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Inhibition der nicht-enzymatischen Bräunung in Lebensmitteln
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten Der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Zur Erlangung des Doktorgrades
Vorgelegt von Taleb Khider Aus Syrien
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung : 17 Dezember 2007 Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Monika Pischetsrieder Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Ing. Heike Dörnenburg
Danksagung Allen voran ergeht mein herzlichster Dank an meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. Monika
Pischetsrieder für die Aufnahme in Ihre Arbeitgruppe, die engagierte Betreuung der Arbeit
und die wissenschaftliche und persönliche Unterstützung in den Jahren der Promotion.
Besonders bedanken möchte ich mich auch für die finanzielle Unterstützung im letzten Jahr
sowie die Unterstützung bei den Stipendienanträgen.
Mein Dank gilt weiterhin Frau Prof. Heike Dörnenburg für die Übernahme des Gutachtens
meiner Arbeit sowie Herrn Prof. Dr. Dr. Rudi Van Eldik für die Prüfung im Nebenfach im
Bereich Analytische Chemie und Herrn Prof. Dr. Peter Gmeiner für die Übernahme des
Prüfungsvorsitzes.
Für ihre Freundschaft und allgemeine Hilfsbereitschaft möchte ich mich bei meinen
Kolleginnen und Kollegen bedanken.
Schließlich sei noch ein ganz besonderes Dankeschön an meinen Eltern ausgesprochen, ohne
die ich wohl meine gesamte bisherige akademische Laufbahn nicht in diesem Maße hätte
verwirklichen können.
Außerdem danke ich dem Hochschulministerium der Syrisch Arabischen Republik, mit deren
Unterstützung die Durchführung dieser Arbeit hier in Deutschland erst ermöglicht wurde.
Taleb Khider
Für meine Eltern
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis .....................................................................................................................5
Verwendete Abkürzungen und Formeln................................................................................9
Ein- und Drei-Buchstabencode der proteinogenen Aminosäuren .....................................11
1. Bräunungsreaktionen.....................................................................................................12
1.1. Die enzymatische Bräunung .....................................................................................12
1.2. Die nicht-enzymatische Bräunung............................................................................14
1.3. Bedeutung der nicht-enzymatische Bräunung in Lebensmitteln...............................16
1.4. Inhibition der nicht-enzymatischen Bräunung in Lebensmitteln..............................18
1.5. Bedeutung von AGEs in der Medizin........................................................................20
1.6. AGE-Inhibitoren in der Medizin...............................................................................21 1.6.1. Typ A: Substanzen, die Aminogruppen der Aminosäuren inaktivieren (Zuckerkonkurrenten).......................................................................................................22 1.6.2. Typ B: Substanzen, die freie Carbonylgruppen blockieren..................................22 1.6.3. Typ C: Metallchelatbildende Verbindungen ........................................................22 1.6.4. Typ D: Dicarbonylfänger .....................................................................................22 1.6.5. Typ E: Inhibition des Abbaus von Amadori-Produkten.......................................23 1.6.6. Typ F: Spaltung von Quervernetzungsprodukten.................................................23
1.7. Zu Zeit verfügbare chemische AGE-Inhibitoren ......................................................23 1.7.1. Aminoguanidin .....................................................................................................24 1.7.2. Carnosin................................................................................................................26 1.7.3. Tenilsetam ............................................................................................................27 1.7.4. OPB-9195 .............................................................................................................28 1.7.5. Pyridoxamin .........................................................................................................28
2. Ziel der Arbeit.................................................................................................................29
3. Inhibition der Maillard-Reaktion in Lebensmitteln ...................................................30
3.1. Inhibition der Bräunung eines Lactose-Lysin-Modellsystems .................................30
3.2. Einfluss des Inhibitorzusatzes auf den pH-Wert der Proben....................................32
3.3. Inhibition der CML-Bildung in einem Lactose-Lysin-Modellsystem .......................34
3.4. Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ..................................................36
4. Inhibition der Maillard-Reaktion von Lactose mit β-Casein .....................................40
4.1. Eigenschaften des β-Casein......................................................................................40
4.2. Bestimmung von CML in β-Casein-Lactose Maillard-Reaktionsmischung mittels kompetitivem ELISA........................................................................................................41
4.3. CML-β-Casein Bestimmung mittels einer nicht-kompetitiver ELISA-Methode .......42 Prinzip des nicht-kompetitive ELISAs.............................................................................42
5
Inhatsverzeichnis
4.4. Untersuchung einer möglichen Kreuzreaktion des CML-Antikörpers mit β-Casein–Sulfit-Addukten..................................................................................................................... 45
4.5. Inhibition der Imidazolon-Bildung in Lactose-β-Casein-Maillardmischungen....... 46 Imidazolonbestimmung.................................................................................................... 46
4.6. Untersuchung der β-Casein-Lactose Maillard-Mischung mittels MALDI-TOF- MS 48
4.6.1. 4.6.1. Prinzip der MALDI-TOF-MS.................................................................... 48 4.6.2. MALDI-TOF-MS Massungen des nativen β-Caseins nach partieller enzymatischer Hydrolyse................................................................................................. 48 4.6.3. Theoretisch zu erwartende Peptidfragmente des mit Lactose erhitzten β-Caseins 50 4.6.4. MALDI-TOF-MS-Analysen des nativen und glykierten β-Caseins nach partieller enzymatischer Hydrolyse................................................................................................. 51 4.6.5. MALDI-TOF-MS-Analyse von intaktem nativem und glykiertem β-Casein...... 53
4.7. Einfluss der Reaktionsbedingung auf den Lactose-induzierten Abbau von β-Casein 54
4.7.1. Einfluss der Temperatur und der Erhitzungsdauer auf den Proteinabbau in Anwesenheit des Zuckers................................................................................................. 54 4.7.2. Einfluss der Zuckerart auf den Proteinabbau von glykiertem β-Casein .............. 56 4.7.3. Untersuchung zur Stabilität anderer Protein-Zucker- Modellsysteme................. 57
4.8. Zusammenfassung und Diskussion........................................................................... 58
5. Inhibition der Maillard-Reaktion in einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung..... 62
5.1. Einleitung................................................................................................................. 62
5.2. Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Bräunung einer Lactose-Pepton-Mischung. 62
5.3. Einfluss des Inhibitorzusatzes und der AGE-Bildung auf die pH-Werte der Lösungen .............................................................................................................................. 65
5.4. Inhibition der CML-Bildung in einer erhitzten Lactose- Pepton-Mischung............ 66
5.5. Inhibition der Bildung von fluoreszierenden Produkten in erhitzten Lactose- Pepton-Mischungen ............................................................................................................. 68
5.6. Inhibition der Lactulosylaminbildung in einer erhitzten Lactose- Pepton- Mischung 70
5.6.1. Lactulosylaminbestimmung................................................................................. 70 5.6.2. Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Lactulosylamin-konzentrationen in der erhitzten Lactose-Pepton-Mischung ................................................................................ 71
5.7. Statistische Bewertung der Ergebnisse .................................................................... 73 5.7.1. Anwendung des GLM-Verfahrens....................................................................... 74 5.7.2. Duncan-Gruppierung der Testsubstanzen bezogen auf ihre Fähigkeit, verschiedene Parameter der Maillard-Reaktion zu inhibieren......................................... 74 5.7.3. Korrelation zwischen den Faktoren Bräunung, Bildung von CML, fluoreszierenden Maillard-Produkten und Lactulosylamin.............................................. 76
5.8. Zusammenfassung und Diskussion........................................................................... 77
6. Inhibition der Maillard-Reaktion in Milch ................................................................. 80
6.1. Inhibition der Bräunung in Magermilch.................................................................. 80 6.1.1. Photometrische Bestimmung der Bräunung in rekonstruierter Magermilch ....... 81
6
Inhaltsverzeichnis
6.1.2. Einfluss der Erhitzung und des Inhibitorzusatzes auf den pH–Wert der Proben .82
6.2. Faktoren, die die Phasentrennung verschiedener Milchproben beeinflussen..........83 6.2.1. Einfluss des Inhibitorzusatzes ..............................................................................83
Untersuchung von fettarmer Milch (1.5% Fett) ...........................................................84 Untersuchungen von rekonstruierter Magermilch........................................................84
6.2.2. Einfluss der Pufferkonzentration..........................................................................85 6.2.3. Einfluss der Inhibitorkonzentration......................................................................85
6.3. Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ..................................................87
7. Isolierung, Strukturaufklärung und Inhibition der Bildung eines Maillard-Produktes aus einer Lactose-Lysin-Reaktionsmischung ....................................................88
7.1. Einfluss von Natriummetabisulfit auf Produktspektrum einer Lactose-Lysin Maillard-Mischung...............................................................................................................88
7.2. Einfluss der Zeit auf die Bildung des Maillard-Produkts.........................................89
7.3. Isolierung von 2-Hydroxymethylfuran aus der Reaktionsmischung.........................90
7.4. Identifizierung von 2-Hydroxymethyl-furan durch spektoskopische Methoden.......91
7.5. Zusammenfassung und Diskussion ...........................................................................94
8. Experimenteller Teil.......................................................................................................97
8.1. Chemikalien, Lösungsmittel und Verbrauchsmaterial .............................................97 8.1.1. Chemikalien..........................................................................................................97 8.1.2. Lösungsmittel .......................................................................................................97 8.1.3. Verbrauchsmaterialien..........................................................................................97 8.1.4. Puffer und Lösungen ............................................................................................98
8.2. Geräte- und Analysensysteme...................................................................................99
8.3. Inhibition Der Maillard-Reaktion in Lactose-Lysin-Mischung..............................103 8.3.1. Inhibition der Bräunung .....................................................................................103 8.3.2. Inhibitoren, die im Modellsystem verwendet wurden........................................103 8.3.3. Inhibition der CML-Bildung ..............................................................................103
Synthese von AGE-Lactose-Lysin .............................................................................103 Durchführung des polyklonalen CML-ELISA-Tests .................................................104
8.4. Inhibition der Maillard-Reaktion in β-Casein-Lactose-Mischung.........................105 8.4.1. CML-Bestimmunug der β-Casein-Lactose Maillard-Produkten mittels kompetitivem ELISA......................................................................................................105
Synthese von AGE-β-Casein......................................................................................105 Durchführung des kompetitiven ELISA Tests ...........................................................105
8.4.2. CML-β-Casein-Bestimmung mittels nicht-kompetitivem ELISA .....................105 Synthese von AGE-β-Casein......................................................................................105 Durchführung des nicht -kompetitiven ELISA Tests149 .............................................106
8.4.3. Imidazolonbestimmung mittels ELISA..............................................................107 8.4.4. MALDI-TOF-Messung ......................................................................................108
Probenvorbereitung ....................................................................................................108 Partielle enzymatische Hydrolyse der glykierten β-Casein-Proben mit Glu-C..........108 MALDI –TOF-MS- Analytik von AGE- β-Casein ....................................................109
8.4.5. Synthese von AGE- α-Lactalbumin oder β-Lactoglobulin.................................109 8.4.6. SDS-PAGE .........................................................................................................109
7
Inhatsverzeichnis
Das Trenngel .............................................................................................................. 109 Das Sammelgel .......................................................................................................... 110 Elektrodenpuffer ........................................................................................................ 110 Probenpuffer .............................................................................................................. 110 Probenvorbereitung für SDS-PAGE .......................................................................... 110 Fixierung / Färbung / Entfärbung............................................................................... 111
8.5. Inhibition der Maillar-Reaktion in Lactose-Pepton-Mischung ............................. 111 8.5.1. Vorbereitung der Proben.................................................................................... 111 8.5.2. Bestimmung von Maillard Produkten................................................................ 111
Bestimmung der Bräunung ........................................................................................ 111 Bildung von flureszierenden Produkten..................................................................... 111 Bestimmung der CML-Bildung ................................................................................. 112 Bestimmung von Lactulosylamin .............................................................................. 112
8.6. Inhibition der Bräunung in Milch und Magermilch .............................................. 112 8.6.1. Inhibition der Bräunung in der Magermilch ...................................................... 112 8.6.2. Inhibition der Bräunung in der Milch ................................................................ 113
8.7. Isolierung und Strukturaufklärung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produktes....... 113 8.7.1. Einfluss des Inhibitorzusatzes auf Lactose-Lysin–Maillard-produkte............... 113 8.7.2. Isolierung des 2-Hydroxymethyl-Furans aus der Probe ................................... 113 8.7.3. Struktur der aus Lactose-Lysin Maillard-Produkten isolierten Substanz .......... 114
9. Zusammenfassung der Dissertation ........................................................................... 116
10. Summary................................................................................................................... 121
Literaturverzeichnis............................................................................................................. 125
Liste der Testsubstanzen ..................................................................................................... 136
8
Verwendete Abkürzungen und Formeln
Verwendete Abkürzungen und Formeln Ab. Abschnitt Abb. Abbildung ABS Absorption AGE Advanced Glycation Endproduct
ALT-711 N-phenacyl-4,5-dimethylthiazolium bromide
AS Aminosäure
Aß ß-amyloid peptide
BSA Bovines Seriumalbumin
CBZ Carbobenzoxygruppe
Schutzgruppe für Aminofunktionen
CML Carboxymethllysin
COSY Correlation Spectoscoy
CVs Values of the Concentration
Da Dalton
DAD Diodenarraydetektor
DETAPAC Diethylentetraaminpentaacetic Acid
Diethylentetraaminpentaessigsäure
DHA Dehydroxy ascorbic acid
DTF 1-Deoxy-1-p-Toluidine-D-Fructose
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
Enzymgekoppelter Immuntest
GO Glyoxal
HMF Hydroxymethylfurfural
HPLC High performance liquid chromatography
Hochleistungsflüssigkeitchromatographie
HSA Humanes Serumalbumin
M.R. Maillard Reaktion
MALDI Matrix assisted laser desorption/ ionsation
Matrix-unterstützte Laserdesorption/ Ionsation
MGO Methyglyoxal
9
Inhatsverzeichnis
MWCO Molecular Weight cut off
Molekulargewichtsausschluss
MW Mittelwert
NMR Nuclear magnetic resonance spectroscopy
Kernmagnetresonanz spektroskopie
NO nitric oxide OLETF Otsuka-Lang-Evans-Tokushima Fat
OMA Oxalic acid monoamide
PBS Phosphate buffered saline
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Phos Phosphoserinreste
ROS reactive oxygen species RNS reactive nitrogen species StABW Standardabweichung
TFA Trifluoroacetatic acid
Trifluoroessigsäure
TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine
TNF-α Tumor Necrosis Factor-α
TOF Time of flight
Flugzeit
TP Thiamin- monophosphat
TPP Thiaminpyrophosphat
TWEEN 20Handelsname des nichtionischen Detergenz
Polyaa20 Sorbitan-Monolaurath
10
Verwendete Abkürzungen und Formeln Ein- und Drei-Buchstabencode der proteinogenen Aminosäuren
A Ala Alanin
C Cys Cystein
D Asp Asparaginsäure
E Glu Glutaminsäure
F Phe Phenylalanin
G Gly Glycin
H His Histidin
I Ile Isoleucin
K Lys Lysin
M Met Methionin
N Asn Asparagin
P Pro Prolin
Q Gln Glutamin
R Arg Arginin
S Ser Serin
T Thr Theonin
U Sec Selenocystein
V Val Valin
W Trp Tryptophan
Y Tyr Tyrosin
11
Einleitung
1. Bräunungsreaktionen
Während der Verarbeitung und der Lagerung von Lebensmitteln treten häufig
Bräunungsreaktionen auf. Bei der Herstellung von Gemüseprodukten findet diese Bräunung
z.B. durch die mechanische Beschädigung von frischen Ausgangsprodukten statt1. Die
Bräunung hat normalerweise einen negativen Einfluss auf die sensorischen Eigenschaften der
Produkte. Neben den Veränderungen in der Farbe verschlechtert sich auch das Aroma und es
tritt eine Abnahme der Nährwert des Produkts auf 1-3. Die Bräunung der Lebensmittel beruht
auf der enzymatischen und nicht enzymatischen Oxidation der Phenole, sowie auf der
Maillard Reaktion, die auftritt, wenn Mischungen von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen
und reduzierenden Zuckern erhitzt werden4. Im Allgemeinen ist es schwierig zu ermitteln, ob
die Bräunung nur enzymatisch oder nicht-enzymatisch abgelauft ist, außer wenn die Enzyme,
die für die enzymatische Bräunung verantwortlich sind, in dem Nahrungsmittel abwesend
sind oder inaktiviert wurden. In diesem Fall treten nur nicht-enzymatische Reaktionen auf5.
1.1. Die enzymatische Bräunung Die enzymatische Bräunung ist ein bedeutendes Problem bei einer großen Anzahl von Waren,
besonders bei Früchten wie Aprikosen, Äpfeln, Birnen, Pfirsichen, Bananen und Trauben, bei
Gemüse wie Kartoffeln, Pilzen und Kopfsalat sowie bei essbaren Meerestieren wie Garnelen,
stacheligen Hummern und Krabben. Die Färbung begrenzt die Lagerzeit vieler verarbeiteter
Nahrungsmittel und stellt auch ein Problem in der Produktion von getrocknetem und
gefrorenem Obst und Gemüse dar6.
Falls es notwendig ist, die helle Farbe eines Produktes zu erhalten, das geschnitten oder
getrocknet wird, ist eine Vorbehandlung erforderlich. Die Vorbehandlung hemmt nicht nur
die enzymatische Bräunung während der Verarbeitung, sondern verhindert oft auch die nicht-
enyzmatische Bräunung während der Lagerung. Die enzymatische Bräunung stellt jedoch
nicht immer einen Nachteil dar, sondern trägt zur erwünschten Farbe und zum Aroma
mancher Produkte wie Rosinen, Pflaumen, Kaffee, Tee und Kakao bei 6.
Die enzymatische Bräunung ist eine Verfärbung, die entsteht, wenn Monophenole der
Pflanzen oder der Schalentiere in Anwesenheit von atmosphärischem Sauerstoff und der
Polyphenoloxydase a zu den o-Diphenolen hydroxyliert und am Ende zu den o-Chinonen
weiteroxidiert werden4,7. Die Chinone kondensieren und reagieren nicht-enzymatisch zum
Beispiel mit anderen Phenolen oder Aminosäuren zu schwarzen oder roten Pigmenten von
unbestimmter Struktur8. Polyphenoloxydase (PPOs) (1,2-Benzinediol: Sauerstoffoxydo-
12
Einleitung Reduktase) sind kupferhaltige Enzyme, die die Tyrosinase, Diphenoloxydase, o-Diphenolase,
Benzkatechinoxidase, Catecholase und Phenolase einschließen8.
PPOs sind in einigen Bakterien und Pilzen, in fast allen höheren Pflanzen, einschließlich
Weizen, Tee, Kartoffel, Gurke, Artischocke, Kopfsalat, Birne, Papaya, Traube, Pfirsich,
Mango, Apfel und Kakaosamen, in einigen Arthropoden und in allen Säugetieren vorhanden.
In allen Fällen scheinen diese mit einer Pigmentierung im Organismus verbunden zu sein,
eine Schutzfunktion zu haben und somit eine lebenswichtige Rolle zu spielen2,9. In Pflanzen
sind lösliche und membrangebundene PPOs beschrieben. Das PPO-Gen ist im Kern kodiert
und im Cytoplasma transkribiert; das gebildete Pro-PPO wird dann zum Chloroplast
transportiert, wo es durch in eine Protease eine aktive Form gespalten wird2.
Man nimmt allgemein an, dass Pilz-PPOs vier Untereinheiten enthalten, obgleich unter
einigen Bedingungen in den octamerischen Formen gefunden werden. Bis jetzt haben alle
entdeckten PPOs die Fähigkeit, o-Dihydroxyphenol in o-Chinone mit Sauerstoff als
Sekundärsubstrat umzuwandeln (Catecholasetätigkeit). Jedoch nicht alle PPOs hydroxylieren
Monophenole. Ein Mechanismus für die Oxidation der Monophenole und der Diphenole wird
in Abbildung (1) vorgeschlagen.
Abbildung 1: Vorgeschlagener kinetischer Mechanismus der Oxidation von Phenolen zu Chinonen
durch die Polyphenoloxydase im Neurospora crassa2
Die o-Dihydroxyphenole, zu denen auch 3,4-Hydroxyphenylalanin (DOPA) und Tyrosin
gehören, sind die wichtigsten Substrate der PPOs in den höheren Pflanzen. Als Folge bilden
13
Einleitung
diese durch Oxidation der OH-Gruppen Chinonen, die eine große Rolle bei der Bräunung
spielen können.
Das Enzym Phenylalanin-Ammoniaklyase (PAL) ist ein Teil des Biosynthesewegs von
phenolischen Verbindungen. Inaktivierung der PAL und dadurch die Biosynthese der
phenolischen Verbindungen ist deshalb eine Methode, um die enzymatische Bräunung von
Früchte und Gemüse zu verhindern 2.
Weiterhin sind die Enzyme verhältnismäßig hitzelabil. Eine Hitzeinaktivierung der PPO ist
durchführbar, indem Temperaturen von >50°C angewendet werden, kann aber zu nicht
erwünschten Änderungen in der Farbe, der Aromen oder Struktur führen10. Infolgedessen
muss auch der Ausschluss von Sauerstoff und/oder die Anwendung von Inhibitoren wie
Säuren, Halogeniden, phenolischen Säuren, Sulfiten, Chelatbildnern wie Ascorbinsäure,
Chininkopplern wie Cystein und verschiedenen substratbindenden Mitteln in Betracht
gezogen werden6. Die wichtigsten Faktoren, die die Rate der enzymatischen Bräunung von
Früchten und Gemüse beeinflussen, sind die Konzentrationen der aktiven PPOs und der
phenolischen Substanzen, der pH-Wert, die Temperatur und der Sauerstoff Partialdruck. Das
pH-optimimum der PPOs liegt zwischen 5 und 7. Die Absenkung des pH-Werts mit Zitronen-
(Zitronensaft), Äpfel- oder Ameisensäure auf 4 oder geringer kann deshalb angewandt
werden, um die Bräunung in Säften, Fruchtscheiben, Avocados etc zu inhibieren. Eine weitere
Abnahme des pH-Wertes auf < 4 z.B. mit Zitronensäure, kann auf Grund der Komplexbildung
mit Kupferionen im aktiver Zentrum zur Inaktivierung des Enzyms führen11.
1.2. Die nicht-enzymatische Bräunung Die nicht-enzymatische Bräunung ist eine Verfärbung, die hergerufen wird durch:
• Die Maillard-Reaktion, in der Carbonylverbindungen, wie reduzierende Zucker,
Aldehyde, Ketone und Aminen, wie Aminosäuren, Peptiden, Proteinen12.
• Endprodukte der Caramellisierung oder Pyrrolse von Kohlenhydraten5, wobei die
Erhitzung von Zuckern über den Schmelzpunkt unter alkalischen oder sauren
Bedingungen stattfindet12.
• Bräunung der Ascorbinsäure durch deren spontanen thermischen Abbau unter aeroben
und anaeroben Bedingungen in Anwesenheit oder in Abwesenheit von
Aminoverbindungen5.
14
Einleitung
• Bräunung der Lipide durch die Oxidation ungesättigter Fettsäuren, wodurch
Carbonylverminderung gebildet weden, die polymerisieren. Diese Reaktion kann
durch Ammoniak, Amine oder Proteine beschleunigt werden5.
Die Maillard-Reaktion kann in drei Stufen unterteilt werden:
• In der frühen Phase bilden sich Glykosylamine, die in einer Amadori-Umlagerung
weiter reagieren.
• Eine mittlere Phase, in der ein Abbau der Zucker und Amadori-Produkte durch
Dehydratisierung und andere Prozesse erfolgt
• Eine späte Phase, die Aldolkondensationen, Polymerisierungen und die Bildung
stickstoffhaltiger Hetrocyclen und farbiger Produkte,der so genannten Melanoidine
beeinhaltet12.
Abbildung 2: Allgemeines Schema der Maillard-Reaktion
Der Schlüsselschritt ist die Amadori-Umlagerung, bei der unstabile Ketosylamine gebildet
werden, welche enolisieren und zu einer Reihe von Reaktionen der mittleren Phase führen12.
15
Einleitung
Maillard-Produkte scheinen die enzymatische Bräunung deutlich inhibieren zu können. Ihre
starker Inhibitionswirkung könnte mit ihren antioxidativen Eigenschaften zusammenhängen10,
welche z.B. auch die Lipide vor einer Oxidation schützen13. Neben diesen Vorteilen
begrenzen Maillard-Reaktionen die Lagerbeständigkeit verschiedener getrockneter Früchte
und Gemüse, Zitrusfruchtprodukte und Säfte14,15.
Ascorbinsäure ist der reaktivste Bestandteil von Orangensaftgetränken, der zu Bildung von
braunen Pigmenten führt, was in Anwesenheit von Sauerstoff und Aminosäuren beschleunigt
wird16. Die Vitamin C-Bräunung führt damit zum Abbau und zum Verlust dieses wichtigen
Vitamins, sowie unter anderen zur Produktion von Furfuralen. Vitamin C und seine
Abbauprodukte reagieren auch mit Aminosäuren in einer Maillard-ähnlichen Reaktion 17.
Zusätzlich zur Verfärbung verursachen die nicht-enzymatischen Bräunungsreaktionen somit
auch die Zerstörung von Nährstoffen wie zum Beispiel der essentiellen Aminosäuren und
Vitaminen. Darüber hinaus verringern sie die Proteinverdaubarkeit, inhibieren
Verdauungsenzyme und stören den Mineralmetabolismus durch Metallionenkomplexierung.
Diese Prozesse spielen vor allem in Milchprodukte eine große Rolle 18-21.
Weiterhin können, insbesondere in erhitzten Fleisch, Maillard-Produkte vorkommen, die
möglicherweise giftige und mutagene Eigenschaften besetzen 12,22.
Obwohl die nicht-enzymatische Bräunung eine Qualitätsverminderung in vielen Produkten
hervorruft, ist die Maillard-Reaktion in einigen Lebensmitteln auch erwünscht, wie z.B. in
Backwaren, gerösteten Nüssen und gebratenem Fleisch. Um den Mangel an Farbentwicklung
während des Kochens mit Mikrowellen bei bestimmten Nahrungsmitteln auszugleichen,
können relevante Ausgangsprodukte der Bräunung dem Lebensmittel zugegeben werden 23,24.
Darüber hinaus besteht das Aroma vieler Nahrungsmittel wie z.B. Kaffee aus flüchtigen
Produkten, die durch nicht-enzymatische Bräunungsreaktionen während der thermischen
Behandlung entstehen13.
1.3. Bedeutung der nicht-enzymatische Bräunung in Lebensmitteln Durch die nicht enzymatische Bräunung wird der Genusswert von erhitzten Lebensmitteln
wesentlich bestimmt. Die Ausbildung eines typischen Lebensmitteln Koch-, Back-, Brat-,
oder Röst- Aromas ist hierbei an erster Stelle zu nennen. Dafür sind die zahlreichen
heterocyclischen sowie nicht-cyclischen Verbindungen verantwortlich, die ab der
fortgeschrittenen Phase gebildet werden. Weiterhin wird durch die Farbbildung insbesondere
16
Einleitung beim Backen und Rösten eine charakteristische Bräunung erreicht25. Der Geschmack wird
z.B. durch die Bildung von Röstbitterstoffen beeinflusst 26.
Diese Veränderungen sind in dem für das jeweilige Lebensmittel typischen Umfang
gewünscht und charakteristisch. Darüber hinausgehende Veränderungen können zum off-
flavor führen. Dies trifft auch auf Umsetzung zu die für ein Lebensmittel nicht typisch sind
aber z.B. infolge längerer Lagerung auftreten 25,27.
Neben den organoptischen Eigenschaften nimmt die nicht-enzymatische Bräunung auch
direkten Einfluss auf die nutriven Eigenschaften. Hierbei spielt besonders die Verfügbarkeit
der essentiellen Aminosäuren eine große Rolle. Die chemische Modifikation einer
Aminosäure kann dazu führen, dass diese vom Körper nicht mehr für Proteinbiosynthese
genutzt werden kann. In diesem Zusammenhang schenkt man besonders Lysin
Aufmerksamkeit.
Zu einer Modifikation der essentiellen Aminosäuren kommt es erst im Verlauf der
fortgeschritten Phase, Wobei insbesondere Verluste bei den schwefelhaltigen Aminosäuren zu
verzeichnen sind. Daneben wird in diesem Stadium eine Abnahme der Verdaulichkeit des
gesamten Proteins beobachtet, welche die Verfügbarkeit sämtlichen einschränkt 27,28.
Die Minderung der biologischen Wertigkeit des Proteins einzelner Lebensmittel ist beim
gesunden Erwachsenen und einer gemischten Kost in der Regel kein Problem. In einigen
Fällen wo nur eine sehr begrenzte Anzahl von Lebensmitteln als Ernährungsrundlage dient
wie z.B. bei Säugligernährung ist jedoch erhöhte Aufmerksamkeit und die Anwendung
besonders schonender Technologien beton 28.
Eng Verknüpft mit der Stabilität und Haltbarkeit von Lebensmitteln sind antioxidativ
wirksame Stoffe. Beim Erhitzen von Lebensmittel kommt es zum Abbau von natürlichen
Antioxidationsmitteln. Gleichzeitig erfolgt aber auch eine Bildung von neuen antioxidativ
wirksam Verbindungen im Zuge der Maillard-Reaktion wie dies z.B. bei Milchprodukte
gezeigt werden konnte 28,29. Antioxidativ wirksam Maillard-Produkten wird auch in vivo eine
positive Rolle zugeschrieben werden30,31 konnten beispielsweise nachweisen, dass
Bestandteile aus einem Peptid-Glycose-Reaktionsgemisch aus Miso, einem gebräunten
Sojaprodukt, auch in vivo antioxidativ wirken. Die Aktivität gegenüber reaktiven
Sauerstoffspezies konnte insbesondere bei Peptid-Glucose-Reaktionsprodukten, Amadori-
Produkten Modell-Melanoidien und Melanoidinen aus verschieden Lebensmitteln wie Kaffee
und Miso gezeigt werden.
Die Produkte der Maillard- Reaktion werden kontrovers im Zusammenhang mit möglichen
mutagenen und karzinogenen Wirkungen diskutiert. In Modellansätzen und Lebensmitteln
17
Einleitung
konnten z.B. heterocyclische aromatische Amine identifiziert werden, welche sich in vitro-
und in vivo- Testsystemen als potente Mutagene und Karziogene zeigten 32. Gleichzeitig
werden jedoch auch antimutagene und anti-karzinogene Effekte durch Bräunugsprodukte
beobachtet, wobei insbesondere der antioxitativen Aktivität der Melanoidine eine
Schlüsselrolle zugeschrieben wird33. Die Maillard- Reaktion kann dazu benutzt werden die
funktionellen Eingeschaften von Lebensmittelproteinen unter ausschließlicher Verwendung
natürlicher Lebensmittelbestandteile gezielt zu verändern. So kann z.B. durch Konjungation
eines 43 kDa Sojaproteins mit Galaktomannan die Löslichkeit insbesondere im
isoelekttrischen Bereich, die Hitzestabilität sowie die emulgierenden Wirkung stark verbessert
werden, diese Modifikation beseitigt gleichzeitig die Allergenität dieses Sojaproteins 34.
1.4. Inhibition der nicht-enzymatischen Bräunung in Lebensmitteln
Mehrere Faktoren können die Bildung von braunen Melanoiden in den Lebensmitteln
beeinflussen. Unter diesen sind pH-Wert, Temperatur, Feuchtigkeitsgehalt, Erhitzungszeit,
sowie Konzentration und Struktur der Ausgangsverbindungen zu nennen35-39.
Die Bräunungsrate erhöht sich mit steigender Temperatur6, so dass eine Reduktion der
Temperatur während Lagerung diese Prozesse somit verlangsamen kann. Weiterhin
beschleunigt ein alkalischer pH-Wert die Reaktionen sehr und führt zu Veränderungen des
Produktspektrums12. Das Verringern des Feuchtigkeitsgehaltes durch Wasserentzug kann die
Reaktionen inhibieren, deren optimale Aktivität von der Wasseraktivität abhängig ist. Dieses
Verfahren kann aber nur durchgeführt werden, wenn das getrocknete Produkt in dieser Form
für den Verbraucher verwendbar ist und eine Lagerung unter Ausschluss von Feuchtigkeit
gewährleistet werden kann40.
Das Verpacken unter Schutzgas ist extrem nützlich, wenn die zu verpackenden Produkte
Sauerstoff enthalten. Durch Verwendung von Inertgas wird die Möglichkeit der
Lipidoxidation verringert, so daraus folgende die Bräununsreaktionen verhindert werden41.
Außer Temperatur, Sauerstoff, pH-Wert und Feuchtigkeit kann die nicht-enzymatische
Bräunung auch von anderen Faktoren beeinflusst werden. Die Bräunungsrate von Aldosen ist
z.B. im allgemein höher als die von Ketosen und die von Pentosen und kurzkettigen
Carbonylverbindungen höher als die von Hexosen. Basische Aminosäuren bräunen im
Allgemeinen leichter als saure Aminosäuren. Ihre Bräunungsaktivität folgt folgender
Ordnung: Lysin > β-Alanin > α-Alanin > Glutaminsäure12.
18
Einleitung Weiterhin werden chemische Inhibitoren werden benutzt, um die Bräunungsreaktionen
während der Produktion und Lagerung verschiedener Nahrungsmittel zu begrenzen. Häufig
werden dabei Sulfit, Bisulfit, Thiole und Calciumsalze verwendt42-44.
Sulfit und Bisulfite inhibieren z.B. die Umwandlung von D-Glukose zum 5-
Hydroxymethylfurfural, sowie die Umwandlung von Ascorbinsäure zu Furfural aufgrund
einer Blockierung der reduzierenden Gruppen (Abbildung 3). Infolgedessen wird die
Furfuralbildung blockiert und die Produktion farbiger Pigmente verhindert.
C
O
HO
CHO
HC
CH
O
HO
CH2OH
Oxidation
C
O
O
CO
HC
CH
O
HO
CH2OH
+ H2O
C
O OH
O
CO
HC
CH
OH
HO
CH2OH
CHO
CO
HC
CH
OH
HO
CH2OH
- CO2- H2O
CHOC
CH
CHHO
CH2OH
OH
CHOC
CH
CH
CH2OH
O
- H2OXyloson
-H2O
OOH
O
Ascorbinsäure Dehydroascorbinsäure 2,3-Diketogluconsäure
Furfural
+SO3-2CHO
C
CH
CH
CH2OH
OH
X
OS
O
O
Abbildung 3: Inhibition der Bildung von Furfural aus Ascorbinsäure nach Zusatz von Bisulfiten45,46.
Der Inhibitionseffekt von Calziumsalz liegt in der Chelatisierung der Aminosäuren durch das
Calcium.
Neben dem guten Einfluss der Sulfite auf die Bräunung stehen auch Nachteile für die
Gesundheit der Konsumenten z.B. die Sulfite reduzieren z.B. stark die Bindung von
Sauerstoffs an Blutfarbstoff Hämoglobin und können Thiamin zerstören. Thiamin ist
lebenswichtig für die Energieproduktion, die Funktion des Nervensystems und die
Proteinbiosynthese. Dazu gibt es viele Menschen, bei denen eine so genannte „Sulfit-
Empfindlichkeit“ vorliegt. Auf Grund dieser Nachteile der Sulfite, wird nach alternativen
chemischen Inhibitoren der Maillard-Reaktion gesucht47.
In diesem Zusammenhang muss festgestellt werden, dass nicht nur Bedarf besteht, die
späteren Reaktionen der nicht-enzymatischen Bräunung zu inhibieren, sondern auch die
frühen Reaktionen, da diese zu einer Blockierung essentieller Aminosäuren und damit zu
einer Reduktion des Nährwert führen.
19
Einleitung
1.5. Bedeutung von AGEs in der Medizin
AGEs (advanced end-products of the Maillard reaction) konnten bereits an verschiedenen
Proteinen und Zellen im Körper wie roten Blutkörperchen48, Augenlinsenprotein49,
Hautcollagen50 oder Lipoproteinen51 nachgewiesen werden. Die AGE-Bildung ist umso
ausgeprägter, je länger die biologische Halbwertszeit des Proteins und je höher die
Glucosekonzentration ist. So findet man einen hohen AGE-Spiegel, bedingt durch einen
erhöhten Blutzuckerspiegel, insbesondere bei Diabetes mellitus. Aber auch aufgrund der
verringerten AGE-Ausscheidung bei Niereninsuffizienz, sowie aufgrund der langen
Inkubationszeit allgemein bei Alterungsprozessen sind die AGE-Konzentrationen erhöht52.
Nicht nur aus Zuckern, sondern auch aus Fettoxidationsprodukten können sich AGEs bilden53,
die man streng genommen „advanced lipooxidation end-products“ (ALEs) nennt. So entsteht
Carboxymethyllysin (CML) nachgewiesenermaßen nicht nur durch Glykierungsreaktionen,
sondern auch bei der Reaktion von Proteinen mit Oxidationsprodukten mehrfach ungesättigter
Fettsäuren54. Der Einfachheit halber wird im Weiteren jedoch ausschließlich von AGEs
gesprochen.
Durch die Bildung von AGE-Strukturen ändern sich Ladung, Hydrophobizität und die
Tertiärstruktur von Proteinen. Aufgrund dessen kann es zu schwerwiegenden Veränderungen
der Eigenschaften und Funktionen von Proteinen, wie Enzymen, Carrierproteinen und
Rezeptoren kommen. In vielen Untersuchungen wurde mittlerweile ein Zusammenhang
zwischen einem erhöhten AGE-Spiegel und verschiedenen Krankheiten wie Diabetes
mellitus55, chronischer Niereninsuffizienz56, grauem Star57, Amyloidose58, Alzheimer59 und
Arteriosklerose60 nachgewiesen. Ob die erhöhten AGE-Konzentrationen Ursache oder nur
Folge dieser Krankheiten sind, ist noch nicht vollständig geklärt. Allerdings tragen die
strukturellen Veränderungen von Proteinen durch Glykierung zur Entstehung vieler
Folgeerkrankungen von Diabetes mellitus wie Augenlinsentrübung und diabetischer
Nephropathie bei.
Neben diesen Mechanismen, bei denen eine veränderte Tertiärstruktur von Proteinen, der eine
pathogene Wirkung von AGEs verursachen, wurden mittlerweile auch rezeptorvermittelte
Reaktionen als Ursache für den schädlichen Einfluss von AGEs auf den Körper gefunden. So
wurden mittlerweile AGE-Rezeptoren auf verschiedenen Zelltypen entdeckt61, die bei
Bindung von AGEs zelluläre Reaktionen auslösen können. 1992 beispielsweise wurde der
Rezeptor RAGE „Rezeptor für advanced glycation end products“ identifiziert62, von dem
20
Einleitung gezeigt werden konnte, dass er CML bindet und diese Wechselwirkung zu inflammatorischen
Reaktionen führt. Man nimmt an, dass dieser Reaktionsweg eine wichtige Rolle bei der
Entstehung von Arteriosklerose spielt63.
In Organen mit hohem Ascorbinsäuregehalt scheint auch die Ascorbylierung wesentlich zur
Modifikation von Proteinen beizutragen. So enthalten beispielsweise Augenlinsen hohe
Konzentrationen an Ascorbinsäure von bis zu 3 mM64, die dort durch das UV-Licht sehr leicht
zu Dihydroxyascorbisäre (DHA) oxidiert werden kann. Bei Untersuchungen der langlebigen
Augenlinsenproteine wurden hohe Konzentrationen an Ascorbylierungsprodukten wie
Oxalsäuremonoamid (OMA) gefunden65. Die Ergebnisse mehrerer Studien weisen auf einen
Zusammenhang zwischen Ascorbylierung und Entstehung von grauem Star hin66,67.
1.6. AGE-Inhibitoren in der Medizin
Bei der Suche nach Arzneistoffen gegen die AGE-bedigten Schädigungen bei Diabetes,
Niereninsuffizienz, Alzheimer, und für anderen Erkrankungen wurden in der Vergangenheit
zunächst in In-vitro-Modellsystemen die AGE-inhibierende Wirkung verschiedener
Substanzen getestet, die als AGE-Inhibitoren wirken.
Khalifah und al.68 haben die Inhibitoren der AGE-Bildung nach ihrer Wirkung auf die
Maillard-Reaktion klassifizieren (gekennzeichnet durch die Buchstaben A-F) (Abb.4) 68.
Abbildung 4 : Klassifikation der AGE-Inhibitoren15.
21
Einleitung
1.6.1. Typ A: Substanzen, die Aminogruppen der Aminosäuren inaktivieren (Zuckerkonkurrenten)
Typ A Inhibitoren (Zuckerkonkurrenten) reagieren mit freien Aminogruppen, um Reaktionen
von Zuckern mit Aminosäure zu verhindern. Beispiele solcher Inhibitoren sind Aldehyde,
Pyridoxal-Phosphat oder Acetylsalicylsäure69-71. Da es nicht möglich ist, alle
Proteinaminogruppen im Körper zu blockieren und es denkbar ist, dass lebenswichtige
Enzyme inaktiviert werden können, können diese Substanzen in den Konzentrationen, in
denen sie als AGE-Inhibitoren eingesetzt werden müssen, als Arzneistoffe nicht verwendet
werden.
1.6.2. Typ B: Substanzen, die freie Carbonylgruppen blockieren
Inhibitoren der Kategorie B reagieren mit Carbonylgruppen, einschließlich denen der Aldose-
it Proteinen reagieren.
iese Mittel wirken auf mehr als einer Stufe der Maillardkaskade. Aminoguanidin z.B.
minoguanidin und andere Hydrazinwirkstoffe, wie Hydralazin,
ende Verbindung. Übergangsmetalle proxidativ wirken und damit die AGE-Bildung
ibition der
smin gebunden, so
dass sie nicht an Oxidationsreaktione beteiligt sind. Deswegen scheint es nicht sinnvoll die
und Ketosezucker und inaktivieren sie, bevor sie m
D
reagiert als Hydrazin mit der Carbonylgruppe der Amadori-Produkte, Glyoxal (GO) und
Mehyglyoxal (MGO)72. A
Isoniazid und Gentamicin, rufen jedoch möglicherweise Nebenwirkungen hervor, da sie
Carbonyl-verbindungen im Körper, besonders Pyridoxal-Phosphat depletieren können73.
Antioxidatative wirksame Thiole, wie z.B Glutathion, können auch die Carbonyl-
verbindungen deaktivieren.
1.6.3. Typ C: Metallchelatbildende Verbindungen
AGE-Inhibitoren dieses Typs, wie DETAPAC, Phytat und Penicillamin74,75funktionieren als
chelatbild
fordern, kann in vitro die Inaktivierung von redoxaktiven Metallionen zu einer Inh
Maillard-Reaktion führen. Im Körper sind jedoch redoxaktive Übergangsmetalle in der Regel
an Trägerproteine wie Ferrition, Transferrin, Laktoferrin oder Cerulopla
Glycoxidation in vivo mit diesen Substanzen zu inhibieren.
1.6.4. Typ D: Dicarbonylfänger
Inhibitoren des Typs D, wie Aminoguanidin und L-Arginin blockieren reaktive
Dicarbonylzwischenprodukte, wie Glyoxal, Methyglyoxal, Glucosone unter Bildung von
22
Einleitung Triazinen und Imidazolonen72,76. Bei verschiedenen Krankheiten wie z.B. Diabetes ist die
Konzentration an reaktiven Dicarbonylverbindungen durch verschiedene Stoffwechsel-wege
aten oder Aceton und 3-
Deoxyglucoson aus Fructose-3-Phosphat gebildet. Da Dicarbonylverbindungen eine sehr
Bl
Aminosäuren, des Glucosons und
nte dass zwei Isoenzyme der Amadoriase (I, II) aus
Aspergillus-sp gereinigt wurden. Die beide bauen Amadori-Produkte mit niedrigem
e, anstatt ihre Bildung zu
omplikationen
1.7. Zu Zeit verfügbare chemische AGE-Inhibitoren
der ersten Gruppe verringern die AGEs-
Konzentrationen in Plasma und Gewebe und damit ihre pathophysiologischen Effekte
erhöht. So wird z.B. Methylglyoxal aus den Triosephosph
höhere Aktivität haben AGEs zu bilden als Zucker, könnte die ockierung dieser
Intermediate die Maillard-Reaktion in vivo effektiv zurückdrängen.
1.6.5. Typ E: Inhibition des Abbaus von Amadori-Produkten
AGE-Inhibitoren des E -Typs z.B. die Amadoriase ist auf Amadori Addukten gerichtet. Die
Amadoridase, die von Bodenbakterien gebildet wird, katalysiert die oxidative Deglykierung
von Amadori-Produkten unter Bildung der entsprechenden
Sauerstoffsuperoxidation77,78. Bisher kon
Molekulargewicht ab, die z.B. an Aminen oder Aminosäuren gebunden sind. In höheren
Organismen sind Amadoriasen bis jetzt nicht gefunden worden.
1.6.6. Typ F: Spaltung von Quervernetzungsprodukten
Inhibitoren des Typs F schließen Thiazoliumsalz wie Phenacylthiazoliumbromid (PTB) und
ALT-711 ein79-81. Diese Substanzen leiten sich von Thiamin (Vitamin B1) ab, das selbst als
Inhibitor der AGE- Bildung wirken kann82.
PTB und Alt-711 spalten bereits gebildete Quervernetzungsprodukt
verhindern. Ihr therapeutisches Bedeutung besteht deshalb darin, dass sie die K
aufheben, die in vivo durch Dicarbonylverbindung hervorgerufen werden. Als zugrunde
liegender Mechanismus wurde vorgeschlagen, dass diese AGE-Quervernetzungsprodukte, die
durch α–Dicarbonylverbindungen hervorgerufen werden, spalten. Jedoch gibt es bisher keinen
Nachweis dafür, dass α–Dicarbonylverbindungen bei der Bildung von AGE-
Quervernetzungs-produkten in vitro oder in vivo eine Rolle spielen.
Es gibt prinzipiell zwei Mechanismen, wie AGE-Inhibitoren physiologisch wirken können,
nämlich durch Verminderung des Gesamtgehalts an AGEs oder durch die Veränderung der
Zusammensetzung der AGEs. Inhibitoren
23
Einleitung
zurückzudrängen. Ein zweiter möglicher Effekt von AGEs-Inhibitoren könnte die chemische
Änderung bestehender oder der neu gebildeter AGEs sein, indem sie z.B. pathologisch aktive
AGEs zu nicht-aktiven Produkten abbauen. In den folgenden Abschnitten werden einige der
bekannten AGE-Inhibitoren vorgestellt (Tabelle 1).
Produktname/ chemischer Name Wirkung Chemische Struktur
Tabelle 1: Chemische Strukturen von AGE Inhibitoren
1.7.1. Aminoguanidin
Aminoguanidin wurde als ,,pimagedine“ von der Firma Alteon enwickelk, um die Reaktion
von Glucose mit Proteinen in vivo zurückzudrängen. Damit sollen Komplikationen vermindert
werden, die z.B. bei Diabetes oder der Alterung durch kovalente Proteinquervernetzung
hervorgerufen werden.
Als Derivat des Hydrazins kann Aminoguanidin reaktive Carbonylverbindungen, die während
der Maillard-Reaktion entstehen, wie z.B. Amadori-Produkte, abfangen und so ihre
Umwandlung zu AGEs verhindern.
Pimagedin/
Reaktion mit 1,2-Dicarbonylverbindungen und reaktive Sauer oder Sitckstoff Arten;
H2N NH
NH 2
NH
Aminoguanidin Chelatbindildner von Übergangmetallen
Carnosin (n=1) Homocarnosin (n=2)
Antioxidantien und Chelatbindildner von Übergangmetallen
N
HN COOH
NH NH2
O
n
® CAS 997/ Tenilsetam [(±)-3-(2-Thienyl)-2-piperazinon]
Inhibition der Quervenetzung von Proteinen sowie Pyrralin und fluoreszierenden M.P S
NH
NH
O
OPB- 9195/ 4-Oxo-N-phenyl-4,5-dihydro-2-[(1-methylethyliden) hydrazino]-5-thiazolacetamid
Fängt reaktive Carbonylverbindungen ab, Chelatbildner von Übergangmetallen, Inaktivierung von Hydroxylradikalen
NH
O S
O
NH
NN CH3
CH3
Pyridoin (R=OH)/ Pyridoxamin (R=NH2)
Chelatbildner mit Übergangsmetallen; Reaktion mit reaktiven Carbonylverbindungen N
OH
HO
R
CH3
N-Phenacyl-1,3-thiazoliumbromid Spaltung von Proteinquervernetzung, Chelatbildner von Übergangsmetallen
N
S
BrO
N-Phenacyl-4,5-dimethyl-1,3-thiazoliumchlorid (Alagebriumchlorid; ALT-711)
Spaltung von Proteinquervernetzung, Chelatbildner von Übergangsmetallen
N
S
OCl
Metformin Reduzierung der Konzentration an Methylgloxal N N
HNH2
NH NH
24
Einleitung Es wird vermutet, dass A nidin vor allem mit den Carbo adori-
Produkte in glykierten Proteinen re weitere Reaktionen inhibiert,
nung und Fluo würden.
Weiter führende Studien haben jedoch gezeigt, dass Aminoguanidin die Amadori-Produkte
heren Konzen r begrenzten Umfang blockiert. Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Mechanismus in vivo vermutlich keine Rolle spielt.
Aminoguanidin reagiert nicht nur mit Carbonylgruppen glykierter Proteine, sondern vor allem
du hylglyoxal oder Desoxyglu osonen.
logischen Bedingungen zu zwei
+)3 triazin und (-) 3-Amino-6-methyl-1,2 ,4-
triazin83 (Abbildung 5).
verbindun 3-Deoxyglucosone (3-DG) zeigen
neurotoxische Effekte in kultivierten kortikalen Neuronen. Diese Effekte waren mit der
a , der eine neuronale Apoptose folgte.
leichzeitige Behandlung, aber nicht Vorbehandlung, mit Aminoguanidin schützten die
gen die neur Produkte, MG und 3DG. Methylglyoxal
irkt auch auf die Neuroblastoma Zellenlinie SHSY5Y toxisch, wogegen die Cytotoxizität
orinkubation mit dert wurde84.
minogua nylgruppen der Am
agiert, sie blockiert und so
reszenzentwicklung führen die zu Bräu
nur bei hö trationen und in einem seh
mit Dicarbonylverbin ngen wie Glyoxal, Met c
Methylglyoxal reagiert z.B.
isomeren Triazinen, (
mit Aminoguanidin unter physio
-Amino-5-methyl-1, 2, 4-
Die Dicarbonyl gen Methylglyoxal (MG) und
Produktion reaktiver S uerstoffspezies verbunden
G
Neuronen ge otoxischen Effekte beider
w
durch V Aminoguanidin vollständig verhin
Abbildung 5: Die Reaktion von Glyoxal, Methylglyoxal, 3-Deoxyglucosone und anderen
α,β-Dicarbonylverbindungen mit Aminoguanidin.
25
Einleitung
Die Lipidoxidation führt zur Bildung reaktiver Aldehyde, die toxische Effekte auf Zellen
haben können. Aminoguanidin wurde verwendet, um die aus Lipiden stammenden α,β-
ungesättigten Aldehyde wie 4-Hydroxy-nonenal und Malondialdehyd abzufangen. Demnach
it Diabetikern, zeigte, dass die Behandlung mit Aminoguanidin eine
Carnosin (β-Alanyl-L-histidin) ist ein natürlich vorkommendes Dipeptid, das im Gehirn und
im Muskel von Säugetieren, einschließlich der Menschen, in hohen Konzentrationen
vorkommt. Es hat stark antioxidative, metallchelatbildende und antiglykierende
Eigenschaften. Letzteres ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass es in Konkurrenz zu
bevorzugten Glykierungsstellen der Proteine tritt. Als Folge verlängert es die Lebensdauer
kultivierter menschlicher Fibroblasten, tötet modifizierte Zellen und schützt Zellen gegen
Aldehyde und Peptidfragmente des Amyloids. Weiterhin inhibiert es in vitro die Bildung von
Proteinquervernetzungsprodukte, Carbonylverbindungen, AGEs und DNA-Protein-
quervernetzungsprodukten. Carnosin ist ein Aldehydfänger, z.B. für das Lipofuscin (Alter
Pigment und möglicher Vorläufer der Zuckerkrankheit Komplikationen, der ,,Atherosclerose“
und der Alzheimerkrankheit)88,89.
arnosine wurde gezeigt, dass es glykierung und Proteinquervernetzung inhibiert, die bei
eptiden wie z.B. Acetyl-Lys-His-amid (Aβ) oder bei Proteinen wie z.B. Crystallin,
Dihydroxyazetonphosphat und Fructose
blaufen89.
kann man annehmen, dass Aminoguanidin in vivo Gewebe gegen toxische Produkte schützt,
die durch oxidativen Stress aus Lipiden gebildet weden85.
Die Behandlung mit Aminoguanidin reduziert weiterhin die Expression von TNF-α, die NO-
Synthese und die Produktion von intraglomerulärem NO2-/NO3
- anregt86.
Eine klinische Studie m
statistisch signifikante und klinisch sinnvolle Reduzierung des im Urin ausgeschiedenen
Proteins ergab. Dieses Ergebnis führte dazu, dass Pimagedine als der erste AGE- Inhibitor
verwendet werden könnte, um die Weiterentwicklung der Nierenkrankheit bei zuckerkranken
Menschen zu verlangsamen87.
1.7.2. Carnosin
C
P
Superoxidedismutase (SOD) stattfindet. Es verhindert Glykierung und Quervernetzung, die
durch Ribose, deoxyribose, dihydroxyazeton,
a
Carnosin verhindert nach kurzer Inkubation vollständig die Inhibition der Aspartatamino-
transferaseaktivität durch Glucose-3-Phosphat. Dies deutet darauf hin, dass es durch endogene
Aldehyde abfangen könnte90.
26
Einleitung Weiterhin konnten neurotoxische Effekte von β-Amyloidpeptid (Aβ 25-35) auf
Endothelzellen des Rattengehirns durch Carnosin inhibiert werden. Substanzen, die ähnliche
ie Zellen ebenfalls,
.7.3. Tenilsetam
enilsetam ((R)CAS 997: (+/-)-3-(2-Thienyl)-2-piperazinon) wurde zuerst als anti-
für weitere Polymerisierungsreaktionen blockiert. Am
den AGEs und Pyrralin in der Nierenrinde und in der Aorta konnte durch die
Eigenschaften haben wie Carnosin, beispielsweise β-Alanin, Homocarnosin, der AGE-
Inhibitor Aminoguanidin und die Superoxiddismutase (SOD), schützen d
jedoch nicht so effektiv wie Carnosin. Der Wirkmechanismus des Carnosin liegt vermutlich in
seinen antiglykierenden und antioxidativen Eigenschaften. Sowohl die AGE-Bildung als auch
oxidativer Stress führen zu Schädigungen von Neuronen und Endothelzellen, welche für die
Alzheimererkrankung mitverantwortlich sind91.
1 T
ischämische, dann als Arzneimittel von ,,Cassella“ (jetzt Aventis) eingeführt und erfolgreich
für die Behandlung von Alzheimer-Patienten verwendet92.
In vitro inhibierte Tenilsetam die Proteinquervernetzung, die durch AGE-Bildung von
Glucose oder Fructose verursacht wurde. So wurde Kollagen z.B. für 4 Wochen mit 100 mM
Glukose inkubiert, was eine reduzierte enzymatische Hydrolysierbarkeit zur Folge hatte.
Diese konnte durch Coinkubation mit 100 mM des Tenilsetam wieder zum Ausgangniveau
gesenkt werden93.
Die Bildung von AGE-Quervernetzungsprodukte des Amyloidpeptid konnte ebenfalls durch
die AGE-Inhibitoren Tenilsetam, Aminoguanidin und Carnosin vermindert werden94. Als
Mechanismus wurde vorgeschlagen, dass Tenilsetam kovalent an glykierte Proteine bindet
und so die reaktiven Stellen
wahrscheinlichsten reagiert es mit Amadori Produkten und kann demnach als Typ E-AGE-
Inhibitor (Inhibition des Abbaus von Amadori-Produkten) angesehen werden. Um
festzustellen, ob Tenilsetam die Maillard-Reaktion in vivo inhibiert, wurden zuckerkranke
Ratten täglich mit (50 mg/kg) Tenilsetam behandelt. Der Diabetes induzierte Bildung von
fluoreszieren
Gabe von Tenilsetam unterdrückt werden. Es wurde deshalb postuliert, dass Tenilsetam als
AGE-Inhibitor Komplikationen in Folge von Diabetes verhindern könnte 95.
27
Einleitung
1.7.4. OPB-9195 OPB-9195 (2-Isopropylidenhydrazono-4-Oxo-Thiazolidin-5-ω-Lacetanilid) inhibiert in vitro,
konzentrationsabhängig effektiv die Bildung der beiden Quervernetzung und die Bildung von
AGEs96.
In vitro-Behandlung von murinen Fibroblasten und Thymozyten mit Glyoxal verursachten
umfangreiche Tyrosinphosphorylierungen von mehreren Proteinen, die durch die Zugabe von
en konnte. In einem Rattenmodell für Diabetes mellitus Typ II
das Thiazolidinderivat OPB-9195,
te, wie Malondialdehyd- und 4-Hydroxy-nonenal-Proteinaddukte wurden
eigten, die selbst
ie Wirkung von Aminoguanidin überstieg68,82. Pyridoxamin inhibiert weiterhin die Bildung
on Proteinaddukten, die während der Lipidperoxidation in vitro entstehen, indem es die
reaktiven Zwischenprodukte abfängt 100. Weiterführende Studien habe jedoch gezeigt, dass
edingt auf die Situation in vivo übertragbar sind.
OPB-9195 inhibiert werd
führten AGEs zu einer erhöhten Expression von Wachstumsfaktoren, wie TGF-beta und
endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) in den Nieren. Die war nach Behandlung mit
OPB-9195 verringert97. Daraus wurde geschlossen, dass
die Weiterentwicklung der diabetesabhängigen glomerulären Sklerose bei den Ratten durch
Erniedrigung der AGE-Konzentrationen im Serum und der Inhibition der glomerulären AGE-
Ablagerung zurückdrängt 98.
AGEs oder Glycoxidationprodukte, wie Carboxymethyllysin (CML) oder Pentosidin und
Lipoxidationproduk
in reichen fetthaltigen Streifen der Intima und in Makrophagen identifiziert. Nach einer
Ballonoperation an Herzarterien von Ratten, ein Modell für die Verdickung der Intima, waren
in den Arterien diese vier Addukte nachweisbar. Orale Einnahme von OPB-9195, ein
Inhibitor für Glycoxidation- und Lipoxidationreaktionen, verhinderte effektiv in den Ratten
die intimale Verdickung als Folge der Ballonverletzung 99.
1.7.5. Pyridoxamin Durch Inkubation mit Ribose konnten Proteine hergestellt werden, die reich an
Amadoriaddukten sind. Diese Zwischenprodukte wurden dann benutzt, um Verbindungen zu
identifizieren, die spezifisch die irreversible Umwandlung der Amadori-Produkte zu AGEs
inhibieren. Durch dieses Verfahren wurden verschiedene Post-Amadori-Inhibitoren getestet,
wobei Pyridoxamin- und Thiaminpyrophosphat die stärkste Inhibitonsrate z
d
v
die Ergebnisse nicht unb
28
Ziel der Arbeit 2. Ziel der Arbeit
Während der Zubereitung und Herstellung von Lebensmitteln laufen vielfältige chemische
Reaktionen ab. Wichtig ist hierbei vor allem, die Maillard-Reaktion,die zur Bildung von
Aromastoffen, Antioxidatien und vor allem auch braunen Farbstoffen, den Melanoidinen
führt. Aus diesem Grund wird die Reaktion auch nicht-enzymatische Bräunung genannt. Je
nach Produkt kann die Bräunung erwünscht (Brotkruste, gebratenes Fleisch) oder
unerwünscht (Trockenprodukte, Milchprodukte) sein. Da die unerwünschte nicht-
enzymatische Bräunung zu großen technologischen Problemen führt, wird nach
werden. Diese Reaktionen finden
vor allem bei Diabetes, Niereninsuffizienz und der Alterung statt und können wiederum
kationen bewirken.
Möglichkeiten gesucht, diese Prozesse wirksam zu unterdrücken. Zurzeit wird vor allem
Sulfit als wirksamer Inhibitor eingesetzt. Auf Grund von toxikologischen Bedenken, wird
jedoch nach alternativen Möglichkeiten gesucht. In der medizinischen Biochemie erfolgten in
den letzten Jahren große Bemühungen Wirkstoffe zu suchen, die eine AGE-Bildung
unterdrücken.
AGEs sind Reaktionsprodukte von Zuckern und Proteinen, die im menschlichen Organismus
nach Mechanismen analog zur Maillard Reaktion gebildet
krankheitsbezogene Kompli
Ziel dieses Projekts ist es, zu testen, ob AGE-Inhibitoren, die in der Medizin verwendet
werden, die nicht–enzymatische Bräunung in Lebensmitteln z.B. im Milchmodellsystem und
in der Milch unterdrücken können. Weiterhin soll der Einfluss einiger Bräunungsihibitoren
auf die Bildung verschiedener Maillard-Produkte, wie Lactulosylamin, fluoreszierenden
Produkte und CML untersucht wurde.
29
Lactose-Lysin-Maillard-Produkte
3. Inhibition der Maillard-Reaktion in Lebensmitteln
3.1. Inhibition der Bräunung eines Lactose-Lysin-Modellsystems
Die Inhibition der Maillard-Reaktion ist nicht nur ein wichtigstes Ziel in der Lebensmittel-
technologie, da die resultierende Produkte zu Qualitätseinflußen in Bezug auf Aussehen,
Geruch, Geschmack und Nährwert führen können, sondern auch in der Medizin, da
Glykierungsprodukte zu pathologisch wirken können. In der Literatur ist deshalb eine Reihe
von Substanzen beschrieben, die verschiedene Aspekte der Maillard-Reaktion unterdrücken
können. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, systematisch zu untersuchen, ob diese
Verbindungen in der Lage sind, die nicht-enzymatische Bräunung in einem Lebensmittel-
modell zu unterdrücken.
Es wird der Einfluss der folgenden 31 Substanzen auf die Bräunung getestet: Prolin,
Glutamin- und Asparaginsäure, Histidin, Tryptophan, Kupfer (II)- und Eisen (III) -Chlorid,
Zimtsäure, Kojisäure, o-Phenylendiamin, Carnosin, Pyridoxamin, Kaliumsorbat,
Natriumbenzoat, Natriumcitrat, Arginin, Aminoguanidin, Kreatin, Semicarbazid, Glutathion,
Liponsäure, Cystein, N-α-Acetylcystein, Mercaptoethanol, Natriummetabisulfit,
Natriumsulfit, Taurin, Thiamin, Pyridoxin, Acetylsalicylsäure und Ethylendiamin-
tetraessigsäure (EDTA).
Diese Substanzen wurden in der Literatur als Inhibitoren für die Bildung von mutagenen
heterozyklischen Aminen in Fleisch beschrieben101, sowie als Inhibitoren der Bräunung im
Lysin-Glucose-Modellsystem 102, als Inhibitoren für die Maillard-Produkte im bovinen
Linsenprotein103, als Bräunungs-Inhibitoren in Früchten und Fruchtgetränken17,104,105, als
Inhibitoren der nicht–enzymatischen Glykierung in vitro106, als Inhibitoren für
Lipidoxidation100,107 oder auch als Abfänger von Dicarbonylzwischenprodukten108.
Um den Einfluss der ausgewählten Substanzen auf die Bräunung der Proben zu testen,
wurden Mischungen von Lactose und Lysin in Anwesenheit von unterschiedlichen
Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 50 mM) der verschiedenen Inhibitoren für 30 Minuten bei 120
°C (Abschnitt 7.3.1) erhitzt. Die Absorptionen der Proben wurden bei 420 nm in
angemessenen Verdünnungen bestimmt. Die Ergebnisse in den Abbildungen 6 A-D
dargestellt.
30
Lactose-Lysin-Mallird-Produkte
0 mM
5 mM10 mM
20 mM50 mM
A
012
Prolin
Aspara
ginsä
ure
Glutam
insäu
re
Histidi
n
Natrium
citrat
Kreatin
Eisen (
III)Chlo
rid
Kupfer
(II) C
hlorid
Zimtsä
ure
Abs
orpt
ion
345
02468
Kojisä
ure
Arginin
Taurin
ylend
iamin
Carnos
in
ridox
amin
msorba
t
mbenz
oat
nogu
anidi
n
Tryptop
han
Lipon
säure
Abs
orpt
ion
o-Phe
n PyKali
u
Natriu
Ami
0 mM
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
B
012
Natrium
metabis
ulfit
Cystei
n
Natrium
sulfit
Thiamin
Acetyl
salic
ylsäu
re345
Abs
orpt
ion ohne
C
inh.5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
012345
Pyrido
xin
Glutha
tion
N-Ace
tylcy
stein
Mercap
toetha
nol
Semica
rbazid
EDTA
Inhibitor-Art und Konzentration
Abs
orpt
ion ohne Inh.
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
D
Abbildung 6: Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Bräunung im erhitzten Lactose-Lysin-
Modellsystem. Die Absorptionen wurden bei 420 nm vermessen.
Die Ergebnisse in Abbildungen C, D stellen der Mittelwert ± SD von 3 Messungen dar.
31
Lactose-Lysin-Maillard-Produkte
Die in Abbildung 6A dargestellten Substanzen zeigen keinen deutlichen Einfluss auf die
Bräunung. Das bedeutet, sie können die Bräunung in den Proben nicht inhibieren, während
Gegensatz dazu zeigen die übrigen Substanzen (Abbildungen 6C und D) einen deutlichen
die Substanzen in Abbildung 6B, die Bräunung verstärkt haben.
Im
inhibitorischen Effekt auf die Bräunung, der mit steigender Inhibitorkonzentration zunahm.
Um die Inhibitionsaktivität der Proben vergleichen zu können, wurde die Inhibitionsrate bei
jeder zugegebenen Inhibitorkonzentration anhand der folgenden Gleichung berechnet:
Inhibitionsrate der Probe (%) = 100-((Absorption der nicht-inhibierten Probe / Absorption der
inhibierten Probe)*100). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Inhibitorkonzentration
Inhibitor/ Inhibitionsrate(%) 5 mM 10 mM 20 mM 50mM
Natriummetabisulfit 36,23 80,90 92,74 97,86
Acetylsalicylsäure 22,15 39,78 65,70 96,54
N-Acetylcystein 35,90 54,24 75,15 94,27
Gluthation 31,72 51,66 77,46 94,07
Cystein 26,35 41,83 58,90 85,96
Thiamin 33,73 46,93 62,5 83,73
Semicarbazid 14,78 26,86 45,88 80,19
Mercaptoethanol 24,02 33,82 55,78 70,88
Natriumsulfit 13,24 22,27 64,82 68,62
Pyridoxin 15,51 29,73 44,13 53,36
EDTA 16,95 18,78 35,62 44,77
Tabelle 2: Inhibitionsrate der Bräunung im Lactose-Lysin-Modellsystem in Abhängigkeit von
Inhibitorkonzentration und Inhibitorart.
Die Inhibitionsrate der Bräunung nimmt, abhängig von der Inhibitorart, mit erhöhten
uss des Inhibitorzusatzes auf den pH-Wert der Proben Die Bildung von nicht-enzymatischer Bräunungprodukten ist vom pH-Wert abhängig.
Deshalb wurde getestet, ob der Inhibitorzusatz zu starken Veränderungen der pH-Werte in
den Proben führt. In diesem Fall wäre es möglich, dass ein scheinbar inhibitorischer Effekt
Konzentration der Inhibitoren zu.
Man kann die Aktivität der Inhibitoren nach ihrer Inhibitionsrate bei der Inhibitor-
konzentration (10mM) ordnen: Natriummetabisulfit > N-α-Acetylcystein > Glutathion >
Thiamin > Cystein > Acetylsalicylsäure > Mercaptoethanol > Pyridoxin > Semicarbazid >
Natriumsulfit > EDTA.
3.2. Einfl
32
Lactose-Lysin-Mallird-Produkte auf eine Veränderung des pH-Werts zurückzuführen ist. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3
veranschaulicht.
Inhibitor /pH 0mM 5mM 10mM 20mM 50mM
Natriumbisulfit 6,55 6,54 6,49 6,46 6,21
Natriumsulfit 6,56 6,56 6,51 6,49 6,44
Cystein 6,53 6,48 6,47 6,46 6,44
Prolin 6,52 6,47 6,46 6,45 6,44
Semicarbazid 6,51 6,50 6,45 6,42 6, 24
Pyridoxin 6,51 6,48 6,46 6,34 6,11
Thiamin 6,53 6,44 6,39 6,31 6,04
Aminoguanidin 6,52 6,52 6,53 6,56 6,73
Glutaminsäure 6,49 6,44 6,33 6,25 5,98
Asparaginsäure 6,47 6,43 6,35 6,25 5,99
Acetylsalicylsäure 6,53 6,4 6,30 6,17 5,62
Taurin 6,52 6,45 6,44 6,36 6,21
Histidin 6,49 6,47 6,43 6,44 6,52
Mercaptoethanol 6,47 6,57 6,57 6,58 6,58
EDTA 6,53 6,47 6,44 6,41 6,36
Natriumcitrat 6,52 6,50 6,49 6,48 6,47
o-Phenylendiamin 6,49 6,44 6,42 6,49 6,74
Pyridoxamin 6,53 6,29 6,17 6,10 6,00
Kreatin 6,52 6,50 6,42 6,41 6,432
Eisen (III) Chlorid 6,49 6,56 6,575 6,60 6,60
Kojisäure 6,49 6,42 6,38 6,33 6,29
Arginin 6,49 6,35 6,34 6,35 6,46
Tryptophan 6,49 6,37 6,35 6,30 6, 26
Natriumbenzoat 6,49 6,38 6,36 6,35 6,38
Kaliumsorbat 6,49 6,42 6,39 6,39 6,37
Ascorbinsäure 6,49 6,34 6,27 6,20 6,01
Zimtsäure 6,49 6,39 6,33 6,27 6,07
Kupfer(II)Chlorid 6,49 6,59 6,60 6,61 6,66
Calcium-Chlorid 6,49 6,57 6,59 6,60 6,63
N-Acetylcystein 6,49 6,47 6,45 6,42 6,27
Nicotinsäure 6,49 6,44 3,37 6,30 6,03
Glutathion 6,49 6,38 6,31 6,27 6,11
Liponsäure 6,49 6,47 6,46 6,43 6,35
Carnosin 6,47 6,40 6,36 6,39 6,39
Tabelle 3: pH-Werte der unter 2.1 beschriebenen erhitzten Proben.
33
Lactose-Lysin-Maillard-Produkte
Die Proben wurden vor der Erhitzung in 0,1 M PBS (pH 6,8) Puffer, wie unter Abschnitt 7.3.1
beschrieben, vorbereitet. Tabelle 3 zeigt, dass in Abwesenheit eines Inhibitors der pH-Wert
der Proben während der Erhitzung um durchschnittlich 0.3 sinkt. In Anwesenheit eines
n
3.3. Inhibition der CML-Bildung in einem Lactose-Lysin-
arboxymethy ein stabil produkt d kierung da ist
t höher als der G on andere s. Daher ines der w ten
wohl das am bes arakterisie E109. CM nt als M für
n Stress und als Indikator für Abbauprozesse in Lebensmitteln, die durch Hitze oder
g ausgelöst werden
drei verschiede kurrierende Mechanismen gebildet werden99 der
g lagert sich die Sc e Base um he sich zu durch die ion
se und Lysin bildet. madori-Produkt wird dann oxidativ zu CML und
nsäure abgebaut112. Über den alternativen Weg der autoxidativen Glycosylierung wird
ose74,113. Im dritten Reaktionsweg, dem so genannten
amiki-weg, entstehen zwei Kohlenstoff-Fragmente, unter anderem Glyoxal, durch
Inhibitors war der pH- Abfall geringfügig schwächer oder stärker ausgeprägt.
Insgesamt waren die Veränderungen der pH-Werte jedoch zu klein, um die beobachtete
inhibitorische Effekt zu erklären. Es wurde deshalb davon ausgegangen, dass die
Verbindungen direkt zu einer Verminderung der Bräunung führen.
Modellsystem
Da das AGE Nε-(C l)lysin es End er Gly rstellt,
sein Gehalt meis ehalt v n AGE ist es e ichtigs
und bislang ten ch rte AG L die arker
oxidative
durch Lagerun 110,111.
CML kann durch ne, kon . Bei
Glycoxidierun hiffsch , welc nächst Reakt
von Gluco Das A
Erytho
CML durch die Reaktion von Lysin und Glyoxal gebildet. Glyoxal entsteht durch metall-
katalysierte Autoxidation von Gluc
N
Fragmentierung und Oxidation der Schiffchen Base114.
Abbildung 7: Vereinfachte Darstellung der Entstehung von CML99
34
Lactose-Lysin-Mallird-Produkte Um Hinweise auf den Inhibitionsmechanismus der Verbindungen, die in den vorhegenden
Untersuchen am wirksamster waren, zu erhalten, wurde ihr Einfluss auf die Bildung einzelner
Maillard Produkte untersucht. Dazu wurde zunächst der Einfluss der Inhibitoren auf die
von CML gem . Lactose sin Mischungen wurden in Abwesenheit und
eit von untersch ichen Ko trationen schiedene hibitoren 30
Minuten bei 120°C erhitz. Nach entsprechenden Verdünnungen wurden die Proben für CML-
g eingesetzt (Ab itt 7.5.1) L wurde ttels ELIS nter Verw ung
lyklonalen anti-CM tikörpers (Abschnitt 7.5.2) bestimmt.
kompetitiven ELISAs
mung von CML in den Lactose-Lysin- Mischungen erfolgte mit einen
gekoppelten Immunosorbent Assay (ELISA). Die Vertiefungen von
titerplatten wurden m er konsta Menge an L-modifi em Protein belegt.
ch freien Bindungsste der Vertie en blockiert man mit un ifiziertem ein,
chuss zugegeb ird (=blo g). Man nützt bei diesen beiden Schritten die
fisch an Kunststoff zu
wurden dann mit den zu untersuchenden Proben, die in stark verdünntem anti-CML-
gelöst wurden, inkubiert (Antikörper-Rektion höher die zentration den
ten Modifikationen i n Proben ist, desto weniger Antikörpe det an di tte.
erfolgt die D tion der undenen örper mittels eines Se är-
pers, der an den erst ntikörper et (=label . Verwendet wird beispielsweise
egen gewonnen wurde. Dieser Antikörper trägt
ung der Extink des geb ten Farbstoffs die Menge des gebundenen
sichtbar gemacht werden. Die Farbreaktion sollte dann durch Zugabe von
lsäure abgebrochen den, wenn Extinktion rte in etw
en das Lambert-Beersche Gesetz nich ehr gültig Eine st e
Analytenkonzentration bewirkt eine Erhöhung der Inhibition und damit gleichzeitig eine
ng der Absorptio weniger Antikörper an die Platte binde
bnisse
nen werden als Mittelwerte in
der Tabelle 4 dargestellt.
Entstehung essen –Ly
Anwesenh iedl nzen ver r In für
Bestimmun schn . CM mi A u end
eines po L An
Prinzip des Die Bestim
kompetitiven enzym
Mikro it ein nten CM ziert
Die no llen fung mod Prot
das im Übers en w ckin
Eigenschaften von Proteinen aus, sich unspezi binden. Die Platten
Antiserum ). Je Kon an
gesuch n de r bin e Pla
Anschließend etek geb Antik kund
Antikör en A bind ing)
ein Antikörper gegen Kaninchen-IgG, der in Zi
ein Enzym, das eine Farbreaktion katalysiert. Nach Zugabe eines Leukofarbstoffes kann über
eine Mess tion ilde
Antikörpers
Schwefe wer die swe a bei 1,5 liegen, da bei
höheren Extinktion t m ist. eigend
Verringeru n, da n.
Die Erge
Jede Probe wurde viermal gemessen und die CML-Konzentratio
35
Lactose-Lysin-Maillard-Produkte Inibitor
Konzentration ABS1 ABS2 ABS3 ABS4 ABS5 MW A Stab. A
CML-konz.
ng/ml
0mM 1,57 1,45 1,35 1,4 1,4 1,24 0,12 1641,25
15mM 1,42 1,39 1,36 1,35 1,28 1,27 0,07 1976,32
10mM 1,45 1,4 1,46 1,37 1,31 1,4 0,06 1664,27
Tabelle 4: CML-Bestimmung in einer erhitzten Lactose-Lysin-Mischung, der unterschiedliche
Konzentrationen von verschiedenen Inhibitoren zugegeben worden war. Die Quantifizierung erfolgte
mittels ELISA unter Verwendung eines polyklonalen anti-CML Antikörpers.
Man sieht anhand dieser Tabelle, dass die CML-Konzentration in den Lactose-Lysin-
CML.
3.4. Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse In diesem Abschnitt wurde der Einfluss von 31 Substanzen auf die Bräunung im Lactose-
Lysin-Modellsystem getestet.
Die Inhibitoren Natriummetabisulfit, Natriumsulfit, Cystein, N-α-Acetylcystein, Mercapto-
ethanol sowie Glutathion zeigten eine starke inhibitorische Wirkung auf die Bräunung. Die
Thiole können dabei an unterschiedliche Stufen der Maillard Reaktion eingreifen42,43.
Mischungen mit steigender Inhibitorkonzentration nicht abnimmt.
Möglicherweise stören die zugesetzten Inhibitoren die CML-Bestimmung mittels ELISA. Aus
diesem Grund wurde in den folgenden Versuchen die inhibitorische Wirkung der
Testsubstanzen auf die CML-Bildung in Lactose-Protein Mischungen untersucht. Dieses
System hat den Vorteil, dass nicht verbrauchter Inhibitor vor der ELISA-Bestimmung leicht
durch Dialyse entfernt werden kann.
Ein weiterer Vorteil ist die sehr viel höhere Affinität des polyklonaler CML-Antikörpers
gegen Protein gebundenes CML im Vergleich zu freiem
20mM 1,64 1,59 1,65 1,56 1,54 1,6 0,05 637,57
Nat
rium
met
abis
ulfit
50mM 1,5 1,45 1,48 1,44 1,46 1,47 0,03 1278,89
0mM 1,61 1,57 1,71 1,61 1,52 1,6 0,07 623,5
5mM 1,4 1,46 1,52 1,73 1,69 1,56 0,14 822,58
10mM 1,44 1,44 1,5 1,61 1,61 1,52 0,09 1023,06
20mM 1,39 1,4 1,44 1,48 1,71 1,48 0,13 1190,32 Pyrid
oxin
50mM 1,01 1,39 1,44 1,45 1,61 1,38 0,23 1775,46
0mM 1,3 1,35 1,38 1,42 1,62 1,42 0,12 1561,7
5mM 1,54 1,49 1,57 1,62 1,78 1,6 0,11 632,88
1 1,42 1,47 1,44 1,52 1,44 0,07 0mM 1,33 1450,67
20mM 1,44 1,53 1,54 1,68 1,63 1,56 0,1 803,38 Cys
tein
50mM 1,95 1,93 1,99 2,11 2,1 2,01 0,08 Nd
36
Lactose-Lysin-Mallird-Produkte
37
R 1
OH + R 2 NH 2
H+
R 1
OHNH 2
+R 2
-H 2O
Kohlenhydrate Amine,z.B. Proteine Hemiketal
R 1 CH NH R 2
Schiff base
braune Produkte
R 1
OH + R 2 SH
-H 2O
R 1 CH (OH) S R 2
Thiol Thiolhemiketal
R 1 CH (OH) S R 2 + R 2 SH R 1 CH (SR 2)
Thioketal Abbildung 8 : Möglicher Inhibitionsmechanismus der nicht-enzymatischen Bräunung durch Thiole
nach Friedman43
Im Gegensatz dazu werden die Effekte des Sulfits weniger gut verstanden, obgleich es eine
größere nukleophile Reaktivität als die Thiole besitzt.
Es wurde vorgeschlagen, dass Natriumsulfite oder Natriummetabisulfite in flüssigen
Lebensmitteln Sulfitionen bilden können (Abb.9), die z.B. mit 3,4-Dideoxy-hexosulos-3-en
(DDH) zur stabilen 3,4-Dideoxy-4-sulfohexosulose (DSH) reagieren115.
S2O52-
+ H2O 2 HSO3-
HSO3- SO3
2- + H+
Abbildung 9: Bildung von Sulfitionen in flüssigen Lebensmitteln nach Zusatz von
Natriummetabisulfit bzw. Natriumsulfit.
CHO
C O
CH
CH
CHOH
CH 2OH
+ S O-
O
O-
:H
+
, 4-Dideoxyhexosulos- 3-en 3, 4-Dideoxy- 4-sulfohexosulose
SO
O-
O
CHO
C
CH
O-
C
CHOH
CH 2OH
HS OO
-
O
CHO
C O
CH 2
C
CHOH
CH 2OH
H
bbildung 10: Bildung von DSH aus DDH und sulfithaltigen Substanzen 99.
en kann, die den größten Einfluss auf den
3
A
DSH hat eine geringre Aktivität im Bräunungsprozess als DDH, weil es wahrscheinlich keine
α, β-ungesättigten Carbonylzwischenprodukte bild
Lactose-Lysin-Maillard-Produkte
Bräunungsprozess haben sollen99. Man kann die höhere inhibitorische Aktivität des
N ium abisulfit im rg mit Natriumsulfit durch die Reaktionsgleichungen in Abb.
9 e n. Ein M kü etab it se zwe lfiti fr elche zwei
Dicarbonylzwischenprodukten reagieren können.
Nicht a hwefelhal n S anze nnte och Brä g in eren. S tärkt
z.B. Liponsäure die Bräunung sogar (Abb.6 B).
Die Rolle von Aminoguanidin bei der Inhibitio r B g vo uore renden s aus
D rb wischenpr kte der eren Lipidoxdationprodukten hnitt
1.3.3.1 beschrieben. Jedoch findet ma ationen über die Rolle
v Am aunidin au e Inhibition der Bräunung.
A ild 6 B) zeig ass inoguanidin ebenso wie Kre die
angege Reaktio din gen tärkt lgli konn sie letzte ase der
d-induzierte Protein-
uervernetzung vor. Die Ergebnisse in Abbildung (6 D) zeigten, dass es auch die Bräunung
GE-Bildung oder Protein-
g inhibiert werden kann, verstärkt diese Verbindung die
somit z.B. die Bräunung von
Traubensaft118. Jedoch zeigte es unter den gewählten Bedingungen nur eine schwache
in B Derivate wie Pyridoxal, Pyridoxal-Phosphat und Pyridoxamin
illard-Zwischenprodukten wie Glyoxal oder
bilden
kann108, die möglicherweise zu farbigen Produkte führen.
atr
,10
met Ve leich
rkläre ole l M isulf tzt i Su onen ei, w mit
lle sc tige ubst n ko n jed die unun hibi o vers
n de ildun n fl szie AGE
ica onylz odu n o spät wurde in Absc
n in der Literatur keine Inform
on
bb
inog f di
ung ( t, d Am atin Bräunung unter den
benen nsbe gun vers . Fo ch ten die Ph
Maillard-Reaktion entweder nicht inhibieren oder sie bilden mit Carbonyl- oder
Dicarbonylverbindungen Zwischenprodukte, die zu braunen Triazinen weiter reagieren83.
Lehman103 schlag Semicarbazid als Inhibitor für die Maillar
Q
inhibiert. Die Wirkung ist jedoch schwächer als die der Thiole oder von Sulfit.
Obwohl Carnosin, Taurin und Arginin103 als Inhibitoren für die A
Quervernetzung wirken, konnten sie unter den hier gewählten Bedingungen die Bräunung
nicht inhibieren (Abb.6 B). Möglicherweise weisen die Addukte von Inhibitor und Maillard-
Zwischenprodukten eine braune Farbe auf.
Obwohl durch die Reaktion von o-Phenylendiamin mit α-Dicarbonylverbindungen die AGE-
Bildung sowie die Protein-Vernetzun
Bräunung, was auf farbige Chinoxalinaddukte zurückgeführt werden könnte103,116,117.
EDTA inhibiert den oxidative Abbau der Ascorbinsäure und
inhibitorische Wirkung auf die Bräunung.
Pyridoxin und alle Vitam 6
können als Inhibitoren der Post-Amadori-Produkte, der Lipoxidation in vivo, der Bildung von
fluoreszierenden AGEs, CML oder frühren Ma
Glycolaldehyd68 wirken.
Abbildung 6 D zeigt, dass Pyridoxin die Bräunung inhibieren kann, im Gegensatz zu
Pyridoxamin, das cyklische Glyoxal- oder Glycolaldehyd-Pyridoxamin-Addukte
38
Lactose-Lysin-Mallird-Produkte Thiamin (Vitamin B1) und seine Derivate wie Thiaminpyrophosphat (TPP) und Thiamin-
monophosphat (TP) können die AGE-Bildung in BSA/Glucose-Mischungen inhibieren82.
Abbildung (5 A) zeigt, dass Thiamin auch die Bräunung zurückdrängt.
Es wurde gezeigt, dass einige Aminosäuren entweder die Bildung von mutagenen
heterocyclischen Aminen (Tryptophan, Prolin)101, die Protein-Quervernetzung (Arginin)103
oder die Bräunung inhibieren. Die oben vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass in dem hier
gewählten System diese Aminosäuren entweder keinen Einfluss auf die Bräunung haben
(Prolin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure), oder sie sogar verstärken (Arginin,
Tryptophan). Zimtsäure, Kojisäure und Benzoesäure-Derivate sind effektiv als
Komplexmittel119 oder Inhibitoren der Polyphenoloxidation und Mutagenbildung8, zeigen
jedoch unterschiedliche Wirkungen auf die nicht-enzymatische Bräunung. Kojisäure verstärkt
bitor der enzymatische Bräunung in Apfelsaft, keinen Einfluss auf die
o ng führt, sowie bei Glycoxdations-reaktion. Die
, dass eine weitere Zugabe dieser Ionen keinen
nes kompetitiven ELISAs mit polyklonalen anti-CML-
Antikörpern die CML-Konzentrationen in einer erhitzten Lactose-Lysin-Mischung zu
bestimmen, wobei die Bräunung in den Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen
unterschiedlicher Inhibitoren verhindert wurde. Es wurde erwartet, dass die CML-
Konzentration mit steigender Konzentration der Inhibitoren abnehmen würde. Die Ergebnisse
in Tabelle 4 zeigen jedoch, dass die CML-Konzentrationen schwanken, ohne dass ein
deutlicher Einfluss der Inhibitoren auf die CML-Bildung erkennbar wäre. Es wurde vermutet,
dass die Ursache der schwankenden CML-Konzentrationen eine Reaktion der nicht
mgesetzten Testsubstanzen mit den CML-Antikörpern sein könnte.
it Zucker-Protein
im Gegensatz zur Acetylsalicylsäure die Bräunung (Abb.6 A, B), während Zimtsäure, trotz
seiner Aktivität als Inhi
nicht-enzymatische Bräunung zeigt.
Es wurde weiterhin die Wirkung der drei Konservierungsstoffe Kaliumsorbat,
Natriumbenzoat und Natriumcitrat auf die Bräunung getestet. Hierbei ergab sich, dass zwei
von ihnen, Kaliumsorbat und Natriumbenzoat, die Bräunung verstärken können, Natriumcitrat
jedoch keinen Einfluss hat.
Die Anwesenheit von Eisen (III)- und Kupfer (II)-Ionen spielt einen große Rolle bei der
Zucker-Aut xidation, die zur AGE-Bildu
Ergebnisse in Abbildung (6 A) zeigen jedoch
Einfluss auf die Bräunung hat.
Schließlich wurde versucht, mittels ei
u
Aus diesem Grund wurde in den folgenden Experimenten die Versuche m
Maillard Lösungen wiederholt.
39
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
4. Inhibition der Maillard-Reaktion von Lactose mit β-Casein
4.1. Eigenschaften des β-Casein β-Casein ist einer der Caseinfraktionen der Milch (α, β, χ, γ). Es macht 25-30 % des Proteins
n. Die 5 Positionen 136-209 enthalten
hen
der aus Milch und hat eine ähnliche Eigenschaften wie αS1-Casein. Die Variante A2 besteht
aus einer Peptidkette mit 209 Resten und einem Molekulargewicht von 24.5 kDa. Die 5
Phosphoserinreste sind in den Positionen 1-40 lokalisiert, die darüber hinaus praktisch die
gesamten ionisierbaren Reste des Moleküls enthalte
dagegen vorwiegend Reste mit apolaren Seitenketten. Insgesamt ist die Struktur des Moleküls
mit polaren Kopf und apolarem Schwanz als seifenähnlich zu bezeichnen. Aus CD-
Messungen folgt, dass β-Casein ca. 9% α-Helix und ca. 25% β-Struktur enthält.
Temperatursteigerung führt zu einer Erhöhung der β-Struktur auf Kosten des aperiodisc
Anteils. Die Selbstassoziation ist endotherm. Das Protein ist mit Ca+2 bei den in der Milch
vorkommenden Konzentrationen fällbar. Bei T ≤ 1°C ist es aber auch das Calciumsalz gut
löslich.
Abbildung 11: Aminosäuresequenz von bovinem β-Caseinmilchprotein (Variante A2)
40
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte 4.2. Bestimmung von CML in β-Casein-Lactose Maillard-
Reaktionsmischung mittels kompetitivem ELISA
Lactose-β-Casein Mischungen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von
unterschiedlichen Konzentrationen von Natriummetabisulfit, dem effektivsten Bräungs-
inhibitor, für 30 Minuten bei 120 °C erhitzt (Abschnitt 7.4.1). Die Proben wurden dialysiert
und dann gefriergetrocknet. Aus den gefriergetrockneten Proben wurden Lösungen von
1mg/ml Protein in Wasser hergestellt. Diese Lösungen wurden für die CML-Bestimmung
verwendet. Die CML-Bestimmung wurde, wie im Abschnitt 7.4.1 beschrieben, durchgeführt.
Die Platten wurden mit 0,5µg/ml CML-HSA belegt. Die noch freien Bindungsstellen der
Vertiefung blockiert man mit fettarmer Milch. Dazu wurden dann gleichzeitig verdünnte
Lösungen der Proben oder des CML-Standards und des CML-Antiserums gegeben. Dabei
findet eine Konkorenzreaktion zwischen dem Antigen, mit dem die Platte belegt wurde, und
dem CML-β-Casein der Proben um das zugegeben CML-Antiserum statt. Je höher die CML-
Zugabe eines Leukofarbstoffes (TMB-Lösung) kann über eine
titivem ELISA bestimmt wurden, dargestellt. Man sieht, dass
Konzentration der Proben ist, desto geringer ist die Menge an ungebundenem Antiserum, das
mit dem CML-HSA reagieren kann. Danach entfernt man das nicht mit dem CML-HSA
gebunden Antiserum. Anschließend bindet ein Enzym gekoppelter sekundärer Antikörper an
den ersten Antikörper. Nach
Messung der Extinktion des gebildeten Farbstoffs die Menge des gebundenen Antikörpers
sichtbar gemacht werden. Die Farbraktion kann mit einer verdünnten Schwefelsäure gestoppt
werden. In Tabelle 5 sind CML-Gehalte der β-Casein-Lactose-Maillard-Reaktions-
mischungen, die mittels kompe
die CML-Konzentration in den β-Casein-Lactose-Maillard-Mischungen keine erkennbare
Tendenz zeigte. In diesem Versuch kann jedoch ausgeschlossen werden, dass die zugesetzten
Inhibitoren stören, da die Proben vor den ELISA-Messungen dialysiert wurden. Konzentration von
Natriummetabisulfit
Absorption
(ABS1) ABS2 ABS3 ABS4 ABS5 MW SD
berechnete CML-
Konzentration ng/ml
0mM 0,161 0,155 0,132 0,119 0,132 0,140 0,018 713,92
15mM 0,152 0,142 0,163 0,200 0,203 0,172 0,028 483,37
10mM 0,168 0,173 0,155 0,131 0,147 0,155 0,017 586,34
20mM 0,161 0,156 0,154 0,205 0,204 0,176 0,026 463,54
50mM 0,174 0,191 0,195 0,194 0,167 0,184 0,013 427,69
Tabelle 5: CML-Konzentration in β-Casein-Lactose-Maillard Reaktionsmischungen, die in
Anwesenheit unterschiedlicher Inhibitorkonzentrationen erhitzt wurden. CML wurde mittels
kompetitivem ELISA unter Verwendung eines polyklonalenen Antikörpers bestimmt.
41
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
Im Folgenden wurde deshalb versucht, die ELISA-Bedingungen zu optimieren. Besonderes
genmerk wurAu de zunächst auf das Protein gelegt, mit dem die Platte belegt wurde. Tabelle 6
zeigt die CML-Gehalte in den gleichen β-Casein-Lactose Maillard Reaktionsmischungen, die
waren. Für diese Versuche wurde der gleiche
ompetitive ELISA verwendet, nur das hier die Platten mit 15µg/ml AGE-β–Casein belegt
im letzten Versuch bereits vermessen worden
k
wurden.
Konzentration von
Natriummetabesulfit
Absorption
(ABS1) ABS2 ABS3 ABS4 MW SD
Berechnete CML-Konzentration
ng/ml
0 mM 0,164 0,202 0,183 0,183 0,183 0,016 304,42
5 mM 0,110 0,106 0,20 0,125 0,115 0,009 361,72
10 mM 0,120 0,150 0,151 0,200 0,155 0,033 327,75
20 mM 0,098 103 0,107 0,111 0,105 0,006 369,40
50 mM 0,084 0,098 0,098 0,113 0,098 0,012 375,24
Tabelle 6: CML-Bestimmung in β-Casein-Lactose-Maillard Reaktionsmischungen, die in
Anwesenheit unterschiedlicher Inhibitorkonzentrationen erhitzt wurden. CML wurde mittels
kompetitivem ELISA unter Verwendung eines polyklonalenen Antikörpers bestimmt. Die Platten
wurden dazu mit AGE-β–Casein beleg.
Erneut schwanken die CML-Werte, ähnlich wie bei den vorgehenden Messungen, wobei eine
Tendenz nicht erkennbar ist. Dashalb wurde festgestellt, dass das Antigen, dies zur Belegung
der Platten verwunendet wurde nicht die Ursache der Schwankung der CML-Werte war.
Zur Bestimmung der CML-ß-Casein-Konzentration, wurde deshalb eine nicht-kompetitive
ELISA-Methode verwendet.
.3. CML-β-Casein Bestimmung mittels einer nicht-kompetitiver LISA-Methode
p des nicht-kompetitive ELISAs
eim nicht-kompetitiven ELISA handelt es sich um die einfachste Variante des ELISAs.
es sich beim
ntigen um ein Protein, kann es direkt eingesetzt werden, da Proteine unspezifisch an
unststoffe binden. Ist das Antigen kein Protein, muss es an ein Protein gekoppelt werden,
über das es somit an die Mikrotiterplatte gebunden wird. Freie Bindungsstellen am Kunststoff
werden durch ein anderes Protein z.B. Magermilch blockiert, damit der anschließend
zugegebene enzymmarkierte Antikörper nicht unspezifisch an die Platte binden kann. Die
4E
Prinzi B
Hierbei wird das Antigen auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Handelt
A
K
42
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte Farbreaktion zur Detektion wird durch Zugabe eines entsprechenden Substrates für das am
per gebundene Enzym gestartet. Hierbei ist das erhaltene Signal diAntikör rekt proportional
ur Konzentration des Antigens.
kompetitivem
ELISA unter Verwendung eines polyklonalenen Antikörpers bestimmt. Die Ergebnisse sind als
M on ess en d stellt
Die Abbildung mac eu d ie rp bz ie it
steigender Inhibitorkonzentration eb s s wa Ge atz rwartun t, dass
Natrium bisulfit ild on en ard uk nhi
Eine m wandlung von
z
Eine Variante der Methode verwendet zwei Antikörper, wobei der erste nicht-enzymmarkierte
Antikörper gegen das Antigen gerichtet ist. Der zweite Antikörper ist enzymmarkiert und
erkennt spezifisch den ersten Antikörper. Dies kann durch eine erhöhte Signalintensität zu
einer gesteigerten Empfindlichkeit führen, wenn der erste Antikörper in der Lage ist an mehr
als einen der gegen ihn gerichteten enzymmarkierten Antikörper zu binden.
Ergebnisse Die gleichen Proben, die für die CML-Bestimmung mittels kompetitivem ELISA (Abschnitt
7.4.2) verwendet wurden, werden mittels nicht-kompetitivem ELISA untersucht. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 12 dargestellt.
Abbildung 12: Die Abhängigkeit der Absorption bzw. CML-Konzentration und Natriummetabisulfit
Konzentration in Lactose-β-Casein-Maillard-Mischungen. CML wurde mittels nicht-
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
0 5 10 20 50
Konzentration von Natriummetabisulfit (mM)
AB
S
ittelwerte ± SD v vier M ung arge .
ht d tlich, ass d Abso tion w. d CML-Konzentration m
enfall teigt, s im gens zur E g steh
meta die B ung v spät Maill Prod ten i biert.
ögliche Erklärung wäre, dass die Inhibition der Bräunung durch Um
Amadori-Produkten in CML erfolgt. Das Amadori-Produkt kann als Ausgangverbindung für
farbige Melanodine fungieren, während das CML ein farbloses Endprodukt darstellt.
43
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde der Einfluss von Aminoguanidin auf die CML-
Konzentration in den Lactose-β-Casein-Maillardmischungen mittels nicht-kompetitivem
ELISA getestet. Aminoguanidin inhibiert die CML-Bildung120, aber nicht die Bräunung
(Abb.6 B).
Dazu wurde eine Lactose-β-Casein Maillardmischung ähnlich wie in den vorhergehenden
Versuchen hergestellt, mit dem Unterschied jedoch, dass Aminoguanidin statt Natriummeta-
bisulfit zur Inhibition verwendet wurde. Die folgende Abbildung zeigt die Relation zwischen
die Absorption bzw. die CML- und der Aminoguanidin-Konzentration.
0,00 5 10 20 50
Konzentration von Aminoguanidin (mM)
Abbildung 13: Die Absorption bzw.
0,
0
1,2
AB
S
CML-Konzentration in einer Lactose-β-Casein-Maillard-
ischung, die mit steigende Konzentration an Aminoguanidin erhitzt worden war. CML wurde mittels
ies auf Probleme mit der ELISA-Methode zurückzuführen ist,
a zwei unterschiedliche Testsysteme verwendet wurden. Die Ergebnisse sind höchst
wahrscheinlich jedoch auch nicht auf eine Umwandlung des Amadori-Produkts in CML
steigende Absorption nach Zusatz von
4
,8
M
nicht-kompetitivem ELISA unter Verwendung eines polyklonalenen Antikörpers bestimmt. Die
Ergebnisse wurde als Mittelwerte ± SD von vier Messungen dargestellt.
Die Versuche führten ebenfalls zu keinem eindeutigen Ergebnis. Es konnte jedoch
ausgeschlossen werden, dass d
d
rückzuführen, da die zu erwartende Inhibition der CML-Bildung durch Aminoguanidin nicht
beobachtet wurde.
Eine weitere mögliche Ursache für die
Natriummetbisulfit wäre, dass der Inhibitor während des Erhitzens mit β-Casein ein Epitop
bildet, mit dem der CML-Antikörper kreuzreagiert.
44
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte 4.4. Untersuchung einer möglichen Kreuzreaktion des CML-Antikörpers mit β-Casein–Sulfit-Addukten β-Casein–Natrimummetabisulfit-Mischungen wurden mit oder ohne Lactose für 30 Minuten
bei 120 °C erhitzt, dialysiert und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in bi-destelliertem
Wasser in einer Konzentration von 1mg/ml gelöst. Die CML-Gehalte der Proben wurden
mittels nicht kompetitivem ELISA, wie unter Abschnitt 4.2 beschrieben, untersucht. Die
Ergebnisse sind in Abb.12 dargestellt.
0,0
0,9
0,3
0,6
AB
S
1,2
0 5 10 20 50
Abbildung 14: CML-Bestimmung mittels nicht kompetitiven ELISA in β-Casein Reaktions-
Mischungen, die in Anwesenheit von Natriummetabisulfit mit oder ohne Lactose erhitzt wurden.
β -Casein erhitzt mit Lactose und Natriummetabisulfit
β –Casein erhitzt mit Natriummetabisulfit ohne Lactose
Differenz der beiden Messwerte
Die Ergebnisse wurde als Mittelwerte ± SD von vier Messungen dargestellt.
e CML-Konzentration von erhitztem ß-Casein
ls Negativ-Kontrolle abgezogen wird. Diese Ergebnisse, insbesondere die der Proben ohne
ürde.
Konzentration von Natriummetabisulfit (mM)
Die Absorption bzw. die Konzentration an CML in den β-Casein-Maillardmischungen steigt
im Gegensatz zu den β-Caseinlösungen, die in Abwesenheit von Lactose erhitzt wurden, mit
steigender Konzentration von Natriummetabisulfit. Die CML-Konzentration von β-Casein-
Maillardmischung steigt entsprechend, wenn di
a
Zuckerzusatz, beweisen, dass Sulfitionen Proteinaddukten bilden, die mit dem Antikörper
kreuzreagiert. Möglicherweise findet ein Abbau des glykierten Proteins statt, wobei das
abgebaute Casein dann durch die Dialyse aus der Lösung entfernt werden w
Eine weitere Möglichkeit wäre, dass der Zusatz von Natriummetabisulfit tatsächlich zu einer
erhöhten CML-Bildung führt. Um diese Hypothese zu testen, wurde in den Proben ein
weiteres spätes Maillard-Produkt, das Imidazolon, mittels ELISA bestimmt.
45
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
4.5. Inhibition der Imidazolon-Bildung in Lactose-β-Casein-Maillardmischungen Prinzip des kompetitiven Imidayolon-ELISAs
Die Imidazolon-Bestimmung wurde, wie im Abschnitt 7.4.2 beschrieben, durchgeführt, wobei
die Platten mit 0,5µg/ml Imidazolon-HSA belegt wurden. Die noch freien Bindungsstellen der
Vertiefung blockiert man mit unmodifiziertem Protein (fettarmer Milch). Darauf hin wurden
gleichzeitig verdünnte Lösungen der Proben oder des Standards und ein monoklonaler anti-
Imidazolon-Antikörper dazu gegeben. In diesem Schritt findet eine Konkurenzreaktion
zwischen dem Antigen, mit dem die Platten belegt wurden und dem Imidazolon-β-Casein der
Proben um den zugegeben Antikörper statt.
Je höher die Imidazolon-Konzentration der Proben ist, desto weniger Antikörper liegt frei vor
und kann an dem Imidazolon-HSA binden. Anschließend entfernt man den nicht mit dem
Imidazolon-HSA gebunden Antikörper und detektiert diesen mit einem Enzym markierten
zweiten Antikörper. Nach Zugabe eines Leukofarbstoffes (TMB-Lösung) kann über eine
idazolonbestimmung
Wasser hergestellt. Bei den Lösungen handelt es sich um die gleichen
ctose-β-Casein-Mischung dargestellt.
Messung der Extinktion des gebildeten Farbstoffs die Menge des gebundenen Antikörpers
sichtbar gemacht werden. Die Farbreaktion kann mit einer Schwefelsäurelösung gestoppt
werden.
Im
Lactose-β-Casein Mischungen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von
unterschiedlichen Konzentrationen von Natriummetabisulfit, dem effektivsten Inhibitor der
Bräunung, für 30 Minuten bei 120 °C erhitzt (Abschnitt 7.4.1). Die Proben wurden dialysiert
und dann gefriergetrocknet. Aus den gefriergetrockneten Proben wurden Lösungen von
1mg/ml Protein in
Proben, bei denen auch CML bestimmt wurde.
In Abbildung 15 wird die Absorption bzw. die Konzentration von Imidazolon in Abhängigkeit
von der Natriummetabisulfit-Konzentration in der La
46
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte
1,2
1,5
0
0,3
0,6
0,9
0 5 10 20 50
Konzentration von Natriumm
AB
S
etabisulfit (mM)
Abbildung .15: Imidazolonbestimmung mittels kompetitiven ELISA in β-Casein Reaktions-
Mischungen, die in Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen an Natriummetabisulfit mit
Lactose erhitzt wurde. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SD von vier Messungen dargestellt.
Auch die Versuche zeigte keine inhibitorsche Wirkung von Natriummetbisulfit auf die
Imidazolonbildung. Die Imidazolonbildung wurde ebenfalls in den Proben gemessen, die
unter Zusatz von Aminoguanidin erhitzt wurden.
0,4
0,2
AB
S
0
0,6
et und das
0 5 10 20 50
Aminoguanidinkonzentration (mM)
Abbildung 16: Imidazolonbestimmung mittels kompetitiven ELISA in β-Casein Reaktions-
Mischungen, die in Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen an Aminoguanidin mit
Lactose erhitzt wurde. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SD von vier Messungen dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Zusatz von Aminoguanidin keinen deutlichen Einfluss auf
die Imidazolonbildung hat. Die Abbildungen 12, 13, 15 und 16 zeigen, dass die unerwarteten
Ergebnisse nicht auf die Art des Inhibitors oder die eingesetzte Antikörper zurückzuführen ist.
Eine Erklärung wäre. Weiterhin ein Abbau des glykierten Proteins stattfind
abgebaute Casein würde dann durch die Dialyse aus der Lösung entfernt werden.
47
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
4.6. Untersuchung der β-Casein-Lactose Maillard-Mischung mittels MALDI-TOF- MS 4.6.1. 4.6.1. Prinzip der MALDI-TOF-MS Die MALDI-TOF-MS (Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization–Time-Of-Flight-Mass-
iche Anwendungsbereich der MALDI-TOF-MS 121,122
LDI-TOF-MS Messungen kann man nicht nur die Reinheit eines Proteins sondern
auch sein relatives Molekulargewicht bestimmen. Das bedeutet, dass kleine Veränderungen
ch Addukte, die durch die Reaktion mit Lactose entstehen,
rmittelt werden können.
durchgeführt. Unter den angewendeten
mit abnehmender Masse steigt, kann somit eine verbesserte Auflösung
durch eine Datenbankrecherche erhalten wurden
it den Signalen des erhaltenen Massenspektrums (Abb.17) vergleichen.
Spectrometry / Matrix-unterstützte Laserdesorptions / Ionisations-Flugzeit-
Massenspektrometrie) ist eine relativ neue Analysenmethode, entwickelt zur Messung der
Molmasse von chemischen Verbindungen, die durch herkömmliche Massenspektrometer
nicht oder nur sehr schwer zu bestimmen sind. Zu diesen Verbindungen gehören z.B.
thermisch labile Polymere oder schwerflüchtige Substanzen. Es handelt sich bei dieser
Methode um eine Weiterentwicklung der für massenspektrometrische Untersuchungen
genutzten Laser Desorption. Der ursprüngl
waren Proteine, glykierte Proteine und andere Polymere kamen später hinzu .
Die Probe wird auf einem Probenteller mit einer Matrix cokristallisiert und durch
Laserbeschuss in die Gasphase desorbiert. Durch Protonenübertragung von Matrix-Molekülen
auf die Proteine/Peptide entstehen Protein-/Peptidionen, die in einem elektrischen Feld
beschleunigt werden. Durch Messung der Flugzeit der Ionen auf einer Driftstrecke lässt sich
auf die Masse der erzeugten Protein-/Peptidionen zurückschliessen123.
Mittels MA
im Molekulargewicht, z.B. dur
e
4.6.2. MALDI-TOF-MS Massungen des nativen β-Caseins nach partieller enzymatischer Hydrolyse Es wurde ein MALDI-TOF-Massenspektrum des nativen β-Caseins nach Hydrolyse mit Glu-
C, wie unter Abschnitt 7.10.2,3 beschrieben,
Bedingungen spaltet die Endoproteinase Glu-C hochspezifisch Peptid-Bindungen C-terminal
zu den Aminosäuren Glutaminsäure und Asparaginsäure. Da die Auflösung der MALDI-
TOF-MS Spektren
erreicht werden. Die Massen der Peptide, die
(Tabelle7), wurden m
48
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte
Abbildung 17: MALDI-TOF- Massenspektrum des nativen β-Case s nach Hydrolyse mit Glu-C.
eaktion mit Lactose und
Lysin und Arginin vor allem die späten Maillard-Produkte CML bzw. Imidazolon gebildet
werden124,125. Die Reaktion von Lactose und einer Lysinseitenkette eines Proteins, könnte sich
ein Amadori-Produkt mit einer Massendiffernz von + 324 Da oder CML, mit einer
Massenzunahme von 58 Da bilden.
in
Durch die Datenbankanalyse kann den gefundenen Peptiden die Aminosäure Sequenz
zugeordnet werden.
Nachdem Lactose Hauptsächlich mit Lysin und Argeninresten reagiert, sind für diese Arbeit
vor allem Peptide interessant, die eine dieser beiden Aminosäuren enthalten.
In früheren Arbeiten war bereits gezeigt worden, dass durch die R
∆M=324 Da ∆M=58 Da
Die Anwesenheit von Arginin im Protein könnte zur Imidazolonbildung führen, wobei die
assenänderung den Wert +144 erreicht. M
LactoseHydrolyse Glucose Galactose
Protein-R-Protein
NH
CHN NH2
Protein-R-Protein
NH
N NH
O C4O3H9
Imidazolon ∆M=144 Da Diese Änderungen der Masse der Proteinfragmente sollte mittels MALDI-TOF Messung des
glykierten Proteins nachgewiesen werden können.
49
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
theoretische gMasse (Da) Masse (Da) Modifikationefundene Peptidsequenzen
847.3233 827.658 Phos:50 KFQSEE
999.4993 997.833 LEELNVPGE
1201.7263 1201.955 SITRINKKIE
1381.6230 1384.134 KFQSEEQQQTE
1461.5893 1461.123 Phos:50 KFQSEEQQQTE
1705.6588 1701.425 Phos:50 KFQSEEQQQTEDE
2059.9917 2024.765 Phos: 30, 32,33,34 LEELNVPGEIVESLSSSEE
2262.2187 2281.821 Phos: 30, 32,33,34 IVESLSSSEESITRINKKIE
2345.1354 23337.949 Phos: 30, 32,33,34 RELEELNVPGEIVESLSSSEE
2808.4010 2825.378 SITRINKKIEKFQSEEQQQT EDE
3010.5578 3025.641 IVESLSSSEESITRINKKIE KFQSEE
3847.7090 3816.701 Phos: 30, 32,33,34 RELEELNVPGEIVESLSSSE ESITRINKKIE
Tabelle 7: Die theoretisch ermittelten und mit MALDI-TOF-MS gefundenen Massen der
Proteinfragmente des nativen β-Caseins nach Hydrolyse mit Glu-C.
4.6.3. Theoretisch zu erwartende Peptidfragmente des mit Lactose erhitzten β-Caseins Wie in der Tabelle 8 dargestellt, kann errechnet werden, welche Peptidfragmente aus dem mit
. Diese kann man mit den gefundenen Massen der MALDI-
essung vergleichen.
ein komplexes MALDI- TOF-Spektrum
Lactose erhitzten Casein zu erwartet sind, wenn die Modifikationen Lactulosyllysin, CML,
und Imidazolon zugelassen wurde
M
Wenn ein Proteinfragment mit einer Masse von 827 Da, das nur einen Lysinrest enthält, mit
Lactose reagiert, erwartet man bei einer MALDI-Messung drei Signale. Den ersten für die
Masse des Poteinfragments selbst (827 Da), den zweiten für das Amadori–Produkt (1152 Da)
und den dritten für das CML-Addukt (886 Da). Enthält ein Proteinfragment jedoch mehrere
Lysin- und/oder Argininreste, die mit Lactose reagieren könnten, erwartet man bei der
MALDI-Messung mehrere Signale. Die Anzahl der Signale ist zirka doppelt so hoch wie die
Anzahl an Lysin- und Arginin-Resten. Im Allgemeinen erwartet man bei glykiertem β-Casein
50
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte
natives
Peptid (Da) Peptidsequenz Amadori-Produkt
(∆M=324 Da) CML
(∆M=58 Da) Imidazolon
(∆M=144 Da) mehrere CML und
Imidazolon-Addukte
827.658 KFQSEE 1152 886
1201.955 SITRINKKIE 1526 1260 1346 1318 (2CML)
1404 (CML+Im.) 1462 (2CML+Im.)
1384.134 KFQSEEQQQTE 1708 1442 1461.123 KFQSEEQQQTE 1785 1519 1701.425 KFQSEEQQQTEDE 2025 1759
2281.821 IVESLSSSEE SITRINKKIE 2349 2083 2169
2398 (2CML) 2484 (CML+Im.)
2542 (2CML+Imm.)
2337.949 RELEELNVPG 2662 2482 EIVESLSSSE E
2825.378 SITRINKKIEKF QSEEQ 3149 2883 2969
2999 (3CML) 3027 (CML+Im.) QQT EDE
2941 (2CML)
3085 (2CML+Im.) 3143 (3CML+Im.)
3025.641 IVESLSSSEESITR 3350 3084 3170
3142 (2CML)
3INKKIE KFQSEE 3286 (2CML+Im.) 3344 (3CML+Im.)
3200 (3CML) 228 (CML+Im.)
3816.701 RELEELNVPGEIVES LSSSE ESITRINKKIE 4141 3875 3961
3933 (2CML) 4105 (2Im.)
4019 (CML+Im.) 4077 (2CML+Im.) 4163 (CML+2Im.)
Tabelle 8: Die theoretisch zu erwartende Peptidfragmente des mit Lactose erhitzten β-Caseins uter
Berucksichtigung von Amadori-Produkte, CML und Imidazolonbildung.
4.6.4. MALDI-TOF-MS-Analysen des nativen und glykierten β-Caseins nach partieller enzymatischer Hydrolyse
das letztere in Anwesenheit verschiedener
Konzentrationen an Natriummetabisulfit erhitzt worden war. Die Proben wurden, wie im
Abschnitt 7.10 beschrieben, vorbereitet. Die Proteine wurden vor den Messungen mit
MALDI-TOF-MS partiell enzymatisch hydrolysiert.
In der Abbildung 18 sind sowohl die MALDI-TOF-Spektren des nativen als auch des
glykierten β-Caseins dargestellt, wobei
51
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
Abbildung 18: MALDI-TOF-Massenspektren nativem β-Casein (1), β-Casein, welches ohne (2) bzw.
Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Natriummetabisulfit 5mM (3); 10mM (4); 20mM
lich auf genetische Varianten des β-Caseins zurückzuführen sind. Für
en den theoretisch erwarteten (Tabelle 8) und den
tsächlichen gefundene Signalen (Abb.18). welcher die nativen Peptide noch Amadori-,
ML-, oder Imdazolonaddukte konnten in diesen Proben nachgewiesen werden.
in
(5); 50mM (6) mit Lactose erhitzt wurde.
Das Spektrum des nativen β-Caseins zeigt zusätzlich zu den theoretisch erwarteten Peptiden,
Signale, die wahrschein
das Spektrum des β-Caseins, das ohne Zusatz des Inhibitors glykiert wurde, erwartet man ein
komplexes Spektrum mit vielen Peptidsignalen, findet jedoch ein einfaches Spektrum
(Spektrum 2 der Abbildung 18) mit nur zwei Peptidsequenzen. Ein ähnliches Bild ergibt sich
für die Spektren von β-Casein, das in Anwesenheit des Inhibitors Natriummetabisulfit (5, 10,
20, 50 mM) glykiert wurde (Spektren 3- 6). Die Anzahl der Signale nimmt dabei, entgegen
der Erwartung, mit zunehmender Inhibitor-Konzentration zu. Weiterhin ist auffällig, dass in
allen erhitzten Proben die Signalintensität gegenüber dem nativen Casein stark zurückgeht.
Tabelle 9 zeigt einen Vergleich zwisch
ta
C
52
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte
886 1260 6 44 15 8 1152 1318 134 1404 1 2 1462 19 1526 170
1759 2025 208 349 23 2482 2542 2662 2883 1785 3 2 98 2484
29 999 302 084 3 3142 31 8 41 2969 2 7 3 085 3143 70 3200 322
t
er
S
(Da) 3286 3344 3875 3933 3961 4105 4019 4077 41
heoretisch
wartete
ignale
41 4163
1 50 158 604 1 2327 4178 4400 5207 169 1230 14 2 1 948 2769g
S
(Da) 5
efundene
ignale 5030 5217 557
Tabelle 9: Vergleich zwischen den theoretisch erwarteten und den tatsächlichen gefundenen
Signalen von β s ohne bzw. in Anwesenheit verschiedener Konzentrati
Natriummetabis M; 20 mM; 50 mM mit Lactose erhitzt wurde.
Um diesem Phänomen weiter nach zu gehen, wurden Spektren unverdaute Reaktions-
Mischungen, nd unterschiedlicher Inhibitorkonzentrationen erhitzt worden
waren, aufgen
4.6.5. MALDI-TOF-MS-Analyse von intaktem nativem und g β-CIn der folgenden Abbildung sind die MALDI-TOF Spektren des in s
gnal bei 24 kDa, welches
em β-Casein entspricht, und ein Signal bei etwa 20 kDa, das durch ein Fragment des β-
deren Reaktionsmischungen, zu denen
hibitor zugesetzt wurde, sollte das Signal für glykiertes β–Casein wieder zu gunsten des
-Casein, welche onen von
ulfit 5 mM; 10 m
die mit Lactose u
ommen.
lykiertem asein
takten β-Casein
dargestellt, wobei die Proben, wie unter Abschnitt 7.10 beschrieben, behandelt worden waren.
Man erkennt im ersten Spektrum des unerhitzten β-Caseins ein Si
d
Caseins hervorgerufen wird. Beim Spektrum des glykierten β- Caseins erwartet man
zusätzlich zum Signal des β-Caseins ein Signal mit einer Masse höher als 24 kDa, das zum
glykierten β-Casein gehört. Bei Spektren der an
In
unmodifizierten β-Caseins zurückgedränkt sein. Allerdings konnte in keinen der Spektren der
erhitzten Caseinlösung ein Protein detektiert werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass β-
Casein während der Hitzeeinwirkung abgebaut wurde.
53
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
Abbildung 19: MALDI-TOF-Massenspektren von unverdautem β-Casein. Vergleich von nativem (1)
mit β-Casein, das ohne (2) oder mit verschiedenen Konzentrationen von Natriummetabisulfit 5mM(3);
10mM (4); 20mM (5); oder 50mM (6) in Anwesenheit von Lactose erhitzt worden war.
Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Proteinzusammensetzung in den
Reaktionsmischungen mittels Gelelktrophorese untersucht.
4.7. Einfluss der Reaktionsbedingung auf den Lactose-induzierten Abbau von β-Casein
4.7.1. Einfluss der Temperatur und der Erhitzungsdauer auf den Proteinabbau in Anwesenheit des Zuckers In weiteren Versuchen wurde getestet, ob die Temperatur und die Erhitzungsdauer in
Anwesenheit des Zuckers einen Einfluss auf den Proteinabbau haben. Diese Untersuchungen
sollten dazu den Proteinabbau während des Erhitzungsprozesses in Lebensmitteln besser
verstehen zu können. Dafür wurden folgende Proben vorbereitet:
1-1mg/ml β-Caseinlösung (in 0,1M PBS; pH=6,8)
2- 1mg/ml ohne Zuckerzusatz erhitzte β-Caseinlösung (in 0,1 M PBS; pH=6,8)
3- Eine Mischung von 1mg/ml β-Caseinlösung mit 0,1M Lactose (in 0,1M PBS; pH=6,8)
wurde ohne Inhibitorzusatz erhitzt
4- Mischung 3 wurde in Anwesenheit von 5 mM Na2S2O5 erhitzt
54
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte 5- Mischung 3 wurde in Anwesenheit von 10 mM Na2S2O5 erhitzt
6- Mischung 3 wurde in Anwesenheit von 20 mM Na2 2S O5 erhitzt
7- Mischung de nw he 5 N 5 zt 3 wur in A esen it von 0 mM a2S2O erhit
Die Proben e te ria d ea ze d p t. Die wurd n un r Va tion er R ktions it un Tem eratur erhitz
Reaktionsmis e de n ls PA n h E ss ichung n wur n dan mitte SDS- GE u tersuc t. Die rgebni e sind n der
Abbildung 2 ge I Abbildung 20A, in der Gel der das Proben, die für 30 0 dar stellt. n der
Minuten bei 120°C erhitzt wurden, dargestellt sind, sieht man nur eine Bande des unerhitzten
β-Caseins (Probe1) und eine etwa schwächere β-Casein-Bande in der Probe (Probe 7), die in
Anwesenheit von 50 mM Natriummetabisulfit glykiert wurde.
Daraus kann man schließen, dass die hohen Temperaturen zum Proteinabbau der glykierten
Proben führen können, und wobei Natriummetabisulfit den Proteinabbau verhindern teilweise
konnte. Die Gele in Abbildung 20 B bis D zeigen weiterhin, dass der Abbau des Geiseins
Praktisch nur in Anwesenheit der Lactose Stattfindet. 1 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
(A) β - Casein -Lactose- Mischungen wurden bei 120°C (B) β - Casein- Lactose- Mischungen wurden bei 80°C Stunden
30 Minuten erhitzt für 24 Stunden erhitzt
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
(C) β -Casein-Lactose-Mischungen wurden bei 80 °C (D) β -Casein-Lactose-Mischungen wurden bei 50 °C
für 6 Stunden erhitzt für 14 Tage erhitzt Abbildung 20: Einfluss der Temperatur und der Erhitzungsdauer auf den β-Caseinabbau nach
Reaktion mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriummetabisulfut in Anwesenheit von
Lactose. Die Bandennummer bezieht sich auf die in Abschnitt 4.7.1 eingeführte Proben
Bezeichnungen.
55
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
In der Abb. 20 B sind die Gele der Reaktionsmischungen dargestellt, die bei 80 °C für 24
Stunden erhitzt wurden. Bei diesem erscheint nicht nur das native β-Casein, sondern auch das
β-Casein in den Proben fünf und sechs, die mit 10 und 20 mM des Inhibitors glykiert wurden.
Allerdings waren die Banden nicht deutlich. Dies bedeutet, dass bei niedriger Temperatur der
Proteinabbau abnimmt.
Der Abbau des glykierten β-Caseins wird weiterhin verringert, wenn man die Proben nur für 6
Stunden bei 80°C erhitzt (Abb.20 C). Bei einer niedrigeren Temperatur (50 °C) führt erst eine
lange Inkubationszeit von 14 Tagen zu einem deutlichen Proteinabbau.
Demnach wird durch Zusatz des Inhibitors, niedrigen Temperaturen und kürzere
Erhitzungsdauer der Abbau des glykierten β-Caseins verringert, kann jedoch nicht vollständig
verhindert werden.
Zusammenfassend konnte mit Hilfe der Gelelektrophorese bestätigt werden, dass in den
erhitzten β-Caseinlösungen ein Proteinabbau stattgefunden hatte. In keinen dieser
Mischungen konnte eine Bande detektiert werden (Abb.20).
4.7.2. Einfluss der Zuckerart auf den Proteinabbau von glykiertem β-asein C
In den nächsten Experimenten wurde untersucht, ob der Proteinabbau selektiv durch die
Reaktion mit Lactose hervorgerufen wird, oder ob auch andere Zucker diese Effekte
hervorrufen können. Um diese Frage zu beantworten, wurde der Abbau des β-Caseins durch
Ribose während der Erhitzung in Abwesenheit und Anwesenheit von Nartriummetabisulfit
als Inhibitor getestet. 3 4 5 6 7 1 2
esenheit oder
rde
β-Casein-Ribose-Mischungen wurden bei 80 °C für 3 Stunden erhitzt.
Abbildung 21: Abbau von β- Casein während der Glykierung mit Ribose in Anw
Abwesenheit von Natriummetabisulfit. Die Probenbezeichnug entspricht der unter Abschnitt 4.7.1,
wobei Lactose durch Ribose ersetzt wu
56
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte In Abbildung 21 ist ein SDS-PAGE Gel einer Reaktionsmischung, in der eine Ribose β-
Casein–Mischung für 3 Stunden bei 80°C erhitzt wurde.
In den Reaktionsmischungen, denen kein Inhibitor zugesetzt worden war, konnte kein β-
Casein detektiert werden. Der Proteinabbau konnte durch den Zusatz von Natriummetabisulfit
konzentrationsabhängig inhibiert werden.
Der Abbau von β-Casein wurde sowohl in den Reaktionsmischung beobachtet, die mit Ribose
als auch mit Lactose erhitzt worden waren. Der Effekt war stark abhängig von der
Reaktionszeit und Temperatur. Der Proteinabbau konnte in beide Mischungen konzentrations-
abhängig vollständig oder teilweise durch Zusatz von Natriummetabisulfit inhibiert werden.
4.7.3. Untersuchung zur Stabilität anderer Protein-Zucker- Modellsysteme Wegen der Instabilität von β-Casein in Anwesenheit von Zuckern ist dieses Protein nicht
geeignet, um di CML-Bildung mittels ELISA zu bestimmen. Deshalb wurden weitere
Versuche durchgeführt, um ein Protein-Zucker Modellsystem zu finden, in dem das glykierte
Protein stabil bleibt. Dabei wurden verschiedene Reaktionsmischungen untersucht, die in
Tabelle 9 beschrieben sind.
Die Protein-Zuckermischungen wurden in PBS-Puffer (0,1M; pH 6,8) gelöst und
unterschiedlich lang mit verschiedene tionen an Natriummetabisulfit erhitzt. n Konzentra
Aus Tabelle 10 geht hervor, dass das glykierte BSA (7 Tage Inkubation bei 50 °C) sowie das
glykierte β-Casein (Ab.3.7.1 und 3.7.2) unabhängig von der Zuckerart abgebaut wurden. Die
Abbaurate war jedoch abhängig von der Erhitzungsdauer und der Inhibitorkonzentration.
Bei Verwendung von Lysozym, α-Lactalbumin, β-Lactoglobulin oder BSA (bei hoher
Inkubationstemperatur) wurden die Proteine ausgefällt. Die pH-Werte der Proben wurden vor
und nach der Inkubation gemessen, wobei keine bedeutende Änderung beobachtet wurde, die
zur Denaturierung des Proteins geführt haben könnte.
57
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
Protein Zucker Temperatur Erhitzungs-Dauer
Beobachtung
α-Lactalbumin 20 mg/ml Lactose 25 °C 2 Stunden
Zusatz des Inhibitors führt zur
Präzipitätion des Protein
50 °C 3 Stunden trübe Lösung bei allen Proben
β-Lactoglobulin 20 mg/ml Lactose
70 °C 3 Stunden
das Protein fällt in allen Proben aus
120 °C 5 Minuten
das Protein fällt in allen Lösungen aus
der Niederschlag ist braun
70 °C 4 Stunden der Niederschlag ist braun
Das Protein fällt in allen Lösungen aus Lysozym
100 mg Lactose 100 mM
50 °C 7 Tage
Das
Ribose oder
Protein fällt in allen Lösungen aus der Niederschlag ist braun
120 °C 5 Minuten 50mM des Inhibitors erhitzt wurden. in allen Proben, denen Zucker
zugegeben wurde, fällt das Protein aus
Trübung der Proben, die ohne Zuckerzusatz unter Zusatz von
70 °C 4 Stunden
Trübung bei den Lösungen der Proben, die ohne Zuckerzusatz erhitzt wurden.
In allen glykierten Proben fällt das Protein aus
BSA 10mg/ml
Ribose oder
Lactose 100 mM
50 °C 7 Tage
Proteinabbau in allen glykierten Proben
Tabelle 10: Stabilität unterschiedlicher Protein-Zucker–Maillard-Mischungen.
4.8. Zusammenfassung und Diskussion Aufgrund der effektiven Inhibitorwirkung von Natriummetabisulfit auf die Bräunung einer
Lysin-Lactosemischung wurde erwartet, dass dieser Inhibitor auch die CML-Bildung
verringert. Wurde jedoch β-Casein mit Lactose in Anwesenheit unterschiedlicher
Konzentrationen an Natriummetabisulfit erhitzt und CML mittels kompetitiven ELISA
bestimmt, wurde dieser Effekt nicht beobachtet. Die Werte schwankten viel mehr ohne
erkennbaren Trend um den CML-Gehalt der nicht inhibierten Probe. Dieses Ergebnis war
58
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte unabhängig davon, ob CML-HSA oder CML- β-Casein zur Belegung der ELISA-Platten
verwendet wurde.
Deshalb wurde weiterhin eine nicht-kompetitive ELISA-Methode getestet, um die CML-
Konzentrationen in den erhitzten Lactose-β-Casein-Proben zu bestimmen, zu denen
unterschiedliche Konzentrationen an Natriummetabisulfit und Aminoguanidin als Inhibitoren
zugesetzt wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten, dass die gemessene CML-
Konzentration mit steigender Inhibitorkonzentration in beiden Fällen zunimmt. Dieses
Ergebnis ist den Erwartungen entgegengesetzt und schwer erklärbar. Deshalb wurde getestet,
ob sich durch die Reaktion von Natriummetabisulfit mit β-Casein ein Epitop bildet, das mit
dem CML-Antikörper kreuzreagiert.
β-Casein wurde deshalb mit Natriummetabisulfit in Anwesenheit und Abwesenheit von
Lactose erhitzt. Der CML-Gehalt in den Proben wurde durch das nicht–kompetitive ELISA
Verfahren bestimmt. In Abwesenheit von Zuckern war jedoch praktisch kein CML
nachweisbar, das heißt dass aus Sulfit kein Epitop gebildet wurde, das mit dem CML-
Antikörper kreuzreagiert.
Um weiter zu untersuchen, ob die schwankenden CML-Konzentrationen, die in den Proben
mit Lactose und Inhibitor gemessen wurden, ein Effekt ist, der auf den Antikörper zurück zu
führen ist, wurden in den gleichen Proben die Imidazolonkonzentrationen mit Hilfe eines
kompetetiven ELISA gemessen. In diesen Proben wurden sowohl Natriummetabisulfit als
auch Aminoguanidin als Inhibitor eingesetzt. Die Imidazolonbestimmung führte zu ähnlichen
Messergebnissen, wie die CML-Messungen.
Da bekannt ist, dass Aminoguanidin die Bildung von CML und Imidazolon inhibiert126,
wurde angenommen, dass andere unspezifische Effekte auftreten, die die AGE-Messungen
störten.
Um zu überprüfen, ob tatsächlich erhöhte CML-Konzentrationen durch Erhitzung in
Anwesenheit von Natriummetabisulfit gebildet wurden, wurde eine alternative Methode
angewendet, um die Bildung von protein-gebundenen Glykierungsprodukten zu detektieren.
Nachdem in unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden konnte, dass die Analytik von
proteingebundenen Maillard-Produkten mittels MALDI-TOF-MS möglich ist127,128, wurde
diese Methode zur Untersuchung des glykierten Proteins durchgeführt. Dazu wurde β-Casein,
mit Lactose und verschiedenen Konzentrationen an Natriummetabisulfit als Inhbitor der
Bräunung für 30 Minuten sterilisiert. So erhielt man unterschiedlich stark modifiziertes AGE-
β-Casein. Nach der Dialyse der Proben und anschließende partielle Hydrolyse mit der
Endoproteinase Glu-C wurden MALDI-TOF-Massenspektren aufgenommen. Die
59
Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte
entstandenen Peptidfragmente wurden mit denen von unmodifiziertem, nativen β-Casein - um
eventuell auftretende Signale, die durch den verdau des Enzyms hervorgerufen werden, Selbst
zu owie mit denen, die durch einen theoreti rotein- erfassen - s schen Verdau in einer P
Datenbank (Peptide Mass; http://www.expas ) ermittelt wurden, verglichen. Damit y.com
können eindeutige Aussagen über die chemische Natur der Modifizierung und über die
Glykierungsstelle im nmolekül gemacht we Protei rden.
Es ist zu erwarten, dass bei der se v rten Pr MS Analy on glykie oteinen mittels MALDI-TOF-
nach partieller enzymamatischer Hydrolyse durch das Auftreten von nativen und glykierten
Peptide mehr Signale detektiert . D n des ch werden ie Spektre glykierten β-Caseins zeigten jedo
praktisch keine Peptidfragmente im Gegensatz zum nativen Protein.
Eine Erklärung dafür wäre, dass die Glykierung den Proteinabbau fördert. Peptidfragm nte e
würden bei der angewendeten Auf Arbeitung während des Hydrolyseschrits abgetrennt. Diese
Hypothese wurde durch MALDI- Messungen des unverdauten nativen und glykierten β-
Caseins bestätigt. In den Spektr nativ aseins sse en des en β-C konn r Mate das Protein bei eine
von 24 kDa detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnte in den glykierten Proben kein
Proteinsignal gefunden werden. Bei den Proben, denen hohe Konzentrationen an
Natriummetabisulfit zugegeben en, n in den MALDI-TOF-Spektren mehr wurd findet ma
Signale, was darauf hin deutet, dass der Inhibitor dem Proteinabbau entgegenwirkt.
Um zu bestätigen, dass die Proteinglykierung tatsächlich zu einer Pr teinfragmentierung o
führt, wurden die Reaktionsmischungen zusätzlich mitt E) els Gelelektrophorese (SDS-PAG
untersucht. Dabei zeigte sich, dass die β- Casein-Ban de nach der Reaktion mit Lactose oder
Ribose deutlich schwächer wird, bzw ganz verschwindet. Die Erhöhung der
Reaktiontemperatur bzw. die gerun Reak es Verlän g der tionszeit, verstärkt den Abbau d
Proteins. Der β-Caseinabbau führte jedoch nicht zum Erscheinen einer neuer Proteinbande.
Der Proteinabbau führt vermutlich zur Bildung von Peptiden, die durch den Dialyseschritt
während der Probenvorbereitung entfernt werden. Eine andere Erklärung für diese
Beobachtung ist, dass die Glykierung von β- Casein zu einer unspezifischen Fragmentierung
des Proteins führt.
Der β-Caseinabbau konnte konzentrationsabhängig durch den Zusatz von Natrium-
metabisulfit inhibiert werden.
Wegen der Instabilität von β-Casein in Anwesenheit von Zuckern ist dieses Protein nicht
geeignet, um CML mittels ELISA zu bestimmen. Deshalb wurden weitere Versuche
durchgeführt, um ein Protein-Zucker Modellsystem zu finden, in dem das glykierte Protein
stabil bleibt. Dabei wurden verschiedene Reaktionsmischungen wie Lactose oder Ribose und
60
Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte α-Lactalbumin, β-Lactoglobulin, Lyzozym oder BSA, untersucht. Die Protein-Zucker-
Mischungen wurden unterschiedlich lang mit verschiedenen Konzentrationen an
Natriummetabisulfit erhitzt. Bei den erhitzten Lactose-Lysozym, -α-Lactalbumin, -β-
Lactoglobulin oder -BSA Lösungen stellte man jedoch fest, dass bei hoher
Inkubationstemperatur das Protein ausgefällt wurde.
Das glykierte BSA (7 Tage Inkubation bei 50 °C), sowie das glykierte β-Casein wurde
unabhängig von der Zuckerart, abgebaut. Die Abbaurate war jedoch abhängig von der
Erhitzungsdauer und der Inhibitorkonzentration.
61
Lactose-Pepton-Maillard-Produkte
5. Inhibition der Maillard-Reaktion in einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung
5.1. Einleitung Peptone sind Gemische aus Peptiden und Aminosäuren, die als Zwischenstufen bei der
n. Die aus Casein oder
partieller Hydrolyse von Proteinen, z.B. mit Hilfe von bestimmten Enzymen, wie Pepsin oder
Trypsin oder durch chemische Hydrolyse durch Säuren gebildet wurde. Die Peptone sind
ebenso wie die Albumosen nicht genau abgegrenzte amorphe, heterogene Mischungen. Meist
enthalten sie auch einen beträchtlichen Anteil an freien Aminosäure
Muskelproteinen hergestellten Peptone verwendet man vor allem zur Herstellung
mikrobiologischer Nährböden. Peptone sind auch Bestandteil bestimmter diätetischer
Lebensmittel. In der Literatur beschrieben, dass Peptone aus Caseine eine hohe thermische
Stabilität aufweisen. Deshalb wurden sie in den nächsten Versuchen als Aminkomponente
verwendet 129.
5.2. Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Bräunung einer Lactose-Pepton-Mischung
Mischungen aus Lactose (0.1M) und Pepton (10mg/ml) wurden in PBS (0,1 mM, pH 6,8)
gelöst. Zu jeweils 5ml der Lösung wurden, dazu werden verschiedene Konzentrationen (0-5-
10-20-50 mM) unterschiedlicher Inhibitoren als Pulver hinzu gegeben. Die Proben wurden
dann im Autoklav bei 120 °C für 30 Minuten erhitzt und anschließend schnell im Eisbad
gekühlt. Die Absorption der Proben wurde nach einem Verdünnungsschritt mittels
Spektrophotometer bei 420 nm vermessen. Die Ergebnisse werden in den folgenden
Abbildungen dargestellt.
62
Lactose-Pepton-Mallird-Produkte
0
metabis
ulfit
Thiamin
atrium
sulfit
Cystei
n
micarbaz
id
0,3
0,6
0,9
1,2
Abs
orpt
ion
Natrium N Se
ohne Inh.
5 mM
A
10 mM
20 mM
50 mM
0
0,3
0,6
0,9
1,2
Acetyl
isylsä
ure
Pyrido
xin
Acetyl
cyste
inEDTA
Abs
orpt
ion ohne Inh.
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
B
0
0,4
0,8
1,2
1,6
Mercap
toetha
nol
o-Phe
nylend
iamin
Nicotin
säure
Glutath
ion
Inhibitor
Abso
rptio
n ohne Inh.
5 mM
20 mM
50 mM
C
Abbildung 22 A, B, C: Bräunung einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung in Abhängigkeit von
Inhibitorart und -konzentration. Die Ergebnisse stellen der Mittelwert ± SD von 3 Messungen dar.
63
Lactose-Pepton-Maillard-Produkte
Um die Inhibitoren nach ihrem Inhibitionsrate auf die Bräunung vergleichen zu können, ist in
nzentration dargestellt.
Abbildungen 23 die Inhibitionsrate der Bräunung in Abhängigkeit von der Inhibitiorart und
Ko
A100
0
20
40
60
Natrium
metabis
ulf
80
it
Thiam
in
Natrium
sulfit
Cystei
n
Sem
icarb
azid
Inhi
bitio
nsra
t (%
)
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
B
0
säure
idoxin
yste
in
Inhi
30
lsalic
ylPy
r
Acety
lc EDTA
bi
60
90
tions
rat (
%)
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
Acety
-70
-50
-30
-10
10
30
50
70
olam
intions
rat (
%
Merca
ptoeth
an
o-Phe
nylend
i
Nicotin
säur
e
Glutath
ion
Inhibitor
Inhi
bi)
5 mM
C
10 mM
20 mM
50 mM
Abbildung 23 A, B, C: Einfluss der Inhibitorart und -konzentration auf die Inhibitionsrate der
Bräunung
Der beste Bräunungsinhibitor war Natriummetabisulfit mit einer Inhibitionsrate von mehr als
80%, gefolgt von Nα-Acetylcystein mit 78% bis hin zu EDTA mit 27% bei einer
64
Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Inhibitorkonzentration von 50 mM. o-Phenylendiamin zeigte eine negative Inhibitionsrate,
was bedeutet, dass es die Bräunung verstärkte. Eine Erklärung dafür könnte sein, dass die
Aminfunktion des OPD die Maillard-Reaktion fördert und die entstehenden Addukte braun
gefärbt sind.
5.3. Einfluss des Inhibitorzusatzes und der AGE-Bildung auf die pH-Werte der Lösungen
Um zu überprüfen, ob die beobachtete Bräunungsinhibition tatsächlich auf eine Reaktion des
Inhibitors zurückzuführen ist oder indirekt über eine Änderung des pH-Werts während der
Reaktion hervorgerufen wird, wurden die pH-Werten nach der Erhitzung gemessen (Tabelle
11 ).
Tabelle 11: pH-Werte der unter Zusatz verschiedener Inhibitoren erhitzten Pepton-Lactose-
Mischungen. Die pH-Werte sind die Mittelwerte von drei Messungen.
ren
influss auf den pH-Wert der Proben haben. Demnach ist die Inhibition der Bräunung nur von
der Inhibitorart und -konzentration abhängig.
Inhibitorart /
Inhibitorkonzentration
0mM
5mM
10mM
20mM
50mM
Natriummetabisulfit 6,41 6,39 6,38 6,33 6,00
Natriumsulfit 6,41 6,36 6,36 6,40 6,51
Cystein 6,41 6,42 6,45 6,49 6,55
Semicarbazid 6,40 6,32 6,31 6,25 6,10
Pyridoxin 6,40 6,39 6,28 6,22 5,94
Thiamin 6,41 6,31 6,27 6,19 5,93
Mercaptoethanol 6,40 6,31 6,30 6,29 6,29
EDTA 6,40 6,31 6,31 6,29 6,23
Pyridoxamin 6,41 6,29 6,17 6,10 6,00
o-Phenylendiamin 6,41 6,43 6,47 6,53 6,76
Nα-Acetylcystein 6,40 6,38 6,27 6,23 5,88
Nicotinsäure 6,41 6,39 6,36 6,20 6,03
Glutathion 6,41 6,36 6,23 6,10 5,71
Acetylsalicylsäure 6,41 6,27 6,20 6,01 4,80
Diese Tabelle zeigt, dass die pH-Werte der Proben mit der Bildung der Maillard-Produkte von
6,8 auf 6,4 sinken und dass weder die Inhibitorart noch ihre Konzentration einen größe
E
65
Lactose-Pepton-Maillard-Produkte
5.4. Inhibition der CML-Bildung in einer erhitzten Lactose- Pepton-Mischung
Nach dem sich die erhitzten Lctose-Pepton Mischung als stabil erweisen, wurden sie dazu
eingesetzt, die Wirkung der Testsubstanzen auf die CML-Bildung zu untersuchen. Dazu
Pepton–Lactose-Mischungen in Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen
Konzentrationen unterschiedlicher Inhibitoren für 30 Minuten bei 120°C erhitzt[vgl.
Abschnitt (5.2)]. Die CML- Gehalte der Proben wurden durch einen kompetitiven ELISA-
Test mit polyklonalen anti-CML-Antikörpern bestimmt. Die Messungen der verdünnten
Proben wie unter Absatz (5.2) beschrieben, durchgeführt, wobei die Platten mit CML-HSA
belegt wurden. Die Abbildungen 24 A, B, C zeigen die CML-Gehalte in den Lactose-Pepton-
Modellmischungen in Abhängigkeit von der Inhibitorart und -konzentration.
Um die Standardabweichung zu berechnen, wurde die CML-Bestimmung jeder Probe vier
Mal wiederholt und CML- Konzentrationen anhand einer Standardkurve berechnet.
0
0,2
0,4
0,6
Thiam
in
Cystei
n
Natrium
sulfit
Sem
icarb
azid
Acety
lsalic
ylsäu
re
Pyrid
oxin
CML-
Koze
ntra
tion
(µg/
ml)
ohne Inh.
5 mM10 mM
20 mM50 mM
A
0
0,2
0,4
0,6
Acety
lcyste
in
Glutath
ion
Nicotin
säur
e
o-Ph
enyle
ndiam
in
EDTA
Merca
ptoeth
nol
Natrium
metabis
ulfit
Inhibitor
CM
L-K
onze
ntra
tion
(µg/
ml)
ohne Inh.
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
B
bbildungen 24 A, B: Inhibition der CML-Bildung in einer erhitzten Lactose- Pepton-Mischung in A
Abhängigkeit von Inhibitorart und –konzentration. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD von 4
Messungen dar.
66
Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Die Abbildungen verdeutlichen, dass die CML-Konzentration in den erhitzten Lactose-
Pepton-Mischungen mit steigender Inhibitorenkonzentration abnimmt.
Manche Substanzen, wie o-Phenylendiamin, inhibieren die CML-Bildung, obwohl sie die
Bräunung verstärken. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass o-Phenylendiamin mit
Zwischenprodukten der Maillard-Reaktion, wie Dicarbonylverbindungen stabile farbige
m die Inhibitoren nach
Maillard-Produkte bilden, die eine weitere Reaktion, z.B. zu CML, verhindern.
ihrem Einfluss auf die CML-Bildung zu ordnen, wurde die U
Inhibitionsrate anhand der folgenden Gleichung berechnet:
Inhibitionsrate = 100 - (Absorption der inhibierten Probe/ Absorption der nicht–inhibierten
Probe)* 100
0
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
B
20
onsr
a
40
te d
e(%
60
80
r CM
L-Bi
l)
100
tein
thion
Nicotin
säur
e
o-Ph
enyle
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in
EDT
Merc meta
bisulf
it
Inhibitor
Acety
lcy
GlutaIn
hi s
biti
Ahn
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t
Natrium
dung
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
A
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d 20er C
40
60
ML-
B
80
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100
g (%
Thi Cys
Nnhib
i amin
tiosr
tein
atrium
sulfit
Semica
rbaz
id
Acetyl
salic Pyri
doxin
I
ylsäu
re
)
Abbildungen 25 A, B: Inhibitionsrate der CML-Bildung in einer erhitzten Lactose-Pepton-
nhibitors hat einen starken Einfluss auf die
Inhibitionsrate. Die Inhibitionsrate sinkt in folgender Reihenfolge:
Mischung in Abhängigkeit von Inhibitorart und -konzentration
Man sieht, dass die Inhibitionsrate der CML-Bildung mit der steigenden
Inhibitorkonzentration steigt. Die Art des I
67
Lactose-Pepton-Maillard-Produkte
Acetylsalicylsäure > Nα-Acetylcystein > Glutathion > Semicarbazid ≈ Natriummetabesulfit >
>.. > EDTA> o-PhenylendiamCystein in.
ldung 26
dargestellt.
5.5. Inhibition der Bildung von fluoreszierenden Produkten in erhitzten Lactose- Pepton-Mischungen
Als weitere Produktklasse der Maillard-Reaktion wurden als nächstes fluoreszierender
Produkte untersucht. Auch hier wurde wieder Einfluss der 13 aktiven Bräunungsinhibitoren
weitergetestet. Lactose-Pepton-Mischungen wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit
verschiedener Konzentrationen unterschiedlicher Inhibitoren für 30 Minuten bei 120 °C
erhitzt (Abschnitt 4.2).
Die Fluoreszenz der Proben wurde bei 440 nm (Emission) nach Anregung bei 370 nm
(Excitation) mit einem Fluorimeter gemessen. Die Ergebnisse sind in Abbi
68
Lactose-Pepton-Mallird-Produkte
Abbildung 26 A, B, C: Inhibition der Bildung fluoreszierender Produkten einer erhitzten Lactose-
Pepton-Mischung. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD von drei Messungen dar.
Die Abbildung 26 zeigt, dass die Bräunungsinhibitoren drei verschiedene Effekte auf die
Bildung von fluoreszierenden Produkten haben können:
• Cystein und OPD inhhibieren die Bildung fluoreszierender Produkte.
• Natriumbisulfit, Pyridoxin, Thiamin, Mercaptoethanol, EDTA, Nα-Acetylcystein,
Nicotinsäure, Glutathion, Semicarbazid und Acetylsalicylsäure können die Bildung
von fluoreszierenden Produkten nicht verhindern und verstärken zum Teil die
Fluoreszenz.
• Natriummetabisulfit verstärkt zunächst bei niedrigen Konzentrationen die
Fluoreszenz, während es in höheren Konzentrationen inhibierend wirkt.
Die Wirkung von Cystein und OPD kann dadurch erklärt werden, dass die
Bräunungsinhibition durch die Inhibition der Bildung fluoreszierender Produkte erfolgt.
Alternativ können andere Inhibitoren, wie Natriumsulfit, Pyridoxin, Thiamin,
Mercaptoethanol, EDTA, Nα-Acetylcystein, Nicotinsäure, Glutathion und Acetylsalicylsäure,
die Bräunung verhindern, in dem sie die Bildung nicht-fluoreszierender Produkte verhindern.
atriummetabisulfit verhindert die Bräunung gleichzeitig über beide Mechaninismen. N
69
Lactose-Pepton-Maillard-Produkte
5.6. Inhibition der Lactulosylaminbildung in einer erhitzten Lactose- Pepton- Mischung
as Amadori-Produkt Lactulosylamin stellt eines der ersten Produkte der Maillard-Reaktion
actulosyamin wichtige Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus erlauben.
en dabei wieder die 13 aktiven Bräunungsinhibitoren. Die
Prinzip der Methode
Die NBT-Methode wurde von Johnson und al.131 entwickelt und beruht auf der oxidierbarkeit
von Amadori-Produkten in alkalischer Lösung132. Unter alkalischen Bedingungen haben
Amadori-Produkte wie Fructosylamin oder Lactulosylamin ein reduzierendes Potential, das
sich von anderen reduzierenden Substanzen wie Glukose, Lactose oder unstabilen Schiff-
basen, wie die N-Glucosylamin-Derivate, unterscheidet133.
Mittels Spektrophotometer wurden die Absorption von NBT, das von Lactulosylamin in den
Proben reduziert wurde, bei 530 nm vermessen. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe von 1-
Deoxy-1-morpholino-D-fructose (DMF) als Standard. Dazu wird werden die Absorption des
reduzierten NBTs, in den Proben nach 10 und 15 Minuten gemessen. Die daraus
resultierende Standardgerade für DMF ist in Abbildung 27 dargestellt.
D
dar. Deshalb kann die Inhibitionswirkung der Testsubstanzen auf die Bildung von
L
5.6.1. Lactulosylaminbestimmung
Die Lactose-Lysin-Mischung wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit unterschiedlicher
Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 50 mM) von verschiedenen Inhibitoren für 30 Minuten bei
120°C erhitzt. Zum Einsatz kam
Proben wurden anschließend verdünnt und Lactulosylamin wurde nach der Reaktion Nitro
Blue Tetrazolium (NBT) bestimmt130.
70
Lactose-Pepton-Mallird-Produkte
y = 0,0002x - 0,0017R2 = 0,9988
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0 200 400 600 800 1000 1200
DMF Konzentration (µM)
Diff
eren
z zw
isch
e de
r Abs
orpt
ion
nach
10
und
15 m
in b
ei 5
30 n
m
Abbildung 27: Standardkurve des NBT-Tests unter Verwendung von 1-Deoxy-1-morpholino-D-
fructose
.6.2. Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Lactulosylamin-
Die r d im Verhältnis
(1:1
bestimm
In der
Lactulo g in den Proben gezeigt.
5konzentrationen in der erhitzten Lactose-Pepton-Mischung
P oben wurden, wie unter Kapitel (7.5.1) beschrieben, vorbereitet un
0) mit bi-destilliertem Wasser verdünnt. Anschließend wurde die Lactulosylamin-
ung wurde unter Verwendung des NBT-Tests wie in Abschnitt (7.5.2) durchgeführt.
Folgenden Abbildung 28 wird der Einfluss der Inhibitorart und -konzentration auf die
sylaminbildun
0
4000
8000
trimmeta
bisulf
it
Thiamin
Natrium
sulfit
Cystei
n
Semica
rbazid
henyle
ndiam
inLact
ulos
ylam
inko
nze
(µM
)
12000
16000
Na o-P
Inhibitor
ntra
tion
ohne
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
A
71
Lactose-Pepton-Maillard-Produkte
12000on
B
0
3000
6000
ulos
amin
onze
(µ)
9000
Acetyl
s
e in
Ace
n
N
e TA
Mercap
toetha
nol
Glutath
ion
ctyl
knt
rati
M
ohne
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
alicylsä
ur
Pyrido
x
tylcy
stei
icotin
säur
EDLa
Inhibitor
Abbildungen 28 A,B: Einfluss der Inhibitorart und –konzentration auf die Lactulosylaminbildung
in einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung
Anhand der Ergebnisse wird deutlich, dass Natriummetabisulfit in niedriger Konzentration
osylaminbildung inhibiert. In höheren Konzentrationen verstärkt es die
EDTA und Thiamin können
et und die Ergebnisse
Abbildung 29 veranschaulicht.
(bis 10 mM) die Lactul
Bildung trotz der starken inhibitorischen Wirkung des Natriummetabisulfit auf die Bräunung.
Die Bräununginhibitoren Natriumsulfit und Mercaptoethnol können die Lactulosylamin-
bildung nicht inhibieren, ähnlich wie Nicotinsäure, Nα-Acetylcystein, o-Phenylendiamin,
Cystein und Glutathion, die nur in hohen Konzentrationen (>20 mM) wirksam sind. Die
Inhibitoren Semicarbazid, Pyroxidin, Acetylsalicylsäure,
gleichzeitig die Bräunung und die Lactulosylaminbildung inhibieren.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die Art und Konzentration der Testsubstanzen einen
großen Einfluss auf die Art der Maillard-Produke (Lactulosylamin, fluoreszierende, braune
oder andere Endprodukte) hat, die sie inhibieren können.
Weiterhin wurde die Inhibitionsrate der Lactulosylaminbildung berechn
in
72
Lactose-Pepton-Mallird-Produkte
-200
-150
-100
-50
0
50
100
Natrim
metabis
ulfit
Thiamin
Natrium
sulfit
Cystei
n
Semica
rbazid
o-Phe
nylen
diamin
Inhibitor
Inib
ition
srat
e (%
)5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
A
-150
-100Ace
tylsa
ly Py
Acetyl
Nikot
Mercap
to Gl
Inhibitor
Inhi
bitio
ns
-50
100
silsäu
rerid
oxin
cyste
in
insäu
reEDTA
ethan
ol
utathi
on
0
50
rate
(%)
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
B
Abbildung 29: Einfluss der Inhibitorart und –konzentration auf die Inhibitionsrate der
Lactulosylaminbildung in einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung
Für einige Inhibitoren, wie Semicarbazid (71%), Acetylsalicylsäure (62%), Pyridoxin (55%)
und EDTA (45%) konnte gezeigt werden, dass sie die Bildung von Lactulosylamin deutlich
inhibieren können. Um die Wirkung von reduzierenden Verbindungen sicher beurteilen zu
können, bedarf es jedoch weitere Untersuchungen, die ausschließen müssten, dass die
Testsubstanzen selbst keinen Einfluss auf die Reduktion von NBT haben.
5.7. Statistische Bewertung der Ergebnisse
Der Einfluss der Inhibitorart und -konzentration auf die Bräunung und Bildung von CML,
fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin wurde mit dem Statistik-Programm SAS
getestet. Außerdem wurde die Abhängigkeit der einzelnen Parameter von einander untersucht.
73
Lactose-Pepton-Maillard-Produkte
5.7.1. Anwendung des GLM-Verfahrens Zur Ermittlung der Abhängigkeit verschiedener Parameter der Maillard-Reaktion von
Inhibitorart und –konzentration mit Hilfe des GLM- Verfahrens werden 130 Proben (13
Inhibitoren, fünf verschiedene Konzentrationen pro Inhibitor, jeweils in Doppelbestimmung)
miteinander verglichen. Die Ergebnisse der statische Bewertung des Zusammenhangs
zwischen den Parametern: Bräunung sowie Bildung von CML, fluoreszierenden Produkten
und Lactulosylamin erfolgte mit Hilfe des GLM-Verfahrens. Ein p-Wert von <0,0001
(Tabelle 12) zeigt eine starke Abhängigkeit des Parameters von der Inhibitorart und -
konzentration.
Produkte Bräunung CML
Fluoreszierende Lactulosylamin
Quelle Anzahl
derVariable p-Wert p-Wert p-Wert p-Wert
Inhibitor (I) 13 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001
Konzentration (C) 5 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001
I*C 65 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001
Tabelle 12: Statistischer Zusammenhang zwischen der Bräunung sowie der Bildung von CML,
fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin und der Inhibitorart und –konzentration ermittelt
durch das GLM-Verfahren.
5.7.2. Duncan-Gruppierung der Testsubstanzen bezogen auf ihre Fähigkeit, verschiedene Parameter der Maillard-Reaktion zu inhibieren
Durch die Duncan-Gruppierung kann man nicht nur ähnliche Einflüsse mehrerer Inhibitoren
erfassen, sondern auch den Einfluss der Inhibitoren auf die Bräunung nach ihrer Stärke
ordnen.
Tabelle 13 zeigt, dass die Inhibitoren Natriummetabisulfit und Nα-Acetylcystein sowie
Thiamin und Acetylsalicylsäure eine ähnliche Wirkung auf die Bräunung haben.
Die Aktivität der Bräununsinhibitoren fällt in der Reihenfolge: Natriummetabisulfit > Nα-
acetylcystein > Glutathion > Thiamin > Acetylsalicylsäure > Mercaptoethanol > Nikotinsäure
> Pyridoxin >........> EDTA > o-Phenylendiamin.
Durch die Duncan-Gruppierung wird deutlich, dass Glutathion und Semicarbazid sowie
Cystein und EDTA einen ähnlichen Einfluss auf die CML- Bildung haben.
74
Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Die Inhibitionsaktivität der CML-Bildung fällt in der Reihenfolge:
Semicarbazid = Glutathion > Acetylsalicylsäure > Nikotinsäure >........> Natriumsulfit Bräunung CML Fluoreszierende Produkte Lactulosylamin
Duncan
Gruppierung Inhibitor
Duncan
Gruppierung Inhibitor
Duncan
GruppierungInhibitor
Duncan
Gruppierung Inhibitor
A o-Phenylendiamin A Na2SO3 A Na2S2O5 A Mercapotoethanol
B EDTA B Cystein B Thiamin B Na2SO3
C Semicarbazid B EDTA C Nα-Acetylcystein C Nα-Acetylcystein
D Na2SO3 C B Mercapotoethanol D C Na2SO3 D EDTA
E Cystein C B D o-Phenylendiamin D Acetylsalicylsäure E Cystein
F Pyridoxin C E B D Pyrodixin E Mercapotoethanol F Na2S2O5
G Nicotinsäure C E B D Nα-Acetylcystein F E EDTA G Thiamin
G Mercaptoethanol C E F D Thiamin F G Nicotinsäure G o-Phenylendiamin
H Acetylsalicylsäure C E F D Na2S2O5 G Glutathion H Glutathion
H Thiamin E F D Nicotinsäure H Pyrodixin H Nicotinsäure
I Glutathion E F Acetylsalicylsäure I Semicarbazid I Semicarbazid
J Nα-Acetylcystein F Glutathion J Cystein J Thiamin
K Na2S2O5 F Semicarbazid K o-Phenylendiamin K Acetylsalicylsäure
Tabelle 13: Duncan-Gruppierung der Testsubstanzen bezogen auf ihre Fähigkeit verschiedene
Parameter der Maillard-Reaktion zu inhibieren. A bezeichnet die schwächste Aktivität und K die
stärkste. Substanzen mit vergleichbarer Wirkung sind mit denselben Buchstaben gekennzeichnet.
pierung, dass der effektivste
nhibitor o-Phenylendiamin war, gefolgt von Cystein und Semicarbazid. Dabei gibt es
Reihenfolge der
inhibitorischen Aktivität der Testsubstanzen: Acetylsalicylsäure > Thiamin > Semicarbasid >
Für die fluoreszierenden Produkte zeigte die Duncan-Grup
I
Ähnlichkeiten zwischen dem Einfluss von Nα-Acetylcystein und Natriumsulfit, zwischen
Natriumsulfit und Acetylsalicylsäure sowie zwischen EDTA und Nikotinsäure.
Die Duncan-Gruppierung macht weiterhin deutlich, dass es bei der Inhibition der
Lactulosylaminbildung nicht nur keine Ähnlichkeit zwischen dem Einfluss der
Bräununginhibitoren gibt, sondern auch eine grundlegend andere
Nikotinsäure > Glutathion >.....> Mercaotoethanol.
75
Lactose-Pepton-Maillard-Produkte
5.7.3. Korrelation zwischen den Faktoren Bräunung, Bildung von CML, luoreszierenden Maillard-Produkten und Lactulosylamin
• Beim dominierenden thermischen Abbauweg von Lactose (80%) entsteht Glyoxal, das
Lysinse en ne r , um CML zu bilden. Der Rest der
Lactose-Abbau üh en -Reak zur B on
elanoidi
(20% ist die d-Reaktion, bei welcher Lactose m en
r t unter Ents ng vo losy uoreszie Maillard en,
Bräunung und CML.
den Lactoseabbau-Weg wobei eines der Vorläufer das andere ist.
araus ergibt sich eine positive Korrelation zwischen der Bildung von Lactulosylamin von
an
ebildetem CML und desto stärker ist die Bräunung und desto geringer sind die
g und CML und der Bildung von Lactulosylamin und fluoreszierenden Maillard-
f
Mit dem Programm-SAS wurde auch die Korrelation zwischen unterschiedlichen Faktoren
derselben Proben berechnet (Tabelle 14).
Es besteht eine positive Korrelation zwischen der Bräunung und der CML-Bildung sowie
zwischen der Bildung von fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin.
Eine mögliche Erklärung dafür wäre, dass bei höheren Temperaturen in erhitzten Lactose-
Peptone-Mischungen zwei unterschiedliche Reaktionsmechanismen gleichzeitig ablaufen
können134(Abb. 28):
mit dem itenkett der Pepto eagiert
produkte f rt über d Maillard tion-Weg ildung v
braunen M nen.
• Ein Nebenweg ) Maillar it Pepton
eagier tehu n Lactu lamin, fl renden -Produkt
Lactulosylamin und fluoreszierende Maillard-Produkte, sowie CML und Bräunung bilden
sich unter den Experimentalbedingungen durch die gleichen Wege das heißt durch der
Maillard-Reaktion- bzw.
D
den fluoreszierenden Maillard-Produkten, sowie zwischen der Bildung von CML und der
Bräunung. Je mehr Lactose thermisch abgebaut wird, desto höher ist die Konzentration
g
Konzentrationen der durch Maillard-Reaktion gebildeten Lactulosylamine und
fluoreszierenden Maillard-Produkte. So ergeben sich eine negative Korrelation zwischen der
Bräunun
Produkten.
76
Lactose-Pepton-Mallird-Produkte
Abb ung 2 ismus r Bildun Lactulo amin nder ailla
CML und Bräu
und
actulosylaminbildung
fluss einiger
igen Veränderungen im Bräunungs-grad
er Proben. Diese Veränderungen sind von der Art und der Konzentration der Inhibitoren
bhängig. Die größte Inhibitonsrate der Bräunung wurde durch Natriummetabisulfit und Nα-
Acetylcystein (mehr als 80%), die kleinste durch EDTA (bis 27%) erreicht. o-Phenylendiamin
zeigte eine negative Inhibitionsrate, was heißt, dass diese Substanz die Bräunung verstärkt.
ng reszierende duk Lactulosyl
ild 8: Mechan de g von syl , fluoresziere M rd-Produkten,
nung.
Bräunu FluoPro te CML amin
Bräunung 1.00000
-0.640<.0001
88 01
65
0.541<.00
-0.85234 <.0001
Fluoreszieren
rodukte
< 00000
02
0.de
P -0.64065
.00011. -0.726
<.000170502
<.0001
CML 0. 88 <.0001
0.72602.0001
000 -0.4541 - <
1.00
9150 <.0001
L
Tabelle 14: Korrelation zwischen Bräunung, Bildung von CML, fluoreszierender Produkte
actulosylamin <.0001 <.0001 < .0001 -0.85234 0.70502 -0.49150 1.00000
L
5.8. Zusammenfassung und Diskussion
Durch die Erhitzung von Lactose-Pepton-Mischungen werden unterschiedliche Maillard-
Produkte in den Proben gebildet. In diesem Abschnitt wurde der Ein
Bräunungsinhibitoren auf die Bildung von vier Arten von Maillard-Produkten getestet: braune
Maillard-Produkte, fluoreszierende Maillard-Produkte, Carboxymethyllysin (CML) und
Amadori-Produkte Lactulosylamin.
Die Messungen der Absorptionen der Proben mit und ohne Zusatz unterschiedlicher
Konzentrationen von verschiedenen Inhibitoren ze
d
a
77
Lactose-Pepton-Maillard-Produkte
Es wurde auch getestet, ob der Zusatz von Inhibitoren und die Maillard-Produktbildung in den
erhitzten Proben zu großen Veränderungen des pH-Werts führen, da dieser die Bräunung der
roben entscheidend beeinflusst. Die Veränderungen in den pH-Werten der Proben waren mit
sin-Modellsystem
en ebenso mehr Aktivität im Lactose-Lysin-Modell als im Lactose-
Pep
Mit Hi
Pepton
verschiedener Inhibitoren erhitzt worden waren. Die CML-Konzentrationen nehmen bei
hoh
die Br
Inhibition der Bräunung, waren Acetylsalicylsäure, Nα-Acetylcystein sowie Glutatathion
en.
ine mögliche Erklärung dafür ist, dass diese Inhibitoren die Maillard-Reaktion nach der
ildung des Amadori-Produkts stoppen. Als folge läuft die Reaktion bei erhöhter
Inhibitorkonzentration bis zur Bildung von Amadori-Produkten und wird dann gestoppt.
Dadurch reichert sich Lactulosylamin an. Cystein, Semicarbazid, Acetylsalicylsäure,
Pyridoxin, und EDTA können die Lactulosylamin-Bildung nicht unterdrücken, so dass diese
P
Ausnahme derer bei Acetylsalicylsäure (Tabelle 11) jedoch so geringfügig, dass sie die
Bräunung nicht beeinflussen.
Ein Vergleich zwischen der Bräunung in Lactose-Lysin und in Lactose-Pepton-
Modellsystemen verdeutlicht, dass die Bräunung bei dem Lactose-Ly
stärker ist als bei den Lactose-Pepton Mischungen. Eine Erklärung dafür wäre, dass Lysin
effektiver als die andere Aminosäure an der Bildung von braunen Produkten beteiligt ist135.
Die Inhibitoren zeigt
ton-Modell.
lfe eines kompetetiven ELISAs wurden die CML-Konzentrationen in den Lactose-
-Mischungen bestimmt, die in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen
en Konzentrationen der ausgewählten Inhibitoren ab. Die CML-Konzentrationen sind wie
äunung von Art und Konzentration des Inhibitors abhängig. Anders als bei der
effektiver als Natriummetabisulfit und Semicarbazid die Bildung von CML zu verhindern.
Weiterhin wurde der Einfluss der Bräunungsinhibitoren auf die Bildung von fluoreszierenden
Produkten in den erhitzten Proben getestet. Nur zwei der verwendeten Bräunungsinhibitoren,
Cystein und o-Phenylendiamin konnten die Bildung von fluoreszierenden Maillard-Produkten
inhibieren. Unter den Versuchbedingungen zeigte nur Pyridoxin eine messbare
Eigenfluoreszenz, so dass man davon ausgehen kann, dass die anderen Inhibitoren die
Fluoreszenzmessung nicht stören.
Die verwendeten Bräununginhibitoren haben einen unterschiedlichen Einfluss auf die
Lactulosylaminbildung in den Proben. Bei Verwendung einiger Inhibitoren wie Natriumsulfit
und Mercaptoethanol steigt die Lactulosylaminkonzentration mit steigender Konzentration
der Inhibitor
E
B
78
Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Bräunungsinhibitoren vermutlich an einen anderen Reaktionsweg eingreifen, der unabhängig
von der Bildung des Amadori-Produkts ist.
Die übrigen verwendeten Bräunungsinhibitoren können die Bildung von Lactulosylamin bis
zu bestimmten Konzentrationen inhibieren oder verstärken, so dass die Inhibition der
Bräunung wohl über zwei Mechanismen abläuft. Bei der Verwendung von
Natriummetabisulfit z.B. nimmt die Konzentrationen von Lactulosylamin bis 10 mM
adori-Produkten stattfindet. Bei einer hohen Natriummetabisulfit-
onzentration könnte die Bräunungsinhibition durch die Hemmung anderer
Zwischenprodukte ablauf
Mög können wefelhaltig itoren auc losylaminb ng
Andere stören 136,137, was ist noch getestet werden müsste.
Die e Auswe r Ergebni deutlicht, e starke ion
zwischen Bräunung, Bildung von CML, fluoreszi
Inhibitorart und -konzentration besteht.
hin eine p orrelation zwischen der Bräunung und der CML-Bildung
owie eine positive Korrelation zwischen der Bildung von Fluoreszenzprodukten und
Bildung von fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin als auch
wischen der CML- und der Lactulosylaminbildung. Eine mögliche Erklärung dafür wäre,
Lactose-Pepton-Mischungen zwei
losylamin oder der fluoreszierenden Maillard-Produkte.
Inhibitorzusatz ab, wobei der Mechanismus der Bräunungs-inhibition durch Inhibition der
Bildung von Am
k
en.
licherweise die sch en Inhib h Lactu estimmu
statistisch rtung de sse ver dass ein Korrelat
erenden Produkten und Lactulosylamin und
Es gibt weiter o Ksitive
s
Lactulosylamin. Die statistische Auswertung zeigte auch eine negative Korrelation zwischen
der Bräunung und der
z
dass bei höheren Temperaturen in erhitzten
nterschiedliche Reaktionmechanismen gleichzeitig ablaufen können: die Degradation von u
Lactose und die Maillard-Reaktion. Die erste ist der dominante Reaktionmechanismus, durch
den vermutlich, dass 80% des reagierenden Zuckers abgebaut wird. Je höher deshalb die
Konzentration von Lactose ist, die direkt abgebaut wird, desto höher ist die Konzentration von
gebildetem CML oder die Bräunung, und desto geringer ist die Konzentration des durch die
Maillard-Reaktion gebildeten Lactu
So ergeben sich eine negative Korrelation zwischen der Bräunung oder CML und der Bildung
von fluoreszierenden Maillard-Produkten.
79
Milch-Maillard-Produkte
6. Inhibition der Maillard-Reaktion in Milch
6.1. Inhibition der Bräunung in Magermilch
In den weiteren Versuchen sollte untersucht werden, in wie weit die zuvor identifizierten
verschiedener Inhibitoren für 30 Minuten bei 120°C erhitzt wurde.
Inhibitoren der nicht-enzymatischen Bräunung auch in einem realen Lebensmittel wirksam
sind. Dazu wurde Milch ausgewählt, da die Erhitzung von Milch und Milchprodukten
Fehlfärbungen verursacht, die zu erheblichen Qualitätseinflüssen führen. Dazu wurde eine
Modellsystem (vgl. Abschnitt 7.6.1) entwickelt, bei dem Magermilchpulver, das in 0,5 M
PBS rekonstruiert worden war, in Anwesenheit oder Abwesenheit von unterschiedlichen
Konzentrationen
Während der Erhitzung trennen sich die Proben in zwei Phasen; eine schaumartige feste Phase
und eine gefärbte Lösung. Somit konnte die Bräunung leicht in der Lösung analytisch
bestimmt werden. Um eine klare Lösung für die Messung der Bräunung zu bekommen,
wurden die Proben zentrifugiert.
In Abbildung 30 sind verschiedene Proben dargestellt, die mit Natriummetabisulfit, Cystein
und Thiamin in unterschiedlichen Konzentrationen erhitzt wurden.
Inhibition der Bräunung in Magermilch durch Natriummetabisulfit
Inhibition der Bräunung in Magermilch durch Cystein
80
Milch-Mallird-Produkte
8
A
r
D
k
D
w
6M
I
E
D
I
Inhibition der Bräunung in Magermilch durch1
bbildung 30: Einfluss der Inhibitorart und -konzentration auf die Inhibitionsrate der Bräunung in
ekonstruierter Magermilch
ie Bräunungsintensität der Proben verändert sich in Abhängigkeit von der Inhibitorart und -
blieben die Lösungen braun.
onzentration, wobei die Farbe bei den nicht inhibierten Proben dunkelbraun war.
urch Zugabe von 50 mM Natriummetabisulfit blieb die Lösung farblos, von 50 mM Cystein
urden sie gelb und von 50 mM Thiamin
.1.1. Photometrische Bestimmung der Bräunung in rekonstruierter agermilch
n den Magermilchproben wurde nur die Wirkung der Inhibitoren getestet, die einen großen
influss auf die Bräunung im Modellsystem hatten.
ie Absorptionen der Proben wurden bei 420 nm gemessen und in Abhängigkeit von
nhibitorart und -konzentration in den folgenden Abbildungen dargestellt.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Abs
orpt
ion
Cystei
nEDTA
Acetyl
salic
ylsäu
re
Pyrido
xin
Semica
rbazid
0 mM
5 mM
10 mM
20 mM
50 mM
Thiamin
Milch-Maillard-Produkte
3,0
0,0
0,5
Mercap
toetha
nol
Thiam
in
Natrium
sulfit
Nicotin
säure
Glutath
ion
Natrium
metabis
ulfit
Inhibitor
Ab 1,0
2,5
son 0 mM
5 mM
10 mM1,5
2,0
rptio
20 mM
50 mM
Abbildung 31: Einfluss der verschiedenen Inhibitoren auf die Bräunung in den rekonstruierten
Magermilchproben, die in Anwesenheit oder Abwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von
verschiedenen Inhibitoren für 30 Minuten bei 120°C erhitzt worden waren. Die Ergebnisse sind als
Mittelwert von 3 Messungen ± SD dargestellt.
Abbildung 31 verdeutlicht, dass die Bräunung in den Proben mit steigender Konzentration der
Inhibitoren abnimmt. Dabei ist die Inhibitionsrate vor allem von der Inhibitorart abhängig.
Natriummetabisulfit, sowie Natriumsulfit oder Mercaptoethanol zeigen im Gegensatz zu
EDTA oder Nicotinsäure einen großen Einfluss auf die Inhibitionsrate der Bräunung in den
Magermilchproben. Die Inhibitionsrate der Bräunung ist bei den Proben im Lactose-Lysin-
Modellsystem größer als bei den Magermilchproben, obwohl beide Proben mit den gleichen
Inhibitoren in gleichen Konzentrationen behandelt wurden.
Eine Erklärung dafür könnte sein, dass Substanzen aus der Magermilchmatrix mit den
z
6.1.2. Einfluss der Erhitzung und des Inhibitorzusatzes auf den pH–Wert der Proben
Die pH-Werte der erhitzten Proben (Abschnitt 5.1) wurden gemessen, um einen möglichen
Einfluss der pH-Wert Veränderungen auf die Inhibition der Bräunung festzustellen. Die
E . Die Mischungen, die ohne Inhibitor
erhitzt wurden, zeigten gegenüber den nicht erhitzten Proben eine leichte Absenkung des pH-
Wert von 6,8 auf 6,5. In den Proben, die in Anwesenheit der Inhibitoren erhitzt worden
rgebnisse dieser Messung sind in Tabelle 18 dargestellt
ugegebenen Inhibitoren reagieren.
82
Milch-Mallird-Produkte waren, waren die pH-Werte gegenüber denen ohne Zusatz von Inhibitoren geringfügig erhöht
oder verringert. Allgemein konnten jedoch keine bedeutenden pH-Wert Änderungen
gemessen werden.
Inhibitor /pH 0 mM 5 mM 10 mM 20 mM 50 mM
Natriumbisulfit 6,47 6,46 6,47 6,47 6,38
N 6,52 6,55 6,62 atriumsulfit 6,47 6,50
Cystein 6,45 6,46 6,46 5,45 6,41
Semicarbazid 6,43 6,44 6,43 6,42 6,35
Pyridoxin 6,47 6,43 6,41 6,37 6,27
Thiamin 6,44 6,42 6,41 6, 37 6,28
Acetylsalicylsäure 6,46 6,43 6,40 633 6,12
Mercaptoethanol 6,45 6,43 6,46 6,46 6,47
EDTA 6,47 6,46 6,44 6,40 6,30
N-Acetylcystein 6,47 6,46 6,44 6,41 6,32
Nikotinsäure 6,45 6,44 6,42 6,39 6,31
Tabelle 15: pH-Werte der in 0,5 PBS (pH 6,8) rekonstruierten 10%igen Magermilchproben, die in
nwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen unterschiedlicher Inhibitoren für 30
Milchproben
Die Trennung der Proben in zwei Phasen in allen erhitzten Proben, denen Testsubstanzen
zugesetzt worden waren, hatte den Vorteil, dass die Bräunung in einer klaren Lösung
gemessen werden konnte. Für einen Einsatz in der Lebensmittelproduktion ist dies jedoch
nicht akzeptabel. Deshalb wurde der Einfluss verschiedener Faktoren auf die Phasentrennung
der Proben getestet.
6.2.1. Einfluss des Inhibitorzusatzes Zunächst wurde der Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Phasentrennung untersucht.
Gleichzeitig wurde in den Proben der pH-Wert vor und nach dem Erhitzungsschritt gemessen,
um feststellen zu können, ob die Phasentrennung durch eine Veränderung des pH-Werts
verursacht wird. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 16 und 17 dargestellt.
A
Minuten bei 120 °C erhitzt worden waren.
6.2. Faktoren, die die Phasentrennung verschiedenerbeeinflussen
83
Milch-Maillard-Produkte
Untersuchung von fettarmer Milch (1.5% Fett) Fettarme Milch wurde in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von
Cystein für 30 Minuten bei 120°C erhitzt, um den Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die
Phasentrennung der Proben zu untersuchen. Der pH-Wert der Proben wurde vor und nach
dem Erhitzen gemessen.
Inhibitorkonzentration 0 mM 5 mM Cystein10 mM
Cystein
20 mM
Cystein
50 mM
Cystein
pH-Wert vor dem
Erhitzen 6,72 6,72 6,71 6,67 6,65
pH-Wert nach dem
Erhitzen 6,42 6,37 6,31 6,24 6,04
Trennung 1 Phase 1 Phase 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen
Tabelle 16: Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Proteinpräzipitation in fettarmer Milch, die in
Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von Cystein für 30 Minuten bei 120°C
rhitzt wurde. e
Untersuchungen von rekonstruierter Magermilch Der gleichen Versuche wurde mit den Magermilchproben durchgeführt, die zuvor aus
Magermilchpulver mit 0,5 M PBS-Puffer (pH 6,8) rekonstruier wurden.
Konzentration der
Inhibitor 0 mM Cystein 5 mM Cystein
10 mM
Cystein
20 mM
Cystein
50 mM
Cystein
pH-Wert vor dem
Erhitzen 6,79 6,79 6,78 6,78 6,77
pH-Wert nach dem 6,48
Erhitzen 6,45 6,44 6,44 6,41
Trennung 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen
Tabelle 17: Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Proteinpräzipitation in fettarmer Milch, die in
nwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von Cystein für 30 Minuten bei 120°C
jedoch die Proteine nur bei einem Zusatz von mehr als 10mM Cystein aus.
A
erhitzt wurden.
Der pH-Wert bleibt in allen Proben über 4,6, dem Wert, bei dem Casein ausfallen.
In den Magermilchproben fallen die Proteine bei allen Inhibitorkonzentrationen sowie bei der
Probe, der kein Inhibitor zugegeben worden war aus. Bei den fettarmen Milchproben fallen
84
Milch-Mallird-Produkte Die Präzipitation des Caseins ist jedoch nicht nur auf die Anwesenheit der Inhibitoren
zurückzuführen, da bei der rekonstruierten Magermilch auch ohne Zusatz von Testsubstanzen
eine Phasentrennung zu beobachten ist.
.2 der konzentration
tion auf die Proteinfäl
ilchpulver in Wasser oder in unterschiedlich
wurden
rs Cystein gegeben. Di
argestellt:
0 mM 5 mM C n 10 mM n 20 mM tein 50 mM tein
6 .2. Einfluss Puffer Weiterhin wurde der Einfluss der Pufferkonzentra lung in der erhitzten
Magermilchlösung getestet, wobei das Magerm
konzentrierten PBS-Puffern suspendiert wurde. Auch zu diesen Proben
unterschiedliche Konzentrationen des Inhibito e Ergebnisse sind in
Tabelle 18 d
ystei Cystei Cys Cys
Wasser 1 Phase 1 Phase 1 Phase 2 Phasen 2 Phasen
PBS (100mM) 2 Phas
Trübung
2 Pha
Trübung
2 Ph
Trübung
2 Ph
Trübung
2 P
Trübung
en sen asen asen hasen
PBS (500mM) 2 Phasen
2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen
Tabelle 18: Einfluss der Pufferkonzentration auf das Ausfällen von Proteinen einer erhitzten
agermilchprobe unter Verwendung von Cystein als Bräununginhibitor
agermilchpulver mit Wasser rekonstituiert wurde. Bei hohen Pufferkonzentrationen fallen
In Abschnitt 5.2.2 wird gezeigt, dass die Trennung der Proben in zwei Phasen beim Zusatz
etestet, ob sich durch Kombination mehrer
M
Diese Tabelle zeigt, dass die Proteine erst bei Zusatz von 20 mM Cystein ausfallen, wenn das
M
die Proteine der Magermilchproben auch ohne Zusatz von Inhibitor aus. Dies bedeutet, dass
der Zusatz des Puffers zur Präzipitation der Proteine führt.
6.2.3. Einfluss der Inhibitorkonzentration
von ≥20mM Cystein erfolgt. Deshalb wurde g
Inhibitoren auf Grund von synergistischen Effekten, die ihibitorische Wirkung bereits bei
niedrigeren Konzentrationen erzielen lässt. Damit könnte die Bräunung inhibiert werden ohne
dass dabei die Proteine ausfallen.
85
Milch-Maillard-Produkte
Deshalb wurde der Einfluss des Zusatzes von 10 und 20 mM Natriummetabisulfit bzw. von
fluss einer Mischung von Inhibitoren auf die Bräunung i germilch oder der
ysin-Modellmi
ng 32 zeigt, dass man eine zwei- bis dreifache Gesamtkonzentration anderer
igt, um die bitionsrat 10 mM Natriummetabisulfit zu erreichen. Bei
testeten Inhibitorenkonzentrationen war weiterhin auch eine Phasentrennung zu
beobachten.
dieser Konzentration beträgt die Inhibitionsrate der Bräunung nicht mehr als
2% durch Natriummetabisulfit und bei den anderen Inhibitoren weniger als 10%.
ei Lactose-
Mischungen aus jeweils 5 mM Cystein und Thiamin und 10 mM Natriummetabisulfit oder
jeweils 5 mM Thiamin und Natriummetabisulfit und 10 mM Cystein (Abbildung 32) getestet.
1 2 3 4 5
Abbildung 32: Ein
Lactose-L
n der Ma
schung.
Abbildu
Inhibitoren benöt
allen ge
Inhi e von
Das bedeutet, dass man wegen Instabilität der Proteinlösung eine Konzentration von 5 mM
der Inhibitoren nicht überschreiten darf, um die Bräunung in Milch oder Magermilch zu
vermeiden. Bei
3
Allgemein beobachtet man, dass die gleichen Inhibitoren eine größere Wirkung b
Lysin-Mischung als bei Magermilch haben. Eine mögliche Erklärung dafür wäre, dass die
Inhibitoren mit anderen Substanzen der Magermilchmatrix reagieren, und damit für die
Inhibition der Bräunungsreaktion nicht mehr zur Verfügung stehen.
ohne Inhibitor 5 m
10 mM Na2S2O5 20 mM Na2S2O5
10 mM Cystein
5 mM Thiamin
M Na2S2O5
5 mM Cystein
5 mM Thiamin
10 mM Na2S2O5
Inhibitionsrate
(%) in
Magermilch
32,31 % 58,71 % 42.61 % 63,66 %
00,5
253
1 2 3 4 5
AB
S
11,5
2,
3,5
LactoMisc
se-Lysin-hung
Magermilch
Inhibitoren
86
Milch-Mallird-Produkte 6.3. Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Es wurden zwei neue Testsysteme mit rekonstruierter Magermilch und 1,5% fettarmer Milch
en, die in den Modellmischungen zuvor
ine effektive Inhibitonswirkung auf die Bräunung zeigten, auf Milch untersuchen kann. Um
Reaktionsbedingungen gesucht, bei denen keine Phasentrennung
rfolgt. Dafür wurde der Einfluss versch r z
Testsubstanzen sowie des Puffers, auf die Phasentrennung getestet. Dabei wurde festgestellt,
cht nur der sondern die Inhi konzen bhäng er
Präzipitation der Proteine führten.
ng d re, das Pufferkonzentrationen die Hydrophobizität der
Mizelloberfläche des Milchserums herabsetzen. So ändert sich die Löslichkeit dieser Mizellen
sich d Phase .
Die Inhibitoren können, auch insbesondere bei hoher Temperatur, durch die Reaktion mit
egen der Proteinpräzipitation sollte man eine Konzentration des Inhibitors von maximal 5
ass die gleichen Inhibitoren eine
Magermilch zeigten. Eine mögliche
Inhibitoren mit anderen Substanzen der Magermilchmatrix
entwickelt, mit denen man den Einfluss der Substanz
e
die Bräunung photometrisch erfassen zu können, wurde das Magermilchpulver in 0,5 M PBS
(pH 6,8) statt in Wasser suspendiert. Der Pufferzusatz führt zu einer Phasentrennung während
des Erhitzens, so dass die Bräunung in der resultierenden Lösung gemessen werden kann.
Um jedoch auch eine Anwendung in der Lebensmittelproduktion ermöglichen zu können,
wurden weiterhin nach
e iedener Fakto en, wie Kon entration der
dass ni Puffer auch bitoren, trationsa ig zu ein
Eine Erkläru afür wä s hohe
und es ergibt aher eine ntennung
Disulfidbrücken die Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine stören, was zur Präzipitation,
vor allen der Caseine führen kann.
W
mM (entspricht einer Inhibitionsrate von maximal 32%) verwenden, um die Bräunung in
fettarmer Milch oder Magermilch zu inhibieren.
Bei einem Vergleich der inihibitorischen Wirkung der Testsubstanzen auf die Lactose-Lysin-
Mischung mit der auf Magermilch wurde festgestellt, d
größere Wirkung bei Lactose-Lysin-Mischung als bei
Erklärung dafür wäre, dass die
reagieren, und damit für die Inhibition der Bräunungsreaktion nicht mehr zur Verfügung
stehen.
87
Isolierung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produkte
7. Isolierung, Strukturaufklärung und Inhibition der Bildung eines Maillard-Produktes aus einer Lactose-Lysin-Reaktionsmischung
.1. Einfluss von Natriummetabisulfit auf Produktspektrum einer Lactose-Lysin Maillard-Mischung
Abschnitt 3 wurde gezeigt, dass Natriummetabisulfit der effektivste Inhibitor der Bräunung
ar. Deshalb wurde weiterhin sein Einfluss auf die Bildung von Maillard-Produkten getestet.
ie Maillard-Produkte einer erhitzten Lactose-Lysin-Mischung wurden mittels HPLC
ufgetrennt und somit einen Unterschied zwischen dem Produktspektrum der
eaktionsmischungen, die mit oder ohne Zusatz von Natriummetabisulfit erhitzt wurden, zu
rkennen. Dafür wurden die Lactose-Lysin-Mischungen für 5 Stunden bei 120 °C erhitzt. Die
raune Probe wur abgeküh und durch ine Membrane filtriert. Die Maillard-Produkte der
actose wurden dann mittels HPLC aufgetrennt. D ographischen Parameter sind in
bschnitt 7.2 beschriebe
7
In
w
D
a
R
e
b de lt e
L ie chromat
A n.
Abbildung 33: Chromatogramm einer Maillard-Mischung (0,1M Lactose und 0,02M Lysin in 0,1M
as nach 26
PBS Puffer, pH=6,8), die für 5 Stunden bei 120 °C erhitzt wurde. Das Hauptprodukt, das bei einer
Wellenlänge von 280 nm detektiert wird, ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Bei einer Detektionswellenlänge von 280 nm wurde ein Hauptprodukt detektiert, d
Minuten eluiert. Es wurde der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von
Natriummetabisulfit auf die Bildung dieses Maillard-Produktes mittels HPLC untersucht.
88
Isolierung eines Lactose-Lysin-Mallird-Produkte
Abbildung 34: Einfluss von Na2S2O5 auf die Bildung von Maillard- Produkten in der Maillard-
Mischung (0,1M Lactose, 0,02M Lysin), die für 5 Stunden bei 120 °C erhitzt wurde.
mischungen kleiner wurde und von 50 mM
Folgenden sollte die Struktur des Produktes identifiziert
des Maillard-Produkts
Alle 60 Minuten wird eine Probe entnommen und mittels HPLC analysiert. Die
lächen unterhalb der jeweiligen Peaks der Substanz werden prozentual im Verhältnis zu den
Gesamtprodukten der Reaktionsmischung dargestellt. Die gebildeten Substanzmengen
abhängig von der Erhitzungsdauer sind in der Abbildung 35 dargestellt.
Abbildung 34 zeigt, dass der Hauptpeak des HPLC-Chromatogramms nach Zusatz von 10
mM von Natriumbisulfit zu den Reaktions
vollständig verschwand.
Folglich kann der Zusatz von hohen Konzentrationen des Inhibitors die Bildung dieses
Produkts vollständig inhibieren. Im
werden. Dazu wurde dieses Maillard-Produkt mittels präparativer HPLC, wie in Abschnitt 7.3
beschrieben, isoliert.
7.2. Einfluss der Zeit auf die Bildung
Um das unbekannte Produkt von einer möglichst großen Ausbeute isolieren zu können, wurde
in diesem Teil der Einfluss der Arbeit der Erhitzungszeit auf die Bildung des Lactose-Lysin-
Maillard-Produktes mittels HPLC untersucht. Dazu wurde die Lactose-Lysin-Mischung
(0,1M Lactose und 0,02M Lysin in 0,1 M PBS-Puffer; pH 6,8) bei 120°C für14 Stunden
erhitzt.
F
89
Isolierung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produkte
Abbildung 35: Einfluss der Erhitzungszeit auf die Bildung des Hauptprodukts der Lactose-Lysin-
Maillard-Mischung.
Die Substanz kann in der Probe bereits nach einer Stunde Erhitzungszeit detektiert werden.
Nach fünf Stunden entstehen diverse unerwünschte Nebenprodukte. Deshalb wurden fünf
Stunden Erhitzungszeit für die präparative Darstellung der ausgewählten Substanz in den
folgenden Versuchen verwendet.
7.3. Isolierung vReaktionsmischung
on 2-Hydroxymethylfuran aus der
Eine Lösung von 0,1M Lactose Monohydrat und 0,02 M Lysin wurde PBS (0.1 M, pH=6,8) 5
Stunden bei 120°C erhitzt und anschließend im Eisbad gekühlt.
Der Großteil des Wassers wurde mittels Rotationverdampfer aus der Reaktionsmischung
entfernt. Die HPLC-Analyse des Rückstandes und des Destillats zeigten jedoch, dass die
unbekante Verbindung unter diesen Bedingungen vollständig in das Destillat überging. Die
Substanz wurde deshalb mittels Diethylether aus dem Destillat extrahiert.
Das Lösungsmittel wurde dann größten Teils unter reduziertem Druck abgedampft und die
verbleibende Menge an Diethylether wurde im Stickstoffstrom entfernt. Die Substanz wurde
ls Rotationverdampfer
ntfernt und die Substanz wurde erneut aus der verbleibenden wässerigen Phase mit Ether
aus dem Etherextrakt anschließen mittels präparativer HPLC (Acetonitril/Wasser als
Elutionsmittel) isoliert.
Das Acetonitril wurde anschließend aus der isolierten Fraktion mitte
e
extrahiert. Der Extrakt wurde mittels wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und Ether erneut
mit einem Stickstoffstrom aus der Probe entfernt. Die gereinigte Substanz wurde bis zu den
NMR- und LC-MS/MS -Messungen bei -20 °C im Gefrierschrank aufbewahrt.
90
Isolierung eines Lactose-Lysin-Mallird-Produkte
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0 5 10 15 20 25 30
Retentionszeit [min]
ABS
bei 2
19 n
m
8,75
Abbildung 36: HPLC-Chromatogramm des unbekanntes Maillard-Produkts nach Extraktion und
Reinigung aus einer erhitzten Lactose-Lysin-Mischung.
7.4. Identifizierung von 2-Hydroxymethyl-furan durch
ach der HPLC-Trennung und Reinigung des unbekannten Lactose-Lysin-Maillard-Produkts
en: 81, 69, 54, 45 detektiert wurden. Die Fragmente können durch
spektoskopische Methoden
N
wurde ein Massenspektrum nach positiver Ionisierung angefertigt. Dabei wurde ein
Hauptsignal bei einem Molekulargewicht von 98,0 erhalten. Weiterhin konnten vier
Fragmente mit den Mass
eine Abspaltung von -OH, -CH2OH, und -CH2-CH2-OH bzw. erklärt werden.
Abbildung 37: Massenspektrum des unbekannten Lactose-Lysin-Maillard-Produktes
91
Isolierung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produkte
In dem Massenspektrum der analysierten Probe hat bei der Verdampfkurve keinen deutlichen
Peak gezeigt, die normalweise die Ionisationintensität als abhängig von der Vedampfzeit
zeigt. Diese Kurve hilft bei der Bestimmung der zugehörigen Fragmente der analysierten
Substanz, deshalb wurde LC/MS/MS als alternative Methode verwendet.
LC/MS/MS-Spektrum zeigt zusätzlich zu den Substanzfragmenten häufig Wasser, Natrium
oder Kalium Addukte der Substanz, was manchmal bei der Bestimmung der Gestammten
Masse der Substanz hilft.
roben, wie in Abschnitt 8.2 beschrieben, durchgeführt.
Für eine LC-MS/MS-Messung wurde eine verdünnte Lösung der Substanz hergestellt und
eine Messung der P
186,8
164,999
49,9410000
420000
gnal
in
117,2
80,9140000
28
Site
ögliche Abspaltungsfragmente: -OH, -CH OH
58,8
56
38,9
560000
700000
840000
nsitä
t [cp
s]
30 48,1 63,2 78,8 94,8 110,2 126,2 141,7 157,5 173,9 189,2
m/z
Abbildung 38: LC-MS/MS-Spektrum des unbekannten Produkts
Das Spektrum der Probe zeigt mehrere Signale: m/z: 39 (M -59); 42 (M – 56); 50 [M–(-OH) -
(-CH -OH)]; 56 [(M +1) - (-CH=CH -OH)]; 69 [(M+1)-(-CH -OH)]; 81(M - OH); 99 (M + 2 2 2
1); 117 [(M+1) +H2O]; 165 [(M+1) + H2O+ 2Na+]; 187 (2M+1). Die restlichen Peaks wurden
das Elutionsmittel verursacht.
Die MS und LC/MS/MS-Spektren zeigen, dass es sich um einen Alkohol mit einem
Molekulargewicht von 98 handelt, wobei die m 2
und -CH2CH2OH sind. Dazu bestätigen die Wasser- und Natriumaddukte diese Erklärung.
Als nächstes wurde eine 1H-NMR-Messung und 13C–NMR-Messung in CDCl3 angefertigt.
Dabei wurden folgende Signale detektiert:
92
Isolierung eines Lactose-Lysin-Mallird-Produkte
Abbildung 39:1H-NMR-Spektrum des unbekannten Lactose-Lysin-Maillard–Produktes.
δ(ppm) = 2,59 (s), 4,6 (s), 6,4 (d), 6,46 (d), 7,38 (d).
Abbildung 40: 13C-NMR-Spektrum des unbekannten Lactose-Lysin-Maillard– Produktes.
Bei dem 13C–NMR-Messung wurden die folgende Signale detektiert: δ (ppm)= 57,4; 107,8;
110,4; 142,6; 154,1.
Die Signale der der 13C–NMR und MS-Messungen zeigen, dass die Substanz ein
0,4 und 143,6
erden hervorgerufen durch die Kohlenstoffe C2 und C3 eines Furanrings. Das
Molekulargewicht von 98 und 5 Kohlenstoffmolekülen besitzt. Die Signale 11
w
93
Isolierung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produkte
Massenspektrum deutet darauf hin, dass der fünfte Kohlenstoff als –CH2-OH vorliegt, was
durch das Singulet bei 4,6 des 1H-NMR-Spektrum bestätigt wurde.
Alle Ergebnisse der spektroskopischen Untersuchungen deuten darauf hin, dass es sich bei
den unbekanten Lactose-Lysin-Maillard-Produkten um 2-Hydroxymethyl-Furan oder
.
Hz, 1H, C2), 6,46
(d, 1H, C3), 7,38 (d, 1H, C4). Die Kohlenstoffsatome wurden nach den Signalen des 13C–
NMR-Spektrums wie folgt zugeordnet:
δ (ppm)= 57,4 (C5), 107,8 (C3), 110,4(C2), 142,6 (C4), 154,1 (C1).
Diese Annahme wurde durch die spektroskopische Untersuchung einer authentischen
Referenzsubstanz bestätigt.
7.5. Zusammenfassung und Diskussion
Unter ,,Aroma" wird einerseits ein Kombinationseindruck verstanden, den Riech- und
Geschmacksstoffe in den Sinnesorganen Nase und Zunge hinterlassen; andererseits wird der
Begriff auch auf ein Gemisch von Aromastoffen oder eine Zubereitung aus solchen
ie Biosynthese der in lebendem Material vorliegenden Aromastoffe erfolgt auf sehr
n Fettsäuren entstehen durch Autoxidation nach einem
en
Metallkatalyse- Aldehyde, Ketone, Lactone und
iedere Fettsäuren144.
Kohlenhydrate sind wichtige Aromavorstufen in erhitzten Lebensmitteln. Bei der Pyrolyse
von Kohlenhydraten allein (bei Zuckern Karamellisierung genannt) entstehen ab 300 °C
Furfurylalkohol handelt. Die kleine Verschiebung des δ-Wert im 13C-NMR von 143,6 auf
142,7 kann gut durch die Bindung der –CH2-OH Gruppe erklärt werden, die zu einer
Verschiebung von -1 führt
So wurden die Protonen von Hydroxymethylfuran nach den Signalen des 1H-NMR-Spektrums
wie folgt zugeordnet: δ(ppm) = 2,59 (s, OH), 4,6 (s, 2H, C5), 6,4 (d, J=3,39
angewandt.
D
unterschiedlichen Wegen138,139. Beim Verletzen oder Absterben, sowie bei der Lagerung und
der Verarbeitung von Pflanzen treten Mikrobielle, enzymatische, oxidative und thermische
Veränderungen auf. Dabei spielt der Abbau der Fette eine besonders wichtige Rolle.
Insbesondere aus ungesättigte
radikalischen Reaktionsmechanismus über Hydroperoxide, gesättigte und ungesättigte
Aldehyde, Alkohole, Ketone und kurzkettige Fettsäuren, die als Aromastoffe wirken 140.
Lipoxygenasen und Alkohol-Dehydrogenasen bewirken ebenfalls die Bildung von Aldehyd
und Alkoholen aus ungesättigten Fettsäuren141-143. Beim Erhitzen bilden sich auch aus
gesättigten Fettsäuren -begünstigt durch
n
94
Isolierung eines Lactose-Lysin-Mallird-Produkte zahlreiche Aromastoffe, unter welchen Furanderivate, Ketone und aromatische
Kohlenwasserstoffe besonders häufig vorkommen145,146.
Schon bei wesentlich niedrigeren Temperaturen, gelegentlich bei Raumtemperatur, reagieren
Kohlenhydrate mit Aminosäuren. Diese Reihe von Reaktionen wird Maillard-Reaktion
genannt und führt zur Bildung von braunen Farbstoffen und von Aromastoffen, welche für
erhitzte und manchmal auch für gelagerte Lebensmittel, insbesondere aber für Koch und
Röstaromen, charakteristisch sind.
In diesem Tel der Arbeit wurde durch präparatives HPLC ein Aromastoff aus einer Lactose-
Lysin-Maillard-Mischung isoliert.
Die Struktur dieses Produkts wurde durch MS, LC-MS/MS, 1H-NMR, und 13C-NMR
ie 1H NMR, und 13C-NMR-Spektren entsprechen denen von Furfurylalkohol, die von einer
ds, SDOC“ erhalten wurden.
urfurylalkohol, Methylfurfural und Acetylfuran waren bereits zuvor als Nebenprodukte der
Karamellisierung beschrieben. Dabei ist vorgeschlagen worden, das Verhältnis von
Furfurylalkohol zu Benzaldehyd, einem anderen Karamelisierungsprodukt, zur
Charakterisierung des Karamellgeschmacks und für die Prozesskontrolle analytisch
einzusetzen147.
Furfurylalkohol, der nicht selbst zum Karamellgeschmack beiträgt, entsteht als flüchtige
Substanz über den thermischen Abbau von Lactose134 und wurde auch im
Milchkaramellaroma als eine der Hauptkomponenten, in Milchschokoladen, und
Magermilchpulver identifiziert148.
Mit Hilfe der HPLC/DAD wurde systematisch untersucht, welche Auswirkung der Zusatz von
Natriummetabisulfit auf das Produktspektrum einer erhitzten Lactose-Lysin-Mischung hat.
Nach Erhitzen bei 120 °C für 5 Stunden wurde ein Hauptprodukt gebildet. Das Produkt wurde
mittels präparativer HPLC isoliert und gereinigt. Die Struktur dieses Produkts wurde dann
thyl-furan
entifiziert. Die 1H NMR, 13C NMR, und MS Spektren entsprechen weiterhin denen
ass die Degradation von Lactose die dominierende Reaktion ist, wenn
aufgeklärt. Es handelt sich um Furfurylalkohol oder 2-Hydroxymethlfuran.
D
Datenbank "Spectral Database for Organic Compoun
F
durch MS, 1H-NMR, und 13C-NMR als Furfurylalkohol oder 2-Hydroxyme
id
Furfurylalkohol einer NMR–Datenbank.
Berg hatte gezeigt, d
Milch für mehr als 20 Minuten bei Temperaturen zwischen 110 und 150 °C erhitzt wurde. So
wurden 80 % der Lactose durch Isomerisierung und Degradation und 20% durch die Maillard-
Reaktion abgebaut134.
95
Isolierung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produkte
Ausgehend vom Lactoseabbau, wurde in Abbildung 41 ein Mechanisum für die Bildung von
Furfurylalkohol und deren Inhibition postuliert. Durch 1,2 Enolisierung von Lactose entsteht
von Lactulose zum 4-Deoxyoson und die weitere Reaktionreihe
Lactulose, die durch Abspaltung von Galactose und 2,3 Enolisierung zum 4-Deoxyoson
umgewandelt wird. Aus dem 4-Deoxyoson wird durch 1,2- Enolisierung und Abspaltung von
Ameisensäure 3-Deoxypentulose gebildet, die durch Cyclisierung zum Furfurylalkohol führt.
Sulfitionen könnten mit den 2,3-Enediol oder 3,4-Enediol der Lactulose reagieren und
demnach die Umwandlung
blockieren, die zur Bildung von Fururylalkohol führt. O
OH
HO
O gal
OH
OH
HO
O
OH
CH2OH
OH
CH2OH
gal
OH
O
HO
O
OH
CH2OH
gal
OH
OH
HO
O
OH
CH2OH
gal
gal
OH
O
OH
OH
CH2OH
CH2OH
O
H
OH
CH2OH
CH2OH
O
H
OH
CH2OH
O
H
Lactose 1,2-Enediol Lactulose2,3-Enediol
OH
OH
CHOH
OH
H
OH
CH2OH
O
HC
OH
H
OH
CH2OH
O
O
HCOOH
CH2OH
H
OH
CH2OH
O
O
OH
4-Deoxyoson 1,2-Enediol 3-Deoxypentulose
Furfuryl-Alkohol
SO
OO
O
OH
CH2OH
H
OH
SO
OO
OH
OH
HO
O
OH
CH OH2
gal
SO
OO
SO
OO
X
X
Abbildung 41: Mechanismus der Bildung von Furfurylalkohol aus Lactose und deren Inhibition
durch Sulfit.
Furfurylalkohol besitzt ein gummiartiges Aroma, so dass seine Anwesenheit in hohen
Konzentrationen in thermisch behandelten Lebensmitteln deren Eigenschaften negativ
beeinflusst. Eine Inhibition der Bildung von Furfurylalkohol wirkt sich deshalb positiv auf die
Qualität erhitzter Lebensmittel aus.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der Zusatz von Natriummetabisulfit die Bildung des
flüchtigen Furfurylakohol in einer erhitzten Lactose-Lysin–Mischung verringert und bei
hohen Konzentrationen (>20mM) vollständig verhindert.
96
Experimenteller Teil 8. Experimenteller Teil
8.1. Chemikalien, Lösungsmittel und Verbrauchsmaterial 8.1.1. Chemikalien Alle verwendeten Chemikalien wurden, wenn nicht anders vermerkt, in der höchsten
Reinheit, also p.a., verwendet.
D(+)-Lactose-Monohydrat, Milchpulver, Natriumdihydrogenphosphatdihydrat, Dinatrium-
e, o-Phenylendiamin, Aminoguanidin-Bicarbonat, N-α-
occus aureus Stin
cotinsäure,
corbinsäure, Kaliumchlorid, Natriummetabisulfit, wasserfreies Natriumsulfat,
Spritzenaufsatzfilter
hydrogenphosphatdihydrat, L-Lysin, CBZ-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Cystein, L-Tryptophan,
N-α-Acetyllysin, Acetylsalicylsäur
Acetylcystein, α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, α-Lactalbumin, β-Lactoglobulin, Tween 20,
Bovin Serium Albumin und β-Casein, Endoprotease Glu-C von Staphyloc
V8, wurden von Sigma gekauft.
Pyridoxin-Hydrochlorid, Pyridoxal, Thiamin-Hydrochlorid, Mercaptoethanol, Ni
DL-Prolin, L-Histidin, Natriumcitrat, Kreatin, Zimtsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure,
Carnosin, Kaliumsorbat, Di-natriumhydrogen-phosphatdihydrat, Natriumcarbonat,
Natriumhydrogencarbonat und 1-Deoxy-1-morpholino-D-fructose wurden von Fluka gekauft.
Semicarbazid, Gluthation, Arginin, Liponsäure wurden bei Acros gekauft.
Taurin, L(+)-As
Natriumsulfit, Calciumchlorid, Kupferchlorid, Eisenchlorid, Ethylendiamin N, N, N, N`-
Tetraessigsäure, Kaliumdihydrogenphosphate wurden bei Serva, Roth, Merk, oder bei Riedel-
de Haen gekauft.
8.1.2. Lösungsmittel
Alle HPLC-Fließmittel wurden in der Reinheit ,,HPLC-Grad’’ bei Fisher Scientific gekauft;
die deuterierten Lösungsmittel wurden bei der Deutero GmbH, Furfurylalkohol bei Fluka
gekauft.
8.1.3. Verbrauchsmaterialien Dialyseschläuche
Sigma-Aldrich Cellulose Dialyseschlauch MWCO >12.400; Vol:33mm* 21mm.
Kanülenspritzen (Steril)
Braun Einmalspritzen ,,Omnifix’’(1ml) ,, Injekt’’(>1ml) mit Einmalkanülen ,,Sterican’’
0,8*40mm, Luer-Lock-Anschluss
97
Exerimenteller Teil
Rotilabo- Spritzenfilter (Roth) 13mm, 0,22 µl PVDF
Reaktionsgefäße
Die folgenden Gefäße sind je nach Größenbedarf und Temperatur zum Einsatz gekommen:
Unter 100°C:
Bis 2ml: Eppendorf Sae-Lock Reaktionsgefäße (0, 5-1,5- 2,0 ml)
Bis 15ml: Greiner bio-one PP-Röhrchen 17*120mm, mit Schraubverschluss
Bis 50ml: Greiner bio-one PP-Röhrchen 30*115mm, mit Schraubverschluss
Über 100°C:
Schott-Duran Laborfläschen mit Schraubdeckel (25ml)
Mikrotiterplatten
Nuc Maxisorb 96-Kavitäten Mikrotiterplatten
8.1.4. Puffer und Lösungen Wenn nicht anders beschrieben, wurde für die Herstellung doppelt destilliertes Wasser
verwendet.
Phosphatpuffer
0,1M PBS-Puffer pH 6.8
0.40 g/l Kaliumchlorid
14.4 g/l Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat
2.80 g/l Kaliumdihydrogenphosphatdihydrat
8.60 g/l Natriumchlorid
0.20 g/l Natriumazid ,1M PBS-Puffer pH 7.8
iumdihydrogenphosphatdihydrat
LISA
3%ige Magermilchpulverlösung
0
16.6 g/l Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat
1.0 g/l Kal
E
Belegungspuffer
0.05 M Carbonatpuffer, pH 9.7
1.59 g/l Natriumcarbonat.
2.93 g/l Natriumhydrogencarbonat
0.20 g/l Natriumchlorid.
Blockier-Puffer
98
Experimenteller Teil PBS-Puffer
75mM Phosphat, 150mM Natriumchlorid, pH 7.4
enphosphat
55H
H-Messung
asserbad
Julabo SW20
fer
11.36 g/l Kaliumhydrogenphosphat
12.20 g/l Dikaliumhydrog
8.60 g/l Natriumchlorid
Verdünnungspuffer
0.05 % Tween 20 und BSA in PBS lösen
TMB-Arbeitslösung
340 µl TMB-Stammlösung und 120 µl 3%-ige Wasserstoffperoxidlösung zu 20 ml
Substratpuffer
8.2. Geräte- und Analysensysteme Analysenwaage
Mettler Toledo AG285
Mettler Toledo AG204
Zentrifuge
Hettich Universal 16R; National Labnet Co.
Ultraschallbad
Bandelin Sonorex Super RK 2
p
Metrohm pH-Meter 654
Schüttelw
Rotationsverdamp
Heidolph VV1,Waterbath,Vacuum-Controller B172, Büchi
Gefriertrocknung
Savant valupump VLP 20, Savant Digital Vacuum Gauge DVG 50, Savant Vacuum Pump
Filter/Recirculator
99
Exerimenteller Teil
Autoklav
Systec V-65
Trockenschrank
r
ystem
ikrotiterplatten-Lesegerät
latten-Schüttler
4
-Spektrometer, Anregungsfrequenz 600 MHZ (1H-NMR und 13C-
Spektrometer, Anregungsfrequenz 600 MHZ (1H-NMR) bzw. 600
lsilan (TMS; δ=0,000 ppm) für Lösungen in
nd Aceton (Aceton; δ=2.17 ppm) für Lösungen in D2O.
atographie(HPLC)
e doppelt destilliert; HPLC-Grade Lösungsmittel wurden ohne
Lösungsmittel wurden zum Teil vorher zusätzlich im
e angegebenen Gradient-Mischungsverhältnisse beziehen sich auf
olumenprozent (V/V).
Vakuum T ockenschrank VTS 70, Ehret
UV-Spektroskopie
Perkin Elmer Lambda 2
HPLC-DAD-S
ELISA
Mikrotiterplatten-Wäscher
Columbus STL Microplate washer
M
Bio-Rad Model 550
Mikrotiterp
Ika Schüttler MTS
Massenspektroskopie
JEOL, JMS-GC MAT II
1H- und 13C-NMR-Spektroskopie
Bruker Advancer FT-NMR
NMR).
Bruker AM 360 FT-NMR-
MHZ (13C-NMR).
Als Standard wurden verwendet: Tetramethy
CDCl3 u
Hochleistungsflüssigkeitschrom
Entionisiertes Wasser wurd
weitere Aufreinigung verwendet. Die
Ultraschallbad entgast. Di
V
HPLC-DAD
100
Experimenteller Teil Analytische HPLC
LC-Pump
0 3-Line Degasser
Ternery Gradient Unit
AS-1555 Intelligent Samler
etektor : Jasco MD-1510 Multiwavelength Detector (DAD)
it analytischer Photozelle.
äule : LC-18 DB(RP-18.250*4.6mm i.D., Partikelgröße 5µm), Supelco
C-18 DB(RP-30*4.6mm, i.D. Partikelgröße 5µm, Supelco
: Jasco DG-980-50 3-Line Degasser
sco LG-980-02S Ternery Gradient Unit
sco AS-1555 Intelligent Sampler
jektionssystem : Rheodyne 7735i
: Jasco MD-1510 Multiwavelength Detector (DAD)
lle.
e : 200nm - 650nm
P-250mm*21.2mm i.D., Partikelgröße
5 µm, Supelco
-18 DB (RP-30*21.2mm i.D., Partikelgröße
5 µm, Supelco
Jasco-Borwin 1.50
PLC-(Gradienten-)System
: 20 µl
: A: Acetonitril B: Wasser
radient linear : (t/A%)(0/0)(140/50)(145/0)(150/0)
Pumpe : Jasco PU-1580 Intelligent HP
Degasser : Jasco DG-980-5
Gradientenmischer : Jasco LG-980-02S
Autosampler : Jasco
D
m
Messwellenlänge : 200nm-650nm
S
Vorsäule : L
Software : Jasco-Borwin 1.50
Präparative HPLC
umpe : Jasco PU-1580 Intelligent HPLC-Pump P
Degasser
Gradientenmischer : Ja
Autosampler : Ja
In
Detektor
mit präparative Photo-Ze
Messwellenläng
Säule : LC-18 DB (R
Vorsäule : LC
Software :
H
Gradientensystem 1 (Analytische Säule)
Injektionsvolumen
Flussrate : 0,6 ml/min
Lösungsmittel
G
101
Exerimenteller Teil
Gradientensystem 2 ( präparative Säule)
jektionsvolumen : 1 mL
: 6 ml/min
asser
: (t/A%)(0/0)(40/50)(45/0)(50/0)
t
-HPLC-System Agilent (Palo Aloto, USA) mit Entgaser, binärer Pumpe, Säulenofen
er PE200 Autosampler (Boston, USA) und eine API2000
SA) Biosysteme wurden benutzt.
en Bedingungen statt:
LC-8 (Zorbax Eclipse.150*4,6mm i.D., Partikelgröße, 5µm),Supelco
in
20 µl
M, pH= 4,5)
: Acetonitril
5) (30/50) (33/10) (38/10) (45/95) (50/95)
-TOF-MS
er Biflex lll MALDI-TOF-MS (Bruker Daltonik) und Bruker Auotoflex
m Reflektor ausgestattet. Die
essungen der freigesetzten positiven Ionen erfolgten nach ,,delayed extraction“ und
e externe Kalibrierung erfolgte mittels
Standard-Matrix-Lösung wurde auf den Stahlträger getropft, bei
aumtemperatur an der Luft getrocknet und vermessen. Die Auswertung wurde mit Hilfe der
re X-Toff vorgenommen.
In
Flussrate
Lösungsmittel : A: Acetonitril B: W
Gradient linear
HPLC-MS-MS Gerä
Ein 1100
und DAD, einem Prekin-Elm
electrospray-MS/MS (Pflegestadt, U
Die Messung fand unter folgend
Säule :
Flussrate : 0.3ml/m
Injektionsvolumen :
Lösungsmittel:
A: Ammoniumformiat (5m
B
Gradient linear : (t /A %): (0/9
MALDI
Es wurden zwei verschiedene Geräte benutzt (es wurde jeweils vermerkt, welches zum
Einsatz kam): Bruk
MALDI-TOF-MS (Bruker Daltonik).
Beide Geräte sind mit einem Stickstofflaser (λ=337 nm) und eine
M
Beschleunigung durch 19 kV im Reflektor-Modus. Di
eines Peptid-Mixes. Dazu wurden 0.5 µl Angiotensin ll, 1 µl Bombesin und 2 µl ACTH-
Fragment 18-39 (jeweils Lösungen der Konzentration 100 pmol/µl mit einer Lösung von
gesättigter α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure in Wasser-Acetonitril mit 0.1% TFA im Verhältnis
1:1gemischt. 1µl dieser
R
Bruker-Softwa
102
Experimenteller Teil 8.3. Inhibition Der Maillard-Reaktion in Lactose-Lysin-Mischung
ib ti n
r (PH= 6.8) gelöst.
dieser Lösung eingefüllt, wobei
ür 30 Minuten bei 120 °C erhitzt und
-VIS
t geeigneten
agen. Der pH-Wert der Lösungen wird gemessen.
.3.2. Inhibitoren, die im Modellsystem verwendet wurden
lsäure 29-Kupferchlorid (II)
8.3.1. Inh i o der Bräunung Lösung von Lactose 0.1 M und Lysin 0.02 M wird in PBS Puffe
In fünf Reagenzgläsern werden jeweils10 ml
unterschiedlicher Mengen des Inhibitors (0, 5, 10, 20, 50 mM) versetzt.
Die Reagenzgläser werden gut geschüttelt und f
anschließend im Eisbad abgekühlt.
Die Absorptionen der Lösungen werden bei 420 nm im Bereich 0,1-1,0 mit einem UV
Spektrophotome er gemessen; die Werte werden unter Berücksichtigung des
Verdünnungsfaktors in ein Diagramm übertr
8
1-Taurin 8-Glutathion 15-Semikarbazid
22-Acetylsalicy
2- Arginin Py doxin 16-Aminoguanidin 23- Gl9- ri utaminsäure 30-Natriummetabisulfit
3-Histidin 0- eatin 17-Pyridoxamin 24-Asp1 Kr araginsäure 31-Eisenchlorid (III)
4-Thiamin
11-C rnosin 18-Nicotia nsäure 25-Ascorbinsäure 32- o-Phenylendiamin
5-Cystein 12-Tryp ylcystein 33-Natriumbenzoat tophan 19-Kojiesäure 26-N-Acet
6-EDTA 13-Zimtsäure 20-Liponsäure 27-Natriumcitrat 34-Mercaptoethanol
7-Prolin 14-Natriumsulfit 21-Natriumbisulfit 28-Kaliumsorbat
8.3.3. Inhibition dung
ynthese von AGE-Lactose-Lysin
se und 0.02M Lysin) in PBS Puffer 0.5 mM (pH =6.8) werden
Reagenzgläser gegeben; dazu werden verschiedene Konzentrationen von verschiedenen
zugegeben. Die Lösungen werden im Autoklav bei
itzt. Nach den Autoklavieren werden die Lösungen schnell im
erdünnungslösungen (1:100) vorbereitet und ihr CML-
der CML-Bil
S 10 ml der Lösung (0.1M Lacto
in
Inhibitoren (5-10-20-50 mM) als Pulver
120 °C für 30 Minuten erh
Eisbad gekühlt. Hiervon werden V
Inhalt mittels ELISA bestimmt.
103
Exerimenteller Teil
Durchführung des polyklonalen CML-ELISA-Tests
dener Parameter wurde der CML-ELISA-Test nach folgendem
eweils 100µl einer Lösung von 0.25 µg/ml CML-HAS in Coating-Puffer wurden in die
ner 96-well Mikrotiterplatte gefüllt und in dieser über Nacht im
ühlschrank bei 4 °C inkubiert.
5% Tween-20 in PBS
milchpulver in Wasser in die Wells
zweimaligem Waschen der Platten mit der Waschlösung aus 0.05% Tween-20
tikörper-Reaktion die zu untersuchenden Proben mit
g auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt. Bei der Antiserumlösung
m ntiserums im
erdünnungspuffer (0.2% BSA und 0.05 Tween-20 in PBS). 100 µl dieser Lösungen (50µl
50µl der verdünnten Proben mit 50µl polyklonalen CML-Antiserum)
l 3%iger Wasserstoffperoxidlösung in 20 ml
Nach Optimierung verschie
Schema durchgeführt:
Coating (Belegen der Platten) J
Vertiefungen (wells) ei
K
Blocking (Blockierung der unbesetzten Bindungsstellen) Nach zweimaligem Waschen der Platten mit einer Lösung von 0.0
wurden jeweils 150µl einer Lösung von 3% Mager
pipettiert und die Platte 2 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert.
Antikörperreaktion Nach erneutem
in PBS wurden für die kompetitive An
Antiserumlösun
handelt es sich u eine 1: 25 000-Verdünnung des polyklonalen CML-A
V
CML-Standard oder
wurden in die Wells pipettiert und die Platten 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt.
Labeling (Markierungsreaktion)
Nach zweimaligem Waschen der Platten mit 0.05% Tween-20 in PBS wurde in jedes Well
100 µl einer Lösung eines mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Anti-rabbit-IgG-
Antikörpers aus der Ziege (1: 10 000, verdünnt mit 0.1 BSA in PBS) gegeben und für 45
Minuten inkubiert.
Farbreaktion Nach dreimaligem Waschen mit 0.05 Tween-20 in PBS wurde durch Zugabe von 75 µl einer
Mischung von Tetramethylbenziden (TMB)-Lösung und Wasserstoffperoxid im
Substratpuffer (0.34 ml TMB-Lösung mit 0.12 m
104
Experimenteller Teil Substratpuffer) die Farbreaktion gestartet. Zum Stoppen wurden nach 15 Minuten 25 µl 2N-
i 450 nm im Microtiterplatten-Reader vermessen.
illard-Produkten
Jeweils 5ml der Lösung wurden in eine 25ml Glasflasche gefüllt und unterschiedliche
ben.
ie Lösung wurde für 30 Minuten bei 120°C erhitzt anschließend im Eisbad abgekühlt und
danach im Dialyseschlauch (>12.4 kDa) gegen bidestilliertes Wasser für zwei Tage
d Die wurde und i ank b r
Verwendung gelagert.
Durchführung des kompetitiven ELISA Tests
1m er) der gefriergetrockneten Proben (m
wurden vorbereitet. Der CML-Gehalt der Proben wurde millels kompet ie
unter Ab. 7.3.2 beschrieben, durchgeführt.
CML-β-Casein-Bestimmung mittels nicht-kompetitivem ELISA
1.0 mg der dialysierten und gefriergetrockneten AGE-β-Casein Proben in Abwesenheit
Schwefelsäure zugeben und die Platten be
8.4. Inhibition der Maillard-Reaktion in β-Casein-Lactose-Mischung 8.4.1. CML-Bestimmunug der β-Casein-Lactose Mamittels kompetitivem ELISA
Synthese von AGE-β-Casein
0.1M Lactose und 25mg β-Casein wurden in 25ml PBS Buffer (0,5M, pH=6.8) gelöst.
Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 50 mM) von verschiedenen Inhibitoren zugege
D
ialysiert. Lösung lyophilisiert m Gefrierschr ei -20 °C bis zu
g/ml Lösung (in Wass it oder ohne Inhibitor-zusatz)
ivem ELISA, w
8.4.2.
Synthese von AGE-β-Casein
Es wurde AGE-β-Casein, ähnlich wie unter 7.4.1 beschrieben, synthetisiert.
Je
oder in Anwesenheit von Natriummetabisulfit wurden in 1 ml bi-destilliertem Wasser gelöst.
Die Proben wurden verdünnt, um sie für die ELISA-Messung tauglich zu machen.
105
Exerimenteller Teil
Durchführung des nicht -kompetitiven ELISA Tests149
eweils 100µl einer Lösung von verschiedenen Konzentrationen (0- 500 µg/ml) β-Casein -
tandardkurve) und 100 µg/ml (für die Proben) wurden in die
ten Bindungsstellen
(0.34 ml TMB-Lösung mit 0.12 ml 3%iger Wasserstoffperoxidlösung in 20 ml
Belegen der Platten
J
AGE in Coating-Puffer (für die S
Vertiefungen (Wells) einer 96-Well Mikrotiterplatte gegeben und über Nacht im Kühlschrank
bei 4 °C inkubiert.
Blockierung der unbesetz
Nach zweimaligem Waschen der Platten mit einer Lösung von 0.05% Tween-20 in PBS
wurden jeweils 150µl einer Lösung von 3% Magermilchpulver in Wasser in die Wells
pipettiert und die Platte 2 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert.
Antikörperreaktion
Nach erneutem zweimaligem Waschen der Platten mit der Waschlösung aus 0.05% Tween-20
in PBS wurden 100µl von 1:10 000 verdünntem Antiserum in die Wells pipettiert und die
Platten 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt.
Bei der Antiserumverdünnung handelt es sich um eine Verdünnung des polyklonalen CML-
Antiserums im Verdünnungspuffer (0.2%BSA und 0.05 Tween-20 in PBS).
Markierungsreaktion
Nach zweimaligem Waschen der Platten mit 0.05% Tween-20 in PBS wurde in jedes Well
100 µl einer Lösung eines mit Meerrettichperoxidase konjugierten Anti-rabbit-IgG-
Antikörpers der Ziege (1: 10 000), verdünnt mit 0.1 BSA in PBS), gegeben und für 45
Minuten inkubiert.
Farbreaktion
Nach dreimaligem Waschen mit 0.05 Tween-20 in PBS wurde durch Zugabe von 75 µl einer
Mischung von Tetramethylbenziden (TMB)-Lösung und Wasserstoffperoxid in Substratpuffer
106
Experimenteller Teil Substratpuffer) die Farbreaktion gestartet. Zum Stoppen wurden nach 15 Minuten 25 µl 2N
Schwefelsäure zugegeben und die Platten bei 450 nm im Microtiterplatten-Reader vermessen.
8.4.3. Imidazolonbestimmung mittels ELISA
etrockneten AGE- β-Casein wurde in bi-destilliertem
en für die ELISA-Messung verdünnt.
150
sung von 0.75 µg/ml Imadazolon -HSA in Coating-Puffer wurde in die
latte gefüllt und in dieser über Nacht im
ühlschrank bei 4 °C inkubiert.
ells
en bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert.
Proben mit
ntiserumlösung auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt. Bei der Antiserumlösung
andelt es sich um eine 1: 2000 Verdünnung des monoklonalen Imidazolon-Antiserums im
erdünnungspuffer (0.2% BSA und 0.05 Tween-20 in PBS). 50 µl dieser Lösungen wurden
in den Wells pipettiert und die Platten 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt.
Synthese von AGE-β-Casein
Es wurde AGE-β-Casein, ähnlich wie unter 7.7 beschrieben, hergestellt.
1mg der dialysierten und gefrierg
Wasser gelöst. Die Proben wurd
Durchführen des monoklonalen kompetitiven Imidazolon – ELISA
Nach Optimierung verschiedener Parameter wurde der Imadazolon-ELISA Test nach
folgendem Schema durchgeführt:
Belegen der Platten
Jeweils 100 µl einer Lö
Vertiefungen (Wells) einer 96-Well Mikrotiterp
K
Blockierung der unbesetzten Bindungsstellen
Nach zweimaligem Waschen der Platten mit einer Lösung von 0.05% Tween-20 in PBS
wurden jeweils 200µl einer Lösung von 3% Magermilchpulver in Wasser in die W
pipettiert und die Platte 2 Stund
Antikörperreaktion
Nach erneutem zweimaligemWaschen der Platten mit der Waschlösung aus 0.05% Tween-20
in PBS wurden für die kompetitive Antikörper-Reaktion die zu untersuchenden
A
h
V
107
Exerimenteller Teil
Markierungsreaktion
Nach zweimaligem Waschen der Platten mit 0.05% Tween-20 in PBS wurde in jedes Well
Waschen mit 0.05 Tween-20 in PBS wurde durch Zugabe von 75 µl einer
meta-bisulfit (5,
0, 20, 50mM) gelöst und für 30 Minuten bei 120°C erhitzt. Nach Abkühlung der Proben
en bidestilliertes Wasser dialysiert, dann gefriergetrocknet.
nzentrationen von Natriummetabisulfit 0, 5, 10, 20, 50mM) wurden in 1
l (nach einer Dialyse gefolgt von einer Gefriertrocknung) in 1 ml (25 mM) Carbonatpuffer
ser Lösung wurden mit 0,3µl Glu-C (1mg/ml), dies entspricht einen Verhältnis
on Enzym:Protein von 3:100 bei 25°C für 15 Stunden inkubiert. Glu-C in Carbonatpuffer
100 µl einer Lösung eines mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Mous-IgG-
Antikörper der Ziege (1: 5000, verdünnt mit 0.1% BSA in PBS) gegeben und für 60 Minuten
inkubiert.
Farbreaktion
Nach dreimaligem
Mischung von Tetramethylbenzid (TMB)-Lösung und Wasserstoffperoxid im Substratpuffer
(0.345 ml TMB-Lösung mit 0.114 ml 3% iger Wasserstoffperoxidlösung in 20 ml
Substratpuffer) die Farbreaktion gestartet. Zum Stoppen der Reaktion wurden nach 30
µl 2N Schwefelsäure zugegeben und die Platten bei 450 nm im Microtiterplatten-Minuten 25
Reader vermessen.
8.4.4. MALDI-TOF-Messung
Probenvorbereitung β-Casein und wasserfrei Lactose (1mg/ml Casein und 0,1M Lactose) wurde in PBS Puffer
(0,1M-pH=6,8) ohne bzw. mit verschiedenen Konzentrationen von Natrium
1
wurde für zwei Tage geg
Partielle enzymatische Hydrolyse der glykierten β-Casein-Proben mit Glu-C Es wurde 1 mg des nativen β-Casein oder des gefriergetrockneten AGE- β-Casein (ohne bzw.
mit verschiedene Ko
m
gelöst, 10µl die
v
spaltet die Peptidbindungen der C-Termenal zur Glutaminsäure.
108
Experimenteller Teil MALDI –TOF-MS- Analytik von AGE- β-Casein Zu jeweils 10µl der hydrolysierter Lösungen wurde 1 µl einer Lösung 1,4-Dithio-DL-Threitol
Lösung (0,1M DTT) gegeben und 15 Minuten stellen gelassen.
ür die MALDI-TOF-MS-Analyse wurden 1 µl der jeweiligen Proben (0,885µg/µl) in10µl
von α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (Peptidauswahl) oder
nitril verdünnt.
.4.5. Synthese von AGE- α-Lactalbumin oder β-Lactoglobulin
in oder β-Lactoglobulin mit 50mM Lactose Monohydrat in
ml PBS Puffer (0.1M, pH=6.5) gelöst. Jede der beiden Lösungen (α-Lactalbuminlösung oder
) wurden in zwei Röhrchen geteilt; das erste Röhrchen blieb ohne
hibitor-Zusatz, in das zweite Röhrchen wurden 50 mM Natriummetabisulfit gegeben. α-
SDS-PAGE
rden mit folgenden Lösungen hergestellt:
2,45 ml Acrylamid (30% )
Lösung (in Wasser)
2 µl TEMED-Lösung
F
einer gesättigten Lösung
Sinapinsäure (Proteinauswahl) in 0,5% Trifluoressigsäure mit 50%-Aceto
Je 1 µl von dieser Probenmischung wurde auf ein Ziel des rostfreien Stahls gefleckt, an der
Luft getrocknet und mit einer MALDI-TOF-MS Anlage vermessen.
8
Es wurden 20mg von α-Lactalbum
2
β-Lactoglobulinlösung
In
Lactalbuminlösung wurde für zwei Stunden bei 25 °C inkubiert. β-Lactoglobulinlösungen
wurden 3 Stunden bei jeweils 50 und 70 °C inkubiert.
8.4.6. Das Trenngel (15%) und das Sammelgel (5%) we
Das Trenngel 1,15 ml deionisiertes Wasser
+ 1,3 ml 1,5mol/l Tris/HCl, pH 8,8
+
+ 50 µl 10% ige SDS-
+
(Vorsicht! Die APS-Lösung generell erst vor dem Gießen des Gels zur Lösung geben!)
+ 50 µl 10% ige APS-Lösung (in Wasser).
zügig zwischen zwei Glasplatten wurde vorsichtig gefüllt, damit sich kein Schaum gebildet
wurde. Das Gel wurde mit Spiritus überschichtet; nach einer Wartezeit von 10 Minuten wurde
das Gel auspolymerisiert. Danach wurde der Spiritus abgekippt und das Glas mit dem Tuch
nachgewischt.
109
Exerimenteller Teil
Das Sammelgel Die Sammelgellösung aus den folgenden Bestandteilen wurde auf die Trenngeloberfläche
rylamid/Bis-Lösung (s.o.)
50µl 10%ige SDS-Lösung
Lösung
50µl 10%ige APS-Lösung
r gewaschen und mittels Filterpapier getrocknet.
Elektrodenpuffer (10fach konzentriert):
)
5,0 g SDS (1%)
l bleibt in
nd das Gerätesystem wird mit Elektrodenpuffer aufgefüllt.
robenpuffer
0, 20, 50 mM) unterschiedlich lang bei verschiedenen Temperaturen erhitzt.
aufgetragen:
2,1ml deionisiertes Wasser
+ 3,8ml 0,5M Tris/HCl, pH 6,8
+ 0,5ml Ac
+
+ 3µl TEMED-
+
Hierbei ist zu beachten, dass die APS-Lösung generell kurz vorher dem Gießen des Gels zur
Lösung gegeben wird.
Das Gel wurde in die Glaskassette eingefüllt und nach dem Kamm darin fixiert wurde,
auspolymerisiert. Zum Glätten der Geloberfläche wurden die Glassplatten sofort mit
deionisiertem Wasse
15,14 g Glycin (2M)
+ 75,07 g Tris (250 mM
+
Die Elektrodenpuffer werden mit deionisiertem Wasser auf 0,5 l Gesamtvolumen aufgefüllt.
Für ein Gel werden im Versuch 450 ml einfach konzentrierte Elektrodenpuffer benötigt. Die
Probentaschen werden mit deionisiertem Wasser gespült und auf der Glasoberfläche mit
einem wasserfesten Stift einzeln markiert. Die Glaskassette mit polymerisiertem Ge
der Vorrichtung fixiert u
PFür 10 ml Probenpuffer wurden folgende Komponenten benötigt: 2,5 ml 0,5 M Tris/HCl-
Puffer, 2 ml Glycerin100%, 0,1 g Bromphenolblau, 0,4 SDS und 0,31 g (0,2M) DTT
(Dithiothreiol).
Probenvorbereitung für SDS-PAGE Lösungen [1 mg/ml β-Casein und (0,1 M) Lactose oder Ribose wurden in PBS- Puffer (0,1M-
pH=6,8)] unter Beigabe unterschiedlicher Konzentrationen von Natriummetabi-sulfit (0, 5,
1
110
Experimenteller Teil Um die Proben zu denaturieren wurden jeweils 100 µl der Proben mit 100 µl
hne Inhibitorzusatz-
ixierung / Färbung / Entfärbung inken oberen
cke in seiner absolvierten Laufrichtung markiert.
ischung
8)
gelöst. 5ml der Lösung wurden in Reagenzgläser gegeben. Dazu wurden verschiedene
n unterschiedlicher Inhibitoren (0-5-10-20-50 mM) als Pulver hinzubegeben.
lav bei 120 °C für 30 Minuten erhitzt und anschließend schnell
ung d ihre
20 nm vermessen
essen.
Probendenaturierungspuffer für 10 Minuten in einem Eppendorf-Thermomixer bei 50°C
erhitzt. Bei den Proben handelt es sich um:
natives ß-Casein, erhitztes ß-Casein ohne Zuckerszusatz, erhitze -o
Lactose- ß-Casein-Mischung und in Anwesenheit von 5, 10, 20 oder 50 mM Na2S2O5
erhitzer Lactose-ß-Casein-Mischung. Jeweils 10 µl Probe pro Probentasche werden mit der
Pipettenspitze aufgetragen. Die Elektrophorese startet bei 150 V und wird nach 70-75
Minuten wieder beendet.
FDas Gel wird aus dem Glassandwich herausgelöst und durch Abtrennen der l
E
Die Färbelösung bestand aus einer Mischung von 80 ml 40%iger Methanol in Wasser, und 20
ml 10%iger Essigsäure in Wasser. Für 100 ml dieser Mischung wurde eine Spatelspitze
Coomassie Brillant Blue G 250 (etwa 0,1 %).
Je nach Farbintensität wurde das Gel mit10%ige Essigsäure in Methanol für ca. 3-5 Stunden
entfärbt. Dabei wurde die Färbelösung mehrmals gewechselt.
8.5. Inhibition der Maillar-Reaktion in Lactose-Pepton-M8.5.1. Vorbereitung der Proben Eine 0.1M Lactose und 10mg/ml Pepton-Mischung wurde in PBS Buffer 0,1 mM (pH = 6,
Konzentratione
Die Proben wurden im Autok
im Eisbad gekühlt
8.5.2. Bestimmung von Maillard Produkten
Bestimmung der BräunDie Proben wurden, wie unter Ab. 7.5.1 beschrieben, vorbereitet, dann 1:5 verdünnt un
Absorption mittels Sepktrophotometer bei 4
Bildung von flureszierenden Produkten Die Proben wurden wie unter Ab. 7.5.1 beschrieben, vorbereitet, dann (1:5) verdünnt und ihre
Fluoreszenz wurde bei 440 nm (Emission) nach Anregung bei 370nm (Excitation) mit einem
Fluorimeter gem
111
Exerimenteller Teil
Bestimmung der CML-Bildung
halt der Proben wurde durch kompetitives ELISA, wie unter Ab. 7.4.1
.5.1 beschrieben, hergestellt, dann 1:10 verdünnt und
Verwendung von Nitro Blue Tetrazolium (NBT) bestimmt130.
l der Proben oder des Standards zu 2.7 ml NBT- Lösung (0.2
ält 0,574 mM NBT) gegeben.
Wasserbad inkubiert.
ie Absorption der Proben oder der Standard-Lösungen wurde bei 530 nm nach 12 und 15
Milch und Magermilch der Bräunung in der Magermilch
in 0,5 M PBS (pH 6,8) 1:10 gelöst und 25 ml dieser Lösung in kleine
Spektrophotometer gemessen. Der pH-Wert der Lösungen wird bestimmt.
1-Natriummetabisulfit
2-Natriumsulfit
3-Semcarbazid
4- Thiamin 5-N-Acetylcystein 6-EDTA
Die Proben wurden wie unter Ab. 7.5.1 beschrieben, vorbereitet, dann (1:100) verdünnt und
der CML-Ge
beschrieben, bestimmt.
Bestimmung von Lactulosylamin Die Proben wurden, wie unter Ab. 7
Lactulosylamin wurde unter
Dazu wurden 0.450 m
Carbonatpuffer, pH 10,3, enth
Die Proben oder die Standard-Lösungen von 1-Deoxy-1-p-toluidine-D-fructose (62.5-
1000µM) wurden für 10 Minuten bei 37°C im
D
Minuten gemessen, und die Differenz aus beiden Messwerten gebildet.
Nach einem Vergleich zwischen den Absorptionen der Proben mit denen des Standards wurde
die Konzentration des Lactulosylamin in den Proben berechnet.
8.6. Inhibition der Bräunung in8.6.1. Inhibition Magermilch wurde
Flaschen gefüllt. Verschiedene Inhibitorenkonzentrationen (0, 5, 10, 20, 50 mM) wurden zu
diesen Lösungen gegeben. Die Flaschen wurden geschlossen und gut geschüttelt und die
Proben im Dampfsterilisator für 30 Minuten bei 120°C erhitzt. Nach dem Sterilisieren werden
die Flaschen im Eisbad abgekühlt und ihre Inhalte wurden für 10 Minuten zentrifugiert. Die
Absorptionen der Lösungen wurden bei 420 nm im Bereich 0.1-1.0 mit dem UV-VIS
Inhibitoren, die in Magermilch verwendet wurden
7- Mercaptoethanol
8-Pyridoxamin
9-Nicotinsäure
10-Cystein
11-Acetylsalicylsäure
112
Experimenteller Teil 8.6.2. Inhibition der Bräunung in der Milch Es wurde Einfluss der Inhibitor-, und Pufferkonzentration, sowie Inhibitormischungen auf die
Minuten bei 120°C erhitzt. Nach dem Sterilisieren werden die
Flaschen im Eisbad abgekühlt.
rung eines Lactose-Lysin-
in 0.1M PBS Puffer pH= 6.8)
wurde ohne und mit verschiedenen Konzentrationen von Natriumbisulfit (0, 5, 10, 20, 50
und durch eine Membran (0.45 µm) filtriert.
in 50ml (0.1M, pH=6.8) PBS Puffer
gelöst. Die Lösung wird in geschlossenen Flaschen für 5 Stunden bei 120°C im Ofen erhitzt,
erdampfer entfernt wurde. Die
r HPLC (Acetonitril/Wasser als Lösungsmittel)
Proteinpräzipitation, die in erhitzten Milch-Inhibitor-Mischungen stattfindet, getestet. Dafür
wurden 10 ml fettarme Milch in kleine Flaschen gefüllt und darauf verschiedene
Konzentrationen von Cystein oder unterschiedlicher Inhibitormischungen dazu gegeben. Die
Proben wurden mit oder ohne Zusatz von verschiedenen Konzentrationen von PBS-Puffer im
Dampfsterilisator für 30
8.7. Isolierung und StrukturaufkläMaillard-Produktes
8.7.1. Einfluss des Inhibitorzusatzes auf Lactose-Lysin–Maillard-produkte
Eine Lactose-Lysin Mischung (0.1 M Lactose-0.02 M Lysin
mM) bei 120 °C für 5 Stunden im Ofen erhitzt.
Die braunen Lösungen wurden abgekühlt
Es wurde eine HPLC-Methode etabliert, um die Maillard-Produkte von der Lactose–Lysin
Mischung zu trennen und einen möglichen Unterschied im Produktspektrum der Mischung
mit und ohne Inhibitor nachzuweisen.
8.7.2. Isolierung des 2-Hydroxymethyl-Furans aus der Probe
18.016g Lactose Monohydrat und 1.4919g Lysin werden
dann im Eisbad gekühlt.
Die Substanz wurde mittels Diethylether (3 x 250ml; 24 h auf einem magnetischen Rührer)
aus dem Destillat extrahiert, wobei der Ether mittels Rotationv
übrige Lösung wurde mittels präparative
aufgetrennt.
113
Exerimenteller Teil
Acetonitril wurde aus der gereinigten Probe mittels Rotationverdampfer (Druck bis 80 m.bar)
mit einem Stickstoffstrom aus der Probe verdampft.
zu den NMR- und LC-MS/MS-Messungen bei 20 °C im
entfernt. Die Substanz wurde nochmals aus der wässerigen Phase extrahiert; dann mittels
Natriumsulfat wasserfrei getrocknet.
Der übrige Ether wurde
Die gereinigte Substanz wurde bis
Gefrierschrank gelagert.
8.7.3. Struktur der aus Lactose-Lysin Maillard-Produkten isolierten Substanz Name: 2-Furylmethanol; Furfurylalkohol
O
Summenformel : C5H6O2
4 1
3 2
5OH
1
3
9 (M -59); 42 (M – 56); 50 [M–(-OH) -
CH2-OH)]; 56 [(M +1) - (-CH=CH2-OH)]; 69 [(M+1)-(-CH2-OH)]; 81(M - OH); 99 (M +
1); 117 [(M+1) +H2O]; 165 [(M+1) + H O+ 2Na+]; 187 (2M+1). Die restlichen Peaks wurden
das Elutionsmittel verursacht.
Die Signale der der 13C–NMR und MS-Messungen zeigen, dass die Substanz hat einen
olekülargewicht 98 und 5 Kohlenstoffmoleküle. Die Signale 110,4 und 143,6
charakterisieren die Kohlenstoffe C2 und C3 des Furanrings, wobei 4 Kohlenstoffe durch
Molekulargewicht : 98.1 g/mol
H-NMR Spektrum in CDCl3
δ (ppm) = 2,59 (s), 4,6(s), 6,4 (d), 6,46(d), 7,38 (d). 13C-NMR in CDCl
δ (ppm)= 57,4 (C5), 107,8(C3), 110,4(C2), 142,6(C4), 154,1(C1).
EI-MS(70ev) Spektrum in Aceton
m/z (relative Intensität): 98 [M]; 81 [M-17]+; 69 [M-39]; 59 [M-42]+; 54 [M-44]+; 45 [M-
57]+. Diese Peaks entspricht bzw. die spalung von (OH, CH2OH, CH2-CH2-OH) oder den
Rest dieser Spaltung.
LC-MS/MS Spektrum
Das Spektrum der Probe zeigt mehrere Signale: m/z: 3
(-
2
M
114
Experimenteller Teil Wasserstoff mit einander verbinden. So bleibt die fünfte Kohlenstoff, die das
assenspektrum als –CH2-OH (Signal 69) verbindet ist, was von dem Signal 4,6 (Singulet)
Hydroxymethylfuran nach der Signale der 1H-NMR-Messung
der folgende Ordnung: δ(ppm) = 2,59 (s, OH), 4,6 (s, 2H, C5), 6,4 (d, J=3,39 Hz, 1H, C2),
hme wurde durch die spektroskopische Untersuchung einer authentische
efernzsubstanz bestätigen.
M
der 1H-NMR-Messung bestätiget wurde.
Alle Ergebnisse der spektroskopischen Untersuchungen deuten darauf hin, dass es sich bei
den unbekanten Lactose-Lysin-Maillard-Produkten um 2-Hydroxymethyl-furan oder
Furfurylalkohol handelt. Die kleine Veränderung der δ-Wert von C2 des Furanrings(143,6)
und selbe des 2-Hydroxymethyl-furan (142,69 durch die Bindung von –CH2-OH in der C2-
Seite des Furanrings erklärt werden könnte, die durch OH-Gruppe tief (-1) verschiebt.
So wurden die Wasserstoff von
in
6,46 (d, 1H, C3), 7,38 (d, 1H, C4). Und wurden der Kohlenstoffatomen nach der Signale der
13C–NMR-Messung in der folgenden Ordnung:
δ (ppm)= 57,4 (C5), 107,8 (C3), 110,4(C2), 142,6 (C4), 154,1 (C1).
Diese Anna
R
115
Zusammenfassung
9. Zusammenfassung der Dissertation
In der Maillard-Reaktion reagieren Carbonylgruppen von reduzierenden Zuckern mit
aillard-Reaktion
ungen, die einen positiven Einfluss auf Geruch, Geschmack, Farbe
und Haltbarkeit der Lebensmittel haben.
gefunden, dass diese Reaktionen auch unter physiologischen Bedingungen im
r entdeckt worden, dass humanes Hämoglobin
proteingebundene Amadori-Produkte enthält, deren Konzentrationen bei Diabetikern mit
erhöhten Blutglucosewerten erhöht waren. Die Bestimmung des fructosylierten Hämoglobins
ist inzwischen zur Beurteilung der diabetischen Stoffwechsellage weit verbreitet. Bald darauf
wie z. B. Albumin, Linsen-crystallin,
ollagen, Lipoproteine oder Zellmembranproteine dieser
post-ribosomalen Modifikation unterliegen, die zu Veränderung von Struktur und Funktion
des betreffenden Proteins führen kann. Später wurde erkannt, dass langlebige Proteine
werden AGE-Bildung. Da diese späten
S Reaktion bei Diabetikern schneller auftreten, wurde vermutet, dass die
Entstehung diabetischer
ismen über die Maillard-Produkte zur Entwicklung
er Änderungen der Farbe, des Aroma, und der verringerten
roteinverdaubarkeit und dem damit verbundenem Nährwertverlust.
ten Nachteile der Maillard-Reaktion wird sowohl im Bereich der
bensmittelchemischen sowie in der medizinischen Forschung nach Möglichkeiten gesucht,
beeinflusst. Weiterhin können
hemische Inhibitoren eingesetzt werden.
Proteinen, Peptiden und freien Aminosäuren. In Lebensmitteln läuft die M
besonders leicht bei erhöhter Temperatur, geringer Wasseraktivität und längerer Lagerung ab.
Dabei entstehen Verbind
Mehr als 50 Jahre nachdem Maillard die Reaktion von Aminosäuren mit Glucose beschrieben
hatte, wurde
menschlichen Körper ablaufen. Zuerst wa
wurde nachgewiesen, dass auch andere Proteine
Proteine der Gerinnungskaskade, K
altersabhängig braun, fluoreszierend und unlöslich
tadien der Mailllard-
Maillard-Reaktion zur Pathophysiologie des Alterns und zur
Spätschäden beiträgt. Die Mechan
diabetischer Spätschäden führen, sind jedoch noch nicht vollständig verstanden.
Bei der Herstellung von Lebensmitteln stört die Maillard-Reaktion bei vielen technologischen
Prozessen wegen d
P
Wegen der oben genann
le
diese Reaktionen unter Kontrolle zu bringen.
In der Lebensmitteltechnologie wird die nicht-enzymatische Bräunung bereits über
unterschiedliche Wege, wie z.B. Absenkung von Reaktionstemperatur, pH-Wert,
Wasseraktivität, Sauerstoffpartialdruck, oder der Lagerzeit,
c
In dieser Dissertation wurde der Einfluss von 31 chemischen Substanzen auf die nicht-
enzymatische Bräunung getestet. Dabei wurde festgestellt, dass die Inhibionsrate der
Bräunung einer Lactose-Lysin-Modellmischung von der Inhibitorart und –Konzentration
116
Zusammenfassung abhängig ist. 12 der getesteten Substanzen zeigten einen ausgeprägten inhibitorischen Einfluss
auf die Bräunung: Cystein, N-α-Acetylcystein, Glutathion, Semicarbazid, Nicotinsäure,
Mercaptoethanol, Natriummetabisulfit, Natriumsulfit, Thiamin, Pyridoxin, Acetylsalicylsäure
e echte
wurde durch EDTA hervorgerufen. Die
Inhibitors abhängig.
sylamin oder fluoreszierender Verbindungen in verschiedenen
Modell-Mischungen bestehend aus Lactose und Lysin, β-Casein oder Peptone, sowie in
Magermilch oder fettarmer Milch getestet.
Mit Hilfe eines kompetitiven ELISA unter Verwendung eines polyklonalen anti-CML-
Anitikörpers wurden die CML-Konzentrationen in Lactose-Pepton-Proben bestimmt, die in
Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen an verschiedenen Inhibitoren erhitzt wurden.
Die gebildeten CML-Konzentrationen waren, wie die Bräunung, von Art und Konzentration
des Inhibitors abhängig.
Die berechneten Inhibitionsraten wiesen jedoch eine andere Reihenfolge als bei der Bräunung
auf, wobei Acetylsalicylsäure, N-α-Acetylcystein und Glutathion effektiver als
Natriummetabisulfit und Semicarbazid waren. Eine Erklärung wäre, dass die Bräunung durch
den 1-Deoxyglucoson-Weg, CML im Gegensatz dazu durch den 3-Deoxyglucoson-Weg
entsteht und unterschiedliche Inhibitoren unterschiedliche Zwischenprodukten angreift.
Die Inhibitorwirkung auf die CML-Bildung in dem Lactose-Lysin Modellsystem konnte nicht
erfolgreich untersucht werden, da die getestet Inhibitoren den ELISA störten und nicht vor der
Messung abgetrennt werden konnten.
Die meisten getesteten Proteine, wie α-Lactalbumin, β-Lactoglobulin, Lysozym oder BSA
zeigten in Anwesenheit der Inhibitoren ein schlechtes Lösungsverhalten. β-Casein wurde
durch die Glykierung zu Bruchstücken < 12,5 kDa abgebaut, was durch MALDI-TOF und
SDS-PAGE nachgewiesen wurde. Es konnte dabei gezeigt werden, dass manche Inhibitoren
und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Aminoguanidin, o-Phenylendiamin, Carnosin,
Pyridoxamin, Kojiesäure, Taurin, Liponsäure, Arginin, Tryptophan, Kaliumsorbat und
Natriumbezoat, die in der Literatur als Inhibitoren der AGE-Bildung beschrieben wurden,
haben in diesen Studien die Bräunung verstärkt, während die übrigen Substanzen keinen
Einfluss hatten. Dabei konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem Effekt um ein
Inhibitionswirkung handelt und nicht auf Veränderungen des pH-Werts zurückzuführen ist.
Die größte Inhibitionsrate der Bräunung zeigten bei einem Inhibitorzuatz von 10 mM
Natrium-metabisulfit und Nα-Acetylcystein, mit einer Inhibitionsrate von mehr als 80% bzw.
54%; die kleinste Inhibitionsrate von18 %
Inhibitionsrate der Bräunung war von der Art und Konzentration des
Weiterhin wurde der Einfluss dieser Bräunungsinhibitoren auf die Bildung anderer Maillard-
Produkte wie CML, Lactulo
117
Zusammenfassung
wie Natriummetabisulfit den Abbau von glykiertem β-Casein praktisch vollständig
zurückdrängten. Gleichzeitig konnte mit diesen Versuchen gezeigt werden, dass die
ptoethanol, EDTA, Nα-Acetylcystein, Nicotinsäure,
r Amadori-
er Bildung von Amadori-Produkten zustande
z.B. nimmt die Konzentration von Lactulosylamin
Glykierung zu einem Abbau von Proteinen führt.
Der Einfluss der Bräunungsinhibitoren auf die Bildung von fluoreszierenden Maillard-
Produkten in Pepton-Lactose-Mischungen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von den
Testsubstanzen erhitzt wurden, wurde ebenfall getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass
Natriumsulfit, Pyridoxin, Thiamin, Merca
Glutathion und Acetylsalicylsäure die Bildung von fluoreszierenden Produkten nicht
verhindern können. Cystein und OPD inhibieren die Bildung von fluoreszierenden Produkten
konzentrationsabhängig, Natiummetabisulfit nur beim Einsatz in hohen Konzentrationen.
Diese Beobachtung könnte durch der Inhibitionmechanismus der Bräunung erklärt werden:
Cystein und OPD blockieren die Bräunung über Inhibition der Bildung von fluoreszierenden
Produkten. Im Gegensatz dazu reagieren Natriumsulfit, Pyridoxin, Thiamin, Mercaptoethanol,
EDTA, Nα-Acetylcystein, Nicotinsäure, Glutathion und Acetylsalicylsäure mit anderen
Zwischenprodukten der Bräunung, die nicht zu fluoreszierenden Produkten führen.
Natriummetabisulfit kann konzentrationsabhängig beide Wege eingehen.
Der Einfluss der Bräunungsinhibitoren auf die Bildung von Lactulosylamin in Pepton-
Lactose-Mischungen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit der Inhibitoren erhitzt wurden,
wurde weiterhin getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass bei Verwendung einiger Inhibitoren,
wie Natriumsulfit und Mercaptoethanol, die Lactulosylamin-konzentration bei steigender
Konzentration der Inhibitoren zunimmt.
Es wird vermutet, dass diese Inhibitoren die Maillard-Reaktion bei de
Produktbildung stoppen können. Folglich läuft die Reaktion bei erhöhter
Inhibitorkonzentration bis zur Bildung der Amadori-Produkte ab. Danach wird sie gestoppt,
wobei die Konzentration von Lactulosylamin zunimmt.
Cystein, Semicarbazid, Acetylsalicylsäure, Thiamin, und EDTA können die Lactulosylamin-
Bildung unterdrücken; demnach könnte bei diesen Substanzen der Mechanismus der
Bräunungsinhibition durch die Inhibition d
kommen.
Die übrigen verwendeten Bräunungsinhibitoren können die Lactulosylamin-Bildung bis zu
bestimmten Konzentrationen inhibieren oder verstärken, so dass die Inhibition der Bräunung
über zwei Mechanismen ablaufen könnte:
bei Erhöhung die Konzentration von Natriummetabisulfit von 0 mM bis 10 mM ab, wobei der
Mechanismus der Bräunungsinhibition durch Inhibition der Bildung von Amadori-Produkten
118
Zusammenfassung abläuft; im Gegensatz zu der bei hoher Inhibitor-konzentration bei denen, die Inhibition
anderer Zwischenprodukten stattfindet.
Die statistische Bewertung der Ergebnisse macht deutlich, dass es einen starken
Zusammenhang zwischen Bräunung, der Bildung von CML, fluoreszierender Maillard-
Produkte und Lactulosylamin auf einer Seite und der Inhibitorart sowie Inhibitorkonzentration
auf der anderen Seite gibt.
Weiterhin besteht eine positive Korrelation zwischen der Bräunung und CML-Bildung sowie
zwischen der Bildung fluoreszierender Maillard-Produkte und Lactulosylamin. Eine negative
Korrelation wurde festgestellt zwischen der Bräunung und der Bildung von
fen
inger sind die Konzentrationen der durch die Maillard-Reaktion
s wurde dann durch MS, 1H-NMR, und 13C- NMR als
Fluoreszenzprodukten und Lactulosylamin sowie zwischen der CML- und
Lactulosylaminbildung.
Eine mögliche Erklärung dafür wäre, dass bei höheren Temperaturen in erhitzten Lactose-
Pepton-Mischungen zwei unterschiedliche Reaktionmechanismen gleichzeitig ablau
können: Beim dominierenden thermischen Abbauweg von Lactose (80%) entsteht Glyoxal,
das mit dem Lysin der Peptone reagiert, um CML zu bilden. Der Rest der Lactose-
Abbauprodukte führt mit anderen Zwischenstufen der Maillard-Reaktion zur Bildung von
braunen Melanoidinen.
Ein Nebenweg (20%) ist die Maillard-Reaktion, bei der die restliche Lactose mit Peptonen
reagiert, unter Bildung von Lactulosylamin, fluoreszierenden Maillard-produken und in
geringerer Konzentration von Bräunungsprodukten und CML.
Je mehr Lactose direkt abgebaut wird, desto höher ist die Konzentration an CML und braunen
Produkten und desto ger
gebildeten Lactulosylamine oder fluoreszierenden Maillard-Produkte. So ergibt sich eine
negative Korrelation zwischen der Bräunung bzw. CML-Konzentration und der Bildung von
fluoreszierenden Maillard-Produkten.
Im letzten Teil dieser Arbeit wurde mit Hilfe der HPLC/DAD systematisch untersucht,
welche Auswirkung der Zusatz von Natriummetabisulfit auf das Produktspektrum einer
erhitzten Lactose-Lysin-Mischung hat. Nach Erhitzen bei 120 °C für 5 Stunden wurde dabei
ein Hauptprodukt gebildet. Das Produkt wurde mittels präparative HPLC isoliert und
gereinigt. Die Struktur dieses Produkt
Furfurylalkohol oder 2-Hydroxymethyl-furan identifiziert. Die 1H NMR, 13C NMR, und MS
Spektren entsprechend denen von Furfurylalkohol einer NMR–Datenbank.
Furfurylalkohol besitzt ein gummiartiges Aroma, so dass seine Anwesenheit in hohen
Konzentrationen in thermisch behandelten Lebensmitteln deren Eigenschaften negativ
119
Zusammenfassung
beeinflusst. Eine Inhibition der Bildung von Furfurylalkohol wirkt sich deshalb positiv auf die
Qualität erhitzter Lebensmittel aus.
Durch Zusatz von Natriummetabisulfit als Bräunungsinhibitor konnte die Bildung dieses
Produktes in der erhitzten Lactose-Lysin–Mischung verringert und bei hohen Konzentrationen
(>20mM) sogar vollständig verhindert werden.
120
Summery 10. Summary
During the Maillard-Reaction, reducing sugars react with proteins, peptides and free amino
acids leading to a very heterogeneous group of products. This process occurs frequently in the
course of food processing and storage, leading to the degradation of the amine compounds
and -as a consequence- to a loss of the nutritional value of proteins. At the same time
s on the food quality. In bread or broiled meat for example, the
ood glucose levels. Analysis of this fructosylated hemoglobin is now
oteins or proteins of the cell
s. It is however not yet fully clear how the Maillard-
zymatic browning
compounds are formed, which have a positive influence on flavour, taste, colour and shelf-life
of food. Furthermore, Maillard product can be toxic. At prominent example therefore is
Acrylamide, which is potentially carcinogenic for humans.
The browning of food which is caused by the Maillard reaction may have desirable and
undesirable consequence
brown colour is a quality parameter, whereas in heated milk it is considered as discoloration.
More than 50 years after Maillard's original paper describing the reaction of amino acids with
glucose; it was found that this reaction also occurs under physiological conditions in the
human body. Initially, it was discovered that human haemoglobin contains protein bound
Amadori-products of which particularly high concentrations were measured in diabetic
patients with elevated bl
widely used as an index of glycemia in diabetes. It was soon recognized thereafter that this
postribosomal modification is also formed from other proteins in vivo like albumin, lens
crystalline, proteins of the clotting cascade, collagens, lipopr
membrane. Glycation may then lead to alterations in the protein structure and function. Later
on, it was realized that long-lived proteins become brown, fluorescent AGEs, and insoluble
with age and, at an accelerated rate, in diabetes. These observations led to the hypothesis that
late stages of the Maillard-reaction contribute to some of the pathophysiology consequences
associated with both aging and diabete
products lead to the development of diabetic complications.
Because of these disadvantages of the Maillard-reactions both in food chemistry as well as the
medicine possibilities were explored to control this process. Different inhibition mechanisms
are already used in the food technology, such as the treatment of food at low temperature, pH
values, water activity, low concentrations of oxygen, and short storage periods. Furthermore
chemical inhibitors may be used.
In this dissertation, the influence of 31 chemical substances on the non-en
was tested. 12 of the tested substances showed a distinct inhibitory effect on the browning of a
lactose-lysine reaction mixture, namely cysteine, Nα-acetylcysteine, glutathione,
121
Summery
semicarbazide, niacin, mercaptoethanol, sodium metabisulfite, sodium sulfite, thiamine,
pyridoxine, aspirin and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). aminoguanidine and o-
cts, intensified the browning in the present
model system. The other test substances did not influence the browning. The observed effects
were cause by a direct chemical interaction and not by a change in the pH value.
At a concentration 10 mM, the highest inhibition rate was observed for sodium metabisulfite
and α-acetylcysteine, with an inhibition rate of more than 80% and 54%, respectively. The
lowest inhibition rate of 18% was caused by EDTA. The inhibition rate of the browning was
generally dependent on the structure and concentration of the test substance.
Furthermore, the influence of these inhibitors on the formation of other Maillard products like
CML, fluorescent products, or Lactulosylamin was tested in models consisting of lactose and
lysine, β-casein or peptone as well as in skimmed and low-fat milk.
Using a competitive ELISA with a polyclonal anti-CML-antibody, CML-concentrations were
quantititifed in lactose-peptone-reaction mixtures, which were heated in the presence of
varying concentrations of various inhibitors. The CML-concentrations were in a similar to the
as browning dependent on the structure and concentration of the test substances.
The calculated inhibition rates of browning and CML formation, however, showed
differences. The most effective inhibitors of CML formation were acetylsalicylic acid, Nα-
acetylcysteine and glutathione, followed by sodium metabisulfite and semicarbazide. A
possible explanation for this observation is that brown melanoidines are formed via 1-
deoxyglucoson; whereas CML by the 3-deoxyglucoson-pathway. Different test substances
interact with different reaction intermediates.
The inhibitory effect of the test compounds on the CML-formation in lactose-lysine or β-
casein model systems could not be successfully tested, because the inhibitors interfered with
the ELISA and could not be separated prior to analysis. Most of the tested lactose-protein-
models, such as α-lactalbumin, β-lactoglobulin, bovine serum albumin or lysozyme were not
suitable, because heating in the presence of some inhibitors resulted in protein precipitation.
β-Casein was degraded by glycation to fragments <12.5 kDa, as demonstrated by MALDI-
TOF and SDS-PAGE. It could be shown that some of the inhibitors, such as sodium
metabisulphite inhibited almost completely the fragmentation of glycated β-casein. At the
same time, these experiments demonstrate that glycation promote protein hydrolysis.
phenylendiamine (OPD), carnosine, pyridoxamine, kojic acid, taurine, liponic acid, arginine,
tryptophan, potassium sorbate and sodium benzoate which were described in the literature as
inhibitors of formation of late Maillard produ
122
Summery The influence of the inhibitors on the formation of fluorescent Maillard products was also
measured in mixtures of lactose and peptone, which were heated in the presence or absence of
ucts. Sodium sulfite, pyridoxine,
centrations (<10mM) of sodium
the lactulosylamin is highly dependent on the structure and
the test substances. The results showed that sodium sulfite, pyridoxine, thiamine,
mercaptoethanol, EDTA, Nα-acetylcysteine, niacin, acetylsalicylic acid and glutathione, can
not prevent the formation of fluorescent products. Cysteine and OPD showed a concentration
dependent inhibition on the formation of fluorescent product, whereas sodium metabisulphite
prevents the formation of fluorescent products only at high concentration.
This observation could be explained by different inhibition mechanisms. Cysteine inhibits the
browning by blocking the formation of the fluorescent prod
thiamine, mercaptoethanol, EDTA, Nα-acetylcysteine, niacin, acetylsalicylic acid and
glutathione, in contrast, interact with other intermediates of the browning, which do not lead
to fluorescent products. Sodium metabisulfite may react dependent on its concentration.
The influence of the test substances on the formation of lactulosylamin was also tested in
mixtures of lactose and peptone, which were heated in the presence or absence of the
inhibitors. The administration of some of these inhibitors, such as sodium sulfite and thiols
increased the concentration of lactulosylamine with increasing concentration of the test
substances. It is suspected that these compounds can stop the Maillard reaction after the
formation of the Amadori-product. Consequently, the reaction at elevated inhibitor
concentration interacts after the formation of the Amadori-Products, so that this intermediate
accumlates in the presence of the inhibitor.
Cysteine, semicarbazide, acetylsalicylic acid, thiamine, and EDTA can not suppress the
formation of lactulosylamin. Therefore, it can be assumed that these substances block the
browning at very early stage.
The other browning inhibitors can block the formation of lactulosylamine at certain
concentration or enhance. At other concentration on the inhibition of browning could take
place by two mechanisms: for example, thus at lower con
metabisulfite the inhibition of browning take place by blocking of Amadori-Products, in
contrast to higher concentrations in which the inhibition of the browning works by inhibition
of other browning intermediates.
The statistical evaluation of the results shows that browning; the formation of CML,
fluorescent Maillard products, and
concentration of the inhibitor. Furthermore, there is a positive correlation between the
browning and the formation of CML and between the formation of fluorescent Maillard-
products and lactulosylamine and a negative correlation between the browning and the
123
Summery
formation of fluorescence products and lactulosylamin as well as between the formation of
CML and lactulosylamin.
A possible explanation for this observation is that in the heated lactose-peptone-mixtures two
different reaction mechanisms can simultaneously take place: a dominant thermal degradation
of lactose (80%) leads to glyoxal, which reacts with lysine of the peptone to give CML. The
other lactose degradation products interact with other intermediate of the Maillard reaction
resulting in formation of brown melanoidins. A minor pathway in the model system (20%) is
rescent Maillard
he product spectrum of a
MS spectra
s (>20mM) - completely prevents the formation
the Maillard reaction, in which lactose reacts with peptone to form lactulosylamin, fluorescent
Maillard-products, and only to a smaller extent to browning and CML.
If more lactose is directly degraded, higher concentrations of CML or brown products, and
lower concentrations of the Amadori-products lactulosylamine or fluo
products are formed. This leads to negative correlations between browning or CML and the
formation of fluorescent Maillard product.
In the last part of this work, the effect of sodium metabisulfite on t
heated lactose-lysine-mixture was investigated by HPLC/DAD. After heating at 120 ° C for 5
hours, a main product was formed. The product was isolated and purified using a preparative
HPLC. The structure of this product was identified by MS, 1H and 13C NMR as
furfurylalcohol or 2-hydroxymethylfuran. The 1H NMR, 13C NMR and
corresponded to those of Furfurylalcohol from a spectra data base.
Furfurylalcohol has a rubber-like flavor, so that high concentrations of these Maillard
products have an adverse effect on the properties of heat-processed foods.
Therefore an inhibition of the formation of furfurylalcohol improves the quality of thermally
heated foods. It was found, that the addition of sodium metabisulfite to a heated lactose-lysine
mixture can reduce and -at high concentration
of furfurylalcohol.
124
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Liste der Testsubstanyen
Liste der Testsubstanzen
ame Summenformel Struktur N
noguanidin nate
CH6N4.H2CO3
1- Amibicarbo 2- DL-Arginin
C6H14N4O2
- Acetylsalicylsäure 3(Aspirin) C9H8O4
4- Cyst C H O N S ein
O
3 7 2 NH2
SHOH
5- EDT 10 12 4 2 8 2 2
2 2
2O A C H O N O Na .xH O CH2N(CH COONa)
l .xHCH2N(CH2COONa)2
6- Glut C10H17N3O6S athion
7- Mercaptoethanol C2H6O S HSCH2CH2OH
8-Natriummetabisulfit Na2S2O5
9- Natriumsulfit Na2SO3ONa
ONa OS
10- Nicotinsäure C6H5NO2
11- Pyridoxin C8H11NO3.HCl
12- Semicarbazid CH5N3O.HCl
13- Thiamin C12H17ClN4OS.HCl
14- Prolin C H NO5 9 2
136
Liste der Testsubstanzen
15- o-P 6 8 2henylendiamin C H N
16- DL-Thioctic acid (Liponsäure) C8H14O2S2
O
17- Kojisäure C H O6 6 4OHOH O
18- Histidin C6H9N3O2
19- Taurin C H NO S 2 7 3
NH2
20- Pyridoxamin C8H12N2O2· 2HCl
N
OH
CH3
OH 2HCl
21- Car 4 4 3nosin C9H1 N O
22- Try
ptophan C11H12N2O2
23- Glutaminsäure C5H9NO4 O O
NH2
O HO H
24- Asparaginsäure C4H7NO4
25- Zimtsäure C9H8O2
O
OH
26- tri-Natriumcitrat 5, 5 Hydrat C6H5O7 Na3 .5,2 H2O
27- Eisen(III) chlorid Fe Cl3 28- Kupfer (II) chlorid Cu Cl2
137
Liste der Testsubstanyen
29- Kaliumsorbat C6H7KO2
30- Natriumbenzoat C7H5NaO2
31- Kreatin C4H9N3O2.H2O
32- Nα-Acetylcystein C5H9NO3S
138
![Problematik, Klinik und Beispiele der ... · PDF fileDMAA) [1,10]. Marine Einzeller sowie essbare Algen können Arsen in Form von Arseno-zuckern [8] und Arsenolipiden [9] 1000fach](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/5a78995e7f8b9a7b698d5c0b/problematik-klinik-und-beispiele-der-110-marine-einzeller-sowie-essbare.jpg)
![& 4 Ä b«-hicomst-proceedings.helsinki.fi/papers/1981_01_25.pdf · 2016. 12. 12. · In Bergmeyer, H.U.: Methoden der enzymatischen Analyse, Band II, 1163 (1^ säPP^n] Hamm:A method](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/60a2a128d0b47b1b92080077/-4-b-hicomst-2016-12-12-in-bergmeyer-hu-methoden-der-enzymatischen.jpg)
