerobic incubator) 41.5 ± 1 C สวนประกอบ

ของกาซม <1% O2 และ 9-13% CO2

101


6.1.3 เครองชง (balance)

6.1.4 ตอบเพาะเชอ (incubator) 37 ± 1 C และ 41.5 ± 1 C

6.1.5 กลองจลทรรศน (microscope)

6.1.6 เครองวดความเปนกรด-เบส (pH-meter)

6.1.7 เครองตผสมอาหาร (stomacher) หรอเครองบดปน (rotary blender)

6.1.8 อางนาแบบควบคมอณหภม (water bath) 47 ± 3 C 50 ± 1 C และ 100 C

6.2 อปกรณ

6.2.1 ขวดรปชมพ (flask) หรอขวดแกวฝาเกลยว

6.2.2 แผนกระจก (glass slide)

6.2.3 หวงและเขมเขยเชอ (loop and needle)

6.2.4 จานเพาะเชอ (petri dish) ขนาด 90-100 มลลเมตร หรอ 140 มลลเมตร

6.2.5 ปเปต (pipette)

6.2.6 หลอดฝาเกลยว (screw-cap tube)

6.2.7 ถงตผสมอาหาร (stomacher bag) หรอโถปน (blender jar)

6.2.8 ตะแกรงหลอดทดลอง (test tube rack)


7.1 การสมตวอยาง (Sampling)

7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขง ตดตวอยางจากหลาย ๆ ตาแหนงใหเปนชนเลก ๆ ผสม

ใหเขากน กรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทว สมตวอยางตามปรมาณ

ทตองการ เชน 25 กรม ใสในภาชนะปราศจากเชอ

7.1.2 กรณทตวอยางเปนของเหลว เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เท หรอ

ปเปตตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทา ๆ กน ใสในภาชนะปราศจากเชอ

ไมนอยกวา 100 มลลลตร เขยาใหเขากน และสมตวอยางตามปรมาตรทตองการ

เชน 25 มลลลตร ใสในภาชนะปราศจากเชอ

7.2 การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)

ควรเรมทาการตรวจวเคราะหตวอยางใหเรวทสดเพราะเชอ Shigella ตายงาย

7.3 ขนตอนการเพมปรมาณเชอ (Enrichment)

เตม Shigella broth ทเตม novobiocin (0.5 µg/ml) ปรมาตร 9 เทาของปรมาณตวอยาง เชน

เตม Shigella broth ทเตม novobiocin (0.5µg/ml) 225 มลลลตร ลงในตวอยาง 25 กรม

หรอ 25 มลลลตร ตผสมใหเขากน ถาจาเปนใหปรบ pH 7.0 ± 0.2 แบบปราศจากเชอ

ปดฝาขวดหลวมๆ บมทสภาวะไรออกซเจน 41.5 ± 1 C 16 - 20 ชวโมง

102


7.4 ขนตอนการแยกเชอ (Isolation)

7.4.1 เขยาขวดตวอยางจากขอ 7.3 เบา ๆ และปลอยทงไวสกครใหชนอาหารขนาดใหญ

ตกอยกนขวด

7.4.2 นาเชอจากขอ 7.4.1 ขดบน MacConkey agar, XLD agar และ HE agar เพอแยก

ใหไดโคโลนเดยว

หมายเหต : ตวอยางทมการปนเปอน Shigella spp. จานวนนอย หรอหลงขนตอน

enrichment ม Shigella spp. จานวนนอยเมอเทยบกบจลนทรยอน ๆ

ทปนเปอนในตวอยางอาหาร ดงนนในบางกรณ เชน การสอบสวน

สาเหตการเจบปวยจากอาหาร ควรนาเชอมาขดบนอาหารเลยงเชอ

(selective agar) ชนดละ 2 จาน (ขนาด 90 - 100 มลลเมตร) หรอชนดละ

1 จาน (ขนาด 140 มลลเมตร) เพอเพมโอกาสการตรวจพบเชอ

7.4.3 บมท 37 ± 1 C 20 - 24 ชวโมง

7.4.4 เลอกโคโลนทมลกษณะเฉพาะคอ กลม ขอบและผวเรยบ โดยทวไปมขนาดมากกวา

2 มลลเมตร

MacConkey agar = ไมมส ขน (translucent) สาหรบโคโลนของ S. sonnei

ไมมสหรอมสชมพออน

XLD agar = ขน และตรงกลางเปนสแดง หรอสเดยวกบอาหารเลยงเชอ

HE agar = สเขยว ชน (moist) สาหรบ S. sonnei โคโลนมลกษณะนน

7.4.5 ถาไมพบโคโลนทมลกษณะเฉพาะและจลนทรยชนดอนยงเจรญไดไมด โดยเฉพาะ

บนอาหารเลยงเชอทมความจาเพาะสง ใหบมเพมอก 24 ชวโมง แลวนามาตรวจหา

โคโลนทมลกษณะเฉพาะอกครง

7.5 ขนตอนการตรวจยนยน (Confirmation)

โคโลนของเชอในกลม Enterobacteriaceae บางชนดมลกษณะคลาย Shigella spp. มาก

ใหเลอกโคโลนทมลกษณะเฉพาะหรอโคโลนทสงสย 5 โคโลน/จานของอาหารเลยงเชอ

แตละชนด กรณพบนอยกวา 5 โคโลน ใหเลอกทงหมด ยกเวนการตรวจวเคราะหอาหาร

ทเกยวของกบโรคอาหารเปนพษ ควรเลอกมากกวา 5 โคโลน/จาน เพอเพมความมนใจวา

ไมม Shigella spp. ปนเปอนในตวอยางอาหารนน

7.5.1 การแยกเชอใหบรสทธ (Purification of colonies)

ขดเชอทสงสยลงบนจานเพาะเชอ NA เพอใหไดโคโลนเดยว บมท 37 ± 1 C

18-24 ชวโมง ถาพบวาเชอยงไมบรสทธ ให sub-culture บนจานเพาะเชอ NA

บมท 37 ± 1 C 18 - 24 ชวโมง จนไดเชอบรสทธ

103


S. sonnei มลกษณะโคโลน 2 แบบบนจานอาหารเลยงเชอเดยวกน คอ

แบบท 1 : โคโลน กลม นนมโดม (dome) ผวเรยบ (phase 1)

แบบท 2 : โคโลน แบน ขอบไมเรยบ ผวดาน (phase 2)

หมายเหต : อาจทดสอบโคโลนทมลกษณะเฉพาะมากทสด 1 โคโลนจากอาหารเลยง

เชอแตละชนดกอน ถาใหผลบวกไมจาเปนตองทดสอบโคโลนทเหลอ

ถาใหผลลบ ตองทดสอบโคโลนทเหลอตอ จนกระทงพบวาโคโลน

ทงหมดใหผลลบหรอพบโคโลนทใหผลบวก

7.5.2 การยนยนทางชวเคม

ใชเขมเขยเชอจากขอ 7.5.1 ทดสอบทางชวเคมกบอาหารเลยงเชอตอไปน

TSI agar

นาเชอมา stab ในสวน butt และ streak บนสวน slant บมท 37 ± 1 C 24 ± 3 ชวโมง

butt : สเหลอง (ใชนาตาลกลโคส)

: สแดงหรอไมเปลยนส (ไมใชนาตาลกลโคส)

: สดา (สราง H2S)

: มฟองอากาศหรอรอยแตกของวน (สรางกาซ)

slant : สเหลอง (ใชนาตาลแลคโตส และ/หรอนาตาลซโครส)

: สแดงหรอไมเปลยนส (ไมใชทงนาตาลแลคโตส และซโครส)

Shigella spp. ทมลกษณะเฉพาะใหผลดงน

butt สเหลอง (สรางกรด) ไมมฟองอากาศ

slant สแดงหรอไมเปลยนส (ไมใชทงนาตาลแลคโตส และซโครส) ไมสราง H2S

Semi-solid nutrient agar for motility tests

นาเชอมา stab ลงใน semi-solid nutrient agar บมท 37 ± 1 C 18-24 ชวโมง

ผลบวก : เชอเจรญแผออกจากแนว stab

ผลลบ : เชอเจรญเฉพาะแนว stab (non-motile)

Shigella spp. ทงหมดใหผลลบ

Urea agar

นาเชอมาขดบนผวหนา (slant) บมท 37 ± 1 C 24 ± 3 ชวโมง และตรวจสอบ

เปนระยะๆ

ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนเปนสชมพแดงถงแดงเขม

(มการยอย urea เกดแอมโมเนย ทาใหเกดการเปลยนส)

ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส

Shigella spp. ใหผลลบ

104


L-Lysine decarboxylase medium

ใสเชอตากวาระดบผวหนาของอาหารเลยงเชอ บมท 37 ± 1 C 24 ± 3 ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอขนสมวง (decarboxylate lysine)

ผลลบ : อาหารเลยงเชอสเหลอง

หมายเหต : การใชพาราฟนเททบหนาในหลอดชวยทาใหมนใจสภาพไรออกซเจน

(anaerobic condition)

Shigella spp. ใหผลลบ

L-Ornithine decarboxylase medium

ใสเชอตากวาระดบผวหนาของอาหารเลยงเชอ บมท 37 ± 1 C 24 ± 3 ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอสมวง (decarboxylate ornithine)


S. sonnei ใหผลบวก

Shigella spp. อน ๆ ใหผลลบ (ไม decarboxylate ornithine)

Indole formation

เขยเชอใสใน tryptone/tryptophan medium 5 มลลลตร บมท 37 ± 1 C 24 ± 3 ชวโมง

เตม Kovac’s reagent 1 มลลลตร

ผลบวก : เกดวงแหวนสแดงภายใน 10 นาท (สราง indole)

ผลลบ : เกดวงแหวนสเหลองหรอสนาตาล

S. sonnei ใหผลลบ

Shigella spp. อนๆ ใหผลไมแนนอน (variable reactions)

β-galactosidase

นาเชอจาก NA 1 loop ใสลงในหลอดนาเกลอ (saline solution) ปรมาตร 0.25

มลลลตร หยด toluene 1 หยด เขยาหลอดเพอผสมใหเขากน บมท 37 C และ

ตงทงไวหลายนาท เตม complete reagent 0.25 มลลลตร และผสมใหเขากน

บมท 37 C 24 ± 3 ชวโมง และตรวจสอบเปนระยะๆ

ผลบวก : เกดสเหลองภายใน 20 นาท (สราง β-galactosidase)

ผลลบ : ไมเปลยนส

S. sonnei ใหผลบวก

S. dysenteriae และ S. boydii ใหผลไมแนนอน (variable reactions)

S. flexneri ใหผลลบ

105


Utilization of carbohydrates

เขยเชอปรมาณนอย (small inoculum) ลงในหลอด bromocresol purple broth

(carbohydrate และ alcohol ใชแยกแตละตวดงน : dulcitol, glucose, lactose,

mannitol, melibiose, raffinose, salicin, sorbitol, sucrose, xylose) บมท 37 ± 1 C

24 ± 3 ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอสมวงเปลยนเปนสเหลอง

Shigella spp. จะใหผลทดสอบตามตารางท 1

ตารางท 1 การจาแนกทางชวเคม และการตรวจยนยนของ Shigella spp. จาก E. coli, Hafnia

และ Providencia species

V strains variable ภายใน หรอระหวาง serovars ของ species, (x %) แสดง % ของ positive strains a บาง strains ของ S. flexneri serovar 2a และ S. boydii 9 สรางกรด b บาง strains ของ S. flexneri serovars 4 และ 6b ไมสรางกรด c S. sonnei สรางกรดหลงจากบมหลายวน d บาง serotypes ของ S. dysenteriae และ S. flexneri serovar 6 และ S. boydii ใหผลลบ e strains ของ S. flexneri และ S. boydii serovars 13 และ 14 สรางกรดและ gas f strains ของ S. dysenteriae serovar 1 และ S. boydii serovar 13 ใหผลบวกเสมอ g strains ของ S. dysenteriae serovar 5 และ S. flexneri serovar 6 ใหผลบวก h strains ของ S. dysenteriae serovars 8 และ 10 ใหผลบวก และ 4 และ 6 ใหผลไมแนนอน i เฉพาะ strains ของ S. boydii serovar 13 ใหผลบวก

การทดสอบ E. coli Hafnia species Providencia S. sonnei S. flexneri S. dysenteriae S. boydii

H2S from TSI − − − − − − −Gas from glucose (TSI) + V + − − −e −e

Motility + V V − − − − Urease − − V − − − − L-Lysine decarboxylase V + − − − − −i

L-Ornithine decarboxylase V + − + − − − Indole formation + − + − Vd (61 %) Vd (44 %) Vd (29 %)

β-Galactosidase + V - + (95 %) - Vf (50 %) Vf (11 %)

Acid from:

Dulcitol V V − − Vg (9.4 %) Vg (4.5 %) Vg (6.7 %)

Glucose + + − + (100 %) + (100 %) + (100 %) + (100 %)

Lactose V V − −c −a − −a

Mannitol + + V + (99 %) +b (94 %) − + (98 %)

Melibiose V V V − V V V

Raffinose V V − −c (2.5 %) V (53 %) − − Salicin V V − − − − − Sorbitol + − − − V (31 %) V (29 %) V (42 %)

Sucrose V − V −c (1.5 %) − − − Xylose + + − − − Vh (4.0 %) V (57 %)

106


การแปลผลทางชวเคม

strains ของ Shigella บาง species ใหผลทางชวเคมทไมแนนอน (ตามตารางท 1)

ดงนนจาเปนตองทาการทดสอบทางนาเหลอง (serotyping) ดวย

การทดสอบนาตาล mannitol เชอ S. dysenteriae ใหผลลบซงแตกตางจาก

Shigella spp. อน ๆ

การทดสอบ L-Ornithine decarboxylase เชอ S. sonnei ใหผลบวก ซงแตกตางจาก

Shigella spp. อนๆ

7.5.3 การจาแนกทางชวเคมเพมเตม (additional biochemical differentiation)

เนองจาก E. coli และ Shigella spp. บาง strains ใหผลทางชวเคมทเหมอนกน

การทดสอบเพมเตมจะชวยยนยนเชอไดดขน

เขยเชอจากขอ 7.5.1 ทดสอบทางชวเคมกบอาหารเลยงเชอตอไปน

Sodium acetate

นาเชอมาขดบนผวหนา (slant) ดวยเขมเขยเชอ (ใชเขมเขยเชอเพอใหอาหาร

เลยงเชอตดมากบเชอนอยทสด) บมท 37 ± 1 C 2 วน

ผลบวก : มการเจรญของเชอ อาหารเลยงเชอเปลยนจากสเขยวเปนสนาเงน

ถาไมมการเจรญของเชอ ใหบมเพมอก 2 วน ท 37 ± 1 C แลว

ตรวจสอบอกครง

Shigella spp. ไมมการเจรญของเชอหรอเจรญไดนอยมาก

E. coli ใหโคโลนสนาเงนและอาหารเลยงเชอทลอมรอบ สนาเงน/สเขยว

Christensen’s citrate

นาเชอมาขดบนผวหนา (slant) ดวยเขมเขยเชอ (ใชเขมเขยเชอเพอใหอาหาร

เลยงเชอตดมากบเชอนอยทสด) บมท 37 ± 1 C 2 วน

ผลบวก : มการเจรญของเชอ สครม/สชมพ อาหารเลยงเชอเปลยนเปน

สแดง ถาไมมการเจรญของเชอ ใหบมเพมอก 2 วน แลว

ตรวจสอบอกครง

Shigella spp. ไมมการเจรญของเชอ

Sodium mucate

เขยเชอลงในหลอด test broth และ control broth บมท 37 ± 1 C 2 วน

ผลบวก : มการเจรญของเชอ อาหารเลยงเชอสเหลอง

ผลลบ : มการเจรญของเชอ อาหารเลยงเชอสนาเงน ถาไมมการเจรญ

ของเชอ ใหบมเพมท 37 ± 1 C 2 วน แลวตรวจสอบอกครง

S. sonnei ใหผลไมแนนอน (variable reactions)

Shigella spp. อน ๆ ใหผลลบ

Shigella spp. จะใหผลทดสอบตามตารางท 2

107


ตารางท 2 การทดสอบทางชวเคมเพอจาแนก Shigella spp. และ E. coli บาง strains

ผลทางชวเคม (การเจรญ) หลงการบมตามกาหนดเวลา

Sodium acetate Christensen’s citrate Sodium mucate

% ผลบวก % ผลบวก % ผลบวก % ผลบวก % ผลบวก % ผลบวก เมอบมครบ หลงจากบม เมอบมครบ หลงจากบม เมอบมครบ หลงจากบม 2 วน 2 วน 2 วน 2 วน 2 วน 2 วน

Species

S. dysenteriae - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) - (0)

S. flexneri - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) - (0)

S. boydii - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) - (0)

S. sonnei - (0) - (0) - (0) - (0) V (6.4) V (36.7)

E. coli V (83.8) + (93.5) V (>15.3) V (>34.2) + (91.6) + (93.0)

+ > 90 % strains positive - > 90 % strains negative V ผลไมแนนอน (variable results) ระหวาง 10% - 89% strains positive % เปอรเซนตของ positive strains หลงการบม

7.5.4 การยนยนทางนาเหลองวทยา

7.5.4.1 การจาแนกแอนตเจน (antigenic differentiation)

Shigella spp. เปน non-motile ดงนนไมม flagella antigens การจาแนกภายใน

และระหวาง species ขนกบการวเคราะหชนดแอนตเจน somatic group “O”

และ specific “O” ทแตกตางกน ตามตารางท 3 โดยใชเชอทเตรยมใหม

(fresh culture) เจรญบน NA มาทดสอบการตกตะกอนบนแผนกระจก

ทสะอาด

ตารางท 3 การจาแนกแอนตเจนภายใน Shigella spp.

Shigella spp. Antigenic group Serovars (specific antigen designation)

S. dysenteriae A 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13

S. flexneri B 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 5a, 5b, 6, X, Y

S. boydii C 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18

S. sonnei D 1

108


หมายเหต : 1. group antigens (A, B, C, D) ม minor antigens ทอาจเกดการตกตะกอนขาม

(cross react) กบ group antigens อนๆ หลกเลยงโดยใช absorbed antisera

และ/หรอ ทาการเจอจางจนถงระดบทกาหนด บาง species โดยเฉพาะ S. dysenteriae

ม envelope antigens ทปกคลม group antigens และ serovar antigens ปองกน

ไมใหเกดการตกตะกอนกบ specific antisera สามารถกาจด envelope antigen

โดยการตมสารแขวนลอยเชอท 100 C 15-60 นาท

2. S. sonnei ม antigen group D ทงในโคโลนทผวเรยบและหยาบ และไมเกดการ

ตกตะกอนขาม (cross react) กบ antigen group ของ Shigella spp. อน ๆ โคโลน

ทผวหยาบไมจาเปนตองทดสอบ auto-agglutinate และ S. sonnei ไมม envelope

antigen

7.5.4.2 การทดสอบการตกตะกอน (Agglutination tests)

หยด group antiserum 1 หยดและนาเกลอ 1 หยด ใหแยกกนบนแผนกระจก

เขยเชอมาแตะบนนาเกลอ และ antiserum ผสมใหเขากน เอยงแผนกระจก

ไป-มาเบา ๆ 30-60 วนาท

ผลบวก : ตกตะกอนใน antiserum และไมตกตะกอนใน

นาเกลอ

auto-agglutinate : ตกตะกอนในนาเกลอ

ถา strains ทเกด auto-agglutinate ไมตองทดสอบตอ ใหทดสอบโคโลนอน ๆ

จากเชอเดยวกน และเชอทแยกจากอาหารเลยงเชอ (selective agar) ทผลทาง

ชวเคม วาเปน Shigella spp.

ถาผลการทดสอบทางชวเคมเปน Shigella spp. แตการทดสอบทางนาเหลอง

วทยาใหผลลบ นาสารแขวนลอยเชอไปใหความรอนในอางนาแบบ

ควบคมอณหภมท 100 C 60 นาท แลวทดสอบการตกตะกอนซา

7.5.4.3 การทดสอบยนยนขนสดทาย (Definitive confirmation)

โคโลนทเกด auto-agglutinate หรอโคโลนทใหผลทางชวเคม และ/หรอทาง

นาเหลองวทยาไมชดเจน ใหสงตรวจยนยนท WHO National Salmonella

and Shigella Center สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตร

การแพทย กระทรวงสาธารณสข หรอสถาบนอนทเชอถอได

109


8. การคานวณ (Calculation of results)

-

9. การรายงานผล (Expression of results)

Shigella spp. /นาหนก หรอปรมาตร (เชน กรม หรอมลลลตร) พบ หรอไมพบ


10.1 ภาคผนวก 1 : อาหารเลยงเชอและสารเคม (Culture media and reagents)

10.2 ภาคผนวก 2 : แผนภมการตรวจหา (detection) Shigella spp. ในอาหาร

10.3 ภาคผนวก 3 : รายละเอยดรปรางลกษณะของโคโลน Shigella spp. และสบนอาหาร

เลยงเชอจาเพาะชนดแขง (selective agars)

110


ภาคผนวก 1

อาหารเลยงเชอและสารเคม

(Culture media and reagents)

อาหารเลยงเชอ กรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรป เตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ

1. Shigella broth

1.1 Base medium

Enzymatic digest of casein 20 กรม

Potassium hydrogen phosphate (anhydrous) 2 กรม

Potassium dihydrogen phosphate (anhydrous) 2 กรม

Sodium chloride 5 กรม

D(+)-Glucose 1 กรม

Polyoxyethylenesorbitan monooleate (Tween 80) 1.5 มลลลตร

นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร

ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ถาจาเปนใหความรอนในการ

ละลาย ปรบ pH 7.0 ± 0.2 ฆาเชอท 121 C 15 นาท เกบท 5 ± 3 C ไดนาน 1 เดอน

1.2 Novobiocin solution

Novobiocin 25 มลลกรม

นากลน 1,000 มลลลตร

ละลาย novobiocin ในนากลน 1,000 มลลลตร ทาใหปราศจากเชอโดยกรองผานเมมเบรน

pore size 0.2 µm เกบท 5 ± 3 C ไดนาน 1 เดอน

การใชงาน (Complete medium)

เตม novobiocin solution 5 มลลลตร ลงใน base medium 225 มลลลตร หรอเตม novobiocin

solution 22 มลลลตร ลงใน base medium 1 ลตร ผสมใหเขากน หลงจากเตมตวอยาง 25 กรม/

มลลลตร ลงไปแลวความเขมขนสดทายของ novobiocin เทากบ 0.5 µg/ml

2. MacConkey agar

Enzymatic digest of casein and animal tissues 20 กรม

Lactose 10 กรม

Bile salts No.3 1.5 กรม

111



Neutral red 0.03 กรม

Crystal violet 0.001 กรม

Agar 9-18* กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจน agar

ละลาย ปรบ pH 7.1 ± 0.2 ฆาเชอท 121 C 15 นาท หรอตามทผผลตระบ ทาใหเยนลงใน

อางนาแบบควบคมอณหภม 47 C เทใสจานเพาะเชอ 15 มลลลตร ทงใหว นแขงตว

ตองทาใหผวหนาแหง กอนนามาใชงาน เกบท 5 ± 3 C ไดนาน 2 สปดาห

3. Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar

Yeast extract 3 กรม

L-Lysine HCl 5 กรม

Xylose 3.75 กรม

Lactose 7.5 กรม

Saccharose 7.5 กรม


Sodium desoxycholate 1 กรม

Sodium thiosulfate 6.8 กรม

Ammonium ferric citrate 0.8 กรม

Phenol red 0.08 กรม




ละลาย ปรบ pH 7.4 ± 0.2 ทาใหเยนลงในอางนาแบบควบคมอณหภม 47 C เทใสจาน

เพาะเชอ 15 มลลลตร ทงใหวนแขงตว ตองทาใหผวหนาแหงกอนนามาใชงาน เกบท

5 ± 3 C ไดนาน 2 สปดาห

* ขนกบความแขงของวน (gel strength of the agar)

112


4. Hektoen enteric (HE) agar

Enzymatic digest of meat 12 กรม



Saccharose 12 กรม

Salicin 2 กรม

Bile salts No.3 9 กรม


Sodium thiosulfate 5 กรม

Ammonium ferric citrate 1.5 กรม

Acid fuchsin 0.1 กรม

Bromothymol blue 0.065 กรม




ละลาย หรอตามทผผลตระบ ปรบ pH 7.5 ± 0.2 ทาใหเยนลงในอางนาแบบควบคมอณหภม

47 C เทใสจานเพาะเชอ 15 มลลลตร ทงใหวนแขงตว ตองทาใหผวหนาแหงกอนนามา

ใชงานเกบท 5 ± 3 C ไดนาน 2 สปดาห

5. Nutrient agar (NA)

Meat extract 3 กรม





ละลาย ปรบ pH 7.0 ± 0.2 ฆาเชอท 121 C 15 นาท ทาใหเยนลงในอางนาแบบควบคม

อณหภม 47 C เทใสจานเพาะเชอ 15 มลลลตร ทงใหวนแขงตว ตองทาใหผวหนาแหง

กอนนามาใชงานเกบท 5 ± 3 C ไดนาน 2 สปดาห


113


6. Triple sugar iron (TSI) agar



Peptone 20 กรม



Sucrose 10 กรม

Glucose 1 กรม

Ferric citrate 0.3 กรม






ละลาย ปรบ pH 7.4 ± 0.2 แบงใสหลอด 10 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท ทงใหวนแขงตว

โดยการเอยงหลอดใหมสวนสงของ butt 2.5 - 5 เซนตเมตร เกบท 5 ± 3 C ไดนาน 1 เดอน

7. Semi-solid nutrient agar


Enzymatic digest of animal tissue 5 กรม

Agar 4-9* กรม



ละลาย ปรบ pH 7.0 ± 0.2 แบงใสหลอด 10 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท เกบท 5 ± 3 C

ไดนาน 1 เดอน

8. Urea agar (Christensen’s medium)

8.1 Base medium


Glucose 1 กรม


114



Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 2 กรม





ละลาย ปรบ pH 6.8 ± 0.2 ฆาเชอท 121 C 15 นาท

8.2 Urea solution

Urea 400 กรม

นากลนหรอนากรอง (ปรบปรมาตรเปน) 1,000 มลลลตร

ละลาย urea ในนากลนหรอนากรอง ทาใหปราศจากเชอโดยกรองผาน membrane filter

ทมร (pore size) ขนาด 0.2 micron

8.3 Complete medium

Base medium 900 มลลลตร

Urea solution 50 มลลลตร

การใชงาน (complete medium)

เตม urea solution ใน base medium ทหลอมละลาย และทาใหเยนลงท 47 C แบงใสหลอด

10 มลลลตร ทงใหวนแขงตวโดยการเอยงหลอด

9. L-Lysine decarboxylase medium

L-Lysine monohydrochloride 5 กรม


Glucose 1 กรม

Bromocresol purple 0.015 กรม



ละลาย ปรบ pH 6.8 ± 0.2 แบงใสหลอด 2-5 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท


115


10. L-Ornithine decarboxylase medium

L- Ornithine monohydrochloride 5 กรม


Glucose 1 กรม




ละลาย ปรบ pH 6.8 + 0.2 แบงใสหลอด 2-5 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท

11. Tryptone/DL-tryptophan medium

Pancreatic digest of casein 10 กรม


DL- Tryptophan 1 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจนละลายปรบ

pH 7.5 ± 0.2 แบงใสหลอด 5 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท เกบท 5 ± 3 C ไดนาน 1 เดอน

12. Bromocresol purple broth




Carbohydrate or alcohol* 10 กรม



* Carbohydrate และ alcohol ใชแยกแตละตวดงน : dulcitol, glucose, lactose,

mannitol, melibiose, raffinose, salicin, sorbitol, sucrose, xylose


ละลาย ปรบ pH 7.0 ± 0.2 ทาใหปราศจากเชอโดยกรองผาน membrane filter ทมร

(pore size) ขนาด 0.2 micron แบงใสหลอด 5 มลลลตร และตรวจสอบความปราศจากเชอ

โดยสมหลอดอาหารเลยงเชอไปบมท 37 C 24 ชวโมง เกบท 5 ± 3 C ไดนาน 1 เดอน

116


13. Sodium acetate agar

Sodium acetate 2 กรม


Magnesium sulfate (anhydrous) (MgSO4) 0.2 กรม

Ammonium phosphate 1 กรม

Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 1 กรม




ละลายสวนประกอบทงหมดยกเวน MgSO4 ในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร

ใหความรอนจน agar ละลาย และคนผสมใหเขากน แลวเตม MgSO4 หรอตามทผผลต

ระบ ปรบ pH 6.7 ± 0.2 แบงใสหลอด 8 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท ทงใหวนแขงตว

โดยการเอยงหลอดใหไดผวหนา (slant) ยาว 5 เซนตเมตร

14. Christensen’s citrate agar

Sodium citrate 3 กรม

Glucose 0.2 กรม

Yeast extract 0.5 กรม

Cysteine monohydrochloride 0.1 กรม

Ferric ammonium citrate 0.4 กรม







ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจน agar ละลาย

และคนผสมใหเขากน ปรบ pH 6.9 ± 0.2 แบงใสหลอดปรมาตร 1/3 ของหลอด ฆาเชอท

121 C 15 นาท ทงใหวนแขงตวโดยการเอยงหลอดใหไดผวหนา (slant) ยาว 4-5 เซนตเมตร

butt สง 2-3 เซนตเมตร


117


15. Mucate broth

Test broth

Enzymatic digest of casein** 10 กรม

Mucic acid 10 กรม



ละลาย mucic acid โดยเตม NaOH (5 mol/l) จานวนนอยลงไปชาๆ ผสมใหเขากน ละลาย

enzymatic digest of casein ในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แลวเตม mucic acid

ปรบ pH 7.4 ± 0.2 แบงใสหลอด 5 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 10 นาท

Control broth




ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ปรบ pH 7.4 ± 0.2 แบง

ใสหลอด 5 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 10 นาท

สารเคม กรณใชสารเคมสาเรจรป เตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ

1. Antisera of Shigella species ใชชนดสาเรจรป

2. β-Galactosidase reagent

2.1 Buffer solution

Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) 6.9 กรม

Sodium hydroxide (10 mol/l solution) ประมาณ 3 มลลลตร

นากลนหรอนากรอง (ปรบปรมาตรเปน) 50 มลลลตร

ละลาย sodium dihydrogen phosphate ในนากลนหรอนากรองประมาณ 45 มลลลตร

ใน volumetric flask ปรบ pH 7.0 ± 0.2 ดวยสารละลาย NaOH ปรบปรมาตรสดทาย

เปน 50 มลลลตร

** ใช nutrient broth No.2 จานวน 25 กรม แทนได

118


2.2 ONPG solution

o-Nitrophenol-β-D-galactopyranoside (ONPG) 0.08 กรม

นากลนหรอนากรอง 15 มลลลตร

ละลาย ONPG ในนากลนหรอนากรองท 50 C แลวทาใหสารละลายเยนลง

2.3 Complete medium

Buffer solution 5 มลลลตร

ONPG solution 15 มลลลตร

การใชงาน (complete medium)

เตม buffer solution ลงใน ONPG solution เกบท 5 ± 3 C ไดนาน 1 เดอน

3. Kovac’s indole reagent

4-Dimethylaminobenzaldehyde 5 กรม

Hydrochloric acid (p=1.18 g/ml to 1.19 g/ml) 25 มลลลตร

2-Methylbutan-2-ol 75 มลลลตร

ผสมสวนประกอบเขาดวยกน เกบท 5 ± 3 C ไดนาน 1 เดอน

4. Saline solution

Sodium chloride 8.5 กรม


ละลาย sodium chloride ในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ปรบ pH 7.0 ± 0.2 แบง

ใสหลอด 10 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท

119



แผนภม การตรวจหา (detection) Shigella spp. ในอาหาร

ตวอยาง 25 กรม/มลลลตร + Shigella broth 225 มลลลตร (เตม novobiocin 0.5 µg/ml)

ตผสมใหเปนเนอเดยวกนและปรบ pH 7.0 ± 0.2

บมสภาวะไรออกซเจน 41.5 ± 1 C 16-20 ชวโมง

ขดบน MacConkey agar, XLD agar และ HE agar

37 ± 1 C 20-24 ชวโมง

ถาไมพบโคโลนทมลกษณะเฉพาะหรอสงสย และจลนทรยชนดอนยงเจรญไดไมด

บมเพมอก 18-24 ชวโมง

เขยเชออยางนอย 5 โคโลน/จาน ลงบนจานเพาะเชอ NA (แยกใหไดโคโลนเดยว)

37 ± 1 C 20-24 ชวโมง

ทดสอบทางชวเคม

อาหารเลยงเชอ/ปฏกรยา ผลการทดสอบ อาหารเลยงเชอ/ปฏกรยา ผลการทดสอบ

TSI agar butt สเหลอง slant สแดง ไมสรางกาซ และ H2S

Motility non-motile

Urea agar - (อาหารเลยงเชอไมเปลยนส)

L-Lysine decarboxylase - (สเหลอง)

L-Ornithine decarboxylase - (สเหลอง) ยกเวน S. sonnei + (สมวง)

Indole + (วงแหวนสแดง)/-(สเหลอง/ นาตาล) ยกเวน S. sonnei -

β-galactosidase S. sonnei + (สเหลอง) S. dysenteriae, S. boydii +/- S. flexneri -

การใชนาตาล dulcitol, ผลตามตารางท 1glucose, lactose, mannitol, melibiose, raffinose, salicin, sorbitol, sucrose, xylose

Sodium acetate - (สเขยว ไมเจรญ/เจรญ นอยมาก)

Christensen’s citrate - (ไมเจรญ)

Sodium mucate - (สนาเงน) ยกเวน S. sonnei + (สเหลอง) / -

ทดสอบทางนาเหลองวทยา

กรณตองการทราบ serovar สงตรวจยนยนท WHO Salmonella and Shigella Center สถาบนวจยวทยาศาสตร

สาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข หรอสถาบนอนทเชอถอได

รายงานผล

120



รายละเอยดรปรางลกษณะโคโลนของ Shigella spp. และสบนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง

(selective agars) สาหรบวตถประสงคการจาแนกเชอและการควบคมคณภาพ

Enterobacteriaceae ทงหมดบนอาหารเลยงเชอเหลาน มลกษณะโคโลน กลม ผวและขอบเรยบ

โดยทวไปขนาดมากกวา 2 มลลเมตร รายละเอยดตามตารางท 4

ตารางท 4 รปรางลกษณะโคโลนของ Shigella spp. และสบนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง

แบคทเรย (species)

อาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง

MacConkey agar XLD agar Hektoen agar

Shigella sonnei* ไมมสถงสชมพออน ขน ตรงกลางเปนสแดง, โคโลนนนสเขยวและชน ขน (translucent) สเดยวกบอาหารเลยงเชอ lactose negative

Shigella spp. อนๆ ไมมส ขน ตรงกลางเปนสแดง, สเขยวและชน ขน สเดยวกบอาหารเลยงเชอ lactose negative

Escherichia coli สแดง มตะกอนขน สเหลอง ทบ ลอมรอบดวย สแดง/ส salmon มโซนของ ในอาหารเลยงเชอ ตะกอนสเหลองในอาหาร ตะกอนในอาหารเลยงเชอ เลยงเชอ

Enterobacter cloacae สแดง มตะกอนขน สเหลอง ทบ ลอมรอบดวย สแดง/ส salmon มโซนของ ในอาหารเลยงเชอ ตะกอนสเหลองใน ตะกอนในอาหารเลยงเชอ อาหารเลยงเชอ

Klebsiella pneumoniae สแดง มตะกอนขน สเหลอง ทบ เปนเมอก สแดง/ส salmon มโซนของ ในอาหารเลยงเชอ ลอมรอบดวยตะกอน ตะกอนในอาหาร เลยงเชอ สเหลอง

Salmonella ไมมส ขน อาหารเลยงเชอ สแดง ตรงกลางสดา สเขยวแกมนาเงน ม/ไมม รอบโคโลนสเหลอง สดาตรงกลาง

Proteus mirabilis ไมมส ขน อาหารเลยงเชอ สเหลอง ตรงกลางสดา สนาเงน/สเขยว ม/ไมมสดา รอบโคโลนสเหลอง อาหารเลยงเชอสเหลอง ตรงกลาง มตะกอน

Enterococcus faecalis โคโลนขนาดเลก กลม ไมมการเจรญ/เจรญนอยมาก ไมมการเจรญ/เจรญ สแดง โคโลนสเหลอง นอยมาก โคโลนสเหลอง

* Shigella sonnei อาจใชนาตาล lactose หลงการบมมากกวา 40 ชวโมง ทาใหเกดผล weak คลาย Escherichia coli โคโลนของ S. sonnei มทงแบบเรยบจนถงหยาบ สญเสย 120-megadalton plasmid และสญเสยความรนแรง โคโลนอาจเกด auto-agglutination ในนาเกลอ และ antiserum

121


DMSc F 2021: วธตรวจวเคราะห Escherichia coli O157 ในอาหาร

Analytical method of Escherichia coli O157 in food


วธนใชในการตรวจวเคราะห Escherichia coli O157 ในอาหาร ครอบคลมการตรวจหา (detection)


ISO 16654:2001 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for

the detection of Escherichia coli O157


3.1 E. coli O157 = Escherichia coli serogroup O157

3.2 E. coli = Escherichia coli

3.3 IMS = Immunomagnetic separation


E. coli O157 เปนแบคทเรยแกรมลบ รปทอน ไมสรางสปอร ไมใชนาตาลซอรบทอล (sorbitol)

และไมสรางเอนไซม β-glucuronidase ซงตางจาก E. coli สวนใหญ (มากกวา 90%) ทใชนาตาล

ซอรบทอล และสรางเอนไซม β-glucuronidase ได

การตรวจหา (detection) แบงเปน 4 ขนตอน ดงน

4.1 การเพมปรมาณเชอ (enrichment) ใชอาหารเลยงเชอ modified tryptone soya broth ทเตม

novobiocin (mTSB+N) บมท 41.5 ± 1 C 6 ชวโมง และบมเพม 12-18 ชวโมง

4.2 การแยกเชอและทาใหเชอเขมขน (separation and concentration) ใช immunomagnetic

particles ทเคลอบดวย antibodies ตอ E. coli O157

4.3 การแยกเชอ (isolation) บนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง (selective agar)

4.4 การตรวจยนยน (confirmation) นาโคโลนทมลกษณะเฉพาะตรวจยนยนทางชวเคมและ

นาเหลองวทยา

122




5.1.1 Cefixime tellurite sorbitol MacConkey agar (CT-SMAC) และอาหารเลยงเชอจาเพาะ

ชนดแขงอกหนงชนด

5.1.2 Modified tryptone soya broth with novobiocin (mTSB + N)

5.1.3 Nutrient agar (NA)

5.1.4 Tryptone/tryptophan medium


5.2.1 Anti-Escherichia coli O157 immunomagnetic particles

5.2.2 Escherichia coli O157 antiserum

5.2.3 Kovac’s indole reagent

5.2.4 Wash buffer: Modified phosphate buffer, 0.01 mol/l, pH 7.2

5.2.5 Normal saline solution





6.1.3 ตอบเพาะเชอ (incubator) 37 ± 1 C และ 41.5 ± 1 C


6.1.5 เครองผสมแบบหมน (rotary mixer) ความเรว 15-20 รอบ/นาท

6.1.6 เครองผสม (vortex mixer)

6.1.7 อางนาแบบควบคมอณหภม (water bath) 44-47 C

6.2 อปกรณ

6.2.1 หลอดพลาสตกชนด Eppendorf ขนาด 1.5 มลลลตร



6.2.4 หวง (loop)

6.2.5 แทงแมเหลก (magnetic separator) พรอม magnetic rack

6.2.6 ไมโครปเปต (micropipette) ขนาด 20-200 ไมโครลตร

6.2.7 พาสเจอรปเปต (pasteur pipette)

123


6.2.8 จานเพาะเชอ (petri dish)


6.2.10 หลอดทดลอง (test tube)




7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขง ตดตวอยางจากหลาย ๆ ตาแหนงใหเปนชนเลก ๆ

ผสมใหเขากน กรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทว ส มตวอยาง

ตามปรมาณทตองการ เชน 25 กรม ใสในภาชนะปราศจากเชอ

7.1.2 กรณทตวอยางเปนของเหลว เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เท หรอ

ปเปตตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทา ๆ กน ใสในภาชนะปราศจากเชอไมนอย

กวา 100 มลลลตร เขยาใหเขากน และสมตวอยางตามปรมาตรทตองการ เชน

25 มลลลตร ใสในภาชนะปราศจากเชอ


เตม mTSB+N (pre-warmed ทอณหภม 41.5 C) ปรมาตร 9 เทาของปรมาณตวอยาง เชน

เตม mTSB+N 225 มลลลตร ลงในตวอยาง 25 กรม หรอ 25 มลลลตร เขยาใหเขากน

หมายเหต : แนะนาใหใชถงตผสมอาหารชนดกรอง (stomacher bag with mesh) เพอ

ไมใหชนสวนอาหารรบกวนในขนตอน immunocapture


7.3.1 บมท 41.5 C 6 ชวโมง และบมตออก 12-18 ชวโมง จนครบเวลาบม 18 - 24 ชวโมง

7.3.2 นาอาหารเลยงเชอขอ 7.3.1 ทไดจากการบม 6 ชวโมงทา immunomagnetic

separation (IMS)

7.4 Immunomagnetic separation (IMS)

การทา IMS ตองใชอาหารเลยงเชอทบมหลงจาก 6 ชวโมง และถาจาเปนตองทาอกครง

ใหใชอาหารเลยงเชอหลงจากบมตออก 12-18 ชวโมง

7.4.1 Immunocapture

7.4.1.1 เขยาขวดตวอยาง จากขอ 7.3.1 และปลอยทงไวสกครใหชนอาหารตกอย

กนขวด

7.4.1.2 เตรยม anti-Escherichia coli O157 immunomagnetic particles ททงไวใหม

อณหภมเทาอณหภมหอง ใสในหลอด Eppendorf ปรมาตร 20 ไมโครลตร

124


7.4.1.3 ปเปตตวอยางจากสวนบนของอาหารเลยงเชอขอ 7.4.1.1 ปรมาตร 1 มลลลตร

(หลกเลยงชนสวนของอาหารหรอไขมน) ใสในหลอดขอ 7.4.1.2 ผสม

ใหเขากนโดยใช rotary mixer ความเรว 12-20 รอบ/นาท นาน 10 นาท

ขอควรระวง ใชเทคนคปราศจากเชอเพอปองกนการปนเปอนจากภายนอก

และการเกดละอองฝอยในอากาศ ถาเปนไปไดใหทาในต

ปราศจากเชอ (safety cabinet) และสวมถงมอ

7.4.2 Separation

7.4.2.1 ขนตอนการลาง

- นาหลอด จากขอ 7.4.1.3 ใสใน magnetic rack พรอมแทงแมเหลก เพอ

ใหแมเหลกจบ magnetic particles โดยหมน rack เบา ๆ เปนมม 180 องศา

เปดฝาหลอดอยางระมดระวงไมใหกระทบ particles ขางหลอด ใช

pasteur pipette คอย ๆ ดดของเหลวจากกนหลอดทง

- เตม wash buffer 1 มลลลตร ลงในหลอด ปดฝา นาแทงแมเหลกออก

- หมน rack เบา ๆ เปนมม 180 องศา ใสแทงแมเหลกกลบเขาไปใน

magnetic rack

- ใช pasteur pipette คอย ๆ ดดของเหลวทง

- ลางดวย wash buffer ซาหลาย ๆ ครง

- ใช pasteur pipette ดดของเหลวทง นาแทงแม เหลกออกจาก

magnetic rack

7.4.2.2 เตม wash buffer 100 ไมโครลตร ลงในหลอดขอ 7.4.2.1 เขยาให magnetic

particles แขวนลอยใน buffer

หมายเหต : 1. เปลยน pasteur pipette ทกครงเมอทาตวอยางใหม

2. วธนไมเหมาะกบอาหารบางชนด เชน fat products หรอ

fresh cheese


ถาย magnetic particles ทแขวนลอยใน buffer จากขอ 7.4.2.2 ปรมาตร 50 ไมโครลตร

ลงบน CT-SMAC และ 50 ไมโครลตร ลงบนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงอนอก

หนงชนด แลวขดแยกเชอ (streak) จากนน นา CT-SMAC บมท 37 C 18-24 ชวโมง

สวนอาหารเลยงเชอชนดอนบมตามคาแนะนาของผผลต หรอตามความเหมาะสม

หมายเหต : การบมเพาะเชอ enrichment broth ท 20 ถง 24 ชวโมง อาจมจลนทรยอนเจรญ

เพมมากขนบนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง ทาใหสงเกตเหนเชอ

125


E. coli O157 ไดยาก ทงนขนอยกบชนดของตวอยางอาหารและจลนทรย

ทปนเป อนตามธรรมชาต (microbial flora) การเจอจางสารแขวนลอย

magnetic particles (จากขอ 7.4.2.2 ) หรอลดปรมาตรใหนอยกวา 50 ไมโครลตร

ตอจานเพาะเชอ สามารถเพมโอกาสในการแยกโคโลนเดยว ของ E. coli O157

แตอาจทาใหขดจากดของการตรวจพบ (detection limit) เพมขน

ลกษณะโคโลนเฉพาะของ E. coli O157

CT-SMAC โคโลนใสเกอบไมมส โดยมสนาตาลอมเหลอง ออน ๆ ขนาดประมาณ

1 มลลเมตร

อาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงอน เปนไปตามคาแนะนาของผผลต


สามารถใชชดทดสอบทางชวเคมทางการคา ในการจาแนก E. coli ทไมใชนาตาลซอรบทอล

และ indole ใหผลบวก และ ชด latex agglutination สาหรบ E. coli O157

7.6.1 เลอกโคโลนลกษณะเฉพาะ 5 โคโลน ตอจานอาหารเลยงเชอแตละชนด กรณพบ

นอยกวา 5 โคโลน ใหเลอกทงหมด ขดบนจานเพาะเชอ NA เพอใหไดโคโลนเดยว

บมท 37 C 18-24 ชวโมง

7.6.2 การยนยนทางชวเคม

ทดสอบการสราง indole

เขยเชอ 1 โคโลนจากจานเพาะเชอ NA (จากขอ 7.6.1) ลงในหลอด tryptone/

tryptophan medium บมท 37 C 24 ชวโมง เตม Kovac’s reagent 1 มลลลตร

ปลอยทงไวทอณหภมหอง 10 นาท

ผลบวก : เกดสแดง

ผลลบ : เกดสเหลอง/สนาตาล

E. coli O157 ใหผลบวก

7.6.3 การยนยนทางนาเหลองวทยา

นาเชอทผล indole เปนบวกมาทดสอบทางนาเหลองวทยา โดยใช antiserum ตอ

E. coli O157

7.6.3.1 หยด saline solution 1 หยด บนแผนกระจกทสะอาด ใช loop เขยเชอ

1 โคโลน จากจานเพาะเชอ NA (จากขอ 7.6.1) ผสมใหเขากนเอยงสไลดไปมา

30-60 วนาท สงเกตการจบกนเปนตะกอน (agglutination) ถามตะกอน

แสดงวาเปน auto-agglutination ไมตองทดสอบกบ E. coli O157 antiserum

ตอไป

126


7.6.3.2 ทดสอบเชอทไมเกด auto-agglutination โดยทาเชนเดยวกบขอ 7.6.3.1

แลวเตม E. coli O157 antiserum หยดเลก ๆ ลงไป ถาตกตะกอนภายใน

1 นาท แสดงวาใหผลบวก

7.6.3.3 โคโลนทสงสย หรอใหผลบวกทตองการตรวจหาแฟลกเจลลาแอนตเจน

และการกอโรคใหสงตรวจยนยนทสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข

กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข หรอสถาบนอนทเชอถอได


-


E. coli O157/นาหนก หรอปรมาตร (เชน กรม หรอมลลลตร) พบ หรอไมพบ



10.2 ภาคผนวก 2 : แผนภมการตรวจหา (detection) E. coli O157 ในอาหาร

127






1. Cefixime tellurite sorbitol MacConkey agar (CT-SMAC)

1.1 Base medium


Enzymatic digest of animal tissues 3 กรม

Sorbitol 10 กรม








ละลายฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.1 ± 0.2

1.2 Potassium tellurite solution

Potassium tellurite for bacteriological use 0.25 กรม


ละลาย potassium tellurite ในนากลนหรอนากรอง 100 มลลลตร ทาใหปราศจากเชอ

โดยกรองผาน membrane เกบอณหภมหองไดนาน 1 เดอน แตถาเกดตะกอนสขาวตอง

ทงไป

1.3 Cefixime solution

Cefixime 5 มลลกรม


ละลาย cefixime ในนากลนหรอนากรอง 100 มลลลตร ทาใหปราศจากเชอโดยกรองผาน

membrane (cefixime จะตองทาการละลายใน ethanol กอน) เกบท 3 ± 2 C ไดนาน 1 สปดาห


128


1.4 Complete medium

Base medium (1.1) 1,000 มลลลตร

Potassium tellurite solution (1.2) 1 มลลลตร

Cefixime solution (1.3) 1 มลลลตร


เตม 1 มลลลตร potassium tellurite solution และ 1 มลลลตร cefixime solution ลงใน

base medium 1,000 มลลลตร ทหลอมและทาใหเยนลงจนมอณหภม 44-47 C เขยาให

เขากน (ความเขมขนสดทายของ tellurite เทากบ 2.5 มลลกรมตอลตร และ cefixime

เทากบ 0.05 มลลกรมตอลตร) นามาเทลงในจานเพาะเชอ 15 มลลลตร ทงใหวนแขงตว

กอนนามาใชตองทาใหผวหนาแหงไมมหยดนา (dry plate) เกบในถงพลาสตกและในทมด

ท 3 ± 2 C ไดนาน 2 สปดาห

2. Modified tryptone soya broth with novobiocin (mTSB+N)

2.1 Modified tryptone soya broth (mTSB)


Enzymatic digest of soya 3 กรม

D(+)-glucose 2.5 กรม



Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 4 มลลลตร


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท

pH 7.4 ± 0.2

2.2 Novobiocin solution

Novobiocin 0.45 กรม


ละลาย novobiocin ในนากลนหรอนากรอง 100 มลลลตร ทาใหปราศจากเชอโดยกรองผาน

membrane เตรยมในวนทใชงาน


เตม novobiocin solution 1 มลลลตร หรอ 4 มลลลตร ลงใน mTSB 225 มลลลตร หรอ

900 มลลลตร ททาใหเยน ความเขมขนสดทายของ novobiocin เทากบ 20 มลลกรม

ตอ mTSB 1 ลตร

129


3. Nutrient agar (NA)






ละลาย ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.0 ± 0.2

4. Tryptone/tryptophan medium

Tryptone 10 กรม


DL-Tryptophan 1 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ถาจาเปนใหความรอน

ในการละลาย แบงใสหลอด 5 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.4 ± 0.2


1. Anti-Escherichia coli O157 immunomagnetic particles ใชชนดสาเรจรป

2. Escherichia coli O157 antiserum ใชชนดสาเรจรป

3. Kovac’s indole reagent

4-Dimethylaminobenzaldehyde 5 กรม

Hydrochloric acid (p201.18 g/ml to 1.19 g/ml) 25 มลลลตร

2-Methylbutan-1-ol or pentan-1-ol 75 มลลลตร

ละลาย 4-Dimethylaminobenzaldehyde ใน alcohol ถาจาเปนใหอนในอางนารอนอณหภม

44-47 C ทาใหเยนทอณหภมหอง คอยๆ เตม HCL เกบทอณหภม 3 ± 2 C ในขวดสชา นายาตอง

มสเหลองออนถงนาตาลออน และไมมตะกอน


130


4. Wash buffer: Modified phosphate buffer, 0.01 mol/l, of pH 7.2


Potassium chloride 0.2 กรม

Disodium hydrogen phosphate (anhydrous) 1.44 กรม

Potassium dihydrogen phoaphate (anhydrous) 0.24 กรม

Polyoxyethylene sorbitan monolaurate 0.2 มลลลตร

(Tween 20 syrup)


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง แบงใสขวด ฆาเชอท 121 C 15 นาท

pH 7.2 ± 0.2 สารละลายอาจจะขนแตเมอตงทงไวจะใส

5. Normal saline solution

Sodium chloride 8.5 กรม


ละลาย sodium chloride ในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสขวด ฆาเชอท 121 C

15 นาท

131



ตวอยาง 25 กรม + mTSB + N (pre-warmed ท 41.5 C) 225 มลลลตร

41.5 ± 1 C 6 ชวโมง และ 18-24 ชวโมง

immunomagnetic separation (IMS)

ใส wash buffer 100 ไมโครลตร ลงใน magnetic particles

ถายสารแขวนลอย magnetic particles 50 ไมโครลตร บน CT-SMAC

และอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงอนอกหนงชนด

37 ± 1 C 18-24 ชวโมง และตามคาแนะนาของ ผผลต

โคโลนทมลกษณะเฉพาะ

เขยเชออยางนอย 5 โคโลน/จาน ลงบนจานเพาะเชอ NA

ทดสอบทางชวเคม : indole test ใหผลบวก

ทดสอบทางนาเหลองวทยา ตกตะกอนกบ antiserum E. coli O157

สงตรวจยนยนท สถาบนวจยวทยาศาสตร กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข

หรอสถาบนอนทเชอถอได


แผนภม การตรวจหา (detection) E. coli O157 ในอาหาร

133


DMSc F 2022: วธตรวจวเคราะห Enterobacteriaceae ในอาหาร

Analytical method of Enterobacteriaceae in food


วธนใชในการตรวจวเคราะหปรมาณแบคทเรยในกลม Enterobacteriaceae ในอาหาร ครอบคลม

การตรวจปรมาณ (enumeration)


American Public Health Association. Compendium of Methods for The Microbiological

examination of foods. 5th ed. 2015. Chapter 9 “Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia

coli as Quality and Safety Indicators”.


3.1 mesophilic bacteria หมายถงแบคทเรยทมอณหภมเหมาะสมในการเจรญอยระหวาง

30-40 C

3.2 psychrotrophic bacteria หมายถงแบคทเรยทสามารถเจรญทอณหภมแชเยน 0-7 C โดยชวง

อณหภมทเหมาะสมในการเจรญอยระหวาง 20-30 C


Enterobacteriaceae เปนกลมของแบคทเรยแกรมลบ รปทอน ไมสรางสปอร เจรญไดใน

ทมออกซเจนและไมมออกซเจน (facultative anaerobe) มทงชนดทมและไมม flagella

(peritrichous flagella) สามารถเปลยนนาตาลกลโคส (glucose) เปนกรด สรางเอนไซม

catalase และรดวซ nitrate พบไดในลาไสของคนและสตวและในสงแวดลอม เชอกลมนไว

ตอความรอน (heat-sensitive) สวนความทนทานตออณหภมแชแขงแตกตางกนขนกบชนดของ

เชอ และเนองจากถกทาลายไดงายโดยนายาฆาเชอ (sanitizers) จงเปนตวบงชทดสาหรบสขลกษณะ

ของสงแวดลอมในโรงงานผลตอาหาร แบคทเรยในกลม Enterobacteriaceae ไดแก Citrobacter,

Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Proteus, Providencia, Salmonella,

Serratia, Shigella และ Yersinia สวนใหญเปน mesophilic bacteria แตบางสายพนธของ

Enterobacter, Hafnia, Yersinia และ Serratia จดเปน psychrotrophic bacteria ซงสามารถเจรญ

134


ไดทอณหภมตาถง 0 C การบมทอณหภมตา (4 C, 10 C, 25 C และ 30 C) อาจชวยเพมประสทธภาพ

ในการตรวจวเคราะหตวอยางอาหารแชเยนทอาจมการปนเปอนของ Enterobacteriaceae

กลม psychrotrophic bacteria การตรวจนบจานวน Enterobacteriaceae ทาไดโดยนาตวอยาง

เรมตน หรอตวอยางทเจอจาง ตามความเหมาะสม (1:10 หรอ 1:100, …) ปเปตลงบนจานเพาะเชอ

เทดวยอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง ผสมใหเขากน ตงทงไวใหวนแขง เททบหนาดวยอาหาร

เลยงเชอชนดเดยวกน เมอวนแขง นาไปบมทอณหภม 35 C และนบจานวนโคโลน



5.1.1 Violet red bile glucose agar (VRBGA)

5.1.2 สารละลายสาหรบเจอจาง (diluent): Butterfield’s phosphate buffered dilution water

หรอ 0.1% peptone water


-





6.1.3 เครองบดปน (blender) หรอเครองตผสมอาหาร (stomacher)

6.1.4 เครองนบโคโลน (colony counter)

6.1.5 ตอบเพาะเชอ (incubator) 35 ± 1 C



6.1.8 อางนาแบบควบคมอณหภม (water bath) 45 ± 2 C

6.2 อปกรณ

6.2.1 โถปน (blender jar) หรอถงตผสมอาหาร (stomacher bag)




135




7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขง ตดตวอยางจากหลาย ๆ ตาแหนงใหเปนชนเลก ๆ ผสม

ใหเขากน กรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนด เขยาใหทว สมตวอยาง 25 กรม

(สามารถเพมขนาดของตวอยางได เชน 50 กรม) ใสในภาชนะปราศจากเชอ

(กรณตวอยางเปนอาหารแชแขง จะตองละลาย (thawed) ตวอยางกอนโดยนาไปไวท

อณหภม 2-5 C ประมาณ 18 ชวโมง กอนการวเคราะห)

7.1.2 กรณทตวอยางเปนของเหลว เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทหรอ

ปเปต ตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทา ๆ กนใสในภาชนะปราศจากเชอ ใหได

ปรมาตรรวมไมนอยกวา 100 มลลลตร เขยาใหเขากน (ตวอยางเรมตน)


เจอจางตวอยางตามลาดบ ลาดบละ 10 เทา (serial ten-fold dilutions) ดวยสารละลายสาหรบ

เจอจาง ดงน

7.2.1 กรณ 7.1.1 เทสารละลายสาหรบเจอจาง 225 มลลลตร (กรณเพมขนาดของตวอยาง

อตราสวนของนาหนกตวอยางตอปรมาตรของสารละลายสาหรบเจอจางเทากบ

1:10 เชน ชงตวอยาง 50 กรม เตมสารละลายสาหรบเจอจาง 450 มลลลตร) ผสม

ใหเขากนโดยใชเครองตผสมอาหารหรอเครองบดปน 2 นาท จะไดตวอยางเจอจาง 1:10

7.2.2 กรณ 7.1.2 ปเปตตวอยาง 10 มลลลตร ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง 90 มลลลตร

เขยาใหเขากน จะไดตวอยางเจอจาง 1:10

7.2.3 ปเปตตวอยางเจอจาง 1:10 มา 10 มลลลตร ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง 90 มลลลตร

เขยาใหเขากน จะไดตวอยางเจอจาง 1:100 ทาเชนนตอไปจนไดตวอยางทเจอจาง

ตามทตองการ

7.3 การตรวจปรมาณ (enumeration) โดยวธ pour plate: ภาคผนวก 2

7.3.1 ปเปตตวอยางเรมตนหรอตวอยางทระดบการเจอจาง 1:10 หรออน ๆ ตามความ

เหมาะสม 1 มลลลตร ลงในจานเพาะเชอ

7.3.2 เท VRBGA ประมาณ 10 มลลลตร ลงในจานเพาะเชอ ผสมใหเขากน ตงทงไวให

วนแขงเททบหนาดวย VRBGA ประมาณ 5-8 มลลลตร เมอวนแขงควาจานเพาะเชอ

7.3.3 บมท 35 C 18-24 ชวโมง

7.3.4 นบโคโลนสแดงอมมวง ทมโซนขนลอมรอบ (โซนเกดจาก precipitated bile acids)

ขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 0.5 มลลเมตร ควรเลอกจานเพาะเชอทมเชอเจรญ

15-150 โคโลน

136



นาจานวนทนบไดคณดวย 1/d

(d = dilution = ระดบความเจอจางเเรกทใชนบจานวน)


9.1 จานวน Enterobacteriaceae/นาหนก หรอปรมาตร (เชน กรม หรอมลลลตร)

9.2 กรณไมพบโคโลนลกษณะเฉพาะ

ตวอยางเปนของแขงหรอของเหลวขนหนดทระดบการเจอจางแรก ใหรายงาน

นอยกวา 10

ตวอยางของเหลวทตวอยางเรมตน ใหรายงาน นอยกวา 1 หรอไมพบ

9.3 รายงานผลเปนตวเลขนยสาคญสองตาแหนง ตวเลขตงแตตาแหนงทสามขนไปใหปรบ

เปนเลขศนย โดยเพมตวเลขตาแหนงทสองขนหนงอนดบเมอตวเลขตาแหนงทสามเปน

5, 6, 7, 8, 9 และคงตวเลขตาแหนงทสองไวเชนเดม เมอตวเลขตาแหนงทสามเปน 1, 2, 3, 4

1 15,500 16,000

2 15,400 15,000

ตวอยาง คาทคานวณได ผลวเคราะห (CFU/กรม)



10.2 ภาคผนวก 2 : แผนภมการตรวจปรมาณ (enumeration) Enterobacteriaceae ในอาหาร

137



อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culture media and reagents)


1. Violet red bile glucose agar (VRBGA)


Peptone 7 กรม

Sodium chloride (NaCl) 5 กรม


Glucose 10 กรม



Agar 12 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ตมใหเดอดนาน 2 นาท pH 7.4 ± 0.2

2. Butterfield’s phosphate buffered dilution water

2.1 stock solution



ชง KH2PO4 34 กรม ละลายในนากลน 500 มลลลตร ปรบ pH 7.2 ดวย 1N NaOH

(NaOH 40 กรม ละลายในนากลนหรอนากรอง ปรบปรมาตรเปน 1,000 มลลลตร)

ประมาณ 175 มลลลตร ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท

2.2 diluent

ปเปต stock solution 1.25 มลลลตร ปรบปรมาตรเปน 1 ลตรดวยนากลนหรอนากรอง

แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตรทตองการ ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.2 ± 0.2

3. 0.1% peptone water

Peptone 1 กรม


ละลาย peptone ในนากลนหรอนากรอง แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตรทตองการ

ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.0 ± 0.2

138



ตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม (1:10 หรอ 1:100, …..)

1 มลลลตร

เท VRBGA 10 มลลลตร ผสมใหเขากน ตงทงไวใหวนแขง

เท VRBGA 5-8 มลลลตร ทบหนา ตงทงไวใหวนแขง

35 C 18-24 ชวโมง

นบจานวนโคโลนสแดงอมมวงทมโซนขนลอมรอบ (15-150 โคโลน)

คานวณ


แผนภม การตรวจปรมาณ (enumeration) Enterobacteriaceae ในอาหาร

139


DMSc F 2023 : วธตรวจวเคราะห Enterococci ในอาหาร

Analytical method of Enterococci in food


วธนใชในการตรวจวเคราะหปรมาณแบคทเรยในกลม enterococci ในอาหาร ครอบคลม

การตรวจปรมาณ (enumeration)


American Public Health Association. Compendium of Methods for The Microbiological

examination of foods. 5th ed. 2015. Chapter 10 “Enterococci”.


3.1 S. equinus = Streptococcus equinus

3.2 S. bovis = Streptococcus bovis

3.3 E. faecium = Enterococcus faecium

3.4 E. faecalis = Enterococcus faecalis

3.5 E. avium = Enterococcus avium


enterococci เปนแบคทเรยแกรมบวก รปกลม หรอกลมร อยเปนค บางครงเรยงตอกนเปน

สายสน ไมสรางสปอร ไมสรางเอนไซม catalase เจรญไดในทมออกซเจนและไมมออกซเจน

(facultative anaerobe) สามารถเจรญไดทอณหภม 45 C ในภาวะทมเกลอ (NaCl) 6.5% ท pH 9.6

และสวนใหญเจรญไดทอณหภม 10 C enterococci เปนกลมของแบคทเรยทอยในลาไสของ

สตวเลอดอนและเลอดเยนรวมทงแมลง fecal streptococci ทผลต antigen group D (ยกเวน

S. equinus และ S. bovis) จดเปน enterococci ปจจบนในวงการอตสาหกรรมอาหารใช

enterococci เปนตวบงชทดสาหรบสขลกษณะการผลตและสภาวะการเกบรกษาทเหมาะสม

การตรวจนบจานวน enterococci ในอาหาร อาจใชอาหารเลยงเชอไดหลายชนด Kenner fecal ( KF)

streptococcal agar เปนอาหารเลยงเชอทนยมใชในอาหารกล มอนทมใชผลตภณฑนม

มองคประกอบของนาตาลมอลโตส (maltose) และแลคโตส (lactose) ท enterococci

140


สวนใหญสามารถยอยและเปลยนเปนกรดได ม sodium azide ทสามารถยบยงการเจรญของ

เชอตาง ๆ รวมทงเชอ S. equinus และ S. bovis หลายสายพนธ และ Enterococcus spp.

บางสายพนธ และยงม 2, 3, 5 triphenyltetrazolium chloride (TTC) ซงจะถกรดวซ ทาใหโคโลน

มสชมพถงสแดงเขมขนอยกบชนดของเชอ การใช Fluorogenic gentamicin-thallous-carbonate

(FGTC) agar เปนอกวธหนงทเหมาะในการตรวจนบ enterococci ในอาหารไดหลากหลายประเภท

และอาจใหผลจานวนนบทสงกวา KF agar อยางนอย 2 เทา FGTC agar มองคประกอบของสาร

ทไมใช azide ในการยบยงเชออน การจาแนกเชอ enterococci เกดจากการยอยสลายแปง

(dyed starch) และ fluorogenic substrate

การตรวจนบจานวน enterococci ทาไดโดยนาตวอยางเรมตน หรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม

(1:10 หรอ 1:100, …) ปเปตลงบนจานเพาะเชอ เทดวยอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง

ผสมใหเขากน ตงทงไวใหวนแขง นาไปบมทอณหภม 35 C และนบจานวนโคโลน



5.1.1 Bile-esculin agar

5.1.2 Brain heart infusion (BHI) broth, BHI broth ทมเกลอ 6.5% NaCl และ BHI

broth pH 9.6

5.1.3 Fluorogenic gentamicin-thallous-carbonate (fGTC) agar

5.1.4 KF streptococcus (KF streptococcal) agar

5.1.5 สารละลายสาหรบเจอจาง (diluent): Butterfield’s phosphate buffered dilution water

หรอ 0.1% peptone water


5.2.1 1% aqueous triphenyltetrazolium chloride (TTC)

5.2.2 Gram stain reagents

5.2.3 3% hydrogen peroxide






141



6.1.5 ตอบเพาะเชอ (incubator) 35 ± 1 C และ 45 ± 1 C

6.1.6 ชดกรองเมมเบรน (membrane filter unit)



6.1.9 Ultraviolet (UV) lamp: 365 nm wavelength (long-wave)


6.1.11 อางนาแบบควบคมอณหภม (water bath) 45 ± 1 C และ 47 ± 2 C

6.2 อปกรณ




6.2.4 แผนกรองเมมเบรนปราศจากเชอ pore size 0.45 µm







7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขง ตดตวอยางจากหลายๆ ตาแหนงใหเปนชนเลก ๆ ผสม

ใหเขากน กรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนด เขยาใหทว สมตวอยางตามปรมาณ

ทตองการ เชน 50 กรม ใสในภาชนะปราศจากเชอ


ปเปต ตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทาๆ กนใสในภาชนะปราศจากเชอ ใหได

ปรมาตรรวมไมนอยกวา 100 มลลลตร เขยาใหเขากน (ตวอยางเรมตน)




7.2.1 กรณ 7.1.1 เทสารละลายสาหรบเจอจาง ปรมาตร 9 เทาของปรมาณตวอยาง

ผสมใหเขากนโดยใชเครองตผสมอาหารหรอเครองบดปน 1-2 นาท จะไดตวอยาง

เจอจาง 1:10

142


7.2.2 กรณ 7.1.2 ปเปตตวอยาง 10 มลลลตร ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง 90 มลลลตร

เขยาใหเขากน จะไดตวอยางเจอจาง 1:10

7.2.3 ปเปตตวอยางเจอจาง 1:10 มา 10 มลลลตร ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง 90 มลลลตร



7.3 การตรวจปรมาณ (enumeration) โดยวธ pour plate: ภาคผนวก 2

7.3.1 ปเปตตวอยางเรมตนหรอตวอยางทระดบการเจอจาง 1:10 หรออนๆ ตามความเหมาะสม

1 มลลลตร ลงในจานเพาะเชอระดบการเจอจางละ 2 จานเพาะเชอ (duplicate)

ถาคาดวาเชอมปรมาณนอย ใหปเปตตวอยางทระดบการเจอจาง 1:10 ลงในจานเพาะเชอ

10 จาน จานละ 1 มลลลตร กรณนนาผลรวมของจานวนโคโลนบน 10 จานเพาะเชอ

รายงานเปนจานวนโคโลนตอกรม

7.3.2 เท KF Streptococcal agar หรอ fGTC agar ประมาณ 12-15 มลลลตร ลงใน

จานเพาะเชอ ผสมใหเขากน ตงทงไวใหวนแขง แลวควาจานเพาะเชอ 18-24 ชวโมง

ลกษณะโคโลนเฉพาะของ enterococci

KF Streptococcal agar โคโลนสชมพหรอสแดง

fGTC agar สงเกตการยอยสลายแปง (เกดโซนใสรอบๆ โคโลน) และการเรองแสง

(เกดโซนเรองแสงสฟา เมอเปดจานเพาะเชอภายใตแสง UV) จาแนกได 3 กลมคอ

1. ยอยสลายแปงและเรองแสง แสดงวาเปน S. bovis

2. ไมยอยสลายแปงแตเรองแสง แสดงวาเปน E. faecium และ related biotypes

3. ไมยอยสลายแปงหรอไมเรองแสง แสดงวาเปน E. faecalis, E. avium,

S. equinus และ streptococci ตวอน

7.3.3 นบจานวนโคโลนดงน

7.3.3.1 นบจานวนโคโลนสชมพและสแดงทงหมดบน KF Streptococcal agar

7.3.3.2 นบจานวนโคโลนทงหมดบน fGTC agar ซงสามารถรายงานแยกกลมได

ตามการยอยสลายแปงและการเรองแสง

7.4 การตรวจยนยน (Confirmation)

เลอกโคโลนลกษณะเฉพาะ 5-10 โคโลนไปตรวจยนยนโดยเขยเชอลงใน BHI broth

บมท 35 C 18-24 ชวโมง ทดสอบตอดงน

การยอมสแกรม

enterococci เปนแบคทเรยแกรมบวก รปกลม หรอกลมร อยเปนค บางครงเรยงตอกน

เปนสายสน

143


การสรางเอนไซม catalase

เตม 3% hydrogen peroxide ปรมาตร 1 มลลลตร ลงใน BHI broth ดการเกดฟองกาซ

ผลบวก : เกดฟองกาซ

ผลลบ : ไมเกดฟองกาซ

enterococci ใหผลลบ

การเจรญในอาหารเลยงเชอทมเกลอ 6.5%

เขยเชอลงใน BHI broth ทมเกลอ (NaCl) 6.5% บมท 35 C 72 ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอขน

ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมขน

enterococci ใหผลบวก

การเจรญท 45 C

เขยเชอลงใน BHI broth (pre-warmed ทอณหภม 45 C) บมท 45 C 72 ชวโมง




การเจรญท pH 9.6

เขยเชอลงใน BHI broth pH 9.6 บมท 35 C 72 ชวโมง




การยอย esculin

เขยเชอลงบน bile-esculin agar บมท 35 C 24 ชวโมง

ผลบวก : มเชอเจรญและอาหารเลยงเชอเปลยนเปนสนาตาลหรอสดา

ผลลบ : ไมมเชอเจรญและอาหารเลยงเชอไมเปลยนส



กรณนบโคโลนทมลกษณะเฉพาะและตรวจยนยนพบวาเปน enterococci บางโคโลน ใหนาสดสวน

ทยนยนแลววา เปน enterococci ไปคณจานวนทนบไดและคณ 1/d (d = dilution = ระดบการเจอจาง

เเรกทใชนบจานวน) ตวอยาง เชน การตรวจโดยใชปรมาตรตวอยาง 1 มลลลตร ทระดบ

144


การเจอจาง 10-4 จานวน 2 จานเพาะเชอ นบจานวนโคโลนเฉลยได 65 เมอสม 5 โคโลนไปตรวจ

ยนยน แลวพบวาเปน enterococci 4 โคโลน ดงนนสดสวนเทากบ 4/5

จานวน Enterococci CFU/กรม หรอมลลลตร = (โคโลนทนบได × สดสวน) × 1/d

= (65 × 4/5) × 1/10-4 = 520,000


9.1 จานวน Enterococci/นาหนก หรอปรมาตร (เชน กรม หรอมลลลตร)

9.2 กรณไมพบโคโลนลกษณะเฉพาะ

ตวอยางเปนของแขงหรอของเหลวขนหนดทระดบการเจอจางแรก ใหรายงาน นอยกวา 10

ตวอยางของเหลวทตวอยางเรมตน ใหรายงาน นอยกวา 1 หรอไมพบ




1 15,500 16,000

2 15,400 15,000




10.2 ภาคผนวก 2 : แผนภมการตรวจปรมาณ (enumeration) Enterococci ในอาหาร

145






1. Bile esculin agar

Beef extract 3 กรม

Peptone 5 กรม

Esculin 1 กรม

Oxgall 40 กรม

Ferric citrate 0.5 กรม

Agar 15 กรม



pH 6.6 + 0.2 เอยงหลอดและปลอยใหวนแขง

2. Brain heart infusion (BHI) broth

Brain heart-infusion 6 กรม

Peptic digest of animal tissue 6 กรม


Dextrose 3 กรม

Pancreatic digest of gelatin 14.5 กรม

di-sodium hydrogen phosphate 2.5 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดตามปรมาตร

ทตองการ ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.4 ± 0.2

3. Brain heart infusion (BHI) broth + 6.0% NaCl

ใชอาหารเลยงเชอ BHI broth สาเรจรป หรอเตรยมตามสตรขอ 2 โดยเตม NaCl 6.0 กรมตอ

อาหารเลยงเชอ 100 มลลลตร

146


4. Brain heart infusion (BHI) broth pH 9.6

ใชอาหารเลยงเชอ BHI broth สาเรจรป หรอเตรยมตามสตรขอ 2 ปรบ pH เปน 9.6

5. Fluorogenic gentamicin-thallous-carbonate (fGTC) agar

5.1 base medium

Tryptic soy agar 40 กรม


Amylose azure 3 กรม

NaHCO3 2 กรม

Galactose 1 กรม

Thallous acetate 0.5 กรม

4-Methylumbelliferone-α-D-Glucuronide 100 100 มลลกรม

Tween 80 0.75 มลลลตร

Gentamicin sulfate 2.5 มลลกรม


ละลายสวนประกอบทงหมดยกเวน NaHCO3 และ gentamicin sulfate ในนากลนหรอ

นากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจน agar ละลาย pH 7.3 ± 0.2

5.2 Gentamicin sulfate solution

อาจเตรยมสารละลายทมความเขมขน 1.0 มลลกรม/มลลลตร ในนากลนทปราศจากเชอ

(เกบท 5 C)

5.3 NaHCO3 solution

เตรยมสารละลาย 10% w/v ควรเตรยมใหมทกครงทใชงาน โดยตมใหเดอด

การใชงาน

เตม gentamicin sulfate solution 2.5 มลลลตร และ NaHCO3 solution 20 มลลลตร ลงใน

base medium 1 ลตร ททาใหเยนจนมอณหภม 55 C ผสมใหเขากน

6. KF streptococcus (KF streptococcal) agar

6.1 base medium

Proteose peptone 10 กรม



147


Sodium glycerophosphate 10 กรม

Maltose 20 กรม

Lactose 1 กรม

Sodium azide 0.4 กรม


Agar 15 กรม



pH 7.2 ± 0.2

6.2 stock solution (1% 2, 3, 5 triphenyltetrazolium chloride)

2, 3, 5 triphenyltetrazolium chloride 1 กรม


ละลาย 2, 3, 5 triphenyltetrazolium chloride ในนากรองหรอนากลน กรองผานเมมเบรน

0.45 µm เกบในขวดปราศจากเชอ


หลอม base medium ทาใหเยนท 45 C และเตม stock solution 1% การใชงาน

7. Butterfield’s phosphate buffered dilution water

7.1 stock solution



ชง KH2PO4 34 กรม ละลายในนากลน 500 มลลลตร ปรบ pH 7.2 ดวย 1N NaOH

(NaOH 40 กรม ละลายในนากลนหรอนากรอง ปรบปรมาตรเปน 1,000 มลลลตร) ประมาณ

175 มลลลตร ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท

7.2 diluent

ปเปต stock solution 1.25 มลลลตร ปรบปรมาตรเปน 1 ลตรดวยนากลนหรอนากรอง

แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตรทตองการ ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.2 ± 0.2

8. 0.1% peptone water

Peptone 1 กรม


148


ละลาย peptone ในนา กลนหรอนากรอง แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตรทตองการ

ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.0 ± 0.2


1. Gram stain reagents ใชชนดสาเรจรป

2. 3% hydrogen peroxide (H2O2)

นา 10% hydrogen peroxide ปรมาตร 30 มลลลตร เตมนากลน 70 มลลลตร ผสมใหเขากน

หรอเปอรเซนตอนๆ โดยปรบใหเปน 3% หรอใชชนดสาเรจรป

149



ตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม (1:10, 1:100, ….)

1 มลลลตร (duplicate)

KF streptococcal agar หรอ fGTC agar

35 C 48 ± 2 ชวโมง 35 C 18-24 ชวโมง

นบโคโลนสชมพและสแดง นบโคโลนทมลกษณะเฉพาะ

สม 5-10 โคโลนเพอตรวจยนยน

เขยเชอลง BHI broth

ยอมสแกรม

+

BHI ทมเกลอ 6.5%

+

catalase

-

BHI 45 C

+

BHI pH 9.6

+

bile-esculin agar

+

คานวณ


แผนภม การตรวจปรมาณ (enumeration) Enterococci ในอาหาร

บม 35 C 18-24 ชวโมง

151


DMSc F 2024 : วธตรวจวเคราะห mesophilic lactic acid bacteria ในอาหาร

โดยเทคนคการนบโคโลนทอณหภม 30 C

Analytical method of mesophilic lactic acid bacteria in

food-Colony-count technique at 30 °C


วธนใชในการตรวจวเคราะหปรมาณแบคทเรยในกลม mesophilic lactic acid bacteria ในอาหาร

ครอบคลมการตรวจปรมาณ (enumeration)


ISO 15214: 1998 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for

the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria — Colony-count technique at 30 C.


-


การตรวจ mesophilic lactic acid bacteria ตามวธนหมายถง จานวนแบคทเรยทสามารถเจรญ

สรางโคโลนบนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) agar pH 5.7

ทอณหภม 30 C 3 วน แตเชอ mesophilic lactic acid bacteria บางชนดไมสามารถเจรญหรอ

เจรญไดไมดบน MRS pH 5.7 สาหรบบางผลตภณฑอาหารอาจมเชอ psychotrophic หรอ

thermophilic lactic acid bacteria ซงในการเพาะเลยงจาเปนตองใชอณหภมทตางออกไป

การตรวจปรมาณ mesophilic lactic acid bacteria สามารถตรวจสอบดวยวธ conventional plate

count method (pour plating) โดยนาตวอยางเรมตน หรอทเจอจางตามความเหมาะสม (1:10

หรอ 1: 100, ...) ปเปตลงบนจานเพาะเชอ เทดวยอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง ผสมใหเขากน

ตงทงไวใหวนแขง หรออาจใชวธเกลยบนผวหนาอาหารเลยงเชอ (surface plating) นาไปบม และ

นบจานวน

152




5.1.1 de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) agar

5.1.2 de Man, Rogosa and Sharpe with sorbic acid (MRS-S) agar

5.1.3 สารละลายสาหรบเจอจาง (diluent): peptone salt solution


5.2.1 Gram stain reagents

5.2.2 3% hydrogen peroxide







6.1.5 ตอบเพาะเชอ (incubator) 30 ± 1 C




6.1.9 อางนาแบบควบคมอณหภม (water bath) 47 ± 2 C

6.2 อปกรณ







153




7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขง ตดตวอยางจากหลายๆ ตาแหนงใหเปนชนเลก ๆ ผสม

ใหเขากน กรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนด เขยาใหทว สมตวอยางตามปรมาณ

ทตองการอยางนอย 10 กรม (ยกเวนกรณทมตวอยางไมเพยงพอ) ใสในภาชนะ

ปราศจากเชอ


ปเปต ตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทาๆ กนใสในภาชนะปราศจากเชอ

ใหไดปรมาตรรวมไมนอยกวา 100 มลลลตร เขยาใหเขากน (ตวอยางเรมตน)




7.2.1 กรณ 7.1.1 เทสารละลายสาหรบเจอจาง ปรมาตร 9 เทาของปรมาณตวอยาง ผสม

ใหเขากนโดยใชเครองตผสมอาหารหรอเครองบดปน 1-2 นาท จะไดตวอยางเจอจาง

1:10

7.2.2 กรณ 7.1.2 ปเปตตวอยาง 10 มลลลตร (ยกเวนกรณทมตวอยางไมเพยงพอ) ใสใน

สารละลายสาหรบเจอจางปรมาตร 9 เทาของปรมาตรตวอยาง เขยาใหเขากน จะได

ตวอยางเจอจาง 1:10

7.2.3 ปเปตตวอยางเจอจาง 1:10 ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง 9 เทาของปรมาตรตวอยาง



7.3 การตรวจปรมาณ (enumeration) โดยวธ pour plating: ภาคผนวก 2

หมายเหต 1. สามารถใชวธ surface plating แทนวธ pour plating ได แตใหบมภายใต

สภาวะ anaerobic หรอ microaerobic โดยอาจบมใน candle jar

2. อาจใชวธเททบหนา (double – layer) ดวยอาหารเลยงเชอ MRS agar

7.3.1 ปเปตตวอยางเรมตนหรอตวอยางทระดบการเจอจาง 1:10 หรออนๆ ตามความเหมาะสม

1 มลลลตร ลงในจานเพาะเชอระดบการเจอจางละ 2 จานเพาะเชอ (duplicate)

(กรณทคาดวาตวอยางมเชอ lactic acid bacteria ปรมาณมาก อาจปเปตตวอยางเฉพาะ

ระดบการเจอจางทจาเปน เพอใหไดจานวนโคโลนทพอเหมาะในการนบ)

7.3.2 เท MRS agar ประมาณ 15 มลลลตร ลงในจานเพาะเชอ ผสมใหเขากน ตงทงไวให

ว นแขง แลวควาจานเพาะเชอ (กรณตรวจตวอยางทมยสตปนเปอนปรมาณมาก

เชน ไสกรอกชนดแหง (dried sausage) ใหใช MRS-S agar แทน MRS agar)

154


7.3.3 บมท 30 C 72 ± 3 ชวโมง

หมายเหต ในระหวางบม ควรระวงไมใหวนแหงเกนไป เพราะมผลยบยงการเจรญ

ของเชอ

7.3.4 นบจานวนโคโลนท 2 ระดบการเจอจางตดกน ทมเชอเจรญนอยกวา 300 โคโลน

แตตองมากกวา 15 โคโลนอยางนอย 1 จานเพาะเชอ

หมายเหต 1. Leuconostoc spp. บางสายพนธอาจสรางโคโลนทมลกษณะเปนเมอก

ขนาดใหญ ซงอาจบดบงโคโลนอน และทาใหจานวน lactic acid

bacteria ทนบไดตากวาความเปนจรง

2. ในบางกรณหรอบางผลตภณฑมโอกาสพบเชออนทไมใช lactic acid

bacteria บน MRS agar จงอาจจาเปนตองตรวจยนยนเชอ โดยเทคนค

งาย ๆ เชน ยอมสแกรม หรอทดสอบการสราง catalase กบ 3%

hydrogen peroxide และถาทาการตรวจยนยนควรระบในรายงานผล

การวเคราะหดวย

ผล : mesophilic lactic acid bacteria ตดสแกรมบวก และ catalase ลบ (ไมเกดฟองกาซ)

8. การคานวณ (Calculation of results) 8.1 กรณทตรวจยนยน แลวปรากฏวาเปน mesophilic lactic acid bacteria บางโคโลน ใหนา

สดสวนทยนยนแลววาเปน mesophilic lactic acid bacteria คณจานวนทนบได เชน

จากจานวนโคโลนทขนบน 1 จานเพาะเชอ นบได 100 โคโลน สมยนยน 5 โคโลน ปรากฏ

วาเปน mesophilic lactic acid bacteria 4 โคโลน ดงนนจานวน mesophilic lactic acid

bacteria คอ (4/5) × 100 เทากบ 80 โคโลน และคานวณเชนนทกจานเพาะเชอทเลอกนบ

แลวนาผลทไดมาคานวณตามสตร

N = จานวน mesophilic lactic acid bacteria ตอ กรมหรอมลลลตร

= ผลรวมของจานวนโคโลนทงหมดทตรวจยนยนแลวทคานวณไดจากทกจาน

เพาะเชอของ 2 ระดบทเลอก

V = ปรมาตรของ inoculum ทใสในแตละจานเพาะเชอ มหนวยเปนมลลลตร

n1 = จานวนของจานเพาะเชอทนามานบโคโลน ทระดบการเจอจางแรกทเลอก

n2 = จานวนของจานเพาะเชอทนามานบโคโลน ทระดบการเจอจางท 2 ทเลอก

d = ระดบการเจอจางแรกทเลอก

c

155


ตวอยาง :

ทระดบการเจอจาง 10-2 จานวนเชอทตรวจยนยนแลว 168, 215 โคโลน

ทระดบการเจอจาง 10-3 จานวนเชอทตรวจยนยนแลว 14, 25 โคโลน

จานวน mesophilic lactic acid bacteria/กรม = 168 + 215 + 14 + 25

1(2 + 0.1 × 2) 10-2

= 422

0.022

= 19182

= 1.9 × 104

8.2 กรณทตวอยางเรมตนหรอตวอยางเจอจางเรมตน มจานวนโคโลนนอยกวา 15 โคโลน

ทง 2 จานเพาะเชอ คานวณหาจานวนโคโลนเฉลย และรายงานดงน

กรณตวอยางเปนของเหลว NE = Y

กรณตวอยางอน NE = Y/d

NE = จานวน mesophilic lactic acid bacteria/กรมหรอมลลลตร

Y = คาเฉลยของโคโลนทนบได จาก 2 จานเพาะเชอ

d = ระดบการเจอจางของตวอยางเจอจางเรมตน

ตวอยาง :

ทระดบการเจอจาง 10-1 มจานวนโคโลน 4, 4 โคโลน

จานวน mesophilic lactic acid bacteria/กรม = 4

10-1

= 40

8.3 กรณทตวอยางเรมตนหรอตวอยางเจอจางเรมตน ไมมเชอเจรญ ทง 2 จานเพาะเชอ ใหรายงาน

ดงน

กรณตวอยางเปนของเหลว จานวน mesophilic lactic acid bacteria/มลลลตร นอยกวา 1

กรณตวอยางอน จานวน mesophilic lactic acid bacteria/กรม นอยกวา 1/d

d = ระดบความเจอจางของตวอยางเจอจางเรมตน

156



9.1 จานวน mesophilic lactic acid bacteria/นาหนก หรอปรมาตร (เชน กรม หรอมลลลตร)




1 15,500 16,000

2 15,400 15,000




10.2 ภาคผนวก 2 : แผนภมการตรวจปรมาณ (enumeration) mesophilic lactic acid bacteria

ในอาหาร

157






1. de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) agar pH 5.7




Triammonium citrate (NH4)3 C6H5O7 2 กรม

Sodium acetate (CH3COONa) 5 กรม

Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) 0.2 กรม

Manganese sulfate tetrahydrate (MnSO4.4H2O) 0.05 กรม

Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 2 กรม

Glucose (C6H12O6) 20 กรม

Polyoxyethylenesorbitan monooleate (Tween 80) 1.08 กรม



ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสขวดตามปรมาตร


หมายเหต สามารถใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปพรอมใช (ready-to-use) แตกรณทมสวน

ประกอบและ pH ตางจากทระบ อาจใหผลการตรวจทแตกตางกน


158


2. de Man, Rogosa and Sharpe with sorbic acid (MRS-S) agar

Sorbic acid 1.4 กรม

1 M sodium hydroxide ประมาณ 10 มลลลตร

เตรยมสารละลาย sorbic acid โดยละลายสวนประกอบเขาดวยกน กรองผานเมมเบรน

แลวใสลงใน MRS agar ทปราศจากเชอ 1,000 มลลลตร (ตามขอ 1.) อณหภมประมาณ 47 C

pH 5.7 ± 0.1

3. Peptone salt solution

Peptone (enzymatic digest of casein) 1 กรม

Sodium chloride (NaCl) 8.5 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสขวดหรอหลอด

ตามปรมาตรทตองการ ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.0 ± 0.2


1. Gram stain reagents ใชชนดสาเรจรป

2. 3% hydrogen peroxide (H2O2)

นา 10% hydrogen peroxide ปรมาตร 30 มลลลตร เตมนากลน 70 มลลลตร ผสมใหเขากน

หรอเปอรเซนตอนๆ โดยปรบใหเปน 3% หรอใชชนดสาเรจรป

159



ตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม (1:10 หรอ 1:100, …..)

1 มลลลตร

เท MRS agar หรอ MRS-S agar ~15 มลลลตร ผสมใหเขากน ตงทงไวใหวนแขง

35 C 18-24 ชวโมง

นบจานวนโคโลน (>15 ถง <300 โคโลน)

ตรวจยนยน

แกรมบวก/catalase ลบ

คานวณ


แผนภม การตรวจปรมาณ (enumeration) mesophilic lactic acid bacteria ในอาหาร

161


DMSc F 2025: วธตรวจวเคราะห Vibrio cholerae ในนาและนาแขง

Analytical method of Vibrio cholerae in water and ice


วธนใชในการตรวจวเคราะห Vibrio cholerae ในนาและนาแขง ครอบคลมการตรวจหา (detection)

Vibrio cholerae O1, Vibrio cholerae O139, Vibrio cholerae non - O1, Vibrio cholerae non - O139


American Public Health Association (AHPA). Standard Method for the Examination of Water

and Wastewater. 22nded. Washington DC; 2012. 9260 H, p. 9-160 – 9-166.

3. นยามศพทและคายอ (Term and abbreviation)

V. cholerae = Vibrio cholerae


V. cholerae เปนแบคทเรยแกรมลบ รปรางเปนทอนตรง หรอทอนโคง เคลอนทไดดวย

แฟลกเจลลาทปลายเซลล ไมสรางสปอร สรางเอนไซม oxidase สามารถเปลยนนาตาลกลโคส

(glucose) เปนกรดโดยไมสรางกาซ สามารถเจรญไดในสภาวะทมเกลอ 0-2% เชอนมกพบได

ปรมาณนอยและพบรวมกบแบคทเรยใน Vibrionaceae family หรอ family อน ๆ ทมปรมาณมาก

การตรวจหา V. cholerae มขนตอนสาคญ 4 ขนตอน ดงน

4.1 การทาใหเชอเขมขน (Concentration) เปนขนตอนทใชเทคนคการกรองตวอยางผานแผน

กรองเมมเบรน (membrane filter) ทมร (pore size) ขนาด 0.45 µm

4.2 การเพมปรมาณเชอ (enrichment) เปนขนตอนทนาแผนกรองทมเชอจลนทรยไปใสในอาหาร

เลยงเชอทไมเตมสารยบยง (nonselective enrichment) และอาหารเลยงเชอทเตมสาร

ยบยง (selective enrichment) แลวบมเพาะเชอเพอให V. cholerae ทไดรบบาดเจบ หรอ

เครยดฟนตว และเพมปรมาณ

4.3 การแยกเชอ (isolation) บนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง

4.4 การตรวจยนยน (confirmation) นาโคโลนทมลกษณะเฉพาะ และโคโลนทสงสย ตรวจยนยน

ทางชวเคม และนาเหลองวทยา

162




5.1.1 Alkaline peptone water

5.1.2 Alkaline peptone water-saltless

5.1.3 Alkaline peptone water-saltless ทเตม colistin หรอ polymyxin B

5.1.4 Saline medium for detection of arginine dihydrolase (ADH), Moeller’s

5.1.5 Saline medium for detection of lysine decarboxylase (LDC), Moeller’s

5.1.6 Saline medium for detection of ornithine decarboxylase (ODC), Moeller’s

5.1.7 Saline nutrient agar (SNA)

5.1.8 0%, 1%, 6%, 8% และ 10% saline nutrient broth

5.1.9 Sheep blood agar

5.1.10 Thiosulfate citrate bile salts (TCBS) agar


5.2.1 Oxidase reagent

5.2.2 Polyvalent V. cholerae O1 antiserum

5.2.3 Sterile mineral oil

5.2.4 V. cholerae Inaba antiserum

5.2.5 V. cholerae Ogawa antiserum

5.2.6 V. cholerae O139 antiserum

5.2.7 นาเกลอ 0.85%





6.1.3 ตอบเพาะเชอ (incubator) 36 C

6.1.4 ชดกรองเมมเบรน (membrane filter unit)


6.1.6 เครองดดสญญากาศ (vaccum pump) 220 โวลต 50 เฮรตซ

163


6.2 อปกรณ


6.2.2 forceps ปากแบนและผวเรยบ



6.2.5 แผนกรองเมมเบรนปราศจากเชอ ขนาดเสนผานศนยกลาง 47 มลลเมตร,

pore size 0.45 µm







7.1.1 กรณทตวอยางเปนนา เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทตวอยางจาก

แตละภาชนะปรมาตรเทา ๆ กน ใสในภาชนะปราศจากเชอไมนอยกวา 200 มลลลตร

หรอปรมาตรอนทตองการทดสอบ

7.1.2 กรณทตวอยางเปนนาแขง เทตวอยางจากแตละหนวยภาชนะบรรจใสรวมกน

ในภาชนะปราศจากเชอ ทาใหตวอยางละลายจนหมด สมใหไดตวอยางไมนอยกวา

200 มลลลตร หรอปรมาตรอนทตองการทดสอบ

7.2 การเตรยมชดกรอง (Preparation of membrane filter unit)

7.2.1 เตรยมชดกรองเมมเบรน

7.2.2 ใช forceps ทฆาเชอแลวคบแผนกรองเมมเบรนปราศจากเชอ 1 แผนมาวางบน

สวนทเปนฐานรองรบกระดาษ วางกรวยกรองรบนาครอบบนฐานรบกระดาษใหสนท

7.3 การทาใหเชอเขมขน (Concentration)

7.3.1 เขยาตวอยางใหเขากนอยางนอย 25 ครง เทตวอยาง 100 มลลลตร หรอปรมาตรอน

ทตองการใชทดสอบลงในกรวยกรองโดยวธปราศจากเชอ แลวปดฝาครอบ

7.3.2 เปดเครองดดสญญากาศเพอใหนาไหลผานจนหมด แลวปดเครอง

7.3.3 ลางรอบ ๆ กรวยกรองดวยนากลนปราศจากเชอ หรอนากรองทมคณสมบต

เทยบเทาประมาณ 150 มลลลตร ปดฝาครอบแลวเปดเครองสญญากาศเพอให

นาไหลผานจนหมดแลวปดเครอง

7.3.4 ทาซาขอ 7.3.1-7.3.3 เพอใหไดแผนกรองเชอ 2 แผน

164



ใช forceps ปราศจากเชอคบแผนกรองหนงแผนใสใน alkaline peptone water-saltless

และอกหนงแผนใสใน alkaline peptone water หรอ alkaline peptone water-saltless ทเตม

colistin หรอ polymyxin B บมท 36 C 6-8 ชวโมง


7.5.1 นาเชอ 1 loop จากบรเวณผวหนาอาหารเลยงเชอทง 2 ชนดในขอ 7.4 ขดบน TCBS

agar และ sheep blood agar

7.5.2 บมตามคาแนะนาของผผลต

ลกษณะโคโลนเฉพาะของ V. cholerae

TCBS agar โคโลนสเหลอง

sheep blood agar สวนใหญยอยสลายเมดเลอดแดงชดเจน (strongly hemolytic)

7.5.3 เลอกโคโลนลกษณะเฉพาะ หรอโคโลนทสงสยอยางนอย 2-3 โคโลน จากอาหาร

เลยงเชอแตละชนด ขดบน SNA plate หรอ SNA slant บมท 36 C 24 ± 3 ชวโมง


นาเชอจาก SNA plate หรอ SNA slant (ขอ 7.5.3) ทดสอบดงน

7.6.1 การตรวจยนยนทางนาเหลองวทยา

7.6.1.1 เขยเชอทใหผลการตรวจยนยนทางชวเคม แลวแตะบนแผนกระจกทสะอาด

หยดนาเกลอ 0.85% 1 หยด ใช loop ผสมใหเขากน สงเกตการจบกนเปน

ตะกอน (agglutination) ถามตะกอนแสดงวาเปน auto-agglutination

7.6.1.2 ถาไมเกด auto-agglutination ใหทดสอบตอโดยเขยเชอแตะบนแผนกระจก

ทสะอาด หยด polyvalent V. cholerae O1 antiserum 1 หยด ผสมให

เขากน เอยงแผนกระจกไปมา 30-60 วนาท สงเกตการจบกนเปนตะกอน

และทาเชนเดยว กบ V. cholerae O139 antiserum ถามการจบกนเปน

ตะกอนแสดงวาใหผลบวก

กรณการทดสอบ polyvalent V. cholerae O1 antiserum ใหผลบวก อาจ

ทดสอบเชอกบ V. cholerae Inaba antiserum และ V. cholerae Ogawa

antiserum

7.6.2 การตรวจยนยนทางชวเคม

จาแนกชนด V. cholerae จากกลม Vibrio species โดยทดสอบรายการทสาคญ

(key differential tests) หรอตามรายการทงหมดในตารางท 1

7.6.2.1 รายการทสาคญ (key differential tests) ในการจาแนก Vibrio species

165


การทดสอบ halotolerance

เตรยม suspension ของเชอ และใส 1 loop ลงใน saline nutrient broth

ความเขมขนของเกลอ (NaCl) 0% และ 1% บมท 36 C 48 ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอขน (มการเจรญของเชอ)

ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมขน (ไมมการเจรญของเชอ)

V. cholerae ใหผลบวกในอาหารเลยงเชอทมความเขมขนของเกลอ

(NaCl) ท 0% และ 1%

Oxidase test

นาเชอขดบนกระดาษกรองทหยด oxidase reagent

(ไมใชหวงนกเกล -โครเมยม หรอลวดโลหะ)

ผลบวก : กระดาษกรองเปลยนเปนสมวงออน มวง หรอ

มวงเขมภายใน 10 วนาท

ผลลบ : กระดาษกรองไมเปลยนส

V. cholerae ใหผลบวก

Nitrate (reduction test)

ปฏบตตามวธของหองปฏบตการ


Inositol (myo-) fermentation

ปฏบตตามวธของหองปฏบตการ

V. cholerae ใหผลลบ

การตรวจหา arginine dihydrolase

เขยเชอลงบรเวณใตผวหนาของอาหารเลยงเชอ ADH แลวทบหนาดวย

sterile mineral oil ประมาณ 1 มลลลตร บมท 36 C 48 ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอขนสมวง


V. cholerae ใหผลลบ

การตรวจหา lysine decarboxylase

เขยเชอลงบรเวณใตผวหนาของอาหารเลยงเชอ LDC แลวทบหนาดวย





166


การตรวจหา ornithine decarboxylase

เขยเชอลงบรเวณใตผวหนาของอาหารเลยงเชอ ODC แลวทบหนาดวย





7.6.2.2 รายการทดสอบเพมเตม (additional differential tests) ตามตารางท 1

ใหทดสอบตามวธของหองปฏบตการ และตามสภาวะทระบไวทายตารางท 1

7.7 การแปลผล

7.7.1 โคโลนทตรวจยนยนทางนาเหลองวทยาแลวใหผลบวกชดเจนถอวาเปน presumptive

positive ใหตรวจยนยนผลทางชวเคม

7.7.2 โคโลนทเกด auto-agglutination หรอโคโลนทใหผลทางชวเคม และ/หรอทาง

นาเหลองวทยาไมชดเจน ใหสงตรวจยนยนทสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข

กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข หรอสถาบนอนทเชอถอได

167


ตารางท 1 ผลทดสอบทางชวเคม และคณลกษณะอน ๆ ของ Vibrio species 12 ชนด

168


ตารางท 1 ผลทดสอบทางชวเคม และคณลกษณะอน ๆ ของ Vibrio species 12 ชนด (ตอ)


-


V. cholerae /100 มลลลตร หรอตอปรมาตรททดสอบ พบ หรอไมพบ



10.2 ภาคผนวก 2 : แผนภมการตรวจหา (detection) V. cholerae ในนาและนาแขง

169






1. Alkaline peptone water



Sodium hydroxide (NaOH, 1N) ~6 มลลลตร

นากลนหรอนากรอง ~994 มลลลตร

ละลาย peptone และ NaCl ในนากลนหรอนากรอง และเตม 1N NaOH จนได pH 8.4

ประมาณ 6 มลลลตร ปรบปรมาตรใหได 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตร

ทตองการ ฆาเชอท 121 C 15 นาท

2. Alkaline peptone water-saltless Peptone 10 กรม

Sodium hydroxide (NaOH, 1N) ~6 มลลลตร

นากลนหรอนากรอง ~994 มลลลตร

ละลาย peptone ในนากลนหรอนากรอง และเตม 1N NaOH จนได pH 8.4 ประมาณ

6 มลลลตร ปรบปรมาตรใหได 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตรทตองการ

ฆาเชอท 121 C 15 นาท

3. Alkaline peptone water-saltless เตม colistin หรอ polymyxin B ใหทาตามคาแนะนาของผผลต

4. Saline medium for detection of arginine dihydrolase (ADH), Moeller’s

Arginine monohydrochloride 10 กรม

Peptone 5 กรม


Dextrose 0.5 กรม


170


Cresol red 5 มลลกรม

Pyridoxal 5 มลลกรม



ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอด 2-5 มลลลตร

ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 6.0 ± 0.2

5. Saline medium for detection of lysine decarboxylase (LDC), Moeller’s L-Lysine monohydrochloride 5 กรม

Peptone 5 กรม









ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 6.0 ± 0.2

6. Saline medium for detection of ornithine decarboxylase (ODC), Moeller’s

l-Ornithine monohydrochloride 5 กรม

Peptone 5 กรม









ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 6.0 ± 0.2

171


7. Saline nutrient agar (SNA)


Peptone 3 กรม




ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจนวนละลาย

แบงใสขวด หรอหลอดตามปรมาตรทตองการ ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.2 ± 0.2

เอยงหลอดและปลอยใหวนแขง

8. Saline nutrient broth (0%, 1%, 6%, 8%, 10% และ 12%)


Peptone 3 กรม

Sodium chloride (NaCl) 0, 10, 60, 80, 100 หรอ 120 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดตามปรมาตร


9. Sheep blood agar

9.1 Base medium

Meat peptone 15 กรม

Liver digest 2.5 กรม





ละลายสวนประกอบในนากลน 1,000 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.2 ± 0.2

9.2 Defibrinated sheep blood


เตม defibrinated sheep blood (ขอ 9.2) 5-7 มลลลตร ลงใน base medium (ขอ 9.1)

*ขนกบความแขงของวน (gel strength of the agar)

172


10. Thiosulfate citrate bile salts (TCBS) agar



Sodium citrate 10 กรม

Sodium thiosulfate 10 กรม

Iron (III) citrate 1 กรม


Dried bovine bile 8 กรม

Sucrose 20 กรม


Thymol blue 0.04 กรม



ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ตมเดอดจนวนละลาย

pH 8.6 ± 0.2


1. Oxidase reagent

N, N, N, N - tetramethyl-p-phenylenediamine 1 กรม

dihydrochloride (C10

H16

N2.2HCl)

นากลน 100 มลลลตร

ละลายสวนประกอบในนาเยน กอนใชงาน

2. Sterile mineral oil ใชชนดสาเรจรป

3. V. cholerae anti-sera ใชชนดสาเรจรป

4. นาเกลอ 0.85%

Sodium chloride (NaCl) 8.5 กรม


ละลาย NaCl ในนากลน 1,000 มลลลตร ฆาเชอท 121 C 15 นาท pH 7.0 ± 0.2

*ขนกบความแขงของวน (gel strength of the agar)

173



กรองตวอยาง

100 มลลลตร หรอปรมาตรทตองการทดสอบ 100 มลลลตร หรอปรมาตรทตองการทดสอบ

alkaline peptone water-saltless alkaline peptone water

หรอ alkaline peptone water-saltless

ทเตม colistin หรอ polymyxin B

36 C 6-8 ชวโมง

ขดบน TCBS agar และ Sheep blood agar

36 C 24±3 ชวโมง

โคโลนทมลกษณะเฉพาะหรอสงสย

เขยเชอจากแตละจานอาหารเลยงเชอลงบน SNA plate หรอ SNA slant

36 C 24±3 ชวโมง

ตรวจยนยนทางชวเคมและนาเหลองวทยา


แผนภม การตรวจหา (detection) V. cholerae ในนาและนาแขง

วธมาตรฐานทางกายภาพสาหรบการวเคราะหอาหาร



1. นายทนงพนธ สจจปาละ ผเชยวชาญเฉพาะดานสขลกษณะการผลต


2. นางสาวขนทอง เพชรนอก นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

3. นายกอเกยรต ศาสตรนทร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

176


วธมาตรฐานทางกายภาพสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย

รหสวธ รายการ หนาชนดอาหารMethod

Type

DMSc F 3003 เมลดธญพชและเมลดพช 1 177สงแปลกปลอม

177


DMSc F 3003: การวเคราะหสงแปลกปลอมชนดเบา (ภายนอก) ในเมลดธญพช

และเมลดพช

Determination of light filth (external) in grains and seeds


วธนใชในการวเคราะหสงแปลกปลอมชนดเบา (light filth) ทอยภายนอกเมลดธญพชและเมลดพช


2.1 AOAC Official Method 950.86: Light Filth (External) in Grains and Seeds

2.2 AOAC Official Method 945.75: Extraneous Materials (Foreign Matter) in Products

2.3 AOAC Official Method 970.66: Light and Heavy Filth

2.4 AOAC Official Method 941.16: Filth in Grain Products and Brewer’s Grits


สงแปลกปลอมชนดเบา (light filth) หมายถง สงแปลกปลอมทนารงเกยจ ไมเปนทยอมรบของ

ผบรโภคมลกษณะเปนชนเลก ๆ (particles) ลอยในชนนามน แยกจากผลตภณฑอาหารไดโดยใช

สวนผสมทเปนของเหลวทมชนนามน ตวอยาง light filth เชน แมลงทงตว ชนสวนของแมลง

ขนสตวฟนแทะ เสนขนของคน ขนนก (feather barbules)


แยกสงแปลกปลอมชนดเบา (จาพวกชนสวนแมลง ตวแมลง และขนสตว เปนตน) ออกจากอาหาร

โดยใช หลกการทสงแปลกปลอมชนดเบาจะลอยขนมาอยในชนของ heptane ซงสามารถแยกออก

โดยใช Wildman trap flask นาไปกรองแลวไปตรวจสอบภายใตกลองจลทรรศน

5. อาหารเลยงเชอและสารเคม (Culture media and reagents)

5.1 40% ethanol: ผสม ethanol กบ H2O ในอตราสวน 40:60

5.2 heptane: commercial n-heptane ซงม toluene นอยกวารอยละ 8

178



6.1 เครองชง (balance) ทมความละเอยด 0.01 กรม

6.2 Widefield stereoscopic microscope

6.3 Compound microscope

6.4 Magnetic stirring bar and stirrer-hot plate เปนแทงแมเหลกทเคลอบดวย teflon ขนาด

ยาวโดยประมาณ 47 มลลเมตร เสนผานศนยกลางภายนอก 9 มลลเมตร ใชกบ hot plate

ทสามารถปรบระดบความรอนและความเรวไดอยางตอเนอง

6.5 ชดเครองกรอง ประกอบดวย filtering flask ขนาด 2,000 มลลลตร Hirsch funnel

เสนผานศนยกลาง 7 เซนตเมตร และเครองปมสญญากาศ

6.6 Trap flask-Wildman ประกอบดวย erlenmeyer flask ขนาด 2,000 มลลลตร และ

stirring rod ซงเปนแทงโลหะเสนผานศนยกลาง 5 มลลเมตร มความยาวมากกวาความสง

ของ flask ประมาณ 10 เซนตเมตร สวนปลายของแทงโลหะมแผนยางรปวงกลม

เสนผานศนยกลาง 5 เซนตเมตร ตดอย

6.7 อางนาเยน (cooling bath)

6.8 Beaker ขนาด 500 มลลลตร

6.9 Cylinder ขนาด 100 มลลลตร

6.10 Forceps

6.11 Petri dish เสนผานศนยกลาง 100 เซนตเมตร

6.12 กระดาษกรอง Whatman 8 Liniert/Ruled เสนผานศนยกลาง 90 มลลเมตร

6.13 เขมเขย (needle)


7.1 ชงตวอยางเมลดธญพชหรอเมลดพช 225 กรม ลงใน trap flask ขนาด 2,000 มลลลตร

7.2 เตม 40% ethanol ลงไปใหไดปรมาตร 600 มลลลตร โดยผานผวดานในของ trap flask

7.3 นาไปตมบน hot plate ใหเดอดเบา ๆ นาน 5 นาท พรอมกวนตวอยางบอย ๆ โดยใช

magnetic stirrer

7.4 หลงจากนนนา trap flask ไปทาใหเยนลงอยางรวดเรวโดยแชในอางนาเยน ใหอณหภม

ลดลงถงอณหภมหอง

7.5 เตม 40% ethanol ลงไปใหไดปรมาตร 900 มลลลตร โดยผานผวดานในของ trap flask

7.6 เตม n-heptane ปรมาตร 30 มลลลตร ผาน stirring rod กวนตวอยางโดยใช magnetic stirrer

จน n-heptane แตกตวเปนเมดนาน 1 นาท เพอจบสงแปลกปลอมในตวอยาง

179


7.7 เตม 40% ethanol ใหชน n-heptane อยในชวงคอ trap flask ตงทงไว 30 นาท โดย 20 นาทแรก

ใหกวนทก ๆ 3-6 นาท สวน 10 นาทหลงใหตงทงไวเพอใหชน n-heptane แยกตว

7.8 หมน stirring rod เพอให เศษตวอยางและสงแปลกปลอมทอาจตดอยกบแผนยางหลดออก

ดงปลาย stirring rod โดยใหสวนปลายอกดานหนงทเปนแผนยางปดคอ flask ใหแนน

และใหชนของ 40% ethanol ทอยดานลางชน n-heptane มความสง 1 เซนตเมตรเหนอ

แผนยาง เทชน n-heptane ลงใน beaker ขนาด 500 มลลลตร ใช 40 % ethanol ลาง stirring

rod และคอ flask โดยรวมนาลางลงใน beaker

7.9 กรองของเหลวใน beaker และ 40% ethanol ทใชลาง beaker ลงบนกระดาษกรอง

โดยใชชดเครองกรอง

7.10 คบกระดาษกรองมาวางบน petri dish

7.11 เตม n-heptane 30 มลลลตร ผาน stirring rod ลงใน trap flask แลวกวนอยางแรง โดยใช

magnetic stirrer

7.12 ดาเนนการตามขอ 7.7 ถงขอ 7.10

7.13 นากระดาษกรองไปตรวจหาสงแปลกปลอม ภายใตกลอง widefield stereoscopic

microscope โดยเรมทกาลงขยาย 30 เทา ขณะทตรวจภายใตกลองจลทรรศน ใหใชเขมเขย

เศษอาหารทอาจบดบงสงแปลกปลอม เมอพบวตถสงสยใหใชกาลงขยายสงขนท

60-75 เทาขนไป ซงจะทาใหเหนรายละเอยดไดมากขน หากยงสงสยอกวาเปนสงแปลกปลอม

หรอไม ใหนาสงแปลกปลอมมา mount บนสไลด และตรวจภายใต compound microscope


-


รายงานสงแปลกปลอมทพบ โดยจดแบงชนดของสงแปลกปลอมทพบเปนกล ม ๆ เชน

แมลงทงตว ชนสวนแมลง ขน เปนตน ใหระบจานวน ขนาดและรายละเอยดอน ๆ ใหมาก

ทสดเทาทจะทาได ในกรณทสงแปลกปลอมทพบมจานวนมากและไมสามารถนบจานวน

ทแทจรงได ใหรายงานจานวนโดยประมาณหรอจานวนขนตาทสามารถตรวจสอบได

และใหใสเครองหมายมากกวา


-

วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหาร


วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหาร



1. นางนตยา พนธบว นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

2. นางปวณา พานชกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

3. นางสาวสแพร ชชวา นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

182


วธมาตรฐานทางกายภาพสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย

รหสวธ รายการ หนาชนดอาหารMethod

Type

DMSc F 4010

DMSc F 4011

DMSc F 4012

DMSc F 4013

DMSc F 4014

อาหารทมสวนประกอบของ

ถวเหลองดดแปรพนธกรรม

ชนด GTS 40-3-2

ขาวโพดดดแปรพนธกรรม

ชนด Bt11

อาหารทมสวนประกอบของ


Event176 maize (Bt176)


ชนด T25


ชนด MON810

-

-

-

-

183

189

195

201

207

Construct-specific method for

detection of DNA sequences

from genetically modified GTS

40-3-2 (Roundup Ready® soya

beans) by means of Polymerase

Chain Reaction



from GM Bt11 maize by means

of Polymerase Chain Reaction



from genetically modified Event

176 maize (Bt176) by means of




from GM T25 maize by means


Event-specific method for


from GM MON810 maize by

means of Polymerase Chain

Reaction

183


DMSc F 4010: Construct-specific method for detection of DNA Sequences

from Genetically modified GTS 40-3-2 (Roundup Ready®

soya beans) by means of Polymerase Chain Reaction


ใชทดสอบหาดเอนเอของถวเหลองดดแปรพนธกรรม GTS 40-3-2 (Roundup Ready® 17)

ทดดแปรเพอใหทนตอ glyphosate วธนสามารถตรวจสอบในวตถดบและผลตภณฑทผานขนตอน

การผลต


2.1 ISO 24276:2006(E): Foodstuffs – Methods of analysis for the detection of genetically

modified organisms and derived products – General requirements and definitions


modified organisms and derived products – Qualitative Nucleic Acid based methods

2.3 SAMBROOK, J. and RUSSELL, D.W,: Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd

edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001

3. นยามศพทและคายอ (Terminology and abbreviation)

PCR: Polymerase Chain Reaction

dNTP: deoxyribonucleotide triphosphates


4.1 ทวไป : การตรวจเชงคณภาพประกอบดวยการตรวจลาดบกรดนวคลอกเปาหมายทจาเพาะ

ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพ

จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรม ภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ

การควบคมการทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวนของ

ตวอยางทใชทดสอบ

184


4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเปาหมายโดยใชเอนไซม

DNA polymerase รวมกบ primer และ deoxyribonucleotide triphosphates (dNTP) ใน buffer

เปนการทาซาในหลอดทดสอบ และมสงทเปนเงอนไขทตองทากอน คอในสวนผสมของ

ปฏกรยา PCR ตองไมม inhibitors ขนตอนการเพมปรมาณม 3 ขนตอนคอ

4.2.1 การแยกสายดเอนเอสายคเปนสายเดยวโดยใชความรอน

4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยว

ทเปนเปาหมาย

4.2.3 จาลองสายของ primers ทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออก แลวทาใหยาวขน

โดยใช DNA polymerase ทอณหภมทเหมาะสม

4.3 การตรวจสอบและยนยนผล

สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR-product สามารถตรวจสอบได

โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยกและ

จาแนกขนาด และอานผลโดยการยอมดวย Ethidium bromide ทจะเขาจบกบดเอนเอและ

สามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลต เทยบกบดเอนเอทรขนาดและ/หรอ

ปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR product ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา อาจทา

การยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบสของ

PCR product สวนในกรณของ real-time PCR การเพมจานวนดเอนเอเปาหมายและ

การตรวจสอบผลจะเกดขนพรอม ๆ กน

4.4 วธนเปนการตรวจสอบลาดบเบสทเปนจดเชอมตอระหวาง CaMV 35S promoter และ

Petunia hybrida chloroplast targeting signal preceding the Agrobacterium EPSPS

4.5 โครงสรางของยน (construct ของ CaMV 35S promoter ตอกบ Agrobacterium EPSPS)

ในขอ 4.4 น อาจมการนาไปใชในพชดดแปรพนธกรรมอนในอนาคต

4.6 ไมสามารถใชวธนตรวจแยกความแตกตางระหวางถวเหลอง GTS 40-3-2 และถวเหลอง

ทเกดจากการผสมพนธระหวาง GTS 40-3-2 และถวเหลองดดแปรพนธกรรมสายพนธอนๆ

(gene stacked cultivars) ยกเวนการตรวจทเมลดเดยว ๆ หรอตรวจทตนถวเหลองโดยตรง

4.7 ลาดบเบสของ primer ทใชในการตรวจวเคราะหนไมตรงกบถวเหลองทไมไดดดแปร

พนธกรรมและพชอน ๆ (ขอมลจาก GenBank® ทสบคนดวย BlastN® 2.2.1 เมอ 1 กรกฎาคม

2001) นอกจากนยงเปน primer ทจาเพาะกบชนสวนดเอนเอทมการดดแปรขนมา ไมไดเกด

ตามธรรมชาต

185


4.8 ไมพบการเพมปรมาณของ primer นเมอตรวจสอบกบถวเหลองทไมไดดดแปรพนธกรรม

มนฝรง มะเขอเทศ ขาวโพด และ sugar beets หรอกบขาวโพด Event176 (Bt176), Bt11,

T25 และ MON810


5.1 Water, PCR grade

5.2 PCR buffer (อาจมหรอไมม MgCl2, ผสมอย) ความเขมขน 10 เทา

5.3 MgCl2 solution ความเขมขน 25 mmol/l

5.4 dNTP solution ความเขมขนของแตละ nucleotide เทากบ 2.5 mM (รวมเปน 10 mM)

5.5 Oligonucleotides ความเขมขนของแตละเสนเทากบ 10 µM ใหขนาด PCR product 172 bp

5.5.1 Forward primer: ออกแบบจากลาดบเบสดเอนเอของ Accession No. V00141, J02048

35s-f2: 5'- TgA TgT gAT ATC TCC ACT gAC g -3'

5.5.2 Reverse primer: ออกแบบจากลาดบเบสดเอนเอของ Accession No. M21084, J03227

petu-r1: 5'- TgT ATC CCT TgA gCC ATg TTg T -3'.

5.6 Thermostable DNA polymerase (สาหรบ hot-start PCR), 5 IU/µl

5.7 Hybridization probe

H-35s-ar1: 5'- ggg TCT TgC gAA ggA TAg Tg-3'.

5.8 Prehybridization solution, ประกอบดวย 5 x SSC, 0,1% (mass concentration) N-lauroyl-

sarcosine, 0.02% (mass concentration) ของ SOS, และ 1% Blocking Reagent

5.9 Hybridization solution, ประกอบดวย 10 pmol of hybridization probe in 2.5 ml

ใน prehybridization solution (5.8). อณหภมทใชสาหรบไฮบรไดเซชน 50 C สามารถ

ดขอมลอน ๆ เกยวกบสภาวะเพมเตมของการทา hybridization ไดในเอกสารอางอง (3)


6.1 Thermal cycler

6.2 Electrophoresis chamber พรอม power supply ขนาด 5V/cm

6.3 Ultraviolet (UV) trans-illuminator ทสามารถใหความยาวคลนท 312 nm.

6.4 เครองบนทกภาพ เชน photo-document หรอ กลอง CCD

186



7. 1 การเตรยมปฏกรยา PCR (PCR setup)

เตรยมสารเคมในหลอดสาหรบปฏกรยา PCR โดยเฉพาะใหมปรมาตรทงหมด 25 ไมโครลตร

เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางท RR_1

ตาราง RR_1

Reagent Final concentration Volume per sample (µl)

Sample DNA 10 ng to 50 ng 1

Water 15.9

10 x PCR buffer (without MgCl2) 1 x 2.5

MgCl2-solutiona, 25 mmol/l 1.5 mmol/l 1.5

dNTP solution , 10 mmol/l 0.8 mmol/l 2

Primer 35s-f2, 5 µmol/l 0.2 µmol/l 1

Primer petu-r1, 5 µmol/l 0.2 µmol/l 1

Taq DNA polymerase, 5 IU/µl 0.5 IU 0.1

a ถา PCR buffer มสวนผสมของ MgCl2 ใหปรบคาความเขมขนสดทายของ MgCl

2 ใหเทากบ 1.5 mmol/l

7.2. สารควบคม (PCR controls)

7.2.1 positive extraction controls

7.2.2 extraction blank controls

7.2.3 positive DNA target controls เชน 0.1% CRM GTS 40-3-2 (Roundup Ready soybean)

7.2.4 negative DNA target controls

7.2.5 amplification reagent controls

7.3 อณหภมและเวลาทใช (Temperature-time programme)

อณหภมและเวลาทใชตามระบในตาราง RR_2 เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห

กบเครอง GeneAmp® 2400 หรอ GeneAmp® 9600 และใชเอนไซม AmpliTaq Gold® DNA

polymerase ถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผลการวเคราะห

ตามตองการ

187


ตาราง RR_2

Step Time/temp

Activation/Initial denature 10 min/95 C

Amplification 30 s/95 C

30 s/60 C

25 s/72 C

Number of cycles 35 to 40

Final extension 3 min/72 C

เวลาและอณหภมทใชในการกระตนการทางานของ heat-activated DNA polymerase

อาจแตกตางไปตามแตละผผลต ใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาวตามคาแนะนา

จากผผลต

7.4 ตรวจสอบ PCR product

โดยการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา และยอมสดวย EtBr (ตามวธมาตรฐานสาหรบ

วเคราะหอาหาร เลมท 3 กรมวทยาศาสตรการแพทย พ.ศ. 2558)

7.5 การยนยนผล

ตรวจสอบดวยวธ Southern hybridization โดยใช H-35s-ar1 (5.7) โดยตวอยางทใหผลลบ

กบการทดสอบน แสดงวาไมใชถวเหลองดดแปรพนธกรรมชนด GTS 40-3-2


8.1 ตวอยางทดสอบจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของ PCR-product เทากบ positive controls

คอ 172 bp และผลของ PCR controls ทงหมดใหผลตามระบในขอ 9

8.2 การสรปผล :

8.2.1 สรปผลวาผลการทดสอบใหผลเปนบวก กรณทผลการทดสอบใหผลบวกทง 2

subsample และผลของชดควบคมเปนไปตามระบในขอ 9

8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 subsample ตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะห

ยงเหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ

188


8.3 การรายงาน

8.3.1 ผลการวเคราะหทเปนบวก ใหรายงาน

ถวเหลองดดแปรพนธกรรมชนด GTS 40-3-2 (Roundup ready soybean)

พบ/detected

8.3.2 ผลการวเคราะหทเปนลบ ใหรายงาน

ถวเหลองดดแปรพนธกรรมชนด GTS 40-3-2 (Roundup ready soybean)

ไมพบ/not detected


ทกครงททา PCR ตองมการใชควบคมโดยทเมอทา PCR เรยบรอยแลวผลของสารควบคมทถอวา

ใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ

9.1 positive extraction controls ตองใหผลบวก

9.2 extraction blank controls ตองใหผลเปนลบ

9.3 positive DNA target controls ตองใหผลบวก

9.4 negative DNA target controls ตองใหผลลบ

9.5 amplification reagent controls ตองใหผลลบ


-

189



from genetically modified Bt11 maize by means of



ใชทดสอบหาดเอนเอของขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด Bt11 (ของบรษท Syngenta เดมคอ

Novatis) ทดดแปรเพอใหสรางสารพษจาก Bacillus thuringiensis เพอตานทานหนอนเจาะ

ฝกขาวโพด ในวตถดบโดยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR)














จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรม ภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ

การควบคมการทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวนของ


190













โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยก

และจาแนกขนาด และอานผลโดยการยอมดวย Ethidium bromide ทจะเขาจบกบดเอนเอ

และสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลต เทยบกบดเอนเอทร ขนาด

และ/หรอปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR product ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา

อาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบสของ

PCR product สวนในกรณของ real-time PCR การเพมจานวนดเอนเอเปาหมายและ

การตรวจสอบผลจะเกดขนพรอม ๆ กน

4.4 วธนเปนการตรวจสอบชดยนทมลาดบเบสบรเวณทเชอมตอกนระหวางยน adh ตาแหนง

1S-Intron2 (IVS2) ทมในขาวโพดตามธรรมชาตและ pat gene จาก Streptpmyces

viridochromogenes ทมการใสเขาในขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด Bt11 ซงตาแหนง

ดงกลาวจะเปนตาแหนงเฉพาะทมเพยงตาแหนงเดยวในขาวโพดดดแปรพนธกรรม

ชนด Bt11

4.5 โครงสรางของยนดงกลาวในขอ 4.4 น อาจมการนาไปใชในพชดดแปรพนธกรรมอนใน

อนาคต

4.6 ไมสามารถใชวธนตรวจแยกความแตกตางระหวางขาวโพด Bt11 และขาวโพดทเกดจาก

การผสมพนธระหวาง Bt11 และขาวโพดดดแปรพนธกรรมสายพนธอน ๆ (gene stacked

cultivars) ยกเวนการตรวจทเมลดเดยว ๆ หรอตรวจทตนขาวโพดโดยตรง

191







5.5 Oligonucleotides ความเขมขนของแตละเสนเทากบ 10 µM ให PCR-product ขนาด 189 bp

5.5.1 Forward primer: adh 1S-intron2 (IVS2) ออกแบบจากลาดบเบสดเอนเอของ

Accession No. AR110602

Intron IVS2-2: 5'-CTg ggA ggC CAA ggT ATC TAA T-3'.

5.5.2 Reverse primer: PAT protein coding region ออกแบบจากลาดบเบสดเอนเอของ

Accession No. AR110602

PAT-B: 5'-gCT gCT gTA gCT ggC CTA ATC T-3'


5.7 Hybridization probe, 5'-labelled (e.g. digoxygenine-labelled) probe Bt ความเขมขน

20 µmol/l: 5'-TAT CTg TCT CAg ggg CAg ACT C-3'


sarcosine, 0,02% (mass concentration) ของ SOS, และ 1% Blocking Reagent




5.10 เอนไซมตดจาเพาะ : Hinf I


6.1 Thermal cycler




192





เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางท Bt11_1

ตาราง Bt11_1



Water 15.8


MgCl2-solutiona, 25 mmol/l 2 mmol/l 2.0

dNTP solution , 10 mmol/l 0.4 mmol/l 1.0

Primer IVS2-2, 10 µmol/l 0.5 µmol/l 1.25

Primer PAT-B, 10 µmol/l 0.5 µmol/l 1.25

Taq DNA polymerase, 5 IU/µl 1 IU 0.2


2 ใหเทากบ 2 mmol/l




7.2.3 positive DNA target controls เชน 0.1% CRM Bt11 maize




อณหภมและเวลาทใชตามระบในตาราง Bt11_2 เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห




193


ตาราง Bt11_2

Step Time/temp



30 s/64 C

30 s/72 C

Number of cycles 38







วเคราะหอาหารเลมท 3 กรมวทยาศาสตรการแพทย พ.ศ. 2558)


ตรวจสอบดวยวธ Southern hybridization โดยใช digoxygenine-labelled oligonucleotide

probe Bt (5.7) โดยตวอยางทใหผลลบกบการทดสอบน แสดงวาไมใชขาวโพดดดแปร

พนธกรรมชนด Bt11 หรอทดสอบโดยการยอยดวยเอนไซม Hinf I ซงตวอยางทม

สวนประกอบของขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด Bt11 จะใหชนสวนดเอนเอ 2 เสน

มขนาด 116 bp และ 73 bp









194




ขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด Bt11 (Bt11 maize) พบ/detected


ขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด Bt11 (Bt11 maize) ไมพบ/not detected










-

195



from genetically modified Event176 (Bt176) maize by means



ใชทดสอบหาดเอนเอของขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด Event176 maize (Syngenta) ในขาวโพด

ทเปนวตถดบและแปรรปแลว โดยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR) ในการตรวจหาลาดบ

เบสทเปนจดเชอมตอระหวางยนสองยนทเชอมตอกนกอนใสเขาไปในยนของขาวโพด

ขาวโพด Event176 ถกดดแปรพนธกรรมเพอใหสรางสารพษทเรยกวา Bt toxin (ชนด cryIA(b))

จาก Bacillus thuringiensis โดยใสยน Bt ทสงเคราะหขนโดยใช CDPK จากขาวโพดเปน promoter













ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพจะแสดง

ใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรม ภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบการควบคม

การทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวนของตวอยาง

ทใชทดสอบ

196













โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยก

และจาแนกขนาด และอานผลโดยการยอมดวย Ethidium bromide ทจะเขาจบกบดเอนเอ

และสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลต เทยบกบดเอนเอทร ขนาด

และ/หรอปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR product ดวยการเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา

อาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบส

ของ PCR product สวนในกรณของ real-time PCR การเพมจานวนดเอนเอเปาหมาย

และการตรวจสอบผลจะเกดขนพรอม ๆ กน

4.4 โครงสรางของยนทตรวจดวยวธน อาจมการนาไปใชในพชดดแปรพนธกรรมอนในอนาคต

4.5 ไมสามารถใชวธนตรวจแยกความแตกตางระหวางขาวโพด Event176 (Bt176) และกบ

ขาวโพดทเกดจากการผสมพนธระหวาง Event176 (Bt176) และขาวโพดดดแปรพนธกรรม

สายพนธอน ๆ (gene stacked cultivars) ยกเวนการตรวจทเมลดเดยว ๆ หรอตรวจท

ตนขาวโพดโดยตรง

4.6 ลาดบเบสของ primer ทใชในการตรวจวเคราะหนไมตรงกบขาวโพดทไมไดดดแปร

พนธกรรมและพชอน ๆ (ขอมลจาก GenBank® ทสบคนดวย BlastN® 2.2.1 เมอป 2001)

นอกจากนยงเปน primer ทจาเพาะกบชนสวนดเอนเอทมการดดแปรขนมา ไมไดเกด


4.7 ไมพบการเพมปรมาณของ primer นเมอตรวจสอบกบถวเหลอง GTS 40-3-2 และขาวโพด

Bt11, T25 และ MON810 หรอกบขาวโพดทไมไดดดแปรพนธกรรม

197


4.8 สารพษ Bacillus thuringiensis (Bt toxin) เปนสารกาจดแมลงทไดมาจากแบคทเรย

และนนทาใหพชทดดแปรพนธกรรมโดยการใสยนชนดนเขาไปสามารถสรางสารพษ

เพอกาจดแมลงได ขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด Event176 (Bt176) ไดดดแปร

โดยใสยนสงเคราะห Cry1A(b) และควบคมการแสดงออกโดยใช CDPK6 promoter

วธวเคราะหนจะตรวจหาลาดบเบสทเชอมระหวาง 2 ยนดงกลาว และใหขนาดของ

PCR product 211 bp ทสามารถตรวจสอบไดโดยใชวธการให PCR product ผานเจล

ดวยกระแสไฟฟาหรอวธไฮบรไดเซชน







5.5.1 Forward primer: Cry03: 5'- CTC TCg CCg TTC ATg TCC gT -3'

ไมมหมายเลข Acession No เนองจาก primer นอยในตาแหนง CDPK6 แตเมอนา

มาเปรยบเทยบการเขาคกบลาดบเบสกบยน CDPK ของขาวโพด Acession No

L27484.1 ใหผลเทากบ 100%

5.5.2 Reverse primer: ออกแบบจากลาดบเบสดเอนเอของ Accession No 41419 โดย

primer นเขาคกบลาดบเบสของยน CryIA(b) ทสงเคราะหขน

Cry04: 5'- ggT CAg gCT CAg gCT gAT gT -3'


5.7 Hybridization probe Cry01: ATg gAC AAC AAC CCC AAC ATC -3.'


sarcosine, 0.02% (mass concentration) ของ SDS, และ 1% Blocking Reagent




5.10 เอนไซมตดจาเพาะ : Hae III, Taq I หรอ Dde I

198



6.1 Thermal cycler







เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางท E176_1

ตาราง E176_1



Water 15.4


MgCl2-solutiona, 25 mmol/l 1.5 mmol/l 1.5


Primer Cry03, 5 µmol/l 0.25 µmol/l 1.25

Primer Cry04, 5 µmol/l 0.25 µmol/l 1.25

Taq DNA polymerase, 5 IU/µl 0.5 IU 0.1


2 ใหเทากบ 1.5 mmol/l




7.2.3 positive DNA target controls เชน 0.1% CRM Event176 maize (Bt176)



199



อณหภมและเวลาทใชตามระบในตาราง E176_2 เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห




ตาราง E176_2

Step Time/temp



30 s/63 C

30 s/72 C

Number of cycles 38







วเคราะหอาหารเลม 3 กรมวทยาศาสตรการแพทย พ.ศ. 2558)


ตรวจสอบดวยวธ Southern hybridization โดยใช digoxygenine-labelled oligonucleotide

probe Cry01 (5.7) โดยตวอยางทใหผลลบกบการทดสอบน แสดงวาไมใชขาวโพดดดแปร

พนธกรรมชนด Event176 (Bt176) หรอตรวจสอบชนสวนดเอนเอทเพมปรมาณโดยใช

เอนไซมตดจาเพาะ Hae III ซงตวอยางทมสวนประกอบของขาวโพดดดแปรพนธกรรม

ชนด Event176 (Bt176) เมอตดดวยเอนไซม Hae III จะใหขนาดชนสวนดเอนเอ 162

และ 49 bp ในขณะทตดดวย Taq I จะใหชนสวน 3 ชนคอ 168, 22 และ 21 bp หรอถาใช

เอนไซม Dde I จะใหขนาด 128, 72 และ 11 bp ตามลาดบ

200












ขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด Event176 หรอ Bt176 พบ/detected


ขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด Event176 หรอ Bt176 ไมพบ/not detected










-

201



from genetically modified T25 maize by means of Polymerase

Chain Reaction


ใชทดสอบหาดเอนเอของขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนดทนทานตอยาปราบวชพช T25

“LibertyLink” ในวตถดบขาวโพด โดยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR) ในการตรวจหา

ลาดบเบสทเปนจดเชอมตอระหวางยน CaMV 35S promoter และ pat gene ทใสเขาไปในขาวโพด











ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพจะแสดง

ใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรม ภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบการควบคม

การทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวนของตวอยาง

ทใชทดสอบ



เปนการทาซาในหลอดทดสอบ และมสงทเปนเงอนไขทตองทากอน คอในสวนผสม

ของปฏกรยา PCR ตองไมม inhibitors ขนตอนการเพมปรมาณม 3 ขนตอน คอ

202



4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวทเปน

เปาหมาย

4.2.3 จาลองสายของ primers ทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออก แลวทาใหยาวขนโดย

ใช DNA polymerase ทอณหภมทเหมาะสม


สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR-product สามารถตรวจสอบไดโดย

ใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยกและจาแนก

ขนาด และอานผลโดยการยอมดวย Ethidium bromide ทจะเขาจบกบดเอนเอและสามารถ

กระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลต เทยบกบดเอนเอทรขนาด และ/หรอปรมาณ

เมอตรวจสอบ PCR product ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา อาจทาการยนยน

ตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบสของ PCR product

สวนในกรณของ real-time PCR การเพมจานวนดเอนเอเปาหมายและการตรวจสอบ

ผลจะเกดขนพรอมๆ กน

4.4 โครงสรางของยนทตรวจดวยวธน อาจมการนาไปใชในพชดดแปรพนธกรรมอนในอนาคต

4.5 ไมสามารถใชวธนตรวจแยกความแตกตางระหวางขาวโพด T25 และขาวโพดทเกดจาก

การผสมพนธระหวาง T25 และขาวโพดดดแปรพนธกรรมสายพนธอนๆ (gene stacked

cultivars) ยกเวนการตรวจทเมลดเดยวๆ หรอตรวจทตนขาวโพดโดยตรง

4.6 ลาดบเบสของ primer ทใชในการตรวจวเคราะหนไมตรงกบขาวโพดทไมไดดดแปรพนธกรรม

และพชอนๆ (ขอมลจาก GenBank® ทสบคนดวย BlastN® 2.2.1 เมอ 1 กรกฎาคม 2001)

นอกจากนยงเปน primer ทจาเพาะกบชนสวนดเอนเอทมการดดแปรขนมา ไมไดเกด


4.7 ไมพบการเพมปรมาณของ primer นเมอตรวจสอบกบขาวโพดทไมไดดดแปรพนธกรรม

และถวเหลอง GTS 40-3-2 รวมถงขาวโพด Bt11, Event176 (Bt176) และ MON810

4.8 ชนสวนดเอนเอเปาหมายม 1 copy

4.9 ยน pat เปนยนทไดมาจาก Streptomyces viridochromogenes ซงสามารถสรางโปรตน

phosphinothricin-N-acetyltransferase ชวยใหพชสามารถทนตอยาปราบวชพชชนด herbicide

glufosinate ammonium ซงสามารถยบยงการสงเคราะห glutamine

203








5.5.1 Forward primer: ออกแบบจากลาดบเบสดเอนเอของ Accession No NC001497

โดย primer นตรงกบลาดบเบสของ CaMV 35S promoter

T25-F7: 5'- ATg gTg gAT ggC ATg ATg TTg -3'

5.5.2 Reverse primer:

T25-R3: 5'- TgA gCg AAA CCC TAT AAg AAC CC -3'

ไมมหมายเลข Acession No แต primer นอยในลาดบเบสของ pat coding region


5.7 เอนไซมตดจาเพาะ : Hinf I และ Mwo I


6.1 Thermal cycler







เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางท T25_1

204


ตาราง T25_1

7.2 สารควบคม (PCR controls)



7.2.3 positive DNA target controls เชน 0.1% CRM T25 maize




อณหภมและเวลาทใชตามระบในตาราง T25_2 เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห





Water 14.8

10 × PCR buffer (without MgCl2) 1 × 2.5



Primer T25-F7, 10 µmol/l 0.5 µmol/l 1.25

Primer T25-R3, 10 µmol/l 0.5 µmol/l 1.25

Taq DNA polymerase, 5 IU/µl 1 IU 0.2a ถา PCR buffer มสวนผสมของ MgCl2 ใหปรบคาความเขมขนสดทายของ MgCl2

ใหเทากบ 1.5 mmol/l


205


Step Time/temp



30 s/64 C

30 s/72 C

Number of cycles 40



อาจแตกตางไปตามแตละผผลต ใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาว ตามคาแนะนา






ตรวจสอบชนสวนดเอนเอทเพมปรมาณโดยใชเอนไซมตดจาเพาะ HinIf I และ/หรอ Mwo I

ซงตวอยางทมสวนประกอบของขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด T25 เมอยอยดวยเอนไซม

Hinf I จะใหชนสวนดเอนเอ 2 เสนคอ 121 bp, และ 88 bp และเมอยอยดวย Mwo I จะให

ชนสวนดเอนเอขนาด 141 bp และ 68 bp







8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 subsample ตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง

เหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ

ตาราง T25_2

206




ขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด T25 (T25 maize) พบ/detected


ขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด T25 (T25 maize) ไมพบ/not detected










-

207


DMSc F 4014: Event-specific method for detection of DNA Sequences from

genetically modified MON810 maize by means of Polymerase

Chain Reaction


ใชทดสอบหาดเอนเอของขาวโพดดดแปรพนธกรรม MON810 หรอ “YieldGuard” (ทนแมลง)

ในวตถดบขาวโพด โดยวธ Polymerase Chain Reaction (PCR) ในการตรวจหาลาดบเบสท

เปนจดเชอมตอระหวางยนขาวโพด และ CaMV 35S promoter ทใสเขาไปในขาวโพด












จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรม ภายใตการทดสอบทมความสมพนธ

กบการควบคมการทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวนของ


4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดยใช

เอนไซม DNA polymerase รวมกบ primer และ deoxyribonucleotide triphosphates (dNTP)

ใน bufferเปนการทาซาในหลอดทดสอบ และมสงทเปนเงอนไขทตองทากอน คอในสวนผสม

ของปฏกรยา PCR ตองไมม inhibitors ขนตอนการเพมปรมาณม 3 ขนตอนคอ

208



4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวทเปน

เปาหมาย

4.2.3 จาลองสายของ primers ทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออก แลวทาใหยาวขนโดย

ใช DNA polymerase ทอณหภมทเหมาะสม


สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR-product สามารถตรวจสอบไดโดย

ใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยกและจาแนก

ขนาด และอานผลโดยการยอมดวย Ethidium bromide ทจะเขาจบกบดเอนเอและสามารถ

กระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลต เทยบกบดเอนเอทรขนาด และ/หรอปรมาณ

เมอตรวจสอบ PCR product ดวยการเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา อาจทาการยนยน

ตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบสของ PCR product

สวนในกรณของ real-time PCR การเพมจานวนดเอนเอเปาหมายและการตรวจสอบผล

จะเกดขนพรอมๆ กน

4.4 ไมสามารถใชวธนตรวจแยกความแตกตางระหวางขาวโพด MON810 และขาวโพดทเกดจาก

การผสมพนธระหวาง MON810 และขาวโพดดดแปรพนธกรรมสายพนธอน ๆ (gene stacked

cultivars) ยกเวนการตรวจทเมลดเดยว ๆ หรอตรวจทตนขาวโพดโดยตรง

4.5 ลาดบเบสของ primer ทใชในการตรวจวเคราะหนไมตรงกบขาวโพดทไมไดดดแปร

พนธกรรมและพชอน ๆ (ขอมลจาก GenBank® ทสบคนดวย BlastN® 2.2.1 เมอ 1 กรกฎาคม

2001) นอกจากนยงเปน primer ทจาเพาะกบชนสวนดเอนเอทมการดดแปรขนมา ไมไดเกด


4.6 ไมพบการเพมปรมาณของ primer นเมอตรวจสอบกบขาวโพดทไมไดดดแปรพนธกรรม

และถวเหลอง GTS 40-3-2 รวมถงขาวโพด Bt11, Event176 (Bt176) และ T25

4.7 ชนสวนดเอนเอเปาหมายม 1 copy

4.8 ยน Bt ทใชในการดดแปรขาวโพดชนด MON810 ไดมาจากแบคทเรยในดน Bacillus

thuringiensis subsp. Kurstaki ซงทาใหขาวโพด MON810 สามารถสรางโปรตนทปองกน

จากการเจาะทาลายของ European corn borer larvae เนองจากโปรตนทสรางขนในพช

จะเรมทางานในลาไสของแมลงทกดกนเขาไป และทาใหเกดรทผนงลาไส สงผลใหระบบ

การดดซมเสยสมดลและเซลลในลาไสถกทาลาย

209








5.5.1 Forward primer: ออกแบบจากลาดบเบสดเอนเอของ Accession No AF434709

ซงเปนลาดบเบสของจโนมของขาวโพด

VW01: 5'- TCg AAg gAC gAA ggA CTC TAA Cg -3'

5.5.2 Reverse primer: ออกแบบจากลาดบเบสดเอนเอของ Accession No V00141,

J02048 โดย primer นตรงกบลาดบเบสของ CaMV 35S promoter

VW03: 5'- TCC ATC TTT ggg ACC ACT gTC g-3'


5.7 เอนไซมตดจาเพาะ : Hae III และ Mwo I


6.1 Thermal cycler







เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางท M810_1

210





7.2.3 positive DNA target controls เชน 0.1% CRM MON810 maize




อณหภมและเวลาทใชตามระบในตาราง M810_2 เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห




ตาราง M810_1


Water 14.8

10 x PCR buffer (without MgCl2) 1 × 2.5


dNTP solution, 10 mmol/l 0.4 mmol/l 1.0

Primer VW01, 10 µmol/l 0.5 µmol/l 1.25

Primer VW03, 10 µmol/l 0.5 µmol/l 1.25

Taq DNA polymerase, 5 IU/µl 1 IU 0.2a ถา PCR buffer มสวนผสมของ MgCl2 ใหปรบคาความเขมขนสดทายของ MgCl2

ใหเทากบ 1.5 mmol/l


211



อาจแตกตางไปตามแตละผผลต ใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาว ตามคาแนะนา






ตรวจสอบชนสวนดเอนเอทเพมปรมาณโดยใชเอนไซมตดจาเพาะ Mwo I และ/หรอ Hae III

ซงตวอยางทมสวนประกอบของขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด MON810 เมอยอยดวย

เอนไซม Hae III จะใหชนสวนดเอนเอ 2 เสนคอ 126 bp, และ 44 bp และเมอยอยดวย

Mwo I จะใหชนสวนดเอนเอขนาด 109 bp และ 61 bp







8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 subsample ตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยงเหมอน

เดมใหสรปผลเปนลบ



ตาราง M810_2

Step Time/temp



30 s/64 C

30 s/72 C

Number of cycles 40


212


ขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด MON810 (MON810 maize) พบ/detected


ขาวโพดดดแปรพนธกรรมชนด MON810 (MON810 maize) ไมพบ/not detected










-

213


ภาคผนวก

รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 1

วธมาตรฐานทางเคม

ท รหสวธ วธ

1 DMSc F 1001 การวเคราะหไนโตรเจนโดย Kjeldahl method

2 DMSc F 1002 การวเคราะหปรมาณไขมนในนม

3 DMSc F 1003 การวเคราะหปรมาณไขมนในนมผงและผลตภณฑนมชนดผง

4 DMSc F 1004 การวเคราะหปรมาณไขมนในนมขนจดและนมขนหวาน

5 DMSc F 1005 การวเคราะหปรมาณไขมนในเนยแขง

6 DMSc F 1006 การวเคราะหปรมาณของแขงทงหมดในนมและผลตภณฑนม

7 DMSc F 1007 การวเคราะหของแขงทงหมดในนมขนหวาน

8 DMSc F 1008 การวเคราะหของแขงทงหมดในเนยแขง

9 DMSc F 1009 การวเคราะหเนอนมไมรวมไขมนในนมพรอมดมและนมแปลงไขมน

10 DMSc F 1010 การวเคราะหเนอนมไมรวมไขมนในนมขนไมหวานและนมขนแปลง

ไขมนไมหวาน

11 DMSc F 1011 การวเคราะหปรมาณความชนในชา

12 DMSc F 1012 การวเคราะหปรมาณความชนในกาแฟ

13 DMSc F 1013 การวเคราะหปรมาณความชนในโกโกผง

14 DMSc F 1014 การวเคราะหปรมาณความชนในชาสมนไพร

15 DMSc F 1015 การวเคราะหปรมาณเถาทงหมดและเถาทละลายนาไดในชา

16 DMSc F 1016 การวเคราะหปรมาณเถาและเถาทละลายนาไดในกาแฟคว

17 DMSc F 1017 การวเคราะหปรมาณสารทสกดไดดวยนารอนในชา

18 DMSc F 1018 การวเคราะหปรมาณเอทานอลในเครองดมพรอมบรโภคจากพชผกผลไม

19 DMSc F 1019 การวเคราะหปรมาณอะซซลเฟม-เค, แอสปารแตม และซคคารน ในอาหาร

20 DMSc F 1020 การวเคราะหปรมาณโซเดยมไซคลาเมตในอาหาร

21 DMSc F 1021 การวเคราะหปรมาณตะกว แคดเมยม ทองแดง เหลก และสงกะส ในอาหาร

22 DMSc F 1022 การวเคราะหปรมาณดบกในอาหารกระปอง

23 DMSc F 1023 การวเคราะหปรมาณสารหนทงหมดในอาหาร

24 DMSc F 1024 การวเคราะหปรมาณอะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง

214



วธมาตรฐานทางจลชววทยา

1 DMSc F 2001 วธตรวจวเคราะห Bacillus cereus ในอาหาร

2 DMSc F 2002 วธตรวจวเคราะห Clostridium perfringens ในอาหาร

3 DMSc F 2003 วธตรวจวเคราะห Listeria spp. และ Listeria monocytogenes ในอาหาร

4 DMSc F 2004 วธตรวจวเคราะห Salmonella spp. ในอาหาร

5 DMSc F 2005 วธตรวจวเคราะห Salmonella spp. ในนาและนาแขง

6 DMSc F 2006 วธตรวจวเคราะห Staphylococcus aureus ในอาหาร

7 DMSc F 2007 วธตรวจวเคราะห Staphylococcus aureus ในนาและนาแขง

8 DMSc F 2008 วธตรวจวเคราะห Cronobacter sakazakii ในนมและผลตภณฑนม

215





1 DMSc F 1025 การวเคราะหปรมาณสารทงหมดในนา

2 DMSc F 1026 การวเคราะหปรมาณความกระดางทงหมดในนา

3 DMSc F 1027 การวเคราะหปรมาณไขมนในไอศกรม

4 DMSc F 1028 การวเคราะหปรมาณไนโตรเจนในไอศกรมโดย Kjeldahl method

5 DMSc F 1029 การวเคราะหปรมาณของแขงทงหมดในไอศกรม

6 DMSc F 1030 การวเคราะหปรมาณกรดซตรกในเครองดม

7 DMSc F 1031 การวเคราะหปรมาณ ไนไตรต และไนเตรต ในผลตภณฑเนอสตว

8 DMSc F 1032 การวเคราะหปรมาณสารตกคางทเหลอจากการระเหยอาหารจาลอง

9 DMSc F 1033 การวเคราะหปรมาณบสฟนอล เอ (Bisphenol A; 2, 2-bis (4-hydroxyphenyl

propane) ทแพรลงสอาหารจาลอง

10 DMSc F 1034 การวเคราะหปรมาณ 4, 4'-Dichlorodiphenyl sulfone ทแพรลงสอาหาร

จาลอง

11 DMSc F 1035 การวเคราะหปรมาณ 4, 4'-Dihydroxydiphenyl sulfone ทแพรลงสอาหาร

จาลอง

12 DMSc F 1036 การวเคราะหปรมาณฟอรมาลดไฮด (Formaldehyde) ทแพรจากผลตภณฑยาง

13 DMSc F 1037 การวเคราะหปรมาณสงกะส ทแพรจากผลตภณฑยาง

14 DMSc F 1038 การวเคราะหปรมาณ N-Nitrosamines และ N-Nitrosatable substances

ทแพรจากหวนมยาง

15 DMSc F 1039 การวเคราะหปรมาณสารทระเหยไดในหวนมยางสงเคราะห

16 DMSc F 1040 การวเคราะหปรมาณ 2-Mercaptobenzothiazole (MBT)

ทแพรออกมาจากผลตภณฑ valcanised rubber

17 DMSc F 1041 การวเคราะหปรมาณ 2, 6-bis (1, 1-dimethylethyl)-4-methyl-phenol

(Antioxidant BHT) และ 2, 2'-Methylethylenebis (6-(1, 1-dimethylethyl)-

4-methyl-phenol) (Antioxidant 2246) ทแพรออกมาจากผลตภณฑ

valcanised rubber

216




1 DMSc F 2009 วธตรวจวเคราะหยสตและราในอาหารโดยวธ pour plate และ spread plate

2 DMSc F 2010 วธตรวจวเคราะห Vibrio cholerae ในอาหาร

3 DMSc F 2011 วธตรวจวเคราะห Vibrio parahaemolyticus ในอาหาร

4 DMSc F 2012 วธตรวจวเคราะห Vibrio parahaemolyticus ในอาหารโดยวธ MPN

5 DMSc F 2013 วธตรวจวเคราะหจานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในอาหาร

โดยวธ pour plate

6 DMSc F 2014 วธตรวจวเคราะหจานวนจลนทรย หรอแบคทเรยทงหมดในนาและนาแขง

โดยวธ pour plate และ spread plate

วธมาตรฐานทางกายภาพ


1 DMSc F 3001 การวเคราะหนาหนกสทธและนาหนกเนอในผกกระปอง

2 DMSc F 3002 การวเคราะหปรมาณนาอสระในผกกระปอง

217





1 DMSc F 1042 การวดคาความเปนกรด-ดางของนา

2 DMSc F 1043 การวเคราะหปรมาณฟลออไรด คลอไรด ไนเตรตและซลเฟตในนา

3 DMSc F 1044 การวเคราะหปรมาณตะกวในนา

4 DMSc F 1045 การวเคราะหปรมาณเหลก แคดเมยม โครเมยม ทองแดง แมงกานส

นกเกล สงกะส และเงนในนา

5 DMSc F 1046 การวเคราะหปรมาณสารหนในนา

6 DMSc F 1047 การวเคราะหปรมาณใยอาหารทงหมดในอาหารโดย Enzymatic-Gravi

metric Method

7 DMSc F 1048 การตรวจวเคราะหปรมาณกรดนาสมในนาสมสายชโดยวธ Titration

8 DMSc F 1049 การตรวจวเคราะหความเปนกรดในซอสบางชนดโดยวธ Titration

9 DMSc F 1050 การวเคราะหคาของกรดในนามนและไขมน

10 DMSc F 1051 การวเคราะห Phenolic Antioxidants ในนามน, ไขมนและเนย

11 DMSc F 1052 การวเคราะหสารโพลารในนามนและไขมนโดยวธคอลมนโครมาโทกราฟ

12 DMSc F 1053 การวเคราะหปรมาณสารเคมปองกนกาจดศตรพช กลมคารบาเมต

ในผกผลไม

13 DMSc F 1054 การวเคราะหปรมาณ 3-chloro-1, 2- propanediol (3-MCPD) ในอาหาร

และสวนผสมอาหาร



1 DMSc F 2015 วธตรวจวเคราะห Coliforms, Fecal coliforms และ E. coli ในนา และ

นาแขง โดยวธ MPN

2 DMSc F 2016 วธตรวจวเคราะห Coliforms, Fecal coliforms และ E. coli ในอาหาร

3 DMSc F 2017 วธตรวจวเคราะห Clostridium botulinum ในอาหาร

4 DMSc F 2018 วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนท ชนดทมความเปนกรดตา

5 DMSc F 2019 วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนทชนดทมความเปนกรด

218


วธมาตรฐานทางชวโมเลกล


1 DMSc F 4001 การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบของพชดดแปร

พนธกรรมดวยวธ CTAB พนฐาน

2 DMSc F 4002 การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบ ของพชดดแปร

พนธกรรมดวยวธ Basic silica method

3 DMSc F 4003 Qualitative endogenous gene testing: lectin (by means of Polymerase

Chain Reaction)

4 DMSc F 4004 Qualitative endogenous gene testing: the chloroplast trnL intron

(by means of Polymerase Chain Reaction)

5 DMSc F 4005 Qualitative endogenous gene testing: Invertase (by means of Polymerase

Chain Reaction)

6 DMSc F 4006 Qualitative endogenous gene testing: hmgA (by means of real-time

Polymerase Chain Reaction)

7 DMSc F 4007 Screening method for the detection of genetically modified plant DNA:

CaMV-35S promoter (by means of Polymerase Chain Reaction)


NOS-terminator (by means of Polymerase Chain Reaction)


nptII (by means of Polymerase Chain Reaction)

Documents

วิธีมาตรฐาน ส าหรับการ ...e-library.dmsc.moph.go.th/ebooks/files/m_4.pdfเล มท 4 Volume IV ว ธ มาตรฐานส า หร