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ALTERAZIONI DEL DIFFERENZIAMENTO SESSUALE:VIE … · della determinazione e differenziazione sessuale sia al processo tardivo. … Un po’ di storia ... SRY (TDF) TESTICOLO. X X

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UNIVERSITA DEGLI STUDI La Sapienza di Roma FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA I

Dipartimento di Pediatria UOC Terapia Intensiva Neonatale

UOC Pediatria dUrgenza e Terapia Intensiva Pediatrica --------------------------------------------------------------------------------------------------

Master Universitario di II livello in Terapia Intensiva Neonatale e Pediatrica

ALTERAZIONI DEL DIFFERENZIAMENTO SESSUALE:VIE METABOLICHE E

GENETICHE. CASI CLINICI PARADIGMATICI

Relatore: Chiar.mo Prof. Corrado MORETTI

Candidato

Dott.ssa Maria Gabriella BURATTINI

La determinazione sessuale, che dipende dallassetto cromosomico dellembrione, viene stabilito da molteplici eventi molecolari che dirigono lo sviluppo delle cellule germinali, la loro migrazione verso la plica urogenitale e la formazione di testicoli

(in presenza del cromosoma Y) o di ovaie (in presenza del cromosomaXX)

La determinazione sessuale pone le basi per la differenziazione sessuale e per la risposta sesso-specifica dei tessuti agli ormoni prodotti dalle gonadi che si

sono differenziate.

Sono stati scoperti numerosi geni che contribuiscono sia al processo precoce della determinazione e differenziazione sessuale sia al processo tardivo.

Un po di storia I cromosomi sessuali dei mammiferi si sono evoluti da una

coppia di OMOLOGHI ANCESTRALI MONOMORFI per riduzione progressiva di uno degli omologhi che avrebbe poi

dato origine al CROMOSOMA Y

Molti dei geni inizialmente presenti sul cromosoma Y

sono stati trasferiti sul cromosoma X durante il

processo evolutivo che ha reso eteromorfa la coppia

dei cromosomi sessuali

Gene SRY (Sex Determining Region del braccio corto cromosoma Y)

indispensabile

la sua assenza determina la differenziazione in senso femminile

DETERMINAZIONE DEL SESSO MASCHILE

Lespressione di SRY deve raggiungere un determinato livello soglia in un periodo di tempo ben definito, nei precursori delle cellule di sostegno, altrimenti in tali cellule si avvia la formazione delle ovaie.

X Y

SRY (TDF) TESTICOLO

X X

OVAIO

Sry codifica per una proteina che presenta un dominio di legame con il DNA di circa 70

amminoacidi. Questo legame caratteristico delle proteine High

Mobility Group e perci chiamato HMG box.

Si pensa che la proteina si leghi alle regioni regolatorie di altri geni che intervengono nel

differenziamento delle gonadi, a valle di Sry, e nei confronti dei quali Sry svolgerebbe dunque la

funzione di regolatore trascrizionale.

SRY: meccanismo dazione

A valle della cascata enzimatica guidata da SRY esistono altri fattori quali SOX 9, SOX 8, DAX1, FGF9 importanti nella differenziazione e nella funzione delle cellule del Sertoli. Sox 9 agisce precocemente nella via di determinazione del sesso in senso maschile.

GENI DELLA DIFFERENZIAZIONE SESSUALE

AZF(azoospermia factor) maturazione testicolare e spermatogenesi GCY(growth control Y) crescita staturale non mediata da ormoni GBY (gonadoblastoma) oncogene nella disgenesia gonadica

Altri geni sono stati individuati sul cromosoma Y che controllano aspetti diversi dello sviluppo sessuale:

La HMG box di Sry altamente conservata in tutti i mammiferi in cui stata sequenziata.

Sono state descritte molte mutazioni della HMG box della proteina SRY umana, in femmine XY (reversione del sesso).

Nessun polimorfismo stato trovato nel dominio HMG di maschi normali.

La sequenza della HMG box, quindi, determinante per lo sviluppo del sesso maschile,

in quanto ogni sua variazione produce alterazioni della proteina le quali, inficiandone la

funzione, risultano in reversione del sesso.

in letteratura

GONADE BIPOTENTE

(compare intorno alla V settimana)

CELLULE MESENCHIMALI

cell. Leydig

cell. Teca e stroma

CELLULE MESODERMICHE

cell. Sertoli

cell. Granulosa

TESTICOLO

CELLULE GERMINATIVE (sacco vitellino creste)

spermatogoni

oociti

OVAIO

Stadio bipotenziale Alla sesta settimana gli organi

riproduttivi hanno la potenzialit di svilupparsi in strutture maschili o

femminili

Lassenza di MIFpermette alla gonade di trasformarsi nelle strutture femminili.

Il dotto di Wollf degenera

La proteina SRY indirizza la gonade a trasformarsi nei testicoli che producono

testesterone e MIFche provoca la degenerazione del dotto di Muller

Nel maschio

Cresta genitale

WT1 SF1

Gonade bipotenziale

MASCHIO FEMMINA

SRY SOX9

Testicolo

INSL3/LGR8

Discesa nello scroto

FOXL2

Ovaio

SRY SOX9

DAX1 WNT4

Nelle femmine non vi sono geni e fattori essenziali per la differenziazione del fenotipo F durante lo sviluppo fetale e prepuberale.

La iperespressione di alcuni geni, quale DAX1 e WNT4, ha un effetto anti-testicolare sopprimendo leffetto di SRY e SOX9 e determinando lo sviluppo di una femmina XY sex-reversal.

WT1 SF1

MIF T

Dotti di Muller:

tube

utero

III sup. vagina

Dotti di Wolff:

vasi deferenti

epididimo

vescicole seminali

DIFFERENZIAZIONE SECONDARIA

Classificazione delle ambiguit sessuali

Disturbi della differenziazione genitale

Pseudoermafroditismo maschile Errori congeniti della biosintesi del testosterone Deficit 5--reduttasi Resistenza periferica agli androgeni

Pseudoermafroditismo femminile Iperplasia surrenalica congenita Assunzione o produzione materna (tumori) ormoni a eff.virilizzante

Intersessualita DSD

Pseudoermafroditismo maschile Ridotta virilizzazione e

mascolinizzazione del maschio XY 46, XY DSD

Pseudoermafroditismo femminile Eccessiva virilizzazione e

mascolinizzazione della femmina XX 46, XX DSD

Maschio XX o XX sex reversal

Ermafroditismo vero

Femmine XY sex reversal

DSD ovotesticolare

DSD testicolare 46,XX

Disgenesia gonadica completa 46,XY

IERI OGGI

DSD dei Cromosomi sessuali 46,XY DSD 46,XX DSD

45,X(sindrome di Turner e varianti) Disordini nello sviluppo del testicolo: (1) disgenesia gonadica completa

(sindrome di Swyer); (2) disgenesia gonadica parziale; (3) regressione

gonadale; (4) DSD ovotestis

Disordini nello sviluppo dellovaio: (1)DSD ovotestis; (2)DSD

testicolare(es.SRY+,duplicazioni di SOX9); (3)disgenesia gonadica.

47,XXY (sindrome di Klinefelter e varianti)

Disordini nella sintesi o nellazione degli androgeni:

(1) Difetti nella sintesi degli androgeni (es. 17-OH steroido

deidrogenasi, 5RD2, mutazioni StAR);

(2) (2) Difetti nellazione degli androgeni (es. CAIS, PAIS);

(3) Difetti del recettore dellormone luteinizzante (es. ipoplasia-aplasia

delle cellule di Leydig); (1) (4) Disordini dellormone

antimuleriano e del recettore antimuleriano (sindrome da

persistenza dei dotti di Mller)

Eccesso di androgeni: (1) fetali (es deficit di 21-

idrossilasi; (2) fetoplacentari (deficit di

aromatasi ,POR[P450 ossidoreduttasi])e

(3) materni (luteoma, farmaci ecc.)

45,X/46,XY (MGD, DSD ovotestis) Altri (es.estrofia della cloaca,atrofia vaginale,MURCS[anomalie dei

dotti di Muller,dei reni,delle vertebre cervicotoraciche],altre

sindromi.

46,XX/46,XY (chimere, DSD

DIFETTO SINTESI TESTOSTERONE

INSENSIBILITA PERIFERICA AGLI ANDROGENI

DEFICIT 5aR

46, XY DSD

46, XX DSD

IPERPLASIA SURRENALICA CONGENITA

FARMACI VIRILIZZANTI ASSUNTI DALLA MADRE

(medrossiprogesterone, danazolo)

TUMORI VIRILIZZANTI MATERNI O FETALI (tumori ovarici, surrenalici)

DSD 46,XX da eccesso di androgeni

Lesposizione in utero agli androgeni determina

dopo la 12a settimana di gestazione esclusivamente ipertrofia clitoridea

nelle fasi pi precoci della differenziazione persistenza del seno urogenitale e

fusione labioscrotale

se sufficientemente precoce, la fusione delle labbra permette la formazione di

uretra peniena

Grumbach MM & Conte FA 1992

QUADRI CLINICI

46, XX DSD

Genitali Interni Femminili

Genitali Esterni:

- Clitoromegalia isolata

- Completa fusione labioscrotale

46, XY DSD

Genitali Interni Maschili

Genitali Esterni:

-Aspetto completamente femminile (Sindrome Morris o Femminilizzazione Testicolare Completa)

- Ipospadia

LA CLINICA

Amoebas at start were not complex: they tore themselves and started sex

(Arthur Guiterman)

DIAGNOSI

Anamnesi familiare Esame obiettivo

Esami di laboratorio e strumentali: - cariotipo - elettroliti - dosaggi ormonali: 17-OHP, T, DHT,DHEA-

S,Androstenedione, ACTH - ecopelvi - genitografia o laparoscopia

colesterolo

5 pregnenolone

4 progesterone

11 desossicorticosterone DOC

corticosterone (composto B)

18 idrossicorticosterone

aldosterone

17-OH progesterone

11 desossicotisolo (composto S)

cortisolo

DHEA DHEA-S

4androstenedione

testosterone

estrone

17- estradiolo

1

1: 20,22 desmolasi 2: 3- ol-deidrogenasi tutti 3: 17- idrossilasi (gene unico codifica enzima anche con attivit n. 5: pazienti con uno od entrambi i difetti) glicocorticoidi e sessuali 4: 21 idrossilasi 6: 11- idrossilasi glico-mineralcorticoidi 7: 18 idrossilasi 8: 18 deidrogenasi mineralcorticoidi 5: 17,20 desmolasi 9: 17-OH steroido-deidrogenasi sessuali 10: aromatasi

2

2

3 17-OH pregnenolone

2

3

4

4

5

6

6 7

8

9

5 10

3

10

SINTOMATOLOGIA delle DIFFERENTI FORME di DEFICIT ENZIMI SURRENALI

20, 22 desmolasi

17- idrossilasi

21 idrossilasi

Blocco sintesi glico-mineralcorticoidi (accumulo 17- OHP) M: genitali esterni normali F: virilizzazione genitali esterni di vario grado Entrambi i sessi: possibile perdita di sali dopo il 4-5 g di vita a sintomatologia variabile possibile ipertensione

11- idrossilasi

3- idrossisteroido-deidrogenasi

17-20 desmolasi 17- OHsteroido-deidrogenasi

i

nel sesso femminile: ambiguit genitali esterni di grado variabile fino allaspetto di maschio con anorchia Esame strumentale consigliato: ecografia pelvica

nel sesso maschile: assenza di sintomi

alla nascita

in entrambi i sessi (potenzialmente letale):

oltre ai sintomi su descritti vomito e dimagramento tardivi

(a partire dal 5-6 giorno di vita)

DEFICIT 21 IDROSSILASI

DIAGNOSI GENETICA

CYP21: gene funzionale CYP21P: pseudogene

SEDE: cromosoma 6p21.3

CYP21

CYP21P

CYP21P CYP21

LOCUS CYP21 (6p21.3)

Gene e pseudogene, entrambi di 10 esoni, presentano una sequenza nucleotidica omologa al 98% per la parte esonica e al 96% per la parte intronica.

CYP21: gene funzionale CYP21P: pseudogene

DIAGNOSI GENETICA

RelatoreNote di presentazioneIl gene CYP21 ed lo pseudogene (CYP21P) sono formati da 10 esoni. Questi 2 geni sono in stretta contiguit con i geni C4A e C4B che codificano per le 2 frazioni del complemento sierico.

ACTH

- CORTISOLO

+

-

- CORTISOLO

+

NORMALE

DEFICIT 21-OH

+

ACTH +

PREANDROGENI +

RelatoreNote di presentazioneNel deficit di 21-OH compromessa la produzione di cortisolo, per cui si determina un incremento cronico della secrezione di ACTH con conseguente accumulo di precursori steroidei, bloccati nel loro normale utilizzo biosintetico. Il risultato un eccessiva produzione di androgeni lungo vie di sintesi alternative.

Rare Deficit 11 beta idrossilasi Deficit 3 beta idrossisteroido deidrogenasi

5 alfa reduttasi

5 REDUTTASI

TUBERCOLO GENITALE

PLICHE LABIO SCROTALI

PLICA URETRALE

Pene

Scroto

Uretra

Clitoride

Grandi labbra

Piccole labbra

T

DHT

FENOTIPO FEMMINILE

FENOTIPO MASCHILE

CASI CLINICI

Amoebas at start were not complex: they tore themselves and started sex

(Arthur Guiterman)

EG: 38 settimane, SGA

TC per diagnosi prenatale (24a sett.) di malformazione cardiaca e dilatazione borderline IV ventricolo

Anamnesi OSTETRICA:

- Infezione materna da toxoplasma nel I trimestre

- Cariotipo materno: 46 XX t (2;9) (p13; p13)

- Cariotipo fetale (LA): 46 XY, -9, +der (9) t(2;9) (p13; p13)

APGAR 5-7: ventilazione con AMBU

NAOMI

Esame obiettivo:

cianosi

tachipnea

soffio 3/VI

FENOTIPO FEMMINILE

STIGMATE DISMORFICHE (impianto basso delle orecchie, clinodattilia V )

Necessit di intubazione e somministrazione di Surfattante dopo 2 ore dalla nascita

CARIOTIPO 46 XY, -9, +der (9) t(2;9) (p13; p13)

TESTOSTERONE 66.4 ng/dl (v.n . O

IPOTESI DIAGNOSTICHE

Fenotipo genitale femminile con derivati mulleriani presenti

MUTAZIONE GENE SRY

MUTAZIONI DI GENI COINVOLTI NELLA DIFFERENZIAZIONE TESTICOLARE

SU CROMOSOMA 9 ?

DELEZIONE 9p24 regola lo sviluppo del testicolo ?

DELEZIONE 10q26-q ter reversione sessuale ?

DESCRIZIONE DI MASCHI XX, FEMMINE XY ED ERMAFRODITIIN LETTERATURA

Non riferiti ad alterazioni del cromosoma 9 Berger et al, 1970 Kasdan et al, 1973 Skordis et al, 1987 De la Chapelle et al, 1987 Kuhnle et al, 1993 Riferiti ad alterazioni del cromosoma 9 Affara et al, 1989 Hoo et al, 1989 Bennet et al, 1993 Ion et al, 1998 Fleiter et al, 1998 Guioli et al, 1998 Veiol et al, 1998

M.A. nato a termine, da parto eutocico, alla nascita presentava ipotonia generalizzata e rime palbebrali lievemente rivolte verso lalto: sospettata sindrome di Down.

E stata eseguita quindi la ricerca di sequenze Y specifiche: gene AMEL ed

amplificazione SRY

Alessandro

Allesame obiettivo, i genitali esterni venivano descritti come maschili normali.

Gli esami strumentali (Ecorenale ed Ecoencefalo) sono risultati nella norma.

E stato quindi eseguito un cariotipo di tipo femminile: 46,XX.

E stato ricontrollato il corredo cromosomico e confermata la presenza di un cariotipo femminile normale.

AMEL

XY XX 556/07 M

SRY

XY 556/07 M

AMEL

XY XX 556/07 M

AMEL

XY XX 556/07 M

SRY

XY 556/07 M

SRY

XY 556/07 M

Amplificazione di AMEL e SRY

XX= femmina controlloXY= maschio controllo

ZFYSRY

sY254sY86

Yp

YqsY127

XX XY 556/07

ZFYSRY

Yp

sY84sY134Yq

sY255

XX= femmina controlloXY= maschio controllo

ZFYSRY

sY254sY86

Yp

YqsY127

ZFYSRY

sY254sY86

Yp

YqsY127

XX XY 556/07

ZFYSRY

Yp

sY84sY134Yq

sY255

ZFYSRY

Yp ZFYSRY

Yp

sY84sY134Yq

sY255

Analisi delle microdelezioni del cromosoma Y. .

FISH con sonda specifica di SRY (segnale rosso) che evidenzia il trasferimento del gene sull'estremit distale del braccio corto di un cromosoma X.

E. L. nata a termine da parto cesareo, presentava alla nascita: genitali esterni ambigui ed atresia anale, dismorfismi facciali

Sospetto clinico di SAG (virilizzazione genitali esterni) dosaggio

17 OH-progesterone

Esami strumentali: Eco encefalo, reni e cuore nella norma, RMN non capace d individuare a livello perineale i meati di uretra, vagina e canale anale

Intervento chirurgico: meato comune urinario-digestivo

Cariotipo femminile normale

Analisi molecolare del DNA negativa per geni cromosoma Y

Lucia

CASO non risolto

Esami di laboratorio

Dosaggio 17OH-progesterone elevato Altri ormoni surrenalici nella norma

Ricerca gene CYP 21 (specifico SAG): NEGATIVA

+ Drop-out

Rimangono ancora oggi senza una spiegazione a livello molecolare la maggior parte dei casi di inversione del sesso XY, di inversione XX SRY

negativa e di ermafroditismo.

E necessario identificare nuovi geni o mutazioni fuori delle regioni codificanti, dei geni conosciuti.

I progressi di questi ultimi anni lasciano solo intravedere la complessit dello sviluppo

dellapparato riproduttivo.

La comprensione del meccanismo dazione dei geni che governano il differenziamento e lo sviluppo

embrionale resta forse la sfida pi affascinante della genetica molecolare.

PUNTI OSCURI

Prospettive future

La sfida trovare: i membri specifici di ogni famiglia che

sono unici per ogni sistema particolare i geni target tessutali specifici che sono

regolati tramite questa rete comune

GRAZIE

PER LATTENZIONE

Diapositiva numero 1Diapositiva numero 2 Un po di storiaDeterminazione del sesso mASCHILESRY: meccanismo dazioneA valle della cascata enzimatica guidata da SRY esistono altri fattori quali SOX 9, SOX 8, DAX1, FGF9 importanti nella differenziazione e nella funzione delle cellule del Sertoli.Sox 9 agisce precocemente nella via di determinazione del sesso in senso maschile.La HMG box di Sry altamente conservata in tutti i mammiferi in cui stata sequenziata.Diapositiva numero 8Diapositiva numero 9Diapositiva numero 10Nel maschioDiapositiva numero 12Diapositiva numero 13Diapositiva numero 14Diapositiva numero 15Diapositiva numero 16Diapositiva numero 17Diapositiva numero 1846, XY DSD 46, XX DSDDiapositiva numero 21QUADRI CLINICIDiapositiva numero 23DIAGNOSIDiapositiva numero 25Diapositiva numero 26Diapositiva numero 27Diapositiva numero 28 DIAGNOSI GENETICADiapositiva numero 30Diapositiva numero 31RareDiapositiva numero 33Diapositiva numero 34Diapositiva numero 35Diapositiva numero 36ESAMI DI LABORATORIOIPOTESI DIAGNOSTICHEDESCRIZIONE DI MASCHI XX, FEMMINE XY ED ERMAFRODITIIN LETTERATURADiapositiva numero 40Diapositiva numero 41FISH con sonda specifica di SRY (segnale rosso) che evidenzia il trasferimento del gene sull'estremit distale del braccio corto di un cromosoma X.LuciaEsami di laboratorioDiapositiva numero 45Prospettive futureDiapositiva numero 47Diapositiva numero 48