Tema 16 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA II

1. Inhibición pseudoirreversibles2. Inhibición irreversible

2.1 Inhibidores irreversibles o venenos catalíticos2.2 Análisis de la velocidad de inactivación enzimática

2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible

1.-Inhibición irreversible simple.

2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.

3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente

4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato.

1. Inhibición Pseudoirreversible

Inhibidores [I] no es >>> [E]

Inhiben a concentraciones parecidas a la enzima

Ki <<<<< Ki de Inhibidores reversibles

Orden 10-12 a 10-14 Unión fuerte a los enzimas

Pseudoirreversible el equilibrio está completamente desplazado hacia la formación del complejo [EI]

E +I EI Io= I + EI

Eo=E + EI

[EI] no es despreciable

a razón de velocidades máximas en presencia y ausencia de inhibidor

00 E

E

kcatE

kcatE

vo

via 0aEE

Io= I + EI

Eo=E + EI

EI = Eo – E

EI = Eo – aEo

EI = Eo (1-a)

)1()1(

)1()1(

aEoa

aKiaEo

aEo

aEoKiIo

E

EIKiI

0aEE

EoKiaa

Io

1

)1(

Dividiendo los dos miembros por (1-a)

1/a

Eo

)1( a

Io

m=Ki

a valores experimentales

Eo

KiEEoIoKiIoKiEoa

2

04)( 2

Io=0

Io=3,0 nM

Io=1,5nM

Io=4,5nM

Eo nM

vo

1,5 3,0 4,5

Representación de Willian y Morrison: Inhibición pseudoirreversible

Inhibidor titula a la enzima

2. Inhibidores irreversibles 2.1 Venenos Catalíticos

* Los inhibidores irreversibles o venenos catalíticos son sustancias que se unen a la enzima de manera tal que reducen su actividad prácticamente a

cero.

* Muchas enzimas son “envenenadas” por trazas de metales pesados, y por esta razón, es una práctica común utilizar sustancias complejantes, p. ej.,

EDTA, en los tampones de ensayo, para secuestrar estos metales pesados.

- Esto es de particular importancia en los procesos de purificación de enzimas:

Inhibidores se unen por enlaces covalentes a centro activo de la enzima

Inhibidor irreversible une a la enzima por un proceso irreversible* (constante de disociación 10-9 mol l-1)

Inhibición suele ser progresiva. Depende del tiempo

aspi

rin

a

Prostaglandin-H-

Sintasa

-La aspirina inhibe la formación de Protaglandina-G2, gracias a la metilación de la subunidad o dominio responsable de la actividad ciclooxigenasa, de la

Prostaglandina-H-sintetasa.

Penicilina

La enzima modificada por la penicilina no puede unir el puente de poli-Gly

2.2. Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible

[I]>>>[E] El I esta en exceso no cambia durante la inhibición

[I] =[Io]

La cinética de la inhibición irreversible puede ser modelada usando un modelo de primer orden de la forma

E +I EI* Se forma este complejo que es inactivo

[EI]*=[ET] (1-exp-k`T)

K`(s-1) tendrá un significado diferente dependiendo del

mecanismo exacto de inhibición Tiempo (s)

[EI]* M

Cinética

2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible

1.-Inhibición irreversible simple.

E + I EI*

2.-Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.

E + I EI*

E + S ES

3.- IInhibición irreversible simple tiempo dependiente

E + I EI EI*

4.- Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato.

E + I EI EI*

E + S ES

1.-Inhibición irreversible simple. ki

E + I EI*

ki constante de inhibición de segundo orden (M-1 s-1)

Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI

k`=ki [Io]

Ecuación diferencial de primer orden describe el cambio en la concentración de [EI] en el tiempo

*

*

EIEE

EIkidt

EId

T

*`**

EIEkEIEIokidt

EIdTT

I =Io

Reacción de segundo orden

Integración de la ecuación

tEI

o Tdtk

EIE

EId0

*´

*

*

)exp1(* t̀kTEEI

[EI]* M

Tiempo (s)

k`=ki [Io]Calcula k`

Iok

ki`

Se obtiene una constante de inhibición de segundo orden

2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.

E + I EI*

E + S ES

ki

Ks

Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI*

Substrato puede proteger a la enzima de la inhibición irreversible

ESEIEE

ES

SEKm

EIkidt

EId

T

*

*

SKm

KmEIEtE

*

Sustituyendo y despejando

I = Io

*´*

**

EIEkdt

EIdSKs

KmEIEtIoki

dt

EId

T

Io

SKm

kiKmk

`

Integración de la ecuación

tEI

o Tdtk

EIE

EId0

*´

*

*

)exp1(* t̀kTEEI

[EI]* M

Tiempo (s)

Calcula k`

SKs

kiKs

Io M

k`(s-1)

m

IoSKs

kiKsk

`

Graficando k` frente a diferentes concentraciones de Inhibidor

ki

S y Ks constantes se pueden calcular idenpendientemente

3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente

E + I EI EI*

Rápido equilibrio reversible entre E y el I seguida de una reacción lenta e

irreversible de inactivación [EI]*Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI*

Ki ki

EIEIEE

EI

IEKi

EIkidt

EId

T

*

*

Ioki

EIEtEI

/1

*

*`*

/1

**

EIEkdt

EId

Ioki

EIEtki

dt

EId

T

Ioki

kik

/1´

KiIo

Iokik

`

Integración de la ecuación

tEI

o Tdtk

EIE

EId0

*´

*

*

)exp1(* t̀kTEEI

[EI]* M

Calcula k`

KiIo

Iokik

`

Graficando k` frente a diferentes concentraciones de Inhibidor

Io M

k`(s-1)

Hipérbola rectangular

Ki y ki Procedimientos de regresión no linear

4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato.

E + I EI EI*

E + S ES

Ki ki

Ks

ESEIEIEE

ES

SEKs

EI

IEKi

EIkidt

EId

T

*

*

KsS

IoKi

EIEtEI

11

*

Sustituyendo y despejando

*`*

11

**

EIEkdt

EId

KsS

IoKi

EIEt

dt

EId

T

KsS

IoKiki

k11

´

Integración de la ecuación

tEI

o Tdtk

EIE

EId0

*´

*

*

)exp1(* t̀kTEEI

[EI]* M

Calcula k`

KsS

IoKiki

k11

´

Graficando k` frente a diferentes concentraciones de Inhibidor

Hipérbola rectangular

Ki y ki Procedimientos de regresión no linear

Io M

k`(s-1)

Como distinguirías entre una Inhibición irreversible tiempo dependiente y otra Inhibición irreversible tiempo independiente

k`(s-1)

Io MIo M

k`(s-1)

RESUMEN

● Existen unos inhibidores denominados pseudoirreversibles que no cumplen todas las condiciones de Michaelis, puesto que la concentración inicial de inhibidor [Io] es efectiva al mismo orden de magnitud que la concentración inicial de enzima.En este tipo de inhibición la Ki presenta valores que van desde 10-8 -10-12.

Se comportan como inhibidores pseudoirreversibles la gran mayoria de inhidores de naturaleza proteica, así como los anticuerpos obtenidos frente a las proteínas enzimáticas. El comportamiento cinético es diferente de los inhibidores reversibles.

● Los inhibidores suicidas son compuestos que son inactivos como inhibidores en ausencia de enzimas, se activan específicamente por la enzima a la que van a inhibir , uniéndose covalentemente a la proteína enzimática.

● Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible. Muestra un comportamiento dependiente de la presencia de substrato y de la posibilidad que el parámetro tiempo influya en el proceso de unión covalente. Así se distinguen desde el punto de vista cinético:

Inhibición irreversible simple Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato. Inhibición irreversible simple tiempo dependiente Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato