ANALISIS KLT-BIOAUTOGRAFI METABOLIT SEKUNDER ACTINOMYCETES KK-2.1 DARI RHIZOSFER KUMIS KUCING (Orthosiphon

stamineus) SEBAGAI KANDIDAT PENGHASIL ANTIBAKTERI

TLC-BIOAUTOGRAPHY ANALYSIS OF SECONDARY METABOLITES ACTINOMYCETES

KK-2.1 FROM CATS WHISKERS (Orthosiphon stamineus) RHIZOSPHERE AS CANDIDATE

PRODUCER OF ANTIBACTERIAL

NURUL ASMI N111 14 064

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2018

ANALISIS KLT-BIOAUTOGRAFI METABOLIT SEKUNDER ACTINOMYCETES KK-2.1 DARI RHIZOSFER KUMIS KUCING (Orthosiphon stamineus) SEBAGAI KANDIDAT PENGHASIL

ANTIBAKTERI

TLC-BIOAUTOGRAPHY ANALYSIS OF SECONDARY METABOLITES ACTINOMYCETES KK-2.1 FROM CATS WHISKERS (Orthosiphon

stamineus) RHIZOSPHERE AS CANDIDATE PRODUCERS OF ANTIBACTERIAL

SKRIPSI

untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana

NURUL ASMI N111 14 064

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2018

v

vi

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillah puji syukur kepada Allah SWT. karena kehendak dan

ridha-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulis sadari skripsi

ini tidak akan selesai tanpa doa, dukungan dan dorongan dari berbagai

pihak. Adapun dalam kesempatan ini penulis ingin mengucapkan banyak

terima kasih kepada

1. Dr. Herlina Rante, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing utama dan

Prof., Dr., Natsir Djide, M.Si., Apt. selaku pembibing pertama yang telah

meluangkan waktu untuk memberikan masukan, bimbingan, ilmu, dan

motivasi yang membangun kepada penulis hingga skripsi ini

terselesaikan dengan baik.

2. Dra. Sartini, M.Si., Apt., Dr. Latifah Rahman, DESS., Apt., dan Dra.

Aisyah Fatmawaty, M.Si., Apt selaku penguji.

3. Dekan dan para wakil dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin.

4. Prof., Dr., Gemini Alam, M.Si., Apt. selaku dosen penasehat akademik

yang telah memberikan banyak nasihat dan arahan setiap awal

semester selama menempuh pendidikan di Universitas Hasanuddin.

Tanpa nasihat dan arahan dari seorang penasehat akademik, maka

tidak terstruktur perencanaan studi selama menempuh pendidikan

strata 1.

5. Seluruh staf Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas segala

fasilitas yang telah memberikan kemudahan dalam pengurusan

administrasi penulisan skripsi ini.

vii

viii

ABSTRAK

NURUL ASMI. Analisis KLT-Bioautografi Metabolit Sekunder Actinomycetes KK-2.1 dari Rhizosfer Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus) sebagai Kandidat Penghasil Antibakteri (dibimbing oleh Herlina Rante dan Natsir Djide).

Actinomycetes merupakan salah satu kelompok mikroorganisme

yang dapat menghasilkan metabolit sekunder yang berfungsi sebagai antibakteri. Isolat actinomycetes KK-2.1 telah diisolasi dari rhizosfer tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui profil KLT bioautografi isolat actinomycetes KK-2.1 yang diujikan pada bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus. Cairan hasil fermentasi diekstraksi dengan metode ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut etil asetat sedangkan biomassa diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol. Dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap ketiga ekstrak tersebut menggunakan metode difusi. Selanjutnya ekstrak yang aktif yaitu ekstrak etil asetat dan ekstrak air diuji dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis bioautografi untuk mengetahui pola pemisahan senyawa yang terkandung dalam ekstrak dan aktif sebagai antibakteri. Campuran fase gerak yang digunakan untuk ekstrak etil asetat yaitu etil asetat:metanol (4:0,5) dan untuk ekstrak air menggunakan n-butanol:metanol:air (7:1:1). Hasil uji KLT bioautografi menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat menghasilkan aktivitas antibakteri terhadap S.aureus dan E.coli pada noda yang memiliki nilai Rf 0,78 yang diduga sebagai golongan senyawa terpenoid. Sedangkan ekstrak air menghasilkan aktivitas antibakteri terhadap S.aureus pada noda yang memiliki nilai Rf 0,3 yang diduga sebagai protein.

Kata kunci : Actinomycetes, Antibakteri, KLT Bioautografi, Orthosiphon stamineus, Rhizosfer.

ix

ABSTRACT

NURUL ASMI. TLC-Bioautography Analysis of Secondary Metabolites Actinomycetes KK-2.1 from Cats Whiskers (Orthosiphon stamineus) Rhizosphere as Candidate Producers of Antibacterial (supervised by Herlina Rante and Natsir Djide).

Actinomycetes is one group of microorganisms that can produce secondary metabolites that function as antibacterial. Isolate Actinomycetes KK-2.1 has been isolated from the rhizosphere of Orthosiphon stamineus. The purpose of this study was to know the profile of TLC bioautography from actinomycetes secondary metabolite KK-2.1 against bacteria Eschericia coli and Staphylococcus aureus. The fermentation liquid is extracted by liquid-liquid extraction method using ethyl acetate solvent while the biomass is extracted by maceration method using methanol solvent. The antibacterial activity test was performed on all three extracts using diffusion method. Furthermore, the active extracts, ethyl acetate and water extract were tested by thin layer chromatography bioautographic method to find out the separation pattern of the compounds contained in the extract and active as antibacterial. Mobile phase ethyl acetate:methanol (4:0,5) for ethyl acetat extract and butanol: methanol: water (7:1:1) for water extract. The results showed that the extract of ethyl acetate isolate KK-2.1 produced antibacterial activity against S.aureus and E.coli with Rf value 0,78 known as terpenoid. While the water extract produces antibacterial activity against S.aureus with Rf value of 0,3 and known as protein.

Keywords : Actinomycetes, Antibacterial, Orthosiphon stamineus, Rhizosphere, TLC Bioautography

x

DAFTAR ISI

Halaman

PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI .......... Error! Bookmark not defined.

UCAPAN TERIMA KASIH .......................................................................... v

ABSTRAK ................................................................................................. vii

ABSTRACT ................................................................................................ ix

DAFTAR ISI ............................................................................................... x

DAFTAR TABEL ...................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xv

BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1

I.1 Latar belakang ...................................................................................... 1

I.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 3

I.3 Tujuan Penelitian .................................................................................. 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA..................................................................... 4

II.1. Actinomycetes ..................................................................................... 4

II.1.1 Struktur actinomycetes...................................................................... 4

II.1.2 Habitat dan keberadaan actinomycetes ............................................ 6

II.1.3 Peranan actinomycetes..................................................................... 7

II.2 Metabolit .............................................................................................. 8

II.3 Rizosfer .............................................................................................. 10

II.4 Metode Pengujian Aktivitas Antimikroba secara Difusi ...................... 11

xi

II.4.1 Cara cakram (disc) .......................................................................... 11

II.4.2 E-test............................................................................................... 12

II.4.3 Ditch-plate technique ...................................................................... 12

II.4.4 Cup-plate technique ........................................................................ 12

II.5 Kromatografi Lapis Tipis .................................................................... 13

II.6 Metode Bioautografi ........................................................................... 14

II.7 Bakteri Uji ........................................................................................... 16

II.7.1 Staphylococcus aureus ................................................................... 16

II.7.2 Escherichia coli ............................................................................... 16

II.8 Antibakteri .......................................................................................... 17

BAB III METODE PENELITIAN ................................................................ 20

III.1 Alat dan Bahan ................................................................................. 20

III.2 Metode Kerja .................................................................................... 20

III.2.1 Sterilisasi alat ................................................................................. 20

III.2.2 Pembuatan medium ....................................................................... 21

III.2.2.1 Medium nutrient agar .................................................................. 21

III.2.2.2 Medium starch nitrate agar ......................................................... 21

III.2.2.3 Medium starch nitrate broth ........................................................ 21

III.2.3 Penyiapan bakteri uji ...................................................................... 22

III.2.3.1 Peremajaan bakteri uji ................................................................ 22

III.2.3.2 Pembuatan suspensi bakteri uji .................................................. 22

III.2.4 Penyiapan isolat actinomycetes ..................................................... 22

III.2.4.1 Peremajaan isolat actinomycetes KK-2.1.................................... 22

xii

III.2.4.2 Fermentasi isolat actinomycetes KK-2.1 ..................................... 22

III.2.5 Ekstraksi ........................................................................................ 23

III.2.6 Uji aktivitas antibakteri ................................................................... 23

III.2.7 Pengamatan morfologi ................................................................... 24

III.2.8 KLT-Bioautografi ............................................................................ 24

III.2.9 Identifikasi komponen kimia ........................................................... 25

III.3 Pengumpulan dan Analisis Data ....................................................... 25

III.4 Pembahasan Hasil dan Pengambilan Keputusan ............................. 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 26

IV.1 Peremajaan Isolat Actinomycetes KK 2.1 ......................................... 26

IV.2 Fermentasi Isolat Actinomycetes KK 2.1 .......................................... 27

IV.3 Ekstraksi ........................................................................................... 28

IV.4 Uji Aktivitas Ekstrak .......................................................................... 29

IV.5 KLT-Bioautografi ............................................................................... 32

IV.6 Identifikasi komponen kimia .............................................................. 34

IV.7 Identifikasi morfologi ......................................................................... 36

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 38

V.1 Kesimpulan ........................................................................................ 38

V.2 Saran ................................................................................................. 38

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 39

LAMPIRAN............................................................................................... 44

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Kelompok actinmycetes berdasarkan penyusun dinding 6 sel

2. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak air, ekstrak etil asetat, 30

dan ekstrak metanol. 3. Identifikasi makroskopik isolat actinomycetes pada media 36

starch nitrate agar

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Hasil inokulasi isolat actinomycetes pada medium starch 27 nitrate agar

2. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak dengan kadar 2 mg dan 31

4 mg terhadap bakteri a) E. coli; b) S. aureus 3. Hasil uji KLT bioautografi ekstrak etil asetat terhadap bakteri 32

E. coli 4. Hasil uji KLT Bioautografi ekstrak etil asetat terhadap bakteri 33

S. aureus 5. Hasil uji KLT bioautografi ekstrak air terhadap bakteri 33

S. aureus 6.Penampakan noda ekstrak etil asetat (a) setelah disemprot 34

H2SO4 10% ; (b) UV 254 nm; dan (c) UV 366 7. Ekstrak etil asetat setelah disemprot (a) vanilin asam sulfat, 34

(b) lieberman burchard, dan (c) FeCl3 8. Hasil inokulai isolat actinomycetes pada media starch nitrate 37

agar 9. Pengamatan secara mikroskopik isolat actinomycetes KK 2.1 37

pada perbesaran 1000x 10. Hasil uji difusi setiap ekstrak 47 11. Proses fermentasi 47 12. Proses ekstraksi cair-cair 48 13. Ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak air 48 14. Ekstrak air pada (a) UV 254; (b) UV 366 nm; (c) setelah 49

disemprot H2SO4 10% 15. Hasil uji kualitatif protein pada ekstrak air 49

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Skema kerja 44

2. Komposisi medium 45

3. Dokumentasi penelitian 47

4. Perhitungan nilai Rf 50

1

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar belakang

Penyakit infeksi merupakan jenis penyakit yang paling banyak

diderita oleh penduduk di negara berkembang, termasuk Indonesia. Salah

satu penyebab penyakit infeksi adalah bakteri (Radji, 2011). Berdasarkan

data World Health Organization, penyebab kematian tertinggi di dunia

setelah penyakit jantung koroner dan stroke adalah infeksi (WHO, 2015).

Pengobatan penyakit akibat infeksi bakteri menggunakan antibiotik

banyak menimbulkan resistensi. Munculnya berbagai patogen yang

resisten terhadap antibiotik menjadi masalah yang serius dalam terapi

klinis karena menyebabkan penyakit menjadi semakin parah dan bahkan

menyebabkan kematian pasien. Oleh karena itu pencarian antibiotik baru

merupakan hal yang harus dilakukan untuk mengatasi hal tersebut

(Sulistyani, 2013). Selama beberapa dekade, metabolit mikroba telah

menjadi salah satu sumber utama obat baru bagi industri farmasi. Salah

satu sumber mikrobial yang potensial adalah actinomycetes (Genilloud,

dkk, 2010).

Actinomycetes merupakan kelompok mikroorganisme dengan

distribusi terbesar di alam khususnya pada tanah (Oskay et al, 2004).

Tanah rhizosfer adalah tanah yang menempel pada perakaran tanaman

yang banyak terdapat bakteri, jamur, dan actinomycetes. Banyaknya

mikroorganisme termasuk actinomycetes pada rizosfer ini disebabkan

2

karena akar tanaman mempunyai kemampuan mengeluarkan eksudat

yang mengandung bahan organik yang berguna sebagai sumber energi

bagi mikroorganisme yang hidup di sekitar perakaran tersebut.

Actinomycetes memiliki distribusi pertumbuhan yang luas serta

pertumbuhan yang berupa filamen di dalam tanah serta mampu

menghambat pertumbuhan mikroorganisme patogen melalui produksi

senyawa aktif yang berupa metabolit sekunder (Bonjar et al, 2006).

Mikroba tanah tersebut merupakan sumber penting antibiotik (Atriana,

2015). Dari 22.500 senyawa aktif yang diperoleh dari mikroba, sebanyak

45% diproduksi oleh actinomycetes, 38% oleh jamur, dan 17% oleh

bakteri uniseluler. Sebanyak 50% dari total populasi actinomycetes tanah

terkenal dalam memproduksi berbagai metabolit sekunder berupa

antibiotik (Fatmawati, dkk, 2014). Hampir 80% antibiotik di dunia diketahui

berasal dari actinomycetes (Ogunmwonyi et al, 2010), oleh karena itu

actinomycetes merupakan sumber potensial dalam eksplorasi antibiotik

baru.

Ambarwati, dkk. (2010) berhasil mengisolasi Streptomyces dari

rizosfer jagung (Zea mays) dan berhasil menemukan 23 isolat, 9 isolat

diantaranya mampu menghambat bakteri Bacillus subtilis dan 5 isolat

mampu menghambat Staphylococcus aureus. Di antara kelima, isolat satu

isolat (RNJ14) mampu menghambat S. aureus dengan kuat (32,33 mm).

Penelitian Sweetline, et al. (2012) berhasil mengisolasi actinomycetes dari

mangrove, 17 isolat di antara 38 isolat mampu menghasilkan zat

3

antibakteri. Delapan isolat mampu menghambat Staphylococcus sp. dan 3

isolat dapat menghambat bakteri Salmonella sp. Ambarwati, et al. (2012)

juga berhasil mengisolasi actinomycetes dari rizosfer padi (Oryza sativa).

Delapan belas isolat dihasilkan dari penelitian ini, empat isolat di

antaranya mampu menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus subtilis,

yaitu isolat RPR 8 dengan diameter daerah hambatan 11 mm, RPR 15 (18

mm), NRPR 6 (16 mm), serta NRPR 46 (21 mm). Pada tahun 2017,

Apriana telah melakukan isolasi actinomycetes dari rhizosfer kumis kucing

(Orthosiphon stamineus) dan salah satu isolat diberi kode KK-2.1 yang

belum diketahui aktifitasnya. Oleh karena itu penelitian ini dilakukan untuk

mengetahui profil KLT bioautografi pada isolat actinomycetes KK-2.1 yang

memberikan efek antibakteri dengan metode Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) bioautografi.

I.2 Rumusan Masalah

Bagaimana profil KLT bioautografi metabolit sekunder actinomycetes

KK-2.1 dari rhizosfer kumis kucing (Orthosiphon stamineus) sebagai

antibakteri terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus?

I.3 Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui profil KLT bioautografi metabolit sekunder

actinomycetes KK-2.1 dari rhizosfer kumis kucing (Orthosiphon stamineus)

sebagai antibakteri terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus

aureus.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Actinomycetes

Actinomycetes adalah organisme prokariotik yang termasuk bakteri

gram positif, hidup bebas, saprofit, terdistribusi secara luas di tanah, air,

dan membentuk kolonisasi pada jaringan tanaman atau endofit, juga

penghasil berbagai senyawa aktif dari hasil metabolisme sekunder.

Karakteristik morfologi dari prokariot ini menyerupai fungi karena memiliki

hifa atau filamen namun tidak bersekat. Mikroba ini termasuk dalam

golongan bakteri karena bersifat prokariot dan memiliki kandungan

peptidoglikan pada dinding selnya (Fatmawati, dkk. 2014).

Metabolit sekunder dari actinomycetes memiliki potensi untuk

memproduksi antibiotik dan senyawa potensial lainnya seperti antioksidan,

neuritogenik, anti kanker, antiinflamasi, dan agen imunosupresif

(Chaudary, et al. 2013).

II.1.1 Struktur actinomycetes

Actinomycetes merupakan kelompok besar bakteri aerob, memiliki

kadar G-C (guanin dan sitosin) yang tinggi, membentuk filamen bercabang

atau hifa dan spora aseksual. Secara morfologi, bakteri ini sangat mirip

dengan jamur. Saat di tumbuhkan pada media agar, cabang

actinomycetes membentuk jaringan hifa yang tumbuh baik di permukaan

5

maupun di bawah permukaan agar. Hifa pada permukaan bagian

atas disebut dengan hifa aerial sedangkan hifa pada bagian bawah

permukaan agar disebut dengan hifa substrat (Chaudary, et al. 2013).

Karakteristik actinomycetes secara mikroskopis ditandai dengan

bentuk filamen bercabang atau batang dan memiliki hifa tidak bersekat.

Miselium dapat bercabang atau tidak bercabang, lurus atau berbentuk

spiral. Spora berbentuk bola, silinder atau oval. Actinomycetes

menghasilkan koloni terdiri dari sistem percabangan filamen setelah

inkubasi 24-48 jam (Chaudary et al., 2013).

Dinding sel actinomycetes memiliki struktur kaku yang berperan

dalam mempertahankan bentuk sel dan mencegah pecahnya sel karena

tekanan osmotik tinggi. Dinding sel terdiri dari berbagai macam senyawa

kompleks yaitu peptidoglikan, asam teikoat, asam teichuronat dan

polisakarida. Peptidoglikan terdiri dari glikan (polisakarida) rantai N-asetil-

d-glukosamin (NAG), N-asetil-d-asam muramik dan asam diaminopimelik

(Chaudary et al., 2013).

Menurut Chaudary et al. (2013), actinomycetes dibedakan menjadi

empat kelompok berdasarkan penyusun dinding sel utama seperti tertera

pada tabel.

6

Tabel 1. Kelompok actinomycetes berdasarkan penyusun dinding sel

Tipe dinding sel Pola Gula Genera

I Tidak ada karakteristik pola

gula

Streptomyces,

Streptoverticillicum, dll.

II Araginosa, xylose

(Monosakarida)

Actinoplanes,

Micromonospora, dll.

III Tidak ada gula

Dermatophilus,

Planomonospora, dll.

IV Galaktosa, arabinosa Mycobacterium,

Nocardia, dll.

Sumber : Chaudary et al. Diversity and Versatility of Actinomycetes and its Role in Antibiotic Production. Madhav Institute of Technology & Science, Gwalior – 474005. India. (2013). Hal. 84

II.1.2 Habitat dan keberadaan actinomycetes

Actinomycetes merupakan organisme yang membentuk filamen

seperti benang dan paling banyak terdapat di dalam tanah sehingga

memiliki aroma khas seperti tanah. Actinomycetes tersebar luas di

ekosistem alami di seluruh dunia, tidak hanya pada tanah namun juga

terdapat pada ekosistem perairan. Senyawa bioaktif dari actinomycetes

laut mempunyai struktur kimia yang berbeda yang mungkin dapat menjadi

dasar sintesis obat baru yang digunakan untuk melawan patogen yang

resisten (Chaudary et al., 2013).

Telah dilaporkan dalam sebuah survei bahwa populasi

actinomycetes terbesar di tanah pada lapisan permukaan dan secara

bertahap menurun seiring dengan bertambahnya kedalaman namun strain

individu actinomycetes hadir di semua lapisan tanah (Chaudary et al.,

2013).

7

II.1.3 Peranan actinomycetes

Actinomycetes telah memproduksi banyak antibiotik. Antibiotik ini

meliputi amfoterisin, nistatin, kloramfenikol, gentamisin, eritromisin,

vankomisin, tetrasiklin, novobiokin, neomisin, dll. Antibiotik ini biasanya

tidak mempengaruhi sel manusia sehingga memiliki efek samping yang

rendah. Pengobatan menggunakan antibiotik ini biasanya digunakan

untuk penyakit infeksi pernafasan, antifungi, dan untuk meningkatkan

sistem kekebalan tubuh. Actinomycetes juga dapat menjadi sumber untuk

produksi enzim L-asparaginase. Berbagai actinomycetes, terutama yang

diisolasi dari tanah seperti Streptomyces griseus, S. karnatakensis, S.

albidoflavus dan Nocardia sp. memiliki kemampuan untuk memproduksi

enzim L-asparaginase. L-asparaginase dari mikroba umumnya digunakan

sebagai agen terapeutik dalam mengobati kanker tertentu, terutama pada

leukemia limfoblastik akut (Chaudary, et al. 2013).

Peranan actinomycetes tidak hanya pada bidang kesehatan, tetapi

juga pada bidang ekologi dan pertanian. Actinomycetes berpotensi untuk

menghambat pertumbuhan beberapa patogen tanaman misalnya Erwinia

amylovora (bakteri yang menyebabkan kebakaran pada apel),

Agrobacterium tumefaciens, dll. Sedangkan dalam ekologi tanah,

actinomycetes aktif dalam bioremediasi, pupuk hayati, dan biokontrol

(Chaudary, et al. 2013).

Actinomycetes memainkan peran penting dalam daur ulang dan

mineralisasi nutrisi dalam tanah. Actinomycetes dapat membantu dalam

8

daur ulang nutrisi dengan mendegradasi sejumlah besar bahan organik

dalam tanah dan yang biasanya ditemukan pada kompos. Actinomycetes

juga dapat bertindak sebagai pendukung pertumbuhan tumbuhan dengan

membantu fiksasi nitrogen, kelarutan nutrisi, imobilisasi nutrisi, kontrol

biologi dan pemeliharaan struktur tanah (Chaudary et al., 2013).

Actinomycetes sebagai rhizobakteria, dapat mempengaruhi

pertumbuhan suatu tumbuhan, antagonis patogen tumbuhan, dan

membuat tersedianya nutrisi untuk tumbuhan. Actinomycetes diketahui

dapat mendegradasi bahan organik kompleks seperti selulosa, lignin,

xylan, kitin, dan polisakarida kompleks lainnya, hal ini disebabkan karena

produksi enzim hidrolitik (Adegboye & Babalola, 2012).

II.2 Metabolit

Metabolit adalah hasil dari metabolisme. Metabolit dibedakan

menjadi dua macam, yaitu metabolit primer dan metabolit sekunder.

Metabolit primer adalah suatu metabolit atau molekul yang

merupakan produk akhir atau produk antara dalam proses metabolisme

makhluk hidup, yang fungsinya sangat esensial bagi kelangsungan hidup

organisme tersebut, serta terbentuk secara intraseluler. Metabolit primer

secara umum berada pada semua sistem biologi antara lain polisakarida,

protein, asam nukleat dan lemak (Pratiwi, 2008). Mikroorganisme

menghasilkan metabolit primer misalnya etanol. Metabolit primer

diproduksi pada waktu yang sama dengan pembentukan sel baru, dan

9

kurva produksinya mengikuti kurva pertumbuhan populasi secara paralel

(Pratiwi, 2008).

Metabolit sekunder adalah suatu molekul atau produk metabolit yang

dihasilkan oleh proses metabolisme sekunder mikroorganisme dimana

produk metabolit tersebut bukan merupakan kebutuhan pokok

mikroorganisme untuk hidup dan tumbuh. Metabolit sekunder merupakan

molekul rendah (BM<3000), secara kimia dan taksonomi bermacam–

macam senyawa dengan fungsi yang tidak jelas, sebagian besar

karakteristik untuk membedakan tipe organisme. Fungsi metabolit

sekunder bagi mikroorganisme penghasil itu sendiri sebagian besar belum

diketahui secara jelas. Metabolit sekunder dibuat dan disimpan secara

ekstraseluler. Metabolit sekunder banyak bermanfaat bagi manusia dan

makhluk hidup lain, karena banyak diantaranya bersifat sebagai obat,

pigmen, vitamin, ataupun hormon. Contohnya adalah kloramfenikol yang

berasal dari Streptomyces venezuellae, penisilin dari Penicillium notatum

(Pratiwi, 2008).

Menurut Genilloud, et al (2003) metabolit sekunder merupakan

senyawa dengan struktur kimia yang bervariasi dan rumit yang diproduksi

oleh beberapa spesies mikroba dan beberapa tumbuhan. Karakteristik

metabolit sekunder yaitu biasanya metabolit tidak diproduksi pada saat

pertumbuhan sel secara cepat (fase logaritmik), tetapi biasanya disintesis

pada akhir siklus pertumbuhan sel, yaitu pada fase stasioner saat populasi

sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang

10

mati. Pada fase ini, sel mikroorganisme lebih tahan terhadap keadaan

ekstrim, misalnya suhu yang lebih panas atau dingin, radiasi, bahan–

bahan kimia dan metabolit yang dihasilkannya sendiri (Pratiwi, 2008).

II.3 Rizosfer

Menurut Hamidah, dkk. (2013), rizosfer merupakan bagian tanah

yang berada di sekitar perakaran tanaman. Akar tanaman akan

mengeluarkan senyawa metabolit (eksudat) ke dalam tanah, seperti

senyawa-senyawa gula, asam amino, asam organik, glikosida, senyawa

nukleotida, enzim, vitamin, dan senyawa indol yang dapat dimanfaatkan

sebagai nutrisi untuk bakteri tanah sehingga dapat mempertahankan

kelangsungan hidupnya. Populasi mikroorganisme di rizosfer umumnya

lebih banyak dan beragam dibandingkan pada tanah nonrizosfer. Kualitas

biologi tanah meningkat dengan adanya mikroorganisme tanah terutama

pada rizosfer.

Beberapa mikroorganisme rizosfer berperan dalam siklus hara dan

proses pembentukan tanah, pertumbuhan tanaman, memengaruhi

aktivitas mikroorganisme, serta sebagai pengendali hayati terhadap

patogen akar. Sulistiyani (2006) menyampaikan bahwa populasi dan

keanekaragaman mikroorganisme diduga dipengaruhi oleh eksudat yang

dikeluarkan oleh akar tanaman. Eksudat akar mempengaruhi

pembentukan populasi mikroorganisme rizosfer. Produksi eksudat akar

tanaman dipengaruhi oleh umur atau fase pertumbuhan tanaman. Variasi

11

eksudat yang dikeluarkan oleh akar baik secara langsung maupun tidak

langsung mempengaruhi kualitas dan kuantitas mikroorganisme di dalam

perakaran. Tanah yang sehat bukan hanya subur dan banyak

mengandung bahan yang menunjang kesehatan tanaman, tetapi juga

mampu menyediakan lingkungan yang cocok bagi mikroba tanah,

sehingga tanaman dapat terlindungi dari patogen tanah. Sistem perakaran

sangat penting dalam penyerapan unsur hara karena sistem perakaran

yang baik akan memperpendek jarak yang ditempuh unsur hara untuk

mendekati akar tanaman. Mikroba tanah akan berkumpul di dekat

perakaran tanaman (rizosfer) yang menghasilkan eksudat akar dan

serpihan tudung akar sebagai sumber makanan mikroba tanah. Bila

populasi mikroba di sekitar rizosfer didominasi oleh mikroba yang

menguntungkan maka tanaman akan memperoleh manfaat yang besar

dengan hadirnya mikroba tersebut. Bakteri rizosfer dapat ditemukan dalam

jumlah yang banyak pada daerah permukaan perakaran, dimana nutrisi

disediakan oleh eksudat dan lysates tanaman.

II.4 Metode Pengujian Aktivitas Antimikroba secara Difusi

II.4.1 Cara cakram (disc)

Metode disc diffusion (tes Kirby & Bauer) menggunakan piringan

yang berisi agen antimikroba, kemudian diletakan pada media agar yang

sebelumnya telah ditanami mikroorganisme sehingga agen antimikroba

dapat berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan

12

adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba

pada permukaan media agar (Pratiwi, 2008).

II.4.2 E-test

Metode E-test digunakan untuk mengestimasi KHM (kadar hambat

minimum) yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat

menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan

strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah

hingga tertinggi dan diletakan pada permukaan media agar yang telah

ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang

ditimbulkan yang menunjukan kadar agen antimikroba yang menghambat

pertumbuhan mikroorganisme pada media agar (Pratiwi, 2008).

II.4.3 Ditch-plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakan

pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan

petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (maksimum 6

macam) digoreskan ke arah parit yang berisi agen antimikroba (Pratiwi,

2008).

II.4.4 Cup-plate technique

Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, dimana dibuat

sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan

13

pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji (Pratiwi,

2008).

II.5 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan bentuk kromatografi

planar, dimana fase diamnya berupa lapisan yang seragam pada

permukaan bidang datar yang dilapiskan pada lempeng kaca, plat

aluminium, atau plat plastik. Prinsip dari kromatografi lapis tipis adalah

suatu analit bergerak naik atau melintasi lapisan fase diam (paling umum

digunakan gel silica), dibawah pengaruh fase gerak yang bergerak melalui

fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).

Kelebihan khas KLT ialah keserbagunaan, kecepatan, dan

kepekaannya. Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa di

samping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat

disaputkan pada plat kaca atau penyangga lain dan digunakan untuk

kromatografi. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat

penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada pelat dan merupakan

keuntungan bila kita menelaah senyawa labil. Kepekaan KLT sedemikian

rupa sehingga bila diperlukan dapat dipisahkan bahan yang jumlahnya

lebih sedikit dari ukuran µg (Harbourne, 1987).

KLT digunakan secara luas untuk analisa kualitatif dengan

membandingkan nilai Rf solut dengan nilai Rf senyawa baku (Gandjar dan

Rohman, 2007). Nilai Rf dihitung dengan menggunakan perbandingan :

14

Jarak yang ditempuh solut

Jarak yang ditempuh fase gerak

Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai

perbandingan distribusi dan faktor retensi sama dengan 0 yang berarti

solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai

minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik

awal dipermukaan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).

II.6 Metode Bioautografi

Bioautografi merupakan metode skrining mikrobiologi yang umum

digunakan untuk mendeteksi adanya aktivitas antimikroba. Skrining

merupakan prosedur pertama yang dilakukan pada sampel yang akan

dianalisis untuk mengetahui ada atau tidaknya analit yang didapat.

Metode skrining ini memberikan sensitivitas yang lebih tinggi daripada

metode lainnya. Metode ini juga memiliki kelebihan yaitu, sederhana,

murah, hemat waktu dan tidak memerlukan peralatan yang canggih

(Choma, et al., 2010).

Prosedur bioautografi untuk skrining aktivitas antimikroba dengan

mengetahui lokasi aktivitas antibakteri pada kromatogram. Agen

antimikroba ditransfer dari lempeng KLT ke plat agar yang diinokulasi

dengan cara difusi dan menampakkan zona hambat (Rahman, dkk.,

2005). Skrining metode bioautografi pada dasarnya untuk menguji

aktivitas biologis, misalnya antibakteri, antijamur, dan antiprotozoa zat uji.

Metode deteksi ini dapat berhasil dengan dikombinasikan dengan teknik

15

kromatografi lapis tipis. Prosedur dalam metode bioautografi hampir sama

dengan yang digunakan dalam metode difusi agar. Perbedaannya adalah

senyawa yang diuji berdifusi ke media agar yang diinokulasi dari lapisan

kromatografi, yang merupakan adsorben atau kertas (Choma, et al.,

2010).

Metode bioautografi dibedakan menjadi tiga yaitu, bioautografi

kontak, bioautografi imersi atau bioautografi agar overlay, dan bioautografi

langsung. Prinsip bioautografi kontak, plat kromatografi diletakkan pada

permukaan agar yang telah diinokulasi mikroba uji selama beberap menit

atau jam sehingga proses difusi dapat terjadi. Plat kromatogram diambil

dan media agar diinkubasi. Daerah hambatan ditunjukan dengan adanya

spot antimikroba yang menepel pada permukaan media agar. Pada

bioautografi imersi, plat kromatogram dicelup pada medium agar, setelah

agar memadat ditambahakan mikroorganisme uji lalu diinkubasi. Metode

ini merupakan kombinasi dari bioautografi kontak dan langsung, karena

senyawa antimikroba ditransfer dari kromatogram ke media agar, seperti

dalam metode kontak, tetapi lapisan agar tetap pada permukaan

kromatogram selama inkubasi dan visualisasi seperti pada bioautografi

langsung (Choma, et al., 2010).

Bioautografi langsung merupakan metode bioautografi yang paling

banyak digunakan dari semua metode bioautografi. Prinsip dari metode ini

adalah plat KLT dicelupkan pada suspensi mikroorganisme kemudian

diinkubasi. Visualisasi dari zona ini biasanya dilakukan dengan

16

menggunakan reagen dehydrogenase untuk deteksi aktivitas, yang paling

umum adalah garam tetrazolium. Dehydrogenase mikroorganisme

mengkonversi garam tetrazolium menjadi berwarna, sehingga terlihat spot

krem-putih dengan latar belakang ungu pada permukaan plat KLT

menunjukan keberadaan agen antibakteri (Choma, et al., 2010).

II.7 Bakteri Uji

II.7.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri patogen

penting yang berkaitan dengan virulensi toksin, dan invasif (Karimela et al,

2017). Rahmi et al. (2015); Herlina et al. (2015) menyatakan bahwa

bakteri S. aureus dapat menyebabkan terjadinya berbagai jenis infeksi

mulai dari infeksi kulit ringan, keracunan makanan sampai dengan infeksi

sistemik serta sering menyebabkan infeksi nosokomial pada rumah sakit.

S. aureus adalah bakteri gram positif dengan diameter 0,5-1,0 mm,

berbentuk serangkaian buah anggur, tidak membentuk spora dan tidak

bergerak (BSN 2015). Foster (2008) menambahkan bahwa

Staphylococcus adalah bakteri berbentuk kokus, gram-positif yang

memiliki lapisan peptidoglikan tebal, berkelompok, berpasangan dan

kadang berantai pendek.

II.7.2 Escherichia coli

E. coli merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk basil, ada

yang individu (monobasil), saling berpasangan (diplobasil) atau berkoloni

17

membentuk rantai pendek (streptobasil), tidak membentuk spora maupun

kapsula, berdiameter ±1,1–1,5 x 2,0–6,0 μm, dan dapat bertahan hidup di

medium sederhana. Pergerakan bakteri ini motil, tidak motil, dan

peritrikus. Ada yang bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif. Kecepatan

berkembang biak bakteri ini berada pada interval 20 menit jika faktor

media, derajat keasaman, dan suhu sesuai. Selain tersebar di banyak

tempat dan kondisi, bakteri ini tahan terhadap suhu, bahkan pada suhu

ekstrim sekalipun. Suhu yang baik untuk pertumbuhan bakteri ini adalah

antara 8OC – 46OC, tetapi suhu optimalnya adalah 37OC. Oleh karena itu,

bakteri tersebut dapat hidup dalam tubuh manusia dan vertebrata lainnya.

E. coli merupakan bagian dari mikrobiota normal saluran pencernaan. E.

coli dapat berpindah karena adanya kegiatan seperti dari tangan ke mulut

atau dengan pemindahan pasif lewat minuman. E. coli dalam usus besar

bersifat patogen jika melebihi jumlah normalnya. Strain tertentu dapat

menyebabkan peradangan selaput perut dan usus (gastroenteritis).

Bakteri ini menjadi patogen berbahaya apabila hidup di luar usus seperti

pada saluran kemih, yang dapat mengakibatkan peradangan selaput

lendir (sistitis) (Elfidasari et al. 2011).

II.8 Antibakteri

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam lima

kelompok yaitu (Ganiswarna, 1995) :

18

1. Antibakteri yang menghambat metabolisme sel bakteri.

Bakteri membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya.

Berbeda dengan mamalia yang mendapatkan asam folat dari luar,

kuman patogen harus mensintesis sendiri asam folat dari asam amino

benzoat (PABA) untuk kebutuhan hidupnya. Antibakteri bekerja

memblok tahap metabolik spesifik pada bakteri, seperti pada

sulfonamide, trimethoprim, PAS dan sulfon.

2. Antibakteri yang menghambat sintesis dinding sel bakteri

Dinding sel bakteri terdiri dari polipeptidoglikan yaitu suatu

kompleks polimer mukopeptida. Antibakteri golongan ini dapat

menghambat sintesis atau menghambat aktivitas enzim yang

berperan dalam pembentukan dinding sel mikroorganisme. Antibakteri

yang termasuk dalam golongan ini adalah penisilin, sefalosporin,

vankomisin dan sikloserin.

3. Antibakteri yang menggangu keutuhan membran sel bakteri

Antibakteri secara langsung bekerja pada membran sel yang

mempengaruhi mempengaruhi permeabilitas dan menyebabkan

keluarnya senyawa intraseluler yang berupa komponen penting dari

dalam sel mikroorganisme yaitu protein, asam nukleat dan nukleotida.

Antibakteri yang termasuk dalam kelompok ini adalah polimiksin,

kolistin, dan sebagainya.

4. Antibakteri yang menghambat sintesis protein sel bakteri

19

Dalam kelangsungan hidupnya, bakteri perlu mensintesis berbagai

protein, dimana sintesis protein berlangsung di ribosom dengan

bantuan mRNA dan tRNA. Antibakteri mempengaruhi fungsi ribosom

pada mikroorganisme yang menyebabkan sintesa protein terhambat.

Pada bakteri, ribosom terdiri atas dua subunit yang berdasarkan

konstanta sedimentasi dinyatakan sebagai ribosom 30S dan 50S.

antibakteri yang berinteraksi dengan ribosom 50S antara lain

kloramfenikol, linkomisin, klindamisin, dan eritromisin.

5. Antibakteri yang menghambat sintesis asam nukleat sel bakteri

Dalam hal ini antibakteri mempengaruhi metabolisme asam

nukleat. Antibakteri kelompok ini bekerja dengan cara berikatan

dengan enzim polimerase-RNA sehingga menghambat sintesis RNA

dan DNA oleh enzim tersebut. Sebagai contoh, kuinolon menghambat

DNA girase dan rifampisin mengikat dan menghambat DNA-

dependent RNA-polimerase yang ada pada bakteri.

20

BAB III

METODE PENELITIAN

III.1 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat gelas

(Pyrex®), autoklaf (All American Model 25X-2®), cawan petri (OneMed®),

freeze dryer (Scanvac®), inkubator (Memmert®), jangka sorong (Tricle

Brand®), laminar air flow (Envirco®), lemari pendingin (Panasonic®),

mikroskop (Olympus CX 22LED®), oven (Memmert®), pipet mikro (Bio

Rad®), shaker (Gemmy Orbit Model : VRN-480®), dan timbangan analitik

(Radwag®).

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain

aquades, bakteri uji Eschericia coli dan Staphylococcus aureus, butanol,

etil asetat, isolat actinomycetes KK-2.1, lempeng KLT silika gel GF 254,

metanol, SNA (Starch Nitrite Agar), SNB (Starch Nitrite Broth), NA

(Nutrient Agar), NaCl 0,9%, dan kertas cakram 6 mm.

III.2 Metode Kerja

III.2.1 Sterilisasi alat

Alat-alat yang akan digunakan dicuci dengan deterjen kemudian

dibilas dengan air lalu dikeringkan. Alat-alat gelas disterilkan

menggunakan oven pada suhu 180°C selama 2 jam. Alat-alat logam

disterilkan dengan cara dipijarkan pada bunsen, sedangkan alat ukur dan

21

alat yang terbuat dari karet atau plastik disterilkan menggunakan autoklaf

pada suhu 121°C selama 15 menit.

III.2.2 Pembuatan medium

III.2.2.1 Medium nutrient agar

Ditimbang medium NA sebanyak 2,3 gram kemudian dimasukkan

kedalam erlenmeyar lalu dilarutkan dalam 100 ml aquades,

dihomogenkan, diatur pH menjadi 7 selanjutnya didihkan dan disterilkan

pada autoklaf dengan suhu 121°C selama 1 jam dengan tekanan 2 atm.

III.2.2.2 Medium starch nitrate agar

Ditimbang agar sebanyak 20 g, starch 20 g, KNO3 1 g, MgSO4 0,5

g, K2HPO4 0,5 g, NaCl 0,5 g, dan FeSO4 0,01 g, kemudian dimasukkan

kedalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 1000 ml aquades,

dihomogenkan, diatur pH menjadi 7 selanjutnya didihkan dan disterilkan

pada autoklaf dengan suhu 121°C selama 1 jam dengan tekanan 2 atm.

III.2.2.3 Medium starch nitrate broth

Ditimbang starch 20 g, KNO3 1 g, MgSO4 0,5 g, K2HPO4 0,5 g, NaCl

0,5 g, dan FeSO4 0,01 g, kemudian dimasukkan kedalam erlenmeyer lalu

dilarutkan dalam 1000 ml aquades, dihomogenkan, diatur pH menjadi 7

selanjutnya didihkan dan disterilkan pada autoklaf dengan suhu 121°C

selama 1 jam dengan tekanan 2 atm.

22

III.2.3 Penyiapan bakteri uji

III.2.3.1 Peremajaan bakteri uji

Inokulasikan biakan segar bakteri uji (Eschericia coli dan

Staphylococcus aureus) ke dalam 10 mL medium nutrient agar pada

tabung reaksi dengan cara digores pada agar miring lalu inkubasi selama

1x24 jam pada suhu 37°C.

III.2.3.2 Pembuatan suspensi bakteri uji

Bakteri uji (Eschericia coli dan Staphylococcus aureus) yang

diremajakan disuspensikan dengan larutan NaCl fisiologis 0,9% sebanyak

10 ml kemudian dibandingkan kekeruhan dengan standar Mc Farland 0,5

sebagai pembanding visual dari kepadatan visual.

III.2.4 Penyiapan isolat actinomycetes

III.2.4.1 Peremajaan isolat actinomycetes KK-2.1

Isolat actinomycetes KK-2.1 yang telah diperoleh diremajakan

dengan cara diinokulasikan ke dalam medium starch nitrate agar miring

sebanyak 10 ml dalam tabung reaksi dan diinkubasi selama 7x24 jam

pada suhu 37°C.

III.2.4.2 Fermentasi isolat actinomycetes KK-2.1

Isolat actinomycetes KK-2.1 yang telah diremajakan dipindahkan

pada labu erlenmeyer 500 mL yang mengandung 200 mL medium SNB.

23

Fermentasi dilakukan pada suhu kamar selama 24 hari dalam kondisi

tergojok.

III.2.5 Ekstraksi

Setelah proses fermentasi, 1000 ml media fermentasi isolat

actinomycetes KK-2.1 disaring dengan menggunakan kain kasa untuk

memisahkan biomassa dan cairan fermentasi. Sebanyak 7,04 gram

biomassa diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan metanol

sebanyak 700 ml sedangkan cairan fermentasi sebanyak 1000 ml

diekstraksi dengan menggunakan metode ekstraksi cair-cair

menggunakan 1000 ml pelarut etil asetat dalam corong pisah lalu digojok

kemudian didiamkan selama 20 menit hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan

atas (etil asetat) diekstraksi sebanyak 2 kali lalu diuapkan hingga

diperoleh ekstrak kering sedangkan lapisan bawah (air) dikeringkan

menggunakan freeze dryer. Dari tahap ekstraksi ini diperoleh ekstrak etil

asetat sebanyak 48 mg, ekstrak air sebanyak 2,8909 gram, dan ekstrak

metanol sebanyak 126,7 mg. Ekstrak yang diperoleh disimpan dalam

desikator selama 16 hari yaitu selama penelitian berlangsung.

III.2.6 Uji aktivitas antibakteri

Medium nutrient agar sebanyak 10 ml dituang ke dalam cawan petri

dan disuspensikan dengan 0,1 ml biakan bakteri uji Eschericia coli dan

Staphylococcus aureus. Setelah medium padat, dimasukkan kertas

cakram yang mengandung amoxicllin (kontrol positif), etil asetat (kontrol

24

negatif), ekstrak etil asetat, ekstrak metanol, dan ekstrak air di atas media

inokulum. Semua cawan petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C,

kemudian diamati adanya aktivitas antibakteri yang ditandai dengan

adanya zona hambatan pertumbuhan bakteri disekitar kertas cakram dan

dilakukan pengukuran garis tengah daerah hambatan dengan

menggunakan jangka sorong.

III.2.7 Pengamatan morfologi

Karakteristik mikroskopik isolat actinomycetes KK-2.1 diamati

menggunakan metode culture slide yaitu koloni dari kultur stok digores

pada media SNA dan cover glass diletakkan pada media, kemudian

diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 minggu. Pengamatan terhadap

struktur dan bentuk spora dengan menggunakan mikroskop perbesaran

1000x.

III.2.8 KLT-Bioautografi

Ekstrak yang aktif ditotol pada lempeng KLT yang dikembangkan

dengan campuran fase gerak etil asetat:metanol (4:0,5) untuk ekstrak etil

asetat dan n-butanol:metanol:air (7:1:1) untuk ekstrak air. Noda hasil

pemisahan diamati pada sinar UV (254 nm dan 366 nm). Noda pada

lempeng ditempelkan ke cawan petri yang berisi medium NA dan telah

berisi biakan bakteri uji, lempeng KLT dibiarkan menempel selama 60

menit di lemari pendingin. Setelah itu, diangkat dengan hati-hati.

25

Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi,

dilakukan pengamatan dengan melihat zona bening yang terbentuk.

III.2.9 Identifikasi komponen kimia

Senyawa aktif pada lempeng KLT kemudian diidentifikasi dengan

cara menyemprotkan reagen kimia untuk menentukan golongan senyawa

yang menghambat pertumbuhan bakteri Eschericia coli dan

Staphylococcus aureus.

III.3 Pengumpulan dan Analisis Data

Data yang diperoleh kemudian dilakukan proses analisis.

III.4 Pembahasan Hasil dan Pengambilan Keputusan

Pembahasan hasil dilakukan berdasarkan hasil pengamatan

kemudian disimpulkan.

26

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Peremajaan Isolat Actinomycetes KK 2.1

Isolat actinomycetes yang digunakan pada penelitian ini merupakan

hasil isolasi dari rhizosfer kumis kucing (Orthosiphon stamineus). Isolat

tersebut diremajakan pada medium starch nitrate agar (SNA). Medium

SNA merupakan salah satu medium yang mengandung sumber karbon

dan mineral-mineral yang dibutuhkan untuk pertumbuhan actinomycetes.

Sumber karbon medium SNA berasal dari soluble starch yang

mengandung sejumlah karbon. Sumber nitrogen anorganik (NO3-) berasal

dari KNO3, sedangkan mineral-mineral dari magnesium, natrium, besi, dan

kalium yang merupakan komposisi dari medium tersebut (Mubarak dkk.

2017). SNA merupakan medium selektif yang digunakan untuk isolasi

actinomycetes dan penggunaan medium ini dapat meminimalisir

kontaminasi bakteri lain (Riyanti, dkk. 2012).

Berdasarkan hasil peremajaan, isolat KK-2.1 memiliki pertumbuhan

yang maksimal pada hari ke-7. Hasil peremajaan pada hari ke-7 dapat

dilihat pada gambar 1.

27

Gambar 1. Hasil inokulasi isolat actinomycetes pada medium starch nitrate agar

IV.2 Fermentasi Isolat Actinomycetes KK 2.1

Produksi senyawa metabolit isolat actinomycetes KK-2.1 dilakukan

pada media produksi cair yaitu starch nitrate broth (SNB). Media

pertumbuhan yang baik adalah media yang mampu menyediakan sumber

karbon dan mineral-mineral yang dibutuhkan dalam pertumbuhan maupun

aktivitas actinomycetes. Selain media pertumbuhan, produksi antibotik

yang optimal dapat diperoleh dengan memperhatikan pH. pH berperan

penting dalam reaksi enzimatis pembentukan metabolit. pH yang optimum

dalam pertumbuhan memacu aktivitas produksi senyawa bioaktif. pH

medium akan berpengaruh pada proses pembentukan dan kestabilan

senyawa anti mikroba yang dihasilkan (Wulandari dan Sulistyani, 2016).

Pada penelitian ini, pH 7 digunakan untuk medium fermentasi karena

pada umumnya antibiotik akan terbentuk pada pH antara 7-8, sedang

pada pH yang lebih tinggi, potensi antibiotik yang terbentuk akan terurai

oleh suasana basa (Ulya, 2009).

28

Proses fermentasi isolat actinomycetes KK-2.1 dilakukan pada suhu

ruang selama 24 hari pada kondisi teragitasi dengan laju penggojokan 150

rpm. Hari ke-24 fermentasi merupakan fase stasioner dari proses

pertumbuhan isolat actinomycetes KK-2.1. Hal ini didasarkan pada hasil

uji aktivitas cairan fermentasi terhadap lama fermentasi yang

menunjukkan bahwa hari fermentasi ke-24 memiliki aktivitas antibakteri

paling besar terhadap bakteri E. coli dan S. aureus dengan diameter zona

hambat masing-masing sebesar 11,54 mm dan 9,69 mm.

IV.3 Ekstraksi

Setelah proses fermentasi, supernatan dan biomassa dipisahkan.

Supernatan diekstraksi dengan cara ekstraksi cair-cair menggunakan

pelarut etil asetat. Penggunaan etil asetat didasarkan pada penelitian

Sulistyani dan akbar (2014) yang telah melakukan optimasi terhadap

pelarut heksan, kloroform dan etil asetat. Dari hasil penelitian tersebut

diketahui bahwa pelarut etil asetat mampu menarik metabolit sekunder

dengan jumlah paling banyak dari supernatan serta memiliki aktivitas

paling tinggi jika dibandingkan dengan ekstrak lainnya. Sehingga pada

penelitian ini digunakan pelarut etil asetat untuk mengekstraksi senyawa

metabolit sekunder pada supernatan. Setelah digojok dan didiamkan

selama 20 menit, akan terbentuk 2 lapisan pada corong pisah, lapisan

atas kemudian diuapkan hingga diperoleh ekstrak sebanyak 48 mg dari

1000 ml supernatan yang diekstraksi. Selanjutnya lapisan bawah

29

sebanyak 100 ml dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer

sehingga diperoleh ekstrak air sebanyak 2,8909 gram. Biomassa

diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol. Setelah

filtrat dan supernatan dipisahkan, supernatan kemudian diuapkan hingga

diperoleh ekstrak metanol sebanyak 126,7 mg. Sedikitnya jumlah ekstrak

yang diperoleh dapat disebabkan karena tidak dilakukannya optimasi

pada media fermentasi. Ekstrak tersebut dimasukkan ke dalam vial lalu

disimpan di dalam desikator.

IV.4 Uji Aktivitas Ekstrak

Ekstrak etil asetat, ekstrak metanol dan ekstrak air yang telah

diperoleh diujikan pada bakteri S. aureus dan E. coli. Kontrol positif

digunakan sebagai pembanding kekuatan ekstrak dalam menghambat

bakteri. Kontrol negatif digunakan untuk memastikan bahwa zona hambat

yang dihasilkan bukan berasal dari pelarut yang digunakan, tetapi murni

dari ekstrak. Kontrol positif yang digunakan adalah kertas cakram

amoxicillin, sedangkan kontrol negatif yang digunakan adalah etil asetat

yang diteteskan pada kertas cakram. Kertas cakram yang digunakan yaitu

kertas cakram yang memiliki diameter 6 mm dengan ketebalan 0,5 mm.

Hasil pengujian dapat dilihat pada tabel 2.

30

Tabel 2. Hasil pengukuran rata-rata diameter zona hambat ekstrak terhadap bakteri E. coli dan S. aureus

Kadar Ekstrak Ekstrak Daya Hambat (mm)

E. coli S. aureus

2 mg Air - 13,17 Etil asetat 7,11 7,56 Metanol - -

4 mg Air - 15,01 Etil asetat 8,98 9,85 Metanol - -

Kontrol positif Amoxicillin 29,13 16,38

Pada hasil uji aktivitas diatas menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat

dapat menghambat aktivitas bakteri E. coli dan S. aureus. Hal ini

menunjukkan bahwa etil asetat mampu menarik senyawa antibakteri yang

dapat menghambat kedua bakteri uji tersebut.

Ekstrak air hanya dapat menghambat bakteri S. aureus. Hal ini

kemungkinan disebabkan karena adanya perbedaan komponen penyusun

dinding sel antara bakteri gram positif dengan bakteri gram negatif.

Dinding sel bakteri gram positif strukturnya lebih sederhana dibandingkan

struktur dinding sel bakteri gram negatif yang lebih kompleks.

Kompleksitas dinding sel bakteri E. coli kemungkinan dapat menghambat

ekstrak yang diujikan untuk dapat menembus dinding sel bakteri. Pada

bakteri gram positif, dinding sel terutama terdiri dari peptidoglikan, tidak

memiliki membran luar dan ruang periplasmik serta sensitif terhadap

antibiotik (Djide, N dan Sartini, 2014). Pada ekstrak metanol, tidak

menunjukkan aktifitas antibakteri terhadap kedua bakteri uji. Hal ini diduga

terjadi karena cairan penyari yaitu metanol pada proses maserasi

biomassa tidak mampu menembus masuk kedalam dinding sel isolat

actinomycetes KK-2.1, sehingga senyawa yang memiliki aktivitas

31

antibakteri tidak dapat keluar dari sel. Oleh karena itu, sebaiknya

biomassa digerus atau disonikasi terlebih dahulu sebelum di maserasi

agar dinding sel bakteri pecah dan penyari dapat masuk menembus

kemudian merusak membran sel bakteri sehingga senyawa antibakteri

pada isolat ini dapar terekstraksi.

Gambar 2. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak dengan kadar 2 mg dan 4 mg terhadap bakteri a) E. coli; b) S. aureus

32

IV.5 KLT-Bioautografi

Ekstrak yang memiliki aktivitas antibakteri yaitu ekstrak air dan

ekstrak etil asetat dilanjutkan pada pengujian menggunakan metode KLT-

bioautografi kontak. Senyawa antibakteri yang berdifusi dari lempeng

kromatogram kedalam media agar akan menghambat pertumbuhan

bakteri setelah diinkubasi pada waktu dan suhu yang tepat hingga noda

yang menghambat pertumbuhan bakteri uji tampak pada permukaan

membentuk zona bening.

Pada ekstrak etil asetat yang dielusi dengan campuran fase gerak

etil asetat:metanol (4:0,5) terlihat adanya empat noda yang muncul pada

lempeng KLT dengan nilai Rf yaitu 0,13; 0,5; 0,61; dan 0,78. Zona bening

terhadap bakteri uji E. coli dan S. aureus hanya pada noda dengan nilai Rf

0,78. Senyawa antibakteri pada noda tersebut mampu menghambat

kedua bakteri uji yang digunakan.

Gambar 3. Hasil uji KLT bioautografi ekstrak etil asetat terhadap bakteri E. coli

Rf=0,78

33

Gambar 4. Hasil uji KLT Bioautografi ekstrak etil asetat terhadap bakteri S. aureus

Sedangkan pada ekstrak air yang telah ditotolkan pada lempeng

KLT dan elusi dengan campuran fase gerak n-butanol:metanol:air (7:1:1)

terlihat adanya tiga noda yang muncul pada lempeng KLT dengan nilai Rf

yaitu 0,1; 0,2; dan 0,3. Namun zona bening hanya terlihat pada noda

dengan nilai Rf 0,3 dengan aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji S.

aureus.

Gambar 5. Hasil uji KLT bioautografi ekstrak air terhadap bakteri S. aureus

Rf=0,78

Rf=0,3

34

IV.6 Identifikasi komponen kimia

Uji kualitatif komponen kimia pada noda yang memiliki aktivitas

antibakteri dilakukan dengan menyemprotkan beberapa reagen. Berikut

hasil yang didapatkan pada uji kualitatif terhadap ekstrak etil asetat.

(a)

(b)

(c)

Gambar 6.Penampakan noda ekstrak etil asetat pada plat KLT (a) setelah disemprot H2SO4 10%; (b) UV 254 nm; dan (c) UV 366

(a)

(b)

(c)

Gambar 7. Penampakan noda ekstrak etil asetat pada plat KLT setelah disemprot

(a) vanilin asam sulfat, (b) lieberman burchard, dan (c) FeCl3

Hasil diatas menunjukkan perubahan warna pada noda yang

memiliki aktivitas antibakteri setelah disemprotkan dengan pereaksi vanilin

asam sulfat dan lieberman burchard. Pereaksi vanilin asam sulfat

digunakan untuk mendeteksi beberapa komponen senyawa termasuk

terpenoid. Hasil positif terpenoid ditunjukkan dengan perubahan warna

Rf = 0,13

Rf = 0,61

Rf = 0,5

Rf = 0,78

35

bercak menjadi ungu. Setelah penyemprotan dengan pereaksi vanilin

asam sulfat, terlihat adanya bercak warna ungu. Hal ini menunjukkan

bahwa bercak noda yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri pada

ekstrak etil asetat diduga merupakan golongan senyawa terpenoid. Pada

penyemprotan dengan pereaksi lieberman burchard terlihat pula noda

berwarna ungu setelah dipanaskan. Pereaksi lieberman burchard

digunakan untuk deteksi senyawa golongan triterpenoid. Terpenoid

mempunyai kemampuan sebagai antibakteri dengan mekanisme kerjanya

diduga melibatkan pemecahan membran oleh komponen-komponen

lipofilik (Wardani dan Sulistyani, 2017). Kafur dan khan (2012)

menyatakan bahwa mekanisme kerja terpenoid sebagai antibakteri diduga

melibatkan kerusakan oleh senyawa lipofilik sehingga mengurangi

permeabilitas dinding sel bakteri dalam memperoleh nutrisi.

Pada ekstrak air, dilakukan uji kualitatif protein menggunakan

metode Lowry. Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ menjadi

Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+

bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat membentuk warna biru.

Setelah dilakukan penambahan pereaksi, terlihat perubahan menjadi

warna biru yang menunjukkan adanya protein (Purwoko dan Handajani,

2007).

Menurut Zaneta dan Kusumaningtyas (2012), mekanisme peptida

antibakteri dalam menghambat bakteri dapat berbeda-beda. Mekanisme

ini dapat dipengaruhi oleh sifat dan komposisi asam amino dari peptida.

36

Pada umumnya peptida dapat berinteraksi dengan membran sel bakteri,

namun ada juga peptida antibakteri yang dapat melewati membran untuk

masuk ke dalam sel bakteri.

IV.7 Identifikasi morfologi

Berdasarkan identifikasi secara makroskopik, isolat actinomycetes

dengan kode KK-2.1 pada media starch nitrate agar menunjukkan ciri-ciri

isolat actinomycetes yaitu koloni kering, tidak mengkilap, tidak berlendir,

dan melekat kuat pada media. Warna miselium aerial, warna miselium

vegetatif dan warna pigmen difusi dapat dilihat pada tabel 3.

Gambar 8. Hasil inokulai isolat actinomycetes pada media starch nitrate agar

Menurut Irwan (2008) setiap koloni actinomycetes memiliki

karakteristik warna miselium udara yang beragam dikarenakan

kemampuan bagian ini untuk memproduksi pigmen tertentu.

Tabel 3. Identifikasi makroskopik isolat actinomycetes pada media starch nitrate agar

Warna miselium

aerial

Warna miselium

vegetatif

Warna pigmen

difusi

Putih Kemerahan Kemerahan

Berdasarkan hasil pengamatan secara mikroskopik dengan

mengunakan metode slide culture yang diinkubasi selama 7 hari, maka

37

isolat actinomycetes dapat dikelompokkan dalam kelompok jenis

Streptomyces dengan bentuk spora yang lurus dan tipe spora

monoverticillus.

Sumber : Dokumentasi pribadi Sumber : Isolation, characterization and identification

of Actinobacteria of Mangrove ecosystem,

Bhitarkanika, Odisha

Gambar 9. Pengamatan secara mikroskopik isolat actinomycetes KK-2.1 pada perbesaran 1000x

38

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Profil KLT-bioautografi pada ekstrak etil asetat dari isolat

actinomycetes KK-2.1 terdapat 4 noda yang muncul pada plat KLT

dengan nilai Rf 0,13; 0,5; 0,61; dan 0,78. Noda dengan nilai Rf 0,78

memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Eschericia coli dan

Staphylococcus aureus, serta diduga sebagai terpenoid. Sedangkan

profil KLT-bioautografi pada ekstrak air terdapat 3 noda yang muncul

pada plat KLT dengan nilai Rf 0,1; 0,2; dan 0,3. Noda dengan nilai Rf

0,3 memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus

aureus dan diduga sebagai protein.

V.2 Saran

Dapat dilakukan penelitian lebih lanjut yaitu isolasi dan karakterisasi

senyawa dari metabolit sekunder actinomycetes KK-2.1 yang aktif sebagai

antibakteri.

39

DAFTAR PUSTAKA

Adegboye, M.F. and Babalola O.O. 2012. Taxonomy and Ecology of Antibiotic Producing Actinomycetes. African Journal of Agricultural Research. 7. (15): 2255 -2261

Ambarwati, C.J., Soegihardjo dan Sembiring, L. 2010. Isolasi dan Identifikasi Streptomycetes dari Rizosfer Jagung (Zea mays L.) yang Berpotensi sebagai Penghasil Antibiotik. Jurnal Biota. 25. (1): 25-31.

Ambarwati, Sujono, T., A., Sembiring, L., dan Wahyuono, S. 2012. Keanekaragaman Isolat Actinomycetes Penghasil Zat Antibakteri dari Rizosfer Padi (Oriza sativa). Prosiding Seminar Nasional Biodiversitas. FMIPA UNS, 10 November 2012.

Ambarwati dan Trisnawati, A.G. 2009. Isolasi Actinomycetes dari Tanah Sawah Sebagai Penghasil Antibiotik. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi, 10. (2): 101-111.

Atriana, N. 2015. 2015. Isolasi dan Penapisan Aktinomiset Penghasil Senyawa Antibakteri dari Lingkungan. Riset Informasi Kesehatan. 5. (1): 34-39.

Bonjar, S.G.H., Zamanian, S., Aghigi, S., Farokkhi, R., Mahdavi, M.J., and Saadoun, I. 2006. Antibacterial Activity of Iranian Streptomyces Coralus Strain 63 Against Ralstonia Solanacearum.J. Biol. Sci. 6. (1): 127-129.

[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2015. SNI 2332.9: Cara Uji Mikrobiologi – Bagian 9. Penentuan Staphylococcus aureus Pada Produk Perikanan. Jakarta (ID): Badan Standar nasional.

Chaudary, H.S., Soni, B., and Shrivastava, A.R. 2013. Diversity and Versatility of Actinomycetes and its Role in Antibiotic Production. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 3. (1): pp. S83-S94

40

Choma, Irena, M., Edyta, M.G. 2010. Bioautography Detection in Thin-Layer Chromatography. Journal of Chromatography A. Chroma-351708. pp 1-7.

Difco and BBL Team. 2009. Manual of Microbiological Culture Media. 2nd

ed. Dickinson and company. New York. Available as PDF file.

Djide, M.N., dan Sartini. 2008. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Unhas. Makassar.

Djide, M.N., dan Sartini. 2014. Dasar-dasar Mikrobiologi Farmasi. Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Unhas. Makassar

Elfidasari, D., Saraswati, A.M., Nufadianti, G., Samiah, R., dan Setiowati, V. 2011. Perbandingan Kualitas Es di Lingkungan Universitas Al Azhar Indonesia dengan Restoran Fast Food di Daerah Senayan dengan Indikator Jumlah Escherichia coli Terlarut. Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains Dan Teknologi. 1. (1): 18-19.

Fatmawati, U., Santosa, S., Rinanto, Y., dan Probosari, R. Antibacterial Activity of Actinomycetes Isolated from Solanaceae Plants Rhizosphere. 2014. Jurnal Farmasi Indonesia. ISSN: 1693-8615 EISSN : 2302-4291. 11. (1): 54 - 68.

Foster, Timothy. 2008. Staphylococcus. Diakses melalui http://gsbs.utmb.edu/microbook/ ch012.htm. Medmicro Chapter 12. [20/1/2016].

Gandjar, I., dan G., Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisa. Pustaka Pelajar. Yogyakarta. hal. 328-329 dan 353-354.

Ganiswarna, G.S. 1995. Farmakologi dan Terapi. Ed. 4. Fakultas Kedokteran UI. Jakarta. hal. 586-587.

Genilloud, Gonzalez, Salazar, Jesus, M., Tormo, V. 2010. Current Approaches to Exploit Actinomycetes as A Source of Novel Natural Products. J Ind Microbiol Biotechnol. 14. (1): 44-88.

41

Hamidah, Ambarwati dan Indrayudha, P. 2013. Isolasi Dan Identifikasi Isolat Actimocetes Dari Rizosfer Padi (Oryza sativaL.) Sebagai Penghasil Antifungi. Fakultas Farmasi Universitas Muhamadiyah Surakarta.

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Terjemahan oleh Kosasih P dan Iwang S. Bandung: ITB. hal. 13.

Herlina N., Fifi A., Aditia D., C., Poppy, D., H., Qurotunnada dan Baharuddin T. 2015. Isolasi dan identifikasi Staphylococcus aureus dari susu mastitis subklinis di Tasikmalaya, Jawa Barat. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon. 1. (3): 413-417.

Irwan, M dan Erna, L. 2008. Skrining Streptomyces sp. Isolat Lombok Sebagai Pengenadali Hayati Beberapa Jamur Patogen Tanaman. CropAgro. 1. (2).

Karimela, E. J., Ijong, F. G., dan Dien, H.A. 2017. Karakteristik Staphylococcus aureus yang di Isolasi dari Ikan Asap Pinekuhe Hasil Olahan Tradisional Kabupaten Sangihe. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia. 20. (1): 188-198.

Kafur, A & Khan, A. 2011. Isolation of endophytic Actinomycetes from Catharanthes roseus (L.) G. Don leaves and their antimicrobial activity. J. Biotech. 9. (4): 302 - 306.

Mubarak, F., Rante, H., Djide, N. 2017. Isolasi Dan Aktivitas Antimikroba Aktinomycetes Dari Tanah Karst Taman Wisata Bantimurung Asal Maros Sulawesi Selatan. As-Syifaa. 9. (01) : 8.

Ogunmwonyi, Mazomba, Mabinya, Ngwenya, Green, Akinpelu, Olaniran, Bernard, and Okoh. 2010. Studies on the Culturable Marine Actinomycetes Isolated from the Nahoon Beach in the Eastern Cape Province of South Africa. Afr. J. Microbiol. pp.2223 - 2230.

Oskay, M., Tamer, A., and Azeri, C. 2004. Antibacterial Activity of Some Actinomycetes Isolated from Farming Soils of Turkey. African J Biotechnol. 3. (9): 441-446.

42

Pratiwi, S., T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.

Purwoko dan Handajani, N. 2007. Kandungan Protein Kecap Manis Tanpa Fermentasi Moromi Hasil Fermentasi Rhizopus oryzae dan R. oligosporus. BIODIVERSITAS. 8. (2): 225.

Radji, M. 2011. Mikrobiologi. Buku Kedokteran EGC. Jakarta.

Rahman, Atta, Choudhary M. Iqbal, and William J.Thomsen. 2005. Bioassay Techniques for Drug Development. Harwood academic publishers. p : 14.

Rahmi Y., Darmawi, Mahdi, A., Faisal J., Fakhrurrazi, dan Yudha F. 2015. Identification of Staphylococcus aureus in preputium and vagina of horses (Equus caballus). Journal Medika Veterinaria. 9. (2): 16.

Rante, H., Wahyono, Murti, Y., dan Alam, G. 2010. Purifikasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri dari Actinomycetes Asosiasi Spons terhadap Bakteri Patogen Resisten. Majalah Farmasi Indonesia. 21. (3): 160–165.

Riyanti, Aziz, S., Sabdono, A., dan Radjasa, K. 2012. Deteksi Gen NRPS Aktinomisetes Simbion Rumput Laut dan Karang Lunak. Prosiding Seminar Nasional. Pengembangan Sumber Daya Pedesaan dan Kearifan Lokal Berkelanjutan II.

Sulistyani, N. 2013. Keragaman Isolat Actinomycetes Berdasarkan Analisis RFLP Terhadap Gen NRPS. Jurnal Ilmiah Kefarmasian. 3: 81-94.

Sulistyani, N dan Akbar, A. N. 2014. Aktivitas Isolat Actinomycetes dari Rumput Laut (Eucheuma cottonii) sebagai Penghasil Antibiotik terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 12. (1): 5–6.

Sulistiyani, T.R. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Antibiotik dari Isolat Actinomycetes Tanah Pulau Timor Bagian Barat (NTT). Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.

43

Sweetline, C., Usha, R., and Palaniswamy, M. 2012. Antibacterial Activity of Actinomycetes from Pichavaram Mangrove of Tamil Nadu. Applied Journal of Hygiene. 1. (2): 15-18.

Ulya, J. 2009. Kemampuan Penghambatan Streptomyces spp. Terhadap Mikroba Patogen Tular Tanah pada Beberapa Kondisi Pertumbuhan : Jenis Media, Waktu Produksi, pH, dan Suhu. Tesis. Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor.

Wardhani, L., dan Sulistyani, N. 2012. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat Daun Binahong (Anredera scandens (L.) Moq.) terhadap Shigella flexneri beserta Profil Kromatografi Lapis Tipis. Jurnal Ilmiah Kefarmasian. 2. (1): 1-16.

Wulandari, S dan Sulistyani, N. 2016. Pengaruh Media Terhadap Pertumbuhan Isolat Actinomycetes Kode Al35 Serta Optimasi Produksi Metabolit Antibakteri Berdasarkan Waktu Fermentasi Dan pH. Media Farmasi. 13. (2): 191-196.

World Health Organization. 2015. Top 10 cause of death worldwide. (Online). (http://who.int/mediacentre/factssheets/fs310/en/, diakses 18 Oktober 2017).

Zanet dan Kusumaningtyas, E. 2012. Peran Peptida Susu Sebagai Antimikroba untuk Meningkatkan Kesehatan. Balai Besar Penelitian Veteriner. 18. (1): 71-73.

Zuyl, J., and Mark, B. 2003. Isolation, characterization and identification of Actinobacteria of Mangrove ecosystem. African Journal of Agricultural Research. 8. (2): 1233 dan1237.

44

Lampiran 1

Skema Kerja

- Dilakukan peremajaan isolat actinomycetes KK-2.1 - Dilakukan fermentasi isolat dari hasil peremajaan - Diekstraksi cairan fermentasi dengan pelarut etil asetat

selama 20 menit (corong pisah) dan biomassa diekstraksi dengan pelarut metanol

- Dikeringkan

- Dilakukan uji aktivitas antibakteri

-Ditotol pada beberapa plat KLT yang kemudian dikembangkan dengan campuran fase gerak yang sesuai -Ditempelkan bercak noda pada plat KLT pada media yang berisi medium dan suspensi bakteri uji. -Dimasukkan ke lemari pendingin kemudian dibiarkan menempel selama 60 menit kemudian diangkat

Isolat actinomycetes KK-2.1

Ekstrak

Ekstrak aktif

Cawan petri Plat kromatogram

Diinkubasi pada suhu 37°C, selama 24 jam

Diamati dan diukur zona hambat

Diamati pada sinar UV 254 dan 366 nm

Dihitung nilai Rf

Disemprot dengan beberapa pereaksi

Diamati

Analisis data

Pembahasan

Kesimpulan

45

Lampiran 2

Komposisi Medium

1. Nutrient Agar

Komposisi :

Agar 15.0 g

Peptone 5.0 g

Beef extract 3.0 g

Air suling hingga 1000 ml

2. Strarch Nitrate Agar

Komposisi :

Agar 20 g

KNO3 1 g

MgSO4 0.5 g

K2HPO4 0.5 g

NaCl 0.5 g

Soluber starch 20 g

FeSO4 0.01 g

Air suling hingga 1000 ml

3. Starch Nitrate Broth

Komposisi :

KNO3 1 g

MgSO4 0.5 g

K2HPO4 0.5 g

46

NaCl 0.5 g

Soluber starch 20 g

FeSO4 0.01 g

Air suling hingga 1000 ml

47

Lampiran 3

Dokumentasi Penelitian

(a) (b)

Gambar 10. Hasil uji difusi setiap ekstrak

Ket. : (a) Bakteri uji E. coli

(b) bakteri uji S. Aureus

A = Ekstrak etil asetat

B = Ekstrak air

C = Kontrol negatif

D = Ekstrak metanol

Gambar 11. Proses fermentasi

A

D

C

B D

CC

B

A

48

Gambar 12. Proses ekstraksi cair-cair

Gambar 13. Ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak air

49

(a) (b)

(c)

Gambar 14. Ekstrak air pada plat KLT (a) sinar UV 254; (b) sinar UV 366 nm; (c) Setelah disemprot H2SO4 10%

Gambar 15. Hasil uji kualitatif protein pada ekstrak air setelah penambahan pereaksi Folin-Ciocalteau

Rf = 0,1

Rf = 0,2

Rf = 0,3

50

Lampiran 4

Perhitungan Nilai Rf

Rf = Jarak yang ditempuh solut

Jarak yang ditempuh fase gerak

Ekstrak etil asetat

Noda 1 = = 0,13

Noda 2 = = 0,5

Noda 3 = = 0,61

Noda 4 = = 0,78

Ekstrak air

Noda 1 = = 0,1

Noda 2 = = 0,2

Noda 3 = = 0,3