Aus dem Institut für Pathologie der Universität zu Lübeck ... · Aus dem Institut für Pathologie der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. med. Alfred Christian Feller Charakterisierung

Aus dem Institut für Pathologie

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. Alfred Christian Feller

Charakterisierung von angioimmunoblastischen T-Zell -Lymphomen

auf morphologischer, immunhistochemischer und mole kularer Ebene

mit Schwerpunkt auf dem microRNA-Expressionsprofil

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität Lübeck

-Aus der Sektion Medizin-

vorgelegt von

Katharina Reddemann

aus Bonn

Lübeck 2015

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Christoph Thorns

2. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Heinz Fehrenbach

Tag der mündlichen Prüfung: 14.09.2015

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 14.09.2015

Promotionskommission der Sektion Medizin

I

Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis ............................. ................................................................ IV

Tabellenverzeichnis ............................... .................................................................... V

Abkürzungsverzeichnis ............................. ............................................................... VI

1. Einleitung ........................................ ............................................................. 1

1.1. Grundlagen ................................................................................................... 1

1.1.1. Lymphome .................................................................................................... 1

1.1.1.1. Periphere T-Zell Lymphome .......................................................................... 2

1.1.1.2. Angioimmunoblastische T-Zell-Lymphome .................................................... 4

1.1.2. microRNA .................................................................................................... 12

1.1.2.1. microRNA-Physiologie ................................................................................ 12

1.1.2.2. microRNA-Dysregulation ............................................................................. 15

1.2. Fragestellung ...............................................................................................17

2. Material und Methoden ............................. .................................................18

2.1. Material ........................................................................................................18

2.2. Methoden .....................................................................................................18

2.2.1. Studiengruppe ............................................................................................. 18

2.2.2. Patientenproben .......................................................................................... 18

2.2.3. Histopathologische Methoden ..................................................................... 19

2.2.3.1. Herstellung des Tissue Microarrays ............................................................ 19

2.2.3.2. Herstellung von Paraffin-Schnittpräparaten ................................................. 20

2.2.3.3. Histochemische Färbungen von formalinfixierten, paraffineingebetteten

Gewebsschnitten ......................................................................................... 20

2.2.3.4. Immunhistochemische Färbung von formalinfixierten, paraffineingebetteten

Gewebsschnitten ......................................................................................... 21

2.2.4. Molekularbiologische Methoden .................................................................. 23

2.2.4.1. Nachweis von Epstein-Barr-Virus kodierter RNA (EBER) in formalinfixierten,

paraffineingebetteten Gewebsschnitten mittels chromogener In-situ-

Hybridisierung ............................................................................................. 23

2.2.4.2. RNA-Isolierung aus paraffineingebettetem Gewebe .................................... 23

2.2.4.3. Quantifizierung von RNA in wässriger Lösung ............................................. 23

2.2.4.4. Relative Quantifizierung der microRNA-Expression mittels RT-qPCR ......... 24

2.2.4.5. Reverse Transkription (RT) – Polymerase- Ketten-Reaktion (RT-PCR) ....... 24

2.2.4.6. Quantitative Real Time- Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ...................... 25

II

2.2.5. Statistische Analysen der RT-qPCR- Ergebnisse ........................................ 27

2.2.5.1. Präprozessierung ....................................................................................... 28

2.2.5.2. Quantilnormalisierung ................................................................................. 28

2.2.5.3. Fall-Kontroll-Analyse ................................................................................... 30

3. Ergebnisse ........................................ ......................................................... 31

3.1. Charakteristika der Patienten/innen ............................................................. 31

3.2. Ergebnisse der histopathologischen Analysen ............................................ 31

3.2.1. Ergebnisse der Analyse der Gewebsschnitte hinsichtlich des histologischen

Musters und der Proliferation der hochendothelialen Venolen und der FDC-

Netzwerke ................................................................................................... 31

3.2.2. Ergebnisse der immunhistochemischen Analysen anhand des tissue

microarray (TMA) ........................................................................................ 36

3.3. Ergebnisse der EBER-ISH .......................................................................... 41

3.4. Ergebnisse der microRNA-Quantifizierung .................................................. 42

4. Diskussion ........................................ ......................................................... 44

4.1. Morphologie - Die Proliferation der Venolen als frühes Merkmal von AITL .. 44

4.2. Immunhistochemie ...................................................................................... 45

4.2.1. Stathmin als relevanter und möglicherweise CD10 überlegener Marker in

AITL ............................................................................................................ 45

4.2.2. LMO2 wird nicht von AITL-Zellen exprimiert ................................................ 46

4.3. MicroRNA-Expression ................................................................................. 47

4.3.1. Mögliche Oncomir in AITL ........................................................................... 47

4.3.2. Mögliche Tumor suppressor-miR in AITL .................................................... 54

4.3.3. Vorsicht bei der Auswahl der endogenen Kontrolle und

Normalisierungsmethode in AITL ................................................................ 56

4.3.4. MicroRNA und Subgruppen ......................................................................... 57

4.4. Limitationen der Arbeit und Ausblick............................................................ 59

5. Zusammenfassung ................................... ................................................. 62

6. Literaturverzeichnis .............................. .................................................... 64

III

7. Anhang ............................................ ............................................................81

7.1. Material ........................................................................................................81

7.1.1. Geräte ......................................................................................................... 81

7.1.2. Verbrauchsmaterialien ................................................................................ 82

7.1.3. Reagenzien und Chemikalien ...................................................................... 83

7.1.4. Kits 84

7.1.5. Antikörper .................................................................................................... 84

7.1.6. Primer ......................................................................................................... 85

7.1.7. Software ...................................................................................................... 85

7.1.8. In silico Ressourcen .................................................................................... 85

7.2. Ergänzende Tabellen und Abbildungen ........................................................86

8. Danksagung ........................................ ........................................................97

9. Lebenslauf ........................................ ..........................................................98

10. Erklärung ......................................... ......................................................... 100

IV

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Biosynthese und Wirkungsweise von microRNAs ............................ 14

Abbildung 2 Anordnung der Gewebsstanzen im tissue microarray ...................... 20

Abbildung 3 Prinzip der RT-qPCR ....................................................................... 27

Abbildung 4 Histomorphologisches Muster der AITL (n=30) ................................ 32

Abbildung 5 Histomorphologisches Bild eines AITL ............................................ 33

Abbildung 7 Bewertung der Expansion der FDC-Netzwerke ............................... 35

Abbildung 8 Bewertung der Proliferation der hochendothelialen Venolen............ 35

Abbildung 9 Durchschnittswerte des Scorings..................................................... 36

Abbildung 10 Immunhistochemische Färbung mit CD3- Antikörper ...................... 38

Abbildung 11 Immunhistochemische Färbung mit CD20- Antikörper ..................... 38

Abbildung 12 Immunhistochemische Färbung mit Stathmin- Antikörper ................ 39

Abbildung 13 Immunhistochemische Färbung mit CD10- Antikörper ..................... 39

Abbildung 14 Immunhistochemische Färbung mit PD1- Antikörper ...................... 40

Abbildung 15 Färbeverhalten der neoplastischen T-Zellen in AITL für die Antikörper

gegen Stathmin, PD1 und CD10 ..................................................... 40

Abbildung 16 In-situ Hybridisierung für EBER ....................................................... 41

Abbildung 17 Boxplot der CT-Werte pro Fall und Platte nach Präprozessierung ... 29

Abbildung 18 Boxplots der CT-Werte pro Fall und Platte nach

Quantilnormalisierung ...................................................................... 29

Abbildung 19 Boxplots der CT-Werte der signifikant aberrant exprimierten

microRNAs nach ansteigenden adjustierten p-Werten ..................... 43

Abbildung 20 TaqMan Human MicroRNA Array A ................................................. 88

Abbildung 21 TaqMan Human MicroRNA Array B ................................................. 89

Abbildung 22 Boxplot der CT-Werte pro Platte ...................................................... 90

V

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Periphere T-Zell Lymphome nach aktueller WHO-Klassifikation .......... 3

Tabelle 2 Nomenklatur der microRNAs ..............................................................15

Tabelle 3 Histochemische Färbungen ................................................................21

Tabelle 4 Antikörper (mit Verdünnungen und Vorbehandlungen) .......................22

Tabelle 5 Master Mix für die RT-PCR (Ansatz für eine Probe) ...........................24

Tabelle 6 Thermocycler Programm (Reverse Transkription) ..............................25

Tabelle 7 Ansatz für die Real-Time PCR ............................................................26

Tabelle 8 Graduierung der Proliferation der hochendothelialen Venolen und der

FDC-Netzwerke mit Zuordnung der Score-Werte ...............................32

Tabelle 9 Grenzwerte der immunhistochemischen Färbungen ........................ 37

Tabelle 10 Signifikant aberrant exprimierte RNAs in der Fall-Kontroll-Analyse .....42

Tabelle 11 Geräte ................................................................................................82

Tabelle 12 Verbrauchsmaterialien ........................................................................82

Tabelle 13 Reagenzien und Chemikalien .............................................................84

Tabelle 14 Kits .....................................................................................................84

Tabelle 15 Antikörper ...........................................................................................84

Tabelle 16 Primer .................................................................................................85

Tabelle 17 Software .............................................................................................85

Tabelle 18 In-silico Resourchen ...........................................................................85

Tabelle 19 Patienten-Charakteristika und Ergebnisse der Graduierungen ...........86

Tabelle 20 Ergebnisse der immunhistochemischen Auswertung anhand des tissue

microarrays .........................................................................................87

Tabelle 21 Charakteristika der Kontrollgruppe......................................................87

Tabelle 22 Ergebnisse der Präprozessierung .......................................................90

Tabelle 23 CT-Werte der Lymphom- und Referenz-Fälle .....................................92

Tabelle 24 Top 10 microRNAs für EBER ..............................................................93

Tabelle 25 Top 10 microRNAs für Stathmin .........................................................93

Tabelle 26 Top 10 microRNAs für CD10 ..............................................................94

Tabelle 27 Top 10 microRNAs für PD1 ................................................................94

Tabelle 28 Top 10 microRNAs für die Proliferation der HEV ................................95

Tabelle 29 Top 10 der microRNAs für die Expansion der FDC-Netzwerke ...........95

Tabelle 30 Top 10 der microRNAs für das histomorphologische Muster ..............96

VI

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Erklärung

ACID Activation induced cell death

ACVBP Doxorubicin, Cyclophosphamid,

Vindesine Bleomycin, Prednison

Ago Argonaut-Protein

AITL Angioimmunoblastisches T-Zell-Lymphom

ALCL Anaplastic large cell lymphoma

ALK Anaplastic lymphoma kinase

AML Akute myeloische Leukämie

Bcl B-cell lymphoma

CD Cluster of differentiation

cDNA Complementary DNA

CGH Comparative genomic hybridization

CHOP Cyclophosphamid, Hydroxydaunorubicin,

Vincristin, Prednison

CP Crossing point

CT Threshold cycle

CTLA4 Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4

CXC-L/R C-X-C motif chemokin/receptor

DGCR8 DiGeorge Critical Region Gene 8

DNA Desoxyribonucleic Acid

DNMT3A DNA(cytosine-5)-methyltransferase 3A

EBER Epstein-Barr-Virus codierte RNA

EBV Epstein-Barr-Virus

ERK Extracellular-signal regulated kinase

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor

FAME Functional assignment of microRNA via

enrichment analysis

Fc Crystallisable Fragment

FDC Follicular dendritic cell

GELA Groupe d’Etudes des lymphomes de

l’Adulte

GSEA Gene set enrichement analysis

VII

GTP Guanosintriphosphat

HCC Hepatocellular carcinoma

HE Hematoxilin Eosin

HIV Human inmmunodeficiency Virus

HRP Horseradish Peroxidase

HTLV Human T-lymphotropic virus

ICOS Inducible t-cell co-stimulator

IDH2 Isocitratdehydrogenase

IGFR1 Insulin-like Growth Factor Receptor

IL Interleukin

IPI Internationaler Prognose Index

K-RAS Kirsten rat sarcoma

KSHV Kaposi-sarcoma Herpes Virus

LDH Laktatdehydrogenase

LMO2 LIM domain only 2

LMP1 Latent membrane protein

MALT Mucosa associated lymphatic tissue

mBACOD Methotrexat, Bleomycin, Doxorubicin,

Cyclophosphamid, Vincristin,

Dexamethason

MDS Myelodysplastisches Syndrom

Min. Minute

MIQE Minimum information for publication of

quantitative Real-time PCR Experiments

miRNA/miR microRNA

mM Milli molar

mRNA Messenger RNA

MTOC Mikrotubulus organizaing center

MYC Myelocytomatose-Gen

nm Nanometer

ng Nanogramm

NFkappaB Nuclear factor kappa light chain enhancer

of activated B-cells

NK Natural killer

NOS Not otherwise specified

NF1 Neurofibromin 1

VIII

NPM Nukleophosmin

Pri-miRNA Primary microRNA

P53 Tumor protein 53

PAS Periodic Schiff Acid

PCR Polymerase Chain Reaction

PD1 Programmed cell death

PIAI Prognosis in AITL

PIT Prognosis Index for T-cell lymphomas

PNEN Pancreatic neuroendocrine neoplasia

PTCL Peripheral t-cell lymphoma

qPCR Quantitative Real-Time PCR

Ras Rat sarcoma (proto-Onkogen)

RISC RNA-induced silencing complex

RNU44 Nucleoläre RNA 44

RT Reverse Transkription

SAP Slam-associated protein

Sec. Sekunde

SEER Surveillance, Epidemiology and End-

Results

siRNA Silencing RNA

SIRT1 Sirtuin-1

snoRNA Small nucleolar RNA

SOX2 Sex-determining region Y-box 2

STAT Signal Transducers and Activators of

Transkription

TCR T-cell receptor

TET2 Ten-eleven Translocation 2 (-Gen)

Tfh Follikuläre T-Helfer Zelle

TNF Tumor necrosis factor

TNM Tumor, Nodus, Mestastasis

(Klassifikation)

TMA Tissue microarray

TRAF TNF receptor associated factor

VEGF Vascular endothelial growth factor

VEGFR1/KDR Vascular endothelial growth factor

receptor 1/

IX

WHO World Health Organization

z.B. Zum Beispiel

°C Grad Celsius

µl Mikroliter

∆ Delta

% Prozent

1

1. Einleitung

1.1. Grundlagen

1.1.1. Lymphome

In der aktuellen Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für Tumore der

hämatopoetischen und lymphatischen Gewebe definieren Jaffe et al. Lymphome als

klonale Tumore reifer oder unreifer B-Zellen, T-Zellen oder natürlicher Killer (NK)-

Zellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung (148). Ihre Klassifikation basiert

auf der Zusammenschau aller verfügbaren Informationen, die diese Erkrankungen

charakterisieren, von Epidemiologie, geographischer Variation und klinischen

Parametern bis Gewebslokalisation, Histomorphologie, Immunphänotyp und mole-

kularem Profil (56). Morphologie und Immunphänotyp sind in der Praxis ausreichend

für die Diagnose der meisten lymphatischen Neoplasien. Jedoch ist kein antigener

Marker spezifisch für eine Neoplasie, sodass die Kombination aus Morphologie und

eines Panels mehrerer Marker für eine korrekte Diagnose notwendig sind (148).

Traditionell werden Hodgkin-Lymphome von sogenannten Non-Hodgkin-Lymphomen

unterschieden (148).

Hodgkin-Lymphome wurden im 19. Jahrhundert nach ihrem Entdecker Thomas

Hodgkin benannt (136). Heutzutage werden darunter das klassische Hodgkin-Lymph-

om und das noduläre lymphozytenprädominante Hodgkin-Lymphom zusammengefasst,

die in der Mehrzahl der Fälle von B-Zellen ausgehen (5).

Non-Hodgkin-Lymphome umfassen alle weiteren Lymphome der B- und T/NK-Zell-

Reihe, wobei B-Zell Lymphome sehr viel häufiger sind als T-Zell-Lymphome (148).

Laut Bericht „Krebs in Deutschland 2009/2010“ der deutschen Krebsregister erkrankten

im Jahr 2010 insgesamt 8590 Männer und 7640 Frauen in Deutschland an einem Non-

Hodgkin-Lymphom. Für 2014 wird nach Prognose der Krebsregister mit der

Neuerkrankung von 9400 Männern und 7900 Frauen gerechnet.

Im Vergleich zu anderen Krebserkrankungen, wie z.B. Brust- oder Lungenkrebs, sind

maligne Lymphome bei Erwachsenen jedoch eher selten. Im Jahr 2010 standen in

Deutschland Non-Hodgkin-Lymphome bei Männern auf Rang 9, bei Frauen auf Rang 8

der Krebsneuerkrankungsliste. Im Mittel waren Männer bei Diagnosestellung 69,

Frauen 71 Jahre alt (1). Etwa 6000 Menschen versterben jährlich in Deutschland an

dieser Erkrankung (1). Eindeutige Risikofaktoren für Non-Hodgkin-Lymphome lassen

sich nur selten nachweisen (1). Immunschwäche (z.B. HIV-vermittelt) sowie seltene

Autoimmunerkrankungen (wie Hashimoto-Thyroiditis) gehen allerdings mit einem

erhöhten Risiko einher. Auch Viren und andere Krankheitserreger tragen zur Ent-

2

stehung einiger Lymphome bei (1, 148): So gilt zum Beispiel der Zusammenhang

zwischen einer Epstein-Barr-Virus (EBV) – Infektion und dem vorwiegend in Afrika

auftretenden Burkitt-Lymphom als gesichert.

1.1.1.1. Periphere T-Zell Lymphome

Periphere T-Zell Lymphome (PTCL) umfassen alle Neoplasien, die sich von post-

thymischen T-Lymphozyten oder reifen natürlichen Killer (NK)-Zellen ableiten (51).

Es gibt zwei Klassen reifer CD3+ T-Zellen, die anhand der Heterodimere des T-Zell-

Rezeptors eingeteilt werden: alpha-beta und gamma-delta. Alpha-beta T-Zellen

umfassen CD4+ (zumeist Helfer) und CD8+ (zumeist zytotoxische) Subpopulationen.

Sie sind Teil des adaptiven Immunsystems und finden sich zumeist im peripheren Blut

und den peripheren lymphatischen Organen, wie Lymphknoten (68). Gamma-delta T-

Zellen (CD4-CD8-, CD4-CD8+) machen unter 5% der T-Zellen aus. Nebst NK-Zellen

gehören sie zum angeborenen Immunsystem und finden sich vor allem in Haut,

Schleimhäuten und roter Milzpulpa (51, 68).

Periphere T-Zell Lymphome sind selten und stellen etwa 15% der Non-Hodgkin-

Lymphome dar. Epidemiologisch zeigen sie wichtige geographische Variationen,

teilweise überlappend mit Endemiegebieten spezieller viraler Infektionen (159). So ist

zum Beispiel in Endemiegebieten des humanen T-lymphotropischen Virus-1 (HTLV-1)

in Japan und der Karibik, das Risiko für die adulte T-Zell Leukämie durch das Virus

erhöht (68).

Gemäß der Weltgesundheitsorganisation (WHO) werden zur Zeit 23 Entitäten

hinsichtlich Morphologie, Immunphänotyp, molekularem Profil, klinischer Parameter

und dem vermuteten normalen zellulären Pendant in der Gruppe der PTCL

unterschieden. Ein Hauptkriterium zur Klassifizierung ist der Manifestationsort der

Erkrankung: So kommen kutane, nodale und extranodale sowie leukämisch

verlaufende periphere T-Zell Lymphome vor (vgl. Tab 1).

3

PTCL Entität Häufig -

keit (%)°

Postulierte

Ursprungsszelle

Phänotyp

Dissiminiert/Leukämisch

Prolymphozytische T-Zell-Leukämie Tαß Nicht-zytotoxisch

Großzellige granulierte lymphozytische T-Zell Leukämie Tαß (seltener Tγδ) Zytotoxisch (a)

Chronische lymphoproliferative Störung der NK-Zellen* NK Zytotoxisch (a)

Systemische EBV-positive T-Zell Lymphoproliferation der

Kindheit

Tαß Zytotoxisch (a)

Adulte(s) T-Zell Leukämie/Lymphom 9,6 Tαß T regulatorisch

Extranodal

Extranodales NK-/T-Zell Lymphom (nasaler Typ) 10,4 NK (seltener Tαß

oder Tγδ)

Zytotoxisch (a)

Enteropathie-assoziiertes T-Zell Lymphom 4,7 IIL, Tαß (seltener

Tγδ)

Zytotoxisch (a)

Hepatosplenisches T-Zell Lymphom 1,4 Tγδ (seltener Tαß) Zytotoxisch (na)

Kutan

Mycosis fungoides Tαß (meist CD4) Nicht-zytotoxisch

Sézary Syndrom Tαß (meist CD4) Nicht-zytotoxisch

Primäre kutane CD30-positive T-Zell Lymphoproliferation Tαß (meist CD4)

Primäres kutanes großzelliges anaplastisches Lymphom 1,7 Tαß (CD4) Zytotoxisch (a)

Lymphomatoide Papulose Tαß (CD4) Zytotoxisch (a)

Subkutanes Pannikulitis-ähnliches T-Zell Lymphom 0,9 Tαß (CD8) Zytotoxisch (a)

Primäres kutanes γδ T-Zell Lymphom Tγδ Zytotoxisch (a)

Primäres kutanes CD8+ aggressives epidermotropisches

cytotoxisches T-Zell Lymphom*

Tαß (CD8) Zytotoxisch (a)

Primäres kutanes CD4+ kleinzelliges/mittelgroßzelliges T-

Zell Lymphom*

Tαß (CD4, Tfh) Zytotoxisch (a)

Hidroa vacciniformis-ähnliches Lymphom Tαß (selten NK) Zytotoxisch

Nodal

Peripheres T-Zell Lymphom, nicht anderweitig spezifiziert

(NOS)

25,9 Tαß (CD4>CD8),

selten Tγδ

Variabel, Tfh,

zytotoxisch (a)

Angioimmunoblastisches T-Zell Lymphom 18,5 Tαß (CD4, Tfh) Tfh

Großzelliges anaplastisches Lymphom, ALK-positiv 6,6 Tαß (Th2?) Zytotoxisch (a)

Großzelliges anaplastisches Lymphom, ALK-negativ* 5,5 Tαß (Th2?) Zytotoxisch (a)

Tabelle 1 Periphere T-Zell Lymphome nach aktueller WHO-Klassifikation

Modifiziert nach (51), *provisorische Entitäten, °Statistik basierend auf pathologisch-anatomischen Registrierungen mit Unterrepräsentanz der leukämischen und kutanen Entitäten, Abkürzungen (nicht im Verzeichnis): a=aktiviert, na=nicht aktiviert

4

Die variable Morphologie und das Fehlen definierter diagnostischer Marker für die

meisten der Subgruppen macht die Diagnose und Klassifizierung der Erkrankungen

sehr anspruchsvoll und behindert ihre Erforschung (67). Zusätzlich zur Rarität,

Diversität und Heterogenität der PTCL, die das Zusammenstellen einer großen

Patientenkohorte erschweren, enthalten die Tumorproben zumeist eine Vielzahl

reaktiver T-Zellen (35). Außerdem sind nur wenige Zelllinien und gute Tiermodelle

verfügbar, sodass das Verständnis der Pathobiologie der PTCL weit hinter dem Wissen

zu malignen B-Zell Neoplasien zurückbleibt (35).

Mit den momentan geläufigen immunhistochemischen und molekularen Markern sind

30 bis 50% der peripheren T-Zell-Lymphom-Fälle bisher nicht klassifizierbar und

werden als PTCL, not otherwise specified, (PTCL- NOS) kategorisiert (67).

Mit Ausnahme der Translokation t(2;5)(p23;q35) in ALK-positiven anaplastischen

großzelligen Lymphomen, sind bisher wenige spezifische diagnostische genetische

Veränderungen für die Subgruppen der peripheren T-Zell-Lymphome berichtet worden.

Mithilfe von Gen-Expressionanalysen konnten reproduzierbare genetische Signaturen

einiger PTCL-Subgruppen gezeigt werden, die zur Klassifizierung der T-Zell

Lymphome beitragen (6). So gibt es vermehrt Hinweise dafür, dass die Ursprungs-

zellpopulation, ein wichtiger Faktor für die Biologie der PTCL sind (51).

1.1.1.2. Angioimmunoblastische T-Zell-Lymphome Die Erkrankung, die wir heute als angioimmunoblastisches T-Zell Lymphom (AITL)

bezeichnen, wurde in den 1970er Jahren unter anderem von Frizzera et al. und

Lennert erstmals beschrieben (47, 87).

Das angioimmunoblastische T-Zell Lymphom ist mit 18,5% eines der zwei häufigsten

peripheren T-Zell Lymphome weltweit (159). Geographisch finden sich

angioimmunoblastische T-Zell Lymphome häufiger in Europa (29%) als in Nordamerika

(16%) oder Asien (18%) (135, 159). Bislang sind jedoch die Ätiologie, Risikofaktoren

oder eine ethnische Prädisposition nicht identifiziert worden (106).

Die Erkrankung betrifft zumeist ältere Erwachsene mit einem mittleren Alter von 69

Jahren (Spanne von 10 bis 96 Jahren) bei Diagnosestellung. Je nach Studie sind

Männer und Frauen entweder gleich häufig betroffen oder aber die Inzidenz wird für

Männner als etwas höher angegeben (39, 165).

Die Symptomatik des angioimmunoblastischen T-Zell Lymphoms geht weniger auf

direkte Komplikationen des Tumorwachstums als auf ein dereguliertes und

geschwächtes Immunsystem zurück (35).

5

Häufig manifestiert sich die Erkrankung mir einer generalisierten Lymphadenopathie,

oft assoziiert mit B-Symptomen (Fieber, Gewichtsverlust und Nachtschweiß) (39). Viele

der Patienten zeigen zudem eine Hepatosplenomeglie. In bis zu 50% der Fälle

kommen Hauteffloreszenzen, oft in Verbindung mit Juckreiz, vor (36). Seltener wurden

unter anderem arthritische Beschwerden, Pleuraergüsse und Aszites sowie

neurologische, pulmonale und gastrointestinale Symptome beschrieben (36, 108).

Häufige laborchemische Befunde sind Autoimmunphänomene, wie hämolytische

Anämie (Coombs-positiv) oder der Nachweis von Autoantikörpern (Kälteagglutinine,

Rheumafaktoren, Anti-nukleäre Antikörper, Anti-Smooth muscle Antikörper) im Blut (43,

106). Außerdem finden sich häufig eine Thrombozytämie und Lymphopenie sowie

erhöhte Laktatdehydrogenase (LDH)- Werte, eine Eosinophilie, eine erhöhte

Blutsenkungsgeschwindigkeit oder auch eine polyklonale Hypergammaglobulinämie

(106). Eine Beteiligung des Knochenmarks (in bis zu 70% der Patienten vorhanden)

signalisiert eine höhere Tumorzelllast und korreliert mit einer höheren Inzidenz von B-

Symptomen, Hepatosplenomegalie und zirkulierenden Tumorzellen (29).

In über 80% der Fälle wird die Diagnose erst in einem fortgeschrittenen Stadium (Ann

Arbor Stadien III oder IV) gestellt (36, 43).

Die Prognose des AITL ist insgesamt schlecht, die mittlere Überlebenszeit beträgt nur

etwa 3 Jahre, unabhängig von der Therapie (106). Jedoch verläuft die Erkrankung

nicht immer frühzeitig letal, was eine 5-Jahres-Überlebenszeit von 33% belegt (108).

Die meisten Patienten sterben nicht aufgrund der Tumorlast, sondern an infektiösen

Komplikationen bei fortgeschrittener Immundefizienz (39).

Der Internationale Prognose Index (IPI) und der Prognose Index für PTCL (PIT) haben

sich für das AITL als nur eingeschränkt aussagekräftig erwiesen (106).

Anders jedoch der 2013 von Federico et al. vorgeschlagene, vereinfachte „prognosis in

AITL“ - Index (PIAI), der 5 Faktoren berücksichtigt: Alter > 60 Jahre, Performance

status (als Messwert der Lebensqualität) > 2, Befall extranodaler Organe > 1,

Vorhandensein von B-Symptomen und Thrombozytenwerte < 150 000/µl. Im Rahmen

des „International Peripheral T-Cell Lymphoma Projects“ konnten so anhand von 243

Fällen eine low-risk-Gruppe (0-1 Faktor erfüllt) mit einer 5-Jahresüberlebenszeit von

44% und eine high-risk-Gruppe (2 – 5 Faktoren erfüllt) mit einer 5-Jahres-

überlebensrate von 24% unterschieden werden (43).

In einer multivarianten Analyse von 157 AITL-Fällen, behandelt nach den Protokollen

der Groupe d’Etude des Lymphomes de l’Adulte (GELA), konnten nur männliches

6

Geschlecht, mediastinale Lymphadenopathie und Anämie als nachteilig in Bezug auf

das Gesamtüberleben nachgewiesen werden (108).

Xu et al., die eine große Populations-basierte Studie unter Verwendung der

„Surveillence, Epidemiology und End-Results (SEER)“-Datenbank durchführten,

konnten anhand von 1207 Patienten unter anderem die 5-Jahresüberlebensrate von

33% bestätigen. In multivarianter Analyse identifizierten sie Alter > 70 Jahre,

männliches Geschlecht und forgeschrittenes Krankheitsstadium als negative prädiktive

Faktoren für Gesamtüberleben und Erkrankungsspezifisches Überleben. Außerdem

konnte gezeigt werden, dass in den letzten 20 Jahren keine Verbesserung des

Überlebens von Patienten mit AITL erzielt werden konnte (165).

Die Primärlokalisation des AITL ist der Lymphknoten, zusätzlich können auch Milz,

Leber, Haut und Knochenmark betroffen sein (39).

Histologische Charakteristika des AITL

Charakteristischerweise ist die Lymphknotenarchitektur ganz oder teilweise durch ein

diffuses polymorphes Infiltrat zerstört, das sich in erster Linie interfollikulär ausbreitet

(39). Gewöhnlich sind die peripheren kortikalen Sinus erhalten, aber eine Infiltration in

das perinodale Gewebe kommt vor (39). Die neoplastischen Zellen sind mittelgroß und

weisen reichlich helles Zytoplasma, distinkte Zellmembranen und zytologische Atypien

auf (149). Oft formen sie kleine Gruppen um Follikel und hochendotheliale Venolen.

Untermischt sind reichlich kleine Lymphozyten, Histiozyten oder epitheloide Zellen,

Immunoblasten, Eosinophile und Plasmazellen (35).

Zwei weitere typische Befunde sind eine prominente Neovaskularisation, hervorgerufen

durch eine deutliche Proliferation hochendothelialer Venolen sowie perivaskulär

proliferierte follikuläre dendritische Zellen (FDCs) (35, 106).

Desweiteren kommen in über 95% der Patienten vermehrt Epstein-Barr-Virus (EBV-)

positive aber auch -negative B-Zellen vor, die teilweise ein Immunoblasten-ähnliches

Aussehen zeigen, teilweise aber auch Reed-Sternberg-Zellen imitieren (39, 111). Der

B-Zell Reichtum, der nicht das klinische Outcome zu beeinflussen scheint, korreliert mit

dem Nachweis der B-Zell-Klonalität (49, 51). In bis zu einem Drittel der Fälle kommen

klonale und oligoklonale B-Zell-Expansionen vor (35). Ein Teil der Patienten entwickelt

hieraus ein zumeist EBV-positives diffuses großzelliges B-Zell Lymphom (51).

In der Praxis kann durch den B-Zell-Reichtum die Abgrenzung des AITL zum

klassischen Hodgkin-Lymphom oder T-Zell- und Histiozyten-reichen großzelligen B-

Zell-Lymphom schwer fallen.

7

Es wurden drei sich überlagernde histomorphologische Muster des angio-

immunoblastischen T-Zell Lymphoms beschrieben (8, 39):

Muster 1 (20% der Patienten) mit weitestgehend erhaltener Lymphknotenarchitektur:

Man sieht hyperplastische, verwaschene B-Zell-Follikel und einen expandierten

Paracortex mit einem polymorphen Infiltrat und einem prominentem Gefäßnetz.

Muster 2 (30% der Patienten) ist charakterisiert durch einen Verlust der normalen

Architektur: Vereinzelt depletierte B-Zell-Follikel mit konzentrisch angeordneten,

teilweise auch gering expandierten FDC-Netzwerken kommen vor. Der übrige Lymph-

knoten wird von einem polymorphen Infiltrat mit steigender Anzahl lymphoider Blasten

eingenommen. Die Gefäßproliferation ist prominent.

Muster 3 (50% der Patienten) mit vollständig zerstörter Lymphknotenarchitektur:

B-Zell-Follikel sind verschwunden, FDC-Netzwerke und Gefäße sind unregelmäßig

proliferiert und ein polymorphes Infiltrat aus verschiedenen Zelltypen herrscht vor.

Diese Muster sind assoziiert mit einer ansteigenden Anzahl neoplastischer Zellen und

man geht davon aus, dass sie fortschreitende Stadien der Erkrankung darstellen (35).

Tan et al. konnten hierzu in einer Meta-Analyse aus eigenen Fällen und von Attygalle

bereits beschriebenen (insgesamt 56) Fällen zeigen, dass Muster 1 tatsächlich einen

Überlebensvorteil im Gegensatz zu Muster 2 und 3 zeigt (152).

Das neoplastische T-Zell-Infiltrat wird oft durch den reaktiven Hintergrund maskiert,

und macht mit 5 bis 30% häufig nur einen Bruchteil des gesamten Zellbildes aus (35,

106, 163, 179). Dominante klonale T-Zellen, von denen man annimmt, dass sie die

neoplastische Population darstellen, sind in 70% der angioimmunoblastischen T-Zell

Lymphome mit konventionellen molekularbiologischen Techniken detektierbar (23).

Jedoch können teilweise simultan auch expandierende B-Zell Klone nachgewiesen

werden (23).

Molekulare Pathogenese

Als normales Pendant der neoplastischen T-Zellen in angioimmunoblastischen T-Zell-

Lymphomen wurden anhand von Gen-Expressionsanalysen follikuläre T-Helfer-(Tfh-)

Zellen postuliert (37, 123). Diese sind eine seltene Untergruppe der alpha-beta T-

Helfer-Zellen. Sie sind hauptsächlich in Keimzentren lokalisiert und interagieren mit

den Keimzentrums-B-Zellen, um das Überleben der B-Zellen, den Immunglobulin

Klassen-Wechsel und die somatische Hypermutation zu fördern und um schließlich

Plasmazellen und Memory-B-Zellen zu weichen (51). Die Tfh-Differenzierung ist ab-

hängig von dem Transkriptionsfaktor bcl6.

8

Die Funktion der Tfh-Zellen korreliert mit ihrem spezifischen Sekretionsprofil

(Expression von IL-2 und CXCL13 = Chemokin, entscheidend für B-Zell-Rekrutierung

und B-Zell-Aktivierung), dem spezifischen Immunphänotyp (Expression von CXCR5=

Rezeptor für CXCL13, notwendig für die Lokalisation der Tfh-Zellen im Keimzentrum)

und Ko-stimulierenden Molekülen wie ICOS, PD1, CD28 und CD40L, die die Tfh-B-

Zell-Interaktion fördern (51).

AITL ist der Prototyp der sich von Tfh-Zellen-ableitenden Neoplasien (37, 66).

Die Herkunft des AITL von Tfh-Zellen erklärt viele der pathobiologischen Eigenschaften

des Lymphoms, z.B. die Expansion der B-Zellen, die Proliferation der FDCs und die

Autoimmun-Effekte (51). Hier gilt CXCL13 als möglicher Mediator mit Schlüsselfunktion

(49). Zusätzlich können normale Tfh-Zellen T-Zell Antworten supprimieren und man

nimmt an, dass die neoplastische T-Zell Population so zu der defekten T-Zell Antwort

in AITL beiträgt (51).

Dass eines der häufigsten T-Zell Lymphome sich von einer der seltensten T-Zell

Subgruppen ableitet, ist bemerkenswert (37, 124) . Es lässt ein erhöhtes Risiko der

Tfh-Zellen für eine maligne Transformation annehmen (124). Anderseits wird die enge

Interaktion mit B-Lymphozyten und FDCs diskutiert und es ist vorstellbar, dass unter

physiologischen Bedingungen der neoplastische Klon von diesen Zellgruppen und dem

entstehenden Mikromilieu Unterstützung erhält (124).

Die neoplastische Transformation der Tfh-Zellen ist bisher nicht verstanden.

In zytogenetischen Analysen wurden verschiedene klonale Aberrationen gefunden –

darunter in bis zu 90% der Fälle Trisomien der Chromosomen 3, 5 und 21, Hinzu-

gewinn von Chromosom X und Verlust von 6q (149). Neuere Studien zeigten in etwa

50%, 30-40% bzw. 10% der jeweils untersuchten AITL-Fälle wiederkehrende

Punktmutationen in den Genen TET2, IDH2 und DNMT3A, die für Enzyme – verant-

wortlich für DNA-Methylierung und epigenetische Transkriptionskontrolle - kodieren.

TET2-Mutationen sind mit einem fortgeschrittenerem Krankheitsstadium, einem hohen

Internationalen Prognostischen Index (IPI) – Wert und einem kürzeren progressions-

freien Überleben assoziiert (21, 30, 85).

Odejide et al. untersuchten mittels next-generation sequencing über 200 Gene, in

denen Mutationen für hematologische Neoplasien bekannt sind. Hierbei zeigte sich,

dass die Gesamtheit der häufigen Genmutationen in AITL eher der myeloider

Neoplasien als der anderer Lymphome ähnelt (113).

Gen-Expressionsanalysen, deren Ergebnisse von Iqbal et al. 2010 veröffentlicht

wurden, haben gezeigt, dass die Gen-Signatur von Tfh-Zellen in AITL signifikant

angereichert ist (66). So konnte neben der Überexpression von Schlüsselgenen der

9

neoplastischen T-Zellen, CTLA4 und ICOS, auch die normaler Tfh-Zellen, CXCL13 und

CXCR5, in AITL nachgewiesen werden (66). Allerdings fanden sich nach molekularen

Klassifikationskriterien zudem auch drei weitere prominente Signaturen in AITL: Die

von B-Zellen und follikulären dendritischen Zellen, die in der Umgebung der

neoplastischen T-Zellen angereichert sind, sowie von Zytokinen, die teilweise von der

stromalen Komponente des Mikromilieus im AITL abhängig sind (66). So ließ sich zum

Beispiel eine höhere Expression von Genen nachweisen, die mit germinalen B-Zellen

assoziiert sind, von denen man – wie bei CD10 und bcl6 - jedoch auch weiß, dass sie

von den neoplastischen T-Zellen exprimiert werden können. Mittels Gene Set

Enrichment Analysis (GSEA) konnte zudem eine signifikante Anreicherung von

Molekülen gezeigt werden, die bestimmten Signalwegen zugeordnet werden können:

Zum Beispiel dem NFkappaB-Signalweg: AITL-Fälle zeigten im Vergleich zu nicht

spezifizierten PTCL eine Aktivierung dieser Signalkaskade; zweitens immun-

suppressiven Wirkungspfaden: insbesondere Gensignaturen, assoziiert mit dem TGF-

beta-Signalweg zeigten sich angereichert; drittens der IL-6- Signalwirkung: Interleukin

6 erfüllt diverse Funktionen und ist unter anderem in die Proliferation von Tfh-Zellen

sowie von EBV-infizierten B-Zellen involviert.

In weiterführenden Studien stellten Iqbal et al. 2014 für AITL insbesondere die Gene

der Signatur heraus, die Assoziationen mit Angiogenese und vaskulärer Endothel-

funktion sowie Zellmigration zeigten (67).

Insbesondere VEGF scheint hier involviert zu sein (124, 126). So konnte gezeigt

werden, dass VEGF nicht nur von bystander-Zellen, sondern auch von den

neoplastischen Zellen in AITL produziert wird (124). Zusätzlich konnten Piccaluga et al.

demonstrieren, dass AITL-Zellen den Rezeptor VEGFR1/KDR exprimieren. Dies führte

zu der Hypothese, dass die VEGF-Produktion nicht nur die Angiogenese sondern auch

das Tumorwachstum über einen autokrinen/parakrinen Loop stimulieren kann und dass

AITL möglicherweise sensitiv für die anti-angiogenetischen Medikamente Thalidomid

und Bevicizumab sein könnten (124, 126, 131).

Die Dichte der Mikrogefäße in Lymphknoten von Patienten mit AITL stellt außerdem

einen negativen prädiktiven Faktor im Hinblick auf progressionsfreies und Gesamt-

Überleben dar (176).

Zusammengefasst spiegeln die molekularen Klassifikationskriterien und die Signalweg-

Signaturen von vielen peripheren T-Zell Lymphomen das Mikromilieu der jeweiligen

Lymphom-Subgruppe wider (50, 67). Dies wurde herausragend an AITL demonstriert

(67). Gleichzeitig konnte auch gezeigt werden, dass insbesondere das Zytokin-Milieu in

10

AITL mit seinem enormen Repertoire aus Chemokinen und Rezeptoren ein komplexes

immunologisches Netzwerk darstellt (67). Außerdem weisen die Studien von Iqbal et al.

stark darauf hin, dass das Mikromilieu signifikant mit der Prognose in AITL verknüpft ist

(67).

Im Vergleich zu B-Zell Lymphomen ist das immunphänotypische Profil von T-Zell

Lymphomen im Hinblick auf die Subklassifizierung sehr viel weniger spezifisch und

hilfreich (148). Nichtsdestotrotz können in Konkordanz mit dem Genexpressionsprofil

des AITL einige Marker in der immunhistochemischen Diagnostik zur Identifizierung

der neoplastischen T-Zell-Population und weiterer Charakteristika im Lymphknoten-

gewebe genutzt werden.

So exprimieren die neoplastischen T-Zellen in AITL typischerweise die Pan-T-Zell-

Antigene CD3, CD4 und CD5 (149). Ein abbaranter Verlust oder eine verminderte

Expression von einzelnen T-Zell-Antigenen können vorkommen (36, 49).

Wie beschrieben, wurde das AITL als eine Neoplasie der follikulären T-Helfer Zellen

erkannt. Dementsprechend können die neoplastischen T-Zellen im AITL immun-

phänotypische Eigenschaften normaler Tfh-Zellen aufweisen: In über 90% der Fälle

exprimieren sie CXCL-13, ein Chemokin, das den B-Zellen den Eintritt in die

Lymphfollikel ermöglicht, und programmed cell- death (PD-1), ein Mitglied der CD28

Rezeptor Familie, das die zelluläre Immunanwort reguliert (77, 171). Desweiteren

konnten Attygalle et al. und Ree et al. zeigen, dass zwei Marker von Keimzentrums-B-

Zellen, CD10 und bcl6, ebenfalls von der Mehrheit der neoplastischen T-Zellen

exprimiert werden (8, 133). Das induzierbare T-Zell ko-stimulierende Molekül (ICOS)

und das Adapter-Molekül SLAM-associated protein (SAP) wurden ebenfalls als

nützliche Marker zur Identifizierung der neoplastischen T-Zellen in T-Zell Lymphomen,

die sich von Tfh-Zellen ableiten, erfolgreich herangezogen (49, 102).

Besonders hilfreich im Hinblick auf die Diagnosestellung AITL ist zudem die immun-

histochemische Darstellung der follikulären dendritischen Zell- (FDC) Netzwerke mit

den Primärantikörpern gegen CD21 und CD23 um die charakteristische Expansion

sichtbar zu machen (22).

Ein standardisiertes Therapie-Regime wurde bislang für Patienten mit AITL nicht

etabliert (165). Momentan wird eine Anthrazyklin-basierte Chemotherapie als

Erstlinien-Therapie betrachtet (106). Durch die intensive Chemotherapie werden in 50-

70% der Patienten zunächst komplette Remissionen erzielt, jedoch hält der Effekt

meist nur kurzzeitig an und die Mehrzahl der Patienten erleidet im Verlauf ein Rezidiv

(106, 131).

11

In Bezug auf das Gesamtüberleben konnte weder ein Unterschied zwischen

verschiedenen Anthrazyklin-basierten Regimes (ACVBP, CHOP, mBACOD) noch

zwischen Anthrazyklin-basierter und nicht-anthrazyklin-basierter Chemotherapie belegt

werden (108, 159).

Insgesamt bleibt die Entwicklung molekular basierter therapeutischer Strategien für T-

Zell-Lymphome insbesondere im Vergleich zu denen für B-Zell-Lymphome insuffizient

(62), dennoch wurden einige Medikamente experimentell mit Erfolg getestet:

Thalidomid zum Beispiel ist ein immunmodulatives Agens, das den Tumor Nekrose

Faktor (TNF), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), IL-6 und

NFkappaB inhibiert. Es wurde erfolgreich eingesetzt und konnte klinisch und radio-

logisch messbare Remissionen der Erkrankung erzielen (106). Basierend auf diesen

Erkenntnissen wurde eine zurzeit (Mai 2014) laufende Studie zu einer Kombinations-

therapie aus CHOP und Lenalidomid initiiert (NCT01553786).

Nachdem eine Phase II-Studie gezeigt hat, dass 16% der refraktär an AITL erkrankten

Patienten auf eine Therapie mit Romedepsin, einem Histon-Deazetylase-Inhibitor,

ansprechen (125), wird zurzeit in einer Phase III-Studie die Langzeiteffizienz dieser

Therapiefom untersucht (NCT0196002). Vielversprechende Ergebisse konnten durch

eine Phase-II-Studie unter Einschluss von 25 AITL-Patienten mit gutem Performance-

Status mit der Kombination aus Rituximab und CHOP erzielt werden. Rituximab ist ein

monoklonaler CD20-Antikörper, der sich gegen die B-Zellen im Microenvironment der

Lymphomzellen richtet. Die Remissionsrate (ORR) lag insgesamt bei 80%, jedoch

zeigte sich kein Einfluss auf das Gesamtüberleben der Patienten (38).

Weitere experimentelle Studien unter anderem mit Alemtuzumab (CD52-Antikörper),

Pralatrexat (Antifolat) Bevacizumab (VEGF-Antikörper) und Bortezomib (Proteasom-

inhibitor) wurden durchgeführt und lassen teilweise ein gutes Ansprechen erkennen

(48, 95). Jedoch ist die Biologie des Angioimmunoblastischen T-Zell Lymphoms nicht

ausreichend gut verstanden und es fehlen größere Studien sowie Langzeit-

beobachtungen um eine Signifikanz dieser Ergebnisse abzusehen.

12

1.1.2. microRNA

1.1.2.1. microRNA-Physiologie

MicroRNAs sind eine Klasse kleiner, endogen exprimierter, nicht proteincodierender

RNAs (173), die die Genexpression, insbesondere durch posttranskriptionelles Gene-

Silencing, regulieren können.

MicroRNAs und ihre assoziierten Proteine gehören zu den häufigeren Ribonukleo-

proteinkomplexen in einer Zelle (9) und ihr Einfluss ist allgegenwärtig (88).

Nichtsdestotrotz wurde man erst in den neunziger Jahren durch Erforschung der

Entwicklungsbiologie des Wurms Caenorhabditis elegans auf sie aufmerksam (80, 82,

83). MicroRNAs sind, anders als siRNAs, durch genomische DNA codiert. Bisher geht

man davon aus, dass etwa 1 bis 4 % des humanen Genoms für microRNA codieren (9,

10, 88) und dass etwa 60% der mRNA in Säugetieren durch sie reguliert werden (88).

Inzwischen sind in der Online-Datenbank „miRbase“ (http://www.mirbase.org/, v21,

Juni 2014) 35828 reife microRNA, identifiziert in 223 Spezies, zusammengetragen

worden (76), von denen 1872 im humanen Genom lokalisiert sind. Es wurden bislang

mehr als 4500 reife microRNAs im menschlichen Organismus gefunden (62).

Reife microRNAs sind einzelsträngig und bestehen aus etwa 22 Nukleotiden (~22 nt)

(9). Sie sind dadurch charakterisiert, dass ihre Vorstufen kurze Haarnadel-Strukturen

ausbilden und spezifische Reifungsprozesse durchlaufen, die definierten kanonischen

und nicht-kanonischen biogenetischen Wegen folgen (24, 169). Die Biogenese der

tierischen microRNAs verläuft mehrschrittig auf dem sogenannten kanonischen Weg:

Ein microRNA-Gen wird meist durch die Polymerase II transkribiert (10). Es resultiert

ein bis mehrere hundert Nukleotide langes, schlaufenförmiges Primärtranskript

(Primary MicroRNA, pri-miRNA), das noch im Zellkern durch einen Komplex aus einem

RNAse III-ähnlichen Enzym (Drosha) und DGCR8 (DiGeorge Critical Region Gene 8)

in eine 70 bis 100 Nukleotide lange Precursor-microRNA (pre-miRNA) gespalten wird.

Diese weist eine Haarnadel (Hairpin)-Struktur auf und gelangt via Exportin 5 in das

Zytoplasma.

Nach dem Modell von Maniataki et al. nimmt im menschlichen Organismus ein

Enzymkomplex, der unter anderem aus einer weiteren RNAse III, genannt Dicer, und

einem Argonaut 2 (Ago2) –Protein besteht, die pre-miRNA auf (100) . Dicer spaltet die

pre-miRNA in eine 19 bis 22 Nukleotide lange doppelsträngige microRNA (9, 24).

Offenbar simultan kommt es ATP-unabhängig zur Entwindung und Singularisierung

des microRNA-Duplexes (100). Es entstehen zwei Einzelstränge, ein 3´- Strang und

13

ein 5´-Strang, von denen meist nur einer als reife microRNA biologisch aktiv bleibt (61)

und auf das Ago2-Protein geladen wird (100). Nach Erkenntnissen von Maniataki et al.

dissoziiert Dicer von dem Enzymkomplex und das entstehende microRibonukleoprotein

(miRNP) führt zur Formung eines RNA-induced silencing-Komplexes (RISC) aus reifer

microRNA und Proteinen der Argonaut-Familie als Kernstrukturen (100).

Über komplementäre Basenpaarung kann die im RISC inkorporierte microRNA an die

3’untranslatierte Region (3´UTR) einer mRNA binden und in Abhängigkeit vom Grad

ihrer Komplementarität entweder eine Repression der Translation oder aber die

Zerschneidung dieser Ziel-mRNA bewirken (9). In Tieren reicht die Komplementarität

zu einer kurzen Sequenz aus etwa 7 Nukleotiden der microRNA (sogenannte seed-

region, meist Nukleotide 2-7) aus, um die produktive Translation der daran bindenden

mRNA erfolgreich zu unterdrücken (10). Das Phänomen der Zerschneidung der Ziel-

mRNA kommt im tierischen Organismus selten vor und setzt die perfekte (vollständige)

Komplementarität von miRNA und mRNA voraus (88). Rechnerisch und experimentell

kann eine einzige microRNA potentiell tausende mRNA-Moleküle als Zielstrukturen

erkennen (116). Ebenso kann eine Ziel-mRNA durch mehrere verschiedene

microRNAs reguliert werden (89).

Experimente unter anderem von Leung et al. haben gezeigt, dass die Proteine der

Argonaut-Familie sich zumeist in sogenannten „processing-bodies“, kurz P-bodies,

innerhalb des Zytoplasmas einer eukaryoten Zelle anreichern. In diesen um-

schriebenen Protein-Aggregaten wird die unterdrückte mRNA fest- und von der

Translationsmaschinerie ferngehalten sowie der RNA-Abbau vermittelt (88).

14

Abbildung 1 Biosynthese und Wirkungsweise von micro RNAs

kanonischer Weg, modifiziert nach (65)

Kürzlich wurden eine Reihe weiterer alternativer Mechanismen der microRNA-

Synthese, sogenannte nicht-kanonische Wege, beschrieben, die sowohl DROSHA- als

auch DICER-unabhängig sein können (u.a. zusammengefasst in (24) und (169)).

Grundsätzlich darf nicht vergessen werden, dass microRNAs nur Transkripte be-

einflussen können, die in einem bestimmten entwicklungsbiologischen oder patho-

logischen Kontext induziert wurden; sie können nicht a priori die Genexpression

herbeiführen (116). Dies legt nahe, dass die Zielstrukturen der microRNA

höchstwahrscheinlich gewebsspezifisch sind und dass Ergebnisse von microRNA-

Expressionsstudien unter Einbeziehung des Ursprungsgewebes interpretiert werden

müssen (116).

DNA

Pol II

Pri -miR

Pre-miR

Pre-miR miR:miR* - Duplex Dicer

Helicase

RISC

miR

miR

mRNA

DGCR8 Drosha

miR*

15

Abkürzung (Beispiel) Erklärung

Pri-miR Primary microRNA

Pre-miR Precursor microRNA

miR-1 Mature, einsträngige Form

miR-1* Komplementärer Strang, der degradiert

wird

miR-17-5p 5’-Arm Beide Stränge stellen die mature Form

dar, keiner wird bevorzugt degradiert miR-17-3p 3’-Arm

miR-20a (13q31.3) Paraloge mit 1-2 Basen

Sequenzunterschieden miR-20b (Xq26.2)

Hsa-miR-1 Homo

sapiens

microRNA mit gleicher Nummer können

unterschiedliche Sequenzen in

verschiedenen Spezies haben Mmu-MiR-1 Mus

musculus

Tabelle 2 Nomenklatur der microRNAs

Modifiziert nach (61)

1.1.2.2. microRNA-Dysregulation

Das Interesse dysregulierte microRNA-Profile in Erkrankungen, insbesondere Krebs,

zu identifizieren, ist groß (116). Eine abnormale microRNA-Expression wurde für viele

Tumorentitäten, einschließlich maligner Lymphome, beschrieben (einen Überblick gibt

hierzu (173), bezüglich Lymphome (41, 62, 151)). Für T-Zell-Lymphome/Leukämien

haben Ikeda und Tagawa die neuesten Erkenntnisse bezüglich microRNAs kürzlich

zusammengefasst und veröffentlicht (vgl. hierzu (62)). Angioimmunoblastische T-Zell-

Lymphome wurden darin nicht berücksichtigt. Auch gibt es nur wenige Tumore, für die

ein direkter kausaler Zusammenhang zwischen microRNA-Dysregulation und

Tumorentwicklung festgestellt werden konnte (116).

Diejenigen microRNAs, deren Expression in Tumoren erhöht ist, werden als mögliche

Onkogene betrachtet und „oncomirs“ genannt (173). Ein prominentes Beispiel ist miR-

155, die in verschiedenen B-Zell-Lymphomen überexprimiert wird (139). MicroRNAs,

deren Expression in Krebszellen vermindert ist, gelten als mögliche Tumorsuppressor-

microRNAs. So zum Beispiel die miR-34-Familie, die ein Zielgen von p53 darstellt und

in zahlreichen Geweben bei Überexpression direkt oder indirekt verschiedene

Onkogene hemmen und den Zelltod eines Tumors begünstigen sowie die

16

Metastasierung verhindern kann (4). Konsequenterweise ist ein miR-34-Analogon die

erste microRNA, die die erste Phase einer klinischen Studie erreicht hat (4).

Außerdem können microRNA-Profile bei der Subklassifizierung von Lymphomen

hilfreich sein. Im Hinblick auf B-Zell-Lymphome konnten Roehle et al. vier microRNAs

identifizieren, die mit einer Genauigkeit von 98% zwischen diffusem großzelligem B-

Zell-Lymphom und follikulärem Lymphom sowie reaktivem Lymphknoten unterscheiden

können (134). Bezüglich T-Zell-Lymphomen konnten zum Beispiel Liu et al. eine

Signatur aus 11 microRNAs ermitteln, die ALK-negative großzellige anaplastische

Lymphome (ALCL) von anderen nodalen PTCL differenziert.

17

1.2. Fragestellung

Ziel der vorliegenden explorativ angelegten Arbeit ist es, das äußerst seltene

angioimmunoblastische T-Zell-Lymphom anhand von 30 Fällen auf morphologischer,

immunhistochemischer und molekularer Ebene näher zu charakterisieren. Der

Schwerpunkt der Arbeit liegt hierbei auf der erstmaligen Erstellung eines microRNA-

Profils der Erkrankung und dessen Vergleich mit dem des nicht-neoplastischen

Kontraparts, Lymphadenitis mit T-Zonen-Hyperplasie. Aufgrund ihrer histologischen

und immunphänotypischen Überschneidungen (77), erscheinen die derartig reaktiv

veränderten Lymphknoten im Hinblick auf Gewebsspezifität, Zellzusammensetzung

und nicht zuletzt aufgrund ihrer Verfügbarkeit als Vergleichskollektiv sehr gut geeignet.

Desweiteren soll die sinnvolle Ergänzung des immunhistochemischen Marker-Panels

für die Routinediagnostik angioimmunoblastischer T-Zell-Lymphome durch Antikörper

gegen Stathmin und LMO2, ein bekanntes Oncoprotein und einen Transkriptionsfaktor,

geprüft werden.

Außerdem geht es um die Erfassung und isolierte Betrachtung bekannter morpho-

logischer Charakteristika als Ausdruck des Mikromilieus in angioimmunoblastischen T-

Zell-Lymphomen, deren Zuordnung zu bereits etablierten histomorphologischen

Mustern und ihren Einfluss auf molekulare Befunde.

Weiter entfernte Ziele sind natürlich, zum Verständnis der Pathophysiologie des

Lymphoms beizutragen und mögliche Biomarker zu identifizieren, um so die

Entwicklung molekular basierter Therapie-Strategien zu fördern und die seit 20 Jahren

stagnierend schlechte Prognose des AITL zu verbessern.

18

2. Material und Methoden

2.1. Material

Die verwendeten Gerätetypen, Verbrauchsmaterialien, Reagenzien und Chemikalien

sowie eine Auflistung der Kits, Antikörper, Primer, Software und in silico Resourcen

finden sich in übersichtlicher, alphabetisch geordneter, tabellarischer Form im Anhang

(Tabellen 11-17).

2.2. Methoden

2.2.1. Studiengruppe Die Studie basiert auf dem Vergleich von zwei Patientenkollektiven. Dreißig Fälle

angioimmunoblastischer T-Zell Lymphome (malignes Lymphom) wurden einer Kontroll-

gruppe von zehn Lymphadenitiden mit T-Zonen-Hyperplasie (benigne entzündliche

Veränderungen), dem vermuteten nicht-neoplastischen Kontrapart, gegenübergestellt.

Pro Patient wurde jeweils eine Einsendung berücksichtigt und rekrutiert. Alle ein-

gesetzten Proben entstammen dem Untersuchungsgut des Referenzzentrums für

Lymphomdiagnostik am Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Schleswig-

Holstein, Direktor Prof. Dr. med. A.C. Feller, aus den Jahren 2010 bis 2012.

Mithilfe der NEXUS Datenbank wurden unter Eingabe der Suchbegriffe „9705/3“ (ICD-

O Code für das AITL) bzw. „Lymphadenitis [AND] T-Zonen-Dysplasie“ entsprechende

Fälle ermittelt. Die initialen Diagnosen wurden von langjährig erfahrenen Fachärzten

für Pathologie des Instituts gestellt. Das jeweilige Schnitt- und Blockmaterial wurde aus

den Archiven des Instituts extrahiert und anhand der routinemäßigen diagnostischen

Schnittpräparate reevaluiert. Die Diagnosen wurden im Kontext der aktuellen WHO

Klassifikation (2008) von drei Untersuchern (Prof. Dr. med. A.C. Feller, Prof. Dr. med.

Ch. Thorns, K.Reddemann) im Konsensusverfahren validiert. Es folgte die Auswahl

von dreißig Fällen angioimmunoblastischer T-Zell-Lymphome und zehn Lymph-

adenitiden, die hinsichtlich der histomorphologischen Charakteristika der jeweiligen

Erkrankung die höchste Repräsentanz zeigten.

2.2.2. Patientenproben

Alle Proben waren humane, formalinfixierte, paraffineingebettete Lymphknoten, die

verschiedenen Lokalisationen (zervikal, axillär, inguinal, nuchal, thorakal, abdominell)

entstammten. Beiden Gruppen gemeinsam war die Voraussetzung eines genügend

19

großen und ausreichend beurteilbaren Lymphknotenanteils, frei von Manifestationen

anderer morphologisch fassbarer Erkrankungen. Alle Proben samt zugehöriger Daten

wurden nach der Rekrutierung für die Studie einer umgehenden Anonymisierung im

Sinne des genehmigten Ethikantrages der Ethikkommission der Universität zu Lübeck

unterzogen (Aktenzeichen: 13-179A).

2.2.3. Histopathologische Methoden

2.2.3.1. Herstellung des Tissue Microarrays Ein Tissue Microarray (TMA) ist ein Paraffinblock, in den mehrere ausgestanzte

Gewebszylinder unterschiedlicher Herkunft eingebracht wurden. So war es möglich

diese verschiedenen Proben gleichzeitig unter gleichen Bedingungen mittels immun-

histochemischer Verfahren oder in-situ-Hybridisierung zu analysieren.

Zunächst wurden die hinsichtlich ihrer Repräsentanz, Dicke und Gewebs-

beschaffenheit am besten geeigneten Gewebe-Paraffinblöcke der 40 oben

beschriebenen Lymphknotenproben ausgewählt. Um einen Überblick über die aktuelle

Zellzusammensetzung in den ausgewählten Blöcken zu erhalten, wurden davon

Hämatoxylin-Eosin-gefärbte Schnittpräparate hergestellt, von zwei Untersuchern

begutachtet und ein repräsentatives Gewebsareal für die Positionierung der

Stanzzylinderentnahme ausgewählt (Prof. Dr. med. Ch. Thorns, K.Reddemann).

Die Herstellung des TMAs erfolgte mit dem Tissue-Tek® Tissue Microarray System

(Sakura Finetek, USA) nach Angaben des Herstellers.

Aufgrund der Heterogenität des untersuchten Gewebes wurde der Durchmesser der

Gewebsstanzen mit jeweils 2 mm relativ groß gewählt. Zur Orientierung auf dem

späteren Schnittpräparat wurde das TMA in Subarrays unterteilt und eine

asymmetrische Anordnung der Proben gewählt:

20

Abbildung 2 Anordnung der Gewebsstanzen im tissue m icroarray

(1-30 Lymphom-Fälle, K1-K10 Fälle der Referenzgruppe)

2.2.3.2. Herstellung von Paraffin-Schnittpräparaten

Zur Anfertigung von Paraffinschnitten der Gewebsblöckchen wurde ein Rotations-

mikrotom der Firma Leica verwendet. Die Schnittdicke betrug 1,5 Mikrometer.

2.2.3.3. Histochemische Färbungen von formalinfixie rten, paraffineingebetteten Gewebsschnitten

Histochemische Färbungen zählen zu den klassischen Techniken der Histologie und

sind die Basis der morphologischen Diagnostik. Verschiedene Gewebs- und

Zellkomponenten werden durch sie sichtbar und unterscheidbar. Sie basieren auf

physikalischen Prozessen, wie der Diffusion oder Elektroadsorption, und chemischen

Reaktionen, wie der Ionenbindung. Aufgrund der Interaktion zwischen

Gewebebestandteil und eingesetztem Reagenz entsteht ein Farbstoff.

Das unterschiedliche Färbeverhalten verschiedener Gewebskomponenten ergänzt so

das histologische Erscheinungsbild.

Folgende histochemische Färbungen wurden in der vorliegenden Arbeit berücksichtigt:

Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung, die Perjod-Säure-Schiff-Reaktion, die Giemsa-

Färbung und die Versilberung nach Gomori.

Die Färbungen wurden entweder manuell oder automatisch (ST 5020, Leica) nach

akkreditiertem Standard des Qualitätsmanagements des Instituts für Pathologie, UKSH

Lübeck, durchgeführt.

Vor den Färbungen wurden die Schnitte in Xylol entparaffiniert und durch die

absteigende Alkoholreihe wieder in ein wässriges Milieu überführt.

21

Nach den Färbungen wurden die Schnitte, je nach Färbung, direkt luftgetrocknet oder

durch die aufsteigende Alkoholreihe bis ins Xylol gebracht und dann eingedeckt.

Färbung Zellkerne Zyto -

plasma

Bindegewebsfasern Anmerkung

Häma-

toxylin-

Eosin

(HE)

Blau Blassrot Kollagene: rot,

elastische: blassrosa

Übersichtsfärbung

Perjod-

Säure-

Schiff

(PAS)

Blau-violett Rosa Pink bis magenta-rot Standardfärbung

für kohlenhydrat-

haltige Gewebs-

komponenten

Giemsa Dunkelblau Hell-blau Hellrot bis rot-orange

Versilber-

ung nach

Gomori

Rot - Elastische: schwarz

Tabelle 3 Histochemische Färbungen

2.2.3.4. Immunhistochemische Färbung von formalinfi xierten, paraffineingebetteten Gewebsschnitten

Immunhistochemische Verfahren basieren auf der Antigen-Antikörper-Reaktion.

Antigene Komponenten (Proteine, Oligopeptide, Polysaccharide, Lipide) in formalin-

fixierten, paraffineingebetteten Gewebsschnitten werden durch Bindung spezifischer

Antikörper und gekoppelter Detektionssysteme mikroskopisch sichtbar gemacht. Durch

Gegenfärbung mit Haematoxylin kann zudem die Zuordnung zu speziellen histo-

morphologischen Strukturen erfolgen.

Die Färbungen der vollständigen Lymphknotenbiopsien erfolgten mithilfe des

automatischen Bond™-Systems unter Verwendung der tabellarisch aufgeführten

Reagenzien und Verbrauchslösungen nach Herstellerangaben (Leica Biosystems).

Die Färbungen der TMA-Paraffinschnitte wurden aufgrund der besonderen

Gewebsbeschaffenheit eines TMAs manuell nach dem Protokoll „Immunhistologie für

Paraffinschnitte – manuell“ (Verfahrensanweisung VA-050, Version 7 vom 23.01.2014)

nach Maßgaben des Qualitätsmanagements des Instituts für Pathologie, UKSH Lübeck,

durchgeführt.

22

In einem ersten Schritt wurden mithilfe geeigneter pH-Lösungen (Novocastra Epitope

Retrieval Solutions, Novocastra) unter Hitzeinduktion in einem Dampfgarer, Dampftopf

oder in der Mikrowelle die Epitope in den Gewebsschnitten freigelegt (Epitop-/Antigen-

demaskierung).

Es folgte die indirekte immunhistochemische Färbung.

Hierbei bindet ein unkonjugierter Primär-Antikörper an das Antigen. Danach wird ein

zweiter Antikörper, der gegen das Fc-Fragment des Primär-Antikörpers (jetzt als

Antigen wirkend) gerichtet ist, aufgetragen. Dieser Sekundärantikörper ist mit einem

Enzym gekoppelt, das im Folgenden den sichtbaren Farbumschlag durch Präzipitation

eines zugesetzen Chromogens katalysiert.

Als Primärantikörper kamen hier monoklonale Maus- und Kaninchenantikörper zur

Anwendung, die gegen folgende Zielstrukturen gerichtet waren: CD3, CD10, CD20,

CD21, CD23, LMO2, PD1 und Stathmin (s. Tab. 3).

Antikörper Hersteller Klon Verdünnung Antigen -

demaskierung

CD3 Lab Vision SP7 1:100 Dampfgarer (pH 9,0)

CD10 Novocastra C56C6 1:30 Dampfgarer (pH 9,0)

CD20 Lab Vision L26 1:500 Dampfgarer (pH 9,0)

CD21 Cellmarque 2G9 1:50 EDTA

CD23 Thermo

Scientific

SP23 1:100 EDTA

LMO2 Cellmarque SP51 1:100 EDTA

PD1 Cellmarque MRQ-22 1:100 EDTA

Stathmin DCS SP49 1:100 Citratpuffer (pH 6,0)

Tabelle 4 Antikörper (mit Verdünnungen und Vorbehan dlungen)

Als Sekundärantikörper wurde ein Ziegenantikörper eingesetzt, der mit einer

Meerrettich-Peroxidase (engl. Horseradish-Peroxidase, abgekürzt HRP) konjugiert ist

(Poly-HRP-Anti-mouse/rabbit/rat IgG, ImmunoLogic). Als Chromogen wurde das

ursprünglich fast farblose Diaminobenzidin (Bright-DAB, ImmunoLogic) zugesetzt,

welches im Beisein von Peroxidase einen Farbumschlag in einen braun-schwarzen

Niederschlag am Ort des Zielantigens zeigt.

Die Aktivität unspezifischer Gewebsperoxidasen wurde in einem Zwischenschritt durch

Inkubation mit 6%iger Wasserstoffperoxidlösung unterdrückt.

23

2.2.4. Molekularbiologische Methoden

2.2.4.1. Nachweis von Epstein-Barr-Virus kodierter RNA (EBER) in formalinfixierten , paraffineingebetteten Gewebsschnitten mittels chromogener In-situ-Hybridisierung

Grundlage dieser Methode ist die Bindung einer synthetischen Oligonukleotidsonde

mittels Basenpaarung (Hybridisierung) an einer nachzuweisenden Nukleinsäure im

Gewebe (in-situ).

Der qualitative Nachweis von Epstein-Barr-Virus kodierter RNA (EBER) wurde hier

mittels einer Fluorescein-konjugierten Oligonukleotidsonde (EBER Probe, Bond ISH

Probe, Leica Biosystems) unter Verwendung des Bond™ Enzyme Pretreatment Kits,

des Bond™ Polymer Refine Detection-Systems und eines Gebrauchsfertigen Bond™

Anti-Fluorescein Antibodys (Leica Biosystems) mit Hilfe des automatischen Bond-

Systems nach Herstellerangaben geführt.

2.2.4.2. RNA-Isolierung aus paraffineingebettetem G ewebe Im Rahmen der RNA-Extraktion wurde das RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation

Kit (Applied Biosystems, P/N 1975M Rev. C) entsprechend den Herstelleranweisungen

verwendet. Es wurden 20 Gewebsschnitte à 5 Mikrometer pro Probe eingesetzt. Die

Proben wurden zuerst mittels Inkubation und Waschung in Xylol und Ethanol

entparaffiniert. Dann erfolgte der Proteaseverdau. Der dritte Schritt war die Isolierung

und Aufreinigung der RNA mittels eines Glasfaser-Filtersystems in einem Mikroliter-

Reagenzgefäß inklusive einer filtergebundenen Nukleasebehandlung.

Die RNA wurde danach bei -80°C gelagert. Die maximale Lagerungsdauer betrug drei

Monate.

2.2.4.3. Quantifizierung von RNA in wässriger Lösung Die Konzentrationsbestimmung der RNA in wässriger Lösung erfolgte über Messung

ihrer Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm unter Verwendung des NanoDrop-

Spektrophotometers.

24

2.2.4.4. Relative Quantifizierung der microRNA-Expr ession mittels RT-qPCR

Die relative Quantifizierung der microRNA-Expression erfolgte unter Anwendung eines

zweistufigen Versuchaufbaus. Zuerst erfolgte die reverse Transkription (RT), dann

wurde die quantitative Real-time PCR (qPCR) angeschlossen.

2.2.4.5. Reverse Transkription (RT) – Polymerase- K etten-Reaktion (RT-PCR)

Im ersten Schritt erfolgte die reverse Transkription, bei der die cDNA unter

Verwendung der jeweiligen Megaplex RT-Primer (microRNA-spezifische stem-loop

Primer), human pool A v2.1 und B v3.0 (Applied Biosystems), dem TaqMan®

MicroRNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems) sowie der zuvor isolierten

RNA synthetisiert wurde. Es wurden stets 350 ng RNA pro Probe verwendet, sodass

auf eine Präamplifizierung verzichtet werden konnte. Alle Reagenzien wurden gemäß

des Megaplex™ Pools Protocol (Applied Biosystems, P/N 4399721 Rev C) eingesetzt.

Die Zusammensetzung des Master Mix lautete wie folgt:

Komponente Volumen

Aqua dest 0,2 µl

10x Puffer 0,8 µl

dNTP mix (100 mM total) 0,2 µl

MgCl2 (25 mM) 0,9 µl

Multiscribe™ RT Enzym (50 U/µl) 1,5 µl

RNase Inhibitor (20 U/µl) 0,1 µl

Tabelle 5 Master Mix für die RT-PCR (Ansatz für ein e Probe)

Dann erfolgte die Zugabe von jeweils 0,8 µl Megaplex RT Primer (entweder Human

pool A v2.1 oder B v3.0) und der zuvor isolierten RNA-Probe (350 ng in 3 µl Aqua dest),

sodass sich ein Gesamtvolumen von 7,5 µl für den Ansatz ergab.

Nach fünfminütiger Inkubation auf Eis folgte die reverse Transkription in einem

Thermocycler (Biometra) unter den nachfolgend genannten Bedingungen (40 Zyklen).

25

Temperatur Zeit Schritt

16°C 2 min. Zyklus (40 Zyklen)

42°C 1 min.

50°C 1 sec.

85°C 5 min. Halten

4°C ∞ Pause

Tabelle 6 Thermocycler Programm (Reverse Transkript ion)

Die so entstandene cDNA wurde bei -20°C verwahrt und innerhalb von sieben Tagen

weiter verarbeitet.

2.2.4.6. Quantitative Real Time- Polymerase-Kettenr eaktion (qPCR) Im zweiten Schritt erfolgte die quantitative Real-time-Polymerase-Kettenreaktion

(qPCR): Die Vervielfältigung der zuvor synthetisierten cDNA mittels Polymerase-

Kettenreaktion und die gleichzeitige Messung der Menge des entstehenden Amplifikats

in Echtzeit. Die quantitative Detektion der Amplifikate erfolgte über die Bestimmung

von Fluoreszenzintensitäten. Hierzu kamen Oligonukleotidsonden (TaqMan-Sonden)

zum Einsatz, die an einem Ende mit einem Reporterfluoreszenzfarbstoff und am

anderen Ende mit einem sogenannten Quencher markiert waren. Aus der räumlichen

Nähe von Reporter und Quencher ergab sich zunächst eine vollständige Suppression

der Fluoreszenz.

Die Sonden hybridisierten spezifisch an bestimmte DNA-Abschnitte. Sie wurden so

gewählt, dass ihre Zielsequenzen in einem DNA-Abschnitt lagen, der durch ein

spezifisches Primerpaar amplifiziert wurde.

Wenn im Verlauf der PCR die verwendete Taq-Polymerase mittels ihrer 5’-3’-Exo-

nukleaseaktivität bei der Gegenstrangsynthese das 5’-Ende der Sonde hydrolytisch

abspaltete, kam es zur Trennung von Reporter und Quencher. Dieser Schritt resultierte

in einer steigenden Fluoreszenzintensität definierter Wellenlänge des angeregten

Reporterfluoreszenzfarbstoffes, welche zum Ende jedes Zyklus detektiert wurde. Stieg

die Intensität des spezifischen Fluoreszenzsignals in einer Probe über das un-

spezifische Hintergrundrauschen und erreichte ein definiertes Fluoreszenzniveau

(Baseline) war der sogenannte Crossing point (CP) oder auch der threshold cycle (Ct)

erreicht. Ab diesem Zeitpunkt verlief die Reaktion nicht mehr linear, sondern

exponentiell. Ab hier war die gemessene Fluoreszenzintensität proportional zu der

Anzahl der Amplifikate und somit zur der Ausgangsmenge der cDNA.

26

Hieraus ergab sich das Maß für die Quantifizierung der Startmenge: Die Anzahl der

PCR-Zyklen die nötig war, um ein definiertes Fluoreszenzniveau zu erreichen.

Die Quantifizierung der MicroRNAs wurde als quantitative RT-PCR basierte Array-

Methode (qRCR-array) unter Verwendung des TaqMan® Universal PCR Master Mix

No AmpErase® UNG und der TaqMan® Array Human MircoRNA A+B cards (alles von

Applied Biosystems) mit Hilfe des 7900HT Real-Time PCR-Systems (Applied

Biosystems) durchgeführt. Das System-Set besteht aus zwei 384-well Reaktionsplatten,

die jeweils mit TaqMan® MicroRNA-Assays (Primern etc.) vorgeladen sind. Drei

endogene und eine negative Kontrolle sind jeweils in den Karten inkludiert, um die

spätere Normalisierung der Daten zu vereinfachen. Mit dem Set konnten in jeweils

zwei qPCR-Läufen 760 microRNAs pro Probe analysiert werden.

Alle Reagenzien wurden gemäß des Megaplex™ Pools Protocol (Applied Biosystems,

P/N 4399721 Rev C) eingesetzt. Für jeden Real-Time-PCR-Lauf wurden hierzu die

Reagenzien in folgender Menge zusammengefügt (siehe Tabelle 6):

Kompon ente Volumen

Universal PCR Master Mix 400µl

Megaplex RT-Produkt 5,3µl

Nukleasefreies Wasser 395µl

Tabelle 7 Ansatz für die Real-Time PCR

Mit dem so entstandenen Gesamtvolumen von 800µl wurde jeweils eine Karte beladen.

Die weitere Prozessierung der Karten erfolgte nach Angaben des Herstellers (Applied

Biosystems TaqMan® Array User Bulletin, P/N 4371129 Rev. B).

Pro Reaktionsplatte wurde ein qPCR-Lauf mit 45 Zyklen durchgeführt.

27

Abbildung 3 Prinzip der RT-qPCR

Modifiziert nach www.appliedbiosystems.com (Zugriffsdatum 23.06.2014)

2.2.5. Statistische Analysen der RT-qPCR- Ergebniss e Zur Darstellung der Resultate der qPCR wurden die automatisch generierten SDS-

Dateien (SDS-Software v2.3, Applied Biosystems) in eine Arbeitsmappe des RQ-

Managers (RQ-manager 1.2.1, Applied Biosystems) transferiert. Nach Empfehlungen

des System-Herstellers Applied Biosystems wurden die Studiendaten unter

Verwendung der automatischen Baseline und einem Threshold Cycle von 0,2

analysiert. Die ermittelten Ct-Werte wurden für die statistischen Analysen in eine Excel-

Tabelle exportiert.

Die statistischen Analysen erfolgten in Zusammenarbeit mit Damian Gola und Dr. Arne

Schillert vom Institut für Medizinische Biometrie und Statistik, Universität Lübeck,

Lübeck.

miR Stem-loop Primer

1. RT-PCR

2. qPCR

forward Primer

reverse Primer TaqMan®-Sonde

28

2.2.5.1. Präprozessierung Insgesamt wurden pro Patientenprobe 760 microRNAs (jeweils 380 auf Platten A und

B) untersucht.

In Anlehnung an verschiedene Publikationen, u.a. von He et al. und Vasilescu et al.,

wurden diejenigen Ct-Werte als fehlend (missing value) betrachtet, die einen Wert über

44 zeigten (57, 157). Platten A und B wurden daraufhin unabhängig voneinander einer

Präprozessierung unterzogen: Um relevante microRNAs für die weitere Analyse und

Diskussion herauszufiltern, wurden in einem ersten Schritt diejenigen microRNAs

exkludiert, die in über 50% der Fälle fehlende Ct-Werte zeigten. Für die Platte A

blieben so 151, für die Platte B 82 microRNAs erhalten. Daraufhin wurden alle Proben

ausgeschlossen, bei denen mehr als 45% der Ct-Werte für diese microRNAs fehlten.

Für die Platte A wurden so 4, für die Platte B 6 Lymphom-Proben von weiteren

Analysen ausgeschlossen. In einem dritten Schritt wurden erneut microRNAs gesucht,

die in den erhaltenen Fällen noch über 50% fehlende Ct-Werte zeigten. Hier wurden

keine weiteren microRNAs ausgeschlossen.

2.2.5.2. Quantilnormalisierung

Die vergleichende Analyse von Experimenten, die –wie hier- multiple Arrays involvieren,

erfordert zudem eine Normalisierung der Daten, da z.B. während der Proben-

präparation und -prozessierung nicht-biologische Variationen auftreten können (15).

Die Normalisierung der Datensätze erfolgte hier mithilfe der Quantilnormalisierung. Die

Grundidee dieser Methode ist einfach: Die Histogramme aller Arrays sehen gleich aus.

D.h. nicht nur das 50%-Quantil (= der Median), sondern alle Quantile sollen für alle

Arrays in etwa gleich sein. Nachteil ist, dass in einzelnen Arrays differentiell exprimierte

MicroRNAs am unteren und oberen Ende der Messskala angeglichen werden.

29

Abbildung 4 Boxplot der CT-Werte pro Fall und Platt e nach Präprozessierung

Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Gola und Schillert

Abbildung 5 Boxplots der CT-Werte pro Fall und Plat te nach Quantilnormalisierung


30

2.2.5.3. Fall-Kontroll-Analyse

Um Unterschiede in der microRNA-Expression von Lymphom-Gruppe zu Kontroll-

Gruppe herauszuarbeiten wurde der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test angewandt. Zur

Kontrolle der Irrtumswahrscheinlichkeit kam die Bonferroni-Holm-Prozedur zum Einsatz.

Das globale Signifikanz-Level wurde mit α (G) = 0,05 gewählt. Das lokale Signifikanz-

Level wurde wie folgt berechnet:

Formel 1 Berechnung des lokalen Signifikanzlevels

Für den Vergleich von mehr als zwei Gruppen im Rahmen der Subgruppenanalyse

kam der Kruskal-Wallis-Test zum Einsatz.

Die Durchführung der genannten statistischen Tests erfolgte mit R, Version 3.0.2

(2013-09-05).

31

3. Ergebnisse

3.1. Charakteristika der Patienten/innen Die dreißig Patienten der Gruppe angioimmunoblastischer T-Zell-Lymphome waren bei

Lymphknotenextirpation im Mittel 69,5 Jahre alt (43 bis 90 Jahre). Die Lymphknoten

stammen von 13 Frauen und 17 Männern.

Das Profil der Patienten in der Studiengruppe entspricht somit im Hinblick auf Alter und

Geschlecht in etwa dem in bisher veröffentlichten Studien (36, 43, 165).

Weitere klinische Angaben zu den Patienten lagen nicht vor.

Die zehn Patienten der Kontrollgruppe waren im Schnitt 36,6 Jahre alt, darunter 6

Frauen und 4 Männer.

3.2. Ergebnisse der histopathologischen Analysen

3.2.1. Ergebnisse der Analyse der Gewebsschnitte hi nsichtlich des histologischen Musters und der Proliferation der hochendothelialen Venolen und der FDC-Netzwerke

Die Auswertung hinsichtlich des histologischen Musters und der Proliferation sowohl

der hochendothelialen Venolen als auch der FDC-Netzwerke erfolgte licht-

mikroskopisch (Axioskop, Zeiss) nach Anwendung der oben aufgeführten histo-

chemischen Färbeverfahren und der immunhistochemischen Darstellung der FDC-

Netzwerke mithilfe der Primärantikörper gegen CD21 und CD23. Um einen für diese

Analyse angemessenen Gewebsabschnitt zu überblicken, wurden hierfür Schnitte der

vollständigen Lymphknotenproben herangezogen. Die Analyse erfolgte im Vier-Augen-

Prinzip durch Herrn Prof. Dr. med. A.C. Feller und Frau K. Reddemann.

Anhand der Analyse der konventionell histochemisch gefärbten Schnittpräparate der

vollständigen Lymphknotenproben wurde das morphologische Muster der angio-

immunoblastischen T-Zell-Lymphome, gemäß den von Attygalle 2002 aufgestellten

Kriterien bestimmt (8). Alle Lymphomfälle konnten einem der drei einleitend

beschriebenen histomorphologischen Muster zugeordnet werden (vgl. Einleitung). Alle

drei Muster wurden durch die ausgesuchten Fälle abgedeckt: Muster 1 wurde in 10%

(3/30), Muster 2 in 47% (14/30) und Muster 3 in 43% (13/30) der Fälle diagnostiziert.

32

Abbildung 6 Histomorphologisches Muster der AITL (n =30)

Die Proliferation der hochendothelialen Venolen, genauso wie die der follikulären

dendritschen Netzwerke findet in der Bestimmung des Musters nach Attygalle bereits

ihre Berücksichtigung. Da zum Beispiel die Neovaskularisation als Antwort auf die

Tumorzellen durch verschiedene Zellen des Mikromilieus verstanden wird und einen

prognostischen Faktor ebenso wie einen therapeutischen Ansatzpunkt darstellt (176),

haben wir beide Charakteristika für weitere Analysen außerdem separat betrachtet. Die

Dichte und Ausbreitung der kleinen Gefäße sowie die Proliferation der follikulären

dendritischen (FDC) Netzwerke wurde hierfür anhand der vollständigen Lymphknoten-

proben semiquantitativ mit einem entsprechend ansteigenden Score von 1 bis 3

bewertet (vgl. Tabelle 7).

Proliferat\Score 1 2 3 Venolen Keine oder gering

vermehrte Gefäß-strukturen, keine vermehrten Aufzweigungen

Mäßig vermehrte Gefäßstrukturen, vermehrte Gefäß-aufzweigungen

Stark vermehrte Gefäßstrukturen, multiple Gefäß-aufzweigungen

FDC-Netzwerke Keine Proliferation über die Follikel hinaus

Geringe bis mäßige Proliferation über die Follikel hinaus

Ausgedehnte, unregelmäßige Proliferation über die Follikel hinaus

Tabelle 8 Graduierung der Proliferation der hochend othelialen Venolen und der FDC-Netzwerke mit Zuordnung der Score-Werte

33

Hierbei wurde für die Gefäßproliferation in 40% der Fälle der Score von 2 vergeben, in

37% bzw. 23% (7/30) wurde ein Punktwert von 3 bzw. 1 zugeteilt.

Bei der vom Muster unabhängigen Betrachtung der FDC-Netzwerke wurde in jeweils

28,5 % der Wert 1 bzw. 3 vergeben. In 43% der Fälle ein Score von 2. Für zwei

Lymphomproben waren die Färbungen aus technischen Gründen nicht adäquat

auswertbar. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 (s. Anhang) dargestellt.

Die durchschnittlichen Punktwerte sowohl für die Proliferation der Venolen als auch für

die Ausdehnung der FDC-Netzwerke stiegen von Muster 1 bis Muster 3 kontinuierlich

an. Die Proliferation der Venolen wurde tendenziell in Mustern 1 und 2 mit einem

durchschnittlich höheren Score bewertet als die Expansion der FDC-Netzwerke.

Abbildung 7 Histomorphologisches Bild eines AITL

Fall 6, HE, Originalvergrößerung: 100x, Histomorphologisches Muster Score 3, Vaskularität Score 2

34

Abbildung 8 Beispiele der histomorphologischen Must er nach Attygalle et al. sowie

der Graduierung der Proliferation der hochendotheli alen Venole n und der FDC-Netzwerke.

A: Muster 1, B: Muster 2, C: Muster 3; HE, Originalvergrößerung: 100x; D: Venolen Score 1, E: Venolen Score 2, F: Venolen Score 3; Gomori Versilber-ung, Original-vergrößerung: 100x; G: FDC Score 1, H: FDC Score 2, I: FDC Score 3; CD23, Originalvergrößerung: 100x. A,D,G: Fall-Nr. 29, B,E,H: Fall-Nr. 11, C,F,I: Fall-Nr. 17.

35

29%

42%

29%

Score 1

Score 2

Score 3

Abbildung 9 Bewertung der Expansion der FDC-Netzwer ke

(nach Scores, prozentual, n=28)

23%

40%

37%

Score 1

Score 2

Score 3

Abbildung 10 Bewertung der Proliferation der hochen dothelialen Venolen

(nach Scores, prozentual, n=30)

36

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3

Muster

Score

FDC

Venolen

Abbildung 11 Durchschnittswerte des Scorings

der Proliferation der hochendothelialen Venolen und der Expansion der FDC-Netzwerke in Abhängigkeit zum histomorphologischen Muster (mit Standardabweichung)

3.2.2. Ergebnisse der immunhistochemischen Analysen anhand des tissue microarray (TMA)

Die neoplastischen T-Zellen im Angioimmunoblastischen T-Zell Lymphom exprimieren

den Pan-T-Zell Marker CD3 (43, 108). Charakteristischerweise weisen sie zudem in

60-100% den Immunphänotyp normaler follikulärer T-Helfer Zellen, u.a. mit Expression

von CD10 und PD-1, auf (8, 37). CD20 ist ein B-Zell-Antigen und wird auf den unter-

suchten Tumorzellen nicht exprimiert.

Das tissue microarray (TMA) wurde nach Qualitätskontrolle mittels HE-Übersichts-

färbung mit Primärantikörpern gegen die genannten Antigene gefärbt. Im Abgleich mit

CD3 und CD20 wurden nun unter Berücksichtigung des Zellverteilungsmusters anhand

des tissue microarrays die neoplastischen T-Zellen identifiziert und die Expression der

Tumorzellen für CD10 und PD1 sowie Stathmin und LMO2 bestimmt. Hierbei wurde

zwischen Positivität und Negativität der Lymphom-Zellen für das jeweilige Antigen

unterschieden.

37

Die Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch (Axioskop, Zeiss) im Konsensusverfahren

und Vier-Augen-Prinzip (J. Knief, K.Reddemann). Die Kontrolle erfolgte durch Herrn

Prof. Dr. med. Ch. Thorns im Konsensusverfahren.

Um eine gewisse Vergleichbarkeit mit anderen Publikationen zu gewährleisten, wurden

bereits für diese Antigene und diese Lymphom-Entität beschriebene Grenzwerte

berücksichtigt (Tabelle 8).

Antigen/Ziel Grenzwert (Pos itivität

liegt vor, wenn….)

Referenz

CD10 > 5% des CD3-positiven T-

Zell-Infiltrats positiv sind

(8, 39)

LMO2 > 30% der Lymphomzellen

positiv sind

(110)

PD1 > 20% der Lymphomzellen

positiv sind

(171)

Stathmin > 40% der Lymphomzellen

positiv sind

(101)

Tabelle 9 Grenzwerte der immunhistochemischen Färbu ngen

CD10 wurde in unserer Fallauswahl nur in 13% der Fälle auf den Tumorzellen

nachgewiesen. Für PD1 dagegen konnte die hohe Expressionsrate bestätigt werden:

77% (85% bei 23 von 27 positiv, bei 3 nicht auswertbaren Fällen).

Wir konnten außerdem zeigen, dass die Tumorzellen in 67% der untersuchten Fälle

Stathmin exprimieren (71% bei 20/28 positiven und 2 nicht auswertbaren Fällen).

LMO2 wird, bei vier aufgrund von Schnittartefakten nicht verwertbaren Fällen, in

keinem der untersuchten Fälle auf den neoplastischen T-Zellen exprimiert.

In nur 10% der Fälle wurden die Tumorzellen als positiv für alle drei beschrieben

Marker bewertet. Die größten Überschneidungen zeigten sich bei der Positivität für

PD1 und Stathmin (50%). In 17% bzw. 7% wurden die atypischen CD3+T-Zellen allein

durch den Marker PD1 bzw. Stathmin markiert. In nur einem Fall lag ausschließlich

CD10 auf den atypischen CD3+T-Zellen vor. Ebenfalls in nur einem Fall ließ sich

keiner der Marker verlässlich auf der postulierten Tumorzellpopulation nachweisen.

Die Ausfallquote der nicht-beurteilbaren Stanzen unter Berücksichtigung der TMAs für

Stathmin, CD10 und PD1 belief sich insgesamt auf 10%, vergleichbar mit Angaben in

den Leitlinien von Ilyas et al. (64).

38

Abbildung 12 Immunhistochemische Färbung mit CD3- Antikörper

Fall 25, CD3, Originalvergrößerung: 40x, Expansion der T-Zone durch ein

hellzelliges, perivaskulär akzentuiertes, mittelgroßzelliges CD3-positives T-

Proliferat


Fall 25, CD20, Originalvergrößerung: 40x, Marginalisierung der B-Lymphozyten

durch Expansion der T-Zone

39

Abbildung 14 Immunhistochemische Färbung mit Stathm in- Antikörper

Fall 20, Stathmin, Originalvergrößerung:100x, Markierung des perivaskulär ak-

zentuierten, mittelgroßzelligen, atypischen T-Zell-Proliferats mit Stathmin.


Fall 25, CD10, Originalvergrößerung:100x, Markierung des perivaskulär akzen-

tuierten, mittelgroßzelligen, atypischen T-Zell-Proliferats mit CD10.

40

Abbildung 16 Immunhistochemische Färbung mit PD1- Antikörper

Fall 20, PD1, Originalvergrößerung: 200x, Markierung der perivaskulär akzen-

tuierten atypischen T-Zellen mit PD1.

Abbildung 17 Färbeverhalten der neoplastischen T-Ze llen in AITL für die Antikörper gegen Stathmin, PD1 und CD10

prozentual, unter Berücksichtigung der Mehrfachpositivität/-negativität und

Ausfallsquote (NA)

41

3.3. Ergebnisse der EBER-ISH Anhand der In-situ-Hybridisierung für EBER wurde mittels des tissue microarrays die

An- bzw. Abwesenheit von EBV-positiven B-Blasten im Begleitinfiltrat des Lymphoms

ermittelt.

Hierbei wurden diejenigen Fälle als positiv bewertet, die 50 und mehr positive EBV-

positive Blasten pro low power field (hier definiert 1 mm Objektfelddurchmesser)

aufwiesen.

42% (11/26) der Fälle konnten so als positiv bewertet werden. Vier Fälle waren

aufgrund von Schnittartefakten des tissue microarrays nicht adäquat auswertbar.

Auch ein Fall der Kontrollgruppe wurde so als EBV-positiv identifiziert.

Abbildung 18 In-situ Hybridisierung für EBER

Fall 5, EBER, Ausschnitt eines Low-power-fields, Originalvergrößerung:200x,

42

3.4. Ergebnisse der microRNA-Quantifizierung

In Konkordanz mit verschiedenen Leitlinien für Experimente mit tissue microarrays und

qPCR wurden die statistischen Analysen von Experten, Damian Gola und Arne

Schillert aus dem Institut für Biometrie und Statistik, Universität zu Lübeck,

durchgeführt (20, 64).

Die Nullhypothese lautete: Es gibt keinen Unterschied in der microRNA-Expression

zwischen der Fall- und der Kontroll-Gruppe.

Für sieben microRNAs konnte auf dem nach Bonferroni-Holm lokal adjustierten

Signifikanzlevel die Null-Hypothese zurückgewiesen werden. Alle microRNAs sind für

den Menschen beschrieben, im Folgenden wird somit auf den expliziten Zusatz

„hsa“ für die microRNAs verzichtet.

Vier microRNAs, wiesen in den untersuchten Lymphomfällen ein signifikant niedrigeres

Expressionslevel auf als die Fälle der nicht-neoplastischen Kontrollgruppe: miR-140-3p,

let-7g, miR-30b und miR-664.

Drei microRNAs zeigten dagegen eine signifikant höhere Expression in der AITL-

Gruppe: miR-146a, miR-193b und miR-34a.

Außerdem konnte die Nullhypothese auch für RNU44, eine kleine nukleoläre RNA

(snoRNA), verneint werden. RNU44 zeigte sich in der Lymphom-Gruppe signifikant

runterreguliert.

microRNA Medianer

∆CT

fold change

(Veränderungen

um das n-fache)

p-Wert Adjustierter

p-Wert

Konfidenz-

intervall

miR-140-3p -1,51 0,35 0,000000527 0,000123 [-2,31, -1,06]

Let-7g -1,41 0,38 0,00001 0,00254 [-2,19, -0,90]

miR-146a 1,27 2,42 0,0000266 0,00615 [0,61, 1,48]

miR-193b 0,91 1,88 0,0000307 0,00706 [0,66, 1,56]

miR-30b -0,93 0,53 0,0000543 0,0124 [-1,70, -0,43]

miR-664 -0,55 0,68 0,0000913 0,0207 [-1,08, -0,33]

miR-34a 2,45 5,45 0,000102 0,0231 [1,35, 3,36]

RNU44 -1,32 0,4 0,0000478 0,011 [-2,65, -0,75]

Tabelle 10 Signifikant aberrant exprimierte RNAs in der Fall-Kontroll-Analyse

Mit p-Werten, adjustiert nach der Bonferroni-Holm-Prozedur, und Konfidenz-

intervallen

43

Abbildung 19 Boxplots der CT-Werte der signifikant aberrant exprimierten microRNAs nach ansteigenden adjustierten p-Werten

Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Gola und Schillert Bezogen auf die Subgruppen, die sich durch die Positivität bzw. Negativität der

neoplastischen T-Zellen für CD10, PD1 und Stathmin, sowie durch die An-bzw. Ab-

wesenheit EBV-positiver B-Blasten ergaben, konnte für keine microRNA die Null-

hypothese auf dem nach Bonferroni-Holm adjustierten Signifikanzlevel verworfen

werden. Auch im Vergleich von drei Gruppen unter Anwendung des Kruskal-Wallis-

Tests, fand sich kein signifikanter Unterschied in der microRNA-Expression in Bezug

auf die Gefäßproliferation, die FDC-Expansion oder das histomorphologische Muster.

Statistisch war somit insgesamt kein Unterschied der microRNA-Expression in den

verschiedenen Gruppen messbar.

Verzichtet man auf die Adjustierung und sortiert man aberrant exprimerte microRNAs

pro Subgruppe nach aufsteigendem p-Wert, ergeben sich 7 Tabellen, deren Top Ten

im Anhang zu finden sind (Tabellen 26-32).

Eine Klassifikation der microRNA-Expression anhand des histologischen Musters oder

des Gefäß- bzw. FDC-Scores war aufgrund des unvollständigen Datensatzes, der sich

durch die Präprozessierung ergab, nicht sinnvoll möglich.

44

4. Diskussion

4.1. Morphologie - Die Proliferation der Venolen al s frühes Merkmal von AITL

Das morphologische Profil angioimmunoblastischer T-Zell-Lymphome ist zwar charak-

teristisch, jedoch keineswegs spezifisch für die Erkrankung und zeigt Überschnei-

dungen zu anderen Neoplasien oder reaktiven Lymphknotenveränderungen (104). Man

kann davon ausgehen, dass gerade Frühformen histologisch oft nicht erkannt werden

und deswegen die meisten Fälle erst in fortgeschrittenem Stadium diagnostiziert

werden. Letztendlich kann auch die schlechte Prognose der Erkrankung zum Teil

darauf zurückgeführt werden.

Setzt man voraus, dass die von Attygalle et al. beschriebenen histomorphologischen

Muster Progressionsstadien der Erkrankung darstellen, konnte anhand der hier

untersuchten und klassifizierten dreißig AITL-Fälle ein positiv korrelierender Trend

sowohl der Proliferation der Gefäße als auch der FDC-Netzwerke mit ansteigendem

Grad der Architekurstörungen bestätigt werden.

Zudem ließ sich anhand der Durchschnittswerte des semiquantitativen Scorings

feststellen, dass tendenziell die Proliferation der Gefäße in früheren Krankheitsstadien

(Muster 1 und 2) früher höher bewertet wurde als die Expansion der FDC-Netzwerke.

In der Praxis könnte somit das Merkmal der Gefäßproliferation im Frühstadium den

Weg für die richtige Diagnose bereits bahnen, auch wenn die FDC-Expansion noch

nicht erkennbar ist.

Diese Beobachtung könnte auch auf eine sequentielle Krankheitsgenese hindeuten.

Vergleichsweise vermuten Pileri et al., dass die VEGF Deregulation, die auch für das

kutane T-Zell-Lymphom Mycosis fungoides beschrieben wurde, in dieser Entität ein

frühes Ereignis darstellt (126). Die Induktion der Angiogenese durch eine abnorme

VEGF-Expression sowohl der neoplastischen als auch der nicht-neoplastischen

Bystander-Zellen könnte in AITL ebenfalls ein erstes Ereignis sein, das die Krankheits-

entstehung und das Tumorwachstum erst begünstigt.

45

4.2. Immunhistochemie

4.2.1. Stathmin als relevanter und möglicherweise C D10 überlegener Marker in AITL

Stathmin, oder auch Onkoprotein 18, wurde ursprünglich als Onkoprotein in T-Zell-

Leukämie-Zellen charakterisiert (103). Die Stathmin-Protein Familie ist hochgradig kon-

serviert. Durch Bindung an freie Tubulinheterodimere im Zytoplasma sind sie Regu-

latoren des dynamischen Netzwerks von Mikrotubuli-Filamenten und des Mikrotubulus-

Organisationszentrums (MTOC) in einer Zelle (31). Filbert et al. konnten zeigen, dass

Stathmin in T-Zellen nach Aktivierung über den T-Zell-Rezeptor ERK-abhängig phos-

phoryliert wird und so das Mikrotubulus –Wachstum verstärkt (44). Verma et al. fanden

heraus, dass Stathmin unter Einflussnahme des Transkriptionsfaktors STAT3 die

Mikrotubulus-Dynamik in migierenden T-Zellen reguliert, was auch die Zelladhäsion an

hochendotheliale Venolen mitinvolviert (158).

Belletti und Baldassarre berichten, dass eine hohe Stathmin-Expression das An-

sprechen maligner Tumore auf Chemotherapeutika, deren Zielstrukturen das Mikro-

tubulus-Netzwerk darstellen (z.B. Vincristin, Bestandteil des CHOP-Therapie-Regimes),

negativ beeinflussen kann (13).

Die Diagnosestellung von Lymphomen ist anspruchsvoll und erfordert zumeist ein

Panel aus mehreren immunhistochemischen Markern. Gerade im Hinblick auf die Sub-

klassifizierung von T-Zell-Lymphomen ist die Identifikation hilfreicher, wenn möglich

sogar spezifischer Marker von großem Interesse, da ihre bisherige Anzahl weit hinter

denen der B-Zell-Lymphome zurücksteht (148).

Anhand von 55 Fällen zeigten Marafioti et al., dass Stathmin auch in neoplastischen

Zellen von T-Zell-Lymphomen exprimiert wird (101). Darunter zeigten sich auch 6 von

8 Fälle von angioimmunoblastischen T-Zell-Lymphomen positiv für Stathmin.

Stathmin könnte somit in der Praxis als immunhistochemischer Marker insbesondere

für angioimmunoblastische T-Zell-Lymphome interessant sein. Weiterhin wäre die

Korrelation zwischen Therapieansprechen und Positivität der Tumorzellen für Stathmin

möglicherweise ein Ansatzpunkt für weitere Forschungsvorhaben. Gründe, die Beo-

bachtung von Marafioti et al. mit einer größeren Fallzahl zu verifizieren und mit bereits

etablierten Markern (PD1 und CD10) für AITL zu vergleichen.

Die Positivität der neoplastischen T-Zellen für Stathmin in den untersuchten Lymph-

knotenproben, befallen von AITL, konnte in 71% (20 von 28 Fällen) bestätigt werden.

Prozentual ist das Ergebnis mit dem von Marafioti et al. (75%) vergleichbar. Stärkste

Überschneidungen zeigte die Stathmin-Expression mit PD-1, das in 85% der Fälle von

den Tumorzellen exprimiert wurde.

46

CD10 ist eine Zellmembrangebundene Metallopeptidase, die insbesondere von B-

Lymphozyten der follikulären Keimzentren exprimiert wird (39). Die Rate der CD10-

positiven AITL-Fälle blieb mit 13% weit hinter den in der Literatur angegebenen 71 bis

90% zurück (39, 104, 108). Anzumerken ist jedoch, dass die CD10 –Positivität der

Tumorzellen in AITL bereits oft als heterogen (nur auf einem Teil der Tumorzellen und

in variabler Intensität) beschrieben und vereinzelt auch kontrovers diskutiert wurde (36,

154). Hierbei wird ein Nachteil der tissue microarray Methode erkennbar: Der

Durchmesser der Gewebsstanzen ist oft nicht groß genug, um bei heterogener

Antigenverteilung im Gewebe sicher eine Positivität auszuschließen. Dieser Pro-

blematik wurde versucht durch sorgfältige Fall- und Arealauswahl entgegenzusteuern.

Außerdem wurde mit 2 mm der Durchmesser der Stanzen relativ groß gewählt. Ein

weiterer Grund der niedrigen Rate CD10-positiver AITL-Fälle in der vorliegenden

Studie ist die subjektive Wahrnehmung des Untersuchers. Gerade für CD10 ist bei

spärlichen internen Kontrollen (Stroma-Fibroblasten und Granulozyten) und eventuell

zusätzlich suboptimalen Färbungen eine Bewertung als schwierig beschrieben worden

(34). Hier jedoch zeigten sich die Vorteile des TMA: Es konnte Kontrollgewebe mit

verbaut werden und durch Komprimierung der Fälle auf einen einzigen Schnitt erfolgte

die sorgfältige manuelle Färbung für alle Proben unter gleichen Bedingungen. Und

durch die Auswertung im Konsensusverfahren im Vier-Augen-Prinzip sowie ledigliche

Dichotomie der Merkmale sollte der Interobserver-Variabilität ausreichend Rechnung

getragen worden sein.

Nichtdestotrotz sind semiquantitative immunhistochemische Analysen von Lymphomen

immer kritisch zu bewerten (vgl hierzu auch (34)). Eine Doppelpositivität für Stathmin

und CD10 mit Negativität für PD1 war nicht nachweisbar.

In 2 Fällen konnte ausschließlich Stathmin die neoplastische T-Zell-Population an-

färben, sowohl CD10 als auch PD1 wurden hier als negativ bewertet.

Daran ist ein möglicher Informationszugewinn durch Stathmin im Antikörper-Panel zur

Diagnosesicherung eines AITL abzulesen.

Die Färbungen bleiben mit verlässlichen Doppelfärbungen zu validieren.

4.2.2. LMO2 wird nicht von AITL-Zellen exprimiert

LMO2 (LIM domain only 2) ist ein Cystein-reicher Transkriptionsfaktor, der eine

tragende Rolle in der Hämatopoese spielt (110, 119). In Patienten mit akuter

lymphoblastischer T-Zell-Leukämie wird LMO2 durch die chromosomalen Trans-

lokationen t(7;11)(q35;p13) oder t(11;14)(p13;q11) aktiviert (110). Die LMO2-Ex-

pression ist außerdem eng mit dem Keimzentrums-phänotyp von B-Lymphozyten

47

verbunden (2). Mittlerweile ist ein monoklonaler Kaninchen-Antikörper für immunhisto-

chemische Färbungen in Paraffin-eingebetten Gewebe verfügbar, der in der Routine-

Diagnostik eingesetzt werden kann (3).

Dyhdalo et al. konnten zeigten, dass LMO2 in Ergänzung zu den Markern CD10 und

bcl6 die Bestimmung des Keimzentrum-Phänotyps in follikulären Lymphomen verein-

facht und bei der Abgrenzung zu Marginalzonenlymphomen helfen kann (40). Im

Hinblick auf normale T-Zellen dokumentieretn Natkunam et al., dass in normalem

lymphatischem Gewebe LMO2 weder auf CD3+-T-Zellen innerhalb noch außerhalb der

Keimzentren nachgewiesen werden konnte (110). Für PTCL allgemein ergaben Unter-

suchungen von Agostinelli et al., dass nur 9 von 237 Fälle LMO2-positive Elemente

zeigten (3).

Da der Immunphänotyp der neoplastischen T-Zellen in angioimmunoblastischen T-Zell-

Lymphomen oft Überscheidungen mit dem Phänotyp von Keimzentrums B-Zellen zeigt

und bisher AITL nicht im Hinblick auf ihre LMO2-Expression untersucht worden sind,

wurde dies hier nachgeholt. Vorteil des verwendeten Markers wäre seine strikte

nukleäre Anfärbung der positiven Zellen. Hier jedoch zeigte sich in keinem der dreißig

untersuchten AITL-Fälle ein mit dem Verteilungsmuster der neoplastischen CD3+T-

Zellen übereinstimmendes Muster für LMO2. Außerdem erschwerte die Positivität der

zahlreichen Endothelien die Auswertung, sodass LMO2 für die Identifikation der

neoplastischen T-Zellen in AITL ungeeignet erscheint.

4.3. MicroRNA-Expression

Die Interpretation und Diskussion der Ergebnisse der microRNA-Expressionsanalyse

erfolgte im Abgleich mit Publikationen aus der Online-Datenbank „pubmed“. Es wurden

Studien zu der Rolle von microRNAs sowohl in Krebserkrankungen und Lymphomen

allgemein als auch in der T-Zell-Entwicklung und -Maturation berücksichtigt, um so

Rückschlüsse auf Erkrankungsassoziierte Signalwege und Gene zu ziehen. Da in den

meisten Fällen die Ziel-Strukturen einer microRNA unbekannt bleiben, stellt der

Nachweis einer microRNA-Dysregulation im Vergleich zum Normalgewebe einen

ersten Schritt in der Charakterisierung physiologischer und pathologischer Prozesse

dar (14).

4.3.1. Mögliche Oncomir in AITL

Diejenigen microRNAs, deren Expression im Vergleich zu nicht-neoplastischem

Normalgewebe erhöht ist, kommen als mögliche Onkogene/ „Oncomirs“ in Betracht. Es

konnte gezeigt werden, dass sie die Tumorentwicklung begünstigen, indem sie Tumor-

48

suppressorgene und/oder Gene, die die Zelldifferenzierung und die Apoptose ver-

mitteln, hemmen (173). Grundsätzlich werden solche Krebs-Phänotypen als

schwerwiegender betrachtet, die von einer Überexpression, einem „Gain-of-function“,

ihrer Gene verursacht werden (116). Durch Hemmung von Genen, die normalerweise

in einem Zelltyp nicht unterdrückt werden, kann „microRNA Gain-of-function“ zu

aberranten Funktionen führen. Der Verlust der microRNA-Funktion (loss of function)

würde demnach nur Zellen betreffen, in denen das Ziel-Gen und die microRNA gleich-

zeitig exprimiert sind (116).

Die microRNAs miR-146a, miR-193b und miR-34a zeigten in den Lymphknoten der

untersuchten Fälle angioimmunoblastischer T-Zell-Lymphome im Vergleich zu den

Fällen der reaktiven Lymphadenitis eine signifikant höhere Expression. Sie kommen

somit für AITL als potentielle „Oncomirs“ in Betracht. Die höchste Signifikanz zeigt

darunter miR-146a (adjustierter p-Wert 0,000123). Den höchsten Fold change weist

miR-34a auf; sie wird über 5 mal höher in AITL als in reaktiv veränderten Lymphknoten

exprimiert.

MiR-146a wird laut „miRBase“ auf Chromosom 5 codiert. Nach Informationen der

Online-Datenbank „miRWalk“ sind für diese microRNA 689 Ziel-Gene validiert, 551

rechnerisch vorhergesagt worden.

MiR-146a ist ein Modulator des Immunsystems und spielt sowohl in myeloischen, als

auch lymphozytären Zellen eine Rolle (32). Ihre Expression kann in myeloischen Zellen

durch mikrobielle Komponenten oder proinflammatorische Zytokine induziert werden.

Zudem gehört sie zu der microRNA-Signatur normaler menschlicher T-Zellen (94). In

naiven T-Zellen ist ihre Expression niedrig, in T-Gedächtniszellen jedoch sehr hoch

(78). MiR-146a ist ein wichtiger Feedback-Regulator des NF-kappaB-Signalweges (11).

Durch zwei Bindungsstellen für NFkappaB im Promoter von miR-146a wird ihre

Expression im Zuge der Aktivierung der T-Zell-Rezeptor (TCR)-Signalkaskade

NFkappaB-abhängig hochreguliert (11, 128). Ziele von miR-146a sind wiederum der

TNF Rezeptor-assoziierte Faktor 6 (TRAF6) und die IL-1 Rezeptor-assoziierte Kinase 1

(IRAK1), die in einem negativen Feedback-Loop die Intensität und die Dauer des

NFkappaB-Signals kontrollieren (11, 150). In humanen T-Zellen kann eine miR-146a-

Überexpression die Produktion von IL-2 hemmen (143). In humanen B-Zellen kann die

miR-146a-Expression NFkappaB-abhängig durch das Epstein-Barr Virus latent

membrane protein 1 (LMP1) induziert werden (107, 143). Yang et al. stellten fest, dass

eine miR-146a-Defizienz eine Überstimulation der T-Zellen durch die TCR-

Signalkaskade, und somit eine ungehemmte T-Zell-vermittelte Entzündungsreaktion

49

hervorrufen kann (170). Weitere Loss-of-function-Studien an Mäusen zeigten, dass

miR-146a eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen spielen

kann. So führt der Verlust von miR-146a zu einer Hochregulation des Signal-

Transducer and Activator of Transcription 1 (STAT1) in regulatorischen T-Zellen, was

zu einer fatalen IFNgamma-vermittelten Autoimmunität führt (97). Auch bei Menschen,

die an den Autoimmunerkrankungen Lupus erythematodes und rheumatoider Arthritis

leiden, zeigt sich eine Dysregulation von miR-146a. Interessanterweise scheinen

gerade diese beiden Erkrankungen eng mit einer Dysregulation follikulärer T-Helfer-

Zellen, den postulierten Ursprungszellen des AITL, assoziiert zu sein (118). In

mononukleären Blutzellen von Lupus-Patienten ist die miR-146a-Expression herunter-

reguliert und zeigt eine negative Korrelation mit der Erkrankungsschwere (143). Im

Unterschied dazu ist in CD4+T-Zellen von Patienten mit rheumatoider Arthritis miR-

146a häufig hochreguliert und die Expression zeigt eine enge positive Korrelation mit

erhöhten TNFalpha-Leveln in diesen Patienten (89). Li et al. konnten in diesem Kontext

zeigen, dass eine Überexpression von miR-146a in vitro die Apoptose von T-Zellen

hemmt (89).

Auch in einigen Malignomen konnte eine aberrante miR-146a-Expression gezeigt

werden. In soliden Tumoren, unter anderem in anaplastischen Schilddrüsen-

karzinomen, Glioblastomen und Plattenepithelkarzinomen der Cervix uteri ließ sich bei

Vergleich mit dem entsprechenden Normalgewebe ebenfalls eine erhöhte Expression

von miR-146a nachweisen (81, 114, 161). In Karzinomen des Pankreas, Magens und

der Prostata zeigte sich die miR-146a-Expression jeweils im Vergleich zu dem

normalen Kontrapart herunterreguliert (74, 90, 92).

In EBV-positiven Burkitt-Lymphom-Zelllinien wurde eine erhöhte miR-146a-Expression

beschrieben (155). Peveling-Oberhag konnte nachweisen, dass diese microRNA in

splenischen Marginalzonen-lymphomen ebenfalls erhöht ist (122). Anhand von 90

Patientenproben haben Zhong et al. zudem demonstriert, dass niedrige miR-146a-

Level bei de-novo aufgetretenen diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen mit höheren

Remissionsraten, besserem Gesamtüberleben und längerem progressionsfreiem

Überleben assoziiert sind (177).

In Bezug auf T-Zell-Lymphome fanden Curtale et al. anhand der humanen Jurkat-T-

Zell-Lymphom-Zelllinie heraus, dass miR-146a in aktivierten T-Zellen über Modulation

des Activation-induced cell-death – (ACID)-Moleküls die Apoptose verhindern kann

(32).

Studien von Paik et al. an Gewebsproben zeigten, dass NK/T-Zell Lymphome des

oberen aerodigestiven Trakts, die eine niedrige miR-146a-Expression aufweisen eine

schlechtere Prognose haben als solche mit hoher miR-146a-Expression. In vitro-

50

Analysen mit NK/T-Zelllinien ließen zudem erkennen, dass eine miR-146a-Über-

expression die Zellproliferation hemmt, die Apoptose induziert und die Chemo-

sensitivität verstärkt, indem durch gezielte TRAF6-Modulation der NFkappaB-Weg

inhibiert wird (115).

Auch ist eine geringe Expression von miR-146a ein hervorstechendes Merkmal von

ALK-positiven anaplastischen großzelligen Lymphomen (ALK(+)ALCL) und zudem ein

Kriterium (von 11), mit dem sich ALK-negative ALCL von PTCL-NOS und AITL gezielt

abgrenzen lassen (94). Desweiteren konnten Tomita et al. zeigen, dass das humane

lymphotrope Virus 1 (HTLV1) in T-Zell-Linien miR-146a NFkappaB-abhängig hoch-

reguliert und somit potentiell ein therapeutisches Ziel in adulten T-Zell-Leukämien

darstellt (155).

In AITL wären folgende Ursachen für eine erhöhte miR-146a-Expression denkbar: A)

die Anzahl der T-Zellen in den Lymphknotenproben der angioimmunoblastischen T-

Zell-Lymphome ist durchschnittlich höher als in denen der reaktiven Lymphadenitis,

sodass die microRNA-Signatur normaler CD3+T-Zellen inklusive miR-146a als

überdurchschnittlich wahrgenommen wird. Durch sorgfältige Fall- und Probenauswahl

sowie Eingrenzung der Kontrollgruppe auf Lymphadenitiden mit T-Zonen-Hyperplasie

wurde jedoch versucht, dieser Variablen entgegenzusteuern. B) Ähnlich wie in rheuma-

toider Arthritis könnte die Expression von miR-146a durch pro-inflammatorische

Zytokine (z.B. IL-6) induziert worden sein und somit das entzündliche Mikromilieu im

Lymphknoten widerspiegeln. Zu Bedenken ist jedoch, dass das hier verwendete nicht-

neoplastische Vergleichsgewebe so gewählt wurde, dass ein ähnliches entzündliches

Zellbild wie in AITL vorherherrscht. C) Die EBV-Last der B-Blasten in AITL könnte eine

messbar erhöhte miR-146a-Expression in der Gesamtgewebsprobe bewirkt haben.

Jedoch zeigt die Subgruppenanalyse, dass es keinen signifikanten Unterschied

zwischen EBER-positiven und EBER-negativen Fällen im Hinblick auf die microRNA-

Expression gibt. Auch wenn die Adjustierung des p-Wert vernachlässigt wird, ist keine

Tendenz für einen möglichen Zusammenhang statistisch belegbar. D) Eine vermehrte

Aktivierung des NFkappaB-Weges aus tumoreigener Ursache könnte zur vermehrten

Transkription des miR-146a-Gens führen. Gleichzeitig müsste man davon ausgehen,

dass der negative Rückkopplungsmechanismus über TRAF6 und IRAK defekt ist. E)

Eine Trisomie von Chromosom 5, deren häufiges Vorkommen in AITL zytogenetische

Untersuchungen belegt haben (149), könnte aufgrund des Gen-Dosis-Effekts zu einer

verstärkten Expression der microRNA führen. Vergleichsweise konnten in Lympho-

zyten von Kindern mit Down-Syndrom (Trisomie 21) dysregulierte microRNAs mit Gen-

locus auf Chromosom 21 nachgewiesen werden, die möglicherweise zu den Immun-

51

defekten in dieser Erkrankung beitragen können (166). Tatsächlich ist miR-146a eine

von zwei microRNAs (neben miR-15a/16) deren Herunterregulation direkt auf eine

chromosomale Aberration zurückgeführt werden kann (116): Für myelodysplastische

Syndrome, die mit einer 5q-Deletion einhergehen, ist eine verminderte Expression von

miR-146a belegt worden (146).

MiR-34a wird ganz überwiegend als Tumorsuppressor-microRNA beschrieben. Sie

wird auf Chromosom 1p36 codiert und gehört zu einer Familie von microRNAs (miR-

34a, -b und –c), die ein direktes Ziel des Tumorsuppressors p53 darstellen (59). Ihre

Hochregulation kann die Apoptose und den Zell-Zyklus-Arrest induzieren (25, 57).

MiR-34a hat unter anderem SIRT-1 zum Ziel, eine NAD-abhängige Deacetylase, die

viele pro-apoptotische Proteine hemmt (18). Durch Repression von SIRT1 wird miR-

34a Teil eines positiven Rückkopplungsweges, der die weitere p53-Aktivierung zur

Folge hat (59, 167). Interessant ist zudem, dass Kauppinen et al. berichten, dass auch

der NFkappaB-Signalweg durch miR-34a die SIRT1-Aktivität herunterregulieren kann.

So können NFkappaB-vermittelte Entzündungsreaktionen stimuliert und der Energie-

stoffwechsel verändert werden (72). Außerdem scheint eine hohe Expression von miR-

34a (durch Hemmung der Diacylglycerolkinase ζ) die TCR-abhängige T-Zell-Akti-

vierung zu verstärken (142). Auch verbindet miR-34a das p53-Netzwerk mit bcl2,

ebenfalls einem anti-apoptotischen Faktor, der eine Ziel-Struktur von miR-34a darstellt

(58). In Tumorzellen kann die miR-34-vermittelte Apoptose durch Inaktivierung von p53

und/oder der miR-34-Gene supprimiert sein (59).

Niedrige miR-34a-Level sind zum Beispiel ein Charakteristikum von MYC-induzierten

Lymphomen, z.B. Burkitt-Lymphomen, da MYC nachweislich die miR-34a-Expression

supprimieren kann (145). He et al. zeigten zudem, dass die miR-34a-Expression in

MALT-Lymphomen und diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen des Magens im

Vergleich zu normalem Magengewebe und mononukleären Blutzellen vermindert ist.

Die verminderte miR-34a-Expression, verbunden u.a. mit einer hohen bcl2-Expression,

war zudem mit einem schlechten Gesamtüberleben in diesen Entitäten verbunden (58).

Allerdings ist in der microRNA-Signatur von splenischen Marginalzonenlymphomen

miR-34a eine der abweichend am höchsten exprimierten microRNAs (7).

Korrespondierend dazu liegen Hinweise dafür vor, dass die Funktion von miR-34a

stark vom zellulären Kontext, der Expression ihrer Ziel-Moleküle und Stoffwechsel-

prozessen abhängt (59). Chang et al. konnten außerdem zeigen, dass die miR-34a-

induzierte Apoptose zumindest teilweise die Präsenz des p53-Wildtyps voraussetzt

(25).

52

Dass hier die als Tumorsuppressor bekannte miR-34a im Tumor stärker exprimiert wird

als im nicht-neoplastischen Kontrapart könnte dafür sprechen, dass die pro-apop-

totischen Funktionen der microRNA hier nicht im Fokus stehen oder aber nicht greifen

können. Ein Hinweis wäre hierfür zum Beispiel auch bcl2, eine postulierte Zielstruktur

von miR-34a, die bekanntermaßen in AITL ebenfalls überexprimiert wird und als

Oncogen gilt (66, 71). Allerdings war die bcl2-Expression nicht Gegenstand der vor-

liegenden Studie und ist für das Fallkollektiv nicht ermittelt worden. Eine vermehrte

Detektion von p53, ein Indikator für die Mutation des p53-Gens, konnte für periphere T-

Zell-Lymphome gezeigt und mit einer schlechteren Prognose in Verbindung gebracht

werden (71). Vielleicht stellt somit miR-34a das Bindeglied zwischen bcl2 und p53

sowie den Grund der Deregulation multipler Apoptosewege in peripheren T-Zell-

Lymphomen dar (vgl. hierzu auch (71)).

Zumindest findet sich auch in ALK-negativen und –positiven anaplastischen groß-

zelligen Lymphomen eine erhöhte miR-34a-Expression als Teil einer 7 microRNAs

umfassenden Schnittmenge zwischen diesen beiden Entitäten (94).

Andererseits könnte wiederum im Rahmen des entzündlichen Hintergrundes in AITL,

möglicherweise auch NFkappaB-vermittelt, die Expression induziert worden sein.

So haben Forte et al. gezeigt, dass miR-34a stark p53-unabhängig über NFkappaB-

Aktivierung von dem EBV- latent membran protein 1 induziert werden kann und dass in

vielen EBV- und Kaposi-Sarkom-assoziierten-Virus (KSHV)-infizierten B-Zell-

Lymphom-Zell-Linien miR-34a eine wachstumsvermittelnde, onkogene Rolle einnimmt

(45).

MiR-193b wird auf Chromosom 16p11.13 codiert (86).

Die in-silico-Recherche in der Datenbank pubmed ergab insgesamt nur 59 Treffer im

Vergleich zu fast 600 Treffern für jeweils miR-146a und miR-34a (Stand Juni 2014).

Sehr viele der veröffentlichten Studien beziehen sich auf Experimente mit Tumorzell-

Linien, was nicht automatisch bedeutet, dass das ermittelte Ergebnis der Wirklichkeit in

vivo entspricht. Liu C et al. stellten zum Beispiel fest, dass microRNA-Experimente

anhand von Zelllinien und Fällen von ALCL oft nicht positiv korrelieren, was vermuten

lässt, dass die Regulation von microRNAs in vivo sehr komplex ist, dass verschiedene

Stromakomponenten die Variabilität des microRNA-Profils beeinflussen und es

spezifische Unterschiede zwischen den Zelllinien gibt (94)

In vitro konnte miR-193b als möglicher Tumorsuppressor in Prostatakarzinomen (132),

in akuter myeloischer Leukämie (AML) (42), in Pankreas-, Magen und Ovarial-

karzinomzellen (63, 109, 178) identifiziert werden. Ebenfalls in vitro zeigten Lenarduzzi

et al., dass miR-193b in Zell-Linien von Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und

53

Halses überexprimiert ist (86). Als eine Zielstruktur von miR-193b konnten sie Neuro-

fibromin1 (NF1), eine GTPase, experimentell sichern. Sie postulierten, dass Tumore,

die miR-193b überexprimieren und damit NF1 herunterregulieren, konstitutiv den Ras-

Signalweg aktivieren können. In T-Zellen ist die T-Zell-Rezeptor- induzierte Aktivierung

des Ras-Signalweges wichtig für die Entwicklung, Proliferation und die Differenzierung

(79). Abnormale Ras-Expression, -Aktivierung oder –Signale in T-Zellen spielen eine

wichtige Rolle für die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen (105), was miR-193b

im Hinblick auf das klinische Erscheinungsbild in AITL, das ebenfalls durch

Autoimmun-Effekte bestimmt wird, in den Fokus rücken könnte.

Analysen an Paraffin-Material von Nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen zeigten, dass

miR-193b hier ebenfalls niedrigere Level aufweist als im verglichenen Normalgewebe

(60). Thorns et al. fanden dagegen heraus, dass miR-193b im Gewebe neuro-

endokriner Neoplasien des Pankreas (PNEN) im Vergleich zu pankreatischen Insel-

zellen sowie im Serum dieser Patienten erhöht ist und bezeichnen miR-193b als viel-

versprechenden Biomarker (153). Ein interessanter Punkt ist zudem, dass miR-193b

Stathmin zum Ziel haben kann. Über Herunterregulation von Stathmin durch miR-193b

in Melanom-Zelllinien konnte die Migration und die Proliferation der Krebszellen

gehemmt werden (26). In unseren Fällen angioimmunoblastischer T-Zell-Lymphome

konnte eine Expression von Stathmin in etwa 70% der Fälle auf den neoplastischen T-

Zellen nachgewiesen werden. Ein signifikanter Unterschied von Stathmin-positiven zu

–negativen Fällen konnte in der Subgruppenanalyse bezüglich des microRNA-Profils

jedoch nicht ermittelt werden. Experimente, die den für Krebs-Zelllinien beschriebenen

Zusammenhang zwischen miR-193b und Stathmin in vivo verifizieren, wären hierzu

wünschenswert.

Eine Überexpression von miR-193b in angioimmunoblastischen T-Zell-Lymphomen

bringt somit den RAS-Signalweg und Stathmin als mögliche deregulierte Mechanismen

in dieser Erkrankung ins Spiel.

54

4.3.2. Mögliche Tumor suppressor-miR in AITL

In vielen Neoplasien wurde eine verminderte Expression von spezifischen microRNAs

gefunden. Diese microRNAs kommen als mögliche Tumorsuppressoren in Betracht

(116).

Grundsätzlich erscheint ein Funktionsverlust (loss-of-function) von Genen in der Onko-

genese weniger schwerwiegend als ein Funktionshinzugewinn (gain-of-function).

Ebenso gilt der Funktionsverlust als stärker altersabhängig (116). Wie microRNAs

herunterreguliert werden, konnte bisher nur für wenige spezifische Krebserkrankungen

belegt werden (s.o. 5q-Deletion in MDS).

Die vorliegende Studie ergab, dass die Expression von vier microRNAs, nämlich miR-

30b, miR-140-3p, let-7g und miR-664, in den Fällen angioimmunoblastischer T-Zell-

Lymphome signifikant niedriger ist, als in den verglichenen Proben von reaktiver

Lymphadenitis.

Was ist zu diesen microRNAs bereits bekannt, was im Hinblick auf angioimmuno-

blastische T-Zell-Lymphome relevant sein könnte?

Im Überblick gibt es für die vier zu diskutierenden microRNAs vergleichsweise sehr viel

weniger publiziertes Material als für die bereits beschriebenen möglichen Oncomirs.

Am interessantesten erscheint miR-30b . Diese microRNA wird auf Chromosom 8

codiert (www.mirbase.org). Insbesondere in kolorektalen Karzinomen wurde miR-30b

sowohl in vitro als auch in vivo als möglicher Tumorsuppressor identifiziert. Liao et al.

konnten zeigen, dass ihre Expression im Karzinom signifikant geringer ist, als in

vergleichbarem Normalgewebe. Auch war ein niedrigeres miR-30b-Level eng mit einer

schlechteren Differenzierung, einem höheren TNM-Stadium und einer schlechteren

Prognose des Tumors verknüpft (91). Auch zeigte sich miR-30b in Lebermetastasen

kolorektaler Karzinome im Vergleich zu den Primärtumoren herunterreguliert (175).

Hier allerdings bleibt die mutmaßliche Gewebsspezifität des microRNA-Profils zu

berücksichtigen. Die Überexpression von miR-30b in vitro wirkte sich zudem hemmend

auf die Zellmigration und Invasion aus und induzierte die Apoptose der

Kolonkarzinomzellen (91, 175).

Bridge et al. belegten experimentell, dass die Expression von Delta-like 4 (DLL4),

einem membranständigen Liganden des Notch-Signalweges, von miR-30b post-

transkriptionell gehemmt werden kann (17). DLL4 spielt eine wichtige Rolle in der

pathologischen Angiogenese und ist in Tumoren überexprimiert, oft in Assoziation mit

Markern der Entzündung und der Angiogenese (120, 121). In Kaposi-Sarkom-Herpes-

Virus-infizierten lymphatischen Endothelzellen wurde die simultane Hochregulation von

55

DLL4 und Suppression von miR-30b beschrieben (17). Weitere Beobachtungen der

Gruppe um Bridge enthüllten, dass DLL4 und miR-30 insbesondere in Tumortypen mit

mittelhoher und hoher Vaskularität negativ korreliert sind und dass die miR-30-Familie

indirekt in vivo den VEGFA-Signalweg kontrollieren kann (17).

Die Recherche bestätigt somit miR-30b auch in anderen Geweben als möglichen

Tumorsuppressor und stellt eine prognostische Relevanz der microRNA in Aussicht.

Außerdem weist die Suppression von miR-30b in den AITL-Fällen auf den angio-

genetischen Marker DLL4 hin, dessen Expression und Funktion in AITL im Hinblick auf

die erhöhte Neovaskularisation in befallenen Lymphknoten bedeutsam sein könnte.

Auch miR-140-3p kommt als tumorsupprimierender Faktor in AITL in Betracht, da ihre

Expression in diesen Lymphknoten signifikant im Vergleich zur nicht-neoplastischen

Kontrollgruppe herunterreguliert ist. Auch in Osteosarkom-, Kolon- (144), Mamma-

(174) und nicht kleinzelligem Lungenkarzinom-Zell-Linien (172) wurden erniedrigte

Level von miR-140-3p beobachtet. In Geweben von Basalzellkarzinomen und kutanen

Plattenepithelkarzinomen (137, 138) sowie nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen

(172) fanden sich die Level von miR-140-3p ebenfalls erniedrigt. In Kaposi-Sarkomen

konnten O’Hara et al. dagegen zeigen, dass miR-140-Level progressiv mit dem Grad

der Transformation steigen und höhere, aggressivere Stadien der Erkrankung mit

höheren miR-140-Leveln assoziiert sind (112).

Als mögliche Ziele von miR-140 wurden in diesen Studien SOX2, ein Tran-

skriptionsfaktor in embryonalen Stammzellen, und Insulin-like Growth Factor Receptor

Typ I (IGF1R) identifiziert.

Interessant ist, dass diesen beiden Zielstrukturen, im Hinblick auf periphere T-Zell-

Lymphome, bisher nur in Zelllinien ALK-positiver anaplastischer großzelliger

Lymphome eine potentielle onkogene Rolle in Verbindung mit dem entitätseigenen

Fusionsprotein NPM-ALK zukommt (53, 141).

Die microRNA let-7g wird auf Chromosom 3 codiert (www.mirbase.org). In Publika-

tionen, gelistet in der online-Datenbank pubmed, wird sie ganz überwiegend als

möglicher Tumorsuppressor geführt. Eine verringerte Expression von let-7g ging

sowohl bei Brustkrebs-Patienten als auch bei Menschen mit Hepatozellulärem

Karzinom (HCC) mit einer höheren Metastasierungsrate und einem schlechteren

Gesamtüberleben einher (69, 129). Eine Hochregulation von let-7g in Magenkarzi-

nomen war mit einer besseren Chemosensitivität des Tumors assoziiert und macht so

diese microRNA zu einem potentiell nützlichen Biomarker mit dem man die individuelle

Krebstherapie steuern kann (73).

56

Wegweisend könnte auch das Verhalten von let-7g in nicht-kleinzelligem

Lungenkarzinom sein: In Adenokarzinomen der Lunge war let-7g insgesamt herunter-

reguliert, am stärksten jedoch in der Gruppe, die weder EGFR- noch K-RAS-

Mutationen zeigte, was auf die Korrelation von let-7g - und microRNAs generell – mit

dem Mutationsstatus in Malignomen aufmerksam werden lässt (33).

Zuletzt bleibt miR-664 zu erwähnen. Sie wird auf Chromosom 1 codiert

(www.mirbase.org) und tritt bisher in Onlinedatenbanken kaum in Erscheinung. Bisher

validierte Ziele der microRNA (vier an der Zahl) sind nur auf der Plattform

„miRWalk“ abrufbar und werden nahezu ausschließlich in einer einzigen Publikation

genannt, die Vorhofflimmern in Hunden und Menschen zum Thema hat (98). In

vereinzelten Studien konnte die Hochregulation von miR-664 mit einer schlechteren

Prognose im Hepatozellulären Karzinom und mit der Proliferation von Prolactinomen

der Hypophyse in Verbindung gebracht werden (28, 168). Wang et al. zeigten dagegen,

dass miR-664 in metastasierten papillären Schilddrüsenkarzinomen höher exprimiert

wird als in nicht-metastasierten Karzinomen gleicher Art (162).

Zu erwähnen ist, dass miR-664 die einzige der signifikant aberrant exprimierten

microRNAs ist, die mit Array B der RT-qPCR detektiert worden ist. Mit diesem Array

wurden vom Hersteller die erst kürzlich entdeckten microRNAs berücksichtigt (27). Das

heißt auch, dass auf diese microRNA in älteren Studien eventuell noch gar nicht

getestet werden konnte, da die microRNA noch nicht bekannt und ein entsprechender

Primer nicht verfügbar war. Weitere Untersuchungen, auch bereits auf ihr microRNA-

Profil hin analysierter Tumorentitäten, mit aktualisierten Primersets könnte den hier

entstandenen Diskussionsschwerpunkt auf microRNAs des Arrays A verschieben.

4.3.3. Vorsicht bei der Auswahl der endogenen Kontr olle und Normalisierungsmethode in AITL

RNU44 ist eine kleine nukleoläre, nicht protein-codierene RNA (snoRNA) mit etwa 70

Nukleotiden Länge. Zusammen mit den weiteren sn/snoRNAs RNU48, U47 und

RNU6B wird sie von Applied Biosystems als endogene Kontrolle für die Normalisierung

von Daten, erhoben mit TaqMan® MicroRNA Assays, mittels der ∆CT-Methode

empfohlen, da sie in zahlreichen Normalgeweben konstitutiv und wenig variabel

exprimiert wird (164).

Auch in der vorliegenden Studie wurde ihre Expression automatisch bei Verwendung

der TaqMan® Array Human MircoRNA A+B cards mitbestimmt.

57

Allerdings kam nach Beratungen mit Experten der Statistik bei der Auswertung nicht

die ∆CT-Methode, sondern die Quantilnormalisierung zum Einsatz und RNU44 ergab

sich als signifikant geringer exprimierte snoRNA in den AITL-Fällen im Vergleich zu der

nicht-neoplastischen Kontrollgruppe. Diese Beobachtung weist auf die generelle

Problematik der Verwendung von endogenen Kontrollen und die Normalisierungs-

methode in Zusammenhang mit microRNA Arrays hin.

Grundsätzlich sind alle Normalisierungsmethoden besser als gar keine (127). Eine

Normalisierung soll Abweichungen durch nicht-biologische Einflüsse reduzieren und ist

für Experimente mit multiplen Arrays notwendig (15).

Valleron et al. jedoch konnten zeigen, dass snoRNAs in benignen und malignen T-Zell-

Populationen unterschiedlich exprimiert werden und spezifische Signaturen sogar

prognostische Relevanz haben (156). Auch Gee et al. fanden heraus, dass ins-

besondere für niedrige Level von RNU44 in Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und

Halses sowie Mammakarzinomen eine starke Korrelation mit einer schlechten

Prognose besteht (52). Sie beobachteten weiterhin, dass die Verwendung der

snoRNAs als Referenzgene in der microRNA-Expressionsanalyse Verzerrungen und

Tendenzen hervorrufen können, zeigen jedoch keine Alternativen auf (52). Anders Qin

et al., die die Entwicklung besserer Normalisierungsmethoden in der microRNA Array-

Analyse anmahnen und insbesondere die Vorteile der Quantilnormalisierung nennen

(130).

4.3.4. MicroRNA und Subgruppen

Die Analyse der a posteriori definierten und sich überschneidenden Subgruppen ist

schwierig zu interpretieren und bei der kleinen Fallzahl von hochexplorativem

Charakter, egal ob für multiples Testen adjustiert wurde oder nicht.

Wichtig erscheint festzuhalten, dass auf lokalem nach Holm adjustiertem Signifikanz-

level in der Subgruppenanalyse die Nullhypothese für keine microRNA zurückgewiesen

werden konnte. Dies betrifft sowohl die Subgruppen, die sich nur auf die neoplastische

T-Zell-Population beziehen (Stathmin-, PD1-, CD10-Positivität/Negativität), als auch

diejenigen, die Merkmale des Mikromilieus widerspiegeln (Anwesenheit EBV-positiver

B-Blasten, Proliferation der Gefäße, Expansion der FDC, histomorphologisches

Muster).

Letztendlich war das grobe Ziel der Subgruppenanalyse herauszufinden, ob die

microRNA-Expression in der Lymphknotenprobe sich einem oder mehreren dieser

Merkmale unterwirft. Die Erwartung war z.B., dass es einen signifikanten Unterschied

in der microRNA-Expression geben würde, in Abhängigkeit davon, ob in der Probe

58

EBV-positive B-Blasten vermehrt sind oder nicht, da einige microRNAs (z.B. miR-146a)

durch das Virus induziert werden können. Auch lag es nahe anzunehmen, dass sich

die microRNA-Level mit zunehmener Architekturstörung des Lymphknotens

(klassifiziert anhand des histomorphologischen Musters) verändern würden. Leider war

jedoch eine Klassifikation aufgrund der geringen Gruppengrößen und des inkompletten

Datensatzes nicht sinnvoll möglich.

Dass das Mikromilieu keine Auswirkung auf die microRNA-Expression haben soll, wie

es die statistische Auswertung hier möglicherweise suggeriert, ist schwer vorstellbar.

Um jedoch aus dem mircoRNA-Profil ähnlich wie aus dem mRNA-Profil der AITL, die

Signaturen der einzelnen Zell-Komponenten und Signalwege, die das Lymphom

charakterisieren, herauszufiltern, bedarf es größer angelegter Studien und sehr viel

mehr Wissen um die einzelnen microRNAs.

Ein nicht zu übersehender Punkt ist auch, dass sich die Kontroll-und Testgruppe in der

Alterszusammensetzung unterscheiden. Die Patienten der Kontrollgruppe sind im

Schnitt 32,9 Jahre jünger als die Patienten des AITL-Kollektivs (36,6 Jahre versus 69,5

Jahre).

Das Alter der Patienten ist bei Beurteilung von Lymphknotenvergrößerungen, die

letztendlich zu einer Lymphknotenbiopsie führen können, von entscheidender

Bedeutung. Bei Kindern sind die meisten Lymphadenopathien gutartig; wohingegen bei

Erwachsenen die Wahrscheinlichkeit für ein Malignom mit dem Alter steigt (54, 84).

Reaktive lymphatische Hyperplasien sind zudem bei älteren Menschen („elderly“)

aufgrund der Unterdrückung der humoralen Immunantwort im Alter ungewöhnlich (70).

In die vorliegende Studie wurden deswegen nur Lymphknoten

Erwachsener,„adulter“ und „älterer“ Personen, einbezogen (vgl. (99)).

Das Gruppenmatching erfolgte mit Fokus auf dem histologischen Bild. Als

definierendes Merkmal der Kontrollgruppe wurde die Diagnose Lymphadenitis mit T-

Zonen Hyperplasie gewählt, da deren histologisches Bild, Zellzusammensetzung und

Struktur, stark dem des angioimmunoblastischen T-Zell Lymphoms (Muster 1) ähnelt

und sogar ein Kontinuum nicht ausgeschlossen ist (46, 75). Die Probenauswahl

konzentrierte sich entsprechend auf die Krankheitsentität und Organspezifität

(Lymphknoten). In einem zweiten Schritt wurde dann die Verfügbarkeit, Qualität und

Repräsentanz des Materials evaluiert.

Somit ist letztendlich der Altersunterschied der Fall- und Kontrollgruppe das Resultat

und der Kompromiss aus Biologie und der Probenverfügbarkeit.

Natürlich sind auch die Ergebnisse der Studie vor dem Hintergrund des

Altersunterschieds kritisch zu bewerten. Die Gruppengröße war zu klein als dass eine

59

Subgruppenanalyse hinsichtlich des Alters Sinn gemacht hätte. Das Alter hätte

beginnend bei der Probenauswahl stärker angeglichen werden müssen. Dies war

jedoch aus o.g. Gründen nicht möglich.

Biologisch kann Altern als Zeit-abhängige Minderung der physiologischen Funktion

eines Organismus beschrieben werden (96). Multiple Faktoren sowohl auf dem

molekularen als auch zellulären Level tragen zu dem Verlust der physiologischen

Integrität mit dem Alter bei (z.B. Telomer-Verkürzung, epigenetische Veränderungen,

Signalwege, die den Alterungsprozess regulieren, verminderte Mitochondriale Funktion,

vermindertes regeneratives Potential) (93).

Das Altern betrifft alle Komponenten des Immunsystems auf unterschiedlichen Ebenen

(16)- auch microRNAs (55, 93). Allerdings ist das alternde Immunsystem nicht nur

durch die erwähnten zellulären und molekularen Veränderungen charakterisiert,

sondern auch von der Antigenexposition, die ein Individuum zeit seines Lebens erfährt

(93). Der Einfluss des Alterns auf das microRNA-Expressionsprofil, noch dazu unter

Berücksichtigung der Organspezifität, erscheint dadurch vielfältig.

Gerade im Hinblick auf Lymphknoten, die im Laufe des Lebens auf eine Vielzahl von

Antigenen und Allergenen (u.a. Bakterien, Viren, Chemikalien, Umweltgifte, Drogen,

Medikamente) reagieren (117) sowie aufgrund der Tatsache, dass wir immer nur eine

Momentaufnahme der Veränderungen untersuchen, muss zusätzlich bedacht werden,

dass durch das Altersmatching lediglich eine Art Pseudosicherheit erzeugt worden

wäre. So haben unterschiedliche medizinische Studien gezeigt, dass microRNAs

sensitiv sind für Umwelteinflüsse, wie Luftverschmutzung, Zigarettenrauch,

Nanopartikel und Chemikalien (zusammengefasst in (160)).

4.4. Limitationen der Arbeit und Ausblick

Die Erforschung angioimmunoblastischer T-Zell-Lymphome ist aufgrund ihrer Rarität

und Komplexität sowie der Heterogenität ihres Erscheinungsbildes anspruchsvoll.

Im Rahmen einer experimentellen Promotionsarbeit aus dem Fachbereich der Medizin

stößt man dadurch leicht an Grenzen. Zum Beispiel ist die Anzahl der untersuchten

Fälle mit insgesamt 40 paraffineingebetteten Lymphknotenproben eher klein, sodass

statistisch ermittelte Aussagen und die Übertragbarkeit auf die gesamte Lymphom-

entität nur unter Vorbehalt möglich sind. Ebenfalls wäre die Ergänzung und Korrelation

der erhobenen Daten mit weiteren klinischen Angaben insbesondere zum Verlauf der

Erkrankung wünschenswert gewesen. Auch im Hinblick auf die Auswahl der nicht-

neoplastischen Kontrollgewebe wäre hierdurch möglicherweise ein multifaktorielles

60

matching möglich geworden, was jedoch eventuell lediglich eine Art „Pseudo-

sicherheit“ erzeugt hätte.

Die in-silico Recherche in der Datenbank Pubmed ergibt bei Eintrag der Suchbegriffe

„AITL [AND] microRNA“ bisher (Stand Juni 2014) einen einzigen Treffer: Eine

Veröffentlichung von Liu et al. in der Zeitschrift „blood“ aus dem Jahr 2013 über die

microRNA-Signatur von anaplastischen großzelligen Lymphomen (ALCL) in Abgrenz-

ung zu weiteren PTCL-Subgruppen, die auch 9 AITL-Fälle berücksichtigt (94).

Legt man die Erkenntnisse von Liu et al. zugrunde, wurden bereits 5 der 7 microRNAs

(miR-146a, miR-34a, miR-193b, miR-30b, let-7g), deren Expression wir für AITL als

signifikant aberrant ermittelt haben, nicht nur als wichtige Bestandteile der CD3+T-Zell-

Signatur, sondern auch der anderer nodaler peripherer T-Zell-Lymphome beschrieben

(94). Desweiteren stellt eine sechste microRNA unseres Profils (miR-140-3p) den

komplementären Strang zu miR-140-5p dar, die als eine der am stärksten exprimierten

microRNAs in der Schnittmenge von normalen CD3+T-Zellen und ALK-negativen

ALCLs in der Studie von Liu et al. genannt wird. Hierzu ist interessant zu wissen, dass

viele microRNAs einer Familie dieselbe seed sequence einer Ziel-mRNA erkennen

können (116).

Natürlich sind die beiden Studien nur unter großem Vorbehalt vergleichbar. Und auch

die weiteren oben aufgeführten Diskussionspunkte bezüglich der microRNA-

Expression der vorliegenden Arbeit müssen unter dieser Prämisse gesehen werden.

Die Ursachen für Variabilität im Hinblick auf RT-qPCR-basierten Studien sind gut

bekannt und erstrecken sich vom Studien-Design über technische bis hin zu bio-

logischen Variablen (19). Auch die Daten-Analyse insbesondere die Normalisierung

der erhobenen Daten ist bisher nicht vereinheitlicht worden (19, 140). Becker et al.

meinen sogar, dass es kaum möglich ist, die wahre Menge einer microRNA exakt in

einer biologischen Probe mit den existierenden Methoden zu messen (12).

Mit Veröffentlichung der MIQE-Guidelines durch Bustin et al. 2009, die eine Checkliste

beinhalten, welche minimalen Informationen für die Publikation von Ergebnissen von

RT-qPCR-Experimenten notwenig sind, ist jedoch ein Leitfaden verfügbar, der die

Seriösität, Integrität und Transparenz der Resultate sichern soll (20).

Außerdem gilt die von uns und von Liu et al. verwendete Methode der quantitativen

RT-PCR (TaqMan) als Goldstandard im Hinblick auf die microRNA-Messung (140). Sie

wird zudem als Validierungsmethode von Mircoarray-Daten eingesetzt (140). Unter den

RT-qPCR-Methoden wurde für die vorliegende Arbeit - und auch von Liu et al. - die

stem-loop RT-qPCR basierend auf TaqMan Arrays (kommerziell erhältlich über Applied

Biosystems) verwendet, die die hohe Sensititivität der stem-loop RT-PCR mit der

61

Möglichkeit, die Expression einer großen Anzahl von microRNAs zu messen, in einem

einzigen Experiment kombiniert (27). Chen et al. konnten für diese Methode eine hohe

Reproduzierbarkeit und eine sehr viel höhere Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu

Microarrays feststellen (27). Auch bei dem Vergleich von Reverse-Transkriptase-Reak-

tionen und qPCR-Arrays, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, zeigte

sich keine signifikante Variation der Ergebnisse (27). Vor diesem Hintergrund können

die beschriebenen Überschneidungen unserer Daten mit denen von Liu et al. vorsichtig

als ein Zeichen der Validität unserer Ergebnisse interpretiert werden.

Das bunte Zellbild in den Lymphknoten mit AITL, wo der Anteil der neoplastischen T-

Zellen schwankt und sehr gering sein kann, wirft zudem die Frage auf, wie ein

microRNA-Profil bei Heterogenität des Gewebes zu werten ist. Und ob die Mikro-

dissektion der neoplastischen T-Zellen aus dem Gewebe im Hinblick auf das Ver-

ständnis der Lymphomentstehung die bessere Wahl gewesen wäre. Gleichzeitig

müsste jedoch gerade in der Erforschung peripherer T-Zell-Lymphome, in denen das

Mikromilieu aus nicht-neoplastischem Begleitinfiltrat und Stroma in Wechselwirkung mit

den Tumorzellen als „emerging theme“ eine große Rolle zu spielen scheint (50),

besondere Berücksichtigung finden. Hier wären Klassifikationsverfahren, wie sie bei

Gen-Expressionsanalysen von AITL bereits zum Einsatz gekommen sind und die die

Signatur der verschiedenen Komponenten der Lymphomerkrankung erkennen konnten,

hilfreich (vgl. hierzu (66)).

An Grenzen stieß diese Arbeit auch bei der Suche nach eventuellen Zielen der

aberrant exprimierten microRNAs. Hier wurde die Recherche lediglich auf

Publikationen in der Datenbank Pubmed beschränkt. Natürlich wurden auch ver-

schiedene online- Plattformen wie „miRWalk“ konsultiert, die validierte und durch ver-

schiedene Algorithmen vorhergesagte Zielgene für microRNAs auflisten. Aufgrund der

Unmenge an möglichen Zielstrukturen, kamen wir jedoch schnell zu der Einsicht, dass

eine sinnvolle Untersuchung auf Zielstrukturen der microRNA nur in Korrelation mit

Genexpressionsanalysen und den damit verbundenen Klassifikationsverfahren möglich

ist. Eine zukunftsträchtige Methode wäre zum Beispiel die von Suzuki et al. kürzlich

entwickelte GSEA-FAME (GFA)-Analyse (Gene set enrichment analysis and functional

assignment of microRNAs via enrichment analysis) (147).

Ebenfalls von Interesse könnte die Kopplung von microRNA-Expressionsuntersuch-

ungen mit CGH-Analysen sein, um eventuellen zytogenetischen Veränderungen als

Ursache einer microRNA-Deregulation auf die Spur zu kommen.

Der Charakter der vorliegenden Studie ist demnach als hochexplorativ anzusehen.

62

5. Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden explorativ angelegten Arbeit war die nähere Charakterisierung

des seltenen, aggressiven und nach wie vor prognostisch ungünstigen angioimmuno-

blastischen T-Zell-Lymphoms im Hinblick auf die Morphologie, den immunhisto-

chemischen Phänotyp der neoplastischen T-Zellen und das molekulare Profil.

Hierbei kamen sowohl praxisnahe Methoden, wie die immunhistochemische Gewebs-

färbung, als auch bisher nur in der Forschung angewendete Methoden, wie die quanti-

tative Real-time PCR für microRNA, zum Einsatz.

Entsprechend sind die gewonnenen Ergebnisse teils praxisnah, teils als zukunfts-

weisend für weitere Forschungsvorhaben anzusehen.

Der Schwerpunkt lag hier auf der erstmaligen Erstellung eines isolierten microRNA-

Profils der Lymphomerkrankung und dem Vergleich mit dem des nicht-neoplastischen

Kontraparts anhand von insgesamt vierzig formalinfixierten und in Paraffin-einge-

betteten Lymphknotenproben (davon 30 AITL-Fälle und 10 Fälle von Lymphadenitiden

mit T-Zonen Hyperplasie als nicht-neoplastische Kontrolle).

Unter Berücksichtigung der aufgezeigten Limitationen der Arbeit, konnten so miR-146a,

miR-34 und miR-193b als mögliche Oncomirs sowie miR-30b, miR-140-3p, let-7g und

miR-664 als mögliche tumorsuppressive microRNAs in AITL identifiziert werden. In

Abgleich mit Ergebnissen der Recherche in der Online-Datenbank pubmed, verweisen

diese aberrant exprimierten microRNAs insbesondere auf den NFkappaB- sowie den

Ras-Signalweg als mögliche deregulierte Wirkungspfade in der Erkrankung.

Ebenso machen sie auf die Rolle viraler Infektionen (namentlich EBV und KSHV) als

möglicherweise onkogene Faktoren in AITL aufmerksam, da einige der beschrieben

microRNAs von den Viren nachweislich induzierbar sind. Darüber hinaus rückt durch

die Untersuchungen auch VEGF in Verbindung mit dem angiogenetischen Marker

DLL4 in den Fokus für weitere Untersuchungen. Zusätzlich finden sich Parallelen und

Überschneidungen zu microRNA-Profilen der Autoimmunerkrankungen systemischer

Lupus erythmatodes und rheumatoider Arthritis sowie zu denen von weiteren

peripheren T-Zell-Lymphomen.

Die ebenfalls signifikante Herunterregulation von RNU44, einer vielfach verwendeten

endogenen Kontrolle in microRNA-Expressionsanalysen, regt zudem die Debatte um

die Gültigkeit ihrer Verwendung im Allgemeinen an und könnte auf einen Vorteil der

Quantilnormalisierung hinweisen.

Die hier vorgenommenen Analysen zur Darstellung eines Zusammenhangs zwischen

microRNA-Profil und verschiedenen histomorphologischen und immunhistochemischen

63

Charakteristika, sowohl der neoplastischen T-Zell-Population als auch des Mikromilieus,

erbrachten überraschenderweise keine signifikante Korrelation.

Dies warf die grundsätzliche Frage auf, ob heterogene Gewebsproben, die wie das

AITL im Lymphknoten mit einem bunten nicht-neoplastischen Begleitinfiltrat und einer

ausgeprägten Stromakomponente einhergehen, überhaupt für eine microRNA-

Expressionsanalyse geeignet sind. Eine Lösung dieser Problematik wäre hier die

Kopplung an Gen-Expressionsanalysen und die einhergehenden Klassifikations-

verfahren, um das Mikromilieu auch auf microRNA-Ebene, insbesondere in hetero-

genen Tumoren wie peripheren T-Zell-Lymphomen, nicht unberücksichtigt zu lassen.

Abschließend empfahl sich in unseren praxisnahen Analysen der Antikörper gegen

Stathmin als sinnvolle Ergänzung im Panel der immunhistochemischen Marker zur

Detektion und Charakterisierung der neoplastischen T-Zell-Population in AITL.

64

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81

7. Anhang

7.1. Material

7.1.1. Geräte

Beschreibung Name Hersteller

Abzüge Captair 5000NU Captair

Filtersysteme

Array-Verschlussapparat Low Density Array Sealer Applied Biosystems

Automat für

immunhistochemische

Färbungen und in-Situ-

Hybridisierung

Bond Max Automated

Immunhistochemistry and

in-situ-Hybridisation

System

Menarini

Brutschrank (verschiedene) Memmert

Computer (verschiedene) HP

Dampfgarer Multi Gourmet Braun

Feuchte Kammer k.A. CarlRoth

Gefrierschränke (verschiedene) Bosch, Liebherr

Heizplatten (verschiedene) Gerhardt, Medax,

Digsi-Therm

Kühlplatte Parafreezer Pathotec GmbH

Kühlschränke (verschiedene) Bosch, Liebherr

Magnetrührer Combimag-RCO Ikamag

Markierungsstift Dako Pen Dako

Mehrkanalpipetten Eppendorf Research®

Plus, verschiedene

Größen

Eppendorf

Mikroskop Axioskop Zeiss

Mikroliter-Pipetten Einkanalmikroliterpipetten

Eppendorf Research®

Eppendorf

Minischüttler Minishaker Sarstedt

Multifärber Leica ST5020 Leica

Objektträger (verschiedene) Leica

Paraffin-Ausgießstation TES 99.250 Medite

pH-Meter PH 537 WTW

Tischzentrifugen verschiedene Sarstedt, Beckman,

82

Heraeus

Instruments,

Eppendorf

Real-Time PCR-System 7900 HT Fast Real-Time

PCR System

Applied Biosystems

Rotationsmikrotom DSC1 Leica

Schüttler Rockomat TecNoMara

Thermocycler T1 Thermocycler Biometra

Thermomixer (verschiedene) Gerhardt, Eppendorf

Tissue Microarray - Herstellung Tissue-Tek® Quick-Ray

Tissue Microarray

System

Sakura Finetek

UV-Spektrometer Nanodrop 585 Nanodrop

Technologies

Vortexer IKA Genius IKA

Waagen (verschiedene) Ohaus, Kern

Wasserbäder (verschiedene) GFL, Köttermann

Labortechnik

Zentrifuge mit Karteneinsätzen Heraeus Instruments

Tabelle 11 Geräte

7.1.2. Verbrauchsmaterialien Beschreibung Name Hersteller

Einbettkassette Rotilabo® CarlRoth

Klebefolie, optisch

klar

(verschiedene) Sarstedt, Roche

Diagnostics

Mikroreaktionsgefäße (verschiedene Größen) Sarstedt

Pipettenspitzen (Verschiedene Größen) Sarstedt

Pipettenspitzen mit

Filter

(Verschiedene Größen) Sarstedt

RNAse

Entfernungsmittel

RNase ZAP 2020 Sigma Sigma-Aldrich

Wägeschälchen k.A. Hassa

Tabelle 12 Verbrauchsmaterialien

83

7.1.3. Reagenzien und Chemikalien Beschreibung Name Hersteller

Ammoniaklösung 25% Merck

Ammonium-Eisen-III-Sulfat Merck

Antigendemaskierungsreagenzien Novocastra™/Bond™

Epitope Retrieval

Solutions

Novocastra, Leica

Biosystems

Antikörperverdünnungslösung Antibody Diluent DAKO

Anti-Fluorescein-Antikörper Gebrauchsfertige Bond™ Anti-Fluor-escein Antibody 15ml

Leica Biosystems

Aqua dest (hauseigen)

Chromogen Bright DAB Chromogen ImmunoLogic

EBER-Detektionssonde Bond™ ISH Probe

EBER Probe

Leica Biosystems

Eindeckmittel Pertex Medite

Entparaffinierungslösung Novocastra Bond

Dewax Solution

Leica Biosystems

Eosin Eosin, yellowish Waldeck

Ethanol Leica, Büfa

Chemikalien

Formalin Formalin 4,5% und 37% Fluka, Riedl de Haen

Giemsa Stammlösung Giemsas Azur-Eosin -Mehtylenblau-Lösung

Merck

Goldchlorid Merck

Hämatoxylin Haemalaun, sauer nach

Mayer

Waldeck

Kaliumdisulfidlösung Waldeck

Kaliumpermanganat Merck

Kernechtrot Chroma

Methanol Merck

Natriumhydroxid Merck

Natriumthiosulfat Merck

Nukleasefreies Wasser DEPC, treated water Ambion

Oxalsäure Merck

84

Paraffin Medite Pure™ Paraffin Medite

Perjodsäure AnalaR Normapur VWR Chemicals

Proteinase K S 2019 DAKO

Puffer Tris Puffer pH 7,2-7,6 DAKO

Puffer Puffer pH 9,0 Novocastra

Schiffs Reagenz Merck

Silbernitrat Caelo

Waschpuffer Bond™ Waschlösung 10x

Leica Biosystems

Xylol 100% J.T. Baker, Büfa Chemikalien

Tabelle 13 Reagenzien und Chemikalien

7.1.4. Kits Name Hersteller

Bond™ Enzyme Pretreatment Kit Leica Biosystems

Bond™ Polymer Refine Detection Leica Biosystems

Bright DAB ImmunoLogic

Bright Vision + Poly- HRP- Anti Ms/Rb/Rt IgG Biotinfrei ImmunoLogic

Recover All™ Total Nucleic Acid Isolation Ambion

TaqMan® Array Human MircoRNA A+B cards v3.0 Applied Biosystems

TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase®

UNG

Applied Biosystems

Tabelle 14 Kits

7.1.5. Antikörper Antikörper Klon Hersteller

CD3 SP7 Lab Vision

CD10 C56C6 Novocastra

CD20 L26 Lab Vision

CD21 2G9 Cellmarque

CD23 SP23 Thermo Scientific

LMO2 SP51 Cellmarque

PD1 MRQ-22 Cellmarque

Stathmin SP49 DCS

Tabelle 15 Antikörper

85

7.1.6. Primer Name Hersteller

Megaplex RT Primer, human pool A v2.1 Applied Biosystems

Megaplex RT Primer, human pool B v3.0 Applied Biosystems

Tabelle 16 Primer

7.1.7. Software Name Hersteller

Endnote V6..0.1 Thomson Reuters

Excel Microsoft

Nexus Pathologie NEXUS AG

R v3.0.2 r-project.org

RQ-Manager 1.2.1 Applied Biosystems

SDS Software v.2.2.2 Applied Biosystems

Thermocycler Management Software Biometra

Word Microsoft

Tabelle 17 Software

7.1.8. In silico Ressourcen Name URL Provider

mirbase http://www.mirbase.org/ University of Man-

chester, Faculty of Life

Science

miRWalk http://www.umm.uni-

heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/

Ruprecht-Karls-Univer-

sität Heidelberg, Medizi-

nische Fakultät Mann-

heim

Pub med http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ US National library of

Medicine National Insti-

tutes of Health

Tabelle 18 In-silico Resourchen

86

7.2. Ergänzende Tabellen und Abbildungen

Fall Alter Geschlecht Pattern Venolen CD23/21 (FDC)

1 65 m 2 2 1 2 68 m 2 1 1 3 79 w 2 1 3 4 45 m 2 1 2 5 69 m 3 2 2 6 69 m 3 2 3 7 80 w 2 3 1 8 72 m 3 3 NA 9 72 w 3 2 3

10 73 m 3 3 3 11 43 m 2 2 2 12 79 w 3 3 2 13 73 w 2 2 2 14 57 m 3 3 2 15 69 m 2 2 2 16 72 w 3 3 2 17 90 w 3 3 3 18 78 w 3 3 2 19 71 m 1 1 1 20 77 m 3 2 2 21 79 w 2 3 1 22 75 w 2 2 NA 23 51 w 1 2 1 24 72 m 2 2 1 25 52 w 3 3 3 26 82 w 2 3 3 27 67 m 2 1 2 28 63 m 3 1 3 29 68 m 1 1 1 30 75 m 2 2 2

Tabelle 19 Patienten-Charakteristika und Ergebnisse der Graduierungen

87

Fall-Nr. Stathmin CD10 LMO2 PD1 1 positiv positiv negativ positiv 2 positiv negativ negativ positiv 3 positiv negativ negativ negativ 4 positiv negativ negativ positiv 5 positiv negativ negativ positiv 6 positiv negativ negativ positiv 7 positiv negativ negativ positiv 8 positiv negativ negativ positiv 9 positiv negativ negativ positiv

10 positiv positiv negativ positiv 11 positiv negativ negativ negativ 12 negativ negativ negativ positiv 13 positiv negativ negativ positiv 14 positiv negativ negativ positiv 15 NA negativ NA NA 16 negativ positiv negativ negativ 17 positiv negativ negativ positiv 18 negativ negativ negativ positiv 19 negativ negativ negativ positiv 20 positiv negativ negativ positiv 21 negativ negativ negativ negativ 22 positiv negativ negativ positiv 23 negativ negativ negativ positiv 24 positiv negativ negativ positiv 25 positiv positiv negativ positiv 26 negativ negativ NA NA 27 positiv negativ negativ positiv 28 NA negativ NA NA 29 positiv negativ negativ positiv 30 negativ negativ NA positiv

Tabelle 20 Ergebnisse der immunhistochemischen Ausw ertung anhand des tissue microarrays

Kontrolle Nr. Alter Geschlecht

1 67 m 2 58 m 3 31 w 4 41 m 5 27 w 6 23 w 7 38 w 8 16 m 9 48 w

10 17 w

Tabelle 21 Charakteristika der Kontrollgruppe

88

Abbildung 20 TaqMan Human MicroRNA Array A übernommen von www.appliedbiosystems.com

89

Abbildung 21 TaqMan Human MicroRNA Array B übernommen von www.appliedbiosystems.com

90

Abbildung 22 Boxplot der CT-Werte pro Platte


Tabelle 22 Ergebnisse der Präprozessierung

nach verschiedenen Schwellen der prozentualen Ausfallquote (missing fraction, MiF). Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Gola und Schillert

91

microRNA/Probe 1 2 3 K1 4 5 6 K2 7 8 RNU44-001094 37,096 30,981 45 27,147 28,387 32,965 31,94 25,787 32,778 28,283 hsa-miR-146a-000468 25,952 24,357 28,496 45 23,155 45 26,264 23,518 25,639 25,256 hsa-miR-34a-000426 31,683 29,247 30,46 29,208 27,193 29,591 29,202 30,064 31,417 30,931 hsa-miR-193b-002367 31,239 29,448 29,634 28,749 28,289 29,349 29,497 28,009 30,285 28,828 hsa-miR-30b-000602 34,187 31,584 39,349 28,765 29,681 45 32,569 27,431 31,588 29,815 hsa-let-7g-002282 35,282 31,452 35,31 28,315 29,769 34,046 34,112 26,699 31,095 29,499 hsa-miR-140-3p-002234 37,029 34,697 37,821 31,617 32,4 35,973 35,129 30,068 34,139 32,732 hsa-miR-664-002897 34,291 33,135 33,691 31,438 32,018 35,305 34,962 29,609 32,806 32,936

microRNA/Probe 9 K3 10 11 12 K4 13 14 15 K5 RNU44-001094 45 27,204 45 29,867 27,109 26,283 28,535 27,456 30,851 27,668 hsa-miR-146a-000468 30,345 24,18 32,048 25,969 23,012 23,871 25,579 23,948 24,502 25,449 hsa-miR-34a-000426 39,847 31,279 36,686 31,982 25,756 28,783 31,799 26,934 30,152 32,283 hsa-miR-193b-002367 31,286 29,88 33,217 30,121 25,737 27,82 29,433 27,372 29,706 29,9 hsa-miR-30b-000602 45 28,705 45 30,308 26,556 27,981 30,913 28,955 30,081 29,499 hsa-let-7g-002282 45 27,872 45 30,145 26,613 27,922 30,258 29,198 29,871 28,504 hsa-miR-140-3p-002234 45 31,054 45 33,491 29,963 30,239 33,003 31,494 33,046 31,785 hsa-miR-664-002897 35,324 32,642 34,142 30,91 29,036 29,245 30,841 29,619 31,04 31,457

92

microRNA/Probe 16 17 18 K6 19 20 21 K7 22 23 RNU44-001094 33,785 30,556 27,956 25,992 27,488 25,76 30,801 27,387 33,671 27,144 hsa-miR-146a-000468 26,008 25,939 22,977 23,594 24,245 23,498 26,757 24,913 26,338 22,265 hsa-miR-34a-000426 28,521 28,163 26,794 29,511 28,97 27,468 31,088 33,27 30,288 27,154 hsa-miR-193b-002367 28,727 28,846 27,215 28,353 28,494 26,73 29,363 28,716 28,629 27,035 hsa-miR-30b-000602 33,512 32,508 29,099 27,98 29,503 27,386 32,255 28,971 33,918 27,321 hsa-let-7g-002282 35,047 31,996 28,97 27,094 28,681 27,506 32,618 28,367 32,259 27,397 hsa-miR-140-3p-002234 34,663 35,611 31,576 30,268 32,137 30,899 36,093 31,085 38,335 30,971 hsa-miR-664-002897 31 45 29,795 29,488 29,302 29,229 32,236 30,464 33,121 29,252

microRNA/Probe 24 K8 25 26 27 K9 28 29 30 K10 RNU44-001094 26,164 28,353 30,662 28,314 28,042 27,517 27,954 45 32,115 28,248 hsa-miR-146a-000468 22,499 25,84 25,575 24,433 24,848 24,936 25,376 29,973 25,982 25,637 hsa-miR-34a-000426 28,867 33,125 29,972 30,718 29,829 30,126 32,753 35,538 30,856 33,763 hsa-miR-193b-002367 27,822 30,255 29,256 27,923 28,463 28,384 27,954 31,07 28,926 29,901 hsa-miR-30b-000602 28,528 30,092 32,279 29,716 29,569 28,529 30,228 45 33,396 30,109 hsa-let-7g-002282 28,142 28,957 31,067 29,801 29,196 27,714 29,735 36,448 33,211 29,092 hsa-miR-140-3p-002234 30,977 32,096 33,7 32,187 31,944 31,062 32,974 45 35,011 31,306 hsa-miR-664-002897 45 31,925 33,441 31,305 30,108 30,497 32,265 30,982 35,768 31,073

Tabelle 23 CT-Werte der Lymphom- und Referenz-Fälle

für die 8 verschiedenen aberrant exprimierten microRNAs und RNU44

93

Tabelle 24 Top 10 microRNAs für EBER

Nach p-Werten des Wilcoxon-Mann-Whitney-Tests, adjustiert mit der Bonferroni-Holm Prozedur inklusive der nicht-adjustierten 95%-Konfidenzintervalle der Differenz im Median Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Gola und Schillert

Tabelle 25 Top 10 microRNAs für Stathmin

Nach p-Werten des Wilcoxon-Mann-Whitney-Tests, adjustiert mit der

Bonferroni-Holm Prozedur inklusive der nicht-adjustierten 95%-

Konfidenzintervalle der Differenz im Median.


94

Tabelle 26 Top 10 microRNAs für CD10





Tabelle 27 Top 10 microRNAs für PD1





95

Tabelle 28 Top 10 microRNAs für die Proliferation d er HEV

Nach p-Werten des Kruskal-Wallis-Tests, adjustiert mit der Bonferroni-Holm

Prozedur


Tabelle 29 Top 10 der microRNAs für die Expansion d er FDC-Netzwerke


Prozedur


96

Tabelle 30 Top 10 der microRNAs für das histomorpho logische Muster


Prozedur


97

8. Danksagung

Ich danke von ganzem Herzen:

Herrn Prof. Alfred Feller für die Überlassung des Themas.

Herrn Prof. Christoph Thorns für seine stets offene Tür, seinen intelligenten

Pragmatismus und seine aufmunternden Kommentare („Wir sind auf einem guten

Weg...“).

Juliana Knief, mit der ich seit mehr als 4 Jahren durch dick- und dünn gehe.

Dr. Julika Ribbat-Idel für ihre Hilfe bei Computerproblemen und ihre mentale

Unterstützung (Nervennahrung).

Annette Aufseß für ihre großartige technische Unterstützung und ihre Erklärungen.

Damian Gola und Arne Schillert für die professionelle statistische Auswertung.

Dr. Niklas Gebauer für seinen Humor und sein Know-How, das er gerne stets mit mir

teilte.

Den Mitarbeitern des Eck- und Molekular-Labors.

Meinen Eltern und Großeltern, für alles was sie mir mitgegeben haben und immer noch

geben.

98

9. Lebenslauf

Name: Katharina Reddemann

Geburtsdatum: 19. April 1985

Geburtsort: Bonn

Staatsangehörigkeit: Deutsch

Ausbildungsverlauf:

1994 - 2004 St. Adelheid Gymnasium,

Bonn

10/2004 – 11/2010 Studium der Humanmedizin,

Rheinische Friedrich - Wilhelms - Universität Bonn

Praktisches Jahr:

08/2009 - 12/2009 Abteilung für Chirurgie,

Landspítali Universitätshospital Reykjavík, Island

12/2009 - 04/2010 Abteilung für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde und -Chirurgie,

Klinikum Lüdenscheid, NRW

04/2010 - 07/2010 Abteilung für Kardiologie, Klinikum Lüdenscheid, NRW

Anstellungen:

08/2011 – heute Ärztin in Weiterbildung im Fach Pathologie.

Institut für Pathologie, UKSH, Lübeck

Direktor: Prof. Dr. A.C. Feller

Promotion (vorliegend):

Thema: „Charakterisierung von angioimmunoblastischen T-Zell-Lymphomen auf

morphologischer, immunhistochemischer und molekularer Ebene mit Schwerpunkt auf

dem microRNA-Expressionsprofil“ seit August 2013

99

Publikationen:

Auszüge der vorliegenden Arbeit wurden publiziert in:

Reddemann K, Gola D, Schillert A, Knief J, Kuempers C, Ribbat-Idel J, Ber S,

Schemme J, Bernhard V, Gebauer N, Feller AC, Thorns C. Dysregulation of

microRNAs in angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Anticancer Res. 2015

Apr;35(4):2055-61.

Knief J, Gebauer N, Bernard V, Schemme J, Reddemann K, Gebauer J, Rades D,

Brabant G, Lehnert H, Feller AC, Thorns C. Oncogenic mutations and chromosomal

aberrations in primary extranodal diffuse large B-cell lymphomas of the thyroid - a

study of 21 cases. J Clin Endocrinol Metab. 2014 Nov 25:jc20143250.

100

10. Erklärung

Gemäß §9 Abs. 1 der Promotionsordnung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne fremde Hilfe im Institut für

Pathologie unter Betreuung durch Herrn Prof. Dr. med. Christoph Thorns angefertigt

und keine anderen als die in der Arbeit genannten Hilfsmittel benutzt habe.

Ich habe weder anderweitig versucht eine Dissertation einzureichen oder eine

Doktorprüfung durchzuführen, noch habe ich diese Dissertation oder Teile derselben

einer anderen Prüfungskommission vorgelegt.

Katharina Reddemann

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Aus dem Institut für Pathologie der Universität zu Lübeck ... · Aus dem Institut für Pathologie der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. med. Alfred Christian Feller Charakterisierung