Beziehungen zwischen der GrSfie von Chloroplasten und ihrem Gehalt an liislichen Eiweiflen und Zuckern

im Zusammenhang mit dem Frostresistenzproblem

Von

U. Heber

Aus dem Institut ftir Landwirtschaftliche Botaaik der Universit~it Bonn (Direktor: Prof. Dr. H. U 11 r i e h)

Mit 5 Textabbildungen

(Eingegangen am 28. September 1958)

Bet der Untersuehung der Ur'saehen der Frostresisienz ist bisher -- wohl hauptsiiehlieh aus methodisehen Gri inden - - die s t rukturel le Komplexizi t i i t dec Zetle .anflex aeht gelassen wor,den. Mall hat in al ler Regel den Gehalt yon ganzen ZetlYexbiinden an einzelnen Sioffen oder Stoffgruppen ermitteJt und Vergleiehe zur Frostresistenz ange.sfellt, um daraus ursiiehliehe Be- ziehungen ableiten zu kSnne.n. Insbesondere wurde der Zuekergehalt in Beziehung zur Fr~str'esistenz intensiv untersueht, da man anfiinglieh glaubie, dal~ die Fro.str,esisfenz dureh Zuekeranh~iufung bedingt se.i (M ii 1- l e r - T h u r g a u 1882, A k e r m a . n 1927, A n d e r s . s o n 1944 u. a.). Im Zellsaft angehguf ter Zueker sollte fiber die Gef r ie rpunktsern iedr igung die Menge des be,i ether b.estimmten Ternpeta lur at~sfrier'baren Wassers r.edu- zier'en, w.odur'eh der Zelle der zum ~ber teben erfor'derliehe Hydratafio.ns- grad erhal ten bliebe. Sphter ging man vo.n der Ansieht, daft Zueker am Resistenzerwerb ursiiehlieh beteiligt sind, weitgehend ab ( P i s e k 1955, K e s s 1 e r 1935, L e v i t t 1956), doeh ist das Problem neuerdings wieder aufgegriffen worden ( H e b e r 1958). Einzig und allein mit der Plasma- viskositiit wurde eine strukiurel le Komponente in Beziehung zur Frost- r.esistenz untersueht ( K e s s l e r 1955, K e s s l e r und R n h l a n d 1938), do.eh exgaben sieh Widerspriiehe (S e a r t h un,d L e v i t t 1957, L e v i t t u n d S i m i n.o v i t e h 1940) und die u sind keineswegs Mar, zumal aueh bet einer fe,sigestetlten Beziehung zwisehen Fr'ostresistenz und Plasma- viskositiit fiber die t ieferen Ursaehen der Resistenz n.iehts ausgesagt ist.

Bet unseren Untersuehungen fiber Frostr'esistenz hab.en wir nun beob- achier, dal~ eine best immte Frak t ion der Plasmaeiweil3e, die sieh dureh frak-

U. Heber: Beziehungen zwischen der Grtif~e yon Chloroplasten 285

tiolriertes Zentrifugieren isolieren l~l~t, infolge des Wasserentzuges beim Einfrieren der L6sung koaguliert ui1d ausf~illt. Dutch Zusatz -con Zuekern o,der ganz bestilnlnten Pro teinen l~il~t sich diese Frostfhllung verhinderl1. Eine ins e:ii1zelner.e gehende Dureharbe~tui1g ergab, dal~ die Sehutzstoffe -- Zucker oder Pro.teille - - llur in d~rekter Weehselwirkung Init den elnp- findliehen Eiweil~en s.ehiitzend gegen de ren Fros~denatnr~.erung wirken k6n- hen ( U l l r i c h und H e b e r 1958). D:araus [assen sich fiir d as. gesaante Frostresistenzprobleln interessante Fo.lgerungei1 ableiten: Soferi1 der Ge- frierversueh Init der F~iweil~16sung ganz gro.b dean E,infrierel1 tier Pflallzen- zelle vergle.ichb.ar ist, so Inul~ aueh in der Zelic ein direkte.r Ko.ntakt yon Sehutzstoff und zu schiitzendeln Protein vo.nntiten sein, dalnit eine Fro.st- re,sistenz zu,stande kolnmt. Weam abe:r ell1 so,leher Ko.ntakt er'forderlieh is~, Iniissen no,twei1dige,rweise die. Sehutzsto,ffe iln Plasma lokalisiert sein, d.emn iln Plasma linden sieh die fro.stelnpfindlichen Eiwefl~e. Es li.egt also. nahe anzullehmen, dal~ es nut auf den Schutzstoffgehalt des Plasmas ankolnmt. lln Plasma k~Anllen abet gallz andere Ye~hiiltnisse herrschen als iln DureJ~- schi1itt der gesalnten Zelle, den bisher jede Analyse wiedergibt: Bei der Analyse erfal~t man ja alle Inhaltsstoffe einschliel~lieh der der Vakuo.le, die wenigstens bei au.sdifferenziertel1 Zellen bedeutend Inehr Rauln ein- llilnlnt als das Plasma ( B u t l e r 1955). Die Inhaltsst.o.ffe dci- Vaku,le diirftel1 abet linch deln obigen Versuch, wenn iiberhaupt, nut wellig Einflul~ auf die Ausbildung der Fro.stresistenz haben. Wenn also bei der Frost- h~irtung beispielsweise keille strenge Ubereinstilnlnung zwisehen Gesalnt- zuckergehalt und l~esistellZ beobachtet wird, so kann ian Plasma eii1e solehe t]bereinstilnlnullg do ch durehalls vorliegen, sie kai111 aber dutch die Ye~- h~ltnisse in der Yakuole ~r werdel1.

Aus diesen ~]ber]egungen ergaben sich fiir uns folgellde Forderui1gel1: Es war llaehzupr4ifel1, ob die u ullseres Mo.dellversuehes auch ant die Pflanze fibertragel1 werden k6nllen. Wir Inul~ten also. festzustellen ver- suchen, ob iln Plaslna - - dort, wo die elnpfindliehen E.iwei~e lokalisiert sind - - tats~iehlieh Sehutzstoffe, insbe:so.ndere Zucker, in griSl~erer Menge angeh~uft sind. We~ter war dann zu priifen, ob der Gehalt des Plaslnas an diesen Sto.ffel1 in direktean Zusalnlnenhang mit der Frostresistenz steht.

Methodik

1. O b j e k t

Weize,npflanzen der S ort.en Crieweller 192 und Hauters' II wurden bei etwa 14 o C 14 Tage angezo.gei1 und dann im Kiihlraum be4 Teanperaturen urn 00 C geh~irtet. Tagsiiber erfolgte Beleuchtung Init HNI- und HNG-Lam- pen der Firlna Osram in 80 cm Entfernung ~:on den Pflanzen. Nach der Frosth~trtung wurden die Pflanzen iln Gew~ichshaus wieder bei e:twa 14 o C enthiirtet.

Teilweise kalnen auch Weizenpflanzel1 zur Untersuchung, die auf deln Felde gewachsel1 und somit natiirlichen Resistenzbedingungen ausgesetzt waren. Die Untersuchung erfolgte dabei iln Friihjahr, als die Frostresistellz im Abnehlnen begr~ffen war.

286 U. Heber

2. M i k r o s k o p i s c h e U n f e r s u c h u n g e n

In verschie,denen Zeitabstiinden wurden Gr51~enmessungen an den Chlo- roplasfen durchgefiihrt. Zu diesem Zweck wurden yore zweiten oder bei iilteren Pflanzen yore dritten Blair zwei his drei Zeniimeter unter der Spitze Handschnitte angefertigt. An den Quer:schniften wurden bei 1200facher VergrSt]erung ,nit dem Okularmikrometer je 100 Chloroplasten ausgemes- sen, und zwar jeweils zur Hiilfte aus dem Pali sadenparenchym und aus dem Schwammparenchym (siehe anch U 11 r i c h 1924). Messungen wurden so- wohl am grSfiten als auch an, kleinsten Durchmesser der Chloroplasten v(~rgenommen. Z u r direkten verg'leichenden Auswertung fanden nach U 11- r i c h (1924) nut die grSl~ten Durchmesser Yerwendung. Die kle~nen Achsen de r als Rotations ellipsoid betrachteten Chloroplasten wurden lediglich zur Kontrolle und zur niiherungsweisen Be rechnung der Volu'mverh~iltnisse be- nutzt. Die Re,produz,ierbarl~eit der aus 100 Messungen gewonnenen Durch- schnittswerte war bei den grol~en Achsen recht gut, w~ihrend bei den klei- hen Achsen nicht zu verniichl~issigende Abweichungen der Messungen von- einander auftraten. Die Ergebnisse de r Messungen wurden statistisch ge- sichert. Das erwies sich als notwendig, da die Schwankungen innerhalb der Chlorc~plastengrSl~en ganz betriichtlich waren. So schwankten die Durch- messer der Chloro.plasten im Zustand der hSchsten Frostresistenz zwischen 4,5 (niedrigster We rt) und 7,5 (hSchsfer Were) Okularmikrometereinheiten, im Zustand der Fro.sfenapfindlichkeit zw~schen 2,3 (niedrigster Wert) und 6,2 (hSchsJter Wevt) Einhe~iten. Die GrSl~enwerte der Chlo,roplasten yon 100 Messungen lief~en sich etwa in eine Gaul~sche Fehlerl~urve einordnen. Die Unter:schiede zwischen den Messungen bei verschiedenen Resistenz- graden beruhten immer auf einer echten Differenz bei 1% Irrtumswahr- scheinlichkeit. Die Volumenberechnungen wurden jetzt unter Zugrunde- legung .der Mittelwerte yon grol~er und kleiner Achse unter der Annahme erhalten, dal~ die Chloroplasten Rotationsellipsoide sind.

Am selben Pflanzenmaterial, an dem die Messungen erfolgten, wurden audl Zucker- und Frostresistenzbestimmungen durchg'efiihrt, urn die erhal- tenen Ergebnisse miteinander vergleichen zu kSnnen.

5. C h l o r o p l a s t e n i s o l i e r u n g e n

Chloroplasten wurden ant zweierlei Weise erhalten:

a) Durch kurzzei~iges Homogenisieren yon zerschnittenen Bl~ttfern i'm w~il3.rige~l, gepufferten Milieu wurden Chloroplasten fre.igelegt und durch fraktioniertes Zentrifugieren isoliert. Als Homogenisaiionsmedium dienfe 0,5m Mannit ( L e u t h a r t und M i i l l e r 1948) in Phosphafpuffer yon pH 7,4. Der pH-Wert durfte beim Homogenisieren nichf unter 6,8 sinken, da dann Denaturierung und Verklumpung eintrat.

b) Bliifter wurden bei --70 o C eingefroren und anschliel~end gefrier- getrocknet. In einer Modifikation des yon B e h r e n s (1958) fiir Zellkerne yon Leber angegebenen Verfahrens wurden Chloroplasten isol~erf, indem alas getrocknete Material in Petrol~ither/Tetrachlorkohlenstoff zersehlagen und an schl~el~end bei unterschiedlichen Dichfen des Suspensionsmediums

Beziehungen zwischen der GriJfie yon Chloroplasten 287

zentrifugie1`t wu1`de. Nahere Einzelheiten des Verfahrens sind an anderer Sfelle mitgeteilt wo1`den (H e b e r t957).

Es soll hier noch die Frage naeh der Reinheit der naeh Gefriertrocknung iso.lie,1,ten Chlo1,oplastei1 gestellt werden. Als VerunreiniguIlg kommen neben Zellke1`nen wohl haupts~iehlieh Zellwandfragmente in Frage. Die Zellkerne liefien sieh leider nicht votlstiindig yon den Chloroplasten abtrennen, doeh diirfte der Gehalt an Kernen aaicht fiber 1 bis. 2% liegen, wie aus dem mikl'oskopisehen Befund hervorTging. Bet sorgfiiltiger Reinigung waren hingegen Zellwandfragmente mikroskopiseh niehf mehr fes.tzustellen. Wei- teren Aufsehlufl konnte der Gehalt der Chlo~oplasten an unliSslichen Zuekeri1 geben, die mi3glicherweise aus Zellwandverunreinigungen stain- men kiinnten. Der Gehalt an unltisliehen Zuekcrn schwankte be.i einzelnen Isolierungei1 zwisehe:n 3,7 und maximal 8,5% des Chloroplastengewiehtes (Anthronmethode, M o r r i s 1948). Hydrolyseversuehe be,i 100 ~ C ergaben, dal3 tiber 80% dieser Zucker dutch 1�89 nHsSO , in 35 Mimtten freigetegt werden. Sie ktinnen also nieht aus Zellulosebestandteilen stammen, wie im iibrigen aueh aus ihrer Zusammensetzung e1`sichtlieh ist: F~s wurden neben Galaktose und Ribo.se mehr Arabinose und Xylo.se als Glukose im Hydro- lysat gefunden. Sehliefilich ergab auch die auf andere Weise vorgenommene Ui1tersuchung einer Proteinfraktioi1, die die gefiirbten Chloroplastenpro- teide einsehlieflt, be,trgehtliche, offenb.ar an das Eiweifi ehem,iseh gebundene Zuekeranteile (H e b e r, im Druek), so daft der griSfite Teil des in den isolier- ten Chlo.ropla.sten gefundenen ui116slichen Zuekers auch in vivo dort lokali- sie,rt sein diirfte. Aus alledem geht he.r~zor, daft die Verunreinigung der Chloroplasten zum mindesten dureh Zellwandbestandteile vernachliissigt w erden kann.

4. Z u c k e r - u n d E i w e i f i b e s t i a n m u n g e n

An den isolierten Chloroplasten wurden Zucker- und Eiweifibestim- mungen durchgefiihrt. Zur Zuckerbestimmung fand die Anthronmethode (Mo r r i s 1948) Verwendung, und zwar wurden die Chloroplasten vor und nach dem Auswaschen mit heifiem Wasse1` untersucht, urn freie und ge- bundene Zucker zu erfassen. Der Gehalt der Chloroplasten an einzelnen Zuckern wurde quantitativ-chromatographisch bestimmt (He b e r 1958a).

Von den Eiweil~en interessie,rten vor allem die liSsliehen Anteile. Sie wur- den aus den Chloroplacsten mit Wasser ausgewasehen und naeh Abzentri- fug~e1,en der Chloroplasten mit Trichl.oressigsiiure gefiillt. Die resultierende Triibung liefi sieb ausphotometrieren, worauf mittels eines Standa1,ds die Eiweil~konzentration erreehnet wurde. Der pH-Wert de1` Chloroplasten blieb wahrend der Frosthiirtung konstant, so daft keine Elutionsartefakte infolge des pH-Einflusses auf die Wasserli~sliehkeit der Eiweifie zu be- fiirchten warei1.

Die ausgewaschenen Chl~roplastei1 erwiesen sich mikroskopisch als in- takt, wenn sie auch grob granuliire Struktur angenommen hatten.

Es set bemerkt, daft fiir diese Untersuchungen nur bis zu 40 mg Chloro- plastensubstanz zur Yerfiigung standen.

288 U. Heber

Paral lel zu diesen Unicrsuchungen wurden am glciche~ Pflanzenanater:ial Zucker-, Zellwandsubstanz- und Fros{re:sistenzbestiananungen durchgefiihrt (zur Methodik vgl. H e b e r 1958).

Ergebnisse und deren Diskussion

Im Ve.rlaufe unserer bisherigen Untersuchungen wurde festge.stellt, da~ Zucker ein sehr gutes FrostschutzvermSgen fiir Plasmaeiweif]e besi/zen. Nun wird aber eine sehr wesentliche Ro.lle der Zueker ger:ade neuerdings vo.n verschiedener Se.iie (u. a. P i s e. k 1950, S i m i n o v i t c h und B r i g g s 1954) bes{r~tten, da bei sehr frosiresistenten Pflanzen ein relativ niedriger Zuckerspiegel beobach/et wurde, w~hrend andere Arten ani~ hohem Zucker- spiegel eine niedrigere Resistenz aufweisen. Auch stimmf, wie school anehr- fach erwi~hnt und auch in den eigenen Untersuchungen best~itigt wurde. der Zuckerspiegel keineswegs immer mi{ dem Resis{enzverlauf iiberei, . We.nigstens teilweise l~il~t sich das letztere Ph~inomen dadurch erkl~irel~, daft nicht alle Zucker gleich s.tark gegen die Fro,stdenaturierung des eanp- findlichen Pro.reins wirken und auch bet hohe~m Zuckergehalt je nach dcr Zusammensetzung der Zucker eine geringere Wir'ksamkeit resultieren kann als. bet nie.drigere~ Spiegel n~.ir hShe~em Geha.l{ an Mo.no.sacchar~den (H e- b e r 1958). Diese Erkl~iilmg veranag abet vo.r allen Dingen nicht voll zu b.e- frie.digen, wenn die Unterschiede tan Zuekergehalt beim u mit der Fro,s~re,sis,tenz zu evident werden und wenn die o.sano.tischen Werte ethel" Art be~ gle~chzeitigen Schwankungen der Frosiresistenz konstant bleiben, wie das bet mediterranen Immergriinen der Fall ist (L a r c h e r 1954). Aul~er- dean verlangt diese Erkl~irung eine Vora.usseizung, die durchaus nicht erf[illf se~n muff. Sie forder.t n~imlich - - und dies gilt tfl3erhaupt fiir eine ~ber- t ragung tier .o,b.en am Modell erarbeitefen Yorstellung einer Fro.stschutz- wirkung .d.er Zucke~. ant die Zelle -- , daft die ZuckeT auf eine direkte Art und Weise wirken kiinnen, also. im Plasnla lokalisiert, sein miissen.

Bet den bi.sherdgen Untersuchungen wird abet tells stillschweigend davon ausgegangen, tells erwhhni, da~ die. Zucke~ als Inhaltssioffe des Zellsaftes zu b.etrachten s~nd. L e v i t t (1956) sagt ant Seit.e, 11, da$ den1 Zueke.r eine direkte Wirkung auf EiweiEe abzusprechen sei, da er in tier Vakuote lokali- siert w~ire.

Um iiber'haupt eine l~bertragung der in vitro gewo.nnenen Erkenntnisse iihe.r die Zuckerschutzwirkung auf die. Ze.lle vo~nehmen zu kiSnnen, war es also no.twendig nachzupriifen, ob Zucker zu e~nem wes.en{lichen Betrage tan Plasma lokalisiert sin.d. Welter war dann tunlichst zu untersuehen, ob und inwieweit eine unter'sch~edliehe Verteilung der Zucker inn.erhalb der Ze:ll.e an6glich und gegeb.en ist. Auch b.ei niedrigean Zuckers.piegel kann .}a, eine elek/ive Verteilung der Zucker vo~ausg.esetzt, ein guter Schutzeffekt resultieren.

Die expe~,ianentellen Miiglichke4ten zur Untersuchung sind sehr be- schr~inkt. Es bestehen drei denkbare Wege, um zu eJner Klhrung der' auf- geworfenen Fragen zu gelangen.

Zum ersten kann es mliglich sein, auf histochemisd~em Wege in siiu Aus-

Beziehungen zwisehen der GrSl3e yon Chloroplasten 289

sagen wenigstens qualitativer o.de.r halbquanti~ativer Ar~ fiber eine Ver- teilung yon Stoffen zu machen. Das ist aber schon bei hochmolekularen Sto.ffen schwierig und erscheint bei den niedermolekularen Zuckern unmSg- lich, da Diffusionsartefakte gaz' nicht auszuschlieflen sin.d, aufler'dem eine R.eaktion nicht zur u s~eh~, die. die Zucker gleichzeitig sichtbar macht u n d .am jew.eiligen Zellort unlSslich fe:stlegL Dieser Weg scheidet a l s o a u s .

Zum zweiten ist denkbar, Plasma und Vaknole zu trennen und gesondert zu untersuchen. Beim kleinzelligen Gewebe hSherer Pflanzen ist das aber bis je4zt nieh~ mSglidl. Gin gewisser Ausweg besteh:t insofern, als .es gelingt. einzetne Zellorganelle zu is.olieren, die mit Siehe.rheit dem Plasma ange- hbr'en. An solehen Zellorgandlen, yon denen wir auf Grund yon Eiweifi- untersuehungen und manometrisehen Messungen annehm.en k5nnen, dal~ si.e besonders frostempfindlieh s,ind, niimlich an den Chloroplasten, sollten ent- spreehende Untersuehungen vorgenommen werden, iib.er die gleieh no,eh be- richter wird.

Der dritte Weg ist an sich am einfaehsten zu begehen. Er besteht daril~, auf indirekte Weise Aufsehlufi zum einen iiber eine Lok.alisaiion und zum anderen iiber eine mengenmiiltige Verteilung van niede~mo.lekularen Stoffen zu erhalien. Naeh den neueren Erk.ennfnissen sind ja Tonoplast und Plasma- lemma nieht die einzigen se.mipermeablen Memb,ranen der Pflanzenzelle, sonde.rn ebenso werden Chloroplasten (G r a n i e k 1938) und wohl aueh Chondriosomen und Mikrosomen (T a f t und L e v i t t 1957, F a r r a n t, R o b e r I s o n und W i l k i n s 1,953) yon einer semipermeablen Hiille be- grenzt. Wenn nun im Verlaufe der Frosthiir'tung im Plasma oder an ein- zelnen Bereiehen des Plasmas niedermolekulare Substanzen - - beispiels- weise Zueker - - angesammelt werden, s.o ist zu fo,rdern, daft sieh das im osmotisehen gerhal ten ausdriiekt: Diese Zellorte miissen an u zu- nehmen, so.fern sie vo.n semipermeablen Membranen umgrenzt sind. Die Volumenzunahme muff sieh abet messen lassen. Ein Naehteil dieses Ver- fahrens ist es natiirlieh, daft nieht sieher Zu sagen ist, worauf eine gemes.sene Volum.enzunahme tat.siiehlieh zuriiekgeht, d. h. ob sie eine osmotisehe Reak- tio,n oder ein.e eehte gergrbl]ernng des untersneh~en Zdlbereiehs dars{ellt oder mSglieherweise sogar beides.

Wie Assimilationsmessungen ergaben, ist das Assimilatio.nssystem der Zelle, das in den Chloroplasten lokalisier• ist, besonders fros'tempfindlieh. In die gleietle Riehtung deutet aueh da.s Ver]mlten der frostempfindliehen Eiweififraktio.n, in der alle griin gefiirbten and somit in den Chloroplasten ]okalisierten Proteide enthalten sind. Die Chloroplasten miissen also vo.n der Zelle beim Resistenzerwerb besonders gesehiitzt werden, and es war an- zunehmen, daft an ihnen eventuell stafffindende Veriinderungen besonders leieht festzusfellen sin& Aus diesem Anlal~ wie aueh ans methodisehen Griinden wurden vergleiehende Gr51]enmessungen an Chloroplasten vor- genommen.

Solche Messungen erscheinen jedoeh nut dann sinnvoll, wenn die Bedin- gungen, unter denen die Pflanzen einer Fr,osthiiriung ausgese4zt werden, mSgliehst ko.nstant bleiben and so geartet sin& daft eine Zellvemmehrung

290 U. Heber

ausgesehlossen \st, damit nieht etwa sekund i re u wie Waehstum o. i . die Anderungen, die im Yerlaufe des Resistenzerwerbes und urs~iehlieh mit diesem ver kni ipf t vor sieh gehen, iiberdeeken oder mit ihnen inter 'ferieren ki3nnen. Es wurde deshalb die Frosih;ir tung in der Kii l tekammer bet kon- stan~ter Tenlpe,ra:tur under neunsti indiger Beliehtung vo~genommen. Die

GriM~enmessungen an den Chloroplas ten Chlo~op,ast~.- erfolgten fr i ihmorgens, damit nieht photo- ~urc.h . . . . e r synthet isch gebi lde ter Zucker, der wie-

der ab t ranspor t i e r t wird, eine osmotische Gr6f lenzunahme vort~iusehen konnte .

Abb. I zeigt die Ergebnisse der an den Chloroplas ten vorgenommenen Messun- gen, in O k u l a r m i k r o m e t e r e i n h e i t e n gegen

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Abb. 1. Abb. 2.

5O

Abb. 1. Der durchsdmittliche griJflte Durchmesser der Chloroplasten bet der Frost- h~irtung und -enth/irtung. K/iliekammerversuch 1957.

Ordinate: Chloroplastendurchmesser in Okularmikrometereinheifen. Abszisse: Ver- suchszeit in Tagen. - - - - H~irtungsversueh . . . . . . Kontrollversuch, x Criewener 192,

:7 Hauters II, A H/irtungsbeginn, B Enth~irtungsbeginn.

Abb. 2. Der durchsehnittliche Durehmesser der Chloroplasten bet der Frosth~irtung und -enth~irtung. K~iltekammerversuch 1958.

Zeichen wie in Abb. 1.

die Ve.r~suchsdaue:r aufgetragen. Es is:t eine deudiche VeCgrbfierung der Chlor~plastendurchmesser im Ve,rlaufe der Frv,sthiirtung festzusfellen. Mit de~ ~b.erCragung der Pflanzen in hShe.re Tenape~ature~ und der dab.eJ ein- setze~lden Enthi ir tung n.imn~t der Chlo,r~,plasCendur'chmess.er wie,der ab. Um diese iibe.r'ra.schen.d attsgepriigten Befunde an H an d yon Kontrol lver- suchen nachzupriifen, wurde die Sorte Criewener in gle~cher Weise zu

Beziehungen zwischen der GrSfie yon Chloroplasten 291

einem spiiteren Ze,itpunkt in der Kiiltekammer gehiirte~. Ira Verlaufe der Frosthhrtung liel~ sieh wieder eine eindeutige GrSfienzunahme der Chlo.ro- plas4en in der gleiehen GrSl3eno,rdnung wie beam ersten Yersueh beobaehten. In ein.em drJtten Vers.ueh fan,d keine de,rar~ starke GrSfienzunahme staff, doch nimmt aueh hier dex Chloro.plastendur'ehmesser mit Erhbhung der Frostresistenz zu und bei der Enthiir~ung wieder ab (Abb. 2).

Tab. 1 gibt zu den einzelnen in Abb. 1 angefiihrten Meflwerten unter Berii&siehtigung der ebenfalls ausgemessenen kleinen Aehsen d er Chloro- plasten u wieder, wob.ei das Chloroplastenvolumen zu Versuehsbeginn, d. h. im fro,stempfindliehen Zustand, gleieh Eins gesetzt

Tab. 1. Die Volumenzunahme oon Chloroplasten ros der Frosth~rtung.

I-I/~rtungsversuch Kontrollversuch (Temperatur + 2 bis --2 ~ C) (Temperatur ca. 14 ~ C)

It~rtungsdauer Chloroplasten in rel. Dauer in Tagen Volumeneinheiten in Tagen

0 1,0 0 10 1,8 14 19 2,2 24 21 2,9 33

Enthartungsdauer in Tg. (Temp. 14 ~ C)

5 2,6 12 1,6 17 1,2

Chloroplasten in rel. Volumeneinheiten

1,0 1,0 1,0 0,7

wurde. IIn Zustand der grSflten Frosfresistenz haben die frosthar~en Chloro- plasten ein etwa dreifaches Volumen gegeniiber dem ungehhr~eten Zus~and.

Worauf sind nun diese GrSflenzunahmen der Chloroplasten bei Er- h5hung der Frostresistenz zuriickzufiihren? Abb. 3 zeigt nebeneinander die ErhShung des Zuckerspiegels der Zelle, der Frostresistenz und des Chloro- plastendurchinessers im gle~chen Versuchsansatz. Beiin Vergleich ergibt sich, dal~ die GrSflenzunahme der Chloroplasten sowohl mit der Erh5hung des Zuekergehaltes als auch init der Erh6hung der Fro.stresistenz parallel geht. Aus dem Gleichgewiehtsverhalten yon Vakuole und Plasma wird klar, da[~ bei einer g 1 e i c h s i n n i g e n Zuekerzunahme in be i d e n Teilen de~ Zelle keine o.der nur eine unwesentliehe Grbl~enzunahme der Chloroplas~en resulfieren kann: Das Wasserbindungsverm5gen der Zelle insgesamt steigt zwar, doeh diirfte das kaum zu einer wesentliehen Grbflenzunahine der ein- zelnen morphologisehen Bestandteile der Zelle fiihren, da dem ja der Wand- druek entgegenwirkt. Geht abet die Zuekerzunahme yon Plasma und Va- kuole nieht gleiehsinnig -r sieh, sondern speiehert das Plasma Zueker, so wird es mit seinen Bestandteilen -- im speziellen Falle den Chloroplasten -- aus o,smotisehen Griinden auf Kosten der u ,,waehsen". Die b eob- aehtete GrSl~enzunahme der Chloroplasten kann natiirlieh aueh auf eine Speieherung voI1 Stoffen n u r in den Chlo.roplasten zuriiekgehen. Aus der

292 U. Heber

GriSl~enzunahme dieser Organel le liil~t sieh also nieht eindeutig entseheiden, ob eine Speiehe.rung yon Sto.ffen in den Chloroplas ten oder im gesamten P lasma vor sieh geht. Unse.re Beobaehtung, dal~ die Kerne yon Weizenzellen eine wesentliehe GriSl~enzunahme beim Erwerb der Fro,stresistenz im Gegen-

satz zu ein.em Befund yon K e s s 1 e r und ~ mik . . . . ter- R u h l a n d (1938) bei Zel lkernen y o n

b~'~-~ ei~h~it,n Semper t~ i tmm vermiss.en la.ss.e.n, weist je-

I0 20 T 30 40 Tage

TA -B Abb. 5. Vergleich zwisdmn dem Durehmesser der Chloroplasten und dem Zuekergehalt sowie der Frostresistenz der B1/itter im K/iltekammerversueh 1957 bei der Sorte Criewener 192. Linke Ordinate: Frostre.sistenz in ~ (diejenige Temperatur, bei der ~0% der Bl~itte'r iiber- lebten), Zuckergehalt in % des Blatttrockengewichte:s; rechte Ordinate: Chloroplastendurch- messer in Okularmikrometer- einheiten. Abszisse: Yersuehs- zeit in Tagen + Chloroplasten- durchmesser, o Frostresistenz, x Zuckergehalt, - - - - Hiir- tungsversuch . . . . . . . Kontroll- versudl, A H~irtungsbeginn,

B Enthfirtungsbeginn.

16

doeh da,rauf him da[t wi r einen Vorgang vor un.s haben, der s.ieh nur auf einzelne, eventuetl besonders frost.empfindliehe Zell- o.rganelle besehriinkt, sieh also nieht auf das ganze P lasma ers.~r,eckf. Sonsf miil~fe ja eine GrSl~enzunahme vo.n Kernen und Chlo.roplasten in der gleichen GriSl~en- ordnung liegen.

Au:s allen diesen Da ten wiire es miig- lieh zu fo.lgern, daft die beo,baehtete Chloro- plastenvergriSfierung .ant einer Zueker- a u f n a h m e be:ruht.

D,ie,se,r Sehlu~ ist jedoeh nieht zwin,gend, da neb.en einer osm.o,fis:ehen Chloroplasfen- ve,rgriSl~er=ng aueh eine GriS~enzun.ahme dutch A u f n a h m e odes Bildung quellfi ihiger hoehmolekularer Substanzen - - eveniuell yon Eiweilten - - mtiglieh ist. Zur Kliirung der Frage, ob nur Zu&er o.der auch Eiweil~e die Grbl~enzun.ahme der Chlo~o,plasten verurs.aehen, i,st d ie eh.e.mi.sehe Analyse heranzuz.iehen. D a m i t ko.mmen wi t zu P u n k t 2 der eingangs skizzie.rfen MiJglieh- keiten, tiber die Lokal isaf ion oder gar Spei- eherung yon Stoffen innerhalb der Ze]le zu entseheiden. Es i.st ngmlieh zu versuehen, die fraglichen Zellorganelle i'm gleich.en Zu- s tand wie in vivo zu i.solieren und fiir sieh zu unfersuehen.

Anfiinglieh isolierten wir Chlo.r:opla~sfen aus 0 ,5m wiil~riger Mannit l t isung und untersuehten ihrert Zuekergehalt . Dabe i stellfe sieh ganz iiberra.sehenderweise und im Gegensatz zu unseren' Annahmen her- ans, daft die Chloroplas ten fro,stempfind- lieher Pflanzen mehr Zu&.er enthiet ten ats die~enige,n r.esisfenter Pflanzen. Sehlie,fllich fand.en wir, daft dieser Zueker ga.r nieht fr.ei in den iso,lierten Chlor,o.plasten vorlag, sondern an Eiw.eil3e gebun,den war. Ent -

Beziehungen zwischen der GrSl~e yon Chloroplasten 293

weder enthielten also die ChloTo.plasten gar keinen Zucker oder es war bei der Isolierungsopera.fion eine Sch~digung dieser Ze]lorganelle einge,treten, in deren u vorhand.ener freier Zucke.r attsgewaschen wurcle..

In ein.em zuerst yon B e h r e n s (1938) angegebeneil Ver'fahren zur Ab- trennung vo,n Zel]bestandteilen aus organischen LSsungsmitteln fanden wit dann eine b.rauchbare Methode, den Lebendzustand zu fixieren und an- schli.el~end Chloroplasten ztt isolieren und zu untersuchen. Im apolaren o~ganischen LSstmgsmittel sind weder Zucker no,ch Eiweifle als. ausgepriigt polar ge]oaute Substanze.n 15slich, so daft Verlagerungsar/efakte nicht zu be~ fiirchten sin& Das Pflanzenmaterial wird innerhalb weniger Sekunden auf - -70 o C e~ngefroren, ge.fr%rgetrocknet -- wobei ebenfalls Lageve.r~nderun-

Tab. 2. Der GehaIt oon Chloroplas/en an wasserldslichen Eiroeil?en und Zuckern im Vergleich zum durchschnittlichen Zuckergehalt der ZeIle und zu ihrer Frost-

resistenz.

Material ungeh~irtet gehartet, geh~rtet Frostresistenz (50%-Totpunkt) -- 7 ~ C -- tO o C -- 140 C Zuekerspiegel der Zelle (Zueker

in % des troekenen Zellinhaltes) 4 8,8 24,9 freie Zueker der Chloroplasten

(in % d. trockenen Chloropl.-Subst.) 1 9,0 16,2 wasserlSsl. Eiwei~e d. Chloroplasten

(in % d. troekenen Chloropl.-Subst.) 7 22 59

gen niedermolekularer KSrper nicht eintreten kSnnen -- und in Petroliither/ TetraehlorkoMensfo.ff zersehlagen. Es war zu befiirehten, dal~ das apolare lipophile LSsungsmittel Lipoide, die einen wesentliehen Bestandteil de.r Chlo.roplasten bilden, extrahieren wiirde und so das Bezugsgewieht, die Chloroplasteilsubstanz, verfiilseht. Es zeigte sieh jedoeh, dal~ nieht einmlal Xanthophylle zu einem sehr wesentlichen Betrage extrahiert wurden. Das Chlorophyll blieb nahezu -vollstiindig in den Chloroplasten gebunden und damit wahrseheinlieh iiberhaupt alle an Eiweil3e festgelegten Lipoide. Aus dem Homogenisat wurde dureh Zentrifugieren bet verschiedene~ Dichte des organisehen LSsungsmittels Chloroplastenmaterial isoliert.

In ether bereits verSffentliehfeil Arbeit (H e b e r 1957) konnten wit bet der Analyse voil Weizeilpflanzen, die unter Feldbedingungen gewaehseil waren, z.eigen, dal3 niedermolekulare Zueker .einesteils in betriiehilieher Konzentration in den Chlor.oplasten vorliegen, .anderenteils dort sogar ge- spe~ehert werden kbnnen. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse voil Chlo~o- plastenun~ersuchungen wiihr'end einer Fros,thiirtung in der Kiilfekammer darges'te.llt. Aus einem Yergleieh ergibt sieh, daft der Anstieg der fret in den Chloroplasten ~zorliegenden Zu&er (Bezugnahme auf die Chloroplasteil- tro&ensubslanz) dem des Gesamtzuekers der Zelle (Bezugnahme auf die Zelltroekensubstanz abziiglieh der Zellwandsubstanz, also auf den gesamten Ze.llinhalt!) bei der Hiirtung ungefiihr parallel liiuft. Deutliehe:r ist da,s

Protoplasma, Bd. LI/2 22

294, U. Heber

noeh aus Versuchen zu ersehen, die in Abb. 4 dargestel l t sind. Es ist hier aber zu beriieksiehtigen, daft gar nieht ohne weiieres vergleiehbare Bezugs- griM]en als Mal~stab dienten! Die Chloroplas ten enthal ten ja ganz bedeutend mehr Festsfoffe als der Durehsehnit t des Zellinhaltes, was bet mikroskopi - seher Betraehtung sehml o hne wei teres aus dem yon den iibrigen Zellinhalts- bes tandte i len s tark abweiehenden Breehungsindex der Chloroplas ten her- vorgeht. So gibt R a b i n o w i t c h (1945) - - wahr:scheinlich zu hoeh! - - einen Fests~offgehalt der Chloropla.sten yon e twa 50% an, wiihrend wi t einen durehsehnitlliehen Feststoffgehalt des Zellinhaltes von ungefi ihr 10 bis 20% annehmen kiJnnen. Wenn die Chloroplas ten abe t beispielsweise einen

Tab. 3. Der p rozentuale Anteil der einzelnen Zucker am freien Zuckergehalt der Chloroplasten roghrend der Fro.sthiirtung in der K~ltekammer im VergIei& zu den

Chloroplasten-Zuckerroerten der Tab. 2.

Material: Criewener 192 ungeh~irtet geh~irfet gehartet Resistenz - - 70 C - - 10 ~ C - - 140 C freie Zucker in % des freien

Zuckergehaltes Frukto,se 17 7 7 Glukose 20 7 17 Saecharose 55 36 4,5 Raffinose 20 4,1 20 Trisaeeharid * - - - - 6 Tetrasaecharid 1 10 7 5 Pentasaccharid * - - 2 5

* Vgl. H e b e r 1958.

doppe l t s,o holmn Fes,t~stoffgchalt b,e:siizen wie de.r Durch.sehnitt de,r Zelle und wenn wet ter bei Bezugnahme au[ die beiden besproehenen Bezugs- gr'bl]en ein para l le le r Zuekeranstieg mit jeweils gleiehen W.erten ftir Ch]oro- p las ten und Zelldurehsehnitt bet der Fr'osthiirtung zu beobaehten ist, ergibt sieh daraus bet Bezugnahme auf eine vergleiehbare GrSfle - - e twa das Fr is&gewieht der Zelle und der Chlor'o.plas,ten - - ein doppe l t so hoher Zuekergehalt in den Chloroplas.ten wie im ZelldurehsehnitL Das bedeutet , daft eine Speieherung yon Zuekern in den Chloroplas ten s taKgefunden hat.

Den Antei] der einzelnen Zueker am freien Zuckergehal t der Chlm'o- pla.sten gibt Tabel le 3 im gleiehen Ye.rsuchsansatz wieder, der in Tabel le 2 e.rbrtert wurde. Eine besonde~re auffi i l l ige Veri inderung der Zusammen- setzung i.m Ver laufe der Zuekerakkumula t ion ist nieht zu bemerken.

Also hat .sieh bet tier analyt isehen Untersuehnng ge.zeigt, dal~ die be- obaehtete GrSI3enzunahme der Chlo.ro,pla,sten wenigsiens zum Teil auf osmo.tis&e Ursaehen zur'iiekgehen kann. Bet diesen Ergebnissen ist aller- dings zu bemerken, dal3 die Hbhe der Zuekerspeiehe.rung, wie wir sie friiher bet Fe ldmater ia l , da.s unter natiirliehen Bedingungen gewaehsen war , ge-

16

Beziehungen zwis&en der G r ~ e ~on Chloroplasten 295

funden haben (H e b e r 1957), im Kii l teka,nmerversuch nicht erreicht wird. Trotz dieser Be.funde bl~ibt .aber die F rage bestehen, ob nicht and , eine Anh~iufung yon quellfiihigen hochmolekularen StoFen an der GrSl~en- zunahme del" Chl~r~plas ten bet der Fros thhr tung b e~eiligt ist. Ta~s~ichlich ist nun eine s t a rke Zunahm e der wasser lSs l ichen Eiweil~e in den Chlo- rop las ten w~ihrend der F ros th~ r tung und eine A b n a h m e bet de r Enth~ir- tung z u verze ichnen , wie aus Tab. 1 und Abb. 5 h e r v o r g e h t . O f f e n b a r ist

,,r

,I t t t

I0 20 30 40 1-age

- 14

- 1 2

- 1 0

- 8

% ~

4,t - 3 2 - 14

24 - 12

\ - i -,o d' . . . . . - 8

~0 20 30 4 0 Tage

Abb. 4. Abb. 5.

Abb. 4. Zuckergehalt der Chloroplasten im Verglei& zum durchs&nittlichen Zucker- gehalt der-Zelle und zur Frostresistenz im K~iltekammerversueh 1958.

Linke Ordinate: Zuckergehalt in % (versehiedene BezuKsgrfl~en!); reehte Ordinate: Frostresistenz in ~ (diejenige Temparatur, bet der 50% der Bl~itter iiberlebten). o Frostresistenz, [] durehsehnittlieher Zuckergehalt der Zelle, bezogen auf den Zell- inhalt (= Trockensubstanz minus Zellwandsubstanz), x Gehalt der Chloroplasten an 15slichen Zuekern (bezogen auf die troekene Chloroplastensubstanz), - - H~ir-

tun gsversudl . . . . . . Kontrollversuch, A H~irtungsbeginn, B Enth~irtungsbeginn.

Abb. 5. Der Gehalt der Chloroplasten an wasserlSsliehen Eiweil~en im Vergleich zur Frostresistenz der B1/itter. K/iltekammerversudi 1958.

Linke Ordinate: wasserlSsliehe Eiweif~e der Chloroplasten in % der Chloroplasten- troekensubstanz; redlte Ordinate: Frostresistenz in 0C (50%-Totpnnkt der Bl~itter). Abszisse: Versnehszeit in Tagen. | wasserlSsliche Eiweil~e des Chloroplasten yon Criewener 192, [] wasserl6sliche Eiweil~e des Chloroplasten yon Hauters II, r~ Frost- resistenz; H~irtungsversudl . . . . . . Kontrollversud3, A H~irtungsbeginn,

B Enth~irtungsbeginn.

also die b e~bachtete, GrSflenzunahme~ der Chlor~plas ten bet der Fros thhr tung nicht n u r au f einen osmotischen Effekt, der durch elekfive Anhi iufung yon Zuckern zus, tandekommt, s~ndern auch au f eine Zunahme yon hodrmole- kularen, nur schwach osmotisch wi rkenden Eiweil~en zuriickzufiihren.

22*

296 U. Heber

Es ist nun zu fragen, ob sich die beobachteten Speichereffekte nur auf Chlo.roplasten beschranken: Wir kSnnen e s als sicher betrachten, daft die Chloroplasten ganz besonders empfindliche Teile d er Zelle sind, doch schlieftt das natiirlich nicht aus, daft andere Te~le der Zelle ebenfal ls eine Rolle als Angriffspunk~e de r Fros twirkung spielen. Da~ die Zellkerne yon W eizenbl~ittern keine sehr wesentlichen GrS~enveranderungen whhrend der Frosth~irtung aufweisen, wurde b ereits gesagt. Noch nicht abgeschlossene Untersuchungen an einer Chondr iosomenfrakf ion be rechtigen nns zu der Annahme, daft auch Chondriosomen wie Chloroplasten zur Anh~iufung yon Zuekern und 15slichen Eiweil3en w~ihrend de r Froslh~irtung befahigt sind.

Tab. 4. Der Gehalt oon ChloropIasten an roasserlSslir Eimei/ten und Zuckern im Vergleich zum durchschnittlichen Zuckergehalt der ZeIle und zu ihrer Frost-

resistenz. Feldversuch 1957.

Frostresistenz (50%-T0tpunkt) -- 11 ~ C -- 10 ~ C -- 10 ~ C Zud~erspiegel der Zelle (Zucker

in % des frockenen Zellinhaltes) 8,7 12,8 39,2 freie Zucker der Chloroplasten

(in % des trockenen Chloropl.-Subst.) 20,0 18,8 t5,3 wasserlSsl. Eiwei~e der Chloroplasten

(in % des trockenen Chloropl.-Subst.) 40,0 29,7 19,6

Aus allen diesen Ergebnissen scheint hervorzugehen, daft die Resistenz- steigerung durch eine Zunahme yon 15slichen Eiweil]en und Zuckern an Plasmaorten bewirk t wird, die der Fro s twirkung ausgesetzt sind, ohne Riicksidlt darauf , wie sich der Gehal t an diesen S toffen in der Vakuole hndert. E i n i g e Ergebnisse mahnen abet z u r VorsicM. In Tabel le 4 sind Analysenwer te ~on Chloro.plasten eines Feldversuches dargestellt . Es sei noch eJnmal da rauf hingewiesen, dal~ im warmen Gew~chshaus angezogene und in der K~iltekammer geh~rtete Pflanzen in ihrem Verhalt:en nicht un- wesenflich v o.n Pflanzen abweichen kSnnen, die au f dem Felde nafiirlichen Hiir• ausgesetzt waren.

In Tab elle 4 w i r d gezeigt, dal~ sich die Frostresistenz nicht wesenflich ~indert, obwohl der Gehal t an Zuckern und Eiweil~en in den Chloroplasten absinkt. Nun stellt eine Resistenz yon - - 1 0 o C eine recht geringe Frost- resistenz dar; denn frostempfindliche We~zenpflanzen "ve r~ragen unter den Bedingunge=n des Resistenztestes ohne weiteres noch Tempera tu ren yon - - 6 o C bis - - 7 o C. Es ist mSglich, daft. es nicht nu t auf e ine unterschiedliche Yer~eilung yon Frostschutzstoffen zwischen Plasma und Vakuole, sondern in Anbet rad l t des sublnikrosko,pischen Fe inbanes be~spielswe.ise der Chloro- plasten auch auf eine unter~schiedliche u i n n e r h a 1 b e.mpfindli- cher Plasmac~rte ankommt. Schliel~!ich ist denkbar, die beobachtete Unstim- migke,it auch s o zu erkl~ire~l, daft die Chlo,ro.plasten im Fe]dversudl bei hohem Prote in- und Zuckergehatt zwar no ch fro:stresistent waren, aber andere Plasmaorte b eTeits ihre Res.istenz verloren hatten. Die empfindlich- ste Stelle tier Zelle muft natiirlich deren ge,samte Fr~stresis~tenz b egrenzen.

Beziehungen zwis&en der GrS~e yon Chloroplasten 297

Zur Kl~irung a l l e r d ieser F r a g e n nli issen noeh we i t e r e U n t e r s u e h u n g e n

v o r g e n o n n n e n werden , doeh liil~t sieh bere i t s sagen, dal] of fenbar der Ver- teJ lung der s e h u t z w i r k s a m e n Stoffe eine z e n t r a l e B e d e u t u n g bet der Aus- b i l d u n g der F ros t res i s t enz z u k o m m i .

Z u s a m m e n i a s s u n g

Chl.o,roplasten VOil W e i z e n b l i i t t e r n weisen G r g f i e n s c h w a n k u n g e n auf , d ie dem G a n g der Frostresist .enz der Pf lanze folgen. D i e beobachte ten G r S f i e n v e r i i n d e r n n g e n im u l aufe yon Res i s t enze rwerb u n d -ver lus t s ind au f A k k u n m l a t i o n u n d A b g a b e yon n i e d e r m o l e k u l a r e n Zuckern u n d was- serlSslichen Eiweil3en zur i ickzuf t ih ren . Es w i r d die B e d e u t u n g dieser A n- h i i u f u n g yon Stoffen in den C h l o r o p l a s t e n ftir die Frostre,sistenz erSr terL yon d e n e n w e n i g s t e n s die Zucke.r in vitro, be.fhhigf .sind, empf ind l i che Plas- maeiwei f ie gegen die W i r k u n g des Frostes zu schiitzen.

Herrn Prof. Dr. H. U 11 r i c h sowie der Deuts&en Fors&ungsgemeinsehaft ge- biihrt Dank fiir die Untersttitzung und Fbrderung der Untersuehungen. Herrn Prof. Dr. F. W e i l i n g danke ieh fiir wertvolle Ratsehl/ige betreff's der statistisellen Be- handlung der Versu&sergebnisse, Frl. v. F r i e k e n und Frau F a u s t fiir ihre zuverl/issige Mitarbeit.

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