Upload
others
View
33
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
22
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan menggunakan
desain penelitian post test design dan control grup design. post test design adalah
setelah diberi perlakuan, sedangkan control grup design adalah kelompok yang
tidak diberi perlakuan. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode ekstraksi
maserasi (perendaman). Pengujian aktivitas mukolitik dilakukan secara in vitro
dan dilakukan dengan metode uji One Way ANOVA.
4.2 Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Sintesis dan laboraturium Kimia
Terpadu Program Studi Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas
Muhammadiyah Malang.
4.3 Sampel Penelitian
Penelitian ini menggunakan ekstrak daun Rhoeo discolor Hance, yang di
campur dengan mukus dan diambil dari bagian dalam mukosa usus sapi yang telah
dibersihkan dan disimpan di dalam freezer dengan suhu dibawah 4C.
4.4 Instrumen Penelitian
4.4.1 Alat Penelitian
1. Alat Pembuatan Serbuk Simplisia
- Mesin penggiling
- Pengayak Mesh 20 dan 40
- Timbangan analitik balance
- Oven BINDER R
2. Alat Ekstraksi
- Timbangan analitik balance
23
- Gelas ukur
- Gelas piala 1000 ml Pyrex Iwaki TE_32 R
- Desikator
- Cawan Porselen Ø 10 cm
- Penyaring Buchner
- Batang pengaduk
- Oven BINDER
- Pipet tetes
- Sudip besi
- Erlenmeyer
- Rotary evaporator vacuum Buchi R-215
- Toples
3. Alat Identifikasi Senyawa menggunakan KLT
- Cawan porselen
- Chamber
- Lempeng KLT
- Penampak noda
- Pinset
- Pipa kapiler 5μ1
- Sinar UV
- Timbangan analitik balance
- Vortex (VM-300)
- Hotplet (streoglass)
4. Alat Pembuatan Larutan Mukus
- Kulkas (freezer)
- Pisau
- Batang pengaduk
- Pipet tetes
- Cawan porselen
- Beaker gelas
4.4.2 Bahan Penelitian
- Aquadestilata (teknis)
24
- KOH 10%
- Dapar posphat pH 7
- Asetilsistein (yang mengandung 200 mg tiap kapsul)
- Daun Nanas kerang
- Etanol (teknis)
- Preaksi FeCl3
- H2SO4
- HCl pekat
- Kertas lakmus
- Logam Mg
- Mukus Usus Sapi
- Na2HPO4. 2H2O (Teknis)
- NaH2PO4. H2O (Teknis)
- Preaksi Mayer dan Wagner
- Tween 80
- Asam sulfat 10%
- dragendrof
- Anisaldehid asam sulfat
4.5 Variabel Penelitian
4.5.1 Variabel Bebas
Variabel bebas yang digunakan pada penelitian ini adalah konsentrasi
daun nanas kerang (Rhoeo discolor Hance) sebesar 0,1%, 0,5%, dan 1%.
Perbedaan konsentrasi tersebut untuk mengetahui seberapa besar aktivitas
mukolitik yang dimiliki oleh daun nanas kerang.
4.5.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah viskositas mukus sapi
setelah diberi bahan uji sebagai parameter untuk menentukan konsentrasi
senyawa yang terkandung dalam daun Rhoeo discolor Hance yang mempunyai
aktivitas mukolitik.
25
4.6 Definisi Operasional Penelitian
1. Ekstrak daun Rhoeo discolor Hance adalah ekstrak yang didapatkan
dari daun tanaman Rhoeo discolor yang dikeringkan dan dibuat serbuk,
kemudian ekstraksi dengan cara maserasi atau perendaman menggunakan
etanol 96%. Setelah itu masing-masing ekstrak dipekatkan dengan rotary
evaporator menjadi ekstrak kental.
2. Uji aktivitas mukolitik dilakukan dengan pengukuran viskositas mukus
usus sapi menggunakan viskometer Oswald dengan berbagai konsentrasi
bahan uji (0,1%, 0,5% dan 1,0%), kontrol negatif dan positif. Penurunan
nilai viskositas pada mukus usus sapi menunjukkan adanya aktivitas
mukolitik.
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Tahap persiapan bahan
Daun Rhoeo discolor Hance yang akan diteliti dicuci bersih dengan air
mengalir, kemudian dijemur di bawah sinar matahari selama 10 menit, dan
kemudian dilakukan pengeringan mennggunakan oven dengan suhu (40-50) C.
Setelah daun kering kemudian dihaluskan menggunakan blender sehingga
diperoleh simplisia halus.
4.7.2 Pembuatan ekstrak etanol daun Rhoeo discolor Hance
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode maserasi
(pemisahan residu dari filtrat), yaitu proses menggunakan pelarut etanol 96%.
Proses maserasi dimulai dengan ekstraksi 345 g simplisia daun Rhoeo discolor
Hance menggunakan pelarut etanol dengan 5000 mL. Bejana maserasi ditutup
rapat dan disimpan di dalam tempat yang terlindung dari sinar matahari
langsung.
Proses maserasi dilakukan selama 24 jam dan sesekali bejana meserasi
di goyang-goyangkan. Hasil maserasi disaring dengan corong buchner
sehingga diperoleh filtrat dan residu. Selanjutnya filtrat yang diperoleh
diuapkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental etanol,
residu di maserasi dengan pelarut etanol 2500 mL hingga semua kandungan
senyawa tertarik oleh pelarut.
26
Kemudian terhadap residu dilakukan ekstraksi dengan pelarut etanol
dengan metode yang sama dan filtrat etanol yang diperoleh dikumpulkan lalu
diuapkan pelarutnya dengan menggunakan alat rotary evaporator sampai
diperoleh ekstrak kental.
Ekstrak kental kemudian dipekatkan dengan oven pada suhu 40C. Hasil
yang sudah kental disimpan dalam botol tertutup aluminium foil dan almari
pendingin untuk mencegah terjadinya kerusakan akibat kontaminasi dari
mikroorganisme dan lingkungan. Filtrat etanol ekstrak kental yang diperoleh
diukur beratnya, diidentifikasi senyawa yang tersaring dan diuji aktivitas
mukolitiknya.
4.7.3 Uji Mukolitik
4.7.3.1 Persiapan mukus usus sapi
Usus sapi dibersihkan dengan air mengalir dari isinya (sisa makanan)
dengan menggosok secara lembut. Potong usus secara membujur kemudian
bagian dalam dikerok perlahan untuk mengumpulkan mukus, mukus yang
didapat berwarna kuning kecoklatan dan kental, mukus dimasukkan ke wadah
kemudian di aduk perlahan sampai homogen. Mukus yang digunakan untuk uji
mukolitik harus dalam keadaan masih segar, setelah itu disimpan dilemari es
pada suhu kurang dari 4C.
4.7.3.2 Pembuatan Dapar Fosfat pH 7
Larutan dapar fosfat pH 7 dibuat dengan mencampurkan 40 mL
larutan dengan Timbang 1,1874 g Na2HPO4. 2H2O dan larutan 60 mL dengan
timbang 0,7076 g NH2PO4. H2O dan diencerkan dengan aquadest hingga 100
mL. Dapar yang telah dibuat kemudian dicek pH menggunakan pH meter.
4.7.3.3 Pembuatan larutan mukus 20% b/b dapar posphat PH 7
Larutan mukus 20% b/b dalam dapar fosfat dibuat dengan cara
mencampur mukus sebanyak 0,2 bagian dari berat total (10 g) dan ditambah
larutan dapar fosfat pH 7 sebanyak 0,8 bagian dari berat total (40 g),
tambahkan 0,5% tween 80 dari berat total (0,5 g), kemudian diaduk dengan
batang pengaduk selama 40 detik agar campuran dapat homogen.
27
4.7.3.4 Pembuatan Larutan Asetilsistein 0,1%
Larutan Asetilsistein 0,1% dibuat dengan cara menimbang 10 kapsul
asetilsistein yang memiliki kandungan 200 mg asetilsistein dan dihitung rata-
rata kapsul. Lalu timbang asetilsistein dilarutkan dalam larutan mukus dapar
fosfat 20% dengan menambahkan 0,5% tween 80, dimana tween berfungsi
untuk meningkatkan kelarutan mukus.
4.7.3.5 Pembuatan larutan uji
Larutan uji 0,1 % dibuat dengan cara mencampurkan 0,005 g ekstrak
kental daun Rhoeo discolor Hance dengan 0,025 g tween 80 (0,5%), kemudian
dilarutkan dalam mukus dapar posphat 20% sampai diperoleh berat 5 g
kemudian campuran tersebut di aduk hingga homogen.
Larutan uji 0,5 % dibuat dengan cara mencampurkan 0,005 g ekstrak
kental daun Rhoeo discolor Hance dengan 0,025 g tween 80 (0,5%), kemudian
dilarutkan dalam mukus dapar fosfat 20% sampai diperoleh berat 5 g kemudian
campuran tersebut di aduk hingga homogen.
Larutan uji 1 % dibuat dengan cara mencampurkan 0,05 g ekstrak
kental daun Rhoeo discolor Hance dengan 0,025 g tween 80 (0,5%),
kemudian dilarutkan dalam mukus dapar posphat 20% sampai diperoleh berat
5 g. campuran tersebut di aduk hingga homogen. Masing-masing larutan uji
dilakukan replikasi 3 kali dengan larutan yang berbeda.
4.7.3.6 Uji Aktivitas Mukolitik
Sebelum menentukan viskositas, larutan uji diinkubasi dalam 37C
selama 30 menit pada inkubator. Larutan uji yang telah di inkubasi diukur
viskositasnya. Pengukuran viskositas dilakukan menggunakan viskometer
Ostwald. Larutan uji dimasukkan ke dalam viskometer Ostwald, kemudian
larutan uji dipompa sampai batas atas viskometer ostwald. Menutup ujung
pipa dan buka penutup saat timer siap. Sebagai kontrol positif, masukkan
larutan asetilsistein 0,1% ke dalam larutan mukus dapar fosfat 20%, dan
untuk kontrol negatif digunakan larutan mukus 20% dalam dapar fosfat.
Viskositas setiap kontrol diuji dengan menggunakan prosedur yang sama dan
diulang sebayak tiga kali.
28
4.8 Skrining Fitokimia
4.8.1. Uji optimasi fase gerak
Ekstrak sebanyak 0,05 g dimasukkan kedalam vial yang sudah dicuci
bersih. Kemudian, ditambahkan pelarut etanol 1 ml aduk sampai larut atau
bila perlu dilarutkan pada alat ultrasonik selama 5 menit. Apabila belum
larut maka dapat ditambahkan 5 menit lagi sampai ekstrak larut dalam
etanol.
Siapkan masing-masing pelarut dengan perbandingan tertentu yaitu,
pelarut (n-heksan:etil asetat); 5:5, (n-heksan:etil asetat); 3:7, (etil asetat :
metanol); 7:2. Dibagi tiga bagian chamber dan diberi label untuk masing-
masing chamber dengan perbandingan pelarut tertentu yaitu, IA, IB, dan IC.
Chamber IA diberi larutan perbandingan (5:5), chamber IB perbandingan
(3:7) dan IC perbandingan (7:2). Masing-masing larutan ditotolkan sebanyak
dua kali totolan pada masing-masing plat. Setelah itu masukkan dalam
chamber dan amati perubahan warna yang terjadi. Angkat masing-masing
plat pada chamber dan tunggu hingga kering. Kemudian, lakukan
pengecekan pada kromatografi lapis tipis UV 365 dan UV 254.
4.8.2 Uji golongan senyawa Rhoeo discolor hance
Ekstrak sebanyak 0,05 g dengan 1 ml dilarutkan dengan etanol sampai
larut atau dilarutkan pada ultrasonic selama 5 menit. Larutan yang sudah larut,
kemudian ditotolkan pada kelima plat KLT atau dilakukan replikasi lima kali.
Dimasukkan secara berbarengan dalam chamber yang berisi fase gerak yaitu
n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan 3:7 (sesuai dengan hasil
optimasi yang dilakukan terlebih dahulu untuk melihat mana yang dapat
memberikan hasil pemisahan yang lebih baik). Amati plat KLT pada chamber,
angkat masing-masing plat tunggu hingga kering. Kemudian, lakukan
pengecekan pada kromatografi lapis tipis UV 365 dan 254, siapkan penampak
noda yang digunakan. Untuk uji golongan saponin yang digunakan
anisaldehid asam sulfat (dengan pemanasan), uji golongan alkaloida dengan
preaksi dragendrof, uji golongan flavonoid dengan asam sulfat 10% dan uji
golongan polifenol dan tannin menggunakan preaksi FeCl3. Kemudian,
diamati perubahan warna yang terjadi.
29
Pada uji golongan saponin ditunjukkan dengan terjadinya warna merah
ungu (ungu) untuk anisaldehid asam sulfat. Uji golongan alkaloida ditunjukkan
dengan terjadinya warna jingga, sedangkan pada uji golongan flavonoid
ditunjukkan dengan terjadinya warna kuning intensif.
4.9 Analisis Data
4.9.1 Analisis data aktivitas mukolitik
Perubahan viskositas mukus setelah diberi beberapa konsentrasi ekstrak
dengan menggunaan Viskometer Ostwald dapat di hitung menggunakan
rumus:
𝝑 = 𝟎,𝟏𝟐
𝒌 ×𝒕
𝑽=𝒌 ( 𝒕− 𝝑 )
…………… (1)
Dimana : t = waktu yang diperlukan larutan (pada garis ke dua)
k = konstanta (0,07)
Rumus perhitungan efek viskositas sampel pada mukus, sebagai berikut:
% 𝑒𝑓𝑒𝑘 𝑚𝑢𝑘𝑜𝑙𝑖𝑡𝑖𝑘 = 100 − 𝑣𝑖𝑠𝑘𝑜𝑠𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝑣𝑖𝑠𝑘𝑜𝑠𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 × 100%
Dalam penelitian ini, data kekentalan (viskositas) dianalisis
menggunakan uji statistik, yaitu menggunakan uji ANOVA. Analisis statistik
secara keseluruhan dilakukan dengan menggunakan software SPSS 18.
4.9.2 Analisis skrinning fitokimia
Analisis fitokimia merupakan analisis kualitatif yang di lakukan untuk
mengetahui komponen bioaktif yang terkandung dalam tiap pelarut dari
ekstrak daun Nanas kerang (Rhoeo discolor Hance). Analisis fitokimia yang
dilakukan meliputi uji saponin, flavonoid, alkaloid dan polifenol.
30
4.10. Kerangka Operasional
Gambar 4.1 Kerangka Operasional
Uji Aktivitas
Mukolitik
secara invitro
Pembuatan ekstrak bahan uji
dengan daun Rhoeo discolor
Hance
Pembuatan dapar fosfat pH 7
Preparasi mukus usus sapi
Preparasi sampel
Pembuatan kontrol negatif
Pembuatan kontrol positif
Pembuatan larutan uji
Viskometer
ostwald
Uji aktivitas
mukolitik
Pengujian
Analisa senyawa saponin,
flavonoid, alkaloid dan tanin
yang terkandung dalam daun
Rhoeo discolor Hance.
Analisis data uji aktivitas
mukolitik Analisis data
Identifikasi senyawa dengan
metode pewarnaan
31
4.11 Bagan Alir Penelitian
4.11.1 Pembuatan Ekstrak Bahan Uji
Pembuatan ekstrak daun Rhoeo discolor Hance dengan metode maserasi
(perendaman) dengan pelarut etanol 96%.
Gambar 4.2 Ekstraksi Daun Rhoeo discolor Hance
dan lakukan kembali maserasi dengan 2500 mL (1:5) pelarut etanol
96% selama 24 jam
Proses meserasi dilakukan dengan metode yang sama secara berulang
sampai filtrat dikumpulkan semua menjadi satu.
Dapat ditandai dengan tidak ada noda yang terbentuk pada plat KLT
Residu dari maserasi etanol dilarutkan dalam 5000 mL (1:10) pelarut
etanol 96%.
Direndam selama 24 jam untuk proses meserasi sambil sesekali
bejana meserasi di goyang-goyangkan, disaring dengan corong
Buchner dan tampung filtratnya
Seluruh hasil filtrat dihomogenkan dalam satu wadah
Dilakukan pemekatan menggunakan rotary evaporator vacum hingga
didapatkan ekstrak yang kental
Pindahkan ke cawan porselen dan keringkan di oven pada suhu 40o C
345 g serbuk simplisia kering daun Rhoeo discolor Hance ditimbang dan
diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol
32
4.11.2 Pembuatan Larutan Mukus
Pembuatan larutan mukus dengan bahan usus sapi yang sudah di
bersihkan dengan air, kemudian mukus di campurkan dengan larutan dapar
yang sudah di siapkan dan di cek pH nya, Alur pembuatan larutan mukus :
Gambar 4.3 Alur Pembuatan Larutan Mukus
Timbang 0,7076 g, larutan NH2PO4. H2O
dan tambahkan aquadest ad 100 ml. Usus dibersihkan dengan
air mengalir
Aduk mukus hingga
homogen
Timbang 1,1874 g, Larutan Na2HPO4.
2H2O dan tambahkan aquadest ad 100 ml
Mukus 0,2 bagian dari berat
total dan dapar fosfat pH 7
0,8 bagian dari berat total
Usus dipotong membujur
dan bagian dalam
dikeruk perlahan
Simpan pada suhu > 4 0C
Campur larutan 1 dan larutan 2 aduk
hingga homogen
Larutan Dapar fosfat pH 7
Tambahkan 5% tween 80 dari berat
total
Aduk dengan batang pengaduk selama
40 detik agar campuran dapat homogen
Larutan mukus dapar fosfat 20%
33
4.11.3 Pembuatan Kontrol Positif Asetilsistein 0,1%
Pembuatan Kontrol positif dengan 10 kapsul actylcystein 0,1%, yang
kemudian di campurkan dalam larutan mukus dapar fosfat pH 7. Alur
pembuatan kontrol positif :
Gambar 4.4 Alur Pembuatan Kontrol Positif Asetilsistein 0,1%
Ditimbang 10 kapsul acetylcysteine yang memiliki
kandungan 200 mg, hitung rata-rata bobot kapsul
Timbang asetilsistein lalu dilarutkan dalam larutan
mukus dapar fosfat 20%
Tambahkan 0,5% tween 80, aduk hingga homogen
Larutan kontrol positif asetilsistein 0,1%
34
4.11.4 Pembuatan Larutan Uji
Pembuatan larutan uji dengan berbagai konsentrasi yang terdiri dari tiga
konsentrasi 0,1%, 0,5%, dan 1,0% yang berbeda pada setiap tahap. Dengan
mencampurkan larutan uji dengan larutan mukus dapar posphat pH 7, yang
dimana nantinya dapat memberikan hasil viskositas berbeda pada setiap
konsentrasi.
Gambar 4.6 Alur Pembuatan Larutan Uji
Gambar 4.5. Pembuatan Larutan Uji
Dibuat larutan uji dengan konsentrasi 0,1%, 0,5% dan 1,0%
Timbang ekstrak kental daun Rhoeo discolor Hance 0,005 g;
0,025 g dan 0,05 g
Campurkan ekstrak kental Rhoeo discolor Hance dengan
larutan mukus dapar fosfat pH 7, aduk hingga homogen
Setiap konsentrasi larutan bahan uji diulangi 3 kali replikasi.
35
4.11.5 Uji Aktivitas Mukolitik dengan Viskometer Ostwald
Pengujian mukolitik dengan alat yang digunakan untuk menentukan
sejumlah cairan yang akan diukur viskositasnya. Dimana, penggunaan nya
dilakukan dengan jalan mengukur waktu yang diperlukan untuk
mengalirnya dalam pipa kapiler dari a ke b. dibawah ini merupakan alur
pengujian mukolitik dengan viscometer Ostwald :
Gambar 4.6 Alur Uji Aktivitas dengan Viskometer Ostwald
Sebelum menentukan viskositas, larutan uji diinkubasi dalam 37C
selama 30 menit pada inkubator.
Viskositas setiap kontrol diuji dengan menggunakan prosedur yang
sama dan diulang sebayak tiga kali
Larutan uji dimasukkan ke dalam viskometer Ostwald
larutan uji dipompa sampai batas atas viskometer Ostwald, tutup ujung
pipa dan buka penutup saat timer siap
Kontrol positif : larutan asetilsistein 0,1% ke dalam larutan mukus
dapar fosfat 20% (kontrol positif)
Kontrol negatif : larutan mukus 20% dalam dapar fosfat
36
4.11.6 Skrining Fitokimia
4.11.6.1 Uji Optimasi Fase Gerak
Uji optimasi KLT pada ekstrak dengan pelarut etanol 96%
dengan tiga perbandingan tertentu di bawah ini perlu dilakukan,
digunakan untuk memperkirakan jawaban yang tepat dan sesuai
yang dihasilkan dari rancangan percobaan, yang di lakukan sebagai
berikut :
Ekstrak sebanyak 0,05 g dimasukkan kedalam vial yang sudah dicuci
bersih. Kemudian, ditambahkan pelarut etanol 1 ml aduk sampai larut
Siapkan masing-masing pelarut dengan perbandingan tertentu yaitu,
pelarut (n-Heksan:etil asetat); 5:5, (n-Heksan:Etil asetat); 3:7, (Etil
asetat:Metanol); 7:2.
Dibagi tiga bagian chamber dan diberi label untuk masing-masing
chamber dengan perbandingan pelarut tertentu yaitu, IA, IB, dan IC.
Chamber IA diberi larutan perbandingan (n-Heksan:Etil Asetat); 5:5,
chamber IB perbandingan (n-Heksan:Etil Assetat); 3:7, dan IC
perbandingan (Etil Asetat:Metanol); 7:2.
Larutan dalam vial ditotolkan sebanyak dua kali totolan pada masing-
masing plat, Setelah itu masukkan dalam chamber dan amati
perubahan warna yang terjadi.
Angkat masing-masing plat pada chamber dan tunggu hingga kering.
Lakukan pengecekan pada kromatografi lapis tipis UV 365 dan UV
254.
Gambar 4.7 Alur Skrining Fitokimia Optimasi Pelarut
37
4.11.7 Uji Golongan Senyawa Rhoeo discolor hance
Uji golongan senyawa ekstrak Rhoeo discolor hance dibawah ini,
dengan perbandingan 3:7 yaitu N-heksan dan etil asetat.
Ekstrak sebanyak 0,05 g dengan 1 ml dilarutkan dengan etanol sampai larut
atau dilarutkan pada ultrasonik selama 5 menit. Larutan yang sudah larut
kemudian, ditotolkan pada kelima plat KLT atau dilakukan replikasi lima
kali.
Masukkan secara berbarengan dalam chamber yang berisi fase gerak yaitu
n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan 3:7 (sesuai dengan hasil
optimasi yang dilakukan terlebih dahulu untuk melihat mana yang dapat
memberikan hasil pemisahan yang lebih baik).
Amati plat KLT pada chamber, angkat masing-masing plat tunggu hingga
kering, lakukan pengecekan pada kromatografi lapis tipis UV 365 dan 254.
Siapkan penampak noda yang digunakan. Untuk uji golongan saponin
yang digunakan anisaldehid asam sulfat (dengan pemanasan).
Uji golongan alkaloida dengan preaksi dragendrof
Uji golongan flavonoid dengan asam sulfat 10%
Uji golongan polifenol dan tannin menggunakan preaksi FeCl3,
Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi.
Pada uji golongan saponin ditunjukkan dengan terjadinya warna merah
ungu (ungu) untuk anisaldehid asam sulfat. Uji golongan alkaloida
ditunjukkan terjadinya warna jingga, uji golongan flavonoid ditunjukkan
terjadinya warna kuning intensif, sedangkan pada uji golongan polifenol
dan tannin ditunjukkan perubahan warna hitam (positif polifenol).
Gambar 4.8 Alur Skrining Fitokimia Identifikasi Senyawa Golongan