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Il contributo della sperimentazione animale allo sviluppo dei farmaci

Domenico Barone

I 50 anni di SSFA e la Ricerca in ItaliaXIII Congresso Nazionale

Roma, 31 marzo – 1 aprile 2014 1

Dall’antichità...…all’età moderna…

...a quella contemporanea

Ippocrate di Cos (460-377 a. C.): Corpus Hippocraticum

Galeno di Pergamo (129-216 d. C.)

William Harvey (1578-1657)

Rudolf Magnus (1873-1927)Henry Dale (1875-1968) – Nobel 1936

Harold Burne (1892-1981)Jack Gaddum (1900-1965)

John Vane (1927-2004) – Nobel 1982 2

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William Harvey (1578-1657): fu il primo a scoprire e descrivere la circolazione sistemica e le proprietà del sangue, studiando il sistema CV di un serpente:

cuoreà cervello e corpo à cuore

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Rudolph Magnus: 1873-1927• lavori su muscoli isolati

da intestino e vasi, in bagni termostatati+O2 +nutrienti+sali+glucosio

• Studi sui riflessi coinvolti nella postura

• Studi sulla tensione muscolare

• Effetto sostanze su cuore, vasi, polmoni e tratto intestinale

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Henry Dale (1875- 1968): lavori con i bagni di organi isolati e perfusi inventati da Magnus:

• Studi sulla trasmissione degli impulsi nervosi attraverso i neurotrasmettitori

• Ergot e derivati rilasciano messaggeri chimici: ACH, H, ADR

• Istamina (H)àanafilassi, allergia, secrezione HCl

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Harold Burn (1892-1981):

Allievo di Henry Dale, maestro di John Vane

• Ideatore dei bioassay• Perfusione attraverso i vasi del tessuto

• Scrisse trattati su organi isolati e perfusi:- Methods of Biological assays (1928)- Biological Standardization (1937)- Functions of autonomic transmitters

(1956)- The autonomic nervous system (1963) 6

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Jack Gaddum (1900-1965):- Allievo di Henry Dale

Tecnica organo isolatoe «super-perfuso»:

- metodo più sensibile

- prolungata sopravvivenza dell’organo isolato

- applicò la valutazione statistica ai dati (bioassay insulina) 7

John Vane (1927-2004):- Allievo di Harold Burn

- bioassayestremamente sensibile con strip di fondo di stomaco di ratto (1957):

- 5-HT 1000x piùpotente di triptaminanel contrarre stripstomaco di ratto

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John Vane:

cascata di 8 organi super-perfusi

diversi tessuti da diversi organi di diversi animali

scoperta di TxA2, PGE2, PGH2

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John Vane

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Anni ’40: antiistaminici per curare la febbreda fieno (H1), ma non H2-antagonisti

Anni ’60: G. Hitchings e G. Helion: - allopurinolo (antiuricemico) e azatioprina (Imuran, trapianti)

- scoperta recettori H2 e vari recettori 5-HT

Anni ’60/’70: David Jack: 5-HTà vasocostrizione vasi cerebrali la cui vasodilatazione dà emicrania;su strip di safena di cane trovòsumatriptan agonista 5-HT 11

Anni ’70: Schild, Black e Duncan: H2-antagonisti: cimetidina(tagamet) antiulcera

Anni ’80: ranitidina (ranidil), H2 antagonistaantiulcera

Hitchings, Helion, Black (Nobel 1988)- beta-bloccanti - H2-antagonisti - antibatterici, antimalarici - immunosoppressori, antiuricemici

(milioni di pazienti salvati)12

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Ancora…peptidi…• Anni ’50: sistema renina-angiotensina:

renina (rene) ACE (polmone)

angiotensinogeno à Ag I à Ag II(14 aa) (10 aa) (8aa)

(ag. press.)

• 1975 -’76: Ondetti, Rubin e Cushmanmutano un peptide inibitore di ACE in un non-peptide inibitore di ACE: captopril(antiipertensivo) à sartanici (antagonostirecettoriali di Ag II) 13

• 1933: Ulf von Euler (Nobel 1970) scoprelipidi acidi ciclopentanoici: le prostaglandine (PG)

• Anni ’60: nasce e si sviluppa la farmacologia PG:- shock anafilattico à istamina + altri mediatori (?)- l’aspirina blocca lo shock- NSAID bloccano la biosintesi PG (E2,F2a) agendo

su cascata acido arachidonico (anti stroke/infarto)- scoperta tromboxano A2, aggregante piastrinico e

vasocostrittore- estratti aortici sull’ arteria celiaca di coniglio

isolata e perfusa à una PG antiaggreg./ipotensiva:la prostaciclina che però è instabile à iloprost(1976) 14

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• Per oltre 100 anni amil nitrito e nitroglicerina sono stati usati nell’angina pectoris

• ’70s: amil nitrito e nitroglicerina à NOàrilassamentomuscolatura vasale liscia à vasodilatazione

• 1980: Robert Furchgott (Nobel 1998): 1) NADR contrae strip di aorta di coniglio 2) ACH sulle cellule endoteliali à fattore ipotensivoà rilassamento muscolatura liscia vasale

3) rimozione cellule endoteliali à miorilassamento

• 1987: questo fattore è il NO, molecola di segnale CV

• ’80s: metabolismo di L-arginina à NO à costante effettoipotensivo

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’70-’80: Studi di binding recettoriale in vitro/in vivo - recettori + 3H-ligando +/- molecola in esame- screening/QSAR studies- recettogramma: profilo farmaco-tossicologico - screening di migliaia di prodotti/anno/recettore- risparmio di migliaia di roditori/anno- studi di binding recettoriale in vivo

- fine ’80: HTS in Discovery su recettori clonati, uso robot, informatica à decine di migliaia di molecole testate su centinaia di recettori/anno

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• Protocolli NIH/NCI: screening di nuovi antitumorali:

- in vitro su cellule tumorali umane e murine - in vivo su roditori portatori di:

- trapianti di cellule tumorali murine:P388, L1210, MMB16, LLC (tumori singenici)

- xenotrapianti di cellule tumorali umane in topi nudi e SCHID (immunodeficienti)

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15 /4 /2013: Paul Tesar & Robert Miller• un fattore di trascrizione che riprogramma le cellule

espandibili progenitrici degli oligodendrociti mielogenicià remielinizzazione della guaina mielinica persa in MS e leucodistrofie

• finora oligodendrociti e loro progenitori erano ottenuti solo da tessuti fetali (bioetica!...) o da cellule staminali pluripotenti

• questi primi studi sono stati condotti in vitro, su cellule di topo ed in vivo in topi ipomielinati

• il prossimo passaggio: trasferire in vivo questo processo di riprogrammazione nell’animale (Tox, Safety, efficacia) per poter passare all’uomo

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Questa rapida carrellata, che copre la storia della moderna farmacologia, dimostra che solo grazie alla sperimentazione animale, sono stati trovati, valutati e sono entrati in terapia centinaia di farmaci salvavita:

• antibiotici • antivirali (HIV, …)• antineoplastici• farmaci SNC (ansiolitici, antidepressivi, antipsicotici)• ipocolesterolemizzanti, ipoglicemizzanti• antiinfiammatori, analgesici, antipiretici, anestetici• immunosoppressori / immunomodulatori• proteine ormonali e farmacologiche ricombinanti:

insulina, GH, FSH, LH, HCG, IFN, fattori di crescita, citochine, McAb,…

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• vaccini (rabbia, vaiolo, HAV, HBV, HPV, polio, varicella, difterite, tetano, pertosse, morbillo, parotite, rosolia, influenza)… HCV, HIV,

• nano(bio)tecnologie:- drug delivery system- nuove formulazioni- diagnostica in vitro e in vivo

• medical device (pacemaker, protesi, stent, cateteri, ecc.)

• Molto resta ancora da fare…mancanza di modelli animali…• …terapia genica e genica somatica• …farmaci per patologie neurodegenerative

(MS, SLA, Alzheimer, Parkinson,…)• malattie rare e malattie orfane (5-6000!)

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Sperimentazione animale non solo nella ricerca…

• La sperimentazione animale è stata determinante nella Ricerca e messa a punto di nuovi farmaci

• è stata altrettanto importante nel determinare i successi della Chirurgia

• Non meno rilevante è il ruolo della sperimentazione animale nelle attività di R&S non clinico: tossicologia, PK/PD, ADME, safety pharmacology, tollerabilità, sviluppo formulativo e…

• Nel QC della produzione (bioassay) dei prodotti biotecnologici (EU/US Pharmacopeia)

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Bilancio di un secolo di sperimentazione animale…

• E’ innegabile che…• ….solo grazie alla sperimentazione animale, in

questi 120 anni di storia della medicina, miliardi dipersone siano state curate e guarite e/o le lorosofferenze siano state alleviate

• ….le terapie abbiano dato anni alla vita e vita agli anni

• ….molto resta ancora da fare, ma le prospettive sono assolutamente positive

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La sperimentazione animale in prospettiva• Molto ci si aspetta ancora da:

- biologia molecolare e nanobiotecnologie- farmacogenetica, farmacogenomica- tracrittoma, proteoma, kinoma- modelli in vitro scientificamente validati (!)

(HTS, meccanismi di azione) e modelli animali di patologie umane

• La sinergia tra test in vitro e modelli in vivo porterà nuove terapie più efficaci, sicure e selettive

• Le valutazioni di efficacia, safety, tossicità e PK/PD non possono e non potranno esimersi dal ricorso alla sperimentazione animale prima della R&S clinici 23

La sperimentazione animale ha posto le fondamenta delle terapie del

cancro, dei trapianti, dell’immunodeficienza acquisita,

delle patologie infettive, infiammmatorie, cardiovascolari,

nervose, autoimmuni, e dell’ictus….

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Camelus dromedarius Camelus bactrianusCamelidi: Lama glama, Vicugna pacos

• Nanobody omodimerici (IgG): 2.5 x 4 nm, 12-15 kD, poco immunogenici à nanoimmunobiotecnologia

• Stabili, non tossici, resistenti al calore, affinità nM, selettivi • Legano epitopi inaccessibili a Ab classici, enzimi, attraversano BBB,

legano Ag citoplasmatici degli astrociti, rapida clearance renale• In terapia: Alzheimer (in Fase I); in oncologia (HER2, HGF):

89Zr-1E2-Alb8 e 6E10: PET imaging, efficacia nel topo con glioblast.• Imaging quantitativa (PET, SPECT), diagnostica aterosclerosi in

uomo e topo (VICAM1), analisi radioimmunoguidata, imagingcerebrale, radioimmunodiagnostica

• 2Rs15d non interferisce con trastuzumab e pertuzumab anti-HER2

Impossibile v isualizzare l'immagine.

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Microtus ochrogaster (arvicola della prateria): modello di studio delle basi neurologiche, genetiche, evolutive e molecolari dei legami/dei comportamenti sociali, del legame di coppia , di scelta/predilezione del partner, monogamia e della cura biparentale. Ox e Vp, interagendo con i rispettivi recettori, coordinano comporta-menti premianti: accoppiamento, scelta selettiva del partner, elabora-zione dei comportamenti sociali necessari al riconoscimento individuale.Accoppiamento àmodifica stabile profilo espressione genica di Ox e VPà forte legame monogamicoTricostatina A (inibitore deacetilasi) : è un fenomeno epigenetico26

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Saguinus oedipus(Cotton top tamarin)

(anche per studi di efficacia, safe safety e Tox con biotecnologici) X

Studiato a fondo per varietà e l’elevato livello qualitativo dei comportamenti sociali collaborativi e altruistici21% affetto da colite àmodello naturale per lo studio dell’insorgenza e l’evoluzione dell’ adenocarcinoma del colon à ricerca e valutazione di antitumoraliModello animale validato per lo studio dell’infezione da EBV (HHV-4)àneoplasieDose tumorigenica di EBV inoculata nel S. oedipusà linfomi multifocali a grandi cellule, modello per studio di antitumorali e vaccini contro EBV Nel S. oedipus la vaccinazione contro l’antigene virale gp340/220 non induce immunità, ma rende l’animale capace di controllare l’infezione da EBV che resta latente

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Ha un antenato ancestrale in comune con l’uomoIbernazione: 3-4 mesi in assoluta anossia a -10 ÷ -15 °C (nel ghiaccio)Risposte adattative:

- depressione coordinata metabolismo cellulare e pompe ioniche- sangue senza nuclei di condensazione, adattamento cuore e SNC- carapace e scheletro: uptake di a. lattico e tampone pH sangue

Deposizione delle uova e sesso dei neonati in funzione della °T amb.Modello animale ideale senza alternative per:

- lo studio dei meccanismi naturali che proteggono cuore e SNCdai danni dell’ipossia

- studi evoluzionistici, di genetica dell’evoluzione, di genomica,di biologia evolutiva dello sviluppo, di ecologia dello sviluppo

Chrysemis pictabellii

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Grazie per l’attenzione!

domenico.barone@libero.it

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