AKTIVITAS PENGHAMBATAN EKSTRAK SIRIH MERAH (Piper

crocatum) TERHADAP PEMBENTUKAN MALONDIALDEHIDA

(MDA) DAN ENZIM TIROSINASE

MUSTIKA WENI

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas

Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Pembentukan

Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase adalah benar karya saya dengan

arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada

perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya

yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam

teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Juli 2014

Mustika Weni

NIM G84100047

ABSTRAK

MUSTIKA WENI. Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper

crocatum) terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase.

Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan SYAEFUDIN.

Daun sirih merah (Piper crocatum) berkhasiat sebagai tanaman obat.

Tanaman tersebut memiliki kandungan senyawa yang berperan sebagai

antioksidan. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidasi dan

penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah. Proses ekstraksi dilakukan

secara terpisah menggunakan pelarut etanol dan n-heksana. Penentuan aktivitas

antioksidan menggunakan metode Thiobarbituric acid (TBA), sedangkan

penghambatan tirosinase menggunakan metode Microplate Reader. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah konsentrasi 200 ppm

memiliki daya hambat pembentukan malondialdehid (MDA) sama besar (α>0.05)

dengan vitamin E, ekstrak n-heksana konsentrasi 200 ppm memiliki daya hambat

pembentukan malondialdehid (MDA) sama besar (α>0.05) dengan vitamin E.

Aktivitas penghambatan tirosinase menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah

memiliki nilai IC50 sebesar 1655 ppm sedangkan ekstrak n-heksana sirih merah

memiliki nilai IC50 sebesar 3090.56 ppm. Ekstrak etanol sirih merah memiliki

kemampuan menghambat MDA dan enzim tirosinase lebih tinggi dibandingkan

ekstrak n-heksana sirih merah.

Kata kunci : Aktivitas antioksidasi, Enzim tirosinase, Piper crocatum

ABSTRACT

MUSTIKA WENI. Inhibitory Activity of Piper crocatum Extract to

Malondialdehida Formation and Tyrosinase Activity. Supervised by MEGA

SAFITHRI and SYAEFUDIN.

Piper crocatum leave bark is a medicinal plant. It contains antioxidant

compounds. The objectives of this research was to determine the antioxidant

activity and inhibitory activity to tyrosinase of P. crocatum extract. Extraction

process of Piper crocatum was conducted separately by using the solvent ethanol

70% and n-hexane. Determination of antioxidant activity was conducted with

Thiobarbituric acid method (TBA) and for tyrosinase inhibitory activity using

microplate reader. The results showed that the ethanol extract at concentration of

200 ppm higher (α>0.05), inhibitory effects than vitamin E on the formation

malondialdehida. n-hexane extract at concentration of 200 ppm higher (α>0.05).

Tyrosinase inhibition activity test showed the ethanol extract has IC50 1655 ppm,

n-hexane extract has IC50 3090.56 ppm. Ethanol extract has inhibitory MDA and

enzyme tyrosinase than n-hexane extract.

Keywords : Antioxidative activity, Tyrosinase, Piper crocatum

AKTIVITAS PENGHAMBATAN EKSTRAK SIRIH MERAH (Piper

crocatum) TERHADAP PEMBENTUKAN MALONDIALDEHIDA (MDA)

DAN ENZIM TIROSINASE

MUSTIKA WENI

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

Pada

Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2014

Judul Skripsi : Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah Piper crocatum

terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA) dan Enzim

Tirosinase

Nama : Mustika Weni

NIM : G84100047

Disetujui oleh

Tanggal Lulus:

Dr Mega Safithri,SSi MSi

Pembimbing I

Syaefudin, SSi MSi

Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc

Ketua Departemen

PRAKATA

Bismillahirrahmanirrahim

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas

segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul

penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 hingga April 2014 ini

adalah Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap

Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Mega Safithri, SSi MSi dan

Syaefudin, SSi MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan

pengarahan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada

Ibu Meri, Ibu Tini beserta seluruh staf Laboran Biokimia yang telah membantu

selama penelitian berlangsung. Terima kasih juga disampaikan kepada mba Leli

dan seluruh staf Pusat Studi Biofarmaka (PSB) yang telah banyak membantu

selama pengumpulan data penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan

kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga dan teman-teman Biokimia 47 untuk

segala doa, kasih sayang dan dukungannya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Mei 2014

Mustika Weni

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1

METODE 2

Bahan dan Alat 2

Prosedur Penelitian 3

Pengeringan Bahan Uji 3

Penetapan Kadar Air Metode Oven 4

Ekstraksi Serbuk Daun Sirih Merah (P. crocatum) 4

Rendemen 4

Analisis Fitokimia 4

Uji Aktifitas Antioksidan Metode TBA-MDA 5

Uji Inhibitor Tirosinase 6

HASIL 7

Kadar Air dan Rendemen Daun Sirih Merah 7

Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah 7

Aktivitas Antioksidasi terhadap Penghambatan Malondialdehida (MDA) 7

Penentuan Penghambatan Enzim Tirosinase pada Ekstrak Etanol 70% dan n-

Heksana 8

PEMBAHASAN 9

Pembuatan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah 9

Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah 11

Potensi Antioksidan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah

terhadap Penghambatan MDA 11

Penentuan Penghambatan (IC50) Ekstrak Etanol 70% dan Ekstrak n-Heksana

Sirih Merah terhadap Enzim Tirosinase 14

SIMPULAN DAN SARAN 15

Simpulan 15

Saran 15

DAFTAR PUSTAKA 15

LAMPIRAN 19

DAFTAR GAMBAR

1 Aktivitas antioksidan dengan metode TBA ekstrak daun sirih merah 8 2 Aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah 9 3 Kurva kadar MDA terhadap waktu 12

DAFTAR TABEL

1 Rendemen ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih merah 7 2 Metabolit sekunder ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih

merah 7

DAFTAR LAMPIRAN

1 Tahapan umum penelitian 20 2 Ekstraksi daun sirih merah 20 3 Pengujian fitokimia 20 4 Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat 20 5 Analisis aktivitas antioksidan dari metode TBA 21

6 Kadar air simplisia daun sirih merah 22 7 Rendemen simplisia daun sirih merah 22 8 Rendemen simplisia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah 22 9 Grafik hubungan antara konsentrasi inhibitor ekstrak etanol 70% dan

ekstrak n-heksana terhadap persen inhibisi 22 10 Fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah 23 11 Hasil absorbansi kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 23 12 Kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 24 13 Absorbansi inkubasi kadar MDA (µM) terhadap waktu 24 14 Aktivitas antoksidan ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana daun

sirih merah metode TBA 24

15 Analisis perhitungan IC50 difenolase ekstrak etanol 70% dan ekstrak

n-heksana daun sirih merah 25 16 Analisis stastistika terhadap penghambatan MDA 25

17 Analisis stastistika terhadap penghambatan enzim tirosinase 26

PENDAHULUAN

Kulit merupakan organ terbesar dan terluar tubuh manusia. Kulit langsung

terkena prooksida dari lingkungan, seperti radiasi ultraviolet (UV), obat-obatan

dan polusi udara. Selain pemicu eksternal serangan oksidatif, kulit juga harus

menghadapi endogen spesies oksigen reaktif (ROS) dan radikal bebas lainnya,

yang terus-menerus diproduksi selama metabolisme. Keseimbangan antara

oksidan dan antioksidan diperlukan untuk meminimalkan kerusakan jaringan.

Namun, jika keseimbangan ini terganggu stres oksidatif dapat terjadi dan hasilnya

adalah kerusakan oksidatif. Spesies oksigen reaktif (ROS) diketahui menyebabkan

modifikasi oksidatif DNA, protein dan lipid (Kang et al. 2005). Dalam mengatasi

bahaya yang timbul akibat radikal bebas, tubuh mengembangkan mekanisme

perlindungan untuk mencegah pembentukan radikal bebas dan peroksidasi lipid,

termasuk pada kulit. Berbagai kompartemen kulit (epidermis, dermis, subkutis)

dilengkapi dengan sistem antioksidan spesifik untuk mempertahankan

keseimbangan antara ROS dan antioksidan, sehingga dapat mencegah stres

oksidatif (Thiele dan Ekanayake-Mudiyanselage 2007).

Melanin pada epidermis berfungsi sebagai kromofor endogen yang akan

menyerap sinar matahari sehingga dianggap sebagai pelindung dampak buruk dari

sinar matahari. Melanin akan menyerap sinar matahari kemudian terjadi proses

fotokimiawi yang merubah molekul-molekul yang stabil menjadi molekul yang

sangat reaktif. Hasil reaksi fotokimiawi dikenal sebagai photo product antara lain

ROS (reactive oxygen species) seperti oksigen singlet, anion superaktif dan

radikal hidroksil. ROS yang terbentuk ini akan memicu kerja tirosinase dan

berakhir dengan sintesis melanin. Produksi melanin secara berlebihan dapat

mengarah pada terjadinya penumpukan melanin di lapisan epidermal

(hiperpigmentasi) dan menyebabkan kulit menjadi lebih gelap. Tirosinase

merupakan enzim yang berfungsi mengatur biosintesis melanin. Enzim tirosinase

bekerja mengubah tirosin menjadi DOPA dan kemudian menjadi dopakuinon

yang selanjutnya melalui beberapa tahap transformasi dikonversi menjadi melanin

(Fitrie 2004). Fungsi antioksidan berperan sebagai ROS scavenger sehingga

mengurangi hiperpigmentasi (Momtaz et al. 2008). Antioksida seperti flavonoid

juga diduga berperan sebagai inhibitor kompetitif enzim tirosinase karena struktur

dari flavonoid yang mirip dengan DOPA sebagai substrat (Chang 2009).

Senyawa antioksidan yang berperan sebagai penghambat pembentukan

melanin dapat diperoleh dari senyawa sintetik ataupun dari bahan alam. Senyawa

yang sering ditemukan dalam bahan kosmetik sebagai pencegah terbentuknya

melanin antara lain asam askorbat, arbutin, asam kojat, merkuri dan hidrokuinon.

Asam kojat memiliki aktivitas inhibisi dan kestabilan paling besar dalam

menghambat pembentukan melanin, serta banyak digunakan dalam produk

kosmetik dibandingkan produk pemutih lain. Namun, Miyazawa (2007)

menyatakan bahwa asam kojat bersifat karsinogenik dan penggunaannya dalam

konsentrasi tinggi dapat merusak kulit.

Pencarian alternatif inhibitor tirosinase yang aman bagi kesehatan terus

dilakukan, misalnya dari bahan alam. Penggunaan tumbuhan sebagai obat telah

lama dikenal secara luas oleh masyarakat Indonesia yang disebut sebagai obat

tradisional. Penggunaan obat tradisional dewasa ini sangat popular dan semakin

2

disukai oleh masyarakat. Hal ini disebabkan obat tradisional sangat murah, mudah

didapat dan memiliki efek samping serta tingkat toksisitasnya jauh lebih rendah.

Sejauh ini ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum) mengandung

senyawa fitokimia dan ekstrak air rebusan daun sirih merah mengandung alkaloid,

flavonoid dan tanin (Safithri dan Fahma 2008). Penelitian lain menyatakan bahwa

ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidasi, yaitu dapat

menghambat oksidasi asam lemak dengan daya hambat terbesar 80.40% dan

sebagai radical scavenger dengan nilai IC50 85.82 ppm. Ekstrak etanol daun sirih

merah juga memiliki aktivitas inhibisi terhadap enzim α-glukosidase sebesar

39.62% (Alfarabi 2010). Berdasarkan hasil penelitian Safithri et al. (2011) ekstrak

air rebusan daun sirih merah (P. crocatum) memiliki aktivitas antioksidasi

terhadap SOD dan katalase sebesar 3,41±0,04 U/ml dan 0,13± 0,02 mU/ml, dan

total fenol sebesar 532,6 ppm. Berdasarkan hasil penelitian pra klinis

menunjukkan bahwa ekstrak air rebusan formula daun sirih merah dan kayu manis

dengan perbandingan 3:2 (60.55%) konsentrasi 200 ppm memiliki daya hambat

yang sebanding dan tidak berbeda nyata dengan vitamin E konsentrasi 200 ppm

(61.40%) (Kartika 2012). Pengujian toksisitas akut air rebusan daun sirih merah

terhadap tikus percobaan Sprague dawley yang diberikan rebusan sirih merah

dengan berbagai dosis, menunjukkan bahwa selama 24 jam pertama sampai 7 hari

masa percobaan tidak ada hewan yang mati baik untuk kelompok dosis 0, 5, 10,

maupun 20 g/kg BB. Dengan tidak adanya kematian tikus putih pada semua dosis

yang diujikan, maka dapat dikatakan bahwa rebusan sirih merah tidak bersifat

toksik (Safithri et al. 2012). Menurut Pranakusumanagara (1998) rebusan daun

sirih merah digunakan untuk membasuh muka atau mandi. Kandungan karvakro

dan arekolin yang terkandung dalam sirih merah ini yang dipercaya meremajakan

kulit, memutihkan, menyegarkan dan membuat tampak lebih awet muda. Sirih

merah juga mengandung senyawa flavonoid yang diduga dapat menghambat kerja

enzim tirosinase (Chang 2009). Berdasarkan uraian diatas, untuk

mempertimbangkan kemungkinan aplikasi sirih merah sebagai pemutih alami

pada kosmetik kecantikan, maka diperlukan kajian mengenai aktivitas

inhibitornya terhadap enzim tirosinase dan aktivitas antioksidan.

Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan ekstrak daun

sirih merah terhadap pembentukan malondialdehida (MDA) dan enzim tirosinase.

Parameter yang digunakan adalah pengujian antioksidasi daun sirih merah secara

in vitro menggunakan metode tiobarbiturat (TBA) dan pengujian aktivitasnya

dalam menghambat enzim tirosinase. Hasil penelitian ini diharapkan dapat

memberikan informasi ilmiah mengenai potensi antioksidasi dan penghambatan

terhadap enzim tirosinase daun sirih merah secara in vitro dan dapat dijadikan

dasar pengembangan produk fitofarmaka sirih merah sebagai antioksidan dan

sebagai pemutih wajah.

METODE

Bahan dan Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik

Ohaus GA 200, eksikator, oven memmert, pisau, blender, cawan porselin, sanstat

water bath, tabung reaksi, pipet tetes, pH meter, pipet mohr, kertas saring, labu

3

takar, erlenmeyer, spektrofotometer Genesys 10 UV (190-1100 nm), rotav eyela

n-1100, bulp, gelas ukur, sentrifus Hettich Universal (0-6000 rpm), corong

plastik, multi-well plate, ELISA reader epoch biotek dan mikropipet.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia daun

sirih merah, etanol 70%, n-heksana, HCl 2 N, akuades, pereaksi Dragendorff,

pereaksi Mayer, pereaksi Wagner, metanol, etil asetat, metanol 30%, etanol 30%,

etanol 99.8%, amoniak, kloroform, eter, FeCl3, tirosinase, L-3, 4-

dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), larutan standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana

(TMP) 6 M, natrium hidroksida (NaOH), asetat anhidrida, asam sulfat (H2SO4),

buffer fosfat pH 6.5, buffer fosfat 0.1 M pH 7, asam linoleat, Dimethyl sulfoxide

(DMSO), asam trikloroasetat (TCA) 20%, asam kojat sebagai kontrol positif dan

asam tiobarbiturat (TBA) 1%.

Prosedur Penelitian

Analisis daun sirih merah dibagi dalam 3 tahap penting, yaitu analisis

fitokimia dari ekstrak sirih merah, analisis antioksidan ekstrak sirih merah dengan

metode TBA dan analisis inhibitor ekstrak sirih merah terhadap enzim tirosinase.

Tahap awal, daun sirih merah dikeringkan dalam oven suhu 50°C selama ± 4 hari

dengan tujuan untuk mengurangi kadar air pada daun sirih merah. Daun sirih

merah yang sudah kering dihaluskan dengan ukuran 60 mesh. Kadar air daun sirih

merah diukur dengan tujuan untuk mengetahui kadar air dari sirih merah. Kadar

air tidak lebih dari 12% (b/b). Selanjutnya, daun sirih merah diekstrak dengan

metode maserasi menggunakan 2 pelarut, yaitu etanol 70% dan n-heksana. Dasar

pemilihan kedua pelarut ini adalah kandungan metabolit sekunder daun sirih

merah (flavonoid dan minyak atsiri) diharapkan dapat terlarut dalam kedua pelarut

yang digunakan. Kedua ekstrak sirih merah (etanol 70% dan n-heksana) dianalisis

fitokimia, yaitu uji alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, steroid dan triterpenoid

dengan tujuan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder sirih merah pada

kedua ekstrak. Ekstrak etanol 70% dan n-heksana selanjutnya diuji aktivitas

antioksidan dengan metode TBA. Sebelum analisis ekstrak etanol 70% dan n-

heksana, asam linoleat diinkubasi dengan tujuan untuk menentukan waktu

inkubasi ekstrak dengan asam linoleat. Selanjutnya, dilakukan analisis

penghambatan ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah terhadap enzim

tirosinase dengan menggunakan metode microplate reader.

Pengeringan Bahan Uji (Safithri 2012)

Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian adalah daun sirih

merah tua yang diperoleh dari 3-5 helai dari pucuk tanaman dengan bentuk daun

yang sempurna yang diperoleh dari perumahan Bogor Raya Permai. Sampel daun

segar diambil sebanyak 2 kg. Daun sirih merah dicuci dengan air bersih dan

ditiriskan dalam wadah plastik dan dikeringkan dalam oven dengan suhu 50oC

selama 4-5 hari sampai diperoleh berat akhirnya yang konstan agar didapatkan

sampel kering dengan kadar air tidak lebih dari 12% (b/b). Daun sirih merah

kering dihaluskan dengan menggunakan blender hingga menjadi serbuk halus,

4

lalu diayak dengan saringan sehingga ukuran serbuk menjadi 60 mesh. Simplisia

dibungkus dengan plastik dan disimpan untuk pengujian selanjutnya.

Penetapan kadar air metode oven (AOAC 2006)

Prinsip penghitungan kadar air adalah bobot hilang pada pemanasan 105ºC

dianggap sebagai kadar air yang terdapat pada sirih merah, karena titik didih air

sebesar 100ºC. Cawan porselen dikeringkan di dalam oven bersuhu 105

°C selama

1 jam, kemudian didinginkan dalam eksikator selama 15 menit. Cawan porselen

ditimbang untuk menentukan bobot kosongnya. Cawan kosong ditimbang dan

dicatat bobotnya. Dua gram simplisia daun sirih merah dimasukkan ke dalam

cawan kemudian dicatat bobotnya, dikeringkan dalam oven pada suhu 105°C

selama 3 jam setelah itu didinginkan dalam eksikator. Cawan porselen ditimbang

kembali.

Kadar Air =

× 100 %

Keterangan:

a = bobot sampel sebelum dikeringkan (g)

b = bobot sampel setelah dikeringkan (g)

Ekstraksi Serbuk Daun Sirih Merah (P. crocatum) (BPOM RI 2004)

Sebanyak 5 gram serbuk simplisia daun sirih merah ditambahkan pelarut

dengan perbandingan 1:10 (b/v), lalu diletakkan pada shaker selama 24 jam,

kemudian disaring. Perlakuan maserasi (menggunakan sampel daun, bekas

maserasi sebelumnya) diulang sebanyak 3 kali. Maserat dipekatkan menggunakan

rotary evaporator pada suhu 50ºC untuk ekstrak etanol 70% dan 45

ºC untuk

ekstrak n-heksana. Residu yang diperoleh ditimbang dan ditentukan rendemennya.

Rendemen

Rendemen ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana daun sirih merah

dihitung dengan membandingkan bobot awal simplisia dengan bobot akhir ekstrak

yang dihasilkan

% Rendemen ekstrak =

x 100%

Analisis Fitokimia (Harbone 1987)

Uji alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL kloroform

dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform yang diperoleh dipisahkan dan diasamkan

dengan 2 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam dibagi menjadi 3 tabung dan masing-

masing tabung ditambahkan dengan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner

sebanyak 3 tetes. Sampel positif mengandung alkaloid ditandai dengan

terbentuknya endapan putih untuk perekasi Mayer, endapan merah untuk pereaksi

Dragendorf dan endapan coklat untuk pereaksi Wagner.

5

Uji flavonoid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL

metanol 30 %, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat yang terbentuk

ditambahkan dengan 3 tetes H2SO4. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan

terbentuknya endapan warna merah.

Uji saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL

akuades kemudian dipanaskan selama 5 menit. Sampel dikocok selama 5 menit.

Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa yang stabil setelah

didiamkan selama 10 menit.

Uji triterpenoid dan steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan

dengan 5 mL etanol 30 %, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Sampel disaring,

filtrat yang diperoleh diuapkan hingga kering. Residu ditambah 0.5 mL eter dan

dipindahkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan dengan pereaksi

Liebermann Burchard (3 tetes asam asetat anhiridat dan 1 tetes H2SO4 pekat).

Adanya triterpenoid ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu,

sedangkan adanya steroid ditunjukkan dengan warna hijau atau biru.

Uji tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL akuades,

kemudian didihkan selama 5 menit. Sampel selanjutnya disaring, filtrat yang

diperoleh ditambahkan dengan 5 tetes FeCl3 1% (b/v). Adanya warna biru tua atau

hitam yang terbentuk menunjukkan adanya tanin.

Uji Aktivitas Antioksidan Metode TBA-MDA (Kikuzaki dan Nakatani 1993)

Penentuan kurva standar larutan 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP).

Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan TMP dengan

konsentrasi 1, 5, 8, 10, 13, 15, 18, 20 µM. Tiap larutan dipipet 1 mL dan

ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam

asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10

menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter

rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian serapannya diukur pada

panjang gelombang 532 nm. Larutan blanko menggunakan 1 mL akuades yang

diberi perlakuan seperti larutan konsentrasi TMP lainnya (konsentrasi 0 TMP).

Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan Metode TBA.

Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan menggunakan 6 mL bufer fosfat

0.1 M pH 7, kemudian ditambah 6 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%,

dan 3 mL air bebas ion dicampurkan. Sebanyak 1 mL campuran ditempatkan di

botol gelap kemudian campuran diinkubasi pada suhu 40oC. Pengukuran

intensitas serapannya dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL campuran asam

linoleat yang telah diinkubasi ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL

larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam

penangas air 100oC selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan

kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Panjang

gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Pengukuran dilakukan

setiap hari hingga tercapai serapan maksimum. Larutan blanko digunakan 1 mL

6

campuran 3 mL etanol 99.8% dan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7, kemudian

ditambahkan 2 mL TCA 20% dan 2 mL TBA 1% dalam asetat 50%. Larutan

blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10 menit. Larutan

disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama

15 menit.

Analisis konsentrasi malondialdehida (MDA) dengan metode TBA.

Analisis antioksidan ekstrak daun sirih merah dibuat dalam konsentrasi 25, 50, 75,

100, dan 200 ppm. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 mL kemudian

ditambahkan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam

etanol 99.8%. Larutan kontrol positif digunakan 1 mL α-tokoferol (200 ppm), 2

mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%.

Semua larutan ini kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan diinkubasi di

penangas 40oC selama waktu inkubasi optimum dari metode TBA dengan

mengambil 1 mL dari setiap larutan, kemudian ditambahkan 2 mL larutan TCA

20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi

diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10 menit. Setelah dingin larutan

disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama

15 menit. Panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm.

Larutan blanko digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99.8% dan 2 mL bufer

fosfat 0.1 M pH 7, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1%

dalam asetat 50%. Larutan blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100oC

selama 10 menit. Larutan disentrifus dengan kecepatan 300 rpm (diameter rotor

sentrifus 130 mm) selama 15 menit.

Uji Inhibitor Tirosinase (Batubara et al. 2010)

Ekstrak dilarutkan dalam DMSO hingga konsentrasinya 10.000 ppm.

Larutan stok disiapkan dengan cara melarutkan ekstrak pekat kedalam bufer fosfat

50 mM (pH 6.5) hingga memperoleh konsentrasi 600 mg/mL. Ekstrak diuji

dengan konsentarsi 20, 200, 400, 800, 1600 dan 3200 ppm. Asam kojat sebagai

kontrol positif diuji pada konsentrasi 200 ppm ditambahkan 30 µL enzim tironase

(sigma, 333unit/mL dalam bufer fosfat) dan campuran diinkubasi selama 5 menit.

Setelah itu, sebanyak 110 µL substrat (L-DOPA 12 mM) ditambahkan dan

campurannya diinkubasi pada suhu 37°C selam 30 menit. Larutan pada masing-

masing sumur diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan microplate reader

pada panjang gelombang 492 nm untuk menentukan persen inhibisi dan nilai

konsentrasi hambat 50% (IC50). Persen inhibisi dihitung dengan cara

membandingkan absorbansi sampel tanpa ekstrak (A) dengan penambahan ekstrak

(B) pada panjang gelombang 492 nm.

% Inhibisi =

× 100 %

Analisis data.

Analisis statistik terhadap aktivitas antioksidasi menggunakan rancangan

acak lengkap, yaitu dengan uji analysis of varian (ANOVA) pada tingkat

kepercayaan 95% dan taraf α=0.05. Data dianalisis dengan program perangkat

lunak Statistical Programme for Social Science (SPSS) PASW 18.0.

7

HASIL

Kadar Air dan Rendemen Daun Sirih Merah

Daun sirih merah dianalisis kadar air terlebih dahulu sebelum digunakan

untuk ekstraksi. Hasil analisis kadar air menunjukkan bahwa proses pengeringan

dengan oven suhu 50°C selama 4 hari mampu menurunkan kadar air hingga

dibawah 10%, kadar air simplisia yang diperoleh sebesar 7.75%. Rendemen

tertinggi hasil Rotary evaporator diperoleh ekstrak etanol 70% daun sirih merah

sebesar 17.84%, sedangkan ekstrak n-heksana sebesar 4.88% (Tabel 1).

Tabel 1 Rendemen ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih merah

Jenis ekstrak %Rendemen ekstrak

Etanol 17.84% ± 0.66

n-heksana 4.88% ± 4.80 n = 2 kali ulangan

Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah

Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% sirih merah

mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, tanin dan steroid. Ekstrak n-heksana

sirih merah mengandung saponin dan steroid (Tabel 2).

Tabel 2 Uji fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah

Senyawa Ekstrak

Etanol 70% n-heksana

Alkaloid

Flavonoid

Saponin

Tanin

Steroid dan Triterpenoid

+ -

+

+

+

+

-

+

-

+ Ket : (+) terdeteksi; (-) tidak terdeteksi

Aktivitas Antioksidasi terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA)

Berdasarkan hasil yang diperlihatkan pada Gambar 1, peningkatan daya

hambat ekstrak etanol 70% terhadap pembentukan MDA tidak berbanding lurus

dengan konsentrasi. Vitamin E konsentrasi 200 ppm digunakan sebagai kontrol

positif. Penghambatan tertinggi ekstrak etanol 70% terdapat pada konsentrasi 200

ppm sebesar 52.13%. Analisis statistik menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70%

pada konsentrasi 50 ppm tidak berbeda nyata (P<0.05) dengan konsentrasi 25 ppm

dan 100 ppm tetapi berbeda nyata (P<0.05) dengan konsnetrasi 200 ppm. Ekstrak

etanol 70% konsentrasi 200 ppm (52.13%) memiliki daya hambat yang tidak

berbeda nyata (P<0.05) dengan vitamin E konsentrasi 200 ppm (36.42%).

Peningkatan daya hambat ekstrak n-heksana terhadap pembentukan MDA

tidak berbanding lurus dengan konsentrasi (Gambar 1). Penghambatan tertinggi

ekstrak n-heksana terdapat pada konsentrasi 200 ppm sebesar 40.13%. Analisis

statistik menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana pada konsentrasi 100 ppm tidak

berbeda nyata (P<0.05) dengan konsnetrasi 25 ppm dan 50 ppm tetapi berbeda

8

nyata (P<0.05) dengan konsnetrasi 200 ppm. Ekstrak n-heksana konsentrasi 200

ppm (40.13%) memiliki daya hambat yang tidak berbeda nyata (P<0.05) dengan

vitamin E konsentrasi 200 ppm (36.42%).

Gambar 1 Aktivitas antioksidan ekstrak daun sirih merah dengan metode TBA.

ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana

Penentuan Penghambatan Enzim Tirosinase pada Ekstrak Etanol 70% dan

n-Heksana

Ekstrak etanol 70% sirih merah terjadi peningkatan daya hambat terhadap

aktivitas enzim tirosinase yang berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi

(Gambar 2). Asam kojat konsentrasi 200 ppm digunakan sebagai kontrol positif.

Penghambatan tertinggi terdapat pada ekstrak etanol 70% dengan konsentrasi

3200 ppm sebesar 76.457%. Analisis statistik menunjukkan bahwa ekstrak etanol

70% pada masing-masing konsentrasi (20 ppm, 200 ppm, 800 ppm, 1600 ppm,

2400 dan 3200 ppm) berbeda nyata (P<0.05). Ekstrak etanol 70% konsentrasi 200

ppm (12.78%) memiliki daya hambat yang berbeda nyata (P<0.05) dengan asam

kojat konsentrasi 200 ppm (91.82%). Nilai IC50 dari ekstrak etanol 70% sebesar

1655 ppm.

Ekstrak n-heksana sirih merah terjadi peningkatan daya hambat terhadap

aktivitas enzim tirosinase yang berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi

(Gambar 2). Penghambatan tertinggi ekstrak n-heksana terdapat pada konsentrasi

3200 ppm sebesar 54.260%. Analisis statistik menunjukkan bahwa persen

penghambatan ekstrak n-heksana sirih merah pada masing-masing konsentrasi (20

ppm, 200 ppm, 800 ppm, 1600 ppm, 2400 dan 3200 ppm) berbeda nyata (P<0.05).

Ekstrak n-heksana konsentrasi 200 ppm (1.23%) memiliki daya hambat yang

36

.42

± 5

.01

ab

19

.95

± 1

2.9

5b

c

25

.58

± 1

3.5

5b

37

.82

± 4

.38

ab

52

.13±

9.3

4a

36

,42

± 5

.01

a

26

.65

± 8

.09

ab

30

.86

± 1

0.6

5ab

17

.47

± 1

.95b

40

.13

± 5

.34

a

0

10

20

30

40

50

60

vitamin E (200) 25 50 100 200

% I

nh

ibis

i

Konsentrasi (ppm)

9

berbeda nyata (P<0.05) dengan asam kojat konsentrasi 200 ppm (91.82%). Nilai

IC50 ekstrak n-heksana sebesar 3090.56 ppm.

Gambar 2 Aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah. ekstrak

etanol 70% dan ekstrak n-heksana

PEMBAHASAN

Pembuatan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah

Daun sirih merah diekstraksi dengan proses maserasi. Ekstraksi adalah

metode suatu cara untuk menarik satu atau lebih zat dari bahan asal dengan

menggunakan pelarut (Syamsuni 2006). Zat aktif yang terdapat dalam simplisia

tersebut dapat digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid

dan lain-lain (Depkes 2000). Tujuan utama ekstraksi ini adalah untuk

mendapatkan atau memisahkan sebanyak mungkin zat-zat yang memiliki khasiat

pengobatan (Syamsuni 2006). Penelitian ini menggunakan metode ekstraksi

maserasi, karena metode ini prosedur dan peralatannya sederhana (Agoes 2007).

Maserasi adalah penarikan cara penarikan simplisia dengan merendam simplisia

tersebut dalam cairan penyari (Syamsuni 2006) dengan beberapa kali pengocokan

atau pengadukan pada temperatur kamar, sedangkan remaserasi merupakan

pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama

dan seterusnya (Depkes 2000). Sebelum diekstraksi, terlebih dahulu simplisia

daun sirih merah dikeringkan. Proses pengeringan simplisia daun sirih merah

dilakukan untuk mengurangi kadar air dan mempermudah penggerusan atau

pembuatan serbuk (Katno et al. 2008). Bahan dikeringkan dengan menggunakan

91

.82

± 0

.41

a

5.4

9 ±

0.7

8g

12

.78

± 2

.3f

45

.18

± 1

.53

e

53

.03

± 0

.61

d

69

.51

± 1

.04

c

76

.46

± 0

.33

b

91

.82 ±

0.4

1a

-4.2

6 ±

1.9

3g

1,2

3 ±

0.9

1f

6.2

8 ±

0.8

3e

18

.61

± 2

.95

d

40

.02

± 1

.14

c

54

.26

± 2

.05

b

-20

0

20

40

60

80

100

asam kojat 20 200 800 1600 2400 3200

% i

nh

ibis

i

Konsentrasi (ppm)

10

oven selama 4 hari pada suhu 50ºC. Pengeringan dengan menggunakan oven

dipilih karena suhu dan kecepatan proses pengeringan dapat diatur, tidak

dipengaruhi oleh cuaca, sanitasi dan higienis dapat dikendalikan. Standar kadar air

maksimum simplisia adalah 10% (Depkes 2008), karena kandungan air yang

tinggi dalam suatu bahan dapat mendorong terjadinya reaksi enzimatik yang

mengakibatkan terjadinya perubahan kimia. Jumlah air dalam bahan pangan

disebut sebagai aktivitas air (water activity = aw). Bakteri membutuhkan aw =

0.91. Oleh karena itu sebagian bakteri tidak dapat tumbuh pada aw = 0.90 atau

dibawahnya, maka untuk membuat makanan tahan lama selama penyimpanan

selain kadar air makanan dibuat 10% juga aw makanan harus di bawah 0.90 untuk

mencegah timbulnya bakteri (Winarno 1980). Hasil pengukuran kadar air dari

kedua simplisia didapatkan di bawah 10%, sehingga simplisia dapat disimpan

dalam jangka waktu lama tanpa adanya kerusakan oleh mikroba (Suharmiati dan

Maryani 2003).

Berdasarkan uji fitokimia pada penelitian sebelumnya, bahwa daun sirih

merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid dan tannin (Safithri dan Fahma

2005), maka senyawa-senyawa tersebut bersifat polar terutama flavonoid.

Berbagai kandungan yang terdapat dalam daun sirih merah yang diperkirakan

sebagai penghambat enzim tirosinase adalah flavonoid (Chang 2009).

Berdasarkan sifat flavonoid tersebut, maka untuk ekstraksi dapat digunakan etanol

70% sebagai bahan penyarinya, karena etanol 70% bersifat semi polar yang dapat

melarutkan senyawa yang bersifat polar maupun non-polar. Etanol 70% tidak

menyebabkan pembengkakan membran sel dan memperbaiki stabilitas bahan obat

terlarut (Harborne 1987) dan relatif lebih aman digunakan. Selain itu etil p-

metoksi sinamat, salah saru turunan asam sinamat merupakan salah satu golongan

minyak atsiri memiliki berbagai aktivitas biologis salah satunya adalah sebagai

penghambat enzim tirosinase (Rudyanto dan Hartanti 2008). Selain menggunakan

etanol 70%, digunakan n-heksana sebagai pelarut karena minyak atsiri merupakan

senyawa non polar sehingga dapat larut dalam senyawa non polar.

Ekstraksi dengan metode maserasi yang dilakukan dalam penelitian ini

menggunakan daun sirih merah segar yang telah dihaluskan direndam dengan

larutan etanol 70% dan n-heksana selama 24 jam. Penggunaan daun yang segar

bertujuan mencegah terjadinya perubahan kimia terhadap senyawa-senyawa yang

terdapat di daun sehingga tidak merusak senyawa yang diinginkan. Simplisia

dihaluskan dengan ukuran 60 mesh bertujuan memperbesar peluang terlarutnya

senyawa-senyawa yang ingin diekstrak dengan etanol 70% dan n-heksana karena

dengan dihaluskan akan memudahkan etanol 70% dan n-heksana berinteraksi

dengan senyawa-senyawa yang ingin diekstrak. Larutan tersebut dipekatkan

dengan rotary evaporator, bertujuan menguapkan pelarut sehingga didapat

ekstrak cairan (liquid) (Nugroho et al. 2000). Suhu yang digunakan yaitu 50oC,

karena meminimalisir kerusakan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak

(Kuswardahani 2007). Ekstrak yang didapat dalam penelitian ini berbentuk serbuk

kering dengan nilai rerata rendemen dari ekstrak etanol 70% sebesar 17.81%,

sedangkan ekstrak n-heksana memiliki rendemen rata-rata sebesar 4.88% (Tabel

2). Hasil rendemen ini menunjukkan bahwa kadar rendemen ekstrak etanol 70%

lebih tinggi daripada ekstrak n-heksana sebab etanol 70% dapat melarutkan

senyawa polar dan nonpolar. Penentuan rendemen berfungsi untuk mengetahui

11

kadar metabolit sekunder yang terbawa oleh pelarut tersebut namun tidak dapat

menentukan jenis senyawa yang terbawa tersebut.

Sampel dalam bentuk ekstrak memiliki kelebihan antara lain, banyaknya

senyawa bioaktif yang terlarut karena semua senyawa tersebut dalam tanaman

masih dalam bentuk konsentrat serta masih dalam bentuk alami. Komposisi alami

memungkinkan semakin kecil efek samping dan perubahan aktivitas senyawa

bioaktif serta mempermudah standarisasi sampel (Sinambela 2003).

Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah

Sampel yang digunakan adalah ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana

daun sirih merah. Uji fitokimia bertujuan untuk mengetahui adanya senyawa

metabolit yang diharapkan dapat berperan sebagai antioksidan dan penghambat

enzim tirosinase.

Hasil uji fitokimia ekstrak etanol 70% daun sirih merah (tabel 2) ini tidak

jauh berbeda dengan hasil penelitian Salim (2006) yang menggunakan rebusan

daun sirih merah yang terbukti mengandung alkaloid, flavonoid dan tanin.

Kesesuaian hasil uji fitokimia antara ekstrak air rebusan dan etanol 70%

membuktikan bahwa etanol 70% menarik senyawa kimia yang relatif sama

dengan air. Dari ketiga senyawa tersebut (alkaloid, flavonoid dan tanin), senyawa

flavonoid dilaporkan dapat menghambat enzim tirosinase (Chang 2009). Senyawa

flavonoid juga berperan sebagai antioksidan seperti yang telah dilaporkan oleh

(Gheldof et al. 2002). Selain senyawa flavonoid, senyawa tanin juga berfungsi

sebagai antioksidan karena kemampuannya dalam menangkap radikal bebas,

menghambat radikal bebas dan tumor (Dangles et al. 2000). Aktivitas antioksidan

dari suatu tumbuhan sangat dipengaruhi oleh keberadaan senyawa metabolit

sekunder yang terkandung.

Potensi Antioksidan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah

terhadap Penghambatan MDA

Salah satu target dari serangan radikal bebas dalam sel makhluk hidup

adalah lipid pada membran sel. Peroksidasi lipid merupakan reaksi tidak

terkendali dari radikal bebas terhadap komponen sel seperti asam lemak tak jenuh

ganda (polyunsaturated fatty acid, PUFA) pada membran sel yang sedikitnya

mengandung tiga ikatan rangkap, sehingga terbentuk radikal bebas baru yang

sangat peka terhadap oksigen (radikal peroksi lipid) (Hasanah 2008). Reaksi ini

berlanjut hingga membentuk produk sekunder yaitu malondialdehida (MDA).

Penelitian ini menggunakan asam linoleat yang merupakan asam lemak tak

jenuh, karena dapat dengan mudah diserang oleh radikal bebas pada ikatan

rangkapnya sehingga menghasilkan lipid peroksida. Asam lemak dapat rusak

akibat teroksidasi oleh beberapa faktor seperti suhu, cahaya, ion-ion logam dan

oksigen (Raharjo 2004). Oleh karena itu laju oksidasi asam linoleat dipercepat

dengan mengatur suhu tetap pada 40oC, dan disimpan pada botol gelap berulir

bertujuan menghindari faktor lain selain suhu dan oksigen.

Sebelum uji potensi antioksidasi dengan metode TBA, dilakukan

pengukuran hidroperoksida yang merupakan produk primer oksidasi asam linoleat

dengan metode diena terkonjugasi. Pengukuran hidroperoksida bertujuan

menentukan waktu inkubasi maksimum. Hasil pengukuran hidroperoksida

digunakan untuk menentukan lama inkubasi asam linoleat sebelum analisa MDA.

12

Gambar 3 Kurva kadar MDA terhadap waktu (Kartika 2013)

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan Kartika (2013) absorbansi

terbesar terjadi pada hari ke-6 (Gambar 3), hasil yang sama juga ditunjukkan oleh

penelitian Alfarabi (2010). Pengukuran potensi antioksidasi dilakukan dua hari

setelah hidroperoksida terbentuk maksimum yaitu pada hari ke-8, dengan asumsi

semua hidroperoksida yang telah terbentuk terdekomposisi menjadi MDA

(Kikuzaki dan Nakatani 1993).

Keberadaan MDA ini dapat dicegah apabila reaksi oksidasi asam linoleat

dihambat. Senyawa antioksidan dapat menghambat proses oksidasi berlanjut

tersebut dengan melengkapi elektron ke senyawa asam linoleat radikal. Senyawa

antioksidan sirih merah (tanin, alkaloid dan flavonoid) didalam larutan inkubasi

asam linoleat dapat dengan mudah melengkapi elektron ke senyawa radikal, oleh

sebab itu senyawa MDA tidak terbentuk atau terbentuk dalam jumlah yang kecil

karena proses oksidasi asam linoleat terhambat dengan adanya antioksidan.

Konsentrasi ekstrak sirih merah yang digunakan untuk mengukur MDA adalah

25, 50, 75, 100, dan 200 ppm. Pemilihan kelima konsentrasi ekstrak yang

digunakan berdasarkan pada batas maksimum kandungan antioksidan dalam

makanan yaitu 200 ppm (Hernani dan Rahardjo 2005). Kontrol positif pada

penelitian ini digunakan vitamin E 200 ppm.

Inkubasi dalam percobaan dilakukan selama 8 hari, setelah itu kadar MDA

diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 532 nm. Kurva

standar yang digunakan adalah larutan 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) dengan

berbagai konsentrasi. TMP merupakan senyawa turunan MDA yang cukup stabil.

Persamaan garis linear yang didapat adalah y=0.086x+0.006 dengan nilai R2=

99.8%. Nilai pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 532 nm tidak

berbanding lurus dengan jumlah MDA yang terbentuk.

Hasil pengujian aktivitas antioksidan dengan MDA-TBA menunjukkan

bahwa setiap ekstrak daun sirih merah mempunyai kemampuan menghambat

radikal bebas MDA. Hal ini terjadi karena nilai absorbansi setiap ekstrak daun

sirih merah lebih kecil dibandingkan dengan kontrol negatif. Kelima konsentrasi

menunjukkan hasil yang tidak linear antara konsentrasi dengan persen

penghambatannya baik pada ekstrak etanol 70%, maupun ekstrak n-heksana. Hal

ini disebabkan ekstrak yang digunakan masih ekstrak kasar, sehingga masih ada

kemungkinan senyawa murni yang dikandung memiliki aktivitas peredam radikal

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ka

da

r M

DA

(µ

M)

Waktu Inkubasi (Hari)

13

bebas lebih kuat dibandingkan ekstraknya. Ekstrak kasar masih mengandung

senyawa-senyawa yang dapat menghambat peredaman radikal bebas terhadap

antioksidan, seperti karbohidrat, protein dan lemak yang menyebabkan aktivitas

antioksidan ekstrak kasar lebih rendah dibandingkan senyawa murni.

Penghambatan tertinggi ekstrak etanol 70% maupun ekstrak n-heksana terdapat

pada konsentrasi 200 ppm. Konsentrasi 200 ppm ekstrak etanol 70% dan ekstrak

n-heksana memiliki daya hambat yang tidak berbeda nyata (P<0.05) dengan

vitamin E konsentrasi 200 ppm (36.42%). Nilai vitamin E 200 ppm pada

penelitian ini mampu memberikan daya hambat terhadap pembentukan MDA

sebesar 36.42%. Nilai tersebut lebih rendah dibandingkan dengan penelitian lain

yang dilakukan dengan menggunakan vitamin E sebagai kontrol positif pada

konsentrasi 200 ppm. Satria (2005) melaporkan bahwa pada konsentrasi 200 ppm,

vitamin E mampu menghambat pembentukan MDA sebesar 93.00%, Kartika

(2012) melaporkan bahwa pada konsentrasi 200 ppm, vitamin E mampu

menghambat pembentukan MDA sebesar 49.82%, Martsolich (2007) melaporkan

bahwa pada konsentrasi 200 ppm, vitamin E mampu menghambat pembentukan

MDA sebesar 55.18%, sedangkan Sufriadi (2006) menyebutkan nilai sebesar

84.01% pada konsentrasi yang sama. Hasil yang berbeda ini terjadi karena ada

faktor yang ikut mempengaruhi nilai potensi antioksidasi vitamin E sebagai

kontrol positif. Walupun vitamin E yang dipakai adalah berasal dari stok yang

sama, namun tidak dengan bahan-bahan lainnya. Hal ini memungkinkan adanya

perbedaan kemurnian dan kualitas bahan-bahan tersebut yang dapat

mempengaruhi hasil yang diperoleh. Selain itu metode yang berbeda juga ikut

mempengaruhi lamanya waktu yang digunakan untuk inkubasi asam linoleat.

Pada penelitian Satria (2005) dan Sufriadi (2006), digunakan metode tiosianat,

sedangkan dalam penelitian ini digunakan metode TBA, sehingga perbedaan

waktu inkubasi ini ikut mempengaruhi nilai potensi antioksidasi yang diperoleh.

Selain itu vitamin E mudah teroksidasi, sehingga hal tersebut yang membuat

kemampuan vitamin E sebagai antioksidan berkurang. Seperti yang diungkapkan

Winarno 1998 bahwa vitamin E merupakan vitamin yang larut dalam lemak,

tahan terhadap suhu tinggi tetapi karena bersifat antioksidan vitamin E teroksidasi

terutama apabila ada lemak yang tengik, timah, garam besi dan mudah rusak oleh

sinar matahari.

Selain dengan vitamin E, aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah ini

dapat dibandingkan dengan tumbuhan lainnya yang memiliki aktivitas

antioksidasi, contohnya dengan mengkudu dan Physalis peruviana. Kemampuan

antioksidasi ekstrak daun sirih merah dengan pelarut etanol dan n-heksana ini

lebih baik karena di setiap konsentrasinya tidak menunjukkan efek prooksidan

bila dibandingkan dengan buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) yang diekstrak

dengan pelarut metanol (Zin et al. 2001). Namun aktivitas antioksidasinya lebih

rendah bila dibandingkan dengan ekstrak etanol 95 % Physalis peruviana

konsentrasi 100 μg/mL (100 ppm) yang sudah memiliki daya hambat

pembentukkan lipid peroksida sebesar 82.3 % (Wu et al. 2005). Jika dibandingkan

dengan pelarut lain, contohnya pelarut air. Ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-

heksana daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidan yang lebih rendah.

Menurut Alfarabi (2008) pembentukan MDA dapat dihambat sebesar 81.78%

pada konsentrasi 200 mg/10mL dengan menggunakan pelarut air, sementara itu

pada konsentrasi yang sama ekstrak etanol dan ekstrak n-heksana hanya mampu

14

menghambat masing-masing sebesar 52.13% dan 44.13%. Adanya potensi

sebagai antioksidan didasarkan pada senyawa-senyawa yang berfungsi sebagai

antioksidan alami yang terdapat pada daun sirih merah antara lain flavonoid,

saponin, alkaloid, tanin dan steroid. Berdasarkan hasil fitokimia, tiga senyawa

falvonoid, tanin dan alkaloid merupakan senyawa yang dominan terdapat pada

ekstrak etanol 70%. Ketiga senyawa ini yang dominan ada pada ekstrak etanol

70% diduga sebagai penyebab tingginya aktivitas antioksidan ekstrak etanol 70%

dan air dibandingkan ekstrak n-heksana. Kandungan senyawa yang berfungsi

sebagai antioksidan pada ekstrak etanol 70% dan ekstrak air relatif sama, namun

aktifitas antioksidan ekstrak air lebih tinggi dibandingkan ekstrak etanol 70%

diduga karena jumlah senyawa antioksidan pada kedua ekstrak berbeda.

Penentuan Penghambatan (IC50) Ekstrak Etanol 70% dan Ekstrak n-

Heksana Sirih Merah terhadap Enzim Tirosinase

Hasil pengujian penghambatan enzim tirosinase dengan ekstrak etanol 70%

dan ekstrak n-heksana, peningkatan konsentrasi berbanding lurus dengan

peningkatan nilai penghambatan enzim tirosinase. Ekstrak etanol 70% memiliki

nilai penghambatan yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak n-heksana, hal ini

menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% memiliki aktivitas yang lebih baik

terhadap penghambatan enzim tirosinase dibandingkan dengan ekstrak n-heksana.

Nilai penghambatan ekstrak etanol 70% konsentrasi 200 ppm (12.78%) dan

ekstrak n-heksana konsentrasi 200 ppm (1.23%) lebih rendah dibandingkan

dengan asam kojat 200 ppm sebesar (91.82%). Dibandingkan dengan hasil

penelitian yang dilakukan (Putri et al. 2010), nilai penghambatan Artocharpus

heterophyllus pada konsentrasi 150 ppm ekstrak metanol Artocharpus

heterophyllus sudah mampu menghambat enzim tirosinase sebesar 125.001%,

sedangkan ekstrak etanol 70% sirih merah pada konsentrasi 1600 ppm baru

mampu menghambat enzim tirosinase sebesar 53.027%. Untuk ekstrak n-heksana

pada konsentrasi 3200 ppm baru dapat menghambat enzim tirosinase sebesar

54.260%. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan enzim tirosinase

dari ekstrak sirih merah rendah. Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan jenis

senyawa bioaktif yang terkandung atau jumlah senyawa bioaktif yang dapat

terekstrak oleh masing-masing pelarut.

Ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana diuji nilai IC50. Hasil penelitian

IC50 enzim tirosinase menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirih merah

memiliki nilai IC50 paling rendah (1655 ppm) dibandingkan dengan nilai IC50

ekstrak n-heksana (>2000 ppm). Hasil ini sama seperti yang dilaporkan Thankam

et al. (2012) bahwa ekstrak curcumin yang memiliki nilai IC50 sebesar 31.25 ppm

lebih tinggi aktivitas penghambatannya dibandingkan dengan ekstrak curcumin

yang memiliki nilai IC50 sebesar 56.47 ppm. Hal ini diduga karena kandungan

senyawa flavonoid yang terdapat pada ekstrak etanol 70% lebih berpotensi

sebagai penghambat enzim tirosinase dibandingkan minyak atsiri pada ekstrak n-

heksana. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Fransiska (2012) yang

menyatakan bahwa ekstrak kasar etil asetat bunga D. Rosea Cav yang diduga

mengandung flavanoid merupakan penghambatan enzim tirosinase teraktif

dibandingkan dengan ekstrak dan minyak atsiri spesies Asteraceae lain yang

diujikan.

15

Senyawa yang diduga memiliki penghambatan terhadap enzim tirosinase

adalah senyawa flavonoid, di antaranya kuersetin (golongan flavonol),

streppogenin (golongan flavanon), dihidromorin (golongan flavanol), calycosin

(golongan isoflavon), 2,4,2,4-tetrahidrokalkon dan likokalkon (golongan kalkon),

kloroporin (golongan stilben) (Chang 2009). Golongan senyawa flavonoid yang

terdapat pada daun sirih merah yaitu golongan flavonoid flavonol, flavanon,

isoflavon dan auron (Arishandy 2010). Senyawa tersebut memiliki kemiripan

struktur dengan substrat L-Tirosin dan L-DOPA sehingga mengarah kepada

inhibitor kompetitif. Selain itu, minyak atsiri juga memiliki potensi penghambat

aktivitas enzim tirosinase. Minyak atsiri yang terkandung dalam daun sirih merah

adalah golongan monoterpen (α-pinen, α-tuyan, sabinen, ß-mirsen, kamfen) dan

golongan seskuiterpen (trans-kariofilen) (Ngaisah 2010). Kadar minyak atsiri

yang terkandung di dalam daun sirih merah sebesar 0.727% (b/v) (Ngaisah 2010).

Senyawa tersebut diharapkan dapat menghambat secara kompetitif aktivitas enzim

tirosnase. Senyawa golongan flavonoid tersebut dapat terekstrak dalam pelarut

etanol 70%, karena sifat flavonoid yang semi polar sehingga dapat tertarik pada

pelarut semi polar (etanol 70%). Senyawa minyak atsiri dapat larut dalam

senyawa yang kepolararannya rendah, yaitu n-heksana.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Dari uji fitokimia, ekstrak etanol mengandung alkaloid, flavonoid, steroid,

saponin dan tanin sedangkan ekstrak n-heksana mengandung tanin dan saponin.

Ekstrak sirih merah berpotensi sebagai antioksidan dan penghambatan tirosinase

dengan nilai penghambatan pembentukan MDA sebesar 52.13% dan nilai

penghambatan tirosinase dengan IC50 1655 ppm untuk ekstrak etanol, sedangkan

untuk ekstrak n-heksana sebesar 40.13% dan tidak berpotensi sebagai penghambat

tirosinase. Ekstrak etanol memiliki kemampuan menghambat pembentukan

malondialdehida dan enzim tirosinase lebih tinggi dibanding ekstrak n-heksana.

Saran

Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui senyawa bioaktif

dari daun sirih merah yang berperan sebagai antioksidan dan inhibitor enzim

tirosinase. Selain itu, perlu dilakukan analisis potensi penghambat enzim

tirosinase daun sirih merah secara in vivo.

DAFTAR PUSTAKA

Agoes G. 2007. Teknologi Bahan Alam. Bandung (ID) : ITB Pr

Alfarabi M. 2010. Kajian antidiabetogenik ekstrak daun sirih merah (Piper

crocatum) in vitro [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

16

Arishandy DNAT. 2010. Isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid dari daun sirih

merah (Piper betle L. var Rubrum) [skripsi]. Malang (ID) : Universitas

Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang

[AOAC] The Association of Official Analytical Chemists. 2006. Official Methods

of Analysis. Ed ke-18. Washington DC (US): Association of Official

Analytical Chemist Publisher.

Batubara I, Darusman LK, Mitsunaga T, Rahminiwati M, Djauhari E. 2010.

Potency of indonesia medicinal plants as tyrosinase inhibitor and

antioxidant agent. J.Biol.Sci. 10:138-144.

[BPOM RI] Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia. 2004.

Ekstrak Tumbuhan Indonsia Vol.2. Jakarta (ID):BPOM.

Chang TS. 2009. An updated review of tyrosinase inhibitor. J Mol Sci. 10:2440-

2475.

Dangles O, Fargeix G, Dufour C. 2000. Antioxidant properties of anthocyanins

and tannins: a mechanistic investigation with catechin and the 3’,4’,7-

trihydroxyflavylium ion. Journal Royal Society of Chemistry. 2:1653-1663.

[Depkes] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2008. Farmakope Herbal

Indonesia Edisi 1. Jakarta (ID) : Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

[Depkes] Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak

Tumbuhan Obat. CetakanPertama. Jakarta : Depkes RI. Hal. 10-11

Fitrie AA. 2004. Histologi dari melanosit.e-USU Repository Universitas Sumatera

Utara 5:16.

Fransiska MA. 2012. Penapisan Inhibitor Tirosinase pada Empat Spesies famili

Asteraceae Chrysantemum morifolium R, Gerbera jamesonil A, Dahlia

rosea Cav dan Tagetes erecta. 1(1) 36-42

Gheldof N, Wang Xiao-Hong, Engeseth NJ. 2002. Identification and

quantification of antioxidant components of honeys from various floral

sources. Journal of Agriculturaland Food Chemistry. 50 : 5870-5877

Guenther E. 1987. Minyak Atsiri. Jilid 1. Jakarta (ID) : UI Press

Hans, W Heldt. 2005. Plant Biochemistry. Elsevier Inc. California.

Harborne. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, penerjemah; Bandung (ID) :

Penerbit ITB

Hartanti L, Setiawan HK. 2009. Inhibitory potential of some synthetic cinnamic

acid derivatives towards tyrosinase enzyme. Indo J Chem. 9:158-168.

Hasanah SNR. 2008. Aktivitas ekstrak etil asetat daun dewandaru (Eugenia

unifloria L.) sebagai agen pengkelat logam Fe dan penangkap

malonaldehida (MDA) [skripsi]. Surakarta (ID) : Fakultas Farmasi

Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Hernani, Rahardjo M. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidasi. Jakarta (ID) :

Penebar Swadaya.

Kang KA, Lee KH, Chae SW, Zhang R, Jung, MS, Lee YK. 2005. Eckol isolated

from Ecklonia cava attenuates oxidative stress induced cell damage in lung

fibroblast cells. FEBS Lett. 579: 6295-6304.

Kartika Y. 2013. Aktivitas antioksidan campuran ekstrak daun sirih merah dan

kulit kayu manis [skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor

Katno, Kusumadewi AP, Sutjipto. 2008. Pengaruh waktu pengeringan terhadap

kadar tanin daun jati belanda (Guazoma ulmifolia Lamk.). The Journal of

Indonesian Medicinal Plant. 1(1) : 38-46

17

Kikuzaki H, Nakatani K. 1993. Antioxidant effect of some ginger constituents. J

Food Sci. 58: 1407-1410.

Kuswardhani DS. 2007. Mempelajari proses pemekatan karotenoid dari minyak

sawit kasar dengan metode fraksinasi bertahap [skripsi]. Bogor (ID) :

Institut Pertanian Bogor.

Marlina PWN. 2008. Konsentrasi flavonoid dan lethal concentration 50 (LC50)

ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) [skripsi]. Bogor (ID) : Institut

Pertanian Bogor.

Martsolich KA. 2007. Potensi antioksidasi ekstrak air dan ekstrak etanol 70 %

daun jati belanda (Guazuma ulmifoliaLamk.) [skripsi]. Bogor (ID):

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian

Bogor.

Miyazawa M. 2007. Inhibitory compound of tyrosinase activity from the sprout of

Polygonium hydropiper L.(Benitade). Biology Pharmaceutical Bulletin.

.30: 595-597.

Murray, Robert K, Granner DK, Mayes, PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia

Harper Edisi 25. Alih Bahasa Andry Hartono. Jakarta : EGC

Ngaisah S. 2010. Identifikasi dan uji aktifitas antibakteri minyak atsiri daun sirih

merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) asal magelang [skripsi]. Surakarta (ID)

: Universitas Sebelas Maret

Nugroho BW, Dadang, Prijono D. 2000. Pengembangan dan Pengembangan

Insektisida Alami. Bogor (ID) : Pusat Kajian Pengendalian Hama Terpadu

IPB.

Pranakusumanagara. 1998. Rahasia dibalik sirih merah dan ritual kecantikan

mojang parahiangan [internet]. [diunduh 2014 Juni 10]. Tersedia pada :

http://www.mojangjajaka. files.wordpress.com

Raharjo S. 2004. Oksidasi Lemak Pada Makanan : Implikasinya Pada Mutu

Makanan dan Kesehatan [skripsi]. Yogyakarta (ID) : Universitas Gadjah

Mada press.

Rudyanto M, Hartanti L. 2008. Sintesis beberapa turunan asam sinamat: pengaruh

gugus yang terikat pada cincin aromatik terhadap kereaktifan benzaldehida.

Indo. J. Chem. 8 (2): 226230

Safithri M, Fahma F. 2005. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum)

sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus putih galur Sprague Dawley.

Laporan penelitian. Bogor: LPPM IPB

Safithri M et al. 2012. Analisis Proksimat dan toksisitas akut ekstrak daun sirih

merah yang berpotensi sebagai antidiabetes. J. Gizi dan Pangan. 7(1) 43-

48.

Safithri M. 2012. Kajian mekanisme antihiperglikemik campuran ekstrak daun

sirih merah dan kulit kayu manis yang berpotensi sebagai minuman

fungsional [disertasi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor.

Salim A. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai

senyawa antihiperglikemia pada tikus galur sparague-dawley. [skripsi].

Bogor (ID) : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut

Pertanian Bogor.

Satria E. 2005. Potensi antioksidan dari daging buah muda dan daging buah tua

mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.). [skripsi]. Bogor

(ID) : Program Studi Biokimia FMIPA IPB.

18

Sufriadi A. 2006. Manfaat daun kayu manis (Cinnamomum burmanni) terhadap

khasiat antioksidasi mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.)

selama penyimpanan. [skripsi]. Bogor (ID) : Program Studi Biokimia

FMIPA IPB.

Suharmiati, Maryani. 2003. Daun dewa dan sambung nyawa. Jakarta : Agromedia

Pustaka

Supriyanti FMT. 2012. Studi inhibisi metanol kulit batang Artocarpus sp dalam

mencegah hiperpigmentasi kulit. Jurnal Pendidikian Kimia FPMIPA UPI

Syamsuni HA. 2006. Ilmu Resep. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Hal166-171

Thiele JJ, Ekanayake-Mudiyanselage S. 2007. Vitamin E in human skin: Organ-

specific physilology and considerations for its use in dermatology. Mol

Aspects Med. 28: 646-667

Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan gizi. PT. Gramedia : Jakarta.

Winarno FG. 1980. Pengantar Teknologi Pangan. Jakarta: Gramedia

Wu JS, Ng LT, Huang YM, Lin DL, Wang SS, Huang S. 2005. Antioxidant

activities of Physalis peruviana. Biol. Pharm. Bull. 28(6) : 963-966.

Zin MZ, Hamid AA, Osman A. 2002. Antioxidative activity of extracts from

mengkudu (Morinda citrifoliaL.) root, fruit, and leaf. Food Chemistry.

78:227-231.

19

LAMPIRAN

20

Lampiran 1 Tahapan umum penelitian

Lampiran 2 Ekstraksi daun sirih merah

Lampiran 3 Pengujian fitokimia

Lampiran 4 Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat

Daun sirih merah

Ekstraksi daun sirih merah dengan

etanol 70% dan n-heksan

Analisis Fitokimia Analisis aktivitas

antioksidan metode

TBA

Analisis inhibitor

tirosinase

30 gram daun sirih merah

ditambahkan etanol 70% untuk

ekstraksi etanol dan n-heksan untuk

ekstrak n-heksan sebanyak 300 mL

Dimaserasi 24

jam suhu ruang Rotavapor

50°C

6 mL asam linoleat dalam etanol 99,8%

6 mL buffer fosfat

3 mL akuades

Campuran dipipet kedalam

botol gelap, diinkubasi 40ºC

Ekstrak etanol 70% dan n-heksan

Alkaloid Flavonoid Tanin Saponin Steroid dan

triterpenoid

21

Lampiran 5 Analisis aktivitas antioksidan dari metode TBA

2 mL buffer fosfat 0,1 M pH 7

20 mL asam linoleat 50 mM

Diinkubasi 8 hari

2 mL TCA 20%

2 mL TBA 1% dalam asam asetat 50%

Diinkubasi 100ºC selama 10

Menit, didinginkan

1 mL diambil setiap 24 jam, ditambahkan

2 mL TCA 20% dan 2 mL TBA 1%

dalam asam asetat 50%

Sampel diinkubasi 100°C selama 10

menit kemudian didinginkan

Disentrifus 3000 rpm

selama 15 menit

Diukur serapannya pada

panjang gelombang 532 nm

1 mL ekstrak etanol dan n-heksan daun sirih merah (25 ppm, 50 ppm,

75 ppm, 100 ppm, 200 ppm), vitamin E 200 ppm dan akuades

Diinkubasi 40ºC

Masing-masing diambil 1 mL

Larutan

Disentrifus 3000 rpm selama 15

menit, diukur panjang gelombang 532

nm

22

Lampiran 6 Kadar air simplisia daun sirih merah Ulangan BobotCawan

Kosong (g)

Bobot

Sampel (g)

Bobot Cawan +

Sampel akhir (g)

Kadar Air

(%)

Rerata

Kadar Air

(%)

1 35.96 2.00 37.80 8.0

2 33.28 2.00 33.13 7.5 7.75 ± 0.35

%Bobot kering (BK) =

x 100%

=

x 100%

= 92% % Kadar air = 100 - %BK

= 100 - 92% = 8%

Lampiran 7 Rendemen simplisia daun sirih merah Jenis sampel Bobot basah (g) Bobot kering (g) %Bobot basah/bobot kering

Daun sirih merah 873.03 187.41 21.47

% rendemen simplisia = Bobot kering (g) x 100 % Bobot basah (g)

= 187.41 x 100% = 21.47 % 873.03

Lampiran 8 Rendemen simplisia ekstrak etanol 70% dan n-heksan sirih merah Ekstrak ulangan Bobot

sampel

(g)

Bobot

terkoreksi

(g)

Bobot ekstrak (g) %Rendemen ekstrak

Etanol 1 30 27.675 4.80 17.344

Etanol 2 30 27.675 5.06 18.284

n-heksan 1 30 27.675 2.29 8.275

n-heksan 2 30 27.675 0.41 1.482

Bobot terkoreksi = (bobot sampel) – (bobot sampel x kadar air) = 30 – (30 x 7.75%) = 30 – 2.325 = 27.675 gram % rendemen = Bobot ekstrak (g) x 100 % Bobot terkoreksi (g)

= 4.80 x 100% = 17.344 % 27.675

Lampiran 9 Grafik hubungan antara konsentrasi inhibitor ekstrak etanol 70%

dan ekstrak n-heksana terhadap persen inhibisi

y = 0.022x + 13.593 R² = 0.9104

-50

0

50

100

0 1000 2000 3000 4000

% in

hib

isi

Konsentrasi (ppm)

inhibisi

Inhibisi

Linear (inhibisi)

Linear (Inhibisi)

23

Lampiran 10 Fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah Golongan

senyawa

Hasil ekstrak Keterangan Gambar

Etanol n-heksana

70% Etanol n-heksana

70%

Flavonoid + - endapan hijau

Alkaloid + - Meyer : putih

Dragendroff : merah

Wagner : coklat

Saponin + + Gelembung

Tanin + - Hijau kehitaman

Steroid dan + + Endapan hijau

Triterpenoid

Ket : (+) mengandung senyawa; (-) tidak mengandung senyawa

Lampiran 11 Hasil absorban kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP)

[TMP] (µM) A1 A2 Rerata ± SD 0 0 0 0

0.5 0.05 0.044 0.05 ± 0.000

1 0.098 0.083 0.09 ± 0.000

2 0.196 0.177 0.19 ± 0.012

4 0.369 0.343 0.36 ± 0.000

5 0.457 0.394 0.43 ± 0.008

6 0.522 0.498 0.51 ± 0.001

8 0.722 0.673 0.70 ± 0.002

24

Lampiran 12 Kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP)

Lampiran 13 Absorban inkubasi kadar MDA (µM) terhadap waktu (λ = 532 nm) Hari A1 A2 A3 [MDA]1 [MDA]2 [MDA]3 Rerata ± SD

0 0.130 0.133 0.122 -3.758 -3.667 -4.000 -3.808 ± 0.172

1 0.220 0.226 0.210 -1.030 -0.848 -1,333 -1.070 ± 0.245

2 0.307 0.309 0.323 1.606 1,667 2.091 1.788 ± 0.264

3 0.405 0.411 0.418 4.576 4.758 4.970 4.768 ± 0.197

4 0.569 0.573 0.577 9.545 9.667 9.788 9.667 ± 0.122

5 0.625 0.633 0.620 11.242 11.485 11.091 11.273 ± 0.199

6 0.844 0.853 0.839 17.879 18.152 17.727 17.919 ± 0.215

7 0.510 0.515 0.521 7.758 7.909 8.091 7.919 ± 0.167

8 0.430 0.444 0.410 5.333 5.758 4.727 5.273 ± 0.518

9 0.305 0.311 0.310 1.545 1.727 1.697 1.656 ± 0.098

(Yayuk 2013)

Kadar MDA hari ke-0 (A1) y = 0.254 + 0.033x 0.130 = 0.254 + 0.033x x = -3.758

Lampiran 14 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana

daun sirih merah metode TBA (λ = 532 nm) Ekstrak Konsentrasi (ppm) [%Inhibisi]1 [%inhibisi]2 Daya hambat (%)

K (-) 0.000 0.000 0.00 ± 0.00c

Vit E (200) 18.62 27.85 36.42 ± 5.01ab

25 10.80 29.11 19.95 ± 12.95bc

Etanol 70% 50 37.61 13.55 25.58 ± 13.55b

100 40.92 34.72 37.82 ± 4.38ab

200 45.52 58.73 52.13 ± 9.34a

K (-) 0.000 0.000 0.00 ± 0.00c

Vit E (200) 32.950 27.832 36.42 ± 5.01a

n-heksana 25 20.901 32.247 26.65 ± 8.09ab

50 2.391 51.447 30.86 ± 10.65ab

100 18.739 16.015 17.47 ± 1.95b

200 43.941 36.265 40.13 ± 5.34a

Daya hambat (%) K(+) =

x 100%

=

x 100% = 27.832%

y = 0.086x + 0.0065 R² = 0.9988

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 5 10 Ab

sorb

ansi

(5

32

nm

)

Konsentrasi 1,1,3,3 tetrametoksipropana (µM)

absorbansi

Linear (absorbansi)

25

Lampiran 15 Analisis perhitungan IC50 difenolase ekstrak etanol 70% dan

ekstrak n-heksana daun sirih merah Ekstrak Konsentrasi A1 A2 Rata-rata % Inhibisi IC50

Absorbansi (ppm)

Etanol 70% K (-) 0.873 0.912 0.892 -

Asam kojat (200) 0.074 0.072 0.073 91.816%a

20 0.830 0.857 0.843 5.493%g

200 0.776 0.781 0.778 12.780%f

800 0.487 0.492 0.489 45.179%e 1655

1600 0.406 0.432 0.419 53.027%d

2400 0.260 0.285 0.272 69.507%c

3200 0.208 0.213 0.210 76.457%b

n-Heksana K (-) 0.873 0.912 0.892 -

Asam kojat (200) 0.074 0.072 0.073 91.816 %a

20 0.923 0.937 0.930 - 4.260 %g

200 0.856 0.906 0.881 1.233 %f

800 0.813 0.860 0.836 6.278 %e 3090.5

1600 0.692 0.761 0.726 18.609%d

2400 0.531 0.540 0.535 40.022%c

3200 0.412 0.404 0.408 54.260%b

Persamaan Garis

y = 0.022 x + 13.59, R2 = 0.910 (ekstrak etanol)

y = 0.018 x – 5.630, R2 = 0.918 (ekstrak n-heksana)

% Inhibisi =

× 100 %

=

× 100 %

= 91.816%

Lampiran 16 Analisis statistika terhadap penghambatan MDA

26

Lampiran 17 Analisis statistika terhadap penghambatan enzim tirosinase

27

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Cirebon pada tanggal 26November 1992 dari pasangan

Bapak Iwan Gunawan dan Ibu Eli.Penulis merupakan anak pertama dari dua

bersaudara.Riwayat pendidikan penulis dimulai dari SD Kartika III/5/6 Cirebon

tahun 1998-2004, melanjutkan pendidikan ke SMPN 5 Cirebon tahun 2004-2007,

dan menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMAN 2 Cirebontahun

2010.Pada tahun yang sama, penulis meneruskan pendidikan di Departemen

Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB melalui jalur

SNMPTN undangan.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis mengikuti organisasi kampus

sebagai anggota divisi biro foundrising CREBs (Community of Research and

Education in Biochemistry) tahun 2012-2014.Penulispernah mengikuti berbagai

kepanitiaan seperti Lomba Karya Ilmiah Populer (LKIP) tahun2013, Seminar

Kesehatan tahun 2012,Masa Pengenalan Departemen tahun 2013, dan

Biochemistry Champion League tahun 2013. Penulis juga pernah menjadi asisten

praktikum Biokimia Umum, Pengantar Penelitian Biokimia dan Struktur dan

Fungsi Subselular pada tahun ajaran 2013/2014. Pada tahun 2013, penulis

melaksanakan praktik lapangan di Laboratorium Pengujian, Balai Besar Penelitian

dan Pengembangan Pascapanen Bogor dengan judul Pembuatan dan Pengujian

Sifat Fisiko-Kimia Kitosan dari Limbah Kulit Udang.