LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

Asta Špadienė

ŽALIOSIOS ARBATOS IR DVISKIAUČIŲ

GINKMEDŽIŲ LAPŲ SAUSŲJŲ EKSTRAKTŲ

ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO IR

POVEIKIO 2 TIPO CUKRINIU DIABETU

SERGANTIEMS PACIENTAMS TYRIMAS

Daktaro disertacija

Biomedicinos mokslai,

farmacija (08)

Kaunas, 2015

Disertacija rengta 2010–2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete

Medicinos akademijoje

Mokslinė vadovė

Prof. dr. Nijolė Savickienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B)

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos

akademijos Farmacijos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

Prof. dr. Jurga Bernatonienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,

Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B)

Narės:

Dr. Narseta Mickuvienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medi-

cinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Prof. dr. Sonata Trumbeckaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas,

Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B)

Prof. dr. Ona Ragažinskienė (Vytauto Didžiojo universitetas, biomedi-

cinos mokslai, farmacija – 08B)

Prof. dr. Maija Dambrova (Latvijos organinės sintezės institutas, biome-

dicinos mokslai, farmacija – 08B)

Disertacija ginama viešame Farmacijos mokslo krypties tarybos posėdyje

2015 m. balandžio 20 d. 13 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto

Farmacijos fakulteto A-203 auditorijoje.

Adresas: Eivenių g. 4, LT-50009 Kaunas, Lietuva.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES

MEDICAL ACADEMY

Asta Špadienė

RESEARCH OF ANTIOXIDANT

ACTIVITY OF DRY EXTRACTS OF GREEN

TEA AND GINKGO BILOBA LEAVES,

AND THEIR EFFECT ON PATIENTS

WITH TYPE 2 DIABETES MELLITUS

Doctoral Dissertation

Biomedical Sciences,

Pharmacy (08)

Kaunas, 2015

Dissertation has been prepared at the Medical Academy of Lithuanian

University of Health Sciences during the period of 2011-2015.

Scientific Supervisor

Prof. Dr. Nijolė Savickienė (Lithuanian University of Health Sciences,

Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B)

Dissertation is defended at the Pharmacy Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:

Chairperson

Prof. Dr. Jurga Bernatonienė (Lithuanian University of Health Sciences,

Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B)

Members: Dr. Narseta Mickuvienė (Lithuanian University of Health Sciences,

Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė (Lithuanian University of Health

Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B)

Prof. Dr. Ona Ragažinskienė (Vytautas Magnus University, Biomedical

Sciences, Pharmacy – 08B)

Prof. Dr. Maija Dambrova (Latvian Institute of Organic Synthesis,

Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B)

Dissertation will be defended at the open session of the Pharmacy

Research Council of Lithuanian University of Health Sciences at 13:00 p.

m. on 20 th of April, 2015, in the Auditorium A-203 of Lithuanian

University of Health Sciences.

Address: Eiveniu str. 4, LT-50009 Kaunas, Lithuania.

5

TURINYS

SANTRUMPOS ............................................................................................. 7

ĮVADAS......................................................................................................... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ................................................................ 13

1.1.Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų cheminė sudėtis

bei farmakologinis poveikis ..................................................................... 13

1.1.1. Žaliosios arbatos cheminė sudėtis ir antioksidacinių savybių

tyrimai .................................................................................................. 13

1.1.2. Žaliosios arbatos preparatų vartojimas medicinos praktikoje

ir farmakologinio poveikio tyrimai ...................................................... 14

1.1.3. Dviskiaučių ginkmedžių lapų cheminė sudėtis ir

antioksidacinių savybių tyrimai ........................................................... 16

1.1.4. Dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų vartojimas

medicinos praktikoje ir farmakologinio poveikio tyrimai ................... 18

1.2. Oksidacinio streso ypatumai ir jo nustatymas in vivo ....................... 19

1.2.1. Aktyvios deguonies formos ir jų susidarymas ........................... 19

1.2.2. Ląstelių antioksidacinės apsaugos sistema ................................ 21

1.2.3. Pusiausvyros tarp aktyvių deguonies formų kiekio ir

antioksidacinės apsaugos sistemos sutrikimas, oksidacinio streso

rodikliai ................................................................................................ 24

1.3. Antro tipo cukrinio diabeto sukelti pažeidimai ir ryšys su

oksidaciniu stresu ..................................................................................... 27

1.4. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio cukriniam diabetui tyrimai ........................................ 30

2. TYRIMŲ OBJEKTAI IR METODAI ..................................................... 33

2.1. Tyrimų objektai, tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga .................... 33

2.2. Tyrimų metodai ir metodikos ............................................................ 37

2.2.1. Reagentai ir medžiagos .............................................................. 37

2.2.2. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų

antiradikalinio aktyvumo įvertinimo metodika .................................... 37

2.2.3. Oksidacinio streso rodiklių nustatymo kraujo plazmoje

metodika ............................................................................................... 39

2.2.4. Bendrieji tyrimai bei diabetinės inkstų pažaidos įvertinimo

metodika ............................................................................................... 40

2.2.5. Diabetinės akių pažaidos įvertinimo metodika .......................... 40

6

2.2.6. Diabetinės nervinio audinio pažaidos įvertinimo metodika ....... 40

2.3. Statistinis duomenų vertinimas ......................................................... 41

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...................................... 42

3.1. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ...................................... 42

3.1.1. Sausojo žaliosios arbatos ekstrakto katechinų

antioksidacinio aktyvumo nustatymas ................................................. 42

3.1.2. Sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto flavonoidų

antioksidacinio aktyvumo nustatymas ................................................. 43

3.2. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio diabetinei akių, nervinio audinio ir inkstų pažaidai

įvertinimas ................................................................................................ 44

3.2.1. Bendras tiriamųjų įvertinimas .................................................... 44

3.2.2. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio diabetinei inkstų pažaidai įvertinimas ................... 51

3.2.3. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio diabetinei akių pažaidai įvertinimas ...................... 55

3.2.4. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio diabetinei nervinio audinio pažaidai įvertinimas ... 57

3.3. Oksidacinio streso rodiklių įvertinimas pacientų, sergančių 2 tipo

cukriniu diabetu, kraujo plazmoje ............................................................ 61

3.4. Prognozuojamos žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių

lapų sausųjų ekstraktų įtakos oksidacinio streso rodiklių kitimui bei

akių, nervinio audinio ir inkstų pažaidai įvertinimas ............................... 65

3.5. Rezultatų apibendrinimas .................................................................. 67

IŠVADOS .................................................................................................... 71

LITERATŪRA ............................................................................................. 73

DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ........ 83

PRIEDAI ...................................................................................................... 87

SUMMARY ............................................................................................... 116

GYVENIMO APRAŠYMAS ..................................................................... 132

PADĖKA .................................................................................................... 133

7

SANTRUMPOS

ADP – adenozino difosfatas (angl. adenosine diphosphate)

ALT – alanino aminotransferazė (angl. alanine aminotransferase)

AST – asparagino aminotransferazė (angl. asparagine

aminotransferase)

ATP – adenozino trifosfatas (angl. adenosine triphosphate)

AV – absorbcijos vienetai

BJKMPI – bendras junginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių

indeksas (angl. Total Conjunctival Index (TCI))

C – katechinas (angl. catechin)

CAT – katalazė (angl. Catalase)

CD – cukrinis diabetas (lot. Diabetes Mellitus)

DNR – deoksiribonukleorūgštis

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (angl. 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl)

EC – epikatechinas (angl. epicatechin)

ECG – epikatechino galatas (angl. epicatecin gallate)

ECS – sausasis žaliosios arbatos ekstraktas (angl. Dry green tea

extract)

EGB – sausasis dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktas (angl. Dry

Ginkgo biloba leaves extract)

EGC – epigalokatechinas (angl. epigallocatechin)

EGCG – epigalokatechino galatas (angl. epigallocatechin gallate)

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. High Performance

Liquid Chromatography)

GGT – γ glutamiltransferazė (angl. γ glutamyl transferase)

GPx – glutationo peroksidazė (angl. Glutathione peroxidase)

4-HNE – 4-hidroksinonenalis (angl. 4-Hydroxynonenal)

HbA1c – glikuotas hemoglobinas

IPI – intravaskulinių pokyčių indeksas

KMI – kūno masės indeksas (angl. Body mass index)

KPI – kraujagyslinių pokyčių indeksas

LOOH – lipidų hidroperoksidai (angl. Lipid hydroperoxide)

MDA – malondialdehidas (angl. Malondialdehyde)

NADP – nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas (angl.

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)

NADPH – redukuotas NADP

PPI – perivaskulinių pokyčių indeksas

SOD – superoksido dismutazė (angl. Superoxide dismutase)

8

TAS – bendra antioksidacinė raiška (angl. Total Antioxidant Status)

TEAC – troloksui ekvivalentiška antioksidacinė geba (angl. Trolox

Equivalent Antioxidant Capacity)

VJS – vibracinio jutimo slenkstis (angl. Vibration sensation threshold

(VST))

9

ĮVADAS

Vaistiniai augalai ir augaliniai preparatai dėka jų sudėtyje esančių biolo-

giškai aktyvių junginių plačiai naudojami įvairių ligų gydymui bei profi-

laktikai. Per pastarąjį dešimtmetį labai išaugo susidomėjimas vaistiniais

augalais bei jų biologinio poveikio tyrimais. Ypatingas dėmesys skiriamas

vaistiniams augalams, pasižymintiems antioksidacinėmis savybėmis. Auga-

liniai antioksidantai neleidžia susidaryti laisviesiems radikalams, juos slo-

pina arba dalyvauja laisvųjų radikalų suardymo procese. Fenoliniai junginiai

yra pagrindinė junginių grupė augaluose, kurie lemia antioksidacinį akty-

vumą [1]. Todėl fenolinių junginių, kaip augalinių antioksidantų, paieška, jų

identifikavimas bei poveikio in vivo nustatymas yra perspektyvi tyrimų

sritis.

Dviskiautis ginkmedis (Ginkgo biloba L.) ir žalioji arbata (gaminama iš

kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L.) lapų) vartojami medicinos prak-

tikoje. Dažniausiai gydymo ir profilaktikos tikslais vartojami šių augalų

lapų sausieji ekstraktai. Šių augalų ekstraktų pritaikymą medicinoje lemia į

jų sudėtį įeinančios veikliosios medžiagos: flavonoidai ir terpenoidai, esan-

tys dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakte bei katechinai – žaliosios arbatos

ekstrakte. Dėl sudėtinio biologiškai aktyvių junginių veikimo ekstraktai yra

veiksmingesni nei tam tikri jų cheminiai komponentai. Šie ekstrakai pasi-

žymi antioksidacinėmis savybėmis, todėl gali būti vartojami mažinti orga-

nizmo patiriamą oksidacinį stresą.

Nustatyta, kad oksidacinis stresas turį neigiamą poveikį daugeliui patolo-

giškų būklių ir sutrikimų [2]. Vienas iš tokių sutrikimų, kurio patogenezei

turi didelę įtaką oksidacinis stresas, yra cukrinis diabetas. Tarptautinės cuk-

rinio diabeto federacijos duomenimis pasaulyje šiuo metu maždaug 382

milijonai žmonių serga cukriniu diabetu. Prognozuojama, kad šis skaičius

iki 2035 m. gali padidėti iki 592 milijonų [3]. Pagal 2013 m. statistinius

duomenis – Lietuvoje cukriniu diabetu serga apie 111 tūkst. žmonių ir dar

maždaug 39 tūkst. žmonių diabetas nediagnozuotas [3]. Sergant cukriniu

diabetu, ilgainiui mažėja organizmo atsparumas, pažeidžiama vis daugiau

audinių ir organų. Nevaldomas cukrinis diabetas lemia komplikacijų atsira-

dimą, todėl padidėja gydymo išlaidos, prastėja tokių ligonių gyvenimo

kokybė. Tarptautinės cukrinio diabeto federacijos duomenimis su cukriniu

diabetu susijusios medicininės metų išlaidos, tenkančios vienam žmogui

Lietuvoje, siekia 1142 USD (apie 840 EUR) [3]. Šias išlaidas galima suma-

žinti, daugiau dėmesio skiriant diabetinių pažeidimų profilaktikai. Viena iš

galimų priemonių yra augaliniai antioksidantai, kurie mažina organizmo

patiriamą oksidacinį stresą.

10

Atlikti moksliniai tyrimai, įrodantys antioksidacines žaliosios arbatos ir

dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų ekstraktų savybes. Tačiau nėra nusta-

tyta, ar minėti ekstraktai gali slopinti oksidacinio streso sukeliamus pažeidi-

mus cukriniu diabetu sergantiems pacientams ir tokiu būdu sulėtinti diabeti-

nių akių, nervinio audinio ir inkstų pažeidimų progresavimą.

Darbo tikslas – įvertinti žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų

sausųjų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą bei poveikį diabetiniams inkstų,

akių ir nervinio audinio pažeidimams.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti sausojo žaliosios arbatos ekstrakto biologiškai aktyvių junginių

(katechino, epikatechino, epigalokatechino, epikatechino galato ir epiga-

lokatechino galato) antioksidacinį aktyvumą, naudojant pokolonėlinį

efektyviosios skysčių chromatografijos metodą.

2. Nustatyti sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto biologiškai

aktyvių junginių (kvercetino, kemferolio ir izoramnetino) antioksidacinį

aktyvumą, naudojant pokolonėlinį efektyviosios skysčių chromatogra-

fijos metodą.

3. Įvertinti sausojo žaliosios arbatos ekstrakto poveikį inkstų, akių bei ner-

vinio audinio pažaidai pacientams, sergantiems 2 tipo cukriniu diabetu,

praėjus 9 ir 18 mėnesių nuo preparato vartojimo pradžios bei palyginti su

placebo poveikiu.

4. Įvertinti sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto poveikį inkstų,

akių bei nervinio audinio pažaidai pacientams, sergantiems 2 tipo cukri-

niu diabetu, praėjus 9 ir 18 mėnesių nuo preparato vartojimo pradžios bei

palyginti su placebo poveikiu.

5. Įvertinti sausojo žaliosios arbatos ekstrakto poveikį oksidacinio streso ro-

diklių (TAS, antioksidacinių fermentų (SOD, CAT, GPx), lipidų peroksi-

dacijos rodiklių (LOOH, MDA, 4-HNE) ir vitamino E) kitimui pacientų,

sergančių 2 tipo cukriniu diabetu, kraujo plazmoje, praėjus 9 ir 18 mėne-

sių nuo preparato vartojimo pradžios bei palyginti su placebo poveikiu.

6. Įvertinti sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto poveikį oksida-

cinio streso rodiklių (TAS, antioksidacinių fermentų (SOD, CAT, GPx),

lipidų peroksidacijos rodiklių (LOOH, MDA, 4-HNE) ir vitamino E) kiti-

mui pacientų, sergančių 2 tipo cukriniu diabetu, kraujo plazmoje, praėjus

9 ir 18 mėnesių nuo preparato vartojimo pradžios bei palyginti su placebo

poveikiu.

11

Mokslinio darbo naujumas

Europos valstybėse (taip pat ir kitose pasaulio šalyse) nebuvo vykdyti

tokios plačios apimties moksliniai tyrimai, nustatantys augalinių antioksi-

dantų (žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų ekstraktų)

poveikį 2 tipo cukrinio diabeto inkstų, akių ir nervinio audinio pakitimų

raidai. Nustatytas žaliosios arbatos sausojo ekstrakto ir dviskiaučių ginkme-

džių lapų sausojo ekstrakto biologiškai aktyvių junginių, lemiančių ekstrak-

tų antioksidacines savybes, antiradikalinis aktyvumas. Pokolonėliniu ESC-

DPPH metodu pirmą kartą nustatytas dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto

flavonoidų (kvercetino ir kemferolio) laisvųjų radikalų surišimo gebos vyra-

vimas prieš kitus šio ekstrakto junginius, taip pat žaliosios arbatos sausojo

ekstrakto katechinų frakcijos laisvųjų radikalų surišimo gebos vyravimas

prieš kitus ekstrakto junginius.

Įvertintas minėtų ekstraktų poveikis cukrinio diabeto sukeltiems smulkių-

jų kraujagyslių pažeidimams – akių tinklainės, inkstų glomerulų, kojų dista-

liosios srities kapiliarų bei arteriolių pažeidimams. Pirmą kartą įvertintas

antioksidacinis šių ekstraktų, vartojamų ilgą laiką (18 mėnesių), poveikis.

Taip pat nustatytas ekstraktų, vartojamų pagal gamintojų rekomendacijas –

du ir tris kartus per dieną (žaliosios arbato sausąjį ekstraktą – vartojant po

400 mg ir po 600 mg per dieną, dviskiaučių ginkmedžių lapų sausąjį

ekstraktą – po 160 mg ir po 320 mg per dieną), poveikis.

Praktinė ir teorinė reikšmė

Antiradikalinio aktyvumo tyrimų metu nustatyti žaliosios arbatos sausojo

ekstrakto ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto biologiškai akty-

vūs junginiai, pasižymintys stipriausiomis antioksidacinėmis savybėmis.

Gauti antioksidacinio aktyvumo tyrimų rezultatai yra vertingi žaliosios arba-

tos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų kokybės vertinimui. Kiekybiš-

kai vertinant žaliosios arbatos sausąjį ekstraktą ar jo preparatus, rekomen-

duojama vertinti ir vyraujančio katechino – epigalokatechino galato – kiekį

ar antioksidacinį aktyvumą (šiuo metu kiekybiškai vertinama tik pagal ben-

drą polifenolių kiekį).

Įvertinti oksidacinio streso rodikliai (bendra antioksidacinė raiška, anti-

oksidacinių fermentų aktyvumas, lipidų peroksidacijos rodiklių ir vitamino

E kiekiai) pacientų, sergančių 2 tipo cukriniu diabetu, kraujo plazmoje po 9

ir 18 mėnesių preparatų vartojimo. Nustatytas reikšmingas sausojo dviskiau-

čių ginkmedžių lapų ekstrakto poveikis lipidų peroksidacijos procesų slopi-

nimui. Gauti duomenys apie šių augalinių ekstraktų poveikį oksidacinio

streso rodiklių kitimui gali būti panaudoti plečiant jų vartojimo galimybes

oksidacinio streso sukeltų ligų profilaktikoje. Tyrimo rezultatai svarbūs

12

pacientams, kuriems ligos pradžioje diagnozuotas 2 tipo cukrinis diabetas,

turintiems neišplitusias arba dar neprasidėjusias diabetines komplikacijas.

Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausuosius ekstraktus

rekomenduojama vartoti kaip priemonę, mažinančią organizmo patiriamą

oksidacinį stresą ir tokiu būdu atitolinančią diabetinių inkstų, akių bei

nervinio audinio pažeidimų atsiradimą.

Darbo rezultatų aprobavimas

Tyrimų rezultatai pristatyti 11 mokslinių konferencijų: Tarptautinė Far-

macijos mokslų ir praktikos konferencija, skirta 225-sioms farmacijos studi-

jų Lietuvoje metinėms paminėti (2010 m. spalio 15–17 d, Kaunas.); IV

nacionalinė doktorantų mokslinė konferencija „Mokslas – sveikatai“

(2011 m. balandžio 7 d., Kaunas); Tarpautinė neuromokslų konferencija,

skirta neurochirurgijos 60 metų jubiliejui Lietuvoje ir Neuromokslų instituto

įsteigimui paminėti (2011 m. birželio 16–17 d., Kaunas); Septintoji tarptau-

tinė mokslinė konferencija „Donozologija – 2011. Sveika gyvensena ir

kenksmingi sveikatai faktoriai“ (2011 m. gruodžio 15–16 d., Sankt Peter-

burgas, Rusija); 6-oji Tarptautinė mokslinė konferencija „The Vital nature

sign“ (2012 m. birželio 1–4 d., Kaunas); 6-asis pasaulinis kongresas „Polife-

nolių pritaikomumas, klinikiniai tyrimai“ (2012 m. birželio 7–6 d., Paryžius,

Prancūzija); Tarptautinė farmacijos mokslų konferencija „Farmacinės che-

mijos ir kitų mokslų pasiekimai ir vystymo perspektyvos“ (2012 m. lapkri-

čio 24 d., Kaunas); 4-oji tarptautinė farmacijos mokslų konferencija, skirta

paminėti 75-ąsias Lietuvos farmakopėjos išleidimo metines (2013 m. lapkri-

čio 23 d., Kaunas); 7-oji Tarptautinė konferencija „Diabetas ir nutukimas

2013. Strategijos, sprendimai ir iššūkiai“ (2013 m. spalio 24–25 d., Ryga,

Latvija); Konferencija Deuel, skirta lipidų tyrimams (2014 m. kovo 4–7 d.,

Kalifornija, JAV); 8-oji Tarptautinė mokslinė konferencija „The Vital

nature sign“ (2014 m. gegužės 15–17 d., Kaunas).

Tyrimų tematika paskelbtos 4 mokslinės publikacijos.

Darbo apimtis ir struktūra: disertaciją sudaro įvadas, literatūros apž-

valga, tyrimo objektai ir metodai, rezultatai ir jų aptarimas, rezultatų apiben-

drinimas, išvados, literatūros sąrašas (146 šaltiniai), disertacijos tema pa-

skelbtų publikacijų sąrašas, priedai, mokslinių publikacijų disertacijos tema

kopijos, santrauka, gyvenimo aprašymas. Darbe pateikta 9 lentelės, 17 pa-

veikslų. Disertacijos apimtis 133 puslapiai.

13

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų cheminė

sudėtis bei farmakologinis poveikis

1.1.1. Žaliosios arbatos cheminė sudėtis ir antioksidacinių savybių

tyrimai

Žalioji arbata – tai yra nefermentuoti, džiovinti kininio arbatmedžio

(Camellia sinensis L.) lapai. Žaliosios arbatos lapuose dominuoja polifeno-

liniai junginiai, iš kurių svarbiausi yra flavonoidai katechinai. Skystuose ir

sausuose žaliosios arbatos ekstraktuose polifenoliniai junginiai sudaro 45–

90 % [4]. 50,0–75,0 % visų katechinų sudaro epigalokatechino galatas

(EGCG), kiti katechinai (epikatechinas (EC), epigalokatechinas (EGC), epi-

katechino galatas (ECG)) nustatomi mažesniais kiekiais [5, 6] (1.1.1.1 pav.).

1.1.1.1.pav. Pagrindinių žaliosios arbatos lapuose esančių junginių –

katechinų struktūra.

Žaliosios arbatos lapuose taip pat randami flavonoliai (kvercetinas, kem-

ferolis, mircetinas ir jų glikozidai), fenolinės rūgštys (galo rūgštis, chloro-

geno rūgštis, kumarilchino rūgštis, teogalinas), proantocianidinai, purino da-

riniai (kofeinas, teofilinas), polisacharidai, nepakeičiamosios amino rūgštys

(teaninas, leucinas, fenilalaninas, valinas, treoninas), vitaminai (B2, E ir C),

mineralai (kalis, kalcis, magnis, manganas, aliuminis, cinkas, natris, fosfo-

ras, fluoras, varis) [4, 5, 7].

Nustatyta, kad žaliosios arbatos lapų antioksidacines savybes lemia poli-

fenoliai [6, 8]. Antioksidacinės katechinų savybės priklauso nuo aromatinių

žiedų ir hidroksigrupių padėties. Didžiausią įtaką antioksidaciniam aktyvu-

mui turi C žiedo 3-padėties trihidroksigalato grupė (galo rūgšties esteriams

14

būdingos stipriausios antioksidacinės savybės) [9, 10]. Antioksidacines sa-

vybes sustiprina B žiedo 5‘-padėties papildoma –OH grupė (epigalokatechi-

nas turi stipresnių antioksidacinių savybių, palyginti su epikatechinu) [9,

10]. Trys hidroksigrupės B žiede padidina flavonoidų radikalų stabilumą

(1.1.1.1. pav.) [11]. Žaliosios arbatos lapų katechinų hidroksigrupės perduo-

da vandenilio atomą aktyviam radikalui ir tokiu būdu nutraukia grandinines

oksidacijos reakcijas [12].

Žaliosios arbatos lapų polifenoliai gali tiesiogiai slopinti aktyvias deguo-

nies formas ir surišti sunkiųjų metalų jonus [6, 12] bei netiesiogiai skatinti

antioksidacinių fermentų (superoksido dismutazės (SOD), katalazės (CAT))

gamybą [4], glutation S-transferazės aktyvumą kepenyse [8] ir tokiu būdu

pašalina ksenobiotikų bei sunkiųjų metalų jonų kenksmingumą, skatinančių

oksidacinių radikalų susidarymą. Nustatyta, kad vartojant žaliosios arbatos

ekstraktą (3 mėn. po 379 mg per dieną), reikšmingai padidėja bendra anti-

oksidacinė raiška (TAS) [13]. Be oksidacinio-redukcinio potencialo ir anti-

oksidacinio aktyvumo, žaliosios arbatos lapų polifenoliai gali surišti akty-

vias anglies formas, pvz., glioksalį, metilglioksalį ir deoksiglukozoną, kurie

lengvai modifikuoja baltymų lizino, arginino ir cisteino liekanas, todėl susi-

daro galutiniai glikozilinimo produktai. Antiradikalinį poveikį lemia kate-

chinų A žiedas [6], o antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo B žiedo greti-

mų dihidroksi- ir trihidroksigrupių [6, 14].

1.1.2. Žaliosios arbatos preparatų vartojimas medicinos praktikoje ir

farmakologinio poveikio tyrimai

Žalioji arbata neturi vartojimo tradicijų Lietuvos liaudies medicinoje.

Indijos ir Kinijos liaudies medicinoje žalioji arbata vartojama kaip centrinės

nervų sistemos stimuliatorius, diuretikas, sutraukiamasis vaistas (stabdantis

kraujavimą ir gerinantis žaizdų gyjimą), kaip širdies darbą gerinanti priemo-

nė. Kiti tradiciniai žaliosios arbatos taikymo būdai – mažina pilvo pūtimą ir

dujų kaupimąsi, reguliuoja temperatūrą bei cukraus kiekį, skatina virškini-

mą, gerina protinę veiklą [15, 16].

Nustatyta, kad žalioji arbata ir iš jos pagaminti preparatai bei išskirti bio-

logiškai aktyvūs junginiai saugo nuo vėžio [4, 5, 6], uždegimo [14], turi ati-

oksidacinį [6, 8, 14], antivirusinį, antibakterinį, neuroprotekcinį [14], antiar-

tritinį poveikį [17], angiogenezę slopinantį aktyvumą, mažina cholesterolio

kiekį [4, 5, 14] bei turi teigiamą poveikį širdies ir kraujagyslių ligų profilak-

tikai [14, 17]. Teigiamas žaliosios arbatos poveikis priklauso nuo polifeno-

linių junginių, ypač katechinų [8].

15

Katechinai mažina trigliceridų ir cholesterolio kiekį kraujyje, saugo nuo

aterosklerozės, stiprina ląstelių membranas, reguliuoja jų pralaidumą [14,

18], mažina padidėjusį cukraus kiekį kraujyje [5, 19], veikia kaip atnioksi-

dantai [5, 20]. Teigiamas žaliosios arbatos ekstrakto poveikis širdies ir krau-

jagyslių sistemai taip pat grindžiamas katechinų antioksidacinėmis savybė-

mis. Širdies ir kraujagyslių sutrikimų atveju oksidacinis stresas ir aktyvios

deguonies formos sukelia endotelio pažeidimus bei aterosklerozės sunkė-

jimą [21]. Endotelio funkcijos sutrikimas skatina širdies ir kraujagyslių ligų,

pvz., krūtinės anginos, miokardo infarkto, insulto atsiradimą. Nustatyta, kad

katechinai apsaugo nuo endotelio funkcijos sutrikimo [22], hipertenzijos,

širdies hipertrofijos, širdies ląstelių pažeidimo [18, 23]. Kraujagyslių užde-

gimas turi didelę įtaką aterosklerozinių pažeidimų progresavimui. Katechi-

nai saugo nuo uždegimo, mažina leukocitų judėjimą (migraciją) ir adheziją

prie endotelio, slopina transkripcijos faktoriaus NF-kB, lemiančio citokinų

ir adhezijos molekulių gamybą, aktyvumą [23]. Katechinai mažina krauja-

gyslių lygiųjų raumenų ląstelių proliferaciją, slopina kraujagyslių ląstelių

augimo faktorių, dalyvaujantį aterogenezėje [23], mažina trombocitų sukibi-

mą, tokiu būdu slopina trombogenezę [21]. Manoma, kad žaliosios arbatos

ekstraktas mažina kraujospūdį dėl poveikio endotelio azoto oksido sintazės

ir NO gamybai, todėl padidėja NO bioprieinamumas. Tokiu būdu gerėja en-

dotelio funkcija – plečiasi kraujagyslės [18].

Katechinai saugo nuo uždegimo, slopina arachidono rūgšties metabolitų

(prostaglandinų ir leikotrienų) gamybą [17]. Žaliosios arbatos katechinams

taip pat būdingas ir antihistamininis poveikis. Histamino išsiskyrimas iš put-

liųjų ląstelių susijęs su uždegimu, dermatitu, dilgėline ir alergine astma [14].

Tyrimuose su graužikais nustatyta, kad žaliosios arbatos katechinai, atsi-

žvelgiant į dozę, mažina histamino išsiskyrimą iš putliųjų ląstelių [24, 25].

Žaliosios arbatos ekstrakto polifenoliai, ypač EGCG, turi antibakterinių

savybių nuo daugumos gramneigiamųjų (pvz., Salmonella, Helicobacter

pylori, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio) ir gramteigia-

mųjų (pvz., Staphylococcus aureus, S.mutans, S. epidermidis) mikroorganiz-

mų [14, 26, 27, 28] bei gali turėti teigiamą poveikį virusinėms infekcijoms

[29].

Žalioji arbata gali pagerinti neurologines ir psichologines funkcijas. Ka-

techinai geba pereiti pro hematoencefalinį barjerą, neutralizuoti laisvuosius

radikalus bei apsaugoti lipidus nuo peroksidinimo, todėl atlieka neuropro-

tekcinę funkciją [14, 30]. Neuronus saugantis katechinų poveikis grindžia-

mas jų geba slopinti oksidacinio streso paveiktų mažo tankio lipoproteinų

susidarymą ir tokiu būdu užkirsti kelią smegenų aterosklerozei [30]. Žalioji

arbata gali turėti įtaką mineralų pusiausvyrai organizme, ypač nutukusiems

16

žmonėms. Žalioji arbata didina cinko ir magnio kiekį, tačiau gali sustiprinti

geležies stoką, kuri būdinga nutukusiems žmonėms. Polifenoliai suriša gele-

žies jonus, Fe mažiau absorbuojama, todėl sumažėja geležies koncentracija

organizme [13, 31, 32].

1.1.3. Dviskiaučių ginkmedžių lapų cheminė sudėtis ir

antioksidacinių savybių tyrimai

Dviskiaučių ginkmedžių lapų biologiškai aktyvūs junginiai priklauso

flavonoidams ir terpenoidams [33] (1.1.3.1 pav.).

1.1.3.1 pav. Pagrindinių dviskiaučio ginkmedžio lapuose esančių junginių:

flavonoidų (A) ir terpenoidų (B) struktūra.

Dviskiaučių ginkmedžių lapų augalinėje žaliavoje ir iš jų pagamintame

kiekybiškai įvertintame sausajame ekstrakte vyrauja flavonoidai 0,5–2 %

(lapuose), 20,0–27,0 % (ekstrakte), iš kurių svarbiausi – flavonoliai: kverce-

tinas, kemferolis ir izoramnetinas bei jų glikozidai ir esteriai su kumaro

rūgštimi, taip pat biflavonoidai (bilobetinas, ginketinas, amentoflavonas) ir

proantocianidinai. Terpenoidai sudaro 0,02–0,2 % (lapuose), 5,0–7,0 %

(ekstrakte), iš jų daugiausia diterpenoidai: ginkolidai A, B, C, J ir M – 2,6–

3,2 % (ekstrakte) ir seskviterpenoido (bilobalido) – 0,02–0,06 % (lapuose),

2,6–3,2 % (ekstrakte). Taip pat yra organinių rūgščių (ekstrakte apie 5,0–

10,0 %) (vanilino, p-hidroksibenzeno, protokatechino, acto, askorbo, kinure-

no), angliavandenių, lektinų, sterolių, karotinoidų [34, 35, 36]. Labai mažai

nustatoma azoto turinčių junginių: 6-hidroksikinureno rūgšties ir 4-metil-

piridoksino (gingotoksino) – 0,02 % (lapuose) ir 0,3 % (ekstrakte). Ginko-

toksino daugiau nustatoma sėklose, o lapuose ir ekstraktuose yra tik pėdsa-

17

kai (1,7 % lapuose). Ginkolinės rūgštys, sukeliančios alergines reakcijas,

turi toksinių savybių, dažniausiai pašalinamos iš ekstraktų gamybos metu.

Kiekybiškai įvertintuose dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose jų turi

būti ne daugiau kaip 5 ppm (5 mg/kg), t. y. ne daugiau kaip 0,0005 % [36].

Toks jų kiekis nėra pavojingas. Pagal Europos farmakopėjos reikalavimus

sausajame dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakte turi būti: flavonoidų 22–

27 %, terpenoidų: bilobalido 2,6–3,2 %, ir ginkolidų A, B ir C suma 2,8–

3,4 %, ginkolinių rūgščių – mažiau nei 5 ppm [37].

Nustatyta, kad antioksidacinį dviskiaučių ginkmedžių preparatų aktyvu-

mą lemia jų sudėtyje esantys flavonoidai [34, 38]. Biologinis flavonoidų

poveikis priklauso nuo sąveikos su baltymais. Flavonoidų ir baltymų kom-

plekso susidarymui turi įtakos erdvinė flavonoidų struktūra ir elektrostatinės

sąveikos tarp baltymo ir flavonoido [38, 39]. Didžiausią elektroneigiamą

krūvį turi hidroksilinti 5 ir 7 atomai A žiede, hidroksilintas 3 atomas C žie-

de, taip pat bet kuris hidroksilintas atomas B žiede (1.1.3.1 pav.). Tokia

stuktūra būdinga flavonoidams, katechinams ir antocianidinams. Su šiais

hidroksilintais atomais gali sąveikauti metalų katijonai. Hidroksilinti atomai

gali atiduoti elektroną, taip pat jungtis (vandeniliniais ryšiais) su baltymais

[38]. Dviguba jungtis tarp 2 ir 3 anglies atomų bei 4-karbonilo grupė C žie-

de (1.1.3.1 pav (A)) yra atsakingos už elektronų pasiskirstymą B žiede,

lemiantį didesnį antioksidacinį aktyvumą (B žiedo hidroksigrupės pasidaro

elektroneigiamesnės ir gali atiduoti elektroną reakcijose su laisvaisiais

radikalais) [11].

Dviskiaučių ginkmedžių lapų flavonoidai ne tik tiesiogiai inaktyvina

aktyvias deguonies formas, taip pat gali stabilizuoti ląstelės oksidacijos-

redukcijos būklę, veikdami baltymus ir aktyvindami antioksidacinius fer-

mentus. Dviskiaučių ginkmedžių lapai (vartojant po 1500 mg per dieną

1 mėn.) padidina bendrą antioksidacinį aktyvumą (TAS) kraujo serume [40].

Nustatyta, kad vandeninis sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto

(turinčio 24 % flavono glikozidų ir 6 % terpeno laktonų) tirpalas (25–400

µg/ml) neutralizuoja O2•–

ir HO•, suriša pereinamosios grupės metalų jonus

in vitro [41, 42], didina antioksidacinių fermentų (SOD, CAT) aktyvumą

žiurkėms (vartojant esktraktą 3 mėn. po 50–100 mg/kg) [39, 42]. Taip pat

teigiamai veikia glutationo reduktazės, t. y. fermento, būtino redukuoto

glutationo redukcijai ir sintezei, aktyvumą [39]. Dviskiaučių ginkmedžių

lapų ekstraktas (vartojant po 540 mg ekstrakto (turinčio 11,3 mg flavono

glikozidų, 2,9 mg bilobalido, 1,3 mg ginkolido A ir 0,8 mg ginkolido B) per

dieną 1 mėn.) dvigubai padidina redukuoto glutationo kiekį kepenyse, page-

rina mikrocirkuliaciją bei organizmo gebėjimą kovoti su laisvaisiais radika-

lais [43]. Flavonoidai saugo ląstelės membranos lipidus nuo peroksidacijos

18

ypač dėl jų gebos sąveikauti su peroksidų radikalais bei jų nesuporuotais

elektronais ir įsiskverbti į gilesnius lipidų sluoksnius [41]. Nustatyta, kad

kvercetinas ardo laisvuosius radikalus, mažina fermentų (ksantino oksida-

zės, lipidų peroksidazės), skatinančių O2•–

radikalų susidarymą, aktyvumą,

tiesiogiai slopina mažo tankio cholesterolio oksidaciją [44], saugo vitami-

ną E nuo oksidacijos [38].

Duomenys apie antioksidacinį terpenoidų aktyvumą, priešingai negu fla-

vonoidų, gan prieštaringi. Manoma, kad bilobalidas bei ginkolidai B, C ir J

gali neutralizuoti O2•–

, tačiau nustatyta, kad ginkolidui A pritrūksta aktyvu-

mo neutralizuoti superoksido radikalą. Ginkolidas B turi apsauginį poveikį

mitochondrijoms, jų funkcijai. Tokiu būdu sumažina aktyvių deguonies

formų gamybą ląstelėje [39]. Teigiama, kad terpenoidai gali sustiprinti anti-

oksidacinį flavonoidų veikimą [41].

1.1.4. Dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų vartojimas medicinos

praktikoje ir farmakologinio poveikio tyrimai

Kinų medicinoje dviskiaučių ginkmedžių lapai ir sėklos buvo vartojami

plaučių, širdies, odos ligoms, šlapimo nelaikymo sutrikimams gydyti, krau-

jotakai gerinti. Nuo 1965 metų dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatai

Willmaro Schwabe‘o buvo pradėti taikyti šiuolaikinėje medicinoje, o 1975

metais užregistruotas kiekybiškai įvertintas sausasis dviskiaučių ginkmedžių

lapų ekstraktas (EGb 761) [45]. Nuo to laiko atlikta daugybė tyrimų, sie-

kiant įvertinti dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto poveikį kraujotakai,

periferinės ir centrinės nervų sistemos laidumui, astmai, susilpnėjusiai at-

minčiai. Šiuo metu kiekybiškai įvertintas sausasis dviskiaučių ginkmedžių

lapų ekstraktas (turintis 24 % flavono glikozidų ir 6 % terpeno laktonų) yra

vienas iš geriausiai ištirtų ir plačiausiai vartojamų vaistinių augalinių prepa-

ratų, esančių daugiau nei 80 šalių rinkoje. Pagrindinės ištirtos veikliosios

medžiagos, lemiančios dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų farmakolo-

ginį poveikį, yra flavonoidai ir terpenoidai. Toliau apžvelgti tyrimai parodė,

kad farmakologinis sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto poveikis

pasireiškia, vartojant šį ekstraktą po 120–240 mg, graužikų modeliuose – po

50–100 mg/kg per dieną 1–3 mėn.

Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto sudėtyje esantys flavonoidai turi

stiprių antioksidacinių [38, 39, 46, 47], antibakterinių [48], antialerginių,

saugančių nuo uždegimo (dėl poveikio į arachidono rūgšties apykaitos pro-

cesą) [49, 50], antivirusinių savybių, didina katecholaminų kiekį [33, 34,

51], mažina kapiliarų trapumą, normalizuoja kraujagyslių pralaidumą. Šios

medžiagos vartojamos, gydant venų nepakankamumą, parestezijas, edemas,

19

glaukomą [33, 36]. Kvercetinas saugo nuo uždegimo, mažina uždegimą

sukeliančių fermentų (ciklooksigenazės ir lipoksigenazės) bei uždegimo me-

diatorių (leikotrienų ir prostaglandinų) kiekį [39], turi neuroprotekcinį po-

veikį, palaiko bendrą neuronų kiekį [52]. Kemferolis yra stiprus atnioksi-

dantas, padedantis saugoti ląstelių lipidus ir DNR nuo oksidacinių pažeidi-

mų, reikšmingas aterosklerozės profilaktikai, nes slopina mažo tankio lipo-

proteinų oksidaciją ir trombocitų agregaciją [38, 53]. Nustatyta, kad kemfe-

rolis slopina monocitus prijungiantį baltymą, kuris svarbus pradiniam atero-

sklerozės plokštelių susidarymo etapui. [54].

Terpenoidams ginkolidams būdingas neuroprotekcinis ir antioksidacinis

aktyvumas, poveikis gliukokortikoidų sintezės reguliavimui [34, 51]. Jie

veikia kaip trombocitus aktyvinančio faktoriaus antagonistai. Ginkolidų

antiuždegiminis veikimas taip pat yra susijęs su trombocitus aktyvinančio

faktoriaus antagonistiniu aktyvumu [39, 55]. Terpenoidai slopina trombocitų

agregaciją, didina eritrocitų atsparumą (ang. erythrocyte flexibility), mažina

kraujo klampumą, todėl pagerėja mikrocirkuliacija [54, 56]. Bilobalido dari-

niai vartojami neuropatijai, encelfalopatijai, edemai, pažinimo funkcijoms

gydyti, taip pat cukrinio diabeto sukeltiems kraujotakos sutrikimams gydyti

[34, 51].

Sausasis dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktas gerina atmintį ir moky-

mąsi [55]; lengvina sutrikusios pusiausvyros kompensavimo mechanizmus,

gerina kraujotaką [43], ypač giliosiose, vidutinėse ir smulkiosiose krauja-

gyslėse (mikrocirkuliacijos srityje) [55], bet nedidina kraujavimo rizikos

[57]; gerina reologinius kraujo parametrus [58]. Dviskiaučių ginkmedžių

lapų sausajam ekstraktui būdingos neuroprotekcinės, antialerginės, antioksi-

dacinės savybės, antagonistiškai veikia trombocitų agregaciją aktyvinantį

faktorių [33, 36, 55]. Nustatyta, kad sausasis dviskiaučių ginkmedžių lapų

ekstraktas dėl antioksidacinių savybių, teigiamai veikia širdies ir kepenų

ląstelių mitochondrijų fukciją [59, 60].

1.2. Oksidacinio streso ypatumai ir jo nustatymas in vivo

1.2.1. Aktyvios deguonies formos ir jų susidarymas

Aktyvios deguonies formos tai yra laisvieji radikalai (hidroksiradikalas

(HO•), superoksido radikalas (O2

•–), azoto oksido radikalas (NO

•), lipidų

peroksidų radikalai (LOO•)), turintys nesuporuotą elektroną, ir neradikalai

(vandenilio peroksidas (H2O2), singletinis molekulinis deguonis (1O2), hipo-

chlorito rūgštis (HOCl), ozonas (O3)), kurie organizme greitai paverčiami

radikalais [61]. Aktyvių deguonies formų susidarymą skatina tiek vidiniai

20

(mitochondrijų kvėpavimas, fagocitozė, uždegimas, išemija / reperfuzija,

fiziniai pratimai), tiek išoriniai (ultravioletinė spinduliuotė, jonizuojančioji

spinduliuotė, vaistai, aplinkos užterštumas, rūkymas) veiksniai [61, 62, 63].

Vidiniai veiksniai yra svarbesni, nes lemia nuolatinį aktyvių deguonies for-

mų, kurios fiziologinėmis sąlygomis yra būtinos ląstelės funkcijonavimui, susidarymą. Tačiau išorinių veiksnių sukelta aktyvių deguonies formų

gamyba labiau siejama su žalingu jų poveikiu [64].

Žmogaus organizme aktyvios deguonies formos susidaro nuolat, veikiant

fermentams arba nefermentiniu būdu [65]. Pagrindiniai fermentai, katalizuo-

jantys aktyvių deguonies formų susidarymą ląstelėse, yra oksidazės (pvz.,

NADPH oksidazė, ksantinoksidazė, esančios fagocitinių (pvz., neutrofilų,

makrofagų) ir endotelio ląstelių sienelėse), oksigenazės bei mitochondrijų

kvėpavimo grandinės fermentai [61, 65, 66, 67]. Žinoma daug įvairių anti-

oksidacinių apsaugos sistemų, tačiau daugumoje ląstelių mitochondrijos yra

vienos iš pagrindinių O2•–

gamybos šaltinių [68]. Pats O2•–

nėra stiprus oksi-

datorius, tačiau jis skatina grandinines oksidacijos reakcijas, kurių metu

susidaro kitos aktyvios deguonies formos [65, 68]. Superoksido radikalas

sukelia grandinines lipidų peroksidacijos reakcijas, kurių metu susidarę lipi-

dų peroksidai ir hidroperoksidai pradeda naują peroksidacijos reakcijų gran-

dinę [61]. Be to, O2•–

gali reaguoti su kitais radikalais, pavyzdžiui, su azoto

oksidu (NO•), ir sudaryti peroksinitritą (ONOO

–), kuris taip pat yra stiprus

oksidatorius [65]. NO•

susidaro iš L-arginino, katalizuojant NO sintazei.

Azoto oksidas yra silpnas reduktorius, labai greitai reaguojantis su O2•–

ir

sudarantis peroksinitritą. Ši reakcija vyksta tris kartus greičiau nei O2•–

savaiminis skilimas, susidarant H2O2, ir netgi greičiau nei NO• reakcija su

hemo baltymais (oksihemoglobinu), kurios metu neutralizuojamas NO• [69].

Nefermentiniu būdu aktyvios deguonies formos (O2•–

) susidaro, jei vie-

nas elektronas yra tiesiogiai perduodamas deguoniui iš redukuotų kofermen-

tų, prostetinių grupių (pvz.: flavinų, ubichinonų, geležies ir sieros grupių)

arba ksenobiotikų (pvz.: herbicido parakvato, vaisto nuo vėžio adriamicino),

kurie prieš tai buvo redukuojami tam tikrų fermentų [65, 67]. Tačiau vienas

iš pagrindinių nefermentinių būdų susidaryti aktyvioms deguonies formoms

yra Fentono (angl. Fenton) reakcija. Tai pagrindinis HO• šaltinis in vivo.

Fentono reakcija (1b) yra svarbi Haberio-Veiso (angl. Haber-Weiss) reakci-

jos (1a,b) dalis. Jos metu O2•–

oksiduoti pereinamosios grupės (kintamojo

valentingumo) metalai (Fe, Cu ir kt.) katalizuoja HO• susidarymą iš H2O2

[69, 70]. Hidroksiradikalas (HO•) yra vienas iš stipriausių gamtoje esančių

oksidatorių [65].

𝑂2•− + 𝐹𝑒3+(𝐶𝑢2+) → 𝐹𝑒2+(𝐶𝑢+) + 𝑂2 (1a)

21

𝐻2𝑂2+𝐹𝑒2+(𝐶𝑢+) → 𝐹𝑒3+(𝐶𝑢2+) + 𝐻𝑂• + 𝑂𝐻− (1b)

Aktyvios deguonies formos yra tarpinės deguonies redukcijos junginiai.

Jos gali susidaryti ląstelėje mitochondrijų kvėpavimo grandinės reakcijų

metu, padidėjus fermentų (oksidazių arba oksigenazių) aktyvumui. Šių jun-

ginių gamybą skatina ir oksiduoti pereinamosios grupės (kintamojo valen-

tingumo) metalai (Fe, Cu ir kt.). Aktyvių deguonies formų susidarymą ska-

tina kai kurios ligos, uždegiminiai procesai bei išoriniai veiksniai, pavyz-

džiui, rūkymas, aplinkos užterštumas, ultravioletinė spinduliuotė, jonizuo-

jančioji spinduliuotė, oksiduotas maistas, vaistai ir kt.

1.2.2. Ląstelių antioksidacinės apsaugos sistema

Evoliucijos metu dėl didelio aktyvių deguonies formų toksiškumo žin-

duolių ląstelėse susidarė antioksidacinė ląstelės apsaugos sistema, kuri

neutralizuoja laisvuosius radikalus vos tik jie pasigamina. Sveiko žmogaus

organizme aktyvios deguonies formos yra greitai sunaikinamos. Antioksida-

cinę ląstelės apsaugos sistemą sudaro: antioksidaciniai fermentai (SOD,

CAT, GPx); mažos molekulinės masės junginiai (antioksidantai), prijun-

giantys laisvuosius radikalus: hidrofilinės (glutationas, askorbo rūgštis) ir

lipofilinės (vitaminai A ir E, flavonoidai, ubichinonas) organinės medžia-

gos, turinčios redukcinių savybių; ir pereinamosios grupės metalų jonus

surišantys baltymai (feritinas, transferinas) [62]. Pagrindiniai ląstelės anti-

oksidacinės sistemos komponentai pateikiami 1.2.2.1 paveiksle.

Fiziologinėmis sąlygomis aktyvias deguonies formas neutralizuoja anti-

oksidaciniai fermentai, kurie veikia skirtingose ląstelės organelėse ir tarpląs-

teliniame užpilde. Superoksido dismutazė (SOD) yra žmogaus ląstelių mito-

chondrijose ir citozolyje. Šis fermentas vadinamas ,,pirmąja gynybos linija”

[69]. SOD katalizuoja O2•–

skilimą iki H2O2. H2O2 veikiant katalazei (CAT)

ir glutationo peroksidazei (GPx), toliau greitai redukuojamas iki vandens

[71, 72]. CAT yra peroksisomose, šiek tiek mažiau citoplazmoje. Taip pat

šio fermento randama ir širdies mitochondrijose. CAT katalizuoja H2O2

skaidymo į H2O ir O2 reakciją [65, 68]. CAT daug mažiau, palyginti su SOD

ar GPx, giminingos su H2O2 ir veikia tik peroksisomose [73]. Tačiau GPx –

pagrindinė peroksidazė, skaldanti tam tikrų rūšių peroksidus. GPx yra

kiekvienoje žmogaus organizmo ląstelėje. Šis fermentas turi keturias seleno-

cisteino aminorūgšties liekanas (vietoj –SH grupės yra –SeH), t. y. Svar-

biausias žmogaus fermentas, kurio veikimui būtinas selenas [74]. GPx svar-

bus, mažinant aktyvių deguonies formų kiekį, kad ląstelė išvengtų pažeidi-

mo ir galėtų pati sukelti atsaką į stresą [73].

22

1.2.2.1 pav. Supaprastinta pagrindinių ląstelės antioksidacinės sistemos komponentų schema [62]. GSH-redukuotas glutationas.

23

H2O2, kuris susidaro, veikiant peroksisomų fermentams, yra ardomas

CAT,o H2O2, susidarantis mitochondrijose ir endoplazminiame tinkle, dau-

giausia ardomas GPx. GPx taip pat skaido lipidų peroksidus [70]. Šis fer-

mentas naudoja redukuotą glutationą kaip elektronų donorą. Todėl GPx

aktyvumas priklauso ir nuo redukuoto glutationo koncentracijos, t. y., nuo

glutationo reduktazės – fermento, palaikančio ląstelėse nekintamą redukuoto

glutationo kiekį, gebančio atkurti glutationą iš oksiduotos jo formos. Šiai

pusiausvyrai yra svarbus ir NADPH/NADP+ santykis [69, 75]. Aktyvių

deguonies formų neutralizavimui būtini ir pagalbiniai fermentai, pvz., gluta-

redoksinas, tioredoksinas ir peroksiredoksinas [68, 71].

Be antioksidacinių fermentų ląstelėje, kaip antioksidantai, veikia ir

mažos molekulinės masės junginiai [76]. Tai dažniausiai yra fenoliniai jun-

giniai, prijungiantys laisvuosius radikalus. Šie antioksidantai gali būti tirpūs

vandenyje (veikiantys tarpląsteliniuose skysčiuose) arba tirpūs riebaluose

(veikiantys membranose) [75, 77]. Tokoferolis (Vitaminas E) yra svarbus

membraninis aktyvių deguonies formų surišėjas. Jis prijungia laisvųjų

radikalų elektronus ir veiksmingai stabdo grandinines lipidų peroksidacijos

reakcijas. Apsauginių reakcijų metu oksiduotą tokoferolį redukuoja ir atku-

ria askorbo rūgštis, o askorbo rūgštį – redukuotas glutationas [69, 75]. Kaip

membraniniai antioksidantai svarbūs ir karotinoidai, kurie dalyvauja nutrau-

kiant lipidų peroksidaciją. Antioksidacinį karotinoidų aktyvumą lemia į jų

struktūrą įeinančios ilgos konjuguotų dvigubų jungčių grandinės. Tokia

struktūra leidžia surišti daugumą aktyvių deguonies formų, net ir HO• bei

O2•–

[63, 69]. Ubichinonas, arba kofermentas Q10, sintetinamas ląstelėje ir

būtinas elektronus perduodant mitochondrijose. Jis neutralizuoja laisvuosius

radikalus ir stabdo lipidų peroksidaciją [69], o oksiduotas ubichinonas vėl

regeneruojamas kvėpavimo grandinėje [71]. L-askorbo rūgštis yra pagrindi-

nis tarpląstelinis antioksidantas. Ji labai greitai oksiduojasi iki monodehidro-

askorbo arba dehidroaskorbo rūgšties ir tokiu būdu veiksmingai neutralizuo-

ja aktyvias deguonies formas [69, 70]. Vienas stipriausių ir vertingiausių

endogeninių antioksidantų yra redukuotas glutationas, kuris gali tiesiogiai

reaguoti su aktyviomis deguonies formomis, atiduoti vandenilio atomą, ir

taip jas neutralizuotis. Taip pat jis veikia kaip elektronų donoras GPx katali-

zuojamose reakcijose, kurių metų neutralizuojamas H2O2, bei redukuoja

kitus oksiduotus ląstelės antioksidantus, pvz., tokoferolį ir askorbo rūgštį

[63, 69, 70].

Pereinamosios grupės metalų jonus surišantys baltymai (metalotioneinai,

feritinas, transferinas ir kt.) sujungia Fentono reakciją katalizuojančius

pereinamosios (kintamojo valentingumo) grupės metalų jonus ir taip stabdo

laisvųjų radikalų susidarymą [70, 78]. Feritinas yra pagrindinis tarpląstelinis

24

baltymas (geležies saugykla), kuris izoliuoja laisvos geležies perteklių [79].

Į metalotioneinų sudėtį įeina cisteino liekanos – merkaptogrupės, todėl jie

geba surišti pereinamosios grupės metalus, tokiu būdu dalyvauja pagrindinių

mikroelementų (Cu, Se, ypač Zn) apykaitoje, taip pat pašalina sunkiųjų

metalų (Cd, Hg, Ag, As) kenksmingumą, sujungia juos į chelatus [70].

Sveiko žmogaus organizme laisvųjų radiklų perteklių neutralizuoja anti-

oksidaciniai fermentai (SOD, CAT, GPx); mažos molekulinės masės jungi-

niai, prijungiantys laisvuosius radikalus: hidrofilinės (glutationas, askorbo

rūgštis) ir lipofilinės (vitaminai A ir E, flavonoidai, ubichinonas) organinės

medžiagos, turinčios redukcinių savybių; ir pereinamosios grupės metalų

jonus surišantys baltymai (feritinas, transferinas).

1.2.3. Pusiausvyros tarp aktyvių deguonies formų kiekio ir

antioksidacinės apsaugos sistemos sutrikimas, oksidacinio streso

rodikliai

Fiziologinėmis sąlygomis aktyvios deguonies formos yra būtinos sveikos

ląstelės funkcionavimui [73, 80, 81]. Nepalankios ląstelės aplinkos sąlygos

sukelia nevaldomą aktyvių deguonies formų daugėjimą. Antioksidacinei ląs-

telės apsaugos sistemai nepajėgiant kovoti su aktyviomis deguonies formo-

mis, laisvųjų radikalų sukeltos grandininės reakcijos sutrikdo fiziologinių

funkcijų veiklą. Pusiausvyros tarp aktyvių deguonies formų kiekio ir anti-

oksidacinės apsaugos sistemos sutrikimas vadinamas oksidaciniu stresu

[65]. Biologinėse sistemose oksidacinis stresas atsiranda, padaugėjus lais-

vųjų radikalų, sumažėjus mažos molekulinės masės antioksidantų, sutrikus

ląstelės oksidacijos-redukcijos (redokso) pusiausvyrai arba dėl ląstelės kom-

ponentų (baltymų, lipidų ir / ar DNR) oksidacinių pokyčių [69].

Laisvųjų radikalų perteklius sukelia lipidų ir baltymų peroksidaciją bei

DNR pokyčius. Lipidų peroksidacija paveikia daugumą ląstelės kompo-

nentų, tačiau pirmiausia pažeidžiamos membranoje esančios polinesočiosios

riebalų rūgštys. Membranos riebalų rūgščių ir cholesterolio peroksidacija

pakeičia ląstelės membranos takumo ir pralaidumo savybes, gali sukelti pla-

čiai išplitusius membranos pažeidimus. Susidarę lipidų peroksidai ir hidro-

peroksidai toliau skatina lipidų ir baltymų peroksidaciją [2, 82]. Aktyvios

deguonies formos gali tiesiogiai atakuoti DNR ir taip sukelti struktūrinius

DNR pokyčius (pvz., DNR grandinės plyšius, azotinių bazių porų mutacijas,

persigrupavimą, DNR fragmentų pašalinimą, įterpimą ir DNR sekų ampli-

kaciją, DNR spiralinės struktūros suirimą) [68, 83]. Iš kitos pusės, oksidaci-

niai DNR pokyčiai gali būti sukelti netiesiogiai, padidėjus tarpląstelinių

Ca2+

jonų kiekiui. Skylant DNR bazėms, susidaro 8-okso-7,8-dihidroguani-

25

nas, hidroksimetilkarbamidas, karbamidas, timino glikolis; timino ir adenino

acikliniai ir sotieji produktai [83]. Vėlesnėmis oksidacinio streso stadijomis,

išsekus audinių ir organų antioksidacinei sistemai, inaktyvinami ir denatū-

ruojami baltymai. Jautriausi oksidacijai yra baltymai (kai kurie fermentai ir

membraniniai jonų nešikliai), į kurių sudėtį įeina sieros turinčios aminorūgš-

tys (pvz., metioninas ir cisteinas) [2, 68, 82]. Oksidacinis stresas gali sukelti

audinių sužalojimus ar net ląstelių mirtį, kuri iš esmės gali būti nulemta

nekrozės arba apoptozės.

Nevaldomas oksidacinis stresas gali nulemti daug patologiškų būklių ir

sutrikimų (1.2.3.1 pav.).

1.2.3.1 pav. Oksidacinio streso poveikis organizmui.

LOPL – lėtinė obstrukcinė plaučių liga, OKS – obsesinis kompulsinis sutrikimas,

DTHS – dėmesio trūkumo ir hiperaktyvumo sutrikimas, SKSS – suaugusiųjų

kvėpavimo sutrikimo sindromas [2].

Širdies ir kraujagyslių sistemos ligos, vėžys, neurodegeneracinės ligos,

senėjimas, uždegiminiai sutrikimai yra susiję su padidėjusia aktyvių deguo-

nies formų gamyba. Oksidacinis stresas turi didelę įtaką cukrinio diabeto ir

jo komplikacijų patogenezei. Šių ligų metu stebimi fiziologiniai ląstelės

oksidacijos-redukcijos sistemos pokyčiai [71, 73].

26

1.2.3.2 pav. Aktyvių deguonies formų nustatymas naudojant

skirtingus rodiklius. Tiesioginiu būdu aktyvių deguonies formų kiekis nustatomas naudojant

fluorescencinius zondus arba paramagnetinį elektronų rezonansą; netiesioginiu būdu –

matuojant bendrą antioksidacinį aktyvumą, oksidacinės pažaidos produktų kiekį arba

mažos molekulinės masės antioksidantų ir / ar antioksidacinių fermentų kiekį bei aktyvumą.

FRAP – geležies jonų redukcijos antioksidacinė galia, GSH – redukuotas glutationas,

GSSG – oksiduotas glutationas, ORAC – deguonies radikalų absorbcijos geba,

TRAP – antioksidanto sugaudytų radikalų suminis matas,

8-okso-Gua – 8-okso-7,8-dihidroguaninas,

8-okso-dG – 8-okso-7,8-dihidro-2-deoksiguanozinas[62].

27

Organizme aktyvios deguonies formos turi labai trumpą gyvavimo

pusperiodį. Yra sudėtinga tiesiogiai pamatuoti jų kiekį. Todėl matuojami

oksidacinio streso rodikliai: redukuoti ląstelės tioliniai junginiai (redukuoto

glutationo kiekis arba redukuoto/oksiduoto glutationo koncentracijų santy-

kis), kofermentai (metaboliniai antioksidantai, vitaminai – atnioksidantai);

antioksidacinių fermentų kiekis ir aktyvumas; aktyvių deguonies formų

pažaidų produktai (lipidų peroksidacijos rodikliai (LOOH, MDA, 4-HNE),

DNR skilimo produktai (timino glikolis, 8-okso-Gua – 8-okso-7,8-dihidro-

guaninas, 8-okso-dG – 8-okso-7,8-dihidro-2-deoksiguanozinas), baltymų

karbonilgrupių kiekis); azoto oksido kiekis audiniuose ir jį sintetinančių

fermentų aktyvumas [62, 69]. Oksidacinio streso rodikliai, naudojami akty-

vioms deguonies formoms nustatyti, pateikiami 1.2.3.2 pav.

1.3. Antro tipo cukrinio diabeto sukelti pažeidimai

ir ryšys su oksidaciniu stresu

Tarptautinės cukrinio diabeto federacijos duomenimis, 2013 m. maždaug

382 milijonai gyventojų sirgo cukriniu diabetu. Prognozuojama, kad iki

2035 m. šis skaičius gali padidėti iki 592 milijonų. 2013 m. Lietuvoje cukri-

niu diabetu sirgo 4,9 % visų gyventojų (20–79 metų amžiaus) [3]. Cukrinis

diabetas – sudėtinis metabolinis sutrikimas, kurio metu sumažėja gliukozės

panaudojimas arba padidėja jos gamyba [84]. Kad ląstelės galėtų pasisavinti

gliukozę, reikalingas insulinas, kurį gamina kasos Langerhanso salelių β ląs-

telės. Insulinas dalyvauja angliavandenių, riebalų ir baltymų apykaitoje, yra

vienintelis hormonas, mažinantis gliukozės koncentraciją kraujyje [61]. Su-

trikus insulino gamybai, gliukozės kraujyje yra daug, tačiau ji negali patekti

į ląsteles. Dėl gliukozės stokos ląstelėse sutrinka riebalų, baltymų bei van-

dens ir elektrolitų apykaita, ląstelės miršta [85]. Padidėjęs gliukozės kiekis

kraujyje (hiperglikemija) neigiamai veikia audinius ir organus [85].

2 tipo cukrinis diabetas, kitaip dar vadinamas nuo insulino nepriklau-

somu cukriniu diabetu, dažniausiai sukeliamas per mažos insulino sekrecijos

ir / ar organizmo audinių atsparumo (rezistentiškumo) insulinui [84]. Daž-

niausiai 2 tipo CD suserga vyresnio amžiaus žmonės, ypač turintys antsvo-

rio. Visame pasaulyje 2 tipo CD yra labiausiai paplitusi diabeto forma, kuri

sudaro maždaug 90 % visų CD sergančių žmonių [86]. Cukrinio diabeto

poveikis apima ilgalaikes pažaidas, tam tikrų organų funkcijos sutrikimus ar

netekimą. Ši pasaulinė pandemija susijusi su pailgėjusia gyvenimo trukme,

nutukimu, netaisyklinga mityba, gyvensenos būdu, fizinio aktyvumo stoka ir

didėjančia urbanizacija.

28

Nevaldomas CD lemia komplikacijų atsiradimą, todėl padidėja gydymo

išlaidos ir prastėja tokių ligonių gyvenimo kokybė. Cukriniam diabetui bū-

dingos savitosios komplikacijos: mikroangiopatija – išplitęs (generalizuotas)

degeneracinis smulkiųjų kraujagyslių (arteriolių, kapiliarų) pažeidimas.

Labiausiai pažeidžiami inkstų glomerulų (nefropatija), akių tinklainės (reti-

nopatija), kojų distaliosios srities (periferinė angiopatija) kapiliarai ir arte-

riolės, skersaruožių raumenų, odos, placentos ir nervų kamienų (neuropatija)

smulkiosios kraujagyslės. Cukriniam diabetui būdinga ir makroangiopatija –

pažeistos širdies vainikinės, galvos smegenų, kojų ir kitų organų kraujagys-

lės, sunkėja aterosklerozė [87, 88, 89]. Daugiau nei 25 % pacientų, sergan-

čių 2 tipo CD, diabetinės komplikacijos nustatomos jau pirmą kartą diagno-

zavus CD [90]. Išsivysčiusiose šalyse cukrinis diabetas yra viena iš pagrin-

dinių mirties bei širdies ir kraujagyslių, apakimo, inkstų pažeidimų, kojų

amputacijos priežasčių [89].

Padidėjęs gliukozės kiekis ir oksidacinis stresas turi lemiamą įtaką CD ir

jo komplikacijų patogenezei. Per pastarąjį dešimtmetį buvo atlikta daug tyri-

mų, siekiant įrodyti neatsiejamą ryšį tarp oksidacinio streso ir CD [91, 92,

93, 94, 95]. Gliukozės ir riebalų perteklius sutrikdo medžiagų apykaitą [96],

kartu padidėja laisvųjų radikalų gamyba. Hiperglikemija tiek savaime, tiek

per sukeltą oksidacinį stresą mažina insulino sintezę ir išsiskyrimą, o tai

lemia CD pablogėjimą [97]. Hiperglikemija sukelia oksidacinio streso atsi-

radimą keliais būdais: intensyvina gliukozės autooksidaciją [63, 91, 96]

galutinių glikozilinimo produktų (angl. Advanced glycation end-products)

susidarymą, gliukozės apykaitą, veikiant aldozės reduktazei (poliolio kelias)

[93, 98], heksaminazei (heksozamino kelias) ar dalyvaujant proteinkinazei C

(diacilglicerolio kelias) bei aktyvina branduolio transkripcijos faktorių κb

[2, 93]. Visi šie mechanizmai intensyvėja, kai mitochondrijose padidėja ak-

tyvių deguonies formų susidarymas. Ląstelinės hiperglikemijos padarinys –

cukriniu diabetu sergančių pacientų smulkiųjų kraujagyslių pažeidimai.

Tačiau stambiųjų kraujagyslių ir širdies sutrikimus, susijusius su padidėjusia

riebalų rūgščių oksidacija, iš dalies skatina savitasis atsparumo (rezistentiš-

kumo) insulinui mechanizmas [95]. Sergant CD, stipriai padidėja baltymų

glikozilinimas. Galutinių glikozilinimo produktų (pvz., 2-(2-furoil)-4(5)-

furanil-1H-imidazolas, imidazolonas, N-ε-karboksi-metil-lizinas, N-ε-kar-

boksi-etil-lizinas, glioksal-lizino dimeras, metil-glioksal-lizino dimeras ir

kt.) kaupimasis skatina mikrokraujagyslinių pokyčių, būdingų diabetinei

retinopatijai, taip pat atsakingų už širdies ir kraujagyslių komplikacijas, atsi-

radimą [63, 99]. Kiti veiksniai, pvz., laisvosios riebalų rūgštys ir leptinai (jų

kiekis cukriniu diabetu sergantiems pacientams yra padidėjęs), taip pat suke-

lia aktyvių deguonies formų susidarymą [91]. Didesnis riebalų rūgščių kie-

29

kis skatina periferinį atsparumą insulinui ir riebalų kaupimąsi neriebali-

niuose audiniuose, pvz., kepenyse, kasoje, širdyje. Tai gali sukelti šių orga-

nų funkcijų sutrikimus [96, 100].

Antrojo tipo CD patofiziologijoje išskiriamos dvi pagrindinės ligos prie-

žastys – atsparumas insulinui ir sutrikusi kasos β ląstelių funkcija [94, 96,

101]. Dėl šių priežasčių pamažu atsiranda širdies kraujagyslių, inkstų,

neuronų, ir tinklainės pokyčiai [92, 95]. Svarbų vaidmenį turi ir oksidacinis

stresas. Atsparumas insulinui yra susijęs su mitochondrijų funkcijos sutriki-

mu, jų kiekio sumažėjimu, morfologiniais pokyčiais, mitochondrijų oksida-

cinių fermentų stoka [100]. Gliukozės ir riebalų apykaita daugiausia priklau-

so nuo mitochondrijų, kuriose gaminama ląstelėms reikalinga energija.

Oksiduojant gliukozę, mitochondrijose gaminama ATP, todėl padidėja

ATP/ADP santykis, kuris pirmiausia priklauso nuo mitochondrijų funkcijos.

Padidėjęs ATP/ADP santykis uždaro kalio kanalus, kurie skatina plazminės

membranos depoliarizaciją, kalcio kanalų atsidarymą, kalcio jonų skverbi-

mąsi į ląstelę ir insulino sekreciją [96, 100]. Jei maisto medžiagų oksidacija

yra neveiksminga, ATP gamybos ir deguonies suvartojimo santykis yra

mažas, todėl padidėja O2•–

susidarymas. Be to, aktyvių deguonies formų

susidarymas, genetiniai veiksniai, senėjimas, sumažėjusi mitochondrijų

biogenezė prisideda prie mitochondrijų funkcijos sutrikimo [100]. Mito-

chondrijų funkcijos sutrikimas yra viena iš pagrindinių atsparumo insulinui

ir jo nulemtų komplikacijų (padidėjusio kraujospūdžio, širdies ir krauja-

gyslių ligų, retinopatijos, neuropatijos, nefropatijos) priežasčių [100]. Suma-

žėjęs ATP/ADP santykis neigiamai veikia kasos β ląstelių funkciją [96,

100]. Kasos β ląstelių funkcijai didžiausią įtaką turi hiperglikemija ir hiper-

lipidemija, kurios taip pat sukelia oksidacinį stresą. Ilgalaikis padidėjusio

gliukozės kiekio poveikis sukelia kasos β ląstelių insulino informacinės

RNR sintezės, insulino kiekio ir išsiskyrimo sumažėjimą. Ilgalaikis padidė-

jęs riebalų rūgščių kiekis slopina gliukozės sukeliamą insulino išsiskyrimą,

silpnina insulino genų raišką (ekspresiją) ir sukelia insuliną išskiriančių ląs-

telių mirtį (apoptozę) [94].

Oksidacinis stresas taip pat lemia endotelio ląstelių disfunkciją, prasideda

diabetiniai kraujagyslių pokyčiai. Tai susiję su sutrikusia aktyvumo pusiaus-

vyra tarp endogeninių prooksidacinių fermentų (pvz., NADPH oksidazės,

ksantinoksidazės, mitochondrijų kvėpavimo grandinės fermentų) ir antioksi-

dacinių fermentų (SOD, GPx, CAT) [94]. Dėl padidėjusio endogeninių pro-

oksidacinių fermentų aktyvumo sumažėja azoto oksido (NO), kuris regu-

liuoja kraujagyslių tonusą, slopina trombocitų funkciją, apsaugo leukocitus

nuo sulipimo ir mažina kraujagyslių sienelių intimos ląstelių vešėjimą (anti-

aterorsklerozinis mechanizmas), aktyvumas [101]. NO aktyvumas mažėja,

30

vykstant greitai jo oksidacijai dėl padidėjusio O2•–

kiekio. Be to, užsitęsęs

oksidacinis stresas sukelia endotelio azoto oksido sintazės funkcijos sutriki-

mą. Šis fermentas vietoje NO pradeda gaminti O2•–

[18, 92, 94]. Aktyvios

deguonies formos skatina mažo tankio liproproteinų oksidaciją. Oksiduoti

mažo tankio lipoproteinai, kurių neatpažįsta jiems jautrūs receptoriai, gali

kauptis makrofaguose, o šie virsta putotomis ląstelėmis ir skatina ateroskle-

rozinių plokštelių susidarymą [102].

Oksidacinio streso sukelti kasos β-ląstelių ir mitochondrijų funkcijos

sutrikimai gali skatinti hiperglikemiją ir pacientų būklės pablogėjimą [101].

Hiperglikemija skatina aktyvių deguonies formų susidarymą, t. y. oksidacinį

stresą. Todėl CD sergantiems pacientams, siekiant sulėtinti komplikacijų

plitimą, aktualu reguliuoti ne tik gliukozės, cholesterolio kiekį, palaikyti

normalų kraujospūdį, bet kartu mažinti organizmo patiriamą oksidacinį

stresą.

Sergant cukriniu diabetu, ne tik padidėja aktyvių deguonies formų gamy-

ba, bet ir sumažėja natūrali antioksidacinė apsauga. Tai lemia sumažėjęs

endogeninių antioksidantų kiekis, geležies jonų perteklius, kartu padidėjusi

aktyvių deguonies formų gamyba, toksinų, gaminančių šias aktyvias formas,

perteklius, antioksidacinių vitaminų stoka [93, 96]. Šiuolaikinės medicinos

CD gydymo algoritmai neapsaugo nuo CD komplikacijų sunkėjimo, todėl

intensyviai ieškoma naujų, mokslo įrodymais pagrįstų gydymo strategijų.

Viena iš galimų priemonių yra augalinių preparatų – antioksidantų, vartoji-

mas

Oksidacinis stresas yra viena iš priežasčių, lemiančių cukrinio diabeto ir

jo komplikacijų sunkėjimą. Dėl oksidacinio streso atsiranda atsparumas

insulinui, sutrinka kasos β ląstelių funkcija. Oksidacinio streso sukelti kasos

β-ląstelių ir mitochondrijų funkcijos sutrikimai gali skatinti hiperglikemiją ir

pacientų būklės pablogėjimą. Padidėjęs gliukozės ir riebalų perteklius sutri-

kdo medžiagų apykaitą, taip padidėja laisvųjų radikalų gamyba. CD sergan-

tiems pacientams hiperglikemija (tiek savaime, tiek dėl sukelto oksidacinio

streso) mažina insulino sintezę ir išsiskyrimą. Šis procesas taip pat lemia

CD eigos pablogėjimą.

1.4. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų

sausųjų ekstraktų poveikio cukriniam diabetui tyrimai

Tyrimai su diabetu sergančiomis pelėmis bei žiurkėmis parodė, kad van-

deninis žaliosios arbatos ekstraktas (100–300 mg/kg) reaktyvina glikogeno

sintazės sistemą, slopina kepenų gliukozės-6-fosfatazės aktyvumą, tokiu

būdu sumažina gliukozės kiekį kraujyje, padidina glikogeno kiekį kepenyse

31

[19, 103]. Nustatyta, kad EGCG padidina jautrumą insulinui [103, 104] ir

gali atkurti pažeistas kasos β-ląsteles [5]. Manoma, kad EGCG saugo nuo

autoimuninio kasos β-ląstelių pažeidimo, slopina branduolio transkripcijos

faktoriaus κb arba ląstelinės azoto oksido sintazės aktyvumą [105]. EGCG ir

ECG blokuoja lipidų micelių susidarymą žarnyne ir nuo natrio jonų priklau-

somą gliukozės nešiklį, turintį didžiausią įtaką gliukozės absorbcijai žar-

nyne. Tai paaiškina teigiamą katechinų galatų poveikį, esant nutukimui ir

sergant CD [106].

Vartojant žaliąją arbatą 6 ir daugiau puodelių per dieną (viename puode-

lyje vidutiniškai 80–150 mg katechinų) sumažėja CD atsiradimo riziką

[107]. Nustatyta, kad žaliosios arbatos vartojimas (12 savaičių po 583 mg

katechinų per dieną) padidina insulino ir sumažina HbA1c kiekį pacientų,

sergančių 2 tipo cukriniu diabetu, kraujyje [107]. Tyrimai su 2 tipo CD ser-

gančiais graužikais parodė, kad žaliosios arbatos ekstraktas (skiriant po

200–300 mg/kg per dieną 4–16 savaičių) mažina gliukozės kiekį kraujyje

bei bendrą cholesterolio koncentraciją [108]; saugo tinklainę nuo neurode-

generacinių pokyčių (pvz., diabetinės retinopatijos) [109, 110]; pagerina

miokardo kolageno savybes [111]; EGCG papildyta dieta (0,1 %) gali

saugoti nuo kraujagyslių uždegimo, sergant CD [112]. Sausais žaliosios ar-

batos lapais papildyta dieta (10–50 %) žiurkėms mažina baltymo (proteinu-

rijos atveju) ir kreatinino kiekį šlapime bei albumino koncentraciją paros

šlapime [113], gali pagerinti glomerulų filtraciją ir inkstų funkciją [114].

Nustatyta, kad etanolinis skystasis žaliosios arbatos ekstraktas (skiriant po

200 mg/kg) sumažina MDA kiekį kraujo serume bei padidina TAS diabeti-

nėms žiurkėms [115]. Remiantis šiais tyrimais su gyvūnais, žaliosios arbatos

sausasis ekstraktas galėtų būti vartojamas profilaktiškai ir gydant diabetinius

akių, nervinio audinio ir inkstų pažeidimus, mažinant destrukcinius proce-

sus. Deja, mažai atlikta klinikinių cukriniu diabetu sergančių pacientų ty-

rimų, o jų rezultatai – prieštaringi. Nustatyta, kad vartojant žaliąją arbatą

4 savaites po 3 puodelius per dieną sumažėjo sistolinis ir diastolinis krau-

jospūdis CD pacientams, turėjusiems nedidelę hipertenziją [116]. Žaliosios

arbatos sausasis ekstraktas (vartojant po 1500 mg (katechinai sudaro 89 %)

per dieną 16 savaičių) pagerino atsparumą insulinui, tačiau, palyginti su CD

sirgusiais ir nevartojusiais šio ekstrakto, reikšmingo skirtumo nepastebėta

[117]. Nustatyta, kad epigalokatechino galatas apsaugo akies lęšiuko endo-

telio ląsteles nuo padidėjusio gliukozės kiekio sukeltos apoptozės, kartu nuo

diabetinės kataraktos atsiradimo [118].

Sergant cukriniu diabetu, vyrauja uždegiminiai procesai, kuriems atsirasti

turi įtakos pacientų amžius, padidėjęs gliukozės ir cholesterolio kiekis, oksi-

dacinis stresas. Uždegiminiai procesai organizme skatina aktyvių deguonies

32

formų susidarymą, inicijuoja CD komplikacijų atsiradimą. Dviskiaučių

ginkmedžių lapų sausasis ektraktas saugo nuo uždegimo, kvercetinas

mažina uždegimą sukeliančių fermentų bei uždegimo mediatorių kiekį [39].

Hiperglikemija, kuri per tam tikrus mechanizmus lemia mitochondrijų funk-

cijos sutrikimus ir oksidacinio streso atsiradimą, gali sukelti toksinį poveikį

neuronams. Kvercetinas pasižymi neuroprotekciniu aktyvumu CD sergan-

čioms žiurkėms (skiriant po 200 mg/kg) [52]. Tyrimai su 2 tipo CD sergan-

čiomis pelėmis bei žiurkėmis parodė, kad kvercetinu papildyta dieta (0,04–

0,08 %) turi teigiamą poveikį, kontroliuojant gliukozės kiekį kraujyje, slopi-

na α-gliukozidazės, pagrindinio fermento, dalyvaujančio virškinant maisto

krakmolą, aktyvumą bei mažina gliukozės kiekį kraujyje nevalgius, jam bū-

dingas hipolipideminis aktyvumas [119].

Nustatyta, kad sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto vartojimas

(vartojant po 60 mg ekstrakto (turinčio 24 % flavonoidų ir 6 % terpenoidų)

per dieną 14–60 dienų) vertingas gydant ankstyvą diabetinę nefropatiją,

ypač jei su šlapimu išsiskiria labai didelis albumino kiekis, nes gali suma-

žinti albumino išsiskyrimą su šlapimu, gliukozės kiekį kraujyje nevalgius,

kreatinino kiekį serume bei šlapalo kiekį kraujyje [58]. Vartojant dviskiau-

čių ginkmedžių lapų sausąjį ekstraktą tris mėnesius (po 120 mg per dieną),

pastebėtas teigiamas jo poveikis 2 tipo CD sergantiems pacientams – nusta-

tyta, kad EGB mažina MDA kiekį [50], fibrinogeno koncentraciją, teigiamai

veikia kraujo klampumą ir kraujagyslių elastingumą (tai aktyvina kraujo-

taką), taip pat reikšmingai pagerina tinklainės kapiliarų kraujo tėkmės greitį

pacientams, kuriems nustatyta diabetinė retinopatija [120, 121].

33

2. TYRIMŲ OBJEKTAI IR METODAI

2.1. Tyrimų objektai, tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga

Tyrimų objektai – žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių sausųjų

ekstraktų kapsulės. Sausasis žaliosios arbatos ekstraktas gautas iš TAIYO

GmbH, Vokietija, serijos Nr. 912121 (polifenolių kiekis 90,9 %). Sausojo

žaliosios arbatos ektrakto 200 mg kapsulės pagamintos AB „Sanitas“ (pa-

galbinė medžiaga – mikrokristalinė celiuliozė; kapsulės korpuse – želatina,

titano dioksidas, indigotinas, cholino geltonasis), serijos Nr. 010609 (tinka

iki 2011.06, polifenolių kiekis 173 mg/kapsulėje), serijos Nr. 020611 (tinka

iki 2013.06, polifenolių kiekis 168,4 mg/kapsulėje). Sausasis dviskiaučių

ginkmedžių ekstraktas gautas iš LINNEA SA, Šveicarija, serijos Nr.

G24067514-000 (flavonoidų kiekis 25,77 %, terpeno laktonų: bilobalido

kiekis 2,67 %, ginkolidų A, B ir C suma 3,23 %, ginkolinių rūgščių nerasta,

skaičiuojant sausai medžiagai). Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto

80 mg kietos kapsulės pagamintos UAB „Aconitum“ (pagalbinės medžia-

gos: mikrokristalinė celiuliozė, talkas, magnio stearatas, bevandenis koloidi-

nis silicio dioksidas; kapsulės korpuse – želatina, titano dioksidas, raudona-

sis geležies oksidas), serijos Nr. 90107 (tinka iki 2012.04, flavonoidų kiekis

22,11 mg/kapsulėje, terpeno laktonų 5,28 mg/kapsulėje ). Tyrime taip pat

vartotos placebo kapsulės (AB „Sanitas“), pagamintos iš mikrokristalinės

celiuliozės (kapsulės korpuse – želatina, titano dioksidas, indigotinas, choli-

no geltonasis). Visos pagalbinės medžiagos, naudotos kapsulių su žaliosios

arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausaisiais ekstraktais gamyboje,

neturi farmakoterapinio poveikio CD sergantiems pacientams [122, 123].

Mikrokristalinė celiuliozė kaip pagalbinė medžiaga naudota abiejų ekstraktų

kapsulių gamyboje, ji sudaro didžiausią dalį visų pagalbinių medžiagų, todėl

buvo pasirinkta ir placebo kapsulių gamybai.

Tyrime vartoti preparatai yra Lietuvoje notifikuoti maisto papildai. Var-

tojimo dozės atitinka rekomenduojamas gamintojų – po vieną kapsulę du

arba tris kartus per dieną: žaliosios arbatos ekstrakto atitinkamai po 400 mg

arba 600 mg per dieną, dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto – po 160 mg

arba 240 mg per dieną.

Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga. Prospektyvusis, atsitiktinių im-

čių dvigubai koduotas biomedicininis tyrimas buvo atliktas LSMU Ligoni-

nės Kauno Klinikos Endokrinologijos klinikoje. Tyrimo trukmė – 18 mėne-

sių. Į tyrimą įtraukti 2 tipo cukriniu diabetu sergantys pacientai, atvykę

gydytojo endokrinologo konsultacijai į LSMU Ligoninės Kauno Klinikos

Endokrinologijos klinikos ambulatorinį skyrių arba gydomi LSMU Ligo-

34

ninės Kauno Klinikos Endokrinologijos klinikos stacionare 2009 m. lapkri-

čio mėn. – 2010 m. lapkričio mėn. laikotarpiu.

Įtraukimo į tyrimą kriterijai:

Amžius – 35–80 metų

2 tipo cukrinis diabetas, gydomas metforminu, insulinu arba abiejų šių

vaistų deriniu

Diagnozuota bent viena cukrinio diabeto komplikacija (diabetinė retino-

patija, diabetinė nefropatija arba diabetinė neuropatija)

Glikuoto hemolobino (HbA1c) kiekis ≤ 13 %

Kūno masės indeksas ≤ 45 kg/m2

Kreatinino kiekis ≤ 160µmol/l

Asmens sutikimas dalyvauti tyrime

Neįtraukimo į tyrimą kriterijai:

Iš tiriamojo apklausos ar medicininių įrašų gauta informacija apie žalio-

sios arbatos ar sausųjų dviskiaučių ginkmedžių lapų alerginį poveikį

organizmui, arba psichologinį minėtų medžiagų netoleravimą.

Labili cukrinio diabeto eiga: dažnos hipoglikemijos ar ketoacidozės

CD gydymas sulfonilšlapalo grupės preparatais ar kitais sekretagogais.

Proliferacinė retinopatija ar makulopatija, ar numatomas gydymas lazeriu

Diabetinės pėdos išopėjimai

Nekontroliuojama arterinė hipertenzija (AKS > 180/100 mm/Hg)

Aktyvi kepenų liga ar pablogėjusi kepenų veikla (kepenų fermentų padi-

dėjimas > 3 kartus)

Inkstų funkcijos nepakakankamumas

Miokardo infarktas, nestabili krūtinės angina, išeminis insultas, kardio-

vaskulinis nepakankamumas NYHA III-IV klasės

Nekoreguoti skydliaukės funkcijos sutrikimai

Didelės apimties operacija mažiau nei prieš 3 mėn.

Šiuo metu gydomi onkologiniai susirgimai

Psichikos ar nervų sistemos liga, kuri trukdo asmeniui suvokti ir tinkamai

vertinti savo sveikatos būklę

Kita, gydytojo tyrėjo įsitikinimu ar nuomone, kliniškai reikšminga liga

Maisto papildų, turinčių antioksidacinių savybių, vartojimas

Pacientas dalyvauja kituose klinikiniuose tyrimuose

2 tipo cukrinio diabeto diagnozė patvirtinta endokrinologo, vadovaujantis

Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2001 m. rugsėjo 17 d.

įsakymu Nr. 489 „Dėl cukrinio diabeto klasifikacijos ir diagnostikos kriteri-

jų patvirtinimo“ [Žin., 2001, Nr. 82-2875]. Gydytojas endokrinologas, įver-

tinęs įtraukimo ir atmetimo kriterijus, atrinko pacientus tinkamus dalyvauti

35

tyrime. Sutikę dalyvauti tyrime pacientai pasirašė suaugusiojo tiriamojo

asmens informavimo ir informuoto asmens sutikimo formą. Tiriamųjų var-

dai, pavardės, gimimo metai ir greta įrašyti skaitmeniniai kodai buvo fiksuo-

jami pacientų registracijos lape, kurį pildė ir saugojo tyrėjas kartu su pacien-

tų pasirašytomis dalyvauti tyrime sutikimo formomis.

Pacientai atsitiktinės atrankos būdu (metodu 1:1:1) buvo suskirstyti į gru-

pes. Pirmoji grupė vartojo sausojo žaliosios arbatos ekstrakto (ECS grupė)

kapsules, antroji – sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto (EGB

grupė) kapsules, trečioji – placebo (placebo grupė) kapsules. Pirmus devynis

mėnesius pacientai vartojo po vieną kapsulę du kartus per dieną, kitus devy-

nis mėnesius – po vieną kapsulę tris kartus per dieną. Paciento asmens duo-

menys ir suskirstymo į grupes tvarka buvo žinoma tik tyrėjui. Gydytojų

endokrinologų ir specialistų pildomose tyrimo anketose bei siuntimuose at-

likti tyrimus buvo įrašomas tik tiriamojo kodas.

Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų ekstraktų povei-

kio CD sukeltai inkstų, nervinio audinio ir akių pažaidai įvertinimo tyrimo

schema pateikta 2.1.1 paveiksle.

Biomedicininis tyrimas buvo atliekamas, atsižvelgiant į Europos Sąjun-

goje ir Lietuvos Respublikoje galiojančius teisės aktus, reglamentuojančius

tyrimus su žmonėmis. Tyrimui atlikti gautas Kauno regioninio biomedicini-

nių tyrimų etikos komiteto leidimas Nr. BE-2-5, 2009 m. (Priedas Nr. 1).

Valstybinė duomenų apsaugos inspekcija išdavė leidimą atlikti asmens duo-

menų tvarkymo veiksmus (Nr. 2R-1322, 2009 m.).

Šis tyrimas buvo tarptautinio Eureka projekto “Natūralių antioksidantų

poveikio cukrinio diabeto komplikacijų vystymuisi metodologijos sukūri-

mas“ dalis. Iš viso projektui buvo atrinkti ir sutiko dalyvauti 250 pacientų,

tačiau dėl ilgos tyrimo trukmės bei asmeninių priežasčių tyrimą baigė 91 pa-

cientas. Šiame darbe analizuojami 71 paciento duomenys, kurie vartojo

žaliosios arbatos, dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų ekstraktų arba place-

bo kapsules, bei dalyvavo tyrime visus 18 mėnesių.

36

2.1.1 pav. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio CD sukeltai inkstų, nervinio audinio ir akių pažaidai

įvertinimo tyrimo schema.

37

2.2. Tyrimų metodai ir metodikos

2.2.1. Reagentai ir medžiagos

Tyrimo metu naudoti chemiškai švarūs reagentai. Išvalytas ir dejonizuo-

tas vanduo (18,2 mΩ cm-1

) buvo ruošiamas Millipore vandens valymo siste-

ma (Bedford, JAV). Etanolis (96,3 %) įsigytas iš AB „Stumbras“ (Kaunas,

Lietuva), 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilo rūgštis (trolok-

sas) (97 %) gauta iš Acros Organics (New Jersey, JAV), kvercetino

(98,0 %), kemferolio (99,0 %) ir izoramnetino (99,0 %) standartai – iš Fluka

(Buchs, Šveicarija), katechinų ((-)-epikatechino galato (97,7 %), (-)-epikate-

chino (97,8 %), (+)-katechino (99,2 %), (-)-epigalokatechino (99,4 %), (-)-

epigalokatechino galato (97,3 %)) standartai – iš Chromadex (JAV). Chro-

matografinei analizei naudoti gradientinio švarumo metanolis ir acetonitri-

las, taip pat ir 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH), natrio citrato dihidratas

(99,0 %), citrinos rūgštis (99, 5 %) bei visi kiti tyrime naudoti reagentai

(analitinio švarumo) buvo gauti iš Sigma-Aldrich (Steinheim, Vokietija).

2.2.2. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų

antiradikalinio aktyvumo įvertinimo metodika

Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų veikliųjų jun-

ginių antiradikalinis aktyvumas nustatytas, pritaikant pokolonėlinį efekty-

viosios skysčių chromatografijos DPPH radikalų surišimo gebos nustatymo

metodą (ESC–DPPH) [124].

ESC analizė atlikta Waters 2695 chromatografu (Waters, Milfordas,

JAV) su ultravioletinės-matomos šviesos absorbciniu detektoriumi Waters

2487 (Waters, Milfordas, JAV). Analitinėje kolonėlėje išskirstyti junginiai

iš detektoriaus per maišymo trišakį pateko į reakcijos kilpą, į kurią tuo pačiu

metu 1 ml/min greičiu buvo tiekiamas DPPH• tirpalas [124]. DPPH

• tirpalo

tiekimui naudotas nuolatinio veikimo ESC siurblys Gilson pump 305

(Waters, Mideltonas, JAV). Kaip reakcijos kilpa naudotas 5 m ilgio, 0,5 mm

vidinio skersmens ir 1,58 mm išorinio skersmens politetrafluoetileno vamz-

delis, kuris buvo laikomas išoriniame termostate (Waters, Milfordas, JAV)

25 C temperatūroje. Reakcijos kilpa sujungta su ultravioletinės-matomos

šviesos tipo detektoriumi Gilson 118 (Mideltonas, JAV), kuriuo matuojama

pratekančio tirpalo absorbcija.

Žaliosios arbatos ekstrakto ESC analizė atlikta [125] ištirpinus apie 0,2 g

kapsulių turinio (tikslus kiekis) 10 ml vandens, acetonitrilo, metanolio, etil-

acetato ir ledinės acto rūgšties mišinyje (eliuentas A) ultragarso vonelėje

38

5 min. Gautas tirpalas filtruotas per membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,22

µm (Carl Roth Gmbh, Vokietija). Veikliųjų medžiagų atskyrimui naudota 4,6

x 250 mm 5µm sorbento dalelių dydžio ACE C18 kolonėlė su 5µm ACE

C18 prieškolonėle (Advanced Chromatography Technologies, Škotija).

Analizės metu kolonėlė buvo laikyta išoriniame termostate (Waters, Mil-

fordas, JAV) 25 C temperatūroje. Judrios fazės tėkmės greitis – 0,1 ml/min,

injekcijos tūris – 10 μl. Eliuentų sistema: A – vanduo / acetonitrilas / meta-

nolis / etilacetatas / ledinė acto rūgštis (89:6:1:3:1 v/v/v/v/v), B – acetonitri-

las. Naudota tokia gradiento sistema: 0–10 min – 100 % A ir 0 % B, 30 min

– 85 % A ir 15 % B, 40–45 min – 20 % A ir 80 % B, 46 min – 100 % A ir

0 % B. Absorbcija matuota prie 275 nm bangos ilgio.

Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto ESC analizė atlikta, remiantis

Europos Farmakopėja 6.1 [37]. Apie 0,2 g kapsulių turinio (tikslus kiekis)

buvo ištirpinta 20 ml metanolio, 15 ml praskiestos druskos rūgšties, 5 ml

vandens ir praskiesta metanoliu iki 50 ml. Gautas tirpalas buvo kaitinamas

vandens vonelėje 25 min. Atvėsintas iki 20C tirpalas filtruotas per mem-

braninį filtrą, kurio porų dydis 0,22 µm (Carl Roth Gmbh, Vokietija). Veik-

liųjų medžiagų atskyrimui naudota 4,0 x 150 mm 5µm sorbento dalelių

dydžio ACE C18 kolonėlė su 5µm ACE C18 prieškolonėle (Advanced

Chromatography Technologies, Škotija). Analizės metu kolonėlė buvo

laikyta išoriniame termostate (Waters, Milfordas, JAV) 25 C temperatūtoje.

Judrios fazės tėkmės greitis – 0,1 ml/min, injekcijos tūris – 10 μl. Eliuentų

sistema: A – 0,1 g/l fosforo rūgštis (pH = 3,0), B – metanolis. Naudota tokia

gradiento sistema: 0–1 min – 60 % A ir 40 % B, 20 min – 45% A ir 55 % B,

21–25 min – 0 % A ir 100 % B. Absorbcija matuota prie 370 nm bangos

ilgio.

Antiradikalinio aktyvumo apskaičiavimas. Žaliosios arbatos ir dvi-

skiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų veikliųjų junginių antiradikalinis akty-

vumas apskaičiuotas pagal etaloninį antioksidantą – troloksą ir išreikštas

troloksui ekvivalantiška antioksidacine geba (TEAC) (1). TEAC atitinka

trolokso kiekį (mg), kuris tokiose pačiose tyrimo sąlygose turi identišką

antiradikalinį aktyvumą, kaip ir tiriamasis junginys viename grame augali-

nės žaliavos. TEAC apskaičiuojamas pagal trolokso kalibracinę kreivę (tie-

siškumo intervalas 0,02–0,12 mg/ml):

39

𝑇𝐸𝐴𝐶 =𝑆𝑗𝑢𝑛𝑔.−𝑏

𝑎×

𝑉𝑡𝑖𝑟𝑝.

𝑚𝑏𝑎𝑛𝑑. (1)

Sjung. – junginio, turinčio antiradikalinį aktyvumą, smailės plotas

pokolonėlinėje chromatogramoje;

a – nuolydis iš trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygties;

b – nuokrypis iš trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygties;

Vtirp. – tiriamo bandinio tirpalo tūris (ml);

mband.. – tiriamo bandinio (sausojo žaliosios arbatos ar dviskiaučių

ginkmedžių lapų ekstrakto) kiekis (g);

2.2.3. Oksidacinio streso rodiklių nustatymo kraujo plazmoje

metodika

Organizmo patiriamam oksidaciniam stresui įvertinti buvo nustatomas

antioksidacinių fermentų (SOD, CAT, GPx) aktyvumas, bendra antioksida-

cinė raiška (TAS), seleno bei vitamino E kiekis, lipidų peroksidacijos rodik-

lių (LOOH, MDA, 4-HNE) koncentracija kraujo plazmos mėginiuose. Visi

tyrimai buvo atlikti Rygos Stradino Universiteto Biochemijos laboratorijoje,

Latvijoje. Buvo tiriami pacientų, dalyvavusių biomedicininiame tyrime,

kraujo plazmos mėginiai, prieš pradedant vartoti preparatus bei praėjus 9 ir

18 mėnesių nuo preparatų vartojimo pradžios. Antioksidacinių fermentų,

SOD [126] ir GPx, [127] aktyvumas bei TAS [128] buvo nustatomas

spektrofotometriškai automatiniu cheminiu analizatoriumi Dayton RX 270

pagal gamintojo Randox Laboratories pateiktas instrukcijas bei naudojant

gamintojo standartinius rinkinius „Ransod“ ir „Ransel“ (Randox Labora-

tories Limited, Crumlin, Jungtinė Karalystė). CAT aktyvumas eritrocituose

įvertintas spektofotometru Cary 50 (Varian Cary® 50 UV-Vis Spectro-

photometer, Varian, Australia Pty Limited) ir išreikštas kaip k (greičio

konstanta)/ 1 g hemoglobino [129]. LOOH kiekis [130] bei MDA ir 4-HNE

koncentracija [131] nustatyta mikroplokštelių skaitytuvu SunriseTM

(TECAN, Austrija), naudojant komercinius diagnostinius rinkinius, atitinka-

mai „NWLSS™ Lipid Hydroperoxide Assay” (Northwest LSS Inc, USA) ir

„LPO Microplate Based Assay Kit” (Oxford Biomedical Research, USA).

Seleno bei vitamino E kiekis kraujo plazmoje įvertintas fluorimetrijos meto-

du [132, 133]. Visi reagentai buvo gauti iš Sigma-Aldrich (JAV), išskyrus

kontrolinius serumus – „Seronorm TE Serum level I“ ir „Vitamin A/E level

II“, naudojamus seleno ir vitamino E kokybės kontrolei, kurie buvo gauti

atitinkamai iš Sero AS (Norvegija) ir Eurotrol (Olandija).

40

2.2.4. Bendrieji tyrimai bei diabetinės inkstų pažaidos įvertinimo

metodika

Tyrimo pradžioje buvo surinkta pacientų anamnezė ir įvertinti medicini-

nių dokumentų įrašai. Nustatyti neinvaziniai antropometriniai duomenys:

svoris (medicininėmis svarstyklėmis), ūgis (medicinine ūgio matuokle), lie-

mens ir klubų apimtis (standartiniu lanksčiuoju centimetriniu matuokliu),

širdies susitraukimų dažnis, sistolinis ir diastolinis arterinis kraujospūdis

(negyvsidabriniu kraujospūdžio matuokliu), išmatuotas sėdint (po 5 minučių

poilsio), ir išvedant dviejų kraujospūdžio išmatavimų vidurkį. Biocheminiai

kraujo tyrimai (glikemijos įvertinimas (HbA1c), inkstų funkcijos rodikliai

(kalis, šlapalas, kreatininas), kepenų fermentai (ALT, AST, GGT)) bei šlapi-

mo tyrimai (paros albumino nustatymas), funkcinis širdies veiklos tyrimas

(elektrokardiografu užrašyta elektrokardiograma) buvo atlikti, prieš prade-

dant vartoti preparatus, ir po 9 bei18 mėnesių preparatų vartojimo. Kraujo

tyrimai, išskyrus HbA1c nustatymą, atlikti klininkinės chemijos analizato-

riumi UniCel DxC 800 (Beckman Coulter, Inc, JAV) pagal gamintojų nuro-

dytas metodikas. HbA1c buvo nustatomas Siemens DCA 2000 analizato-

riumi, naudojant DCA 2000 HbA1c rinkinį (Siemens AG, Vokietija).

Diabetiniai inkstų pažeidimai įvertinti, atsižvelgiant į šlapalo ir kreatinino

kiekį kraujo serume bei albumino kiekį paros šlapime.

2.2.5. Diabetinės akių pažaidos įvertinimo metodika

Oftalmologinį tyrimą atliko gydytojas specialistas. Tas pats gydytojas

vertino tiriamuosius viso tyrimo metu. Tyrimai atlikti pagal standartizuotą

ištyrimo schemą, pagal kurią buvo sukurta anketinė rezultatų fiksavimo for-

ma (Priedas Nr. 2) [134, 135]. Oftalmologinis tyrimas atliktas, naudojant di-

dinamąją (nuo 7 iki 45 kartų) plyšinės lempos sistemą Marco V Slit Lamp

(Ser. Nr. 93C0048). Statinio tyrimo metu (nejudinant akies obuolio) stebima

60 laipsnių akies dugno dalis. Judinant akies obuolį, stebima180 laipsnių

akies dugno dalis. Tyrimo metu naudotos Volk linzės (Volk Optical,

Mentor, JAV), turinčios 60D ir 78D (dioptrijų).

2.2.6. Diabetinės nervinio audinio pažaidos įvertinimo metodika

Neurologinį tyrimą atliko gydytojas specialistas. Tas pats gydytojas verti-

no tiriamuosius viso tyrimo metu. Tyrimai atlikti pagal standartizuotą ištyri-

mo schemą, pagal kurią sukurta anketinė rezultatų fiksavimo forma (Priedas

Nr.3). Neurologinis tyrimas atliktas, naudojant – Mičigano neurologinio ty-

41

rimo klausimyną (angl. The Michigan Neuropathy Screening Instrument)

[136, 137]. Periferinių jutimų įvertinimui atlikti specialūs kiekybiniai testai:

1) bioteziometru (Bio-Medical Instrument Co., Newbury, Ohio, USA)

matuotas vibracinio jutimo slenkstis pėdose. Remiantis literatūros duomeni-

mis, daugelyje tyrimų diabetinė neuropatija nustatoma, kai vibracijos jutimų

slenkstis (VJS) > 25V; 2) tyrimas Semmes-Weinstein 10g monofilamentu;

3) Achilo sausgyslės refleksas tirtas neurologiniu plaktuku; 4) temperatūros

jutimo slenksčio tyrimas atliktas cilindrine Tip-Therm lazdele; 5) adatos

dūrio testas atliekamas Neurotip adata. Skausmo intensyvumas vertintas, va-

dovaujantis Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m.

balandžio 8 d. įsakymu Nr. V-208 „Dėl Būtinosios medicinos pagalbos ir

Būtinosios medicinos pagalbos paslaugų teikimo tvarkos bei masto patvirti-

nimo“ (Žin., 2004, Nr. 134-4882;2004, Nr. 55-1915) patvirtinta skaitmenine

skausmo vertinimo skale, kur skausmas išreiškiamas balais nuo 0 (nėra

skausmo) iki 10 balų (nepakeliamas skausmas).

2.3. Statistinis duomenų vertinimas

Viso tyrimo duomenys buvo sukaupti kompiuterinėje duomenų bazėje.

Pacientų duomenys buvo koduojami ir įrašyti į programos paketo Excel

2007 for Windows (Microsoft, JAV) elektronines lenteles. Statistinė analizė

atlikta, naudojant standartinius statistinius paketus – STATISTICA 6.0a ir

SPSS (angl. Statistical Package for the Social Sciences) for Windows 20.0.

Tolydiesiems kintamiesiems įvertinti buvo skaičiuojamas vidurkis (m) ir jo

standartinė paklaida (SE). Dėl mažų imčių taikyti neparametriniai vertinimo

kriterijai. Kelių grupių vidurkio skirtumo hipotezė tikrinta, naudojant

Kruskal-Wallis kriterijų, o esant reikšmingam skirtumui vidurkiai tarp gru-

pių porų lyginti naudojant Mann-Whitney kriterijų. Priklausomų imčių (tos

pačios grupės atskiri matavimai) vidurkių skirtumas lygintas, naudojant

Wilcoxon bei Friedman kriterijus. Tarpusavio ryšiai tarp požymių vertinti,

naudojant Spearman koreliacijos koeficientą. Analizuojant žaliosios arbatos

ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų ekstraktų prognozinę vertę oksidaci-

nio streso rodiklių kitimui bei akių, nervinio audinio ir inkstų pažaidai, nau-

dota žingsninė daugianarė logistinė regresinė analizė. Tikrinant statistines

hipotezes, buvo pasirinktas 0,05 reikšmingumo lygmuo.

42

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų

sausųjų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas

3.1.1. Sausojo žaliosios arbatos ekstrakto katechinų antioksidacinio

aktyvumo nustatymas

Remiantis literatūros duomenimis, žaliosios arbatos ekstrakto antioksida-

cinis aktyvumas priklauso nuo katechinų koncentracijos [5, 20] ir šių jungi-

nių gebos inaktyvinti laisvuosius radikalus [6, 12]. Didžiausią katechinų dalį

(iki 75,0 %) sudaro epigalokatechino galatas [6], kuris pasižymi stipriausio-

mis antioksidacinėmis savybėmis [9, 10]. Eksperimentais nustatyta penkių

pagrindinių žaliosios arbatos ekstrakto katechinų (katechino, epikatechino,

epigalokatechino, epikatechino galato, epigalokatechino galato) geba inakty-

vinti DPPH radikalus. Siekiant kiekybiškai nustatyti katechinų antiradikalinį

aktyvumą, apskaičiuota troloksui ekvivalentiškos antioksidacinės galios

(TEAC) reikšmė. Pagal TEAC reikšmę stipriausių antioksidacinių savybių

turi epigalokatechino galatas (234,07±28,65 mg/g), truputį silpnesnių – epi-

katechino galatas (163,58±19,18 mg/g), epigalokatechinas (40,62±1,19

mg/g), epikatechinas (15,73±0,97 mg/g), ir silpniausių antioksidacinių savy-

bių turi katechinas (1,51±1,07 mg/g). Nustatytų katechinų suminis aktyvu-

mas – 457,14 mg/g, todėl galime teigti, kad vienas gramas sausojo žaliosios

arbatos ekstrakto turi ne mažesnį antiradikalinį aktyvumą, kaip ir 0,5 g

etaloninio antioksidanto trolokso. Sausojo žaliosios arbatos ekstrakto

UV-DPPH chromatogramos pateiktos 3.1.1.1 pav.

B žiedo 5‘-padėtyje (1.1.1.1. pav.) esanti papildoma OH grupė (EGC ir

EGCG atveju) bei C žiedo 3-padėtyje esanti trihidroksigalato grupė (ECG ir

EGCG atveju) yra svarbiausios, inaktyvinant DPPH radikalus [10, 138].

Remiantis literatūroje aprašytais tyrimais, žaliosios arbatos ekstrakto EGCG

turi stipriausių antiradikalinių ir antioksidacinių savybių [12]. Tačiau anti-

oksidacinio EGC ir ECG aktyvumo tyrimų rezultatai yra prieštaringi, ir

negalima vienareikšmiškai teigti, kuris iš jų turi stipresnių antioksidacinių

savybių. Remiantis šio tyrimų rezultatais, pagal antioksidacinį aktyvumą ka-

techinus galima išdėstyti tokia seka: epigalokatechino galatas > epikatechi-

no galatas > epigalokatechinas > epikatechinas > katechinas. Toks pats eiliš-

kumas buvo nustatytas Higdon‘o ir Frei‘o [22]. Epigalokatechino galatas,

turi stipriausių antioksidacinių savybių, gali būti naudojamas kaip kokybinis

parametras, vertinant žaliosios arbatos preparatų antioksidacinį aktyvumą.

43

3.1.1.1 pav. Žaliosios arbatos ekstrakto ESC (a) ir UV-DPPH (b)

chromatogramos. 1 – epigalokatechinas, 2 – katechinas, 3 – epikatechinas, 4 – epigalokatechinogalatas,

5 – epikatechino galatas.

3.1.2. Sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto flavonoidų

antioksidacinio aktyvumo nustatymas

Flavonoidai yra pagrindiniai junginiai, lemiantys antioksidacinį dviskiau-

čių ginkmedžių lapų ekstrakto aktyvumą [33, 38, 39]. Nustatyta pagrindinių

EGB flavonoidų – kvercetino, kemferolio ir izoramnetino, geba surišti

DPPH radikalus. Sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto chromato-

gramos, gautos nustatant flavonoidų antioksidacinį aktyvumą ECS-DPPH

metodu, pateiktos 3.1.2.1 pav.

44

3.1.2.1 pav. Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto ESC (a) ir UV-DPPH

(b) chromatogramos. 1 – kvercetinas, 2 – kemferolis, 3 – izoramnetinas.

Atsižvelgiant į TEAC reikšmes, stipriausią antioksidacinį aktyvumą turi

kvercetinas (27,96±0,17 mg/g), o kemferolis ir izoramnetinas turi mažesnį

(atitinkamai TEAC 9,52±0,26 mg/g ir 2,99±0,28 mg/g) aktyvumą. Didesnę

radikalų surišimo gebą lemia papildomas hidroksilintas atomas B žiede

(kvercetino atveju), kuris turi elektronų donorinių savybių [11, 38]. Suminis

vertintų flavonoidų aktyvumas – 40,76 mg/g. Flavonoidai, esantys viename

grame šio ekstrakto turi ne mažesnį antiradikalinį aktyvumą, kaip ir 40 mg

etaloninio antioksidanto trolokso.

3.2. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio diabetinei akių, nervinio audinio ir inkstų

pažaidai įvertinimas

3.2.1. Bendras tiriamųjų įvertinimas

Tyrime dalyvavo 71 pacientas. 26 pacientai iš visų tiriamųjų vartojo dvi-

skiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules (EGB grupė), 20 pacientų – ža-

45

liosios arbatos ekstrakto kapsules (ECS grupė), 25 pacientai – placebo kap-

sules (placebo grupė). Tiriamųjų pasiskirstymas grupėse pagal lytį pateiktas

3.2.1.1 paveiksle.

3.2.1.1 pav. Tiriamųjų pacientų pasiskirstymas grupėse pagal lytį.

EGB – pacientų, vartojusių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules, grupė;

ECS – pacientų, vartojusių žaliosios arbatos ekstrakto kapsules, grupė; Placebo – placebo

kapsules vartojusių pacientų grupė.

Tyrime dalyvavę pacientai 2 tipo cukriniu diabetu sirgo vidutiniškai

10,87±0,9 metų (3.2.1.2 pav.). Vidutinis tiriamųjų amžius – 61,46±1,2 metų

(3.2.1.3 pav.). Reikšmingo amžiaus ir CD stažo skirtumo tarp grupių nenus-

tatyta. 23,9 % visų tiriamųjų buvo gydomi metforminu, 31,0 % – insulinu,

45,1 % – metformino ir insulino deriniu (3.2.1.4 pav.).

46

3.2.1.2 pav. Vidutinis tiriamųjų CD stažas kiekvienoje tiriamųjų grupėje.

Vidurkis lygintas naudojant Kruskal-Wallis kriterijų, p = 0,585.

EGB – pacientų, vartojusių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules, grupė;

ECS – pacientų, vartojusių žaliosios arbatos ekstrakto kapsules, grupė; Placebo – placebo

kapsules vartojusių pacientų grupė. Pastaba: šiame paveiksle duomenys pateikiami kaip

vidurkis ir jo standartinis nuokrypis.

47

3.2.1.3 pav. Vidutinis tiriamųjų amžius kiekvienoje tiriamųjų grupėje

Vidurkis lygintas naudojant Kruskal-Wallis kriterijų, p = 0,958.

EGB – pacientų, vartojusių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules, grupė;

ECS – pacientų, vartojusių žaliosios arbatos ekstrakto kapsules, grupė; Placebo – placebo

kapsules vartojusių pacientų grupė. Pastaba: šiame paveiksle duomenys pateikiami kaip

vidurkis ir jo standartinis nuokrypis.

48

3.2.1.4 pav. Tiriamųjų pacientų pasiskirstymas grupėse

pagal CD gydymui vartojamą vaistą. EGB – pacientų, vartojusių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules, grupė; ECS –

pacientų, vartojusių žaliosios arbatos ekstrakto kapsules, grupė; Placebo – placebo

kapsules vartojusių pacientų grupė.

Diabetinė neuropatija jau buvo diagnozuota 91,5 % tiriamųjų. Diabetinė

retinopatija buvo diagnozuota 21,2 % tiramųjų, o diabetinė nefropatija –

8,4 % (3.2.1.5 pav.). Dauguma tiriamųjų (72,1 % moterų ir 71,4 % visų

tyrime dalyvavusių vyrų) nurodė, kad serga arterine hipertenzija, tačiau jų

arterinis kraujospūdis buvo kontroliuojamas kraujospūdį reguliuojančiais

vaistais. Įvertintos ir kitos gretutinės ligos: patirtas insultas – 2,8 % tiriamų-

jų, miokardo infarktas – 7 % tiriamųjų, širdies revaskuliarizacija (šuntavi-

mas) atlikta 7 % tiriamųjų. Tyrime dalyvavę pacientai neturėjo periferinių

arterinių ligų (protarpinio šlubumo, kojų arterijų revaskuliarizacijos, ampu-

tacijos). Dauguma tiriamųjų nurodė esą nerūkantys (88,7 %), iš kurių

15,5 % atsisakė rūkimo, diagnozavus CD.

Nustatyta, kad daugumos tiriamųjų (95,8 %) kūno svoris yra per didelis

(kūno masės indeksas > 25). Kitas reikšmingas antsvorio rodiklis yra juos-

mens/klubų apimties santykis. Padidėjusiai rizikos grupei priskiriami vyrai,

kurių juosmens apimtis > 102 cm, o juosmens/klubų apimties santykis

> 0,9, moterys atitinkamai – > 88 cm ir > 0,85. Tyrimo metu nustatyta, kad

vyrų juosmens apimties vidurkis – 118,0±3,6 cm, moterų – 108,67±2,4 cm,

vyrų juosmens/klubų apimties santykio vidurkis – 1,04±0,01, moterų –

0,92±0,01. Tai yra 89,3 % vyrų ir 79,1 % moterų priskirti padidėjusios rizi-

49

kos grupei – išsivystęs “pilvinio” tipo nutukimas, kuris lemia metabolinio

sindromo ir širdies bei kraujagyslių ligų atsiradimą.

3.2.1.5 pav. Tiriamųjų pacientų diabetinių komplikacijų dažnis (procentais).

R – retinopatija, Nf – nefropatija, N – neuropatija.

Vertinant biocheminių kraujo tyrimų rezultatus, nustatyta, kad vidutinis

glikuoto hemoglobino (HbA1c) kiekis 8,10±0,22 %. Sergant cukriniu dia-

betu, rekomenduojama, kad glikuotas hemoglobinas būtų < 6,5 %. HbA1c

padidėjimas yra susijęs su kliniškai reikšminga didesne smulkiųjų ir stam-

biųjų kraujagyslių komplikacijų rizika. 84,4 % visų tiriamųjų nustatytas

didesnis nei 6,5 % HbA1c kiekis.

HbA1c, KMI bei juosmens/klubų apimties santykis viso tyrimo metu

išliko panašus (t. y. be statistiškai reikšmingų pokyčių) visose grupėse

(3.2.1.1 lentelė). Nors šie rodikliai viršijo rekomenduojamas normas (tai le-

mia cukrinio diabeto komplikacijų sunkėjimą), bet tyrimo metu jie nekito,

todėl galime teigti, kad neturėjo įtakos vertinant dviskiaučių ginkmedžių ir

žaliosios arbatos sausųjų ekstraktų poveikį akių, nervinio audinio bei inkstų

pakitimų progresavimui.

50

3.2.1.1 lentelė. Tiriamųjų grupių pacientų HbA1c koncentracijos vidurkiai,

KMI vidurkiai, juosmens/klubų apimties (JKA) santykio vidurkiai, prieš pra-

dedant vartoti preparatus bei po 9 ir 18 mėn. preparatų vartojimo.

Grupė* Tyrimo

pradžioje (I)

Po 9

mėn.(II)

Po 18

mėn.(III) p***

Hb

A1

c

(%)

EGB (n = 12) 7,66±0,3 7,48±0,3 7,38±0,3 p = 0,544

ECS (n = 8) 7,41±0,5 7,46±0,8 7,18±0,6 p = 0,607

placebo

(n = 14)

8,41±0,6 7,71±0,4 7,93±0,4 p = 0,211

p** p = 0,884 p = 0,652 p = 0,357

KM

I EGB (n = 23) 32,86±1,5 32,96±1,4 33,22±1,4 p = 0,279

ECS (n = 17) 34,83±1,3 35,18±1,4 35,37±1,3 p = 0,939

placebo

(n = 24)

35,38±1,3 35,62±1,4 34,86±1,4 p = 0,381

p** p = 0,282 p = 0,624 p = 0,474

JK

A

(vy

rų)

EGB (n = 10) 1,04±0,02 1,03±0,03 1,03±0,03 p = 0,459

ECS (n = 5) 1,04±0,02 1,02±0,02 1,02±0,01 p = 1,0

Placebo

(n = 6)

1,05±0,03 1,10±0,15 0,97±0,04 p = 0,449

p** p = 0,941 p = 0,577 p = 0,366

JK

A

(mo

terų

)

EGB (n = 12) 0,95±0,02 0,94±0,03 0,93±0,03 p = 0,529

ECS (n = 11) 0,91±0,02 0,96±0,02 0,94±0,02 p = 0,103

placebo

(n = 18)

0,92±0,02 0,91±0,02 0,95±0,02 p = 0,168

p** p = 0,421 p = 0,061 p = 0,818

*EGB – pacientų, vartojusių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules, grupė; ECS –

pacientų, vartojusių žaliosios arbatos ekstrakto kapsules, grupė; placebo – placebo kapsules

vartojusių pacientų grupė.

**grupių vidurkiai lyginti naudojant Kruskal-Wallis kriterijų.

***tos pačios grupės vidurkiai tarp skirtingų matavimų lyginti naudojant Friedman

kriterijų.

Pastebėta, kad metforminą vartojusių pacientų grupėje viso tyrimo metu

glikuoto hemoglobino kiekis buvo reikšmingai mažesnis nei vartojusių insu-

liną ar abiejų šių vaistų kombinaciją (3.2.1.2 lentelė), tačiau tyrimo metu

(lyginant duomenis tyrimo pradžioje bei po 9 mėn. ir 18 mėn.) HbA1c reikš-

mingai nepakito. Vertinant EGB, ECS ir placebo poveikį atskirai metformi-

ną, insuliną ar abiejų šių vaistų kombinaciją vartojusių pacientų grupėse

reikšmingo skirtumo nei tarp vartotų preparatų, nei tyrimo metu nenustatyta.

51

3.2.1.2 lentelė. Pacientų, vartojusių metforminą, insuliną ir abiejų šių vaistų

kombinaciją, HbA1c koncentracijos vidurkis, prieš pradedant vartoti pre-

paratus bei po 9 ir 18 mėn. preparatų vartojimo. Vartotas

vaistas

Tyrimo

pradžioje (I) Po 9 mėn.(II) Po 18 mėn.(III) p**

Metforminas (1)

(n = 8)

6,70±0,16 6,79±0,28 6,75±0,45 p = 0,798

Insulinas (2)

(n = 11)

8,69±0,46 7,83±0,25 7,77±0,40 p = 0,723

Metforminas ir

insulinas (3)

(n = 15)

8,36±0,28 8,04±0,39 7,35±0,25 p = 0,356

p* 1–2gr. p=0,002;

1–3gr. p=0,005;

2–3gr. p=0,866.

1–2gr. p=0,005;

1–3gr. p=0,042;

2–3gr. p=0,932.

1–2gr. p=0,046;

1–3gr. p=0,020;

2–3gr. p=0,780.

*grupių vidurkiai lyginti naudojant Kruskal-Wallis kriterijų, gauta p < 0,05, todėl vidurkiai

tarp grupių porų lyginti naudojant Mann-Whitney kriterijų.

**tos pačios grupės vidurkiai tarp skirtingų matavimų lyginti naudojant Friedman kriterijų.

Sergant cukriniu diabetu, o ypač esant nutukimui, gali būti pažeistos ir

kepenys. Kepenų fermentų (asparagino aminotransferazės (AST), alanino

aminotransferazės (ALT), γ glutamiltransferazės (GGT)) kiekis viso tyrimo

metu išliko pastovus. Statistiškai reikšmingo tiriamų ekstraktų poveikio ke-

penų fermentų kitimui nenustatyta.

Apibendrinant šiuos duomenis, galime teigti, kad daugumai tiriamųjų nu-

statyti rizikos veiksniai, lemiantys cukrinio diabeto sukeliamų akių, nervinio

audinio bei inkstų pažeidimų plitimą, tai – pačių tiriamųjų amžius (vidutinis

61,46±1,2 metų), CD stažas (vidutinis 10,87±0,9 metų), KMI (95,8 %

tiriamųjų kūno svoris buvo per didelis), pilvinis nutukimas (79,1 % moterų

ir 89,3 % vyrų), diagnozuota arterinė hipertenzija (72,1 % moterų ir 71,4 %

vyrų). Šiuos pokyčius lemia ir oksidacinis stresas, būdingas cukrinio diabeto

eigai.

3.2.2. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio diabetinei inkstų pažaidai įvertinimas

Prieš tyrimo pradžią šešiems (8,4 %) tiriamiesiems jau buvo diagnozuo-

ta diabetinė nefropatija, patvirtinta objektyviais tyrimais. Vieni iš svarbiau-

sių kriterijų, vertinant diabetinius inkstų pažeidimus, yra albumino kiekis

paros šlapime, bei kreatinino ir šlapalo kiekis kraujyje. Jeigu albumino kie-

kis paros šlapime nuolat viršija 30 mg/24 val., galima įtarti prasidedančią

nefropatiją. Toliau progresuojant nefropatijai, padidėja šlapalo ir kreatinino

kiekis kraujyje. Tyrimo pradžioje 22,2 % tiriamųjų nustatyta padidėjusi

52

mikroalbuminurija (albumino kiekis paros šlapime > 30 mg/24 val), padi-

dėjęs šlapalo (> 7,1 mmol/l) ir kreatinino kiekis (vyrams > 113 µmol/l,

moterims > 91 µmol/l) kraujyje nustatytas maždaug 12 % tiriamųjų.

Tyrimo metu statistiškai reikšmingo mikroalbuminurijos skirtumo nei tarp

grupių, nei tarp skirtingų matavimų nenustatyta (3.2.2.1 lentelė). Nustatyta

tiesinė priklausomybė (r = 0,53, p < 0,001) tarp kreatinino ir šlapalo kiekio

didėjimo. Vertinant vidutinį šlapalo kiekį nei tarp grupių, nei tarp skirtingų

matavimų statistiškai reikšmingo skirtumo nepastebėta (3.2.2.1 lentelė).

Tuo tarpu kreatinino kiekio mažėjimo tendencija pastebėta visų grupių vy-

rams, tačiau tik dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktą vartojusių tiriamųjų

grupėje nustatytas statistiškai reikšmingas kreatinino kiekio sumažėjimas

po 18 mėn (p = 0,025), palyginti su pradiniais duomenimis (3.2.2.1 lente-

lė). Moterims kreatinino kiekis viso tyrimo metu nekito. Padidėjęs kreatini-

no kiekis siejamas su labiau pažengusia inkstų pažaida.

3.2.2.1 lentelė. Tiriamųjų grupių pacientų vidutinis albumino kiekis paros

šlapime bei vidutinis kreatinino ir šlapalo kiekis kraujyje, prieš pradedant

vartoti preparatus bei po 9 ir 18 mėn. preparatų vartojimo.

Grupė**

Tyrimo

pradžioje

(I)

Po 9 mėn.(II) Po 18

mėn.(III) p****

Albumin

o kiekis

paros

šlapime*,

mg/24val

EGB (n = 3) 31,69±9,2 58,38±23,9 46,44±18,3 p = 0,717

ECS (n = 3) 31,92±8,8 34,37±14,0 56,25±25,5 p = 0,717

Placebo

(n = 4)

21,11±1,7 22,38±2,8 28,46±12,1 p = 0,441

p*** p = 0,908 p = 0,750 p = 0,582

Šlapalo

kiekis*,

mmol/l

EGB

(n = 21)

5,65±0,3 5,99±0,4 5,49±0,3 p = 0,962

ECS

(n = 16)

5,39±0,5 4,95±0,3 4,61±0,4 p = 0,545

Placebo

(n = 24)

5,41±0,2 4,91±0,2 4,88±0,3 p = 0,376

p*** p = 0,651 1–2gr.

p = 0,026

1–3gr.

p = 0,032

2–3gr.

p = 0,766

1–2gr.

p = 0,030

1–3gr.

p = 0,155

2–3gr.

p = 0,185

53

3.2.2.1 lentelės tęsinys

Grupė**

Tyrimo

pradžioje

(I)

Po 9 mėn.(II) Po 18

mėn.(III) p****

Kreatinino

kiekis*,

µmol/l

(vyrų)

EGB

(n = 10)

93,17±7,2 85,75±7,5 74,3±4,1 I–II,

p = 0,155

I–III,

p = 0,025

II–III,

p = 0,138

ECS

(n = 4)

86,75±5,5 88,22±5,3 76,6±5,8 p = 0,936

Placebo

(n = 7)

86,43±4,1 82,14±5,6 80,0±4,2 p = 0,857

p*** p = 0,940 p = 0,660 p = 0,558

Kreatinino

kiekis*,

µmol/l

(moterų)

EGB

(n = 11)

80,86±4,4 82,71±5,0 86,55±7,6 p = 0,231

ECS

(n = 11)

77,0±5,9 73,91±5,0 77,36±6,1 p = 0,761

Placebo

(n = 17)

79,06±2,9 75,78±3,2 76,29±4,8 p = 0,410

p*** p = 0,543 p = 0,366 p = 0,369

*Albumino kiekis paros šlapime, norma: 0–30 mg/24 val; šlapalo kiekis, norma: 2,9–7,1

mmol/l; kreatinino kiekis, normos: vyrams 57–113 µmol/l, moterims 39–91 µmol/l.

**EGB – pacientų, vartojusių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules, grupė; ECS

– pacientų, vartojusių žaliosios arbatos ekstrakto kapsules, grupė; placebo – placebo

kapsules vartojusių pacientų grupė.

***grupių vidurkiai lyginti naudojant Kruskal-Wallis kriterijų. Jeigu gauta p < 0,05, toliau

vidurkiai tarp grupių porų lyginti naudojant Mann-Whitney kriterijų.

****tos pačios grupės vidurkiai tarp trijų skirtingų matavimų lyginti naudojant Friedman

kriterijų. Jei gauta p < 0,05, toliau vidurkiai tarp I–II, I–III ir II–III matavimų lyginti

naudojant Wilcoxon kriterijų.

Diabetinių inkstų pažeidimų progresavimui didelę įtaką turi hipertenzija

ir arterinio kraujospūdžio svyravimai. Padidėjęs kraujospūdis skatina laisvų-

jų radikalų susidarymą. Nors arterinė hipertenzija diagnozuota 71,8 % tiria-

mųjų, tačiau jų arterinis kraujospūdis buvo kontroliuojamas kraujospūdį

reguliuojančiais vaistais ir tyrimo metu buvo normos ribose [139]. Tyrimo

metu statistiškai reikšmingų arterinio kraujospūdžio svyravimų nenustatyta

(3.2.2.2 lentelė).

Tyrimų su CD sergančiais gyvūnais metu nustatyta, kad žaliosios arbatos

ekstraktas gali pagerinti inkstų funkciją [114], sumažinti kreatinino bei albu-

mino kiekį šlapime [113], tačiau panašaus pobūdžio tyrimų su 2 tipo CD

sergančiais pacientais nebuvo atlikta. Šio tyrimo rezultatai neparodė reikš-

mingo teigiamo žaliosios arbatos ekstrakto poveikio inkstų funkcijos rodik-

54

liams nei vartojant po vieną kapsulę du kartus per dieną (400 mg sausojo

žaliosios arbatos ekstrakto), nei vartojant po vieną kapsulę tris kartus per

dieną (600 mg sausojo žaliosios arbatos ekstrakto). Tam galėjo turėti įtakos

ir vyresnis pačių tiriamųjų amžius, ilga CD trukmė, padidėjęs HbA1c kiekis

bei greta esančios komplikacijos (diabetinė neuropatija, diabetinė retino-

patija) – visa tai atspindi ilgai trunkančią, pažengusią CD ligos eigą. Šie

pokyčiai turėjo įtakos ir vertinant dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto

poveikį. Anksčiau atlikti tyrimai, gydant ankstyvą diabetinę nefropatiją [58]

parodė teigiamą standartizuoto (24 % flavono glikozidų ir 6 % terpeno lak-

tonų) sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto poveikį tiek albumino,

tiek kreatinino bei šlapalo kiekio sumažėjimui. Šio tyrimo metu nustatytas

teigiamas dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto poveikis tik kreatinino kie-

kio mažėjimui vyrams, vartojant po vieną kapsulę tris kartus per dieną (t.y.

240 mg sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto).

3.2.2.2 lentelė. Tiriamųjų grupių pacientų vidutinis sistolinis (SKS) ir

diastolinis (DKS) kraujospūdis, prieš pradedant vartoti preparatus bei po 3,

6, 9, 12, 15 ir 18 mėn. preparatų vartojimo. Statistiškai reikšmingų skirtumų

nenustatyta, p > 0,05.

Grupė* EGB grupė ECS grupė Placebo grupė

0 mėn. (I) SKS 133,67±3,1 142,38±5,0 137,05±3,7

DKS 81,76±2,0 87,62±2,5 84,60±2,0

3 mėn. (II) SKS 145,48±4,3 138,69±4,1 138,55±3,6

DKS 85,86±2,7 86,31±3,3 83,55±2,1

6 mėn. (III) SKS 138,90±5,3 142,72±5,0 140,20±3,6

DKS 84,90±3,1 86,85±2,4 87,20±2,1

9 mėn. (IV) SKS 143,86±4,3 138,50±4,3 136,90±2,7

DKS 87,00±2,9 92,00±2,7 85,15±2,0

12 mėn. (V) SKS 148,48±4,2 138,08±3,5 140,65±4,5

DKS 89,19±2,1 89,31±2,3 87,55±2,4

15 mėn. (VI) SKS 140,9±4,4 134,77±3,4 136,40±4,1

DKS 84,67±2,1 86,15±2,2 84,55±1,6

18 mėn. (VII) SKS 139,5±3,4 131,92±2,5 140,40±4,1

DKS 86,38±5,7 82,46±1,7 85,00±1,9

*EGB – pacientų, vartojusių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules, grupė; ECS –

pacientų, vartojusių žaliosios arbatos ekstrakto kapsules, grupė; placebo – placebo kapsules

vartojusių pacientų grupė.

55

3.2.3. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio diabetinei akių pažaidai įvertinimas

Oftalmologinio tyrimo rezultatai pateikti 3.2.3.1 lentelėje.

3.2.3.1 lentelė. Tiriamųjų grupių pacientų kraujagyslinių pokyčių indekso

(KPI), intravaskulinių pokyčių indekso (IPI) ir perivaskulinių pokyčių indek-

so (PPI) vidurkiai, prieš pradedant vartoti preparatus bei po 9 ir 18 mėn.

preparatų vartojimo.

Grupė** Tyrimo

pradžioje (I)

Po 9

mėn.(II)

Po 18

mėn.(III) p****

KP

I*

EGB (n = 16) 10,41±0,38 9,41±0,38 9,58±0,42 I–II, p = 0,007

I–III, p = 0,016

II–III, p = 0,642

ECS (n = 13) 10,05±0,42 9,63±0,42 9,29±0,49 p = 0,341

Placebo

(n = 14)

9,28±0,37 9,11±0,42 8,82±0,45 p = 0,205

p*** p = 0,124 p = 0,428 p = 0,257

IPI*

EGB (n = 16) 8,0±0,18 8,13±0,18 7,95±0,21 p = 0,472

ECS (n = 13) 7,89±0,21 8,21±0,21 8,29±0,24 p = 0,519

Placebo

(n = 14)

8,28±0,18 8,21±0,21 8,47±0,22 p = 0,879

p*** p = 0,580 p = 0,953 p = 0,175

PP

I*

EGB (n = 16) 2,54±0,18 2,04±0,18 1,79±0,2 I–II, p = 0,039

I–III, p = 0,004

II–III, p = 0,001

ECS (n = 13) 2,47±0,2 2,16±0,2 2,07±0,23 p = 0,053

Placebo

(n = 14)

2,32±0,17 1,74±0.2 1,88±0,21 p = 0,267

p*** p = 0,604 p = 0,276 p = 0,459

*KPI norma: 3,464–4,236; IPI norma: 2,607–3,193; PPI norma: 0,415–0,685.

**EGB – pacientų, vartojusių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules, grupė;

ECS – pacientų, vartojusių žaliosios arbatos ekstrakto kapsules, grupė; placebo – placebo

kapsules vartojusių pacientų grupė.

***grupių vidurkiai lyginti naudojant Kruskal-Wallis kriterijų.

****tos pačios grupės vidurkiai tarp trijų skirtingų matavimų lyginti naudojant Friedman

kriterijų. Jei gauta p < 0,05, toliau vidurkiai tarp I–II, I–III ir II–III matavimų lyginti

naudojant Wilcoxon kriterijų.

Tyrimo metu vertinti kraujagyslių pokyčiai (arteriolių, venulių bei kapi-

liarų spindis, vingiuotumas; aneurizmos), intravaskuliniai pokyčiai (kraujo-

taka, eritrocitų agregacija, ištuštėję kapiliarai) bei perivaskuliniai pokyčiai

(paburkimas, hemoragijos, lipidų ir hemosiderino atsidėjimas) (Priedas

Nr. 2). Apskaičiuoti šių pokyčių indeksai bei bendras (suminis) junginės

kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių indeksas. Diabetinė retinopatija bu-

56

vo diagnozuota tik 21,2 % tiriamųjų, prieš pradent dalyvauti tyrime. Tačiau

tyrimo pradžioje visiems tiriamiesiems, nepriklausomai nuo to, kiek laiko

serga cukriniu diabetu, nustatyti akies junginės mikrocirkuliacijos pokyčiai,

bendras junginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių indekso vidurkis –

20,40±0,4 (beveik tris kartus didesnis nei norma).

Vertinant tiriamų ekstraktų poveikį akies junginės mikrocirkuliacijai

reikšmingo poveikio, palyginti su placebu, nenustatyta. Tačiau nustatytas

statistiškai reišmingas kraujagyslinių pokyčių indekso ir perivaskulinių

pokyčių indekso sumažėjimas dviskiaučių ginkmedžių lapų esktrakto kapsu-

les vartojusių pacientų grupėje po 9 ir 18 mėn. preparato vartojimo, palygin-

ti su duomenimis tyrimo pradžioje. Tai parodo teigiamą šio preparato povei-

kį kraujagyslių pokyčiams (arteriolių, venulių bei kapiliarų spindžiui, vin-

giuotumui, aneurizmoms) bei perivaskuliniams akies junginės pokyčiams

(paburkimo, hemoragijų atsiradimui, hemosiderino ir lipidų atsidėjimui).

Suskaičiavus bendrą junginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių

indeksą, pastebėta šio indekso mažėjimo tendencija visose tiriamųjų grupėse

(3.2.3.1 pav.), tačiau tik EGB grupėje šis sumažėjimas buvo statistiškai

reikšmingas. Sausąjį dviskiaučių ginkmedžių ekstraktą vartojusių pacientų

grupėje bendras junginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių indeksas

po 9 mėn. sumažėjo 1,38 balo (p = 0,003), po 18 mėn. dar 0,26 balo

(p = 0,059) palyginti su duomenimis po 9 mėn. arba 1,64 balo (p = 0,003)

palyginti su duomenimis tyrimo pradžioje. Analizuojant tyrimo rezultatus,

pastebėta tendencija, kad sausasis dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktas

normalizuoja akies junginės arteriolių, venulių, kapiliarų spindį, mažina

aneurizmų, paburkimo, hemoragijų atsiradimą, hemosiderino ir lipidų atsi-

dėjimą, tačiau, kad patvirtinti šį poveikį tikslinga atlikti tolimesnius tyrimus

su didesne tiriamųjų apimtimi. Pacientams, sergantiems diabetine retinopa-

tija, padidėja endotelio ląstelių pralaidumas, kuris gali sukelti tinklainės

sustorėjimą, edemą, hemoragijas, dėl ko prarandamas regėjimo aštrumas

[121]. Teigiamas EGB poveikis, esant diabetinei retinopatijai, siejamas su

flavonoidų antioksidacinėmis savybėmis bei geba neutralizuoti laisvuosius

radikalus ir mažinti lipidų peroksidaciją [121]. Svarbų vaidmenį atlieka ir

EGB terpenoidai, kurie pagerina reologinius kraujo parametrus (kraujo

klampumą, kraujagyslių elastingumą, kraujo tėkmės greitį) [54], todėl page-

rėja tinklainės kraujotaka [43, 120].

Sausąjį žaliosios arbatos ekstraktą vartojusių pacientų grupėje reikšmingų

skirtumų nei tarp skirtingų matavimų, nei palyginti su placebo grupe nenus-

tatyta. Literatūros duomenimis ECS gali būti reikšmingas graužikams, esant

diabetinei retinopatijai [109, 110, 118], tačiau statistiškai reikšmingų duo-

57

menų apie teigiamą ECS poveikį diabetinės retinopatijos rodikliams 2 tipo

CD sergantiems pacientams nėra.

3.2.3.1 pav. Tiriamųjų grupių pacientų bendro junginės kraujagyslių

mikrocirkuliacijos pakitimų indekso (BJKMPI) vidurkiai tyrimo metu. EGB grupė – pacientai, vartoję dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules (n = 16),

ECS grupė – pacientai, vartoję žaliosios arbatos ekstrakto kapsules (n = 13), Placebo

grupė – placebo kapsules vartoję pacientai (n = 14). Tyrimo metu reikšmingo BJKMPI

skirtumo tarp grupių nenustatyta (vidurkiai lyginti naudojant Kruskal-Wallis kriterijų, p >

0,05). EGB grupėje BJKMPI reikšmingai mažėjo (vidurkiai tyrimo pradžioje, po 9 ir po 18

mėn. lyginti naudojant Friedman kriterijų, p = 0,001).

3.2.4. Žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų poveikio diabetinei nervinio audinio pažaidai įvertinimas

Prieš pradedant tyrimą, diabetinė neuropatija, patvirtinta objektyviais

tyrimais, jau buvo diagnozuota 91,5 % tirimųjų. Diabetinė neuropatija yra

viena dažniausių cukrinio diabeto komplikacijų. Yra žinoma, kad 2 tipo

cukrinis diabetas pasireiškia palaipsniui be ryškių simptomų, todėl diagno-

zė nustatoma pavėluotai. Literatūros duomenimis daugiau nei 7,5–10 %

pacientų, jau diagnozavus 2 tipo cukrinį diabetą, nustatoma ši komplikacija

[140, 141]. Diabetinės neuropatijos dažnis didėja priklausomai nuo ti-

riamųjų amžiaus, HbA1c kiekio bei CD trukmės [142]. Mūsų tyrime

dalyvavo vyresnio amžiaus pacientai, ilgai sergantys CD (vidutiniškai

58

10,87±0,9 metų), kuriems nustatyti ryškūs diabetiniai pokyčiai (remiantis

medicininių dokumentų duomenimis).

Tyrimo pradžioje 49,3 % tiriamųjų teigiamai atsakė į daugiau nei pusę

Mičigano klausimyno klausimų (3.2.4.1 pav.). Tyrimo metu, nepriklauso-

mai nuo vartoto preparato, stebėta teigiama dinamika atsakant į klausimus

„a“ (Ar tirpsta jūsų kojos arba pėdos?), „d“ (Ar jums būna mėšlungis kojo-

se arba pėdose?) ir „j“ (Ar jūs jaučiate silpnumą didesnę paros dalį?).

3.2.4.1 pav. Tiriamųjų pacientų atsakymai į Mičigano

klausimyno klausimus, tyrimo pradžioje. Klausimų raidžių reikšmės 3 priede.

Vertindami paviršinius jutimus, statistiškai reikšmingų skirtumų nei tarp

grupių, nei tyrimo metu tarp skirtingų matavimų nenustatyta (3.2.4.1 len-

telė).

Diabetinei neuropatijai būdingas deginantis skausmas kojose. Tyrimo

pradžioje 49,3 % tiriamųjų jautė skausmą kojose (vidutiniškai 1,87±0,3

stiprumo), o skausmo intensyvumas balais ≥ 6 (t.y. deginantis skausmas)

nustatytas 7,04 % sergančiųjų diabetu. Tyrimo pradžioje kojų skausmo

intensyvumas balais EGB ir ECS pacientų grupėse buvo reikšmingai dides-

nis nei placebo grupėje (p < 0,05). Pastebėta tendencija, kad preparatus var-

tojusių tiriamųjų grupėse skausmo intensyvumas mažėjo, nors ir statistiškai

nereikšmingai. Tuo tarpu placebą vartojusių tiriamųjų grupėje pastebėta

59

skausmo intensyvumo didėjimo tendencija. Skausmo intensyvumo kitimo

kaita tyrimo metu pateikta 3.2.4.2 pav.

3.2.4.1 lentelė. Procentinė visų tiriamųjų dalis, kuriems nustatytas monofi-

lamento, paviršinių ir temperatūrinių jutimų pėdose sutrikimas, prieš pra-

dedant vartoti preparatus bei po 9 ir 18 mėn. preparatų vartojimo. Statistiš-

kai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p > 0,05. Tyrimas Tyrimo

pradžioje

Po 9 mėn. Po 18 mėn.

Monofilamentas 31,4 % 32,1 % 31,1 %

Paviršiniai

jutimai

32,2 % 32,7 % 31,8 %

Temperatūriniai

jutimai

42,8 % 42,35 % 44,1 %

3.2.4.2 pav. Tiriamųjų grupių pacientų kojų skausmo intensyvumo (balais)

vidurkiai tyrimo metu. EGB grupė – pacientai, vartoję dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules (n = 12),

ECS grupė – pacientai, vartoję žaliosios arbatos ekstrakto kapsules (n = 7), Placebo grupė

– placebo kapsules vartoję pacientai (n = 9). Tyrimo pradžioje nustatytas reikšmingas kojų

skausmo intensyvumo skirtumas tarp preparatus vartojusių ir placebo grupės (vidurkiai

lyginti naudojant Kruskal-Wallis kriterijų, p < 0,05).

Vibracinio jutimo slenksčio (VJS) kojose kitimas tyrimo metu pateiktas

3.2.4.3 pav. Remiantis vibracinio jutimo slenksčio tyrimu, tyrimo pradžioje

26,8 % tiriamųjų nustatytas vibracinio jutimo slenkstis ≥ 25 V (vidutinis

60

VJS buvo 25,29±1,4 V). Statistiškai reikšmingas vibracinio jutimo slenksčio

mažėjimas stebėtas žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų eks-

traktus vartojusių pacientų grupėse. Teigiamas EGB poveikis vibracinio ju-

timo slenksčio mažėjimui nustatytas, tiek po 9 mėn. (vartojant po 160 mg

sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto per dieną), tiek po 18 mėn.

(pirmus 9 mėn. vartojant po 160 mg sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų

ekstrakto per dieną, sekančius 9 mėn. – po 240 mg per dieną), palyginti su

duomenimis tyrimo pradžioje (vidurkiai tarp skirtingų matavimų lyginti

naudojant Wilcoxon kriterijų, p = 0,01). Žaliosios arbatos ekstraktą vartoju-

sių pacientų grupėje reikšmingas skirtumas nustatytas tik po 18 mėn. (pir-

mus 9 mėn. vartojant po 400 mg sausojo žaliosios arbatos ekstrakto per

dieną, sekančius 9 mėn. – po 600 mg per dieną) (vidurkiai tyrimo pradžioje

ir po 18 mėn. lyginti naudojant Wilcoxon kriterijų, p = 0,04). Kadangi vibra-

cinio jutimo slenkstis ECS grupėje tolygiai mažėjo viso tyrimo metu, tai

galime teigti kad teigiamą žaliosios arbatos ekstrakto poveikį lėme ne tik di-

desnė koncentracija, bet ir ilgalaikis šio preparato vartojimas.

3.2.4.3 pav. Tiriamųjų grupių pacientų vibracinio jutimo slenksčio (VJS)

vidurkiai tyrimo metu. EGB grupė – pacientai, vartoję dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules (n = 12),

ECS grupė – pacientai, vartoję žaliosios arbatos ekstrakto kapsules (n = 7), Placebo grupė

– placebo kapsules vartoję pacientai (n = 9). Tyrimo metu reikšmingo skirtumo tarp grupių

nenustatyta (vidurkiai lyginti naudojant Kruskal-Wallis kriterijų, p > 0,05). EGB ir ECS

grupėse VJS reikšmingai mažėjo (vidurkiai tyrimo pradžioje, po 9 ir po 18 mėn. lyginti

naudojant Friedman kriterijų, p < 0,05).

61

Nors teigiamo EGB poveikio diabetinei nervinio audinio pažaidai mecha-

nizmas nėra žinomas, tačiau manoma, kad EGB mažina kraujo klampumą

(teigiamai veikia reologines eritrocitų bei leukocitų savybes, slopina trom-

bocitų agregaciją), tokiu būdu pagerina mikrocirkuliaciją [34, 54, 56]. Tyri-

mai su žiurkėmis parodė, kad EGB slopina oksidacinį stresą, todėl mažėja

neuropatinio skausmo intensyvumas [143]. Literatūros šaltinių duomenų

apie EGB ar ECS poveikį diabetine neuropatija sergantiems pacientams

nėra. Šiame tyrime statistiškai reikšmingo EGB ir ECS poveikio diabetinei

nervinio audinio pažaidai, palyginti su placebu, nenustatyta.

3.3. Oksidacinio streso rodiklių įvertinimas pacientų, sergančių 2

tipo cukriniu diabetu, kraujo plazmoje

Sergant cukriniu diabetu, hiperglikemija pati savaime skatina aktyvių de-

guonies formų susidarymą [93, 96, 97]. Tokie faktoriai, kaip rūkymas, nutu-

kimas, fizinio aktyvumo trūkumas, hipertenzija, ilga CD trukmė ir vyresnis

pačių sergančiųjų amžius taip pat lemia oksidacinio streso intensyvumą.

Oksidacinis stresas, savo ruožtu, blogina CD eigą, skatina CD sukeliamų pa-

žeidimų plitimą ir CD komplikacijų progresavimą. Siekiant įvertinti CD ser-

gančių pacientų patiriamą oksidacinį stresą, nustatytas antioksidacinių fer-

mentų aktyvumas, atlikta oksidacinės pažaidos (lipidų peroksidacijos)

rodiklių kiekybinė analizė. Taip pat įvertintas bendra antioksidacinė orga-

nizmo raiška ir vitamino E koncentracija. Tyrimo metu (prieš pradedant var-

toti preparatus bei praėjus 9 ir 18 mėnesių nuo preparatų vartojimo pradžios)

vertintų tiriamų grupių pacientų kraujo plazmos oksidacinio streso rodikliai

pateikti 3.3.1 lentelėje.

3.3.1 lentelė. Tiriamųjų grupių pacientų kraujo plazmos oksidacinio streso

rodiklių vidurkiai, prieš pradedant vartoti preparatus bei po 9 ir 18 mėn.

preparatų vartojimo.

Grupė** Tyrimo

pradžioje (I) Po 9 mėn.

(II) Po 18 mėn.

(III) p****

SO

D*

(U/g

Hb

)

EGB

(n = 19) 1390,50±24,0 1499,50±23,4 1463,00±39,3 I–II, p = 0,001

I–III, p = 0,064

II–III, p = 0,324 ECS

(n = 15) 1360,75±31,5 1450,05±39,1 1410,75±32,9 I–II, p = 0,022

I–III, p = 0,163

II–III, p = 0,156 Placebo

(n =23) 1406,20±27,9 1487,24±25,8 1464,04±29,8 I–II, p = 0,01

I–III, p = 0,042

II–III, p = 0,761

p*** p = 0,590 p = 0,683 p = 0,438

62

3.3.1 lentelės tęsinys.

Grupė** Tyrimo

pradžioje (I) Po 9 mėn.(II) Po 18 mėn.

(III) p****

CA

T*

(k/g

Hb

)

EGB

(n = 17)

215,77±14,1 200,88±9,4 222,61±11,5 I–II, p = 0,375

I–III, p = 0,679

II–III, p = 0,022

ECS

(n = 16)

229,05±16,6 219,11±14,1 237,82±15,8 p = 0,472

Placebo

(n =23) 211,75±14,5 242,48±13,7 206,04±16,5 I–II, p = 0,093

I–III, p = 0,749

II–III, p = 0,017

p*** p = 0,661 p = 0,079 p = 0,093

GP

x*

(U/l

)

EGB

(n = 18) 6734,35

±427,2 7146,46

±369,1 6077,44

±528,3 p = 0,946

ECS

(n = 16) 6971,05

±448,7 7586,80

±640,8 6561,19

±390,0 p = 0,269

Placebo

(n =21) 6398,28

±392,9 7311,70

±422,2 6787,78

±348,4 p = 0,097

p*** p = 0,541 p = 0,999 p = 0,743

TA

S*

(mm

ol/

l)

EGB

(n = 19) 1,59±0,03 1,56±0,07 1,66±0,05 p = 0,602

ECS

(n = 15) 1,64±0,03 1,67±0,04 1,66±0,03 p = 0,936

Placebo

(n = 23) 1,54±0,03 1,67±0,04 1,60±0,04 p = 0,153

p*** p = 0,171 p = 0,450 p = 0,332

Vit

am

ina

s E

*

(µg

/ml)

EGB

(n = 19) 13,88±0,9 12,60±0,6 13,21±1,5 p = 0,331

ECS

(n = 16) 13,41±1,0 13,58±1,1 13,96±1,3 p = 0,814

Placebo

(n = 22) 15,81±0,9 13,18±0,8 12,03±0,7 I–II, p = 0,004

II–III, p = 0,037

I–III, p < 0,001 p*** p = 0,125 p = 0,908 p = 0,341

63

3.3.1 lentelės tęsinys. Grupė** Tyrimo

pradžioje (I) Po 9 mėn.(II) Po 18 mėn.(III) p****

MD

A*

(µM

)

EGB

(n = 19) 1,75±0,09 1,62±0,10 1,32±0,11 I–II, p = 0,228

I–III, p = 0,005

II–III, p = 0,084 ECS

(n = 15) 1,81±0,15 1,51±0,09 1,62±0,19 I–II, p = 0,022

I–III, p = 0,047

II–III, p = 0,605 Placebo

(n = 23) 1,84±0,26 1,68±0,10 1,89±0,25 p = 0,232

p*** p = 0,790 p = 0,630 1–2gr. p = 0,071

1–3gr. p = 0,018

2–3gr. p = 0,368

4-H

NE

*

(µM

)

EGB

(n = 17) 4,78±0,61 4,32±0,50 3,85±0,57 p = 0,120

ECS

(n = 15) 4,36±0,79 4,58±0,74 4,54±0,49 p = 0,282

Placebo

(n = 20) 6,51±1,09 5,69±0,53 5,01±0,65 p = 0,157

p*** p = 0,392 p = 0,137 p = 0,337

LO

OH

*

(µM

)

EGB

(n = 20) 7,38±0,53 5,06±0,34 6,19±0,71 I–II, p = 0,001

I–III, p = 0,218

II–III, p = 0,277 ECS

(n = 16) 7,80±0,82 6,54±0,54 7,31±1,35 p = 0,144

Placebo

(n = 22) 8,58±1,08 7,24±0,64 7,26±0,88 p = 0,873

p*** p = 0,930 1–2gr.

p = 0,034

1–3gr.

p = 0,009

2–3 gr.

p = 0,509

p = 0,843

*SOD – superoksido dismutazė, norma: 1102–1601U/g Hb; CAT – katalazė, norma: 140–

360 k/g Hb; GPx – glutationo peroksidazė, norma: 4171–10881 U/l; TAS – bendra

antioksidacinė raiška, norma:1,30–1,77 mmol/l; vitamino E norma: 5–16 µg/ml; MDA –

malondialdehidas, norma: < 1,53 µM, 4-HNE – 4-hidroksinonenalis, norma: < 3,72 µM;

LOOH – lipidų hidroperoksidai, norma: < 12,7 µM.

**EGB – pacientų, vartojusių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto kapsules, grupė; ECS

– pacientų, vartojusių žaliosios arbatos ekstrakto kapsules, grupė; placebo – placebo

kapsules vartojusių pacientų grupė.

*** grupių vidurkiai lyginti naudojant Kruskal-Wallis kriterijų. Jeigu gauta p < 0,05, toliau

vidurkiai tarp grupių porų lyginti naudojant Mann-Whitney kriterijų.

****tos pačios grupės vidurkiai tarp trijų skirtingų matavimų lyginti naudojant Friedman

kriterijų. Jei gauta p < 0,05, toliau vidurkiai tarp I–II, I–III ir II–III matavimų lyginti

naudojant Wilcoxon kriterijų.

64

Tyrimo pradžioje visų pacientų kraujo plazmos pavyzdžiuose nustatytas

padidėjęs MDA ir 4-HNE kiekis. Tačiau endogeninės antioksidacinės ap-

saugos sistemos aktyvumas, kaip atsakas į padidėjusią lipidų peroksidaciją,

nebuvo padidėjęs. Tai patvirtina hipotezę, kad sergant cukriniu diabetu,

vyksta intensyvus aktyvių deguonies formų susidarymas ir lipidų peroksi-

dacija. Nors antioksidacinių fermentų aktyvumas buvo normos ribose,

tačiau visų tiriamųjų kraujo plazmos pavyzdžiuose nustatytas sumažėjęs

seleno, kuris būtinas GPx veikimui, kiekis (normalus seleno kiekis – 80–120

µg/l). Jo koncentracija tyrimo pradžioje buvo 75,50±2,7 µg/l EGB grupėje,

78,50±3,7 µg/l ECS grupėje ir 77,52 ± 3,2 µg/l placebo grupėje.

Vertinant oksidacinio streso rodiklius tarp tiriamųjų, vartojusių placebą ir

žaliosios arbatos ar dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktus, statistiškai

reikšmingo skirtumo nebuvo (išskyrus LOOH kiekio sumažėjimas po

9 mėn., bei MDA kiekio sumažėjimas tyrimo pabaigoje). Tačiau nustatyti

kai kurie reikšmingi kitimai grupėse po 9 bei 18 mėn. preparatų vartojimo

palyginti su duomenimis tyrimo pradžioje. Buvo pastebėta SOD aktyvumo

didėjimo tendencija visose tiriamųjų grupėse, nors EGB ir ECS grupėse

SOD aktyvumas reikšmingai padidėjo tik po 9 mėn., o toliau išliko nepaki-

tęs. Tuo tarpu placebo grupėje SOD aktyvumas didėjo viso tyrimo metu,

tiek po 9, tiek po 18 mėn. CAT aktyvumas reikšmingai padidėjo EGB gru-

pėje, tuo tarpu placebo grupėje tyrimo pabaigoje jis reikšmingai sumažėjo

palyginus su duomenimis po 9 mėn. GPx aktyvumas išliko be statistiškai

reikšmingų pakitimų viso tyrimo metu. Remiantis literatūros duomenimis,

tiek žaliosios arbatos ekstraktas [4], tiek dviskiaučių ginkmedžių lapų

ekstraktas [39, 144] gali lemti antioksidacinių fermentų aktyvumą, tačiau

šiame tyrime tokio šių ekstraktų kapsulių poveikio, palyginti su placebu,

nenustatyta.

Nors vitamino E kiekis viso tyrimo metu buvo normos ribose, tačiau

pastebėtas reikšmingas vitamino E kiekio sumažėjimas placebą vartojusių

tiriamųjų grupėje tiek po 9 mėn., tiek po 18 mėn. palyginti su pradiniais

duomenimis (p < 0,05). Tai leidžia manyti, kad placebą vartojusių pacientų

organizme kovai su laisvaisiais radikalais buvo intensyviau naudojamos

endogeninės antioksidantų atsargos. Tuo tarpu EGB ir ECS vartojusių pa-

cientų grupėse antioksidacinė ląstelės apsaugos sistema buvo “papildyta”

augaliniais antioksidantais, todėl po 18 mėnesių vitamino E atsargos reikš-

mingai nesumažėjo.

Tyrimo metu nustatytas reikšmingas MDA ir LOOH kiekio sumažėjimas

sausąjį dviskiaučių ginkmedžių ekstraktą vartojusių pacientų grupėje. Praė-

jus 9 mėn., po preparatų vartojimo pradžios nustatytas teigiamas šio ekstrak-

to poveikis LOOH kiekio mažėjimui (p = 0,009), o po 18 mėn. reikšmingai

65

sumažėjo MDA kiekis (p = 0,018) palyginti su placebo grupe. Reikšmingos

EGB ir ECS įtakos kitų lipidų peroksidacijos rodiklių mažėjimui, palyginti

su placebo grupe, nenustatyta. Tačiau pastebėta MDA ir LOOH kiekio

mažėjimo tendencija antioksidantus vartojusių pacientų grupėse, lyginant

duomenis tarp atskirų matavimų. Vartojant sausąjį dviskiaučių ginkmedžių

lapų ekstraktą po 160 mg per dieną sumažėjo LOOH kiekis (p = 0,001)

palyginti su duomenimis tyrimo pradžioje. MDA kiekis EGB grupėje reikš-

mingai sumažėjo po 18 mėn. (p = 0,005), t. y. vartojant po 240 mg sausojo

dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto per dieną. ECS sumažino MDA kiekį

nepriklausomai nuo koncentracijos – statistiškai reikšmingas skirtumas nu-

statytas tiek vartojant po 400 mg sausojo žaliosios arbatos ekstrakto (po 9

mėn.) (p = 0,022), tiek vartojant po 600 mg sausojo žaliosios arbatos

ekstrakto per dieną (po 18 mėn.) (p = 0,047), palyginti su duomenimis

tyrimo pradžioje. Reikšmingo 4-HNE kiekio kitimo nenustatyta. Šie

rezultatai neprieštarauja anksčiau atliktiems tyrimams, kurių metu nustatytas

MDA kiekio mažėjimas, vartojant ECS ar EGB ekstraktus [4, 50, 115].

Tačiau kitų mokslininkų aprašytas teigiamas vartojamų ekstraktų poveikis

TAS didėjimui [13, 40] mūsų tyrime nenustatytas. Žaliosios arbatos ir

dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktai tiesiogiai suriša laisvuosius radika-

lus [6, 12, 41], tokiu būdu sumažėja laisvųjų radikalų kiekis bei žalingas jų

poveikis, mažiau susidaro lipidų peroksidacijos produktų. Apibendrinant

rezultatus, galime teigti, kad žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių

lapų sausieji ekstraktai slopina lipidų peroksidacijos procesus organizme

(nustatytas teigiamas tirtų ekstraktų poveikis MDA kiekio mažėjimui).

Žaliosios arbatos ekstrakto įtaka osidacinio streso rodiklių kitimui apra-

šyta straipsnyje „Antioxidant effects of Camellia sinensis L. extract in

patients with type 2 diabetes” (Priedas Nr.5).

3.4. Prognozuojamos žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių

lapų sausųjų ekstraktų įtakos oksidacinio streso rodiklių kitimui

bei akių, nervinio audinio ir inkstų pažaidai įvertinimas

Analizuojant žaliosios arbatos ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų

ekstraktų įtaką oksidacinio streso rodiklių kitimui bei akių, nervinio audinio

ir inkstų pažaidai, atlikta žingsninė daugianarė logistinė regresinė analizė. Į

regresijos modelį įtraukėme tuos oksidacinio streso bei akių, nervinio audi-

nio ir inkstų pažaidos rodiklius, kuriems tirti ekstraktai turėjo įtakos lygina-

mojoje analizėje bei remiantis mūsų tyrimo rezultatų koreliacine analize.

Nustatyta, kad svarbiausi parametrai, kuriems (prognozuojama) žaliosios

arbatos sausasis ekstraktas turės įtakos, yra perivaskulinių pokyčių indeksas

66

(3,5 karto didesnis nei vartojant placebą), vitamino E kiekis (1,5 kartus di-

desnis vartojant žaliosios arbatos ekstraktą palyginti su placebo vartojimu),

bendras junginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių indeksas (1,2 kar-

to didesnis nei vartojant placebą) bei superoksido dismutazės aktyvumas

(1,2 karto mažesnis nei vartojant placebą) (3.4.1 lentelė).

3.4.1 lentelė. Galimybė, kad sausojo žaliosios arbatos ekstrakto vartojimas

turės teigiamos įtakos oksidacinio streso, akių, nervinio audinio bei inkstų

pažaidos rodiklių kitimui, palyginti su placebu (žingsninė daugianarė logis-

tinė regresija). Rodiklis GS 95 % PI p

PPI 3,575 1,383–13,332 0,026

BJKMPI 1,232 1,063–1,992 0,023

SOD 1,191 1,082–3,614 0,047

CAT 1,017 1,001–1,035 0,042

GPx 1,090 1,009–3,001 0,029

Vit E 1,527 1,087–2,722 0,015

PPI – perivaskulinių pokyčių indeksas, BJKMPI – bendras junginės kraujagyslių

mikrocirkuliacijos pokyčių indeksas, SOD – superoksido dismutazė, CAT – katalazė, GPx

– glutationo peroksidazė, Vit E – vitaminas E, GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinis

intervalas.

3.4.2 lentelė. Galimybė, kad sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto

vartojimas turės teigiamos įtakos oksidacinio streso, akių, nervinio audinio

bei inkstų pažaidos rodiklių kitimui, palyginti su placebu (žingsninė daugia-

narė logistinė regresija). Rodiklis GS 95 % PI p

IPI 1,241 1,057–1,213 0,032

PPI 1,255 1,028–2,310 0,022

BJKMPI 2,488 1,102–5,613 0,028

GPx 1,320 1,399–2,257 0,019

IPI – intravaskulinių pokyčių indeksas, PPI – perivaskulinių pokyčių indeksas, BJKMPI –

bendras junginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių indeksas, GPx – glutationo

peroksidazė, GS – galimybių santykis, PI – pasikliautinis intervalas.

Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas turės įtakos bendro jun-

ginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių indeksui (2,5 karto didesnis),

glutationo peroksidazės aktyvumui (1,3 karto mažesnis), perivaskulinių po-

kyčių indeksui (1,3 karto mažesnis) ir intravaskulinių pokyčių indeksui (1,2

karto mažesnis), palyginti su placebo vartojimu (3.4.1 lentelė). Remiantis

logistinės regresinės analizės bei lyginamosios analizės rezultatais galime

teigti, kad žaliosios arbatos vartojimais turėtų teigiamą poveikį tik vitamino

E kiekio kitimui, tai yra vartojusių šį ekstraktą pacientų grupėje vitamino E

67

kiekis būtų 1,2 karto didesnis nei placebo vartojusių pacientų grupėje. Tuo

tarpu dviskiaučių ginkmedžių sausojo ekstrakto vartojimas turės teigiamą

poveikį tik akies junginės intravaskulinių ir perivaskulinių pokyčių indek-

sams, atitinkamai 1,2 ir 1,3 karto mažesnis vartojant šį ekstraktą palyginti su

placebą vartojusiais.

3.5. Rezultatų apibendrinimas

Žaliosios arbatos sausojo ekstrakto antioksidacinį aktyvumą lemia kate-

chinai [5, 10, 12, 20]. Tačiau tyrimai, vertinantys dviskiaučių ginkmedžių

lapų ekstrato ir veikliųjų junginių antioksidacinį aktyvumą, labai priešta-

ringi. Remiantis literatūros duomenimis, EGB terpenoidai neturi antiradika-

linių bei lipidų peroksidaciją slopinančių savybių, o antioksidacinis ekstrak-

to aktyvumas priklauso nuo į jo sudėtį įeinančių flavonoidų [34, 38, 39, 42].

Yra duomenų, kad terpenoidai gali sustiprinti antioksidacinį flavonoidų

aktyvumą [42, 43]. Flavonoidai dalyvauja tam tikrose oksidacijos, reduk-

cijos, metilinimo, gliukuronizacijos, sulfoninimo reakcijose in vivo, o susi-

darę metabolitai prisideda prie bendro dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrak-

to poveikio in vivo [43]. Todėl šiame tyrime nustatyta pagrindinių biologiš-

kai aktyvių junginių, kurie (literatūros duomenimis) lemia tiriamų kapsulių

antioksidacinį aktyvumą, geba surišti laisvuosius DPPH radikalus. Nustaty-

tas suminis žaliosios arbatos katechinų (katechino, epikatechino, epigalo-

katechino, epikatechino galato ir epigalokatechino galato) aktyvumas

457,14 mg/g, išreikštas troloksui ekvivalentiška antioksidacine geba, o

dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto flavonoidų (kvercetino,

kemferolio ir izoramnetino) aktyvumas, išreikštas troloksui ekvivalentiška

antioksidacine geba – 40,76 mg/g. Remiantis šiais duomenimis, galima būtų

teigti, kad žaliosios arbatos ekstrakto katechinai turi stipresnių antioksida-

cinių savybių nei dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto flavonoidų frakcija.

Vertinant šių ekstraktų antioksidacinį poveikį in vivo (2 tipo CD sergan-

tiems pacientams) – tiek dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktas, tiek žalio-

sios arbatos ekstraktas turėjo antioksidacinių savybių. Nustatytas reikšmin-

gas MDA kiekio sumažėjimas EGB grupėje po 18 mėn. preparato vartojimo

(pirmus 9 mėn. vartojant po 160 mg sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų

ekstrakto per dieną, sekančius 9 mėn. – po 240 mg) ir ECS grupėje po

9 mėn. preparato vartojimo (vartojant po 400 mg per dieną) bei po 18 mėn.

(pirmus 9 mėn. vartojant po 400 mg sausojo žaliosios arbatos ekstrakto per

dieną, sekančius 9 mėn. – po 600 mg per dieną) palyginti su duomenimis

tyrimo pradžioje. Vartojant dviskiaučių ginkmedžių lapų sausąjį ekstraktą

(po 160 mg per dieną), po 9 mėn. reikšmingai sumažėjo ir LOOH kiekis.

68

Taip pat nustatytas teigiamas EGB kapsulių poveikis LOOH kiekio mažėji-

mui po 9 mėn., bei MDA kiekio mažėjimui po 18 mėn, palyginti su placebo

grupe. Tačiau reikšmingos šių preparatų įtakos nei bendrai antioksidacinei

raiškai, nei 4-HNE kiekio kitimui nenustatyta. MDA ir LOOH yra laisvųjų

radikalų pertekliaus sukeltos lipidų peroksidacijos produktai, todėl jų kiekio

mažėjimas atspindi teigiamą šių ekstraktų poveikį lipidų peroksidacijos

procesų slopinimui. Remiantis ankstesniais tyrimais in vitro bei in vivo su

graužikais, minėti ekstraktai gali mažinti organizmo patiriamą oksidacinį

stresą tiesiogiai inaktyvindami aktyvias deguonies formas bei netiesiogiai

skatindami antioksidacinių fermentų gamybą [4, 6, 12, 39, 41]. Šiame

tyrime pastebėjome kai kurias antioksidacinių fermentų (SOD, CAT, GPx)

aktyvumo kitimo tendencijas atskirose tiriamųjų grupėse skirtingais tyrimų

etapais, tačiau daryti išvados apie teigiamą žaliosios arbatos ir dviskiaučių

ginkmedžių lapų ekstraktų poveikį minėtų fermentų aktyvumo didėjimui

negalime, nes reikšmingo skirtumo, palyginti su placebo grupe, nenustatyta.

Literatūros duomenimis, vartojant šiuos ekstraktus didėja bendra antioksi-

dacinė raiška [13, 40], mažėja MDA kiekis kraujo serume [50, 115]. Savo

tyrime taip pat pastebėjome vitamino E kiekio mažėjimo tendenciją placebą

vartojusių tiriamųjų grupėje. Galime daryti prielaidą, kad placebą vartojusių

pacientų organizme kovai su laisvaisiais radikalais buvo intensyviau naudo-

jamos endogeninės antioksidantų atsargos. Tuo tarpu žaliosios arbatos ir

dviskiaučių ginkmedžių lapų sausuosius ekstraktus vartoję pacientai

“papildė” antioksidacinę ląstelės apsaugos sistemą augaliniais antioksidan-

tais, todėl šiose grupėse vitamino E kiekis viso tyrimo metu išliko nepakitęs.

Tačiau, kad patvirtinti šį teiginį, tikslinga atlikti išsamesnius tyrimus su di-

desne tiriamųjų grupe.

Vertinant antiradikalinį aktyvumą DPPH-ESC metodu, ECS katechinams

nustatytas didesnis antiradikalinis aktyvumas nei EGB flavonoidams, tačiau

dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas sukėlė geresnį farmakolo-

ginį poveikį 2 tipo CD sergantiems pacientams. Vertinant bendrą žaliosios

arbatos sausojo ekstrakto poveikį akių, nervinio audinio bei inkstų pažaidai,

reikšmingas skirtumas, palyginti su placebu, nenustatytas. Tačiau vertinant

duomenis tarp skirtingų matavimų (po 9 ir po 18 mėn. preparato vartojimo)

žaliosios arbatos ekstraktą vartojusių tiriamųjų grupėje, nustatytas reikšmin-

gas vibracinio jutimo slenksčio sumažėjimas po 18 mėnesių preparato varto-

jimo (pirmus 9 mėn. vartojant po 400 mg sausojo žaliosios arbatos ekstrakto

per dieną, sekančius 9 mėn. – po 600 mg per dieną), palyginti su duomeni-

mis tyrimo pradžioje. Žaliosios arbatos sausasis ekstraktas neturėjo reikš-

mingos įtakos kitiems diabetinės akių, nervinio audinio ir inkstų pažaidos

rodikliams nei tyrimo metu, nei palyginti su placebo grupe. Literatūros šalti-

69

niuose aprašyti pavieniai atvejai apie galimą teigiamą ECS poveikį grauži-

kų diabetinei inkstų pažaidai (kreatinino bei albumino kiekio mažėjimui)

[113] ir diabetinei akių pažaidai [109, 110, 118], deja, mūsų tyrimų metu 2

tipo CD sergantiems pacientams toks poveikis nenustatytas. Dviskiaučių

ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto vartojimas taip pat neturėjo teigiamo

poveikio akių, nervinio audinio bei inkstų pažaidai 2 tipo CD sergantiems

pacientams, palyginti su placebu. Tačiau vertinant duomenis tarp skirtingų

matavimų (po 9 ir po 18 mėn. preparato vartojimo) dviskiaučių ginkmedžių

lapų ekstraktą vartojusių tiriamųjų grupėje, nustatytas reikšmingas kreatini-

no kiekio vyrams ir vibracinio jutimo slenksčio mažėjimas po 18 mėn.

(pirmus 9 mėn. vartojant po 160 mg sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų

ekstrakto per dieną, sekančius 9 mėn. – po 240 mg). Sausąjį dviskiaučių

ginkmedžių ekstraktą vartojusių tiriamųjų grupėje taip pat sumažėjo akies

junginės kraujagyslinių bei perivaskulinių pokyčių indeksai ir bendras jun-

ginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių indeksas po 9 mėn. (vartojant

po 160 mg sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto per dieną) ir po

18 mėn. (pirmus 9 mėn. vartojant po 160 mg sausojo dviskiaučių ginkme-

džių lapų ekstrakto per dieną, sekančius 9 mėn. – po 240 mg ) preparato

vartojimo, palyginti su pradiniais duomenimis. Šie duomenys neprieštarauja

kitų mokslininkų tyrimų rezultatams, įrodantiems teigiamą EGB poveikį

[34, 43, 54, 56, 57, 120, 121, 143]. Teigiamo EGB poveikio akių, nervinio

audinio ir inkstų pažaidai mechanizmas nėra visiškai ištirtas. Manome, kad

jis priklauso nuo flavonoidų antioksidacinių savybių, gebos neutralizuoti

laisvuosius radikalus ir mažinti lipidų peroksidaciją [121] bei teigiamo ter-

penoidų poveikio reologiniams kraujo parametrams, todėl pagerėja mikro-

cirkuliacija [34, 54, 56]. Yra duomenų, kad terpenoidai taip pat gali turėti

antioksidacinių savybių [34, 51], tačiau šie duomenys labai prieštaringi.

Norint patvirtinti šį teiginį, tikslinga būtų atlikti tolesnius tyrimus ir įvertinti

antiradikalinį atskirų terpenoidų aktyvumą. Pastaraisiais metais atlikti tyri-

mai su metforminu atskleidė galimas antioksidacines metformino savybes

[145, 146], tačiau mūsų tyrimo duomenimis medikamentinis CD gydymas

metforminu, insulinu ar abiejų šių vaistų deriniu reikšmingos įtakos nei

diabetinės akių, nervinio audinio ir inkstų pažaidos rodiklių kitimui, nei

oksidacinio streso rodikliams neturėjo.

Tyrime visi preparatai buvo vartojami du kartus per dieną pirmus 9 mėn.

(sausojo žaliosios arbatos ekstrakto 400 mg per dieną, sausojo dviskiaučių

ginkmedžių lapų ekstrakto 160 mg per dieną), sekančius 9 mėn. – po tris

kartus per dieną (sausojo žaliosios arbatos ekstrakto 600 mg per dieną, sau-

sojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto 240 mg per dieną). Analizuojant

ECS ir EGB koncentracijos įtaką, reikšmingo skirtumo, vartojant preparatus

70

du kartus ar tris kartus per dieną, nenustatyta. Pastebėtas teigiamas ECS

poveikis vibracinio jutimo slenksčio mažėjimui po 18 mėn. bei EGB povei-

kis kreatinino kiekio vyrams, vibracinio jutimo slenksčio, bendro junginės

kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių indekso ir kraujagyslinių bei peri-

vaskulinių pokyčių indeksų mažėjimui po 18 mėn. gali būti siejamas ne tik

su didesne preparatų koncentracija, bet ir su ilgu jų vartojimu.

Apibendrinant mūsų tyrimo rezultatus, stipraus žaliosios arbatos ir dvi-

skiaučių ginkmedžių lapų sausųjų ekstraktų poveikio diabetinei akių, nervi-

nio audinio ir inkstų pažaidai nenustatyta. Vartojusių ECS ir EGB ekstraktus

pacientų grupėse pastebėtos kai kurių rodiklių gerėjimo tendencijos, nebuvo

patvirtintos lyginant su placebo grupe. Tam galėjo turėti įtakos vyresnis pa-

čių tiriamųjų amžius, ilgai trunkanti, įsisenėjusi CD ligos eiga, padidėjęs

HbA1c kiekis bei jau diagnozuotos diabetinės komplikacijos, turinčios ryš-

kius diabetinius pokyčius, taip pat mažas tiriamųjų skaičius kiekvienoje gru-

pėje. Todėl būtų tinkslinga atlikti tyrimus ir įvertinti minėtų ekstraktų povei-

kį diabetinei akių, nervinio audinio ir inkstų pažaidai pacientams, kuriems 2

tipo CD diagnozuotas laiku, t. y. ligos pradžioje bei dar nesant diabetinių

komplikacijų. Kad būtų galima daryti išvadą apie teigiamą žaliosios arbatos

ir dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų ekstraktų poveikį 2 tipo CD sergan-

tiems pacientams bei patvirtinti, ar paneigti pastebėtas tendencijas, reikalin-

ga pakartoti tyrimus su didesne tiriamųjų apimtimi.

71

IŠVADOS

1. Nustatytas sausojo žaliosios arbatos ekstrakto tirtų katechinų suminis

antioksidacinis aktyvumas (TEAC – 457,14 mg/g). Epigalokatechino ga-

latas pasižymėjo stipriausiomis antioksidacinėmis savybėmis, todėl gali

būti naudojamas kaip kokybinis parametras, vertinant žaliosios arbatos

preparatų antioksidacinį aktyvumą.

2. Nustatytas sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto flavonoidų

frakcijos (kvercetino, kemferolio, izoramnetino) antioksidacinis aktyvu-

mas (TEAC – 40,76 mg/g). Kvercetinas pasižymėjo stipriausiomis anti-

oksidacinėmis savybėmis, todėl gali būti naudojamas kaip kokybinis

parametras, vertinant dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų antioksida-

cinį aktyvumą.

3. Sausąjį žaliosios arbatos ekstraktą vartojusių tiriamųjų grupėje nustatytas

reikšmingas vibracinio jutimo slenksčio sumažėjimas po 18 mėn. (pirmus

9 mėn. pacientai vartojo po 400 mg, sekančius 9 mėn. – po 600 mg per

dieną), palyginti su duomenimis tyrimo pradžioje.

4. Sausąjį dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktą vartojusių tiriamųjų gru-

pėje nustatytas reikšmingas kreatinino kiekio kraujo plazmoje vyrams ir

vibracinio jutimo slenkščio sumažėjimas po 18 mėn. (pirmus 9 mėn. pa-

cientai vartojo po 160 mg, sekančius 9 mėn. – po 240 mg per dieną).

Akies junginės kraujagyslinių, perivaskulinių pokyčių indeksai ir bendro

junginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pokyčių indeksas reikšmingai

sumažėjo tiek po 9 mėn., tiek po 18 mėn., palyginti su duomenimis tyri-

mo pradžioje.

5. Palyginti su placebu reikšmingo sausojo žaliosios arbatos ir sausojo dvi-

skiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų poveikio akių, nervinio audinio ir

inkstų pažaidai pacientams, sergantiems 2 tipo cukriniu diabetu, nenus-

tatyta.

6. Sausąjį žaliosios arbatos ekstraktą vartojusių tiriamųjų grupėje reikšmin-

gai sumažėjo malondialdehido kiekis tiek po 9 mėn. (vartojant po

400 mg per dieną), tiek po 18 mėn. (pirmus 9 mėn. vartojant po 400 mg,

sekančius 9 mėn. – po 600 mg per dieną), palyginti su duomenimis

tyrimo pradžioje.

72

7. Palyginti su placebu reikšmingo sausojo žaliosios arbatos ekstrakto po-

veikio oksidacinio streso rodikliams pacientų, sergančių 2 tipo cukriniu

diabetu, kraujo plazmoje, nenustatyta.

8. Sausąjį dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktą vartojusių tiriamųjų gru-

pėje reikšmingai sumažėjo malondialdehido kiekis po 18 mėn. (pirmus

9 mėn. pacientai vartojo po 160 mg, sekančius 9 mėn. – po 240 mg per

dieną) bei lipidų hidroperoksidų kiekis – po 9 mėn., palyginti su duome-

nimis tyrimo pradžioje.

9. Palyginti su placebu nustatytas reikšmingas sausojo dviskiaučių ginkme-

džių lapų ekstrakto poveikis lipidų peroksidacijos procesų slopinimui:

vartojant preparatą 9 mėn. (po 160 mg per dieną) reikšmingai sumažėjo

lipidų hidroperoksidų kiekis. Ilgiau vartojant preparatą, skirtumo su pla-

cebo vartojimu nebuvo. Vartojant preparatą 18 mėn. (pirmus 9 mėn. – po

160 mg, sekančius 9 mėn. – po 240 mg per dieną) reikšmingai sumažėjo

malondialdehido kiekis.

73

LITERATŪRA

1. Dai J, Mumper RJ. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their

Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules 2010, 15, 7313-7352; ISSN

1420-3049

2. Amira AMA. Oxidative Stress and Disease: An Updated Review. Research

Journal of Immunology. 2010; 3:129-145.

3. IDF Diabetes Atlas 6th edn. Brussels, Belgium, 2013. International Diabetes

Federation Web. http://www.idf.org/diabetesatlas/

4. Chacko SM, Thambi PT, Kuttan R and Nishigaki I. Beneficial effects of green

tea: A literature review. Chin. 2010; 5:13-21.

5. Sinija VR, Mishra HN. Green tea: Health benefits. Journal Nutritional &

Environmental Medicine 2008; 17(4): 232–242.

6. Kanwar J, Taskeen M, Mohammad I, Huo C, Chan TH, Dou QP. Recent

advances on tea polyphenols. Front Biosci (Elite Ed) 2012;4:111–131.

7. Graham HN. Green tea composition, consumption and polyphenol chemistry.

Preventive Medicine 1992; 21(3):334–350.

8. Forester SC, Lambert JD. Antioxidant effects of green tea. Mol Nutr Food

Res. 2011; 55(6): 844–854.

9. Guo Q, Zhao B, Shen S, Hou J, Hu J, XIn W. ESR study on the structure-

antioxidant activity relationship of tea catechins and their epimers. Biochim

Biophys Acta.1999; 1427(1):13-23.

10. Braicu C, Ladomery MR, Chedea VS, Irimie A, Berindan-Neagoe I. The

relationship between the structure and biological actions of green tea

catechins. Food Chemistry. 2013; 141: 3282–3289.

11. Moderno PM, Carvalho M, Silva BM. Recent Patents on Camellia sinensis:

Source of Health Promoting Compounds. Recent Patents on Food, Nutrition &

Agriculture. 2009; 1:182-192.

12. Lambert JD, Elias RJ. The antioxidant and pro-oxidant activities of green tea

polyphenols: a role in cancer prevention. Arch Biochem Biophys. 2010;

501(1): 65–72.

13. Suliburska J, Bogdanski P, Szulinska M, Stepien M, Pupek-Musialik D,

Jablecka A. Effects of Green Tea Supplementation on Elements, Total

Antioxidants, Lipids, and Glucose Values in the Serum of Obese Patients. Biol

Trace Elem Res. 2012; 149(3): 315–322.

14. Khan N, Mukhtar H. Tea polyphenols for health promotion. Life Sci. 2007;

81(7):519-33.

15. Cabrera C, Artacho R, Giménez R. Beneficial effects of green tea-a review. J

Am Coll Nutr. 2006; 25(2):79-99.

16. Graziose R, Lila MA, Raskin I. Merging Traditional Chinese Medicine with

Modern Drug Discovery Technologies to Find Novel Drugs and Functional

Foods. Curr Drug Discov Technol. 2010; 7(1): 2–12.

74

17. Cooper R, Morre DJ, Morre DM. Medicinal Benefits of Green Tea: Part I.

Review of Noncancer Health Benefits. J Altern Complement Med. 2005;

11(3):521-528.

18. Khurana S, Venkataraman K, Hollingsworth A, Piche M, Tai TC.

Polyphenols: Benefits to the Cardiovascular System in Health and in Aging.

Nutrients. 2013; 5(10): 3779–3827.

19. Ramadan G, El-Beih NM, El-Ghffar EAA. Modulatory effects of black v.

green tea aqueous extract on hyperglycaemia, hyperlipidaemia and liver

dysfunction in diabetic and obese rat models. British J Nutri. 2009; 102:1611-

1619.

20. Kuroda Y, Hara Y. Editors. Health Effects of Tea and its Catechins. Kluwer

Academic/Plenum Publishers, New York, 2004. p.81-87.

21. Deka A, Vita JA. Tea and Cardiovascular Disease. Pharmacol Res. 2011;

64(2): 136–145.

22. Higdon JV, Frei B. Tea Catechins and Polyphenols: Health Effects,

Metabolism, and Antioxidant Functions. Critical Reviews in Food Science and

Nutrition, 2003; 43(1):89–143.

23. Velayutham P, Babu A, Liu D. Green Tea Catechins and Cardiovascular

Health: An Update. Curr Med Chem. 2008; 15(18): 1840–1850.

24. Tachibana H. Green tea polyphenol sensing. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol

Sci.2011; 87(3): 66–80.

25. OyetakinWhite P, Tribout H, Baron E. Protective Mechanisms of Green Tea

Polyphenols in Skin. Oxid Med Cell Longev. 2012; 2012: 560682. Published

online Jun 26, 2012. doi: 10.1155/2012/560682.

26. Radji M, Agustama RA, Elya B, Tjampakasari CR. Antimicrobial activity of

green tea extract against isolates of methicillin-resistant Staphylococcus

aureus and multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa. Asian Pac J Trop

Biomed. 2013; 3(8): 663–667.

27. Stoicov C, Saffari R, Houghton J. Green tea inhibits Helicobacter growth in

vivo and in vitro. Int J Antimicrob Agents. 2009; 33(5): 473–478.

28. Reygaert W, Jusufi I. Green tea as an effective antimicrobial for urinary tract

infections caused by Escherichia coli. Front Microbiol. 2013; 4:162. doi:

10.3389/fmicb.2013.00162.

29. Steinmann J, Buer J, Pietschmann T, Steinmann E. Anti-infective properties of

epigallocatechin-3-gallate (EGCG), a component of green tea. Br J Pharmacol.

2013;168(5): 1059–1073.

30. Kakuda T. Neuroprotective effects of the green tea components theanine and

catechins. Biol Pharm Bull. 2002; 25(12):1513-8.

31. Shen CL, Yeh JK, Cao J, Wang JS. Green Tea and Bone metabolism. Nutr

Res. 2009; 29(7): 437–456.

32. Shen CL, Chyu MC, Yeh JK, Zhang Y, Pence BC, Felton CK, Brismée JM,

Arjmandi BH, Doctolero S, Wang JS. Effect of green tea and Tai Chi on bone

health in postmenopausal osteopenic women: a 6-month randomized placebo-

controlled trial. Osteoporos Int. 2012; 23(5): 1541–1552.

75

33. Ulbricht Catherine E, Basch Ethan M, editor. Natural standard herb and

supplement reference: evidence based clinical reviews. New York: Mosby;

2005. p. 359-376.

34. European Scientific Cooperative on Phytotherapy (ESCOP). Gingko folium.

In: ESCOP, ed. ESCOP Monographs: The scientific foundation for Herbal

Medicinal Products: 2nd Edition. Stuttgart, New York: Thieme, 2003; 178–

210.

35. WHO monographs on selected medicinal plants. Volume 1. World Health

Organization, Geneva. 1999. p. 154-168. Prieiga per internet:

http://apps.who.int/medicinedocs/pdf/s2200e/s2200e.pdf

36. Wichtl M, editor. Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals: A Handbook for

Practice on a Scientific Basis. Germany: Medpharm Scientific Publishers;

2004. p. 251-254.

37. European Pharmacopoeia 6.1, 04/2008:1827 ir 01/2008:20229.

38. Peluso MR. Flavonoids Attenuate Cardiovascular Disease, Inhibit

Phosphodiesterase, and Modulate Lipid Homeostasis in Adipose Tissue and

Liver. Experimental Biology and Medicine. 2006; 231:1287-1299.

39. Shi C, Liu J, Wu F, Yew DT. Ginkgo biloba Extract in Alzheimer’s Disease:

From Action Mechanisms to Medical Practice. Int. J. Mol. Sci. 2010;

11(1):107-123. doi:10.3390/ijms11010107.

40. Thanoon IA, Abdul-Jabbar HA, Taha DA. Oxidative Stress and C-Reactive

Protein in Patients with Cerebrovascular Accident (Ischaemic Stroke): The

role of Ginkgo biloba extract. Sultan Qaboos Univ. Med. J. 2012; 12(2):197-

205.

41. Rojas P, Montes P, Rojas C, Serrano-García N, Rojas-Castañeda JC. Effect of

a phytopharmaceutical medicine, Ginko biloba extract 761, in an animal

model of Parkinson's disease: therapeutic perspectives. Nutrition. 2012;28(11-

12):1081-1088. doi: 10.1016/j.nut.2012.03.007.

42. DeFeudis FV (c). Ginkgo biloba extract (Egb761). From Chemistry to the

clinic. Ullstein Medical, Vokietija.1998. p. 119-133.

43. Suter A, Niemer W, Klopp R. A New Ginkgo Fresh Plant Extract Increases

Microcirculation and Radical Scavenging Activity in Elderly Patients. Adv

Ther. 2011; 28(12):1078-1088. doi: 10.1007/s12325-011-0083-4.

44. Pereira Braga C, Momentti AC, Barbosa Peixoto F, de Fátima Ferreira

Baptista R, dos Santos FA, Fava FH, Fernandes AA. Influence of treatment

with quercetin on lipid parameters and oxidative stress of pregnant diabetic

rats. Can J Physiol Pharmacol. 2013, 91(2): 171-177.

45. Drieu K, Jaggy H. History, Development and Constituents of Egb 761. In:

Terris A.van Beek, editor. Ginkgo Biloba (Medicinal and Aromatic Plants –

Industrial Profiles). CRC Press; 2003. p. 314-328.

46. Masteikova R, Muselik J, Bernatoniene J, Bernatoniene R. Antioxidative

activity of Ginkgo, Echinacea, and Ginseng tinctures. Medicina (Kaunas).

2007;43(4):306-9.

76

47. Bernatoniene J, Kucinskaite A, Masteikova R, Kalveniene Z, Kasparaviciene

G, Savickas A. The comparison of anti-oxidative kinetics in vitro of the fluid

extract from maidenhair tree, motherwort and hawthorn. Acta Pol Pharm.

2009 Jul-Aug;66(4):415-21.

48. Sati SC, Joshi S. Antibacterial Activities of Ginkgo biloba L. Leaf Extracts.

Scientific World Journal. 2011;11:2237–2242.

49. Chirumbolo S. The role of quercetin, flavonols and flavones in modulating

inflammatory cell function. Inflamm Allergy Drug Targets. 2010;9(4):263–

285.

50. Kudolo GB, Delaney D, Blodgett J. Short-term oral ingestion of Ginkgo

biloba extract (EGb 761) reduces malondialdehyde levels in washed platelets

of type 2 diabetic subjects. Diabetes Res Clin Pract. 2005; 68(1):29-38.

51. Barnes J, Anderson LA and Phillipson JD. Herbal Medicines Second edition.

Pharmaceutical Press 2002, p.250-263.

52. Ferreira PE, Lopes CR, Alves AM, Alves ÉP, Linden DR, Zanoni JN, Buttow

NC. Diabetic neuropathy: an evaluation of the use of quercetin in the cecum of

rats. World J Gastroenterol. 2013;19(38):6416-26.

53. Salvamani S, Gunasekaran B, Shaharuddin NA, Ahmad SA, Shukor MY.

Antiartherosclerotic Effects of Plant Flavonoids. BioMed Research Interna-

tional. 2014; 2014, Article ID 480258, 11 pages. http://dx.doi.org/10.1155/

2014/480258.

54. Lim S, Yoon JW, Kang SM, Choi SH, Cho BJ, Kim M, Park HS, Cho HJ,

Shin H, Kim YB, Kim HS, Jang HC, Park KS. EGb761, a Ginkgo Biloba

Extract, Is Effective Against Atherosclerosis In Vitro, and in a Rat Model of

Type 2 Diabetes. PLoS ONE 2011; 6(6): e20301.

doi:10.1371/journal.pone.0020301.

55. Alok S, Jain SK, Verma A, Kumar M, Mahor A, Sabharwal M. Herbal

antioxidant in clinical practice: A review. Asian Pac J Trop Biomed. 2014;

4(1):78–84.

56. DeFeudis FV (b). Ginkgo biloba extract (Egb761). From Chemistry to the

clinic. Ullstein Medical, Vokietija.1998. p. 185-196.

57. Kellermann AJ, Kloft C. Is There a Risk of Bleeding Associated with

Standardized Ginkgo biloba Extract Therapy? Pharmacotherapy. 2011;

31(5):490-502.

58. Zhang L, Mao W, Guo X, Wu Y, Li C, Lu Z, Su G, Li X, Liu Z, Guo R, Jie X,

Wen Z, Liu X. Ginkgo biloba Extract for Patients with Early Diabetic

Nephropathy: A Systematic Review. Evid Based Complement Alternat Med.

2013; 2013:689142. doi: 10.1155/2013/689142.

59. Baliutyte G, Baniene R, Trumbeckaite S, Borutaite V, Toleikis A. Effects of

Ginkgo biloba extract on heart and liver mitochondrial functions:

mechanism(s) of action. J Bioenerg Biomembr. 2010 Apr;42(2):165-72. doi:

10.1007/s10863-010-9275-x. Epub 2010 Mar 19.

77

60. Baliutytė G. Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo Biloba l.) lapų ekstraktų

poveikis mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai. Daktaro disertacija.

2011 m. 38-89 psl.

61. Praškevičius A, Ivanovienė L, Stasiūnienė N, Burneckienė J, Rodovičius H,

Lukoševičius L, Kondratas D. Biochemija. KMU leidykla, Kaunas,2003;

p.274-278; 608-613.

62. Samoylenko A, Hossain JAl, Mennerich D, Kellokumpu S, Hiltunen JK,

Kietzmann T. Nutritional Countermeasures Targeting Reactive Oxygen

Species in Cancer: From Mechanisms to Biomarkers and Clinical Evidence.

Antioxid Redox Signal. 2013; 19(17): 2157–2196.

63. Rahman K. Studies on free radicals, antioxidants, and co-factors. Clin Interv

Aging. 2007; 2(2): 219–236.

64. Kalyanaraman B.Teaching the basics of redox biology to medical and

graduate students: Oxidants, antioxidants and disease mechanisms. Redox

Biol. 2013; 1(1): 244–257.

65. Turrens JF. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol;

2003;552(2):335–344.

66. Murphy MP, editor. How mitochondria produce reactive oxygen species.

Biochem J 2009; 417(1):1–13.

67. Bandyopadhyay U, Das D, Banerjee RK. Reactive oxygen species: Oxidative

damage and pathogenesis. Current Science 1999; 77(5):658-666.

68. Bartz RR, Piantadosi CA. Clinical review: Oxygen as a signaling molecule.

Crit Care. 2010; 14(5): 234.

69. Powers SK, Ji LL, Kavazis AN, Jackson MJ. Reactive oxygen species: impact

on skeletal muscle. Compr Physiol. 2011;1(2):941-969.

70. Jungwirth U, Kowol CR, Keppler BK, Hartinger CG,Berger W, Heffeter P.

Anticancer Activity of Metal Complexes: Involvement of Redox Processes.

Antioxid Redox Signal. 2011;15(4): 1085–1127.

71. Li X, Fang P, Mai J, Choi ET, Wang H, Yang XF. Targeting mitochondrial

reactive oxygen species as novel therapy for inflammatory diseases and

cancers. J Hematol Oncol. 2013;6:19. doi: 10.1186/1756-8722-6-19.

72. Buettner GR. Superoxide Dismutase in Redox Biology: The roles of

superoxide and hydrogen peroxide. Anticancer Agents Med Chem. May 1,

2011; 11(4): 341–346.

73. Sena LA and Chandel NS. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive

Oxygen Species. Molecular Cell 2012;48(2):158-167.

74. José M. Matés and Francisca Sánchez-Jiménez, Antioxidant enzymes and

their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience.

1999; 4:339-345.

75. Lu JM, Lin PH, Yao Q, Chen C. Chemical and molecular mechanisms of

antioxidants: Experimental approaches and model systems. J Cell Mol Med.

2010;14(4):840-860.

76. Aruoma OI. Free radicals, oxidative stress, and antioxidants in human health

and disease. J Am Chem Soc. 1998;75:199-212.

78

77. Grune T, Schröder P, Biesalski HK. Low Molecular Weight Antioxidants. In:

The Handbook of Environmental Chemistry Part 2/20. Springer-Verlag Berlin

Heidelberg, 2005; pp 77-90.

78. Elias RJ, Kellerby SS, Decker EA. Antioxidant activity of proteins and

peptides. Crit Rev Food Sci Nutr. 2008;48:430–41.

79. Mackenzie EL, Iwasaki K, Tsuji Y. Intracellular Iron Transport and Storage:

From Molecular Mechanisms to Health Implications. Antioxid Redox Signal.

2008;10(6): 997–1030.

80. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol

Rev 2002;82(1):47-95.

81. Ray PD, Huang BW, Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeo-stasis

and redox regulation in cellular signaling.Cell Signal 2012;24(5): 981-990.

82. Birben E, Sahiner UM, Sackesen C, Erzurum S, Kalayci O. Oxidative Stress

and Antioxidant Defense. World Allergy Organ J. Jan 2012; 5(1): 9–19.

83. Rowe LA, Degtyareva N, Doetsch PW. DNA damage-induced reactive

oxygen species (ROS) stress response in Saccharomyces cerevisiae. Free

Radical Biol. Med. 2008;15: 1167-1177.

84. Sacks DD, Arnold M, Bakris GL, Bruns DE, Horvath AR, Kirkman MS,

Lernmark A, Metzger BE, Nathan DM. Guidelines and Recommendations for

Laboratory Analysis in the Diagnosis and Management of Diabetes Mellitus.

Diabetes Care. 2011;34(6): e61–e99.

85. König M, Bulik S, Holzhütter HG. Quantifying the Contribution of the Liver

to Glucose Homeostasis: A Detailed Kinetic Model of Human Hepatic

Glucose Metabolism. PLoS Comput Biol. 2012;

8(6):e1002577.doi: 10.1371/journal.pcbi.1002577.

86. World Health Organization, Diabetes, Fact sheet No.312, 2013

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/en/

87. Norkus A. Diabetologija. Platiniškės (Vilniaus r.): Piksma; 2010. p. 330-406.

88. Kahn CR, Weir GC, King GL, Jacobson AM, Moses AC, Smith RJ. Joslin‘s

Diabetes mellitus. Fourteenth Edition. Philadephia: Lippincott Williams &

Wilkins; 2005. p. 793-885.

89. IDF About Diabetes, 2013. International Diabetes Federation Web.

http://www.idf.org/complications-diabetes.

90. Frier BM, Fisher M. Diabetes mellitus. In: Colledge NR., Walker BR, Ralston

SH Davidson’s. Principles and Practice of Medicine 21st Edition. Elsevier

Limited, 2010; pp.795-835.

91. Jay D, Hitomi H, Griendling KK. Oxidative stress and diabetic cardiovascular

complications. Free Radic Biol Med. 2006;15;40(2):183-92.

92. Bashan N, Kovsan J, Kachko I, Ovadia H, Rudich A. Positive and negative

regulation of insulin signaling by reactive oxygen and nitrogen species.

Physiol Rev. 2009;89(1):27-71. doi: 10.1152/physrev.00014.2008.

93. Bandeira SM, Fonseca LJ, Guedes SG, Rabelo LA, Goulart MO, Vasconcelos

SM. Oxidative stress as an underlying contributor in the development of

79

chronic complications in diabetes mellitus. Int J Mol Sci. 2013;14(2):3265-84.

doi: 10.3390/ijms14023265.

94. Pitocco D, Zaccardi F, Stasio E, Romitelli F, Santini SA, Zuppi C, Ghirlanda

G. Oxidative Stress, Nitric Oxide, and Diabetes. Rev. Diabet. Stud.

2010;7(1):15–25.

95. Giacco F, Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications. Circ Res.

2010;107(9):1058-1070.

96. Alfadda AA, Sallaml RM. Reactive Oxygen Species in Health and Disease. J

Biomed Biotechnol. 2012; 2012:936486. doi: 10.1155/2012/936486.

97. Kaneto H and Matsuoka T. Involvement of Oxidative Stress in Suppression of

Insulin Biosynthesis under Diabetic Conditions. Int J Mol Sci. 2012; 13(10):

13680–13690.

98. Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying

mechanism. Diabetes. 2005;54(6):1615-25.

99. Singh VP, Bali A, Singh N, Jaggi AS. Advanced Glycation End Products and

Diabetic Complications. Korean J Physiol Pharmacol. 2014; 18(1): 1–14.

100. Kim JA, Wei Y, Sowers JR. Role of mitochondrial dysfunction in insulin

resistance. Circ Res. 2008;102(4):401-414.

101. McDonnell ME, Umpierrez GE. Insulin Therapy for the Management of

Hyperglycemia in Hospitalized Patients. Endocrinol Metab Clin North Am.

2012; 41(1): 175–201.

102. Johansen JS, Harris AK, Rychly DJ, Ergul A. Oxidative stress and the use of

antioxidants in diabetes: linking basic science to clinical practice. Cardiovasc

Diabetol. 2005;4(1):5.

103. Suzuki Y, Miyoshi N, Isemura M. Health-promoting effects of green tea. Proc

Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2012; 88(3): 88–101.

104. Hininger-Favier I, Benaraba R, Coves S, Anderson RA, Roussel AM. Green

Tea Extract Decreases Oxidative Stress and Improves Insulin Sensitivity in an

Animal Model of Insulin Resistance, the Fructose-Fed Rat. J Am Coll Nutr.

2009; 28(4):355-361.

105. Han MK. Epigallocatechin gallate, a constituent of green tea, suppresses

cytokine-induced pancreatic beta-cell damage. Exp Mol Med. 2003;

35(2):136-9.

106. Park JH,Bae JH, IM SS, Song DK. Green tea and type 2 diabetes. Integrative

Medicine Research 2014. Article in Press. DOI: 10.1016/j.imr.2013.12.002.

107. Khan N, Mukhtar H. Tea and Health: Studies in Humans. Curr Pharm Des.

2013; 19(34): 6141–6147.

108. Haidari F, Shahi MM, Zarei M, Rafiei H, Omidian K. Effect of green tea

extract on body weight, serum glucose and lipid profile in streptozotocin-

induced diabetic rats. A dose response study. Saudi Med J. 2012

Feb;33(2):128-33.

109. Kumar B, Gupta SK, Nag TC, Srivastava S, Saxena R. Green tea prevents

hyperglycemia-induced retinal oxidative stress and inflammation in

streptozotocin-induced diabetic rats. Ophthalmic Res. 2012;47(2):103-8.

80

110. Silva KC, Rosales MA, Hamassaki DE, Saito KC, Faria AM, Ribeiro PA,

Faria JB, Faria JM. Green tea is neuroprotective in diabetic retinopathy. Invest

Ophthalmol Vis Sci. 2013;54(2):1325-1336.

111. Babu PV, Sabitha KE, Srinivasan P, Shyamaladevi CS. Green tea attenuates

diabetes induced Maillard-type fluorescence and collagen cross-linking in the

heart of streptozotocin diabetic rats. Pharmacol Res. 2007;55(5):433-40. Epub

2007 Feb 2.

112. Babu PV, Si H, Liu D. Epigallocatechin gallate reduces vascular inflammation

in db/db mice possibly through an NF-κB-mediated mechanism. Mol Nutr

Food Res. 2012;56(9):1424-32.

113. Kang MY, Park YH, Kim BS, Seo SY, Jeong BC, Kim JI, Kim HH.

Preventive Effects of Green Tea (Camellia Sinensis var. Assamica) on

Diabetic Nephropathy. Yonsei Med J. Jan 1, 2012; 53(1): 138–144.

114. Bahadoran Z, Mirmiran P, Azizi F. Dietary polyphenols as potential

nutraceuticals in management of diabetes: a review. J Diabetes Metab Disord.

2013; 12: 43. Published online 2013. doi: 10.1186/2251-6581-12-43.

115. Coimbra S, Castro E, Rocha-Pereira P, Rebelo I, Rocha S, Santos-Silva A.

The effect of green tea in oxidative stress. Clin. Nutr. 2006;25:790–796.

116. Mozaffari-Khosravi H, Ahadi Z, Barzegar K. The effect of green tea and sour

tea on blood pressure of patients with type 2 diabetes: a randomized clinical

trial. J Diet Suppl. 2013;10(2):105-15. doi: 10.3109/19390211.2013.790333.

117. Liu CY, Huang CJ, Huang LH, Chen IJ, Chiu JP, Hsu CH. Effects of green tea

extract on insulin resistance and glucagon-like peptide 1 in patients with type

2 diabetes and lipid abnormalities: a randomized, double-blinded, and

placebo-controlled trial. PLoS One. 2014 Mar 10;9(3):e91163. doi:

10.1371/journal.pone.0091163. eCollection 2014.

118. Ye P, Lin K, Li Z, Liu J, Yao K, Xu W. [(-)-Epigallocatechin gallate regulates

expression of apoptotic genes and protects cultured human lens epithelial cells

under hyperglycemia]. Mol Biol (Mosk). 2013;47(2):251-7. [straipsnis rusų

kalba]

119. Jeong SM, Kang MJ, Choi HN, Kim JH, Kim JI. Quercetin ameliorates

hyperglycemia and dyslipidemia and improves antioxidant status in type 2

diabetic db/db mice. Nutr Res Pract. 2012;6(3):201–207.

120. Huang SY, Jeng C, Kao SC, Yu JJ, Liu DZ. Improved haemorrheological

properties by Ginkgo biloba extract (Egb 761) in type 2 diabetes mellitus

complicated with retinopathy. Clin Nutr. 2004;23(4):615-21.

121. DeFeudis FV (a). Ginkgo biloba extract (Egb761). From Chemistry to the

clinic. Ullstein Medical, Vokietija. 1998. p. 73-80, 182-183.

122. Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2007 m. liepos 10 d.

įsakymas Nr. V-596 „Pagalbinių medžiagų, kurios turi būti nurodomos ant

vaistinio preparato pakuotės ir pakuotės lapelyje, sąrašas“ Žin., 2007, Nr. 78-

3176.

123. U.S. Food and Drug Administration. Inactive Ingredient Search. Available at:

http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/

81

124. Raudonis R, Jakstas V, Burdulis D, Benetis R, Janulis V. Investigation of

contribution of individual constituents to antioxidant activity in herbal drugs

using postcolumn HPLC method. Medicina (Kaunas). 2009; 45(5):382-94.

125. Saito ST, Welzel A, Suyenaga ES, et al. A method for fast determination of

epigallocatechin gallate (EGCG), epicatechin (EC), catechin (C) and caffeine

(CAF) in green tea using HPLC. Cienc Tecnol Aliment 2006;26(2):394-400.

126. Wooliams JA, Wiener G, Anderson PH, et al. Variation in the Activities of

Glutathione-Peroxidase and Superoxide-Dismutase and in the Concentration

of Copper in the Blood in Various Breed Crosses of Sheep. Res Vet Sci

1983;34:253-256.

127. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative

characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med

1967;70:158.

128. Miller NJ, Rice-Evans C, Davies MJ, et al. A novel method for measuring

antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in

premature neonates. Clin. Sci 1993;84:407-412.

129. Aebi H. Catalase in vitro. Meth Enzymol 1984;165:121-126.

130. Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd ed., Worth

Publishers, New York; 2000.

131. Esterbauer H, Cheeseman KH. Determination of Aldehydic Lipid-

Peroxidation Products - Malonaldehyde and 4-Hydroxynonenal. Meth

Enzymol 1990;186:407-421.

132. Alfthan G. A micromethod for the determination of selenium in tissues and

biological fluids by single-test-tube fluorimetry. Analytical Chimica Acta

1984;165:187-194.

133. Thompson JN, Erdody P, Maxwell WB. Simultaneous fluorometric

determinations of vitamins A and E in human serum and plasma. Biochem

Med 1973;8:403-414.

134. Lee VS, Kingsley RM, Lee ET, Lu M, Russell D. Asal NR, Bradford RH Jr,

Wilkinson CP. The diagnosis of diabetic retinopathy. Ophthalmoscopy versus

fundus photography. Ophthalmology 1993; 100(10): 1504-1512.

135. Global Diabetic Retinopathy Project Group. Proposed international clinical

diabetic retinopathy and diabetic macular edema disease severity scales.

Ophthalmology 2003; 110(9): 1677-1682.

136. American Diabetes Association: Consensus statment of the American

Diabetes Association and the American Academy of Neurology. Report and

Recommendations of the San Antonio Conference on Diabetic Neuropathy.

Diabetes 1988; 37: 1000-1004.

137. Moghtaderi A, Bakhshipour A, Rashidi H. Validation of Michigan neuropathy

screening instrument for diabetic peripheral neuropathy. Clin Neurol

Neurosurg 2006; 108(5): 477-481.

138. Nanjo F, Goto K, Seto R, et al. Scavenging effects of tea catechins and their

derivatives on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Free Radic Biol Med

1996;21(6):895-902.

82

139. Mancia G, Fagard R, Narkiewicz K, Redón J, Zanchetti A, Böhm M,

Christiaens T, Cifkova R, De Backer G, Dominiczak A, Galderisi M, Grobbee

DE, Jaarsma T, Kirchhof P, Kjeldsen SE, Laurent S, Manolis AJ, Nilsson PM,

Ruilope LM, Schmieder RE, Sirnes PA, Sleight P, Viigimaa M, Waeber B,

Zannad F; 2013 ESH/ESC Guidelines for the management of arterial

hypertension: the Task Force for the management of arterial hypertension of

the European Society of Hypertension (ESH) and of the European Society of

Cardiology (ESC). Journal of Hypertension. 2013; 31(7):1281-357. doi:

10.1097/01.hjh.0000431740.32696.cc.

140. Partanen J, Niskanen L, Lehtinen J, Mervaala E, Siitonen O, Uusitupa M.

Natural history of peripheral neuropathy in patients with non–insulin–

dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1995; 333: 89–94.

141. Boulton AJM. Management of Diabetic Peripheral Neuropathy. Clinical

Diabetes January 2005; 23(1): 9-15.

142. Li L, Chen J, Wang J, Cai D. Prevalence and risk factors of diabetic peripheral

neuropathy in Type 2 diabetes mellitus patients with overweight/obese in

Guangdong province, China. Prim Care Diabetes. 2014 Aug 19. pii: S1751-

9918(14)00082-5. doi: 10.1016/j.pcd.2014.07.006.

143. Taliyan R, Sharma PL. Protective effect and potential mechanism of Ginkgo

biloba extract EGb 761 on STZ-induced neuropathic pain in rats. Phytother

Res. 2012;26(12):1823-1829. doi: 10.1002/ptr.4648. Epub 2012 Mar 15.

144. Bridi R, Crossetti FP, Steffen VM, Henriques AT. The antioxidant activity of

standardized extract of Ginkgo biloba (EGb 761) in rats. Phytother. Res. 2001;

15(5):449-451.

145. Alhaider AA, Korashy HM, Sayed-Ahmed MM, Mobark M, Kfoury H,

Mansour MA. Metformin attenuates streptozotocin-induced diabetic

nephropathy in rats through modulation of oxidative stress genes expression.

Chem Biol Interact. 2011;192(3):233-42. doi: 10.1016/j.cbi.2011.03.014.

Epub 2011 Mar 30.

146. Dai J, Liu M, Ai Q, Lin L, Wu K, Deng X, Jing Y, Jia M, Wan J, Zhang L.

Involvement of catalase in the protective benefits of metformin in mice with

oxidative liver injury. Chem Biol Interact. 2014;216:34-42. doi:

10.1016/j.cbi.2014.03.013.

83

DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ

SĄRAŠAS

1. Asta Špadienė, Nijolė Savickienė, Nijolė Jurgevičienė, Rimantas Žalin-

kevičius, Antanas Norkus, Rytas Ostrauskas, Andrejs Skesters, Alisa

Silova, Hiliaras Rodovičius, Migle Francaite-Daugeliene. The effect of

Ginkgo biloba L. leaves extract on the microcirculation of the eye in

patients with type 2 diabetes. Central Europe Journal of Medicine. 2013;

8(6):736-741 (Priedas Nr. 4).

2. Spadiene A, Savickiene N, Ivanauskas L, Jakstas V, Skesters A, Silova

A, Rodovicius H. Antioxidant effects of Camellia sinensis L. extract in

patients with type 2 diabetes, Journal of Food and Drug Analysis 2014;

22(4): 505-511 (Priedas Nr. 5).

3. Lina Lasaite, Asta Spadieneb, Nijole Savickiene, Andrejs Skesters, Alise

Silova. The Effect of Ginkgo biloba and Camellia sinensis Extracts on

Psychological State and Glycemic Control in Patients with Type 2

Diabetes Mellitus. Natural Product Communication 2014; 9(9):1345-

1350 (Priedas Nr. 6).

4. Asta Špadienė, Nijolė Savickienė, Andrejs Skesters, Alisa Silova, Hilia-

ras Rodovičius. The effects of Ginko biloba L. and Camelia sinensis L.

extracts on oxidative stress in patients with type 2 diabetes. African

Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2012; 6(44):3080-3085 (Priedas

Nr. 7).

Konferencijų tezės:

1. Špadienė, Asta, Savickienė, Nijolė, Rodovičius, Hiliaras, Ivanauskas,

Liudas, Skesters, Andrejs „Quantitative determination of active consti-

tuents in green tea dry extract using high-performance liquid chromato-

graphy”. The International Conference on Pharmaceutical Sciences and

Pharmacy Practice dedicated to 225th Anniversary of Pharmaceutical

education in Lithuania in connection with 25th Congress of Lithuanian,

2010 m. spalio 15-17 d., Kaunas. Konferencijos tezių rinkinys, p. 90-

92.

2. Špadienė, Asta, Savickienė, Nijolė, Rodovičius, Hiliaras, Pauliukienė,

Renata, Kazanavičius, Gintautas. „Pacientų, dalyvaujančių projekte

84

“Natūralių antioksidantų poveikio cukrinio diabeto komplikacijų

vystymuisi metodologijos sukūrimas”, atrankos tyrimas“ IV nacionalinė

doktorantų mokslinė konferencija „Mokslas – sveikatai“ : 2011 m.

balandžio 7 d., Kaunas : Konferencijos tezių rinkinys / Lietuvos sveika-

tos mokslų universitetas. ISBN 978-9955-1 p. 100-101, Nr. 2.

3. Špadienė, Asta, Savickienė, Nijolė, Žalinkevičius, Rimantas, Skesters,

Andrejs, Silova, Alise „The intensity of diabetic neuropathy and

aberrancy of plasma oxidative stress parameters in patients with type 2

diabetes”. International Translational Neuroscience Conference: Cele-

brating the 60th Anniversary of Neurosurgery in Lithuania and

establishing the Institute of Neurosciences of Lithuanian University of

Heal. 2011 m. birželio 16-17 d., Kaunas. Konferencijos tezių rinkinys,

p. 80, No. 63.

4. Skesters A., Silova A., Savickiene N., Rusakova N., Larmane L.,

Spadiene A., Moiseev G. „Pедокс-статус крови больных с ново-

выявленным сахарным диабетом 2-го типа”, septintoji tarptautinė

mokslinė konferencija ДОНОЗОЛОГИЯ – 2011 Здоровый образ

жизни и вредные для здоровья факторы, 2011 m. gruodžio 15-16 d.

Sankt Peterburgas. Konferencijos tezių rinkinys p. 637-640.

5. Silova A., Skesters A., Savickiene N., Rusakova N., Spadiene A.,

Moiseev G. „Возможное применение препаратов, содержащих фла-

воноиды, для корррегирования перекисного окисления липидов у

больных сахарным диабетом 2-го типа с микроангиопатиями”,

Septintoji tarptautinė mokslinė konferencija ДОНОЗОЛОГИЯ – 2011

Здоровый образ жизни и вредные для здоровья факторы 2011 m.

gruodžio 15-16 d. Sankt Peterburgas. Konferencijos tezių rinkinys p.

522-524.

6. Asta Spadiene, Nijole Savickiene, Nijole Jurgeviciene, Rimantas Zalin-

kevicius, Antanas Norkus „The Effect of Ginkgo biloba L. leaves

extract on the microcirculation of the eye in patients with type 2

diabetes”. 6th International scientific conference "The Vital nature

sign“, Kaunas, Lithuania, 1-4 June, 2012 . Konferencijų tezių rinkinys

p. 41, No P-17.

7. A. Skesters, A. Silova, A. Spadiene, N. Savickiene, N. Rusakova, L.

Larmane “Correction of oxidative stress in diabetes mellitus patient

85

with natural poliphenols”. 6th World Congress on Polyphenols Appli-

cations, Clinical Evidences, polyphenols & Waste valorisation, 7-6 Juin

2012, Paris, France. Abstract Book , International Society of Antioxi-

dants in Nutrition & Health (ISANH). Paris. ISANH, 2012. (Session K.

Oxidative stress.). p. 23.

8. Asta Spadiene, Nijole Savickiene, Liudas Ivanauskas, Valdas Jakstas,

Hiliaras Rodovicius „Evaluation of antioxidant activity of Green tea

catechins using postcolumn HPLC method”. Achievements and deve-

lopment perspectives of pharmaceutical chemistry and other sciences :

the international conference on pharmaceutical sciences and pharmacy

practice dedicated to 125th Birth Anniversary of prof. Benediktas

Šiaulis. November 24, 2012 Kaunas, Lithuania. Konferencijų tezių

rinkinys, ISBN 978-9955-15-254-5. p. 24.

9. Špadienė, Asta; Savickienė, Nijolė; Rimkienė, Laura; Jakštas, Valdas;

Rodovičius, Hiliaras “Evaluation of antioxidant activity of Ginkgo

biloba flavonoids using postcolumn HPLC method”. The 4th internatio-

nal conference on pharmaceutical sciences and pharmacy practice dedi-

cated to the 75th anniversary of Lithuanian Pharmacopoeia: Book of

abstracts: November 23, 2013, Kaunas, Lithuania. Konferencijų tezių

rinkinys, ISBN 978-9955-15-309-2. p. 24-25.

10. Savickienė, Nijolė; Špadienė, Asta; Šķesters, Andrejs; Silova, Alise;

Norkus, Antanas; Ostrauskas, Rytas “The Effects of natural antioxi-

dants on process of complications in patients with type 2 diabetes”. The

7th International conference on diabetes & obesity 2013 "Strategies,

solutions & challenges" , 24-25 October, Rīga, Latvia. Konferencijų

tezių rinkinys, ISBN 978-9984-793-37-5 ; 978-2-35609-081-2. p. 49.

11. Nijolė Savickienė, Asta Špadienė, Nijole Jurgeviciene, Andrejs Skes-

ters, Alisa Silova, Miglė Francaite-Daugeliene, Rytas Ostrauskas “The

Influence Of Ginkgo Extract On The Microcirculation Of The Eye In

Patients With Type 2 Diabetes”. The Deuel conference on lipids San

Diego, California, March 4 - 7, 2014. Abstract book: p. 26, No. 16.

12. Špadienė, Asta; Lašaitė, Lina; Savickienė, Nijolė; Rodovičius, Hiliaras;

Kazanavičius, Gintautas “The Effects of Ginkgo Biloba L. and Came-

llia Sinensis L. extracts on diabetes-related distress and quality of life in

patients with type 2 diabetes”. 8th International Scientific Conference

86

The Vital Nature Sign, May 15-17, 2014, Kaunas. Abstract book. ISSN

2335-8653. 2014, p. 38, No. P-6.

13. Savickienė, Nijolė; Špadienė, Asta; Šķesters, Andrejs; Silova, Alise;

Norkus, Antanas; Ostrauskas, Rytas; Francaitė-Daugėlienė, Miglė “The

Effects of natural antioxidants on process of complications in patients

with type 2 diabetes”. 8th International Scientific Conference The Vital

Nature Sign, May 15-17, 2014, Kaunas. Abstract book. ISSN 2335-

8653. 2014, p. 27, no. L-16.

87

PRIEDAI Priedas Nr. 1

88

Priedas Nr. 2

OFTALMOLOGINIO TYRIMO ANKETA

1. V be cor. OD , ; OD cor. sph.(+) , ; cor. sph(-) ,

2. V be cor. OS , ; OS cor. sph.(+) , ; cor. sph(-) ,

3. V su cor. OD ,

4. V su cor. OS ,

5. Katarakta 1. senatvinė, 2. komplikuota, 3. nėra OD OS

6. Glaukoma 1. pirminė, 2. pseudoeksfoliacinė, 3. neovaskulinė, 4. nėra. OD OS

OD OS

7. Diagnozė: 1. RD simplex

2. RD preproliferans

3. RD proliferans

4. RD simplex + maculopathia

5. RD proliferans + maculopathia

6. Angiosclerosis retinae sclerotica

7. Angiosclerosis retinae hypert.

8. Kita

8. Gydymas OD OS

1. PLK

2. FLK

3. PLK + FLK

4. LK negydyta

5. IOL 1.yra; 2. nėra

Mikrocirkuliacijos pokyčiai junginės kraujagyslėse:

Kraujagysliniai pakitimai:

(Išraiška balais: 0 balų- pakitimų nėra; 1 balas pakitimas silpnai išreikštas; 2 balai –

stipriai išreikštas arba dažnai pasikartojantis pakitimas).

9. Arteriolių spindis: Balai

1-normalus, 2-susiaurintas, 3-praplėstas

10. Venulių spindis:

1-normalus, 2-susiaurintas, 3- praplėstas

11. Limbinių kapiliarų arterinės dalies spindis:

1-normalus, 2- susiaurintas, 3-praplėstas

12. Limbinių kapiliarų veninės dalies spindis:

1-normalus, 2-susiaurintas, 3- praplėstas

13. Arteriolių vingiotumas:1-yra, 2-nėra

14. Venulių vingiuotumės: 1-yra, 2-nėra

15. Kapiliarų vingiuotumės: 1-yra, 2-nėra

16. Aneurizmos arteriolėse: 1-yra, 2-nėra

17. Aneurizmos venulėse: 1-yra, 2-nėra

18. Aneurizmos kapiliaruose: 1-yra, 2-nėra

19 Kraujagyslinių pakitimų indeksas balais

89

Intravaskuliniai pokyčiai:

20. Kraujotaka: 1- tolygi, 2- ne

21. Eritrocitų agregacija tik venulėse:

1-yra, 2-nėra

22. Eritrocitų agregacija venulėse

ir kapiliaruose: 1-yra, 2-nėra

23. Eritrocitų agregacija venulėse,

kapiliaruose ir arteriolėse: 1-yra, 2-nėra

24. Eritrocitų agregacija ir kraujotakos

išsisluoksniavimas visose

mikrocirkuliacijos grandyse(3 balai):

1- yra, 2-nėra

25. Ištuštėję, obliteruoti kapiliarai(3balai):

1- yra, 2- nėra

26. Intravaskulinių pakitimų indeksas balais

Perivaskuliniai pakitimai:

27. Perivaskulinis paburkimas: 1-yra, 2-nėra

28. Hemoragijos: 1-yra, 2- nėra

29. Hemosiderino atsidėjimas: 1-yra,2-nėra

30. Lipidų atsidėjimas: 1- yra, 2- nėra

31. Perivaskulinių pakitimų indeksas balais

32. Bendras junginės kraujagyslių mikrocirkuliacijos pakitimų indeksas

90

Priedas Nr. 3

NEUROPATIJOS TYRIMO ANKETA (Žymėjimo pavyzdys ):

a) Ar tirpsta jūsų kojos arba pėdos?

b) Ar jūs kada nors jautėte deginantį skausmą kojose arba pėdose?

c) Ar jūsų pėdos pernelyg jautrios prisilietimui?

d) Ar jums būna mėšlungis kojose arba pėdose?

e) Ar jūs kada nors jautėte dilgsėjimą kojose arba pėdose?

f) Ar jums skauda, kai patalynė liečiasi prie jūsų odos?

g) Kai jūs maudotės, ar galite skirti vandens temperatūrą, ar kojos jaučia:

vanduo karštas ar šaltas?

h) Ar kada nors buvo atvira opa ant jūsų pėdų?

i) Ar gydytojas jums kada nors sakė, kad jums yra diabetinė neuropatija?

j) Ar jūs jaučiate silpnumą didesnę paros dalį?

k) Ar simptomai ryškesni nakties metu?

l) Ar jums skauda kojas, kai jūs vaikščiojate?

m) Ar jaučiate savo pėdas, kai vaikščiojate?

n) Ar jūsų pėdų oda tokia sausa, kad net trūkinėja?

o) Ar jums buvo atlikta amputacija?

KAIRĖ: DEŠINĖ

: Vibracijos jutimo slenksčio tyrimas

10 g filamentas

Paviršinis jutimas pėdose

Temperatūros jutimas

Achilo refleksas

Skausmas kojose

Jeigu taip, tuomet skausmo intensyvumas balais (0-10):

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1

0

91

Priedas Nr. 4

92

93

94

95

96

97

Priedas Nr. 5

98

99

100

101

102

103

104

Priedas Nr. 6

105

106

107

108

109

110

Priedas Nr. 7

111

112

113

114

115

116

SUMMARY

INTRODUCTION

Medicinal plants and herbal preparations containing biologically active

compounds are widely used for the prevention and treatment of various

diseases. Medicinal plants, as natural antioxidants, prevent the formation of

free radicals, inhibit them, or participate in their degradation process.

Phenolic compounds are the main group of compounds in plants that

determine antioxidant activity [1]. Dried extracts of Ginkgo biloba (Ginkgo

biloba L.) and green tea (made from Camellia sinensis L.) leaves are usually

used for treatment and prophylactic purposes. A wide application of extracts

in medicine is determined by their active substances - flavonoids and

terpenoids in Ginkgo biloba extract, and catechins in green tea extract. Due

to a complex functioning of the biologically active compounds, extracts are

of higher efficiency if compared to their individual isolated components.

Ginkgo biloba and green tea extracts have strong antioxidant properties and

can be used to reduce oxidative stress.

Oxidative stress plays an important role in the pathogenesis of diabetes

mellitus ant its complications. Uncontrolled diabetes leads to the develop-

ment of complications, and this increases the cost of treatment and decreases

the quality of life of such patients. According to the data of the International

Diabetes Federation, annual diabetes-related medical cost per capita in

Lithuania amounts to USD 1142 (around EUR 840) [3]. This cost can be

reduced if more attention were paid to the prevention of diabetic compli-

cations. Natural antioxidants may serve as means to reduce oxidative stress.

The number of scientific studies has increased over the past decade,

proving the antioxidant properties of Ginkgo biloba and green tea extracts.

However, it has not been determined whether the aforementioned extracts

can inhibit lesions caused by the oxidative stress in patients with diabetes

mellitus, and thus slow the development of diabetic kidney, eye and nerve

tissue lesions.

The aim of the research was to evaluate the antioxidant activity of dry

Ginkgo biloba leaf extract (EGB) and dry green tea extract (ECS) and their

effect on the diabetic kidney, eye, and nerve tissue damage.

Tasks of the research:

1. To identify the antioxidant activity of the biologically active com-

pounds of the dry green tea extract (catechin, epicatechin, epigallocate-

117

chin, epicatechin gallate, and epigallocatechin gallate) by using post-

column high-performance liquid chromatography.

2. To identify the antioxidant activity of the biologically active com-

pounds of the dry Ginkgo biloba leaf extract (quercetin, kaempferol,

and isorhamnetin) by using post-column high-performance liquid chro-

matography.

3. To evaluate the impact of green tea dry extract on the diabetic kidney,

eye, and nerve tissue lesions in patients with Type 2 diabetes mellitus

after 9 and 18 months of intake, and to compare this effect with that of

placebo.

4. To evaluate the impact of Ginkgo biloba dry extract on the diabetic

kidney, eye, and nerve tissue lesions in patients with Type 2 diabetes

mellitus after 9 and 18 months of intake, and to compare this effect with

that of placebo.

5. To evaluate the impact of green tea dry extract on oxidative stress

parameters (TAS, antioxidant enzymes (SOD, CAT, GPx), the indices

of lipid peroxidation (LOOH, MDA, 4-HNE), and vitamin E in the

blood of patients with Type 2 diabetes mellitus after 9 and 18 months of

intake, and to compare this effect with that of placebo.

6. To evaluate the impact of Ginkgo biloba dry extract on oxidative stress

parameters (TAS, antioxidant enzymes (SOD, CAT, GPx), indices of

lipid peroxidation (LOOH, MDA, 4-HNE) and vitamin E in the blood

of patients with Type 2 diabetes mellitus after 9 and 18 months of

intake, and to compare this effect with that of placebo.

Novelty and scientific value:

There were no such wide-scale studies carried out in European states (or

in other states of the world) that would aim at determining the impact of

natural antioxidants (dry green tea extract and dry Ginkgo biloba extract) on

the development of diabetic kidney, eye, and nerve tissue lesions. We have

evaluated the antioxidant activity of the main biologically active compounds

of dry green tea extract and dry Ginkgo biloba extract that are responsible

for the antioxidant properties of the extracts. This was the first time when,

by applying the post-column HPLC-DPPH method, the domination of the

free radical-scavenging activity of the flavonoids (quercetin and kaempfe-

rol) in the Ginkgo biloba extract over the other compounds of this extract

was determined - as well as the domination of the free radical-scavenging

activity of the catechin fraction over the other compounds in the green tea

extract. For the standardisation of the green tea extract or its preparations, it

is also recommended to evaluate the level of the antioxidant activity of the

118

dominant catechin – epigallocatechin gallate (currently, standardisation is

based only on the total level of polyphenols).

We have evaluated the impact of the aforementioned extracts on the

disorders of small blood vessels caused by diabetes mellitus, i.e. disorders

of the capillaries and arterioles of the retina, renal glomeruli, the distal area

of the legs, and nerve trunks. We have also evaluated the oxidative stress

parameters (TAS, antioxidant enzymes (SOD, CAT, GPx), indices of lipid

peroxidation (LOOH, MDA, 4-HNE) and levels of vitamin E) in the blood

of patients with Type 2 diabetes mellitus (DM), and compared these para-

meters after 9 and 18 months of the use of the studied extracts. It was the

first time when we evaluated the antioxidant effect of these extracts after

their long-term use (18 months), and compared the effect of the extracts

after the use according to the manufacturers’ recommendations – i.e. one

capsule two or three times a day (400 mg and 600 mg of dry green tea

extract per day, or 160 mg and 240 mg of dry Ginkgo biloba extract per day,

respectively).

The research results are important for patients with diagnosed Type 2

DM in its initial stage, and for those who have less developed complications

of diabetes or at the very onset of such complications. These herbal antioxi-

dants are recommended as a preventive measure, which reduces oxidative

stress to the body and delays the occurrence of DM complications.

This scientific research was carried out by implementing the Eureka E!

3695 Project “Creation of the Methodology for Effects of Natural Antioxi-

dants on the Development of the Diabetes Mellitus Complications”,

partially funded by the European Social Fund Agency from the Structural

Funds according to the Agreement of the Association regarding the project

“Eureka” Research and Development Projects – Eureka (Eureka)” (VP1-

3.1-ŠMM-06-V-01-003).

RESEARCH OBJECTS AND METHODS

Objects of the research: capsules with 200 mg of green tea extract,

containing 173 mg or 168.4 mg of polyphenols per capsule (Lot No.

010609, EXP 06.2011 and Lot No. 020611, EXP 06.2013, respectively)

(JSC Sanitas, Lithuania), and capsules with 80 mg of Ginkgo biloba extract,

containing 22.11 mg of flavonoids and 5.28 mg of terpene lactones per

capsule (Lot No. 90107, EXP 04.2012) (JSC Aconitum, Lithuania). The

research also included the use of placebo capsules (JSC Sanitas, Lithuania)

which were made from microcrystalline cellulose.

119

The preparations used in the research were food supplements registered

in Lithuania. The doses used in this research comply with the manufac-

turer’s recommendations and do not exceed the established total daily

intake.

Patients and study design. A double-blind placebo-controlled prospec-

tive biomedical trial was carried out at Clinic of Endocrinology of the Hos-

pital of the Lithuanian University of Health Sciences (LSMU) Kauno Klini-

kos. The duration of the trial was 18 months. All participants were outpa-

tients of the Clinic of Endocrinology, Hospital of the LSMU Kauno Klini-

kos. Subjects diagnosed with type 2 diabetes mellitus (treated with insulin,

metformin, or a combination of both) aged from 35 years to 80 years and

followed up for diabetic retinopathy, nephropathy, or neuropathy, were

enrolled into the study. The exclusion criteria included HbA1c > 13 %, BMI

> 45 kg/m2, a history of uncontrolled hypertension, other significant medical

problems (major cardiovascular, hepatic, and other endocrine diseases),

hypersensitivity to the test drug, and not being able to comply with the study

protocol. The experimental protocol used in this study was approved by the

Lithuanian Bioethics Committee and the State Data Protection Inspectorate.

A written informed and voluntary consent was obtained from all partici-

pants.

All patients were randomised into groups, and were treated with green

tea extract capsules (the ECS group), Ginkgo biloba extract capsules (the

EGB group), or placebo capsules (the placebo group). The patients had one

capsule twice daily during the first nine months and one capsule three times

daily during the remaining nine months. This scientific work analyses the

data on the 71 patients who received dry green tea, Ginkgo biloba leaf

extracts, or placebo capsules, and participated in the study during all 18

months.

The antiradical activity of the active compounds of dry green tea and

Ginkgo biloba extracts was determined by applying the post-column

HPLC-DPPH method [124]. The antiradical activity was calculated accor-

ding to the reference antioxidant – trolox, and it was expressed by the

Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC). The HPLC analysis of the

green tea extract was performed on the basis of the method described by

Saito et al. [125]. The HPLC analysis of the Ginkgo biloba extract was

carried out on the basis of the European Pharmacopoeia 6.1 [37].

To evaluate the oxidative stress, we evaluated the activity of antioxi-

dant enzymes (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione

peroxidase (GPx)), the total antioxidant activity (TAS), the level of sele-

nium and vitamin E, and the concentration of lipid peroxidation parameters

120

(lipid hydroperoxides (LOOH), malondialdehyde (MDA), 4-hydroxynone-

nal (4-HNE)) in blood plasma samples. All the tests were conducted in the

Laboratory of Biochemistry at Riga Stradins University in Latvia [126-133].

Blood plasma samples of the biomedical trial participants were tested at

baseline and after 9 and 18 months of intake.

General studies and the evaluation of diabetic kidney lesions: the

patients’ histories were recorded, the medical documents were evaluated,

and non-invasive anthropometric data were collected at the beginning of the

trial. Biochemical blood tests (glycated haemoglobin (HbA1c), renal func-

tion indicators (potassium, urea, creatinine), liver enzymes (ALT, AST,

GGT)) and urine tests (determination of albumin per day), and functional

cardiac testing (electrocardiogram recorded by an electrocardiograph) were

carried out at baseline and after 9 and 18 months of intake.

Diabetic kidney lesions were evaluated depending on the amount of urea

and creatinine in the serum and the amount of daily albumin in the urine.

Evaluation of diabetic eye lesions: the research was carried out accor-

ding to a standardised testing scheme that was used as the basis for the

creation of the registration form of the previous results [134, 135]. The

ophthalmological examination was carried out using the magnifying (from 7

to 45 times) Marco V Slit Lamp system. During the research, the Volk

lenses (Volk Optical, Mentor, USA) with 60D and 78D (dioptres) were

used. All ophthalmological examinations were performed by the same medi-

cal specialist at baseline and after 9 and 18 months of intake.

Evaluation of diabetic nerve tissue lesions: the research was carried out

according to a standardised testing scheme, on the basis of which a form of

the questionnaire was created to record the results. The neurological exami-

nation was carried out using the Michigan Neuropathy Screening Instrument

[136, 137]. A special quantitative testing was performed to evaluate the

peripheral senses: the vibration sensation threshold in the feet, the Semmes-

Weinstein 10g monofilament test, the Achilles tendon reflex test, the tempe-

rature sensitivity threshold test, and the pin-prick test. All neurological

examinations were performed by the same medical specialist at baseline and

after 9 and 18 months of intake.

Statistical Analysis: The statistical analysis was carried out using the

standard statistical software packages – STATISTICA 6.0a and SPSS for

Windows 20.0. To evaluate the continuous variables, the mean (m) and the

standard error (SE) of the mean were calculated. Nonparametric tests were

used because of the small number of variables. The comparisons between

the groups were made by using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test

at each time point. The comparisons between three different measurements

121

were made using Wilcoxon and Friedman tests. The correlations between

the variables were evaluated using the Spearman correlation coefficient.

Multinomial logistic regression analysis was used to analyse the predictive

value of green tea and Ginkgo biloba dry extracts for the oxidative stress

parameters and diabetic kidney, eye, and nerve tissue lesions. The results

were considered statistically significant at p <0.05.

RESEARCH RESULTS AND DISCUSSION

1. Evaluation of the antioxidant activity of catechins in dry green tea

extract

We evaluated the ability of five main catechins of the green tea extract

(catechin (C), epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate

(ECG), and epigallocatechin gallate (EGCG)) to inactivate the DPPH

radicals. According to the TEAC value, EGCG had the strongest antioxidant

properties (234.07±28.65 mg/g), while ECG (163.58±19.18 mg/g), EGC

(40.62±1.19 mg/g), and EC (15.73±0.97 mg/g) were less strong, and C

(1.51±1.07 mg/g) was the least strong. The total antioxidant activity of the

evaluated catechins was 457.14 mg/g, and therefore we can suggest that one

gram of green tea extract has at least the same antiradical activity as 0.5 g of

a standard antioxidant trolox.

Our results are consistent with literature data indicating that EGCG in the

green tea extract has the strongest antiradical and antioxidant properties [10,

12, 138]. Meanwhile, the test results of the antioxidant activity of EGC and

ECG are contradictory, and therefore it is not possible to unambiguously

state which one of them has stronger antioxidant properties. Based on the

data of our research, according to the antioxidant activity, catechins can be

arranged in the following sequence: epigallocatechin gallate > epicatechin

gallate > epigallocatechin > epicatechin > catechin. The same sequence was

also described by Higdon and Frei [22]. Epigallocatechin gallate, distin-

guished by the strongest antioxidant properties, can be used as a quality

parameter to evaluate the antioxidant activity of green tea extract prepara-

tions.

2. Evaluation of the antioxidant activity of flavonoids in dry Ginkgo

biloba leaf extract

Flavonoids are the main compounds determining the antioxidant activity

of the Ginkgo biloba extract (EGB) [33, 38, 39], and therefore the capacity

122

of the main EGB flavonoids – quercetin, kaempferol, and isorhamnetin – to

scavenge the DPPH radicals was evaluated.

With respect to the TEAC values, quercetin had the highest antioxidant

activity (27.96±0.17 mg/g), while kaempferol and isorhamnetin exhibited

lower activity (the TEAC was 9.52±0.26 mg/g and 2.99±0.28 mg/g, respec-

tively). The total antioxidant activity of the evaluated flavonoids was 40.76

mg/g. Flavonoids in one gram of this extract had at least the same antiradi-

cal activity as 40 mg of a standard anti-oxidant troloxin did.

3. General characteristics of the patients

The research included 71 patients: 26 patients (12 males and 14 females)

received capsules of Gingko biloba dry extract (the EGB group); 20 patients

(9 males and 11 females) received capsules of green tea extract (the ECS

group), and 25 patients (7 males and 18 females) received placebo capsules

(the placebo group). The patients who participated in the study had type 2

diabetes mellitus (DM) for, on the average, 10.87 ± 0.9 years (12.1±1.6

years, 9.1±1.1 years, and 11.0±1.5 years, respectively, in the EGB, ECS,

and placebo groups). The mean age of the patients was 61.46±1.2 years

(62.2±2.2 years, 61.3±2.1 years, and 61.6±1.9 years, respectively, in the

EGB, ECS, and placebo groups). There were no significant differences in the

age and the duration of DM between the groups. In total, 23.9% of the

research subjects were treated with metformin, 31.0% - with insulin, and

45.1% - with a combination of metformin and insulin. The majority of the

research subjects identified themselves as non-smokers (88.7%), including

15.5% who quit smoking after being diagnosed with DM.

Diabetic neuropathy was diagnosed in 91.5% of the patients. Diabetic

retinopathy was diagnosed in 21.2%, and diabetic nephropathy – in 8.4% of

the patients. The majority of the research subjects (72.1% of all the partici-

pating females and 71.4% of all the males) indicated that they had arterial

hypertension, but their arterial blood pressure was regulated by medications.

The study showed that the majority of the research subjects were over-

weight (95.8%) (i.e. the body mass index was > 25). The mean body mass

index was 32.86±1.5 in the EGB group, 34.83±1.3 - in the ECS group, and

35.38±1.3 - in the placebo group. The biochemical blood test results showed

that the mean level of glycated haemoglobin (HbA1c) was 8.10±0.22%

(7.66±0.3%, 7.41±0.5%, and 8.41±0.6%, respectively, in the EGB, ECS,

and the placebo groups). The recommended level of glycated haemoglobin

for patients with diabetes mellitus is < 6.5%. The level of HbA1c exceeding

6.5% was observed in 84.4% of the studied patients. The HbAc1 levels and

123

the body mass index (BMI) remained similar (i.e. without statistically signi-

ficant changes) in all groups throughout the research.

Summarising the data, we can suggest that risk factors leading to the

progression of diabetic kidney, eye, and nerve tissue lesions were observed

in the majority of the patients. These included the subjects’ age, body mass

index, abdominal-type obesity, and diagnosis of arterial hypertension. These

changes are caused by the oxidative stress typical to progression of diabetes

mellitus.

4. Evaluation of the effect of dry green tea and Ginkgo biloba leaf

extracts on diabetic kidney lesions

At the baseline of the biomedical trial, six (8.4%) patients were

diagnosed with diabetic nephropathy, which was confirmed by objective

testing. Daily albumin level in urine and blood levels of creatinine and urea

were among the most important criteria for the evaluation of the diabetic

kidney lesions. No statistically significant differences in microalbuminuria

were observed either between the groups or between individual measure-

ments within groups. A linear dependence (r = 0.53, p<0.001) was found

between an increase in creatinine levels and an increase in the urea level.

The evaluation of the mean level of urea did not show any statistically

significant difference between the groups or between individual measure-

ments within groups. Meanwhile, a trend of a decline in creatinine levels

was observed among male patients in all the groups; however, a statistically

significant decrease in the creatinine level was only determined in the EGB

group after 18 months of intake (by 18.87 µmol/L (from 93.17±7.2 µmol/L

to 74.3±4.1 µmol/L), p = 0.025), in comparison to the baseline data. Creati-

nine levels among female subjects were without any significant changes throughout the study. An increase in creatinine levels is associated with more

extensive kidney damage.

5. Evaluation of the effect of dry green tea and Ginkgo biloba leaf

extracts on diabetic eye lesions

During the research, we evaluated vascular, intravascular, and perivascu-

lar alterations, and calculated the total conjunctival index (TCI). At the

beginning of the research, diabetic retinopathy was diagnosed in only 21.2%

of the patients. However, at baseline, all the patients, regardless of the dura-

tion of diabetes mellitus, had changes in the conjunctival microcirculation;

the mean value of the total conjunctival index was 20.40±0.4 (exceeding the

norm by almost three times).

124

There were no statistically significant differences between the groups.

When the data were analysed separately for each of the groups, significant

differences were observed between three different measurements in the

EGB group. The index of the vascular changes in the EGB group decreased

by 1.0 point after 9 months (from 10.41±0.38 to 9.41±0.38, p = 0.007), and

by 0.83 point - after 18 months (to 9.58±0.42, p = 0.016), compared to the

baseline data. The index of perivascular changes in the EGB group

decreased by 0.5 point after 9 months (from 2.54±0.18 to 2.04±0.18,

p = 0.039), and by 0.75 point - after 18 months (to 1.79±0.2, p = 0.004),

compared to the baseline data. Although the TCI decreased in all the groups,

this decline was statistically significant only in the EGB group after 9

months (decreased by 1.38 points (from 20.96 to 19.58), p = 0.003)) and

after 18 months (decreased by 1.64 points (to 19.32), p = 0.003), compared

to the baseline data. Therefore, we can assume that the Ginkgo biloba

extract had a positive impact on vascular changes (diameter, sinuosity and

microaneurysms of the arterioles, venules, and capillaries) and perivascular

changes of the ocular conjunctiva (perivascular intumescence, haemorrha-

ges, accumulation of haemosiderin, and lipid infiltration of the conjunctiva),

but further exploration needs to be done to confirm this effect with more

patients. Meanwhile, there were no significant differences observed in the

ECS group either between individual measurements within the group or

when comparing to the placebo group.

6. Evaluation of the effect of dry green tea and Ginkgo biloba leaf

extracts on diabetic nerve tissue lesions

At baseline, diabetic neuropathy was diagnosed in 91.5 % of the research

subjects. The fact that the research was conducted with older patients with

long-term progression of DM resulting in obvious diabetic changes might

have made a significant impact on the results. We have found no statistically

significant differences in diabetic nerve tissue lesions between the groups.

However, there were some significant changes within the groups.

Diabetic neuropathy is characterised by a burning pain in the legs. At

baseline, 49.3% of the research subjects felt pain in their legs (mean

1.87±0.3 strength), and 7.04% of the patients evaluated the intensity of pain

by ≥ 6 points (burning pain). At baseline, the evaluation of the intensity of

pain in the legs by points in the EGB and ECS groups was significantly

higher than in the placebo group (p < 0.05). A trend of decreasing pain

intensity (although not statistically significant) was observed in the EGB

125

and ECS groups. Meanwhile, a trend of increasing pain intensity ascending

was observed in the placebo group.

26.8% of the research subjects had their vibration sensation threshold

(VST) at ≥ 25 V (mean VST was 25.29±1.4 V) at the baseline of the trial. A

statistically significant reduction in the vibration sensation threshold was

observed in the EGB group after 9 months (by 5.59 V (from 27.3 V to 21.71

V), p = 0.01) and after 18 months (by 6.02 V (to 21.28 V), p = 0.01), and in

ECS group - after 18 months (by 1.98 V (from 24.42 V to 22.44 V), p =

0.04), as compared with the data at baseline.

7. Evaluation of oxidative stress parameters in the plasma of patients

with type 2 diabetes

In patients with diabetes mellitus, hyperglycaemia promotes the forma-

tion of reactive oxygen species [93, 96, 97]. Such factors as smoking, obe-

sity, lack of physical activity, hypertension, long-term progression of DM,

and an older age of the patients also affect the intensity of oxidative stress.

Oxidative stress, consequently, exacerbates DM and promotes the progres-

sion of diabetic lesions and DM complications. At baseline, the samples of

blood plasma of all patients showed an increased level of malondialdehyde

(MDA) and 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE). Meanwhile, there was no

increase in the activity of the endogenous antioxidant defence system as a

response to an increased lipid peroxidation. This confirms the hypothesis

that diabetes mellitus is associated with an intensive formation of reactive

oxygen species and lipid peroxidation. Although the activity of antioxidant

enzymes was within the normal range, the blood plasma samples of all

patients showed a reduced level of selenium, which is vital for glutathione

peroxidase (GPx). The level of selenium was 75.50±2.7 µg/Lin in the EGB

group, 78.50±3.7 µg/Lin in the ECS group, and 77.52±3.2 µg/Lin in the

placebo group (the normal range of selenium levels is within 80-120 µg/L).

The evaluation of the oxidative stress parameters between patients treated

with placebo and the green tea extract or Ginkgo biloba extract did not show

any statistically significant difference, except for the level of lipid hydro-

peroxides (LOOH) and MDA. However, we have detected certain signi-

ficant changes in oxidative stress parameters within groups when comparing

between individual measurements. Although the level of vitamin E was

within the normal range (5-16 µg/mL) throughout the study, a significant

decrease in the level of vitamin E was observed in the placebo group (the

mean concentration of vitamin E at baseline was 15.81±0.9 µg/mL, after 9

months – 13.18±0.8 µg/mL, and after 18 months – 12.03±0.7 µg/mL,

126

p < 0.05). The level of LOOH significantly decreased in the EGB group

after 9 months (by 2.32 µM (from 7.38±0.53 µM to 5.06±0.34 µM),

p = 0.001), compared with the baseline, and the level of MDA significant

decreased both in the EGB group after 18 months (by 0.43 µM (from

1.75±0.09 µM to 1.32±0.11 µM), p = 0.005) and in the ECS group after 9

months (by 0.3 µM (from 1.81±0.15 µM to 1.51±0.09 µM), p = 0.022) and

18 months(by 0.19 µM (to 1.62±0.19 µM), p = 0.047), compared with the

data at baseline.

When evaluating the effects of green tea and Ginkgo biloba extract on

oxidative stress parameters in comparison with placebo, a significant

decrease in the level of LOOH after 9 months (5.06±0.34 µM and

7.24±0.64 µM, respectively, in the EGB and the placebo groups, p = 0.009)

and the level of MDA after 18 months (1.32±0.11 µM and 1.89±0.25 µM,

respectively, in the EGB and the placebo groups, p = 0.018) was observed in

the EGB group. These results are consistent with those obtained in previous

studies, which showed a decrease in the level of MDA when treated with

ECS or EGB extracts [4, 50, 115]. However, our research did not show any

positive effect of the extracts on the increase in TAS, as described by other

researchers [13, 40]. We did not observe any significant influence of EGB

or ECS on other lipid peroxidation parameters as compared with the placebo

group.

8. Overview of the results

The antioxidant activity of dry green tea extract depends on catechins [5,

10, 12, 20]. Meanwhile, the research results on the evaluation of the anti-

oxidant activity of Ginkgo biloba extract and its active compounds are very

controversial. According to the sources of literature, EGB terpenoids do not

have and antiradical or lipid peroxidation-inhibiting properties, and the anti-

oxidant activity of the extract depends on flavonoids found in the

composition of the extract [34, 38, 39, 42]. The available data shows that

terpenoids can enhance the antioxidant activity of flavonoids [41, 42]. Fla-

vonoids participate in various oxidation, reduction, methylation, glucuroni-

dation, and sulfonation reactions in vivo, and the resultant metabolites

contribute to the overall effect of the Ginkgo biloba extract in vivo [42].

Therefore, we evaluated the main biologically active compounds that, based

on the sources of literature, determine the antioxidant activity of the

extracts, i.e. the ability to scavenge free DPPH radicals. The results showed

that the total antioxidant activity of green tea catechins (catechin,

epicatechin, epigallocatechin, epicatechin gallate, and epigallocatechin gal-

127

late) expressed by the trolox equivalent antioxidant capacity was

457.14 mg/g. Meanwhile, the activity of Ginkgo biloba flavonoids (quer-

cetin, kaempferol, and isorhamnetin) expressed by the trolox equivalent

antioxidant capacity (TEAC) was 40.76 mg/g. Based on these results, we

can suggest that catechins in the green tea extract have stronger antioxidant

properties than the flavonoid fraction in the Ginkgo biloba extract do. The

evaluation of the antioxidant effect of these extracts in vivo (in patients with

Type 2 DM) showed that both Ginkgo biloba extract and green tea extract

had antioxidant properties. There was a significant decrease in MDA levels

in the EGB group after 18 months of intake (160 mg of Ginkgo biloba

extract per day for the first 9 months, and 240 mg per day – during the next

9 months) and in the ECS group after 9 and 18 months of intake (400 mg of

the green tea extract for the first 9 months, and 600 mg of the extract during

the next 9 months), compared with baseline data. The level of LOOH signi-

ficantly decreased in the EGB group after 9 months (160 mg of the Ginkgo

biloba extract per day) in comparison with baseline measurements. We also

found a positive effect of the Ginkgo biloba extract on the decrease in

LOOH levels (after 9 months) and MDA levels (after 18 months) as

compared with placebo. Meanwhile, we did not find any significant impact

of these preparations on the change in the levels of TAS or 4-HNE. MDA

and LOOH are the products of lipid peroxidation induced by excess of free

radicals. Therefore, a drop in MDA and LOOH levels shows the positive

effect of these extracts on the inhibition of the lipid peroxidation processes.

Based on the previous studies with rodents in vitro and in vivo, the afore-

mentioned extracts can reduce the oxidative stress by a direct inactivation of

the reactive oxygen species and by an indirect promotion of the production

of antioxidant enzymes [4, 6, 12, 39, 41]. We have found some trends of the

antioxidant enzyme (SOD, CAT, GPx) activity in different groups of

patients and at different stages of the research, but we cannot conclude that

green tea and Ginkgo biloba leaf extracts have positive effects on the

activity of these enzymes because there were no significant differences com-

pared with the placebo group. According to the sources of literature, the use

of these extracts increases the level of TAS [13, 40] and reduces the level of

MDA in blood serum [50, 115]. We have also observed a trend of

decreasing vitamin E levels in the placebo group. This suggests that the

organisms of placebo users used the endogenous antioxidant reserves more

intensively to fight free radicals. Meanwhile, the antioxidant system of cell

protection was “complemented” by herbal antioxidants in the EGB and ECS

groups, and therefore, after 18 months, the resources of vitamin E did not

128

decrease significantly. However, to confirm this statement, more detailed

studies with more patients should be carried out.

Although the evaluation of the antiradical activity by applying the

DPPH-HPLC method showed that ECS catechins had a higher antiradical

activity than EGB flavonoids did, the Ginkgo biloba extract had a better

pharmacological effect on patients with Type 2 DM. The evaluation of the

overall impact of the green tea extract on the diabetic kidney, eye, and nerve

tissue lesions did not show any statistically significant differences between

the ECS and the placebo groups. However, the evaluation of the data

between different measurements (after 9 and 18 months of intake) within the

ECS group showed a significant reduction in the vibration sensation

threshold after 18 months of treatment with the dry green tea extract (400

mg per day for the first 9 months, and 600 mg per day - during the next 9

months). The green tea extract did not have any significant impact on other

indicators of diabetic kidney, eye, or nerve tissue lesions either throughout

the study period or when comparing with the placebo group. Although the

sources of literature described several cases of a possible positive impact of

ECS on diabetic kidney lesions (a reduction in creatinine and albumin

levels) [113] and on diabetic eye lesions [109, 110, 118] in rodent models,

our research with patients with type 2 DM did not confirm this effect. The

use of the Ginkgo biloba extract did not have any significant impact on

kidney, eye, or nerve tissue lesions in patients with type 2 diabetes mellitus

as compared with the placebo group either. However, the evaluation of the

data between different measurements (after 9 and 18 months of intake)

within the EGB group showed a significant drop in creatinine levels among

males, and also a significant reduction in the vibration sensation threshold

after 18 months of treatment with the dry Ginkgo biloba extract (160 mg per

day for the first 9 months, and 240 mg per day – during the next 9 months).

The indexes of vascular and perivascular changes in the ocular conjunctiva

as well as the total conjunctival index also decreased in the EGB group after

9 (160 mg of the extract per day) and 18 months (160 mg per day for the

first 9 months, and 240 mg per day – during the next 9 months) of intake as

compared with baseline measurements. These data do not contradict the

results of other scientists, which prove a positive impact of EGB [34, 43, 54,

56, 58, 120, 121, 143]. Although the mechanism of a positive impact of

EGB on diabetic kidney, eye, an nerve tissue lesions is not fully researched,

we assume that this impact depends on the antioxidant properties of

flavonoids and the ability to neutralise free radicals and to reduce lipid

peroxidation [121], as well as on a positive impact of terpenoids on the

rheological parameters of blood, which leads to better microcirculation [34,

129

54, 56]. The available data shows that terpenoids can also have antioxidant

properties [34, 51]; however, these data are very controversial, and to

confirm this statement, further research on the evaluation of the antiradical

activity of individual terpenoids should be carried out.

Based on the multinomial logistic regression analysis and the compara-

tive analysis, we can conclude that green tea consumption is expected to

have a positive effect only on the level of vitamin E. - i.e. the level of

vitamin E will be by 1.2 times higher in the group receiving green tea

extract than in placebo-treated patients. Meanwhile, the consumption of the

dry Ginkgo biloba leaf extract will have a positive effect on the indexes of

the intravascular and perivascular changes of the ocular conjunctiva –

respectively, by 1.2 and 1.3 times lower when using the extract, compared

with placebo.

A recent study with metformin revealed possible antioxidant properties

of metformin [145, 146]; however, the data of our research shows that

pharmaceutical treatment of DM with metformin, insulin, or a combination

of both of these medications did not significantly change the indicators of

diabetic kidney, eye, or nerve tissue lesions or the oxidative stress

parameters.

All of the preparations in the study have been used two times per day

during the first nine months (400 mg of dry green tea extract or 160 mg of

dry Ginkgo biloba leaf extract) and three times per day - during the second

nine months (600 mg of dry green tea extract or 240 mg of dry Ginkgo

biloba leaf extract). The analysis of the effect of ECS and EGB concentra-

tions did not show any significant difference between the dosage regimens –

i.e. when the preparations were used twice or three times per day. Mean-

while, a positive effect of ECS on the vibration sensation threshold after 18

months and a positive effect of EGB on creatinine levels in males, the vibra-

tion sensation threshold, the total conjunctival index and the indexes of

vascular and perivascular changes in the ocular conjunctiva after 18 months

of intake can be linked not only to a higher concentration of these extracts,

but also to the long-term use.

In summary, the results of our study did not show a more obvious impact

of the dry green tea and Ginkgo biloba extracts on the diabetic kidney, eye,

and nerve tissue lesions. The trend of the improvement in some indicators

observed in the ECS and EGB groups was not confirmed by the comparison

with the placebo group. This could have been influenced by an older age of

the patients, a long-term advanced progression of DM, an increased level of

HbA1c, the already diagnosed diabetic complications with obvious diabetic

changes, and also by the small number of subjects in each group. Therefore,

130

it would be useful to conduct a study with patients who had timely

diagnosed type 2 DM (i.e. in the initial stage of the disease and in the initial

stage of diabetic complications) in order to evaluate the impact of the

aforementioned extracts on the diabetic kidney, eye, and nerve tissue

lesions. It would also be useful to repeat the study with more patients in

order to confirm the positive effect of dry green tea and Ginkgo biloba leaf

extracts on patients with type 2 diabetes and to confirm or reject the

observed trends.

CONCLUSIONS

1. The total antioxidant activity of catechins in the dry green tea extract was

evaluated as TEAC 457.14 mg/g. Epigallocatechin gallate had the stron-

gest antioxidant properties, and can therefore be used as a qualitative

parameter when assessing the antioxidant activity of green tea prepa-

rations.

2. The total antioxidant activity of the flavonoid fraction in the dry Ginkgo

biloba leaf extract was evaluated as TEAC 40.76 mg/g. Quercetin proved

to have the strongest antioxidant properties, and can therefore be used as

a qualitative parameter when assessing the antioxidant activity of Ginkgo

biloba preparations.

3. A significant reduction in the vibration sensation threshold was found in

the group of patients treated with the dry green tea extract after 18

months (the patients received 400 mg of the extract per day for the first 9

months, and 600 mg per day – during the next 9 months), compared with

the baseline data.

4. A significant reduction in the vibration sensation threshold and creatinine

levels in males was found in the group of patients treated with the dry

Ginkgo biloba leaf extract after 18 months (the patients received 160 mg

of the extract per day for the first 9 months, and 240 mg per day – during

the next 9 months), compared with the baseline data. There also was a

significant decrease in the total conjunctival index and the indices of

vascular and perivascular changes in the ocular conjunctiva after 9 and

18 months of intake, compared to baseline measurements.

131

5. Dry green tea and dry Ginkgo biloba leaf extracts, compared to placebo,

did not have any significant effect on the diabetic kidney, eye, or nerve

tissue lesions.

6. A decrease in the level of malondialdehyde was observed in the group of

patients treated with the dry green tea extract after 18 months (the

patients received 400 mg of the extract per day for the first 9 months, and

600 mg per day – during the next 9 months), compared to baseline

measurements.

7. There was no significant effect of the dry green tea extract, compared to

placebo, on oxidative stress parameters in the plasma of patients with

type 2 diabetes.

8. A decrease in the level of malondialdehyde was observed in the group of

patients treated with the dry Ginkgo biloba extract after 18 months (the

patients received 160 mg of the extract per day for the first 9 months, and

240 mg per day – during the next 9 months), and a decrease in the level

of lipid hydroperoxide was observed after 9 months of intake, compared

with baseline measurements.

9. Dry Ginkgo biloba leaf extract, as compared to placebo, significantly

reduced the lipid peroxidation processes: the level of lipid hydroperoxide

significantly decreased after 9 months of intake (160 mg per day). There

was no difference from placebo after prolonged use of the extract. The

level of malondialdehyde significantly decreased after 18 months of

intake (160 mg of extract per day for the first 9 months, and 240 mg per

day – during the next 9 months).

132

GYVENIMO APRAŠYMAS

Vardas Asta

Pavardė Špadienė

Adresas: Eivenių g. 4, Kaunas

Elektroninis paštas: astaspadiene@gmail.com

Išsilavinimas

1999–2004 Farmacijos magistras, Kauno medicinos

universitetas

1995–1999 Kauno “Aušros” gimnazija

1986–1995 Kauno “Aušros” vidurinė mokykla

Kvalifikacija

Nuo 2004 Vaistininko profesinė kvalifikacija

Darbo patirtis

Nuo 2008 LSMU Farmacijos f-tas, Vaistų chemijos k-dra,

asistentė

Nuo 2005 Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba, vyriausioji

specialistė

2004–2008 LSMU Farmacijos f-tas, Farmacinės chemijos ir

farmakognozijos katedra, asistentė

2002–2004 UAB „Kanadiečių vaistinė“, farmakotechnikė

133

PADĖKA

Dėkoju visiems, kurie padėjo man sėkmingai įvykdyti doktorantūros

studijas.

Nuoširdžiai dėkoju mokslinio darbo vadovei prof. N. Savickienei už

paskatinimą dalyvauti doktorantūros studijose, pasitikėjimą, kantrybę,

pagalbą ir patarimus dalyvaujant projekte, vykdant tyrimus bei rengiant

disertaciją.

Nuoširdžiai dėkoju Vaistų chemijos katedros vedėjui prof. H. Rodovičiui

ir visam kolektyvui už suteiktą galimybę tęsti mokslus doktorantūros

studijose, palankias darbo sąlygas, draugišką atmosferą, gerą nuotaiką ir

palaikymą.

Dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof.

L.Ivanauskui ir jos kolektyvui už suteiktą galimybę atlikti antioksidacinio

aktyvumo vertinimo tyrimus, pagalbą atliekant efektyviosios skysčių

chromatografijos analizę, už puikias darbo ir technines sąlygas mokslinio

tiriamojo darbo įgyvendinimui, materialinę bazę.

Ypatingai dėkoju LSMU MA Endokrinologijos klinikos vadovei bei

Endokrinologijos instituto direktorei prof. R. Verkauskienei bei visam

kolektyvui už suteiktą galimybę atlikti biomedicininį tyrimą, bendra-

darbiavimą, už žinias, vertingas konsultacijas, visapusišką pagalbą ir ma-

terialinę bazę.

Mokslinis darbas atliktas, vykdant Eureka E! 3695 projektą „Natūralių

antioksidantų poveikio cukrinio diabeto komplikacijų vystymuisi metodo-

logijos sukūrimas“. Šis projektas buvo dalinai finansuojamas Europos

socialinio fondo agentūros iš struktūrinių fondų lėšų pagal Asociacijos

sutartį dėl projekto „Programos „Eureka“ mokslinių tyrimų ir technologi-

nės plėtros projektų įgyvendinimas“ – Eureka“ (Eureka)“ įgyvendinimo

(VP1-3.1-ŠMM-06-V-01-003).