Análisis cinético de la inhibición enzimática, inhibición competitiva, no competitiva y acompetitiva, inhibición irreversible, fármacos como inhibidores, antimetabolitos

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Universidad del Perú , Decana de América FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICADepartamento Académico de Bioquímica

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• La importancia del estudio de la cinética enzimática reside en dos principios básicos. En primer lugar, permite explicar cómo funciona una enzima, y en segundo lugar, permite predecir cómo se comportará esa enzima in vivo. Las constantes cinéticas definidas anteriormente, Km y Vmax, son los pilares fundamentales a la hora de intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del metabolismo.

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La actividad enzimática puede ser disminuida o eliminada por la acción de ciertas sustancias a las cuales se les conoce con el nombre de inhibidores enzimáticos. Mediante el uso de inhibidores enzimáticos se ha obtenido información muy valiosa sobre la conformación del centro activo de algunas enzimas.

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Producion celular de especiesProducion celular de especiesreactivas del oxígeno reactivas del oxígeno

Oxidasas de función mixta: citocromos P-450Oxidasas de función mixta: citocromos P-450

xantina oxidasaxantina oxidasahemoglobinahemoglobina

riboflavinariboflavinacatecolaminascatecolaminas

lipoxigenasalipoxigenasaprostaglandina sintasaprostaglandina sintasa

DNA

peroxisoma

membrana celularmembrana celularbicapa lipídicabicapa lipídica

mitocondria

citoplasmacitoplasma

retículo endoplásmicoretículo endoplásmico

Fe++(+)

Cu+(+)

oxidasasoxidasas flavoproteínasflavoproteínas

Metales de transición Metales de transición

Cadena Cadena respiratóriarespiratória

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• Los inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a las enzimas y disminuyen su actividad. Ya que el bloqueo de una enzima puede matar un organismo patógeno o corregir un desequilibrio metabólico, muchos medicamentos actúan como inhibidores enzimáticos. También son usados como herbicidas y pesticidas.

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Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de interacciones con el centro activo u enzimática, a través de interacciones con el centro activo u otros centros específicos (alostéricos).otros centros específicos (alostéricos).Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores según el lugar de De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores según el lugar de acción: acción:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activoII. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

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Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: Se unen a la enzima de forma no covalente estableciendo un equilibrio con la enzima libre y diferentes tipos de inhibiciones son producidas dependiendo en si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima sustrato o a los dos.

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

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CaracterísticasDisminuir o bloquear la velocidad de reacción,

uniéndose a la enzima. Son específicos.Alteran grupos importantes para la función catalítica,

o Alteran ligeramente la conformación de la enzima sin llegar a desnaturalizarla.

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Aplicaciónes

– Permiten determinar qué aminoácidos están presentes en el sitio catalítico de la enzima y su probable rol en la catálisis.

– Son el fundamento de fármacos antivíricos, antibacterianos y antitumorales.

Proteasa del HIV formando un complejo con la proteasa inhibidora ritonavir. La estructura de la protesa se muestra como una cinta roja, azul y amarilla. La inhibidora se muestra como una estructura de pequeñas bolas y varillas cercana al centro.

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Mediante el uso de inhibidores enzimáticos se ha obtenido información muy valiosa sobre la conformación del centro activo de algunas enzimas.

Ciertos metales como el plomo, mercurio y arsénico inhiben enzimas que tienen en su centro activo grupos – SH libres.

El proceso de inhibición enzimática es útil para comprender los mecanismos de farmacológica de algunos compuestos o medicamentos.

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• Muchas moléculas de medicamentos son inhibidores enzimáticos, por lo que su descubrimiento y mejora es un campo de investigación activo en la bioquímica y la farmacología. Un inhibidor enzimático medicinal es juzgado a menudo por su especificidad (su carencia de unirse a otras proteínas) y su potencia (su constante de disociación, la cual indica la concentración necesaria para inhibir a la enzima). Una alta especificidad y potencia asegura que el medicamento va a tener pocos efectos secundarios y así su toxicidad baja.

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Los IE también son usados en la naturaleza y están implicados en la regulación del metabolismo. p.e las enzimas en una ruta metabólica pueden ser inhibidas por los productos resultantes de sus respectivas vía. Este tipo de contra reacción retarda el flujo a través de la vía cuando los productos comienzan a acumularse y es una manera importante de mantener la homeostasis en una célula. Otros inhibidores enzimáticos celulares son proteínas que se unen específicamente e inhibe a su blanco de la enzima

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. Esto puede ayudar a controlar enzimas que pueden ser dañinas para la célula, como las proteasas o nucleasas; un buen ejemplo es el inhibidor de la ribonucleasa, que se une a esta enzima en una de las interacciones proteína–proteína más fuertes conocidas. Inhibidores enzimáticos naturales también pueden ser venenos y ser usados como defensa en contra de depredadores o una forma de matar a la presa.

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Inhibición. TiposInhibición Permanente(irreversible)

Unión del inhibidor de manera irreversible por enlaces covalentes, con la enzima provocando una modificación en su estructura química de los residuos esenciales de los aminoácidos de los grupos ubicados en los centros de fijación y sitio activo. Ejemplo: el iodoacetato reconoce grupos SH y OH y envenena la cisteína.

Irrreversibles: se dan en los denominados zimógenos o proenzimas, que son enzimas que se producen en forma activa. Por hidrólisis parcial, se transforman en forma activa. Así sucede con las enzimas digestivas: pepsina, tripsina y quimotripsina, que se secretan como pepsinógeno, tripsinógeno y quimotripsinógeno.

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Mecanismo de acción de la G3PDHMecanismo de acción de la G3PDH

Inhibición irreversible porInhibición irreversible por iodoacetato, bloqueo deiodoacetato, bloqueo de grupo –SH en el sitiogrupo –SH en el sitio activo de la enzimaactivo de la enzima20/09/2013 17

Inhibición reversibleLa unión del inhibidor a la enzima es temporal. Al

quitar el inhibidor del medio se recupera la actividad.

Para distinguir si la inhibición es reversible o no, se somete a diálisis el complejo E-I; si la actividad no se restablece, la inhibición es permanente.

Los inhibidores reversibles se unen a la enzima con interacciones no covalentes tales como los puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y enlaces iónicos.

Los enlaces débiles múltiples entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir una unión fuerte y específica. Reversibles: El complejo EI se forma por uniones no covalentes. Puede disociar

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Tipos de inhibición reversible pueden ser clasificados como:

• El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

• El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

• El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Anticompetitiva

• Mixtos.20/09/2013 19

Inhibición Competitiva I y S compiten por sitio catalítico. Por lo general, el inhibidor

competitivo es un análogo químico o derivado del

substrato no metabolizable del verdadero sustrato.

Actúa sólo aumentando el Km (Km

app) para S. Vm permanece inalterable- Las fijaciones de substrato e

inhibidor son mutuamente exclusivas

• A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición

• El inhibidor es tan específico como el substrato

Ks k3

E + S E-S E + P + I KI

EISe define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:

Ki = [E] [I] [EI]

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Vmax igualKM diferente

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Medicamentos antivirales efectivos contra el H1N1, el Oseltamivir y el Zanamivir, son inhibidores competitivos de la Neuraminidasa y son particularmente efectivos en las primeras 48 horas, antes de que el virus logre “liberarse” de sus células huéspedes iníciales e infectar otras células.

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Antibióticos

Insecticidas

Hervicidas

Venenos

Diferentes Medicamentos

Dolor

Inflamación

Infecciones virales

Cáncer

Inhibición enzimática

Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico

Sulfas Infecciones microbianas

Antihipertensores: Captopril y Enalopril

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cáncer

Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico

Sulfas Infecciones microbianas

Antihipertensores: Captopril y Enalopril

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cáncer

Inhibidores Competitivos

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Inhibición No CompetitivaI se une tanto a la enzima

como al complejo E-S.Km no se altera (KI = Km ).

Vm varía. Disminuye a medida que aumenta [I].

I, podría impedir la conformación de centro catalítico.

No puede ser superada aumentando [S].

Ks k3

E+S E-S E+P + + I I EI+S ESI Ks

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• La presencia del I hace que decrezca la vmáx (es decir, no puede ser compensada su presencia por elevadas [S]) pero la Km aparente no varía (o sea, que a la misma [S] se alcanza la 1/2 vmáx

correspondiente a la presencia del inhibidor). En realidad la afinidad de E por S sí ha disminuido realmente (aunque no "aparentemente").

Algunas E que poseen un grupo -SH esencial, SON INHIBIDAS SON INHIBIDAS NO COMPETITIVAMENTE NO COMPETITIVAMENTE por iones de metales pesados (la enzima requiere esos grupos -SH intactos para su actividad normal). El agente quelante EDTA (tetra-acetato de etilen-diamida) se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así de modo no competitivo a algunas E que precisan esos iones para su actividad.

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El inhibidor NO se une al sitio activo

NO se puede revertir con un exceso de sustrato

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Inhibición Acompetitiva El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES; el complejo ESI no es productivo

I sólo se une al complejo E-S.I no se une al centro activo sino a cualquier otro sitio.No se puede superar la inhibición aumentando la [S]. Km es más pequeño (aparente afinidad)

Ks k3

E + S E-S E + P + I kI

ESI

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Cinéticas de InhibiciónCompetitivoVmax igualKM diferente

No competitivoVmax diferenteKM igual No inhibitor

1V

1/[S]020/09/2013 29

Inhibición acompetitiva

I

El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora

La subunidad catalítica une al sustrato y cataliza la reacción20/09/2013 30

Activación Enzimática

Cuando un ligando (soluto, compuesto) en el medio de reacción, aumenta la eficiencia con que una enzima cataliza una reacción o proceso.

Tipos: – Activación enzimática esencial.

–Activación enzimática no esencial.

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Activación Enzimática Esencial

Activador (A) es imprescindible para la enzima.

En su ausencia no hay actividad de la enzima.

Puede ser “un segundo sustrato”. – La enzima Hexoquinasa tiene dos

sustratos: glucosa y ATP-Mg.20/09/2013 32

puede ser un metal. El metal interacciona con S, o con la E, o puede pre-existir ya ligado a la enzima. – Carboxipeptidasa: Zn+2 ligado fuertemente a

la enzima. – Hexoquinasa: Mg+2 ligado a sustrato ATP.– Enzimas dependientes de K+: K+ interacciona

directamente con la enzima como si fuera un sustrato y luego el K+ se desliga de la enzima.

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Inhibición Irreversible

- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki,

sino por una constante de velocidad ki:

E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

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Inhibidor IrreversibleFluorofosfato de diisopropilo

(DFP)

Acetilcolinesterasa

Acetilcolina

Acetato + Colina

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

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Inhibidor Irreversible

Malatión

Acetilcolinesterasa

Tripsina

Elastasa

Fosfoglucomutasa

Cocoonasa (larvas de gusanos de seda

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

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Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

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Reactivos de grupos -SH, 1

(a) Agentes alquilantes

E SH E S CH2 COO-

ICH2 COO- IHYodoacetato

(b) Compuestos insaturados

N CH2 CH3

O

O

E SHE S

N CH2 CH3

O

O

N-Etil maleimida (NEM)20/09/2013 38

Reactivos de grupos -SH, 2

(c) Formadores de mercáptidos

HOHg COO-

E SH E S Hg COO-

p-Hidroximercuribenzoato

(d) Oxidantes

Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

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Organofosfóricos

CH CH2 OHSer

PF O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

CH CH2 O P O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

Ser

DFP:diisopropilfluorofosfato

- Actúan sobre enzimas serínicas- Únicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa- Neurogases

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Ligandos de coordinación de metales

Es el caso del ion cianuro, CN-

Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinacióndel Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.

Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad

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Substratos suicidas (Inhibidores activados enzimáticamente) -Son inhibidores irreversibles, poco reactivos hasta que se unen al sitio activo de un enzima específica.Se usan para obtener nuevos agentes farmaceuticos, en el llamado el diseño racional de fármacosSuelen ser muy efectivos y con pocos efectos secundariosSe trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de los inhibidores irreversiblesEjemplo: difluorometilornitina para tratar la enfermedaddel sueño africana (tripanosomiasis africana)

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E + I EI EI* E’ + I*

Modo de acción de los inhibidores suicidas

1 2 3

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

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Ejemplos de inhibidores suicidas, 1

- Sistema de la -lactamasa bacteriana

La utilización masiva de antibióticos -lactámicos (penicilinas,sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido ala aparición de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son porproducir una enzima, la -lactamasa, que inactiva a los antibió-ticos -lactámicos.

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R CO NHS

NO

CH3

CH3

COO-

R CO NHS

HN

CH3

CH3

COO-

CO

O-

-Lactamasa

Penicilina (activa)

Ác.peniciloico (inactivo)20/09/2013 45

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicidade la -lactamasa, el ácido clavulánico

O

NO

COO-

CCH2OH

H-Lactamasa

O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

O-

O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

OCH2CHSer

Esta moléculareacciona con la

serina activa de la-lactamasa,

produciendo suinactivación

Ác.clavulánico

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Ejemplos de inhibidores suicidas, 2

- Sistema de la monoamino oxidasa (MAO) cerebral

Los estados depresivos, en general, están relacionados con undescenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones delcerebro.

Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).

Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea comoterapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchosinhibidores suicidas de la MAO

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HO

HO

CHOH CH2 NH2

O2 + H2O

NH3 + H2O2

HO

HO

CHOH CHO

Noradrenalina

Dihidroxifenilglicol

Monoaminooxidasa

La MAO es una flavoproteína:tiene un grupo prostéticoflavínico (FAD) fundamentalpara la catálisis. Los inhibidoressuicidas de la MAO inactivanal cofactor FAD.

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HC C CH N+CH3

CH3

N

NNH

N

H3C

H2C

O

OSE

R

N

NNH

NH

H3C

H2C

O

OSE

R

CH

CHCHN+H3C

H3C

Flavina

Flavina modificada

N,N’ dimetilpropargilamina

(pargilina)

Inhibición suicida de laMAO mediante Pargilina

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“Bioquímica” Mathews, van Holde y Ahern. Addison Wesley 2002

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Estos compuestos entre ellos muchos fármacos prolongan la acción farmacológica de las drogas y aumentan su vida media en el plasma.Las enzimas biotransformantes poseen baja especificidad de sustrato•Ellas pueden metabolizar varios sustratos con distinta eficiencia y ser inhibidas por diversos compuestos entre ellos los fármacos, de acuerdo a las leyes de la inhibición de enzimas.

INHIBIDORES: FARMACOS

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INHIBICION COMPETIVA El agente inhibidor de la actividad enzimática en este caso puede ser:

–Sustrato de la enzima (morfina y diazepam).–Compuesto que se une al sitio activo del sustrato pero no es metabolizado por la enzima (anfetamina no es metabolizada por la MAO pero inhibe el metabolismo a través de la MAO de tiramina).–Este tipo de inhibición puede ser superada, aumentando la concentración del sustrato.La estatinas son ejemplos de inhibidores competitivos. Son análogos estructurales del sustrato de la HMG Co A reductasa enzima reguladora de la síntesis del colesterol

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INHIBICION NO COMPETITIVA–Inhibición no-competitiva. El agente inhibidor forma un complejo con la enzima, el cual impide parcial o totalmente la interacción de la enzima con su sustrato. Esta interacción puede ser:–Reversible o irreversible, pero en cualquier caso no es vencible por aumento de la concentración de sustrato. –Producida por intermediarios del metabolismo que son muy reactivos que inactivan irreversiblemente a la enzima, ya sea debido a la unión covalente a la proteína (sistema del P450 : Cloranfenicol) o al grupo HEM (citocromo P450 : etinil-estradiol, secobarbital, SKF-525A).

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• El plomo es un ejemplo de inhibidor no competitivo. Forma enlaces covalente con los grupos sulfhídrilos de la cisteina en las proteínas. Reacciona con la ferroquelatasa, enzima que incorpora hierro a la síntesis del grupo hemo de la hemoglobina y otras hemoproteínas.

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CONSECUENCIAS CLÍNICAS DE LA INHIBICIÓN METABÓLICA

La inhibición provoca un aumento de la vida media del fármaco o del compuesto endógeno cuyo metabolismo es inhibido, lo cual conlleva a un aumento de la actividad farmacológica.La administración de fármacos inhibidores del metabolismo de compuestos endógenos, produce las respuestas farmacológicas correspondientes a:

• La acumulación de tales compuestos endógenos, como es lo que ocurre con los inhibidores de la acetilcolinesterasa, la MAO y la dopa-descarboxilasa.

• La falta de formación del producto final: inhibidores de la xantina-oxidasa.

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• 5 de las 10 mas utilizadas drogas medicamentosas son inhibidores enzimáticos.

• La penicilina y la amoxicilina inhiben la síntesis de las paredes bacterianas.(Beta lactamasa)

• El captopril, enalapril y el lisinopril (hipotensores) inhiben la enzima convertidora de angiotensina impidiendo la formación de angiotensina II a partir de la angiotensina I.

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INDUCTORES

Aumentan los niveles enzimáticos y por tanto, la actividad enzimática. Además, en general estos inductores aumentan el clearance de los fármacos

biotransformados por las enzimas inducidas.

Mecanismos:

Entre los mecanismos involucrados en la inducción podemos mencionar el aumento de:

La transcripción del DNA. La velocidad de Procesamiento del RNA. La Estabilización del mRNA. La Eficiencia translacional. La Estabilización de la proteína.

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CONSECUENCIAS CLÍNICAS DE LA INDUCCCIÓN ENZIMÁTICASi el metabolito de un fármaco es inactivo, la

inducción enzimática produce una disminución en la intensidad y/o duración del fármaco cuyo metabolismo es inducido. Se puede llegar a producir la tolerancia farmacocinética (barbitúricos).

Si el metabolito es la forma activa terapéutica del fármaco, la inducción enzimática provocará un aumento de dicha actividad, y si el metabolito produce un efecto tóxico, se aumentará la toxicidad.

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• Un fármaco inductor puede incrementar el metabolismo de una sustancia endógena como la inducción de la UDP-glucuroniltransferasa encargada de glucuronidar la bilirrubina y facilitar así su eliminación (aplicación de Fenobarbital a recién nacidos que tienen ictericia).

• Un fármaco inductor puede inducir la producción de una enzima sintetizante como es el caso de los barbituratos que inducen la síntesis de la delta-ámino-levulínico-sintetasa, enzima clave en la síntesis del HEM, por lo que los enfermos de porfiria desencadenarán un crisis de porfiria.

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• 1 Cuales son las principales formas de inhibición enzimática? Describa cada una de ellas con gráficos y ecuaciones.

• 2 Que características tendría un inhibidor competitivo? Y uno no-competitivo?

• 3 Mencione la importancia biológica del fenómeno de la inhibición enzimática.

• 4 Esquematice un protocolo para evaluar • a) la presencia de un inhibidor

reversible/irreversible, • b) determinar el tipo de inhibición reversible

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