MATERIAŁY POMOCNICZE DO ĆWICZEŃ

Z „BIOCHEMII ZWIERZĄT”

MARIA MIKA

KRAKÓW 2010

-1-SPIS TREŚCI

1.Wstępne uwagi praktyczne................................................................................................................4 1.1. Wprowadzenie do ćwiczeń...........................................................................................................4 1.2. Zasady BHP.................................................................................................................................4

2. Węglowodany.....................................................................................................................................5 2.1. Badanie własności monosacharydów, disacharydów i polisacharydów.....................................12 2.1.1. Reakcja Molischa z - nafolem........................................................................................12 2.1.2. Reakcja Seliwanowa z rezorcyną na ketozy.....................................................................12 2.2. Wykrywanie pentoz........................................................................................................................13 2.2.1. Próba Biala z orcyną na pentozy......................................................................................13 2.3. Reakcje redukcyjne.....................................................................................................................13 2.3.1. Reakcja Trommera............................................................................................................13 2.3.2. Reakcja Fehlinga..............................................................................................................14 2.3.3. Reakcja Bendedicta...........................................................................................................14 2.3.3. Reakcja Tollensa...............................................................................................................14 2.4. Disacharydy................................................................................................................................15 2.4.1. Hydroliza kwaśna sacharozy.............................................................................................15 2.5. Polisacharydy..............................................................................................................................15 2.5.1. Reakcja skrobi z jodem.....................................................................................................16 2.5.2. Reakcja glikogenu z jodem...............................................................................................17 2.5.3. Hydroliza kwaśna skrobi...................................................................................................17 2.6. Osazony.......................................................................................................................................17 2.7. Identyfikacja cukrów..................................................................................................................19

3. Aminokwasy....................................................................................................................................20 3.1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów............................................................................21 3.1.1. Miareczkowanie glicyny metodą Sorensena.....................................................................21 3.1.2. Reakcja van Slyke’a z kwasem azotowym (III)..............................................................22 3.1.3. Reakcja ninhydrynowa.....................................................................................................23 3.1.4. Reakcja dla cysteiny.........................................................................................................23 3.1.5. Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych........................................24 3.1.6. Reakcja dla układu indolowego w tryptofanie................................................................24 3.1.7. Reakcja Sakaguchiego dla układu guanidynowego w argininie......................................25

4. Białka................................................................................................................................................26 4.1. Reakcje charakterystyczne dla białek.........................................................................................27 4.1.1. Wykazanie amfoterycznego charakteru białek.................................................................27 4.1.2. Zachowanie się białek w obecności kwasów....................................................................27 4.1.3. Zachowanie się białek w obecności zasad.......................................................................27 4.2. Białka jako koloidy.....................................................................................................................27 4.3. Denaturacja białek......................................................................................................................28 4.3.1. Denaturacja cieplna..........................................................................................................29 4.3.2. Denaturacja pod wpływem etanolu..................................................................................29 4.3.3. Denaturacja pod wpływem stężonego kwasu siarkowego...............................................29 4.3.4. Strącanie białka za pomocą kationów..............................................................................29 4.3.5. Strącanie białka za pomocą anionów...............................................................................30 4.4. Reakcje barwne białek...............................................................................................................30 4.4.4. Reakcja biuretowa............................................................................................................30 4.4.5. Reakcja Libermana...........................................................................................................31 4.5. Oczyszczanie białek metodą dializy...........................................................................................31 4.6. Kolorymetria...............................................................................................................................33 4.6.1. Ilościowe oznaczenie białka w surowicy krwi metodą Lowry’ego..................................35

-2-

5. Kwasy nukleinowe...........................................................................................................................36 5.1. Badanie własności kwasów nukleinowych.................................................................................37 5.1.1. Hydroliza kwasów nukleinowych , badanie produktów hydrolizy...................................37 5.2. Odróżnienie RNA od DNA..........................................................................................................39 5.2.1. Reakcja orcynolowa.........................................................................................................39 5.2.2. Reakcja z difenyloaminą..................................................................................................39

6. Lipidy...............................................................................................................................................40 6.1. Reakcje charakterystyczne dla lipidów prostych.......................................................................41 6.1.1. Rozpuszczalność lipidów.................................................................................................41 6.1.2. Badane składu lipidów prostych – próba akroleinowa....................................................41 6.1.3. Reakcja zmydlania...........................................................................................................42 6.1.4. Wykazane obecności w lipidach prostych nienasyconych kwasów tłuszczowych – reakcja HÜbla................................................................................................................44 6.1.5. Utlenianie wiązania podwójnego.....................................................................................44 6.2. Tłuszcze złożone – badanie składu lecytyn...............................................................................44 6.2.1. Wykrywanie glicerolu......................................................................................................45 6.2.2. Wykrywanie kwasów tłuszczowych................................................................................45 6.2.3. Wykrywanie kwasu fosforowego....................................................................................45

7. Cholesterol........................................................................................................................................46 7.1. Reakcje charakterystyczne dla cholesterolu...............................................................................46 7.1.1. Reakcja Salkowskiego......................................................................................................46 7.1.2. Reakcja Libermana-Burcharda.........................................................................................46

8. Kwasy żółciowe................................................................................................................................47 8.1. Reakcje charakterystyczne dla kwasów żółciowych.................................................................47 8.1.1. Próba Haya........................................................................................................................47 8.1.2. Emulgujące działanie żółci...............................................................................................47 8.1.3.. Próba Pettenkofera...........................................................................................................47

9. Hormony steroidowe........................................................................................................................48 9.1. Reakcje charakterystyczne dla hormonów steroidowych..........................................................50 9.1.1. Reakcja Zimmermanna.....................................................................................................50 9.1.2. Reakcja Kobera.................................................................................................................50 9.1.3. Reakcja Portera-Silbera....................................................................................................50 9.1.4. Reakcja z błękitem tetrazoliowym....................................................................................50

10. Hemoglobina...................................................................................................................................51 10.1. Wykrywanie oraz oznaczanie hemoglobin i jej pochodnych..................................................52 10.1.1. Otrzymywanie methemoglobiny....................................................................................52 10.1.2. Otrzymywanie hematyny kwasowej..............................................................................52 10.1.3. Otrzymywanie hematyny zasadowej i hemochromogenu.............................................53

11. Produkty rozpadu hemu...............................................................................................................53 11.1.Reakcje charakterystyczne dla barwników żółciowych..........................................................55 11.1.1. Próba Gmelina..............................................................................................................55 11.1.2. Próba Rosina.................................................................................................................55 11.1.3. Próba Cole’a..................................................................................................................55 11.1.4. Próba Schlesingera........................................................................................................55

12. Witaminy........................................................................................................................................56 12.1. Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w wodzie....................................60 12.1.1. Wykrywanie obecności witaminy B1 – metoda Jensena.............................................60 12.1.2. Wykrywanie obecności witaminy B2 – metoda Eulera i Adlera.................................60

-3-

12.1.3. Wykrywanie obecności witaminy B6 – metoda Greena.........................................................60 12.2. Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w tłuszczach................................60 12.2.1. Wykrywanie obecności witaminy A –metoda Carra i Price’a....................................60 12.2.2. Wykrywanie obecności witaminy D3 w tranie............................................................61 12.2.3. Wykrywanie obecności witaminy E za pomocą Fe+3..................................................61 12.3. Ilościowe oznaczanie witaminy C w liściach kapusty............................................................62 12.4. Ilościowe oznaczanie witaminy C w mleku.......................................................................... 62

13. Enzymy..........................................................................................................................................63 13.1. Kinetyka reakcji enzymatycznych.........................................................................................64 13.1.1. Badanie szybkości reakcji I- rzędu i wyznaczanie stałej K na przykładzie hydrolizy sacharozy...................................................................................................65 13.2. Enzymy reakcje barwne.........................................................................................................67 13.2.1. Wykrywanie katalazy.................................................................................................67 13.2.2. Wykrywanie peroksydazy..........................................................................................67 13.2.3. Wykrywanie oksydazy fenolowej..............................................................................68 13.2.4. Wykrywane oksydazy polifenolowej.........................................................................68 13.2.5. Rozkład mocznika pod wpływem ureazy...................................................................68 13.2.6. Hydroliza sacharozy przez inwertazę.........................................................................69 13.2.7. Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wolghemuta.....................69 13.2.8. Oznaczenie aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi zwierząt gospodarskich.............................................................................................................71

-4-

1. WSTĘPNE UWAGII PRAKTYCZNE

1.1. Wprowadzenie do ćwiczeń:

Obecności - student obowiązany jest być na wszystkich zajęciach, w wyjątkowej sytuacji może mieć 2 nieobecności podczas całego roku akademickiego – usprawiedliwione ( nie ma możliwości odrobienia ćwiczeń).

Warunki zaliczenia – warunkiem otrzymania zaliczenia jest otrzymanie pozytywnych ocen z kolokwiów obejmujących zakres materiału ćwiczeń , obecności i aktywność studenta na zajęciach. Student który nie otrzymał zaliczenia w pierwszym terminie, może otrzymać zaliczenie w terminach poprawkowych ustalonych przez prowadzącego ćwiczenia.

Uwaga !! – Na wszystkich ćwiczeniach konieczne jest posiadanie fartucha ochronnego. W przypadku jego barku student nie zostanie wpuszczony na salę ćwiczeń.

1.2. Zasady BHP:

1. Laboratorium chemiczne jest miejscem pracy w którym należy zachowywać się w sposób odpowiedzialny i poważny.2. W laboratorium znajdują się płyny żrące , łatwo palne , trujące , barwiące, dlatego należy pracować w fartuchu ochronnym.3. Na stołach laboratoryjnych znajdują się zestawy odczynników które są dokładnie opisane. Przed opuszczeniem sali trzeba sprawdzić , czy wszystkie odczynniki znajdują się na swoim miejscu.4. Korzystając z odczynników , należy pamiętać iż otwierając butelkę trzeba odłożyć korek tak ,aby nie zabrudzić stołu. Po użyciu odczynnika butelkę zamknąć korkiem i odstawić na właściwe miejsce.5. Nie wolno używać tej samej pipety szklanej lub końcówki pipety automatycznej do różnych roztworów. Nie wlewać raz pobranego roztworu ponownie do butelki.6. Należy starannie usunąć rozlane na stół lub podłogę odczynniki.7. Przy ogrzewaniu cieczy nad palnikami należy zwrócić uwagę na ustawienie probówki pod odpowiednim kątem i zachować bezpieczeństwo pracy.8. Odczynniki stężone i żrące znajdują się pod digestorium. Podczas pracy z nimi należy zachować szczególną ostrożność i zabezpieczyć się , stosując opuszczoną szybę wyciągu. Wszystkie odczynniki stanowią potencjalne zagrożenie , szczególnie dla oczu oraz błon śluzowych jamy ustnej i nosa.9. Nie wolno pipetować ustami stężonych kwasów, zasad, bromu i roztworów cyjanków. Posługujemy się w tym celu pipetami zaopatrzonymi w gruszki gumowe, pipetami automatycznymi, lub biuretami.10. Żadnej substancji nie bada się smakiem.11. W wypadku oparzenia się kwasem , należy natychmiast przemyć skórę roztworem węglanu amonu lub węglanu sodu. W wypadku poparzenia się zasadą - przemyć skórę rozcieńczonym roztworem kwasu octowego, a następnie spłukać wszystko wodą.12. W razie dostania się kwasu lub zasady do ust - natychmiast przepłukać je duża ilością wody , a następnie wymienionymi w p. 11 roztworami. W przypadku połknięcia roztworu kwasu lub zasady - wypić dużą ilość mleka lub wody z surowym białkiem jaja.13. Jeżeli jakiś płyn dostanie się do oka ,natychmiast należy przemyć go dużą ilością wody.14. Każdy wypadek np. poparzenia lub skaleczenia należy zgłosić osobie prowadzącej ćwiczenia.15. Wiele odczynników stosowanych w laboratorium biochemicznym jest truciznami , często więc należy myć ręce, a bezwzględnie przed opuszczeniem laboratorium.16. Po wykonaniu ćwiczeń laboratoryjnych i sprawdzeniu ich przez osobę prowadząca ćwiczenia zawartość probówek wylewa się do specjalnie przygotowanych pojemników ,nigdy do zlewu!17. Przed opuszczeniem laboratorium sprawdź czystość i porządek na swoim stanowisku pracy.

-5-2. WĘGLOWODANY.

Węglowodany ( cukry, sacharydy ) powstają w procesie fotosyntezy w komórkach roślin zielonych i stanowią główne źródło energii.Ze względu na wielkość cząsteczki można je podzielić na :

monosacharydy ( cukry proste i ich pochodne) oligosacharydy (2,3 lub więcej do 6 cukrów prostych połączonych wiązaniami

o-glikozydowym polisacharydy ( polimery o dużej masie cząsteczkowej zawierające dużą liczbę reszt

monosacharydów)

MONOSACHRYDY

- cukry proste o wzorze ogólnym CnH2nOn to wielowodorotlenowe aldehydy lub wielowodorotlenowe ketony . Stąd, jeśli posiadają grupę aldehydową (-CHO) nazywamy je aldozami, a jeśli grupę ketonową (-C=O) to ketozami.Natomiast w zależności od liczby atomów węgla w cząsteczce cukru prostego dzielimy je na:

Aldozy (grupa –CHO przy C1) Ketozy ( grupa –C=O przy C2) Triozy 3 - Tetrozy 4 terulozy Pentozy 5 pentulozy Heksozy 6 heksulozy

Szereg aldoz

-6-

Szereg ketoz

Cukry proste tworzą dwa szeregi konfiguracyjne D i L przy czym cukry które naturalne występują w przyrodzie głównie należą do szeregu D. Przynależność danego cukru do szeregu D lub L zależy od konfiguracji grupy OH i H przy ostatnim asymetrycznym atomie węgla tj. C4 dla pentoz i C5 dla heksoz. Węgiel asymetryczny to taki węgiel który posiada cztery różne podstawniki (w postaci atomów lub grup atomów).

-7-

Jeżeli grupa alkoholowa OH przy ostatnim węglu asymetrycznym jest po stronie prawej to taki cukier należy do szeregu D , jeśli jest po stronie lewej do szeregu L.

Formy D i L cukrów są izomerami optycznymi zwanymi enancjonomerami czyli odbiciami lustrzanymi. Tak więc izomeria D i L to izomeria lustrzana. .

Od ilości węgli asymetrycznych w cząsteczce cukrów zależy ilość jego odmian optycznych tzw. stereoizomerów. Zgodnie z regułą La Bel-Van’t Haffa przy „n” asymetrycznych węgla istnieje 2n

odmian stereoizomerów. np. 21 = 2 (triozy), 22 = 4 (terozy) itd.Obecność węgli asymetrycznych nadaje również cukrom zdolność optyczną skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego (monochromatycznego) , które przechodzi przez dany monocukier lub jego roztwór. Jeśli cukier skręca płaszczyznę światła spolaryzowanego w prawo to jest to forma (+) , gdy w lewo (-). Prawo – lub lewoskrętność danego związku zależy od asymetrii wszystkich grup alkoholowych (OH) natomiast przynależność do szeregu D lub L od asymetrii tylko jednej grupy alkoholowej, która znajduje się przy ostatnim węglu asymetrycznym tj. węglu C4 w pentozach i C5

heksozach.Oznacza to, że przynależność monosacharydu do szeregu D lub L nie pozostaje w żadnym związku z jego prawo- lub lewoskrętnością i dlatego istnieją cukry należące do szeregu D, które skręcają płaszczyzną światła spolaryzowanego w lewo np. D-fruktoza (-92,30).Cechą charakterystyczna cukrów prostych jest zdolność tworzenia form cyklicznych (pierścieniowych) w środowisku obojętnym lub słabo kwaśnym. Podczas cyklizacji powstaje nowy węgiel asymetryczny przy C1 w aldozach i C2 w ketozach , przy czym cukry mogą cyklinować w formy piranozowe lub furanozowe.

piran furan

Podczas cyklizacji powstaje wiązanie półacetalowe tj mostek tlenowy :

- w przypadku aldoz mostek tlenowy powstaje między: C1 - C5 (forma piranozowa) C2 – C4 (forma furanozowa)

- w przypadku ketoz mostek tlenowy powstaje między: C2 – C6 (forma piranozowa) C2 - C5 (forma furanozowa)

Aldehyd D- glicerynowy Aldehyd L- glicerynowy

-8-

Nowopowstały węgiel asymetryczny C1 w aldozach i C2 w ketozach nosi nazwę węgla anomerycznego, a zachodzące zjawisko anomerii. Utworzenie nowego węgla daje możliwość różnego ułożenia podstawników tj. grupy OH i H przy tym węglu, powstają więc anomery i .

Anomer - występuje gdy nowopowstała grupa OH przy węglu anomerycznym i grupa OH przy ostatnim węglu asymetrycznym jest w pozycji cis tj. po tej samej stronie cząsteczki.

Anomer - występuje gdy nowopowstała grupa OH przy węglu anomerycznym i grupa OH przy ostatnim węglu asymetrycznym jest w pozycji trans tj. po przeciwnych stronach cząsteczki

Cyklizacja monosacharydów

1. Tworzenie formy piranozowej przez glukozę:

Przy przepisywaniu wzoru Fishera na pierścień wszystkie grupy OH będące po prawej stronie we wzorze Fishera idą pod pierścień , a będące po stronie lewej nad pierścień.!!!

2. Tworzenie formy furanozowej przez fruktozę:

Wzór łańcuchowy -Fishera Wzór pierścieniowy (taflowy) Howortha

-9-

Wiele monosacharydów różni się między sobą jedynie przestrzennym ułożeniem atomów – są to izomery . Na przykład glukoza, galaktoza, mannoza maja identyczny wzór sumaryczny , ale różnią się przestrzennym ułożeniem grup OH i atomów wodoru przy jednym lub dwóch atomach węgla

Te niewielkie różnice konfiguracji mają jedynie znikomy wpływ na właściwości chemiczne tych cukrów.

Pochodne monosacharydów

1. Estry cukrów:Reszta fosforanowa -PO3

2- (w poniższych wzorach przedstawiana będzie jako P) może być

przyłączana przy C1 , C6 lub C1 i C6

2. Aminocukry : wchodzą w skład wielocukrów . W połączeniu z białkami decydują o swoistości antygenowej komórek i tkanek.

-10-

CH2O - P

-D-glukopiranozo-6-fosforan -D-glukopiranozylo-1-fosforan -D-glukopiranozylo-1,6-bisfosforan

3. Kwasy cukrowe dzielimy je na: Jednokarboksylowe :

Aldonowe – utlenienie do grupy COOH przy C1 (kwas glukonowy, manannowy,galaktanowy)

Uronowe – utlenienie końcowej grupy alkoholowej do COOH przy C6 (kwas glukuronowy, mannouronowy, galaktouronowy)

Dwukarboksylowe: aldarowe , utlenienie obu skrajnych węgli C1 i C6 do COOH ( kwas glukarowy mannarowy, galaktarowy)

OLIGOSACHRYDY

To związki których cząsteczki powstają przez połączenie od dwóch do dziesięciu reszt monosacharydów wiązania o-glikozydowymi. W grupie tej najważniejsze są disacharydy (dwucukry).

Powstanie wiązania glikozydowego pomiędzy dwoma monosacharydami.

-11-

Własności disacharydów zależą od sposobu powiązania monosacharydów. Jeżeli dwa monosacharydy wytworzą wiązanie o-glikozydowe między węglami anomerycznymi to takie disacharydy nie mają właściwości redukujących , nie tworzą osazonów ( form krystalicznych) i nie wykazują mutarotacji

(zmiana skręcalności właściwej cukrów spowodowana przechodzeniem formy w aż do ustalenia między nimi stanu równowagi) gdyż ich grupy aldehydowe lub ketonowe są zablokowane.

Disacharydem nie redukującym jest sacharoza :

Jeżeli między dwoma monosacharydami powstaje wiązanie o-glikozydowe przy udziale jednego hydroksylu półacetalowego to takie disacharydy maja właściwości redukujące , tworzą osazony i wykazują mutarotację są to np. maltoza i laktoza

POLISACHARYDY

Są polimerami o dużej masie cząsteczkowej , zawierające dużą liczbę reszt monosacharydów . Polisacharydami są takie produkty roślinne jak: celuloza, skrobia , oraz wielocukier występujący w organizmach zwierzęcych – glikogen. Ze względu na budowę chemiczną polisacharydy można podzielić na homoglikany (wielocukry jednoskładnikowe) i heteroglikany (wielocukry wieloskładnikowe).

-12-

2.1. Badanie właściwości monosacharydów, disacharydów i polisacharydów

Reakcje charakterystyczne

Cukry proste (monosacharydy) , zarówno aldozy jak i ketozy , ogrzewane ze stężonymi kwasami solnym lub siarkowym ulegają odwodnieniu do cyklicznych aldehydów , przy czym z pentoz powstaje furfural (aldehyd furylowy) natomiast z heksoz 5-hydroksymetylofurfural (aldehyd 5-hydroksymetylofurylowy) zgodnie z podanymi reakcjami:

Oprócz wolnych monosacharydów reakcję te dają także monosacharydy powstające w wyniku hydrolizy z disacharydów oraz z polisacharydów zarówno wolnych jak i występujących w połączeniu z innymi związkami. Furfural oraz 5-hydroksymetylenofurfural mogą kondensować z fenolami i aminami aromatycznymi lub ich pochodnymi takimi jak -naftol, antron i tymol oraz floroglucyna, orcyna i rezorcyna.Do celów analitycznych stosuje się następujące reakcje oparte na powyższej zasadzie:

2.1.1 Reakcja Molischa z - naftolem :Zasada: jest to najbardziej ogólna reakcja na cukry zarówno wolne jak i związane. Ujemny jej wynik wyklucza obecność cukru, dodatni zaś nie zawsze jest wystarczający do jego stwierdzenie ponieważ podobną reakcję dają np. aldehydy ,acetony .Zasada próby polega na powstaniu czerwono-fioletowego zabarwienia w wyniku kondensacji pochodnych furfuralowych z - naftolem.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór glukozy 10% etanolowy roztwór -naftolu H2SO4 – stężony

Do 1ml roztworu glukozy dodać 1-2 kropli świeżo sporządzonego 10% etanolowego roztworu - naftolu. Po dokładnym zmieszaniu , bardzo ostrożnie! po ściance probówki wprowadzić 1 ml stężonego roztworu H2SO4 tak, aby była widoczna granica między cieczami. W miejscu zetknięcia się obu cieczy powstaje czerwono-fioletowy pierścień. Pierścień zielony określa negatywną reakcję . Dla porównania przeprowadzić reakcję z wodą!

2.1.2. Reakcja Seliwanowa z rezorcyną na ketozyZasada: W reakcji tej barwny związek z rezorcyną daje hydroksymetylofurfural, powstający dużo łatwiej z ketoz niż z aldoz pod wpływem działania kwasu solnego. Próba ta pozwala więc na odróżnienie ketoz od aldoz ponieważ w obecności rozcieńczonego roztworu HCL tylko ketozy ulegają odwodnieniu w czasie ogrzewania w temp.1000C przez 30 sekundWykonanie oznaczenia :Odczynniki : roztwór fruktozy roztwór glukozy odczynnik Seliwanowa (0,05%roztwór rezorcyny w 25%HCL)

-13-

Do dwóch probówek dać 1 ml odczynnika Seliwanowa. Do pierwszej dodać 2 krople roztworu fruktozy a,do drugiej 2 krople glukozy. Po dokładnym zmieszaniu wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Wyjąć obie probówki po 30 sekundach i porównać zabarwienie. W obecności ketozy w ciągu 30

sekund powstaje czerwone zabarwienie. Roztwory aldoz krótko ogrzewane nie ulegają zabarwieniu. Zabarwienie może wystąpić po dłuższym ogrzewaniu .

2.2. Wykrywanie pentoz

2.2.1 Próba Biala z orcyną na pentozyZasada: W obecności soli żelaza (III) furfural powstający z rybozy w środowisku HCl daje z orcyną kompleks o barwie zielonej Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór pentozy (np. ksylozy, rybozy) 0,2% roztwór orcyny w 20% HCl 1% FeCl3

Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl3 i 0,5 ml roztworu pentozy. Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone zabarwienie. Dla porównanie przeprowadzić reakcję na heksozie (np. glukozie )

2.3. Reakcje redukcyjneW środowisku zasadowym formy pierścieniowe cukrów przekształcają się w formy łańcuchowe z odtworzeniem wolnych grup aldehydowych lub ketonowych. Grupy te nadają cząsteczkom cukru własności redukcyjne. Aktywna w tych warunkach forma aldehydowa lub ketonowa redukuje niektóre jony metali ciężkich Szczególnie łatwo redukują jony metali takich jak : Cu+2, Bi+2, Ag+1.Ponieważ w środowisku zasadowym wodorotlenki tych metali wytrącają się w postaci koloidalnych osadów, co nie pozwala na wykazanie redukcyjności cukrów zwykle wprowadza się związki organiczne (winian sodowo-potasowy), które z wodorotlenkami metali ciężkich tworzą rozpuszczalne kompleksy. Na wskutek dysocjacji takiego kompleksu w roztworze pojawiają się jony metali , które mogą ulec redukcji przez cukier redukujący. W reakcjach tych cukrowiec ulega utlenieniu, przy czym produktu utlenienia są rozmaite w zależności od przebiegu reakcji.

2.3.1. Reakcja TrommeraZasada: Próba ta polega na redukcji przez cukier jonu miedzi Cu+2 do Cu+1 Przebiega ona w podwyższonej temperaturze w środowisku alkalicznym. Jeżeli ogrzewamy wodorotlenek miedzi w roztworze alkalicznym to przechodzi on w czarny nierozpuszczalny tlenek miedzi (I) zgodnie z reakcją:

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4 Cu(OH)2 CuO + H2O

czarny osad W obecności cukru-związku redukującego reakcja ta przebiega odmiennie:

2Cu(OH)2 Cu2O + 2H2O + 1/2O2

osad czerwonyPowstają nierozpuszczalne kryształki tlenku miedzi (I) , które w zależności od swojej wielkości posiadają barwę od żółtej przez pomarańczową do czerwonej. Reakcja ta jest bardzo czuła i pozwala wykryć nawet ślady cukrów. Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór glukozy (lub innego monosacharydu) 1M NaOH 0,2 N CuSO4

Do 2 ml glukozy dodać 5 kropli 1M NaOH i kroplami 0,2N CuSO 4, aż do momentu pojawienia się osadu Cu(OH)2 (należy unikać nadmiaru siarczanu miedzi gdyż wytrąca się czarny tlenek miedzi (II) maskujący właściwą barwę). Po podgrzaniu we wrzącej łaźni wodnej około 5 minut wytrąca się pomarańczowo- czerwony osad Cu2O . Dla porównania reakcję wykonać na wodzie .

-14-

2.3.2 Reakcja Fehlinga

Zasada: jest to zmodyfikowana reakcja Trommera, w której zastosowano winian sodowo-potasowy (sól Seignetta) jako odczynnik zapobiegający wytrącaniu się jonów Cu+2. tworzy on z jonami Cu+2sól kompleksową. W ten sposób nadmiar nie zredukowanych jonów Cu+2 pozostaje w roztworze nie przechodząc w czarny tlenek miedzi (II) CuO. Dalszy przebieg reakcji jest identyczny jak w przypadku reakcji Trommera. Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór glukozy Fehling I (roztwór CuSO4) Fehling II (NaOH + winian sodowo-potasowy)

Do probówki wlać około 2 ml glukozy oraz 1 ml Fehlinga I i 1 ml Fehlinga II . Zawartość probówki bardzo dokładnie wymieszać, a następnie ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez około 10 minut dla uzyskania czerwono- pomarańczowego osadu tlenku miedzi (I) Cu2O. Dla porównania przeprowadzić reakcją na wodzie.

2.3.3.Reakcja BenedictaZasada: Podobnie jak w próbach Tromera i Fehlinga w tej reakcji redukcji ulegają jony Cu+2

do Cu+1 pod wpływem cukru. Odczynnikiem utrzymującym jony Cu+2 w roztworze jest cytrynian sodowy ,pełniący rolę soli Seignetta Wykonanie oznaczenia:Odczynniki:roztwór glukozy odczynnik Benedicta(CuSO4 + Na2CO3 bezw. + cytrynian sodu)

Do około 2 ml odczynnika Benedicta dodać kilka kropli glukozy, wymieszać i ogrzać na łaźni wodnej 3 – 5 minut. Po oziębieniu wytrąca się czerwono-pomarańczowy osad tlenku miedzi (I) Cu2O. Dla porównania przeprowadzić reakcję na wodzie.

2.3.4 Reakcja TollensaZasada:Redukcja soli srebra do srebra metalicznego w środowisku alkalicznym , w obecności wolnych grup aldehydowych lub ketonowych cukrów. Reakcja przebiega następująco:

AgNO3 + NH4OH AgOH + NH4NO3

AgOH + 2NH3 Ag(NH3)2OH2Ag(NH3)2OH + R-CHO 2Ag + R- COONH4 + NH3 + H2O

Wykonanie oznaczeniaOdczynniki:roztwór glukozy (lub innego cukru) roztwór azotanu srebra amoniak

Do suchej i czystej probówki wlać 0,5 ml roztworu azotanu srebra , a następnie dodawać po kilka kropli amoniaku, aż powstający osad AgOH rozpuści się w nadmiarze. Do powstałej soli kompleksowej dodać 2 ml glukozy lub innego cukry redukującego i po wymieszaniu umieścić probówkę we wrzącej łaźni wodnej . Po około 10 minutach wydzieli się na ścianach probówki metaliczne srebro w postaci lustra.

-15- 2.4. Disacharydy

Disacharydy (dwucukry) składają się z dwóch cząsteczek cukrów prostych połączonych wiązaniem o- glikozydowym. Wiązanie glikozydowe nie odznacza się dużą trwałością szczególnie w obecności jonów wodorowych. Hydrolizę wiązania glikozydowego można bardzo łatwo przeprowadzić pod wpływem kwasów, lub enzymatycznie. Enzymy katalizujące tę reakcje odznaczają się dużą specyficznością działania , zależną nie tylko od rodzaju składników ale i również od typu wiązania glikozydowego ( i ).Powszechnie występującym disacharydem jest sacharoza popularny cukier spożywczy, który otrzymuje się na skale przemysłową z trzciny cukrowej i buraków cukrowych. Disacharyd ten utworzony jest przez reszty glukozy i fruktozy połączone anomerycznymi atomami węgla.Hydrolizę sacharozy do glukozy i fruktozy katalizuje sacharaza nazywana również inwertazą.

2.4.1. Hydroliza kwaśna sacharozy Zasada: pod wpływem kwasów mineralnych sacharoza ulega rozpadowi na glukozę i fruktozę. Rozpad sacharozy zachodzi również wpływem enzymu - inwertazy. Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór sacharozy 2M H2SO4

2M NaOH

Odmierzyć 20 ml sacharozy do erlemajerki i dodać 6 ml 2M H2SO4 Roztwór w zlewce podgrzać do wrzenia i gotować przez 3 minuty. Po ostudzeniu zobojętnić 2 M NaOH , kontrolując proces zobojętnienia papierkiem lakmusowym. Na produktach hydrolizy wykonać reakcję Fehlinga. (str 14)

2.5. Polisacharydy

Polisacharydy (wielocukry) należą do związków organicznych najobficiej występujących w przyrodzie. Są one produktami polikondensacji monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi. Sumaryczny wzór wielocukrów jednoskładnikowych można wyrazić jako:Mn - [ (n-1)H2O], gdzie M oznacza dowolny monosacharyd , zaś n - liczbę jego cząsteczek. Masa cząsteczkowa polisacharydów waha się w szerokich granicach tj. od kilku tysięcy do kilku milionów. Ze względu na budowę chemiczną polisachrydy można podzielić na homoglikany (jednoskładnikowe: np. skrobia, glikogen, celuloza) i heteroglikny (wieloskładnikowe: np. chondroityna, heparyna, kwas hialuronowy).Roślinną substancja zapasową jest skrobia składająca się z amylozy i amylopektyny. Amyloza nie ma rozgałęzień i jest zbudowana z reszt glukozy połączonych wiązaniami -1,4-glikozydowymi. Amylopektyna jest rozgałęzioną formą skrobi, w której na jedno wiązanie -1,6-glikozydowe przypada około trzydzieści wiązań -1,4- glikozydowych. Połowę węglowodanów spożywanych przez ludzi stanowi skrobia. Zarówno amylopektyna jak i amyloza są hydrolizowane przez -amylazę wydzielaną przez gruczoły ślinowe i przez trzustkę.Komórki zwierzęce magazynują glukozę w postaci glikogenu. Glikogen jest rozgałęzionym polimerem o dużej masie cząsteczkowej , zbudowanym z reszt glukozy. Większość reszt glukozy jest w glikogenie połączona wiązaniami -1,4-glikozydowymi. Rozgałęzienia powstają w miejscach wiązań -1,6- glikozydowych występujących przeciętnie co dziesięć reszt glukozy. Bardzo ważnym polisacharydem roślinnym jest celuloza pełniąca funkcje strukturalne , a nie odżywcze. Jest ona nie rozgałęzionym polimerem reszt glukozy , połączonych wiązaniami -1,4-glikozydowymi. Konfiguracja pozwala celulozie na tworzenie bardzo długich , prostych łańcuchów.

-16-

2.5.1.Reakcja skrobi z jodemZasada: Cząsteczki jodu wchodzą „do kanału” utworzonego przez spiralnie skręcone łańcuchy polisacharydu i są „przytrzymywane” przez tlen przy pierwszym i czwartym atomie węgla każdej cząsteczki glukozy . Wytwarza się więc łańcuch drobin jodu , wzdłuż którego mogą przesuwać się elektrony , co powoduje pochłanianie światła przez cały kompleks. Skrobia na wskutek adsorbcji cząstek jodu barwi się na kolor niebieski.

Barwa kompleksu zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu. Amyloza daje z jodem zabarwienie niebieskie, zaś amylopektyna - fioletowe. Amyloza o konfiguracji liniowej nie jest zdolna do tworzenia kompleksu z jodem . Musi istnieć konfiguracja helisu, aby cząsteczki jodu mogły się w niej regularnie ułożyć. Jedna cząsteczka jodu przypada na 6 reszt glukozydowych czyli na jeden skręt helisu co jest przyczyną znikania zabarwienia z jodemWykonanie oznaczeniaOdczynniki:kleik skrobiowy J2 w KJ 1M NaOH 2 M HCL

Do 2 ml kleiku skrobiowego dodać kroplę roztworu J2 w KJ. Powstaje niebieskie zabarwienie. Probówkę w której powstała niebieska barwa ogrzać - niebieskie zabarwienie znika. Po ochłodzeniu pod wodą zabarwienie powraca.

-17-

Wiązanie 1,6-glikozydowe Miedzy dwiema resztami glukozy

Wiązanie 1,4-glikozydowe między dwiemaresztami glukozy

1. Wpływ zasad na zabarwienie z jodem. W środowisku zasadowym zabarwienie nie powstaje ponieważ jod reaguje z zasadą według równania:

J2 + 2NaOH NaJ +Na JO + H2O

2. W środowisku kwasowym reakcja przebiega w kierunku odwrotnym: NaJO + NaJ + 2HCL 2NaCL + J2 + H2O

Do 2 ml kleiku skrobiowego dodać kilka kropli 1M roztworu NaOH i kroplę roztworu jodu w KJ. Zabarwienie nie powstaje. Po zakwaszeniu kwasem solnym (2M HCL), barwa pojawia się.

2.5.2. Reakcja glikogenu z jodem Odczynniki: roztwór glikogenu J2 w KJ

Do roztworu glikogenu (1ml) dodać dwie krople J2 w KJ. Powstaje jasno-czerwonobrunatne zabarwienie.

2.5.3. Hydroliza kwaśna skrobi:Zasa da: skrobia pod wpływem kwasów lub enzymów ( i amylazy) ulega hydrolizie do dwucukru maltozy poprzez stadium dekstryn.

Skrobia skrobia rozpuszczalna dekstryny maltoza

W czasie hydrolizy skrobi tworzą się najpierw dekstryny o dużej cząsteczce - amylodekstryny (zabarwienie z jodem -fioletowe), które ulegają dalszemu rozkładowi na erytrodekstryny(zabarwienie z jodem- czerwone). Powstałe przy dalszej hydrolizie achrodekstryny nie dają zabarwienia z jodem. Produktem końcowym jest maltoza. Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: kleik skrobiowy 2N H2SO4

J2 w KJ

Do kolbki odmierzyć 30 ml kleiku skrobiowego dodać 12 ml 2N H2SO4, ogrzewać do wrzenia na płytce nad palnikiem. W statywie umieścić 10 probówek z dwoma kroplami J2 w KJ. Od chwili zagotowania skrobi należy zmniejszyć płomień palnika i pobierać z kolbki (która cały czas znajduje się na płytce) co 1 minutę po około 1ml gotującej skrobi i wlewać ją do kolejnych przygotowanych w statywie probówek z jodem. Po rozcieńczeniu próbek wodą (10 ml) przy prawidłowo wykonanej hydrolizie otrzyma się skalę barw od ciemnoniebieskiej poprzez fioletową, czerwoną do bezbarwnej - odpowiada to poszczególnym stadiom rozkładu skrobi.

2.6. Osazony

Monosachardy , zarówno aldozy jak i ketozy oraz disacharydy redukujące reagują z aminami np. z fenylohydrazyną. W pierwszym etapie kondensacji z fenylohydrazyną powstają fenylohydrazony, które następnie utleniają się w przypadku aldoz do ketofenylohydrazonów zaś ketozy do aldofenylohydrazonów. Powstałe związki kondensują z kolejną cząsteczką fernylohydrazyny, co prowadzi ostatecznie do wytworzenia difenylohydrazonów czyli osazonów , niezależnie od tego czy cukrowcem była aldoza czy ketoza. Na tym etapie reakcja zatrzymuje się na wskutek powstania chelatowego wiązania między atomami azotu obydwóch reszt fenylohydrazyny. Wytrąca się żółty osad o charakterystycznych kształtach. Reakcja przebiega według równania:

-18-

Na podstawie tej reakcji nie można jednak rozróżnić monosacharydów epimerycznych . Różnią się one bowiem ułożeniem podstawników tylko przy dwóch kolejnych (C-1i C-2) atomach węgla w cząsteczce, przy których zachodzi właśnie reakcja kondensacji z fenylohydrazyną. Do takich heksoz należy glukoza , fruktoza i mannoza. Proces enolizacji umożliwiający zamianę tych heksoz , zachodzi w środowisku rozcieńczonych wodorotlenków następuje etapami i jest odwracalny. Otwarcie formy pierścieniowej i przesunięcie równowagi w kierunku postaci łańcuchowej poprzez jego formę enolową, prowadzi do wytworzenia cukrów epimerycznych. Enolizacja niweluje więc różnice konfiguracji podstawników przy atomach C-1, C-2 , stąd osazony tych cukrowców mają identyczne kryształy. Żółto zabarwione kryształy osazony poszczególnych mono- i disacharydów różnią się temperaturą topnienia i kształtem kryształów co pozwala je łatwo identyfikować pod mikroskopem

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki : roztwory cukrowców mieszanina - chlorowodorek fenylohydrazyny + krystaliczny octan sodu (1:2)

Do 10 ml roztworu cukrowca dodać szczyptę mieszaniny- (chlorowodorek fenylohydrazynyi krystaliczny octanu sody ).Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 45 minut.Po upływie tego czasu mieszaninę oziębić i oglądać utworzone osazony pod mikroskopem.

-19-

Osazon glukozy, mannozy i fruktozy Osazon laktozy Osazon maltozy

2.7. Identyfikacja cukrów

Korzystając z poprzednio wykonanych reakcji można zidentyfikować nieznany cukier. Postępuje się według niżej przedstawionego schematu:

-20-3. AMINOKWASY

r. Fehlinga (+)(sacharoza)

Aminokwasy są podstawowymi jednostkami strukturalnymi białek. Zbudowane są z grupy karboksylowej , aminowej, atomu wodoru oraz charakterystycznej grupy R (łańcuch boczny aminokwasu), która wiąże się kowalencyjnie z atomem węgla, określanym jako węgiel . Ten atom węgla nazwano ponieważ sąsiaduje on z grupą karboksylową. W roztworach wodnych aminokwasy występują tylko w znikomej ilości (0,1%) jako cząsteczki elektrycznie nie- naładowane , natomiast w ogromnej większości są jonami. Jony te zależnie od oddziaływania środowiska mogą mieć charakter kwasowy bądź zasadowy. W środowisku kwasowym aminokwas przyłącza proton i staje się kationem. Natomiast w środowisku zasadowym oddaje proton i zachowuje się jak anion.W środowisku o pH obojętnym aminokwasy występują w formie zjonizowanej jak jony obojnacze (jony dwubiegunowe) Aminokwas w postaci jonu obojnaczego ma protonową grupę aminową (NH3

+) oraz zjonizowana grupę karboksylową (COO-)

NH2 NH3+

½ ½ H¾ C ¾COOH H¾ C¾ COO-

½ ½ R R aminokwas jon dwubiegunowy postać niezjonizowana ( obojnaczy , dipol aminokwasu)

Ze zmianami pH roztworu zmienia się stan jonizacji cząsteczki aminokwasu .W roztworze kwaśnym (np. pH 1) cofa się dysocjacja grupy karboksylowej – staje się ona niezjonizowana (COOH) , a zjonizowana pozostaje grupa aminowa (NH3

+) W roztworze zasadowym(np. pH 11) zjonizowana jest grupa karboksylowa (COO-),a niezjonizowana - grupa aminowa (NH2)

NH3+ NH3

+ NH2

½ ½ ½ H ¾ C¾ COOH H¾ C ¾ COO- H¾ C¾ COO- ½ ½ ½ R + R R forma przeważająca forma przeważająca forma przeważająca w pH 1 w pH 7 w p H 11

Wszystkie aminokwasy (z wyjątkiem glicyny) zawierają cztery różne podstawniki wokół węgla (węgiel połączony z grupą karboksylową) . Ich steroizomery, należące do szeregu D lub L, są optycznie czynne. W białkach występują tylko L-aminokwasy, a jonizacji ulegają jedynie grupy w łańcuchach bocznych ¾ R aminokwasów oraz końcowa grupa aminowa i karboksylowa, ponieważ pozostałe grupy karboksylowe i aminowe są zablokowane wiązaniem peptydowym (¾ CO-NH ¾). Ze wzglądu na to , że łańcuch boczny aminokwasu może posiadać ładunek ujemny lub dodatni, wyróżnia się aminokwasy obojętne, kwaśne i zasadowe Ponadto wchodzące w skład białek aminokwasy, mogą zawierać w łańcuchu bocznym niepolarne grupy hydrofobowe bądź polarne reszty hydrofilowe, które nie ulegają jonizacji lub mogą dysocjować tylko przy odpowiednim pH roztworu.. Różne łańcuchy boczne aminokwasów sprawiają, że związki te wykazują odmienne właściwości fizykochemiczne. Aminokwasy mają różną wielkość i różny charakter kwasowo-zasadowy. W obrębie aminokwasów wchodzących w skład białek tradycyjnie wyróżnia się dwie grupy . Do pierwszej z nich należą aminokwasy niepolarne, które mają boczny łańcuch alifatyczny (glicyna, alanina, walina, leucyna, izoleucyna i metionina) lub pierścień aromatyczny (fenyloalaniana, tyrozyna, tryptofan). Do tej grupy zalicza się także prolinę hydrofobowy iminokwas zawierający drugorzędową grupę iminową.W obrębie drugiej grupy znajdują się aminokwasy polarne, które w łańcuchu bocznym mają grupę hydroksylową niejonizującą w warunkach fizjologicznych (pH ok. 7,4), ale uczestniczącą w tworzeniu wiązań wodorowych (seryna, treonina i tyrozyna) oraz nie jonizująca grupę sulfhydrylową - cysteina, która może tworzyć wiązanie dwusiarczkowe z inną resztą cysteiny. Z kolei aminokwasy dikarboksylowe (kwas asparaginowy i glutaminowy) zawierające dodatkową jonizującą grupę karboksylową oraz aminokwasy diaminowe (arginina, lizyna, histydyna) mające dodatkowo jonizującą grupę aminową , biorą udział w oddziaływaniach elektrostycznych.

-21-

W warunkach fizjologicznych łańcuch boczny wymienionych aminokwasów może być naładowany ujemnie lub dodatnio. Ponadto aminokwasy z polarnym łańcuchem bocznym, ale nie posiadającym ładunku, mogą uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodorowych w obrębie cząsteczki białka (asparagina - amid kwasu asparaginowego oraz glutamina - amid kwasu glutaminowego).

3.1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów

Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów można podzielić na dwa typy. Pierwsze z nich to reakcje wspólne dla wszystkich aminokwasów. Wynikają one z występowania grup funkcyjnych: karboksylowej i aminowej. Z kolei reakcje specyficzne dla poszczególnych aminokwasów wiążą się z występowaniem charakterystycznego układu w łańcuchu bocznym na przykład grupy hydroksylowej –OH lub sulfhydrylowej –SH, reszty fenylu lub fenolu, bądź układu indolowego, imidazolowego czy guanidynowego. Reakcje te pozwalają na odróżnienie niektórych aminokwasów. Zależnie od charakteru bocznego łańcucha poszczególne aminokwasy tworzą różne barwne pochodne. 3.1.1. Miareczkowanie glicyny metodą SorensenaZasada.Podczas miareczkowania aminokwasu , np.glicyny roztworem NaOH , z grupy aminowej ¾NH3

+ aminokwasu dysocjują jony H+. Wiążą się one z jonami OH- , tworząc słabo zdysocjowane cząsteczki wody , zgodnie z równaniem: COO- COO-

½ ½ H3N+ ¾C¾H + OH- H2N ¾C¾H + H2O

½ ½ R ROdszczepienie protonów od wszystkich grup amoniowych ¾NH3

+ zachodzi dopiero przy wartościach pH roztworu powyżej 12. Bark odpowiednich wskaźników alkacymetrycznych, które zmieniłyby barwę w tym zakresie pH sprawia że uchwycenie końcowego punktu miareczkowania jest bardzo trudne, a najczęściej nawet niemożliwe. Jeżeli podczas miareczkowania stosuje się fenoloftaleinę, to zmiana barwy tego wskaźnika następuje wcześniej niż zostanie osiągnięty punkt równoważnikowy. Zatem dla ilościowego oznaczenia aminokwasu (glicyny) grupa ¾NH2 musi być zablokowana.

-22-

W tym celu do roztworu aminokwasu dodaje się aldehyd mrówkowy (grupa ¾NH+3 nie reaguje z

aldehydem) , co prowadzi do powstania połączenia N, N-dihydroksymetylowego danego aminokwasu zgodnie z poniższą reakcją:

Wytworzenie takiej pochodnej aminokwasu powoduje, że uwolnione w warunkach doświadczenia jony H+ z grupy ¾NH+

3, nie mogą być już wiązane z zablokowanymi grupami ¾COO-., natomiast powodują zakwaszenie środowiska, stąd po dodaniu aldehydu mrówkowego znajdująca się w roztworze fenoloftaleina ulega odbarwieniu. Teraz aminokwas zachowuje się jak słaby kwas, który można już oznaczyć przy użyciu NaOH w obecności fenoloftaleiny. Ilość grup karboksylowych odpowiada ilości aminokwasu (glicyny)Wykonanie oznaczenia:Odczynniki::roztwór glicyny 0.2% roztwór fenoloftaleiny w etanolu 0,1M NaOH aldehyd mrówkowy o pH 8,5

Do zlewki wlać 5 ml roztworu glicyny dodać 2 krople fenoloftaleiny. Następnie z biurety dodawać roztwór NaOH, aż do uzyskania lekko różowego zabarwienia . Oznacza to osiągnięcie w roztworze wartości pH wynoszącej około 8,3. Wtedy dla zablokowania grupy aminowej dodać 5 ml 20% roztworu aldehydu mrówkowego o pH około 8,5. Różowe zabarwienie roztworu znika. Dodawanie NaOH należy kontynuować, aż do ponownego uzyskania lekko różowego zabarwienia miareczkowanego roztworu. Mnożąc ilość zużytego NaOH przez równoważnik glicyny (0,0075) można obliczyć ilość glicyny w roztworze.

3.1.2. Reakcja van Slyke’ a z kwasem azotowym (III)Zasada: wolne -aminokwasy zachowują się jak aminy I-rzędowe. Pod wpływem kwasu azotowego (III) ulegają one dezaminacji, wydziela się wtedy wolny drobinowy azot, natomiast aminokwasy są zamieniane w odpowiednie -hydroksykwasy. Kwas azotowy (III), który jest czynnikiem deaminującym, ze względu na jego nietrwałość otrzymujemy w reakcji z azotynem sodu , działając na niego kwasem octowym: NaNO2 + CH3COOH ¾ HNO2 + CH3COONa

Otrzymany w ten sposób HNO2 reaguje z aminokwasem , zgodnie z poniższym równaniem: COOH COOH ½ ½ H2N ¾C¾ H + HNO2 ¾ HO ¾C¾H + H2O + N2

½ ½ R RWykonanie oznaczenia:Odczynnik:i 10%NaNO2

stężony CH3COOH 0,5mol/l glicyny

-23-

Do 1 ml roztworu glicyny dodać 1 ml NaNO2 , a następnie 1 ml CH3 COOH. Powstający w tej reakcji HNO2 nie ulega rozkładowi do tlenków, lecz reaguje z grupą aminową glicyny. Obserwuje się wydzielenie pęcherzyków bezbarwnego , gazowego azotu.

3.1.3. Reakcja z ninhydrynąZasada:Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu – poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji 2 cząsteczek ninhydryny: zredukowanej i utlenionej z amoniakiem powstaje fioletowo niebieskie zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu -amonowego aminokwasów. Dodatni barwny odczyn ninhydrynowy dają oprócz aminokwasów, peptydów i białek , także sole amonowe, aminocukry i amoniak. Oznaczana próba musi być wolna od tych związków.

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: 0,5 mol/l roztwór glicyny 0,1% roztwór ninhydryny

Do około 1 ml roztworu glicyny dodać 2 krople roztworu ninhydryny. Próbkę ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez około 3 minuty , pojawia się niebiesko-fiołkowe zabarwienie.

3.1.4. Reakcja dla cysteiny (aminokwas siarkowy)Zasada: ogrzewanie roztworu cysteiny w środowisku silnie zasadowym prowadzi do deaminacji , a także powstania jonów siarczkowych. Podobnie reaguje cysteina zawarta w białku. Jony siarczkowe reagują z octanem ołowiu (+2) . Powstaje wtedy czarny osad siarczku ołowiu (+2)

COOH COOH ½ ½ H2N ¾C¾H + 2 OH- C= O + NH3

+ S2- + H2O

½ ½ CH2¾ SH CH3 Cysteina kwas pirogronowy

Pb2+ + S2+ ¾¾ PbS¯ czarny

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór cysteiny 30% NaOH 1 M Pb(CH3COO)2

Do 1 ml roztworu cysteiny dodać 2 ml NaOH i ogrzewać około 15-20 minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie dodać kilka kropel roztworu Pb(CH3COO)2 i ponownie ogrzać powstaje ciemnopopielaty roztwór z którego po około 10 minutach wytrąca się ciemny osad PbS.

-24-

3.1.5. Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych.

Zasada: Tyrozyna - aminokwas zawierający w łańcuchu bocznym pierścień aromatyczny podczas ogrzewania ze stężonym kwasem azotowym (V) ulega reakcji nitrowania, tworząc żółto zabarwioną dinitrotyrozynę

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór jaja kurzego HNO3

NaOH stężony

Do 2 ml roztworu białka jaj kurzego dodać 2 ml HNO3 i bardzo ostrożnie lekko podgrzać (2 min).Uwaga ! reakcja silnie egzotermiczna. Roztwór zabarwia się na żółto. Po oziębieniu zawartość probówki zalkalizować NaOH ( tzn. dodać 5- 10 kropli bardzo ostrożnie) powstaje pomarańczowe zabarwienie.

3.1.6. Reakcje dla układu indolowego w tryptofanie. Zasada: Związki zawierające układ indolowy, np. tryptofan lub białka zwierające ten aminokwas w roztworze stężonego kwasu np. siarkowego tworzą barwne produkty kondensacji z aldehydami lub ich pochodnymi. Reakcje te mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczania tryptofanu zarówno wolnego jak również związanego w cząsteczce białka. Tryptofan, kondensuje z kwasem glioksalowym (reakcja Adamkiewicza i Hopkinsa) oraz aldehydem mrówkowym (reakcja Voiseneta), tworzy fiołkowo zabarwione produkty zgodnie z równaniem reakcji:

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego kwas glioksalowy H2SO4 stężony 2.5% aldehyd mrówkowy HCL stężony 0.05%NaNO2

-25-

1. Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml kwasu glioksalowego, wymieszać i podwarstwić stężonym H2SO4 ( 1-2 ml), wlewając go bardzo ostrożnie!!! po ściance nachylonej probówki. Na

granicy zetknięcia obu warstw, tworzy się fiołkowy pierścień. Próbę należy wykonać pod wyciągiem przy opuszczonej szybie!

2. Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 kroplę 2,5% roztworu aldehydu mrówkowego oraz 2 do 3 ml stężonego HCL. Zawartość probówki ostrożnie wymieszać i odstawić na 5 minut. Po upływie tego czasu dodawać kroplami(5-10 kropel) ,0.05% roztwór NaNO2 Odstawić na 20 minut. Tworzy się zabarwienie fiołkowe.

3.1.7. Reakcja Sakaguchiego dla układu guanidynowego w argininie.Zasada: Związki zawierające resztę guanidynową, w tym arginina i białka zawierające ten aminokwas reagują z -naftolem w środowisku zasadowym zawierającym bromian (I) Powstaje wtedy pomarańczowo-czerwony barwnik. Reakcja ta jest bardzo czuła i może służyć do ilościowego oznaczania argininy w białkach. Reakcji tej nie dają inne niskocząsteczkowe związki azotowe (np. mocznik, kreatyna itp.) ponieważ w tej reakcji niezbędny jest odpowiedni układ , gdzie R jest grupa alkilową: H2N –C- R

॥ NH

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór jaja kurzego 20% NaOH 2% naftol woda bromowa

Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml NaOH i 2 do 3 kropli alkoholowego roztworu -naftolu i zawartość probówki dobrze wymieszać. Następnie dodać po kropli świeżo przygotowanej wody bromowej ( w środowisku zasadowym powstaje bromian (I)) i ponownie wymieszać . Tworzy się związek o pomarańczowo-czerwonym zabarwieniu.

-26-

4.BIAŁKA

Aminokwasy połączone wiązaniami peptydowymi tworzą łańcuch polipetydowy. Wiązanie peptydowe łączy grupę karboksylową jednego aminokwasu z grupą aminową drugiego aminokwasu.

Powstanie dipeptydu z dwu wolnych aminokwasów wiąże się z uwolnieniem jednej cząsteczki wody zgodnie z poniższą reakcją :

Równowaga tej reakcji jest znacznie silniej przesunięta w kierunku hydrolizy niż w kierunku syntezy. W związku z tym biosynteza wiązań peptydowych wymaga dostarczenia energii swobodnej, natomiast hydroliza wiązań jest termodynamicznie korzystna. Wiele aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi tworzy liniową strukturę łańcucha polipeptydowego. W łańcuchu polipeptydowym możemy wyznaczyć kierunek, ponieważ jego składniki mają dwa różne końce – z jednej strony grupą aminowa, a z drugiej grupę karboksylową . Jako początek łańcucha polipeptydowego umownie przyjęto jego koniec aminowy czyli koniec N i dlatego sekwencje aminokwasowe łańcucha polipeptydowego zapisuje się poczynając od reszty aminokwasowej z wolną (końcową) grupa -aminową np:

Łańcuch polipeptydowy jest złożony z powtarzających się regularnie fragmentów , tworzących łańcuch główny oraz fragmentów zmiennych – charakterystycznych łańcuchów bocznych różnych aminokwasów. Większość naturalnych łańcuchów polipeptydowych – białek - zawiera od 50 – 2000 reszt aminokwasowych.Omawiając budowę białek często wymienia się cztery poziomy ich struktury. Struktura pierwszorzędowa określa po prostu sekwencję aminokwasów. Struktura drugorzędowa opisuje wzajemne przestrzenne ułożenie reszt aminokwasowych, sąsiadujących ze sobą w sekwencji liniowej Przykładem struktury drugorzędowej jest helisa lub nić . Struktura trzeciorzędowa odnosi się do powiązań przestrzennych i wzajemnego ułożenia reszt aminokwasowych oddalonych od siebie sekwencji liniowej oraz lokalizacji mostków dwusiarczkowych. W białkach składających się z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego , można określić jeszcze jeden poziom organizacji struktury. Każdy z tych łańcuchów nazywa się w takim przypadku podjednostką danego białka. Struktura czwartorzędowa opisuje wzajemne ułożenie przestrzenne podjednostek i rodzaj ich kontaktu.

-27-

Badania konformacji, funkcji i ewolucji białek doprowadziły do wyróżnienia jeszcze dwu dodatkowych, ważnych poziomów ich organizacji. Naddrugorzędowa struktura odnosi się do zespołów struktur drugorzędowych. W wielu białkach na przykład nić jest oddzielona od drugiej nici helisą , taki motyw nazywa się jednostką . .Niektóre łańcuchy polipeptydowi fałdują się, tworząc dwa lub więcej ściśle zwiniętych rejonów. Te ściśle zwinięta jednostki globularne , nazywane

tetrapeptyd

Końcowa resztaaminowa koniec N

Końcowa resztakarboksylowakoniec C

domenami, złożone są ze 100 do 400 reszt aminokwasowych.

4.1. Reakcje charakterystyczne dla białek

4.1.1 Wykazanie amfoterycznego charakteru białekBiałka są polielektrolitami zawierającymi rozmaite grupy funkcyjne w bocznym łańcuchu aminokwasów. Niektóre z nich łatwo ulegają dysocjacji w roztworach wodnych. Jony wodorowe znajdujące się w roztworze mogą zmieniać jonizację tych grup i stąd całkowity ładunek cząsteczki zależy od pH środowiska. Przy określonej wartości pH roztworu w wyniku jonizacji w cząsteczce białka powstaje tyle samo ładunków dodatnich co ujemnych, czyli białko osiąga punkt izoelektryczny, który podobnie jak w przypadku aminokwasów oznacza się symbolem pI. W tych warunkach suma ładunków elektrycznych danego białka jest równa zeru. Białka mają charakter amfoteryczny, wynikający przede wszystkim z występowania wolnych grup karboksylowych ¾COO-

(kwasu asparaginowego, i glutaminowego oraz C-końcowej grupy cząsteczki) i amoniowej ¾NH3+

( lizyny i argininy oraz N-końcowej grupy cząsteczki). W roztworach o pH powyżej wartości pI (punktu izoelektryczego) białko występuje w postaci anionu. Zachowuje się wtedy jak kwas, czyli oddaje jony wodorowe. Zaś w roztworach o pH poniżej punktu pI białko występuje w postaci kationu. Zachowuje się wtedy jak zasada, czyli przyłącza jony wodorowe. Wynika z tego ,że cząsteczka białka w pierwszym przypadku staje się silnie zdysocjowany zasadą polianionową podczas gdy w drugim przypadku staje się coraz silniej zdysocjowanym kwasem polikationowym

4.1.2 Zachowanie się białek w obecności kwasówWykonanie oznaczenia:Odczynniki : 0,5% roztwór żelatyny 0,01mol/l HCL zieleń bromokrezolowa

Przygotować dwie probówki. Do jednej nalać 2 ml wody destylowanej, a do drugiej 2 ml 0,5% żelatyny. Do obu probówek dodać po 3 krople zieleni bromokrezolowej i kroplami z pipety roztwór HCL, aż do otrzymania barwy żółtej (pH około 3). Porównać ilość zużytego kwasu do otrzymania barwy w wodzie destylowanej i w roztworze żelatyny.

4.1.3. Zachowanie się białek w obecności zasadWykonanie oznaczenia:Odczynniki: : 0,5% roztwór żelatyny 0,01mol/l NaOH błękit tymolowy

Do 2 probówek nalać kolejno: do pierwszej 2 ml wody destylowanej a do drugiej 2 ml 0,5% żelatyny. Do obu probówek dodać po 3 krople błękitu tymolowego i miareczkować z pipety roztworem NaOH aż do uzyskania barwy niebieskiej . Porównać ilość kropli zużytej zasady przy miareczkowaniu wody i żelatyny.

4.2 Białka jako koloidy

Układy koloidalne są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Wszystkie komórki są zespołami mniej lub bardziej różnorodnych układów koloidowych. W przyrodzie ożywionej zasadniczą rolę odgrywają ciekłe roztwory koloidowe – zole, których fazą dyspresyjną jest woda. Trwałość takich roztworów zależy od wielu czynników np. ładunku elektrycznego cząsteczek rozproszonych, stopnia uwodnienia i temperatury.

-28-

Ze względu na jakość fazy rozproszonej można wyróżnić następujące typy układów koloidowych:A.roztwory wielkocząsteczkowych biopolimerów - białek, kwasów nukleinowych i polisacharydów (faza rozproszona skład się z cząsteczek o rozmiarach 5-100 nm)

B.roztwory micelarne, których typowymi przedstawicielami są roztwory mydeł i detergentówC. roztwory substancji nie polarnych , które nie wykazują powinowactwa do wodyPierwsze dwa typy układów koloidowych zalicza się do hydrofilowych (liofilowych) a trzeci do hydrofobowych (liofobowych). Koloidy hydrofilowe nazywa się także emulsoidami lub koloidami odwracalnymi. Koloidy hydrofobowe natomiast – suspensoidami koloidami nieodwracalnymi lub zawiesiną koloidową. Te dwa typy układów koloidowych różnią się znacznie cechami fizykochemicznymi.Roztwory koloidów hydrofilowych, zależnie od temperatury i stężenia, mogą występować w formie ciekłej –jako zole lub w formie elastycznego ciała stałego – jako żele. Przechodzenie zolu w żel nazywa się żelatynowaniem (żelowaniem) i jest procesem odwracalnym

+ H2O + H2O (pęcznienie) podniesienie temp. Koloid suchy ¾¾¾¾ żel ¾¾¾¾¾¾¾¾ zol (osuszenie) obniżenie temp. - H2O (osuszenie)

- H2OWykonanie oznaczenia:Odczynniki: żelatyna (subst.) skrobia (subst.) 1.Do 2 probówek odważyć : do pierwszej 0,5 g skrobi a do drugiej 0,5 g żelatyny . Dodać 1ml wody i po bardzo dokładnym wymieszaniu pozostawić na 30 minut w celu napęcznienia. Następnie dodać po 5 ml wody , wymieszać dokładnie do otrzymania jednorodnego roztworu a następnie wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Wyjąć po około 5 minutach ostudzić pod zimną wodą lub w lodzie. Otrzymuje się żele. Jeżeli ponownie wstawimy je do wrzącej łaźni wodnej otrzymamy zole .

2. Skrobię i żelatynę w oddzielnych probówkach zalać 5 ml wrzącej wodą bez uprzedniego napęcznienia. Zwrócić uwagą na różnicę w rozpuszczaniu się koloidu napęczniałego i suchego.

4.3 Denaturacja białekTerminem tym obejmuje się zmiany w konformacji łańcucha polipetydowego, wskutek których białko traci właściwości. Denaturacja występuje wówczas, kiedy pod wpływem czynników fizycznych lub chemicznych ulega zniszczeniu struktura IV, III lub II rzędowa. Czynniki denaturujące działają na wiązania które stabilizują przestrzenną strukturę białek. Do wiązań tych należy zaliczyć przede wszystkim wiązania wodorowe tworzące się między grupami =CO i =NH wiązań peptydowych (w tym samych lub różnych łańcuchach polipeptydowych), a także między grupami funkcyjnymi łańcuchów bocznych, takimi jak : - COOH, -OH, -NH2, i -SH . W utrzymaniu konformacji cząsteczki białka współdziałają również wiązania jonowe, powstające między grupami -COO- i NH3

+, a także oddziaływania hydrofobowe między aminokwasami niepolarnymi. Ważnym czynnikiem stabilizującym konformację łańcuchów polipeptydowych są kowalencyjne wiązania disiarczkowe, tworzące się między resztami cysteiny tego samego lub różnych łańcuchów polipeptydowych. Istotną rolę odgrywają ponadto metale łączące ze sobą łańcuchy boczne aminokwasów wiązaniami koordynacyjnymi.W wyniku rozerwania wiązań stabilizujących strukturę białka uwolnione grupy funkcyjne mogą wytwarzać inne wiązania, które zmieniają konfigurację cząsteczki. Taka nowa, zdeformowana cząsteczka odznacza się zawsze zmianą, oraz utratą właściwości biologicznych (enzymatycznych, antygenowych, hormonalnych).

-29-

Denaturację białka wywołują niektóre czynniki fizyczne takie jak: ogrzewanie, wysychanie, ultradźwięki, promieniowanie krótkofalowe. Chemiczne czynniki denaturujące to: kwasy, zasady , jony metali ciężkich, mocznik , detergenty, fenol, chloroform, rozpuszczalniki mieszające się z wodą jak : alkohol, aceton.

4.3.1.Denaturacja cieplna

Zasada: Ciepło powodując zrywanie wiązań wodorowych w cząsteczce, prowadzi do nieodwracalnej denaturacji białek. Proces denaturacji cieplnej rozpoczyna się dla różnych białek w różnych temperaturach (między 40 a 100oC ). Tylko nieliczne białka wytrzymują krótkie gotowanie (np. żelatyna , rybonukleaza). Białko zdenaturowane w pI jest nierozpuszczalne.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór białka NaCL (in substancja) MgSO4

Około 2 ml roztworu białka jaja kurzego zagotować do wrzenia. Tworzy się biały, kłaczkowaty osad wytrąconego białka. Osad staje się wyraźniejszy po dodaniu niewielkiej ilości NaCL lub MgSO4

4.3.2. Denaturacja pod wpływem etanolu. Zasada: Rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, aceton), dezorganizując warstwę wodną otaczającą cząsteczki białek i osłabiając oddziaływania hydrofobowe, powodują wytrącenie białek. W temp. poniżej 00C nie denaturują białek. Działania takie ujawniają się w większych stężeniach i w wyższej temperaturze (20-300C)Wykonanie oznaczeniaodczynniki: roztwór białka 95% alkohol etylowy

Do 1ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml alkoholu etylowego. Po 10 minutach dodać 2 ml wody . Strąt nie rozpuszcza się.

4.3.3.Denaturacja pod wpływem stężonego kwasu siarkowego Wykonanie oznaczenia.:Odczynniki: roztwór białka stężony H2SO4

Do około 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać bardzo ostrożnie ! 3-5 kropel stężonego kwasu siarkowego. Kwas ten mimo denaturacji nie wytrąca białka z roztworu.

4.3.4. Strącanie białka za pomocą kationów (sole metali ciężkich) Zasada: jeśli wartość pH jest większa od pI (punktu izoelektrycznego) , cząsteczki białka stają się anionami i mogą reagować z kationami. Powstające sole zależnie od rodzaju jonu dysocjują w różnym stopniu. Kationy metali alkalicznych dają sole bardzo dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie , natomiast kationy metali ciężkich ( Fe3+, Cu2+, Hg2+, Pb2+) tworzą sole o bardzo małej dysocjacji i trudno rozpuszczalne.

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki :roztwór białka 1% FeCL3

1% CuSO4

1.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli 1% roztworu FeCL3. Roztwór barwi się na kolor brudnopomarańczowy. Po pewnym czasie wytrąca się brunatny osad białczanu żelazowego.

2.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli roztworu CuSO 4. Powstaje jasnobłękitny osad białczanu miedziowego.

-30-

4.3.5. Strącanie białka za pomocą anionówZasada: Po stronie kwasowej punktu izoelektrycznego cząsteczki białka maja ładunek dodatni oraz zdolność reagowania z anionami. Niektóre kwasy organiczne dają trwałe, nierozpuszczalne połączenia z białkami i są stosowane jako odczynniki odbiałczające płyny biologiczne. Związki te w większych stężeniach powodują denaturację białka Podobnie stężone roztwory kwasów nieorganicznych (HCL, H2SO4) denaturują białko.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór białka

60% CCL3COOH

Do 1 ml roztworu białka kurzego dodać kilka kropel kwasu trichlorooctowego, wytrąca się białko w postaci białego osadu.4.4.Reakcje barwne białek

4.4.1 Reakcja biuretowa – wykrywanie białekZasada: reakcję biuretową dają białka oraz peptydy mające więcej niż dwa wiązania peptydowe. W środowisku zasadowym układy wiązań peptydowych dają z jonami miedzi (+2)barwne kompleksy. Aby reakcja przebiegała prawidłowo kationy Cu2+muszą być związane w postaci kompleksu , co chroni je przed wytrąceniem w postaci wodorotlenku miedzi. Wiązania peptydowe w środowisku zasadowym ulegają enolizacji zgodnie z równaniem:

Białko lub peptyd , w którym wiązania peptydowe uległy enolizacji, reagują z jonami Cu , dając kompleks barwy niebiesko-fioletowej. Nasilenie barwy kompleksu zależy od ilości wiązań peptydowych i budowy łańcucha peptydowego, a więc intensywność barwy roztworu jest proporcjonalna do stężenia białka. W przypadku peptydów o niezbyt długich łańcuchach powstaje kompleks barwy czerwono-fioletowej

.

-31-

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego 10% NaOH 1% CuSO4

Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml 10% NaOH, a następnie dodać parę kropel roztworu CuSO4 . Roztwór barwi się na niebiesko-fioletowo.

4.4.2 Reakcja Libermana

Tetrapeptyd – forma ketonowa

Tetrapeptyd – forma enolowa

Zasada: Reakcja ta wykazuje w białku obecność grupy węglowodanowej, a więc dają ją wszystkie glikoproteidy. W obecności HCL część węglowodanowa cząsteczki białka przechodzi w furfural, który z fenolami wytworzonymi na skutek równoczesnej hydrolizy białka daje zabarwienie fiołkowe.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego HCL stężony

Do około 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 3 ml stężonego HCL (ostrożnie!) i ogrzewać przez 5 minut w łaźni wodnej . Roztwór barwi się na kolor fiołkowy.Białka dają ponadto reakcje barwne charakterystyczne dla zawartych w nich aminokwasów.

4.5.Oczyszczanie białek metodą dializy

Do zbadania struktury , a także określenia właściwości fizykochemicznych i funkcji, białka muszą być wyizolowane z materiału biologicznego, a następnie poddane procedurze systematycznego oczyszczania. W odróżnieniu od związków niskocząseteczkowych, białka nie przechodzą przez błony półprzepuszczalne. W trakcie oczyszczania białka bądź przygotowania materiału biologicznego do różnego typu oznaczeń, zachodzi często konieczność usunięcia z roztworu białka nadmiaru soli (odsolenie) lub niskocząsteczkowych związków organicznych. Do tego celu stosuje się dializę która oparta jest na procesie dyfuzji. Proces dyfuzji zachodzi zawsze w kierunku od wyższego stężenia substancji rozpuszczonej do niższego i prowadzi do wyrównania stężeń w całej objętości roztworu bez nakładu energii. Małe cząsteczki można więc oddzielić od białka metodą dializy przez błonę półprzepuszczalną taką jak błona celulozowa. Cząsteczki o wymiarach znacznie większych niż średnica poru pozostają w woreczku dializacyjnym natomiast jony i mniejsze cząsteczki przechodzą przez pory błony i pojawiają się dializacie na zewnątrz woreczka.

-32-

W celu przyspieszenia dializy i możliwie maksymalnego oczyszczenia białek od soli lub innych niskocząsteczkowych związków zmienia się roztwór do którego próbka jest dializowana , a także stosuje się mieszanie.

Odczynniki:mleko z dodatkiem NaCL ( 100 mg/25 ml mleka ) i glukozy (100 mg/25 ml mleka) = roztwór przeznaczony do dializy (A)10% NaOH1%CuSO4

10% -naftolstężony H2SO4

Fehling IFehling II20 mmol/l AgNO3

woreczek do dializyWykonanie oznaczenia:

1.Przygotować 4 probówki do których pobrać po 1 ml roztworu do dializy czyli płynu przeddializacyjnego (A).

2. Przygotować woreczek do dializy, mocno związać sznurkiem jeden koniec. 3. Do zlewki oznakowanej symbolem B wlać 200 ml wody destylowanej 4.Wlać 20 ml roztworu do dializy A do woreczka dializacyjnego i mocno związać jego drugi

koniec sznurkiem 5. Umieścić napełniony woreczek dializacyjny w zlewce B z wodą destylowaną . 6. Zlewkę z napełnionym woreczkiem dializacyjnym umieścić na mieszadle magnetycznym. 7. Co 15 minut wylewać płyn dializacyjny (B) ze zlewki do erlenmajereki ( w celu

przeprowadzenia analizy) , a zlewkę napełniać 200 ml wody destylowanej przez okres 1 godz. Każdorazowo, do czterech probówek pobrać po 1 ml płynu dializacyjnego (B) w celu przeprowadzenia analizy

8. Po upływie 1 godz. wylać z woreczka dializacyjnego płyn dializowany (C) do erelenmajerki z której pobrać po 1 ml do czterech probówek w celu przeprowadzenia analizy tego płynu.

Analiza roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacyjnego (B) i dializowanego (C) - sprawdzenie obecności białka (1)metodą biuretową ,(2) potwierdzenie występowania cukru (glukoza i laktoza) reakcją Molischa, (3)potwierdzenie występowania cukru redukującego rekacją Fehlinga, (4)wykazanie występowania jonów chlorkowych.

1. Sprawdzenie obecności białka.Reakcja biuretowado 1 ml roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacyjnego (B) i dializowanego (C) dodać 1 ml 10% NaOH oraz 3 krople 1% CuSO4. W obecności białka roztwór barwi się na kolor fioletowy.

2. Sprawdzenie obecności cukru.Reakcja MolischaDo 1 ml roztworu A, B i C dodać 2 krople -naftolu. Po dokładnym zamieszaniu ostrożnie po ściance probówki wlać 1 ml stężonego H2SO4, tak aby widoczna była granica między cieczami. W miejscu zetknięcia się obu warstw powstaje czerwono-fioletowy pierścień w przypadku obecności cukru.

3. Potwierdzenie występowania cukrowca redukującego Reakcja Fehlinga. Do 1 ml roztworu A, B i C dodać 1 ml odczynnika Fehlinga I i 1 ml Fehlinga II. Zawartość probówek dobrze wymieszać i ogrzać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut W przypadku obecności cukru redukującego powstaje pomarańczowy osad tlenku miedzi (I).

-33-

4. Potwierdzenie występowanie jonów chlorkowych. Do 1ml roztworu A, B i C dodać 1 ml roztworu AgNO3. Wytrąca się osad chlorku srebra w przypadku występowania jonów chlorkowych w badanych roztworach.

Na podstawie przeprowadzonego doświadczenie: porównać jak zmienia się zawartość składników (białka, cukru, jonów chlorkowych roztworze przeznaczonym do dializy (A), dializacyjnym (B) i dializowanym (C).

4.6. Kolorymetria

Kolorymetria jest działem analizy chemicznej, w którym podstawą ilościowego oznaczania substancji w roztworze stanowi prosta zależność między intensywnością zabarwiania roztworu (absorpcja światła o określonej długości fali - l ), a stężeniem zawartej w nim substancji. Metodami kolorymetrycznymi można oznaczyć zarówno stężenia substancji mających własną barwę jak i substancji bezbarwnych, które za pomocą odpowiednich reakcji chemicznych przeprowadza się w związki barwne . W tym przypadku reakcja barwna musi przebiegać do końca, a powstałe zabarwienie musi być dostatecznie trwałe, niewrażliwe na działanie światła, mało zależne od pH, temperatury, nadmiaru odczynnikaMetody kolorymetryczne mają zastosowane tylko do oznaczenia ilościowego substancji dających barwne połączenia, które pochłaniają światło o długości fali światła widzialnego , czyli w zakresie długości od 360 do 770 nm.W odróżnieniu od metod kolorymetrycznych spektrofotometria pozwala na oznaczenie stężenia związków pochłaniających światło nadfioletowe (tzn. o długości fali od 220 do 360 nm ) oraz podczerwone (tzn. o długości fali ponad 770 nm) Tym niemniej metody kolorymetryczne należą do najszybszych i najłatwiejszych technik analitycznych. Odznaczają się one uniwersalnością , dokładnością i czułością przewyższającą pod tym względem inne metody. Zasady kolorymetrii Barwa substancji zależy od aktywnego pochłaniania, czyli absorpcji światła przez tę substancję. W czasie obserwacji światła przechodzącego przez daną substancję do oczu dochodzą promienie, które nie zostały przez nią zaabsorbowane. Widzi się więc barwę dopełniającą, na którą składają się poszczególne rodzaje przepuszczonych fal elektromagnetycznych. Na przykład barwa niebieska roztworu oznacza, że dana substancja pochłania światło żółte, przepuszczając te długości fal, które tworzą widzianą przez nas barwę dopełniającą tj., niebieską, roztwór zabarwiony na czerwono pochłania światło niebiesko- zielone, roztwór zabarwiony na żółto światło niebiesko-fioletowe.

Istnieje ścisły związek między zabarwieniem substancji a jej strukturą elektronową. Cząsteczka (lub jon) wykazuje absorpcję w części widzialnej widma lub w nadfiolecie, gdy pod wpływem promieniowania elektrony jej zostają przeniesione ze stanu podstawowego do jednego ze stanów wzbudzonych.

-34-

Powstanie barwy lub jej zmiana są zawsze związane z deformacją normalnej elektronowej struktury cząsteczki. Zmiany energii elektronowej pod wpływem naświetlania występują w cząsteczkach zawierających grupy chromatoforowe, ugrupowania z wielokrotnymi wiązaniami nienasyconymi, np.

Wzrost intensywności zabarwienia cząsteczki powoduje obecność tzw. grup auksochromowych, np. ¾OH, ¾NH2, ¾SH, ¾CH3, ¾Cl, ¾Br, pierścień fenylowy czy naftylowy.Ilość światła pochłoniętego po przejściu przez barwny roztwór zależy od grubości warstwy barwnego roztworu. Zależność tą ujmuje prawo Lamberta. Zgodnie z tym prawem logarytm stosunku natężenia światła padającego do natężenia światła przechodzącego jest wprost proporcjonalny do grubości warstwy. Io Log ¾¾ = k • d IIo - natężenie światła padającegoI - natężenie światła po przejściu przez barwny roztwórk - współczynnik proporcjonalnościd - grubość warstwy barwnego roztworu przez który przechodzi światło (cm)

Ilość światła pochłoniętego zależy również od stężenia substancji barwnej, zależność tą podaje prawo Beera. Zgodnie z tym prawem logarytm ze stosunku natężenia światła padającego do natężenia światła przechodzącego przez roztwór jest wprost proporcjonalny do stężenia barwnej substancji. Io

Log ¾¾ = k • c I

gdzie : Io

Log —— - absorbancja = A I k - stała charakterystyczna dla danego ośrodka optycznego c – stężenie substancji barwnejŁącząc wzór określający prawo Lamberta z wzorem określającym prawo Beera otrzymuje się nowe wyrażenie , ujmując matematycznie zależność pomiędzy gęstością optyczną a stężeniem substancji i grubością warstwy roztworu

A = k • c • d

Absorbancja (A) jest miarą wygaszania światła przez barwny roztwór. Innym określeniem absornbancji jest gęstość optyczna lub ekstynkcja

Zgodnie z prawem Lamberta - Beera absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia i grubością warstwy barwnego roztworu.

Uzyskiwane wartości absorbancji powinny się znajdować w przedziale 0,1 -1,0 a najdokładniejsze wyniki otrzymuje się przy wartościach od 0,2 – 0,6. Ponieważ na wartość absorbancji ma wpływ grubość warstwy roztworu, należy oznaczenia przeprowadzać w kuwetach o takiej grubości warstwy, która umożliwiłaby uzyskanie wartości absorbancji w optymalnych warunkach.

-35-3.6.1.Ilościowe oznaczenie białka metodą Lowry’egoZasada:metoda Lowry opiera się na reakcji jaką dają wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne z odczynnikiem Folina Ciocaltou:I etap ¾ przyłączenie jonów miedzi (odczynnik Lowry C) do wiązań peptydowych

II etap ¾ redukcja kwasu fosfowolframowego i fosfomolibdenianowego do odpowiednich tlenków przez miedź związaną z białkiem, reakcja między odczynnikiem fenolowym, a tyrozyną i tryptofanemMetoda Lowry pozwala na oznaczenie białka już w stężeniu 1mg/ml. Jest powszechnie stosowana do oznaczania zawartości białka w płynach biologicznych i homogenatach tkankowych. Odczynniki: Standard – krystaliczna albumina wołowa BSA o stężeniu: 50mg/ml Lowry A 50 ml Lowry B 1 ml Lowry C = 50 ml Lowry A + 1 ml Lowry B Odczynnik Folina Ciocaltou

ärozcieńczenie surowicy: 0,1 ml surowicy + 9,9 ml Lowry C lub 0,05 ml surowicy + 4,95 ml Lowry CPo inkubacji zmierzyć absorbancję próbek (A) wobec próby odczynnikowej ”0”przy fali o dł. l = 660 nm w kuwecie o grubości warstwy d = 1cm Obliczenie stężenia białka:

(A) Absorbancja próby badanej x 0.05 x 100 = (.x.) g/100ml (A) Absorbancja standardu

Stężenie białka całkowitego w surowicy

Gatunek zwierząt Wartości g/100ml

KonieBydłoOwceKozyŚwiniePsyKotyKróliki

6,0 - 7,85,1 - 7,16,5 - 7,05,9 – 7,85,9 - 7,45,5 – 7,06,0 – 8,06,0 – 8,3

-36- 5.KWASY NUKLEINOWE

Organizmy żywe mogą istnieć wyłącznie wtedy, gdy są zdolne przekazać swą informację genetyczną organizmom potomnym . Podstawę tej informacji genetycznej stanowi kwas dezoksyrybonukleinowyDNA ¾¾ RNA ¾¾ białka ¾¾ komórka ¾¾ organizm

Poniższy schemat przedstawia schemat przepływu informacji genetycznej

Synteza potomnej cząsteczki DNA to replikacja ( etap u na schemacie),przekazanie informacji z DNA na RNA – transkrypcja ( etap v ) , a z RNA dla syntezy białka – translacja � Translacja jest związana z przetłumaczeniem informacji zapisanej w sekwencji nukleotydów na„język aminokwasów.Istnieje możliwość przekazania informacji z RNA na DNA tj. odwrotna transkrypcja (etap x)DNA jest polimerem zbudowanym z jednostek monomerycznych – deoksyrybonukleotydów . Każdy nukleotyd składa się z zasady azotowej, cukru oraz z jednej lub więcej grup fosforanowych. Cukrem występującym w deoksyrybonukleotydach jest deoksyryboza.

Zasady azotowe to : pochodne puryny lub pirymidyny. Zasadami purynowymi w DNA są adenina (A) i guanina (G), a pirymidynowymi – tymina (T) i cytozyna (C).

Związek zasady purynowej lub pirymidynowej z cukrem nazywamy nukleozydem. W DNA występuje 4 rodzaje nukleozydów: deoksyadenozyna, deoksyguanozyna, deoksytymidyna i deoksycytydyna. W deoksyrybonukleotydach N-9 zasady purynowej lub N-1 zasady pirymidynowej jest związany z C-1 deoksyrybozy wiązaniem N-glikozydowym. Ester nukleozydu i kwasu fosforowego nazywamy nukleotydem . Najczęstszym miejscem estryfikacji w nukleotydach występujących w przyrodzie jest grupa hydroksylowa związana z C-5 cukru. Tego rodzaju związek jest nazywany nukleozydo-5’- fosforanem lub 5’- nukleotydem. ( Cyfra ze znaczkiem prim ‘ określa atom w cząsteczce cukru).

-37-

Rdzeń DNA jest niezmienny, wzdłuż całej cząsteczki i składa się z reszt deoksyrybozy połączonych resztami fosforanowymi. Grupa 3’-hydroksylowa reszt cukrowej jednego deoksyrybonukleotydu jest połączona z grupą 5’- hydroksylową następnej reszty cukrowej wiązaniem fosfodiestrowym.

Komórkowy DNA składa się z dwóch bardzo długich łańcuchów polinukleotydowych, zwiniętych wokół jednej wspólnej osi. Każda z dwóch nici helisy jest zorientowana w przeciwnym kierunku. Na zewnątrz dwuniciowej helisy znajdują się rdzenie cukrowo-fosforanowe każdego z łańcuchów , podczas gdy zasady purynowe i pirymidynowe są skierowane do wnętrza helisy. Obydwa łańcuchy są połączone wiązaniami wodorowymi między zasadami tworzącymi pary. Adenina (A) zawsze tworzy parę z tyminą (T), a guanina (G) jest zawsze sparowana z cytozyną (C), dzięki czemu jeden łańcuch helisy jest zawsze komplementarny do drugiego. Informacje genetyczną koduje ściśle określona sekwencja zasad w każdym z łańcuchów. Wiele cząsteczek DNA tworzy formy koliste.Podczas replikacji obydwa łańcuchy helisy DNA ulegają rozpleceniu i rozdzielają się w miarę postępu syntezy nowych łańcuchów. Każdy łańcuch rodzicielski stanowi matrycę dla nowo powstającego łańcuchu komplementarnego. Tak więc replikacja DNA jest procesem semikonserwtywnym – każda potomna cząsteczka uzyskuje jeden łańcuch z rodzicielskiej czasteczki DNA i drugi nowo syntetyzowany. Aktywnymi prekursorami w syntezie DNA są cztery 5 ’

–trifosforany deoksyrybonukleozydów. Nowa nić jest syntetyzowana w kierunku 5’ 3’.DNA nie jest jednak bezpośrednio matrycą do syntezy białek; funkcje takie pełnią natomiast cząsteczki RNA – kwasu rybonukleinowego. RNA jest długą nierozgałęzioną makrocząsteczką złożoną z nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi 3’ 5’. Jednostką cukrową w RNA jest ryboza. Głównymi zasadami w RNA są : adeina (A) uracyl, (U) guanina (G) oraz cytozyna (C). Adenina może tworzyć parę z uracylem , a guanina z cytozyną

Funkcję pośredników przenoszących informację w procesie biosyntezy białka pełni klasa cząsteczek RNA nazywanych informacyjnymi RNA (mRNA). Inne cząsteczki RNA, jak transportujący RNA (tRNA) i rybosomowy RNA (rRNA) stanowią część mechanizmu syntezy białka . Wszystkie rodzaje komórkowych RNA są syntetyzowane przez polimerazy RNA zgodnie z instrukcjami przekazywanymi przez matrycę DNA.

5.1.Badanie właściwości kwasów nukleinowych

5.1.1 Hydroliza kwasów nukleinowych, badanie produktów hydrolizy.Zasada : w czasie ogrzewania z kwasami, kwasy nukleinowe ulegają hydrolizie rozpadając się na zasady purynowe i pirymidynowe, kwas fosforowy i pentozę. Przez łagodną hydrolizę, przeprowadzoną zasadami lub enzymami, uzyskuje się większe fragmenty kwasów nukleinowych, mianowicie nukleotydy i nukleozydy.

-38-

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: nukleinian sodu 2 M H2SO4

2 M NaOHDo 2 ml nukleinianu sodu dodać 5 ml 2M H2SO4 i wstawić do wrzącej łaźni na 10 minut.

Hydrolizat zobojętnić 10% NaOH wobec papierka lakmusowego. ¯Następne reakcje wykonujemy na otrzymanym hydrolizacie kwasów nukleinowych !!!

1. Wykrywanie cukrów - reakcja Molischa Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: hydrolizat 10% alkoholowy roztwór - naftolu

H2SO4 stężony

Do około 1 ml hydrolizatu dodać 2 krople 10% alkoholowego roztworu -naftolu i wymieszać. Następnie ostrożnie !, po ściankach probówki dodać około 1 ml stężonego H2SO4, aby powstały dwie, dobrze odgraniczone warstwy. Powstaje fioletowo-czerwony pierścień.

2. Próba Biala z orcyną na pentozyZasada: W obecności soli żelaza (III) furfural powstający z rybozy w środowisku HCl daje z orcyną kompleks o barwie zielonej Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: hydrolizat 0,2% roztwór orcyny w 20% HCl 1% FeCl3

Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl3 i 0,5 ml roztworu hydrolizatu Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone zabarwienie. przeprowadzić

3. Wykrywanie zasad purynowych:Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: 5%NH4OH 5% AgNO3

Do probówki wlać około 1 ml hydrolizatu, a następnie zalkalizować go 5% NH 4OH. Roztwór przesączyć po czym przenieść go do zlewki i zalać 1 ml AgNO 3. W obecności zasad purynowych powstaje brązowy osad

4. Wykrywanie kwasu fosforowego Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: hydrolizat

NH4OH HNO3 stężony roztwór molibdenianu amonu

Do 0,5 ml hydrolizatu dodać amoniaku, aż roztwór stanie się alkaliczny. Następnie zakwasić stężonym HNO3 i dodać 3 ml molibdenianu amonu. Ogrzać do wrzenia, pojawia się żółty osad fosforomolibdenianu amonu.

-39-

5.2.Odróżnienie RNA od DNA

5.2.1. Reakcja orcynolowaZasada: ryboza wolna oraz związana w nukleozydach i nukleotydach ogrzewana ze stężonym

roztworem HCL przechodzi w furfural, który z orcyną i jonami F3+ tworzy trwały kompleks o ciemno- zielonej barwie.Wykonanie oznaczenia :Odczynnik : 0.1%roztwór RNA 0,1%roztwór DNA odczynnik orcynolowy

Do jednej probówki wlać 1 ml roztworu RNA , a do drugiej 1ml DNA a następnie dodać po 1 ml odczynnika orcynolowego i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na około 15 minut. W probówce zawierającej RNA powstaje ciemno-zielone zabarwienie, probówka z DNA pozostaje jasnozielona (reakcja negatywna).

5.2.2. Reakcja z difenyloaminą.Zasada : difenyloamina daje barwny kompleks z deoksyryboząWykonanie oznaczenia:Odczynniki:0,1% roztwór RNA 0,1% roztwór DNA odczynnik difenyloaminowy

Do jednej probówki wlać 1 ml roztworu RNA a do drugiej 1ml DNA a następnie dodać po dodać po 2 ml odczynniki difenyloaminowego. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. W probówce zawierającej DNA powstaje niebieskie zabarwienie. RNA nie wykazuje dodatniego odczynu, próbka pozostaje bezbarwna.

-40-6.LIPIDY

Lipidy występują w komórkach wszystkich organizmów żywych. W organizmach zwierząt są one obecne w większej ilości w różnych komórkach narządach lub w postaci wyodrębnionej tkanki tłuszczowej. Obecność lipidów w pożywieniu jest niezbędna . Pełnią one zarówno funkcje

energetyczne jak i strukturalne. Są one ponadto źródłem i nośnikiem wielu substancji biologicznie czynnych i witamin. Lipidy (tłuszcze) występujące w przyrodzie dzieli się na proste (tłuszcze właściwe, woski) i złożone (fosfolipidy, glikolipidy, sfingolipidy) oraz prekursory i pochodne lipidów (kwasy tłuszczowe, glicerol , sfingozyna).

Lipidy proste (tłuszcze właściwe) są estrami glicerolu i wyższych jednokarboksylowych kwasów tłuszczowych. Glicerol może tworzyć wiązanie estrowe z jedną , dwiema, lub trzema resztami kwasów tłuszczowych. Powstające w ten sposób związki noszą nazwę monoacylo-,diacylo-,lub triacylogliceroli:

Kwasy tłuszczowe występujące w lipidach nadają im odpowiedni charakter fizykochemiczny. Im większa masa cząsteczkowa kwasów tłuszczowych , tym wyższa jest temperatura topnienia lipidów. Temperatura ta będąca jakościowym wyrazem stosunku kwasów tłuszczowych nasyconych do nienasyconych w lipidach maleje wraz ze wzrostem procentowego udziału kwasów nienasyconych. Lipidy o dużej zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych są zazwyczaj ciekłe i oleiste.

Niektóre kwasy tłuszczowe występujące w organizmach zwierzęcych

Liczbaatomówwęgla

Liczbawiązańpodwój-

nych

Nazwapotoczna

Wzór

12

14

16

18

20

0

0

0

0

0

kwas laurynowy

kwa mirystynowy

kwas palmitynowy

kwas stearynowy

kwas arachidowy

CH3(CH2)10COO-

CH3(CH2)12COO-

CH3(CH2)14COO-

CH3(CH2)16COO-

CH3(CH2)18COO-

16

18

18

18

20

1

1

2

3

4

kwas palmitooleinowy

kwas oleinowy

kwas linolowy

kwas linolenowy

kwas arachidonowy

CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COO-

CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COO-

CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6COO-

CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6COO-

CH3(CH2)4(CH=CHCH2))4(CH2)2COO-

-41-

Woski to estry wyższych kwasów tłuszczowych i alkoholi innych niż glicerol .Spełniają w przyrodzie rolę ochronną alkohole i kwasy tłuszczowe wosków są związkami nasyconymi o dłuższych łańcuchach węglowych (od 26 do 42) niż kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach właściwych. Lipidy złożone to materiał budulcowy wszystkich komórek, głównie błon plazmatycznych, a także

monoacyloglicerol diacyloglicerol triacyloglicerol

osłon włókien nerwowych. Występują szczególnie obficie w tkance nerwowej , krwi, limfie, wątrobie żółtku jaj. Łączą je podobne właściwości fizykochemiczne i biologiczne. I. Fosfolipidy – składnikiem alkoholowym jest glicerol którego dwie grupy hydroksylowe zestryfikowane są kwasami tłuszczowymi nasyconymi i nienasyconymi a trzecia kwasem fosforowym. Przedstawicielami są lecytyny oraz kefaliny.

II. Sfingolipidy różnią się pod względem budowy od innych lipidów. Zamiast glicerolu występuje w nienienasycony 18-węglowy aminoalkohol sfingozyna (np. ceramidy, sfingomieliny)

III. Glikolipidy występują we wszystkich tkankach na zewnętrznej stronie błony komórkowej. W ich skład wchodzą sfingozyna, kwas tłuszczowy i reszta oligosacharydowa (cerebrozydy, gangliozydy)

6.1.Reakcje charakterystyczne dla lipidów prostych

6.1.1. Rozpuszczalność lipidówZasada: Lipidy- tłuszcze są nierozpuszczalne w wodzie , natomiast rozpuszczają się w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak eter, chloroform, aceton, gorący alkohol. Przy wytrąceniu lipidów wodą powstaje emulsja, czyli zawiesina kuleczek tłuszczu, które szybko łączą się ze sobą tak, że powstaje wyraźna granica między dolną fazą wodną i górną fazą tłuszczową. Zawiesinę tłuszczu w wodzie można utrwalić przez dodanie substancji absorbujących się na granicy obu faz. Substancje takie, zwane emulgatorami, obniżają napięcie powierzchniowe i powodują rozdrobnienie cząsteczek tłuszczu zawieszonych w wodzie. Działanie emulgujące posiadają białka, sole kwasów żółciowych oraz mydła. Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: olej alkohol aceton chloroform woda

Do dwóch probówek wlać po 1 ml wody, jedną pozostawić zimną, drugą podgrzać nad palnikiem, Do kolejnych probówek wlać w takiej samej ilości (tzn. po 1 ml) alkohol, chloroform i aceton, a następnie do wszystkich probówek dodać po około 0,5 ml oleju. Obserwując roztwory stwierdzić różnicę rozpuszczalności w wyżej wymienionych rozpuszczalnikach.

6.1.2.Badanie składu lipidów prostych –próba akroleinowaZasada : próba ta pozwala wykryć w cząsteczce lipidów prostych obecność glicerolu (trójwodorotlenowy alkohol, dobrze rozpuszczalny w wodzie). Obecność jego wykrywa się przeprowadzając go w nienasycony aldehyd – akroleinę

-42-

H / CH2 — OH C = O ½ -2H2O ½ CH — OH ¾¾¾¾ CH

½ KHSO4 ½½ CH2 — OH CH2

Wynikiem reakcji jest ostra i nieprzyjemna woń będąca połączeniem zapachu SO2 i spalonego tłuszczu. Odwodnienie glicerolu zachodzi pod wpływem kwaśnego siarczanu potasu, który ulega przy tym redukcji do SO2 o charakterystycznym zapachu.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: olej KHSO4 krystaliczny

Do trzech kropli oleju w probówce dodać szczyptę krystalicznego KHSO4, Podgrzać nad palnikiem. Po podgrzaniu wytwarza się po pewnym czasie akroleina, którą poznaje się po charakterystycznym dławiącym zapachu spalonego tłuszczu.

6.1.3. Reakcja zmydlania.Zasada: hydroliza lipidów pozwala na wykazanie obecności kwasów tłuszczowych w cząsteczce tłuszczu. Lipidy pod wpływem podgrzanej pary wodnej ulegają hydrolizie dając glicerol i wolne kwasy tłuszczowe zgodnie z poniższą reakcją:

CH¾O¾CO¾R1 CH2¾OH R1¾COOH½ ½ CH¾O¾CO¾R2 + 3H2O CH¾OH + R2¾COOH½ ½ CH¾O¾CO¾R3 CH2¾OH R3¾COOH

Triacyloglicerol glicerol kwasy tłuszczowe

Rozkład ten można również osiągnąć za pomocą hydrolizy zasadowej (KOH lub NaOH), z tym że otrzymuje się wówczas odpowiednie sole kwasów tłuszczowych nazywane mydłami, a sam proces nosi miano zmydlania tłuszczu. Sole sodowe i potasowe kwasów tłuszczowych dobrze rozpuszczają się w wodzie , tworząc micelarne roztwory koloidowe.

CH2-O- CO-(CH2)16 — CH3 CH2- OH½ ½CH-O- CO- (CH2)16 — CH3 + 3NaOH ¾ CH – OH + 3 CH3(CH2)16 COONa½ ½CH2- O- CO- (CH2)16 — CH3 CH2- OH

Trójstearynian glicerolu glicerol stearynian sodu

Mydła tworzą koloidy hydrofilowe lub hydrofobowe w zależności od środowiska. W roztworze wodnym grupy polarne (¾COONa) skierowane są na zewnątrz a rodniki hydrofobowe (węglowodorowe) do wnętrza micelarnych kuleczek mydła. W rozpuszczalnikach organicznych układ tych grup jest odwrotny (mielca odwrócona). Grupy hydrofilowe i hydrofobowe mydła ustawiają się zatem w charakterystyczny sposób na granicy faz i zmniejszają napięcie powierzchniowe. Związki zmniejszające napięcie powierzchniowe są dobrymi emulgatorami poza mydłami należą do nich detergenty i kwasy żółciowe.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: margaryna 2 M NaOH H2O

W erlenmajerce umieścić kawałek margaryny i ogrzewać na płytce nad palnikiem z 10 ml wody i 2 ml (2M) NaOH. Po pewnym czasie powstaje klarowny, lekko opalizujący i pieniący się roztwór: jest to mydło sodowe .

-43-

Na otrzymanym roztworze mydła sodowego wykonać poniższe reakcje !!!!

a. wysalanie mydełZasada: jest to odwracalny proces fizyczny, polegający na odwodnieniu koloidalnych cząsteczek

mydła. Cząsteczki mydła są otoczone warstewką wody związanej, dzięki czemu utrzymują się w roztworze. Dodanie do roztworu mydła dobrze rozpuszczalnej, obojętnej soli powoduje odwodnienie koloidalnych cząsteczek mydła, zmniejsza ich rozpuszczalność i następuje wytrącenie mydła w postaci osadu. Po dodaniu wody mydło rozpuszcza się ponownie.

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania) NaCl in substantia

Do 2 ml mydła dodać NaCl in substantia, aż do nasycenia. Wytrąca się mydło wysolone w postaci osadu. Płyn znad osadu odlać , a do osadu czyli wytrąconego mydła dodać wody. Mydło rozpuszcza się.

b. wytrącanie wolnych kwasów tłuszczowychZasada : pod wpływem kwasów (siarkowego lub solnego) z mydeł zostają uwalniane kwasy tłuszczowe:

2 CH3(CH2)16COONa + H2SO4 ¾ 2CH3(CH2)16COOH + Na 2SO4

mydło stearynowe kwas stearynowy

Wydzielone kwasy tłuszczowe po ogrzaniu do wrzenia zbierają się na powierzchni roztworu i po oziębieniu tworzą „plaster”. Kwasy te są nierozpuszczalne w wodzie, rozpuszczają się jedynie w alkoholu, eterze, chloroformie i chloroformie tłuszczach.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania) papierki lakmusowe H2SO4 stężony

Do probówki nalać około 3 ml mydła, zakwasić go (wobec papierka lakmusowego) stężonym kwasem siarkowym. Po ogrzaniu na powierzchni tworzy się warstwa wytrąconych kwasów tłuszczowych, która po oziębieniu krzepnie.

c. działanie emulgujące mydełZasada: mydła zawierają w swej cząsteczce grupę hydrofobową ( łańcuch węglowodorowy), nie rozpuszczającą się w wodzie tylko w tłuszczach oraz grupą hydrofilową (grupa karboksylowa – COOH) łatwo rozpuszczalną w wodzie. Mydła w roztworze umieszczają się na granicy fazy wodnej i tłuszczowej, przy czym ich dysocjowane grupy COOH, naładowane ujemnie łączą się z wodą, a grupy hydrofobowe rozpuszczają się w kuleczkach tłuszczu. W wyniku tego zostaje zniesiona granica faz, poszczególne kuleczki tłuszczu nie łączą się z sobą i powstaje emulsja tłuszczowa. Emulsja jest formą cieczy złożonej z dwu, nie mieszających się z sobą faz – rozproszonej i rozpraszającej. Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania) olej H2O

Do probówki wlać 1 ml oleju a następnie dodać 5 ml wody i 1 ml mydła. Po wytrząśnięciu w probówce tworzy się trwała emulsja tłuszczowa. Do drugiej probówki wlać 1 ml oleju i tylko 5 ml wody, a następnie mocno wytrząsnąć . Utworzy się nietrwała emulsja tłuszczowa.

-44-

6.1.4. Wykazanie obecności w lipidach nienasyconych kwasów tłuszczowych – reakcja H ü bla Zasada: podwójne wiązania nienasyconych kwasów tłuszczowych nadają im specyficzne cechy chemiczne. W miejscach „nienasycenia” kwasy tłuszczowe przyłączają łatwo atomy wodoru, tlenu i innych pierwiastków , np., chlorowców ulegając przy tym przekształceniu w pochodne kwasów nienasyconych. Specjalne znaczenie ma przyłączenie J2, ponieważ reakcja jodowania jest kryterium

jakościowej charakterystyki lipidów. Reakcja ta pozwala na oznaczenie liczby wiązań podwójnych w lipidach i kwasach tłuszczowych.

CH3(CH2)n – CH=CH(CH2)n1 COOH + J2 CH3(CH2))n- CH- CH – (CH2)n1COOH ½ ½ J J kwas tłuszczowy kwas dwujodotłuszczowyReakcja powyższa została wykorzystana w próbie Hübla, w której w obecności chlorku rtęciowego HgCl2 następuje przyłączenie jodu w miejscu podwójnego wiązania kwasu tłuszczowego. Po dodaniu do kwasu tłuszczowego roztworu Hübla I (alkoholowy roztwór jodu), roztwór zabarwia się na kolor brunatno-brązowy. Pod wpływem roztworu Hübla II (alkoholowy roztwór HgCl2) następuje wbudowanie jodu w cząsteczkę kwasów tłuszczowych i mieszanina odbarwia się.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: olej odczynnik Hübla I (2,6% alkoholowy roztwór jodu) odczynnik Hübla II (3% alkoholowy roztwór HgCl2)

Do 2 ml oliwy dodać kroplami odczynnik Hübla I. Roztwór zabarwia się na kolor brunatno-brązowy. Następnie wkropić odczynnik Hübla II. Następuje odbarwienie roztworu.

6.1.5. Utlenianie wiązania podwójnego. Zasada: Jeżeli na lipidy zawierające kwasy tłuszczowe nienasycone podziała się substancją utleniającą , dochodzi do rozerwania wiązania podwójnego z równoczesnym utlenieniem znajdujących się w jego sąsiedztwie atomów węgla, kwas rozpada się na krótsze związki – w ten sposób można określić miejsce położenia wiązania podwójnego cząsteczce kwasu. Jako substancję utleniającą używa się nadmanganian potasu (KMnO4) , w którym mangan w środowisku obojętnym przechodzi ze stopnia utlenienia +7 na stopień utlenienia +4Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: olej 1 mol/l Na2CO3

0,01 mol/l KMnO4

Do probówki wlać parę kropli oleju a następnie dodać 3 ml Na2CO3. Mieszaninę lekko podgrzać. Po czym dodać kroplami KMno4, aż do utworzenia brunatnego osadu dwutlenku manganu (MnO2)).

6.2.Tłuszcze złożone- badanie składu lecytyn Lecytyny (fosfatydylocholiny) zbudowane są z cząsteczki glicerolu estryfikowanego dwoma cząsteczkami kwasów tłuszczowych (nasyconego i nienasyconego) oraz z jednej cząsteczki kwasu fosforowego estryfikowanego aminoalkoholem choliną (trimetyloetanolamina). Istnieje szereg odmian lecytyn, różniących się między sobą rodnikami kwasów tłuszczowych oraz położeniem kwasu fosforowego.

fosfatydylocholina -45-

-

Lecytyny są substancjami żółtymi, woskowatymi. Na powietrzu łatwo się utleniają . Są to związki higroskopijne, łatwo rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych oraz w wodnych roztworach kwasów żółciowych. Nie rozpuszczają się w acetonie i wodzie z którą tworzą lepkie koloidalne roztwory.

6.2.1.Wykrywanie gliceroluNa suchej lecytynie wykonać reakcje akroleinową na obecność glicerolu.

6.2.2.Wykrywanie kwasów tłuszczowych:Zasada: pod wpływem NaOH lecytyna ulega hydrolizie i tworzą się sole sodowe kwasów tłuszczowych oraz powstająca z choliny trimetyloamina N(CH3)3

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: lecytyna 20% NaOH

Umieścić kilka granulek lecytyny w probówce i nalać około 3 ml 20% NaOH. Ogrzewać przez kilka minut. Podczas ogrzewania czuć woń trimetyloaminy. W roztworze tworzą się mydła.

6.2.3.Wykrywanie kwasu fosforowegoZasada: podczas utleniania lecytyny w wysokiej temperaturze wszystkie jej składniki ulegaja utlenieniu na substancje lotne. Fosfor jako ciało stałe pozostaje na dnie probówki, a po rozpuszczeniu w rozcieńczonym HNO3 można go wykryć molibdenianem amonu, z którym tworzy żółty osad fosforomolibdenianu amonu Wykonanie oznaczenia Odczynniki: lecytyna mieszanina do spalań (KNO3 + K2CO3 w stosunku. 2:3) HNO3 rozcieńczony molibdenian amonu

Do probówki wsypać kilka granulek lecytyny dodać dwukrotnie większą ilość mieszaniny do spalań i trzymać nad płomieniem palnika tak długo, aż zawartość probówki przyjmie czarne zabarwienie. Pozostałość w probówce rozpuścić w rozcieńczonym kwasie azotowym Zawartość probówki przesączyć. Do otrzymanego przesączu wlać niewielką ilość molibdenianu amonu, aż do uzyskania żółtego zabarwienia.

-46-

7. CHOLESTEROL

Cholesterol ( 5 cholesten-3--ol) wchodzi w skład lipidów budulcowych ustroju . Jest głównym sterolem zwierzęcym. Wywodzi się on z 27-węglowego układu cholestenu i posiada jedno wiązanie podwójne w pozycji 5 oraz grupę hydroksylową w pozycji 3.

Cholesterol występuje w komórkach wszystkich tkanek i narządów, przeważnie jako wolny, ale także może być związany estrowo z kwasami tłuszczowymi. Wolny cholesterol stanowi niezbędny składnik błon cytoplazmatycznych i błon organellowych.W obrębie cytoplazmy cholesterol może być magazynowany w postaci pęcherzyków zawierających estry cholesterolu. Najwięcej tych pęcherzyków jest w komórkach kory nadnerczy oraz gonad gdzie cholesterol jest substratem koniecznym do syntezy hormonów steroidowych. W wątrobie z cholesterolu powstają kwasy żółciowe.

7.1.Reakcje charakterystyczne dla cholesterolu :

7.1.1 Reakcja SalkowskiegoZasada: Po podwarstwieniu chloroformowego roztworu cholesterolu stężonym kwasem siarkowym, faza dolna kwasu fluoryzuje na zielono, natomiast warstwa górna chloroformowa barwi się na czerwono. .Przypuszcza się , że barwa reakcji pochodzi od utworzonych dodatkowo wiązań podwójnych lub kondensacji dwu cząsteczek cholesteroluWykonanie oznaczenia:Odczynniki: cholesterol chloroform H2SO4 stężony

Niewielką ilość cholesterolu wsypać do suchej probówki (obecność wody przeszkadza w reakcji !) i dodać 2 ml chloroformu , a następnie bardzo ostrożnie po ściankach probówki wlać 2 ml stężonego kwasu siarkowego tak , aby płyny nie zmieszały się. Otrzymaną reakcję oglądać pod lampa kwarcową !. Warstwa dolna kwasu siarkowego wykazuje zabarwienie żółte z zieloną fluorescencją, natomiast warstwa górna , chloroformowa jest zabarwiona na czerwono.

6.1.2.Reakcja Libermana – BurchardaWykonanie oznaczenia:Odczynniki: cholesterol chloroform bezwodnik kwasu octowego H2SO4 stężony

W suchej probówce szczyptę cholesterolu rozpuścić w 2 ml chloroformu i dodać 10 kropli bezwodnika kwasu octowego, następnie bardzo ostrożnie wlać po ściankach probówki 1-2 kropli stężonego kwasu siarkowego. Roztwór zabarwia się kolejno na czerwono- fiołkowo- niebiesko- zielono.

47-

8 .KWASY ŻÓŁCIOWE.

Sole kwasów żółciowych są polarnymi pochodnymi cholesterolu. Związki te są wysoce efektywnymi detergentami, ponieważ ich cząsteczki zawierają zarówno polarne, jak i niepolarne rejony. Sole kwasów żółciowych są syntetyzowane w wątrobie, magazynowane, zagęszczane w pęcherzyku

żółciowym i uwalniane stamtąd do jelita cienkiego. Sole te, będące głównym składnikiem żółci, działają emulgująco na tłuszcze pokarmowe. Skuteczne zwiększenie powierzchni cząsteczek lipidów ma dwie konsekwencje: ułatwia hydrolizę tłuszczów przez lipazy i ich wnikanie do ściany jelita. Sole kwasów żółciowych są również głównym produktem rozpadu cholesterolu.

8.1.Reakcje charakterystyczne dla kwasów żółciowych:

8.1.1.Próba HayaZasada: kwasy żółciowe obniżają napięcie powierzchniowe cieczy – siarka lub talk w obecności żółci nie utrzymuje się na powierzchni , lecz szybko opada na dnoWykonanie oznaczenia:Odczynniki: rozcieńczona żółć talk H2ODo 2 probówek wlać po 5 ml wody. Do jednej dodać kroplę żółci i dokładnie wymieszać. Do obu probówek wsypać szczyptę talku. W probówce do której dodano żółć (czyli kwasy żółciowe) talk szybko opada na dno, natomiast probówce gdzie jest tylko woda talk utrzymuje się na powierzchni.

8.1.2.Emulgujące działanie żółciZasada: obniżenie napięcia powierzchniowego w obecności kwasów żółciowych umożliwia tworzenie się emulsji.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: rozcieńczona żółć olej H2ODo 2 probówek nalać po 5 ml wody i 5 kropli oliwy. Do jednej z nich dodać 3 krople żółci – obie probówki silnie wstrząsnąć i odstawić. Po paru minutach w probówce bez żółci nastąpi rozdzielenie warstw wody i oliwy, natomiast w probówce drugiej powstaje zawiesina tłuszczu.

8.1.3. Próba Pettenkofera Zasada: w środowisku silnie kwaśnym fruktoza tworzy 5-hydroksymetyelenofurfural, który kondensuje z kwasami żółciowymi na barwne pochodne

-48-

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: rozcieńczona żółć fruktoza lub sacharoza H2SO4 stężony

Do 1 ml rozcieńczonej żółci dodać kilka kryształków fruktozy lub sacharozy i po rozpuszczeniu cukru

Sole kwasów żółciowych

Kwas glikocholowy

Kwas taurocholowy

ostrożnie po ściankach probówki wlać około 1 ml stężonego kwasu siarkowego Na pograniczu obu warstw tworzy się czerwony pierścień.

9.HORMONY STEROIDOWE

Cholesterol jest prekursorem pięciu głównych klas hormonów steroidowych: progestagenów, glukokorykoidów, mineralokortykoidów, androgenów i estrogenów.

cholesterol (C27)¯

pregnenolon (C21)¯

progestageny (C21)

glikokortykoidy (C21) androgeny (C19)

mineralokorykoidy (C21)

estrogeny (C18)

Progesteron, hormon grupy progestagenów, przygotowuje podłoże macicy do umiejscowienia jaja. Progesteron jest również niezbędny do utrzymania ciąży. Androgeny (testosteron, androsteron, androstendion) są odpowiedzialne za rozwój drugorzędowych męskich cech płciowych, natomiast estrogeny (estradiol, estron, estriol)konieczne do wytworzenia drugorzędowych cech płciowych żeńskich. Estrogeny wspólnie z progesteronem uczestniczą również w cyklu owulacyjnym. Glikokorykoidy (kortyzol, kortyzon, kortykosteron) pobudzają glukoneogenezę i tworzenie glikogenu oraz wzmagają rozkład tłuszczu i białka. Umożliwiają reakcję zwierząt na stres . Mineralokortykoidy (głównie aldosteron) powodują zwiększenie resorpcji Na+ i wydzielanie K+ i H+

przez kanaliki nerkowe, co prowadzi do wzrostu objętości i ciśnienia krwi.

Głównymi miejscami syntezy tych grup hormonów są dla : progestegenów – ciałko żółte, estrogenów – jajnik, androgenów – jądra, glukokortykoidów i mineralokortykoidów – kora nadnerczy.

Synteza progesteronu i kortykoidów.

Progesteron jest syntetyzowany z pregnenolonu w dwóch etapach. Grupa 3-hydroksylowa pregnenolonu jest utleniania do grupy 3-ketonowej i wiązanie r5 izomeryzuje do wiązania r4

. . Koryzol , główny glukokortykoid tworzy się z progesteronu przez hydroksylację przy C-17, C-21, i C-11.Początkowym etapem syntezy aldosteronu, głównego mineralokortykoidu jest hydroksylacja progesteronu przy C-21. Powstały deoksykortykosteron jest hydroksylowany przy C-11. Kątowa grupa metylowa C-18 zostaje utleniona do aldehydu i powstaje aldosteron.

-49-

Synteza androgenów i estrogenówSynteza androgenów rozpoczyna się od hydroksylacji progesteronu przy C-17. Boczny łańcuch zawierający C-20 i C-21 jest odszczepiany i powstaje androstendion. Testosteron jest tworzony przez redukcję grupy ketonowej przy C-17 androstendionu. Estrogeny są syntetyzowane z androgenów przez usunięcie kątowej grupy metylowej przy C-19 i utworzenie aromatycznego pierścienia A. Z androstendionu powstaje estron , natomiast estradiol powstaje z testosteronu.

-50-

9.1.Reakcje charakterystyczne dla hormonów steroidowych:

9.1.1.Reakcja Zimmermanna

Zasada: w środowisku alkalicznym 17-ketosteroidy (androsteron, androstendion, dehydroepiandrosteron) kondensują z m-dwunitrobenzenem na pochodne o barwie fiołkowo-różowej.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki :alkohol etylowy absolutny (100%) 96% alkohol etylowy 2% m-dwunitrobenzen 2,5 mol/l KOH w alkoholu etylowym

Do probówki wsypać około 10mg androsteronu, a następnie dodać kolejno przy pomocy pipety automatycznej (200ml)

1. 0,2 ml alkoholu etylowego absolutnego (100%)2. 0,2 ml 2% m-dwunitrobenzenu3. 0,2 ml 2,5mol/lKOH,

po czym inkubować roztwór przez okres minimum 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po tym okresie w celu zahamowania reakcji dodać 1 ml 96% alkoholu etylowego.Powstaje zabarwienie fiołkowo-różowe.

9.1.2.Reakcja Kobera Zasada: w obecności stężonego kwasu siarkowego, estrogeny z hydrochinonem tworzą różowo-żółte zabarwienie o zielonej fluorescencji. Jest to reakcja specyficzna dla aromatycznego pierścienia A estrogenów.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: estradiol odczynnik Kobera (70%H2SO4 + hydrochinon)

Do probówki wlać około 10 ml estradiolu i dodać 2 ml odczynnika Kobera. Następnie ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 20 minut. Po tym okresie oziębić probówkę pod bieżącą zimną wodą. Po oziębieniu dodać 0,2 ml H2O i ponownie wstawić do wrzącej łaźni wodnej na okres 10 minut. Po oziębieniu powstaje żółto- kremowe zabarwienie które pod lampa kwarcową daje zieloną fluorescencję .

9.1.3.Reakcja Portera-SilberaZasada: jest to reakcja charakterystyczna tylko dla 17-hydroksykortykosteroidów, czyli posiadających grupę hydroksylową przy C17 (kortyzon, kortyzol). Z chlowodorkiem fenylohydrazyny, w obecności kwasu siarkowego powstaje żółty hydrazyn.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: kortyzol lub kortyzon odczynnik Portera-Silbera (chlorowodorek fenylohydrazyny + kwas siarkowy)

Do probówki wlać około 10 ml kortyzolu a następnie dodać 1 ml odczynnika Portera_Silbera. Probówkę wstawić do gorącej łaźni wodnej na około 5 minut, powstaje żółte zabarwienie.

9.1.4.Reakcja z błękitem tetrazoliowym.Zasada: reakcję tę dają wszystkie kortykosteroidy posiadające ugrupowanie -ketalowe w łańcuchu bocznym przy C17 ( kortyzol, kortyzon, aldosteron). Redukują one błękit tetrazoliowy do różowego , a przy dużych ilościach sterydu do niebieskiego formazonu.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: kortyzol lub kortyzon roztwór błękitu tetrazoliowego (1mg błękitu w 1ml 2mol/l NaOH)

Do probówki wlać 10 ml kortyzolu po czym dodać 1 ml roztworu błękitu tetrazoliowego. Powstaje różowe zabarwienie.

-51-

10.HEMOGLOBINA

Warunkiem wiązania tlenu przez hemoglobinę, białka należącego do grupy hemoprotein jest

obecność jednostki niebiałkowej, a mianowicie grupy hemowej. Składa się ona z części organicznej i atomu żelaza. Część organiczna protoporfiryna, zbudowana jest z czterech pierścieni pirolowych, połączonych mostkami metanowymi w pierścień tetrapirolowy. Do tego pierścienia przyłączone są łańcuchy boczne, z których cztery są grupami metylowymi, dwa – grupami winylowymi i dwa – resztami kwasu propionowego.

Atom żelaza w grupie hemowej , umieszczony w centrum pierścienia protoporfiryny, wiąże się z czterema atomami azotu wiązaniami koordynacyjnymi, piąte wiązanie – z tlenem (zachodzi proces utlenowania), a szóste wiązanie koordynacyjne służy do połączenia z białkiem przez pierścień imidazolowy histydyny.

W procesie utlenowania stopień utlenienia żelaza nie zmienia się, powstaje oksyhemoglobina (Hb-O2). W przypadku utleniania żelazo zmienia swój stopień utlenienie z Fe+2 do Fe+3 z jednoczesnym przyłączeniem cząsteczki H2O, powstaje methemoglobina (Met-Hb).Hemoglobina jest przenośnikiem tlenu w organiźmie w postaci oksyhemoglobiny. tj. hemoglobiny utlenowanej. Cząsteczka hemoglobiny może przyłączyć 4 cząsteczki tlenu atmosferycznego, 1g hemoglobiny wiąże 1,36 ml tlenu. Proces utlenowania hemoglobiny i trwałość powstałej oksyhemoglobiny zależy od ciśnienia parcjalnego tlenu, tzn. od jego stężenia.Oksyhemoglobina pod działaniem kwasów, zasad i rozpuszczalników organicznych, jak etanol lub aceton, przechodzi w parahematynę, inaczej nazywaną hemichromogenem. Część białkowa jest tu zdenaturowana, a żelazo – w postaci Fe+3. Redukując hemichromogen otrzymuje się hemochromogen, zbudowany z hemu i zdenaturowanej globiny .

-52-

Grupa winylowa

Grupa metylowa

Reszta kwasu propionowego

Sposób połączenia hemu z białkiem

Hematyna może powstać z hemoglobiny przez działanie na nią zasadą (hematyna zasadowa) lub kwasem (hematyna kwasowa), w warunkach tlenowych, zawiera ona Fe+3 i nie ma części białkowej. Zarówno kwasy, jak i zasady rozbijają hemoglobinę, przy czym uwolniony hem utlenia się tlenem z Hb-O2 na hematynę, a globina ulega denaturacji. Oksyhemoglobina pod działaniem gorącego stężonego roztworu CH3COOH i NaCl traci białko i w ten sposób powstaje hemina z żelazem Fe+3.. Hemina rozpuszczona w wodorotlenku przechodzi w hematyną zasadową.Łagodne, nie denaturujące globinę, środki utleniające hemoglobinę, jak H2O2,, , K3[Fe(CN)6],KMnO4, zmieniaja ją w methemoglobinę (Met-Hb), w której zamiast hemu występuje hematyna z żelazem Fe+3

HbO2 + [Fe(CN)6]3- ¾¾¾ Met-Hb + [Fe(CN)6]2- + O2

Barwniki hematynowe nie wiążą tlenu, CO i dają barwne pochodne z cyjankami (cyjanomethemoglobina). Trujące działanie cyjanków polega na blokowaniu układu hemowego enzymów biorących udział w utlenieniach tkankowych. Z hemoglobiną 300-krotnie silniej niż tlen łączy się tlenek węgla, w wyniku czego powstaje hemoglobina tlenkowowęglową,- karboksyhemoglobina (Hb-CO). Zdolność wiązania CO mają chromoproteiny zawierające hem, natomiast proteiny hemetynowe właściwości tej nie wykazują. Silne toksyczne działanie tlenku węgla wiąże się z wyłączeniem hemoglobiny z udziału w transportowaniu tlenu i blokadą oksydazy cytochromowej, uczestniczącej w utlenianiu tkankowym.

10.1.Wykrywanie oraz oznaczanie hemoglobin i jej pochodnych:

10.1.1.Otrzymywanie methemoglobinyWykonanie oznaczenia:Odczynniki: krew (nie rozcieńczona) K3[Fe(CN)6] Do probówki wlewamy około 0,5 ml krwi nie rozcieńconej a następnie dodajemy parę kropli roztworu heksacyjanożelazianu (żelazicyjanku) potasowego K3[Fe(CN)6]. Pod działaniem tego środka utleniającego Hb-O2 przechodzi w Met-Hb. Krew przybiera zabarwienie brunatne.

10.1.2.Otrzymanie hematyny kwasowejWykonanie oznaczenia:Odczynniki: 10-krotnie rozcieńczona krew 2 MHCL

-53-

Do probówki wlać 2 ml rozcieńczonej krwi , następnie dodać 3-4 krople 2M HCl. Roztwór zmienia barwę na brunatną ponieważ hemoglobina ulega rozkładowi na globinę i hematyną kwasową. Z hematyny w obecności jonów Cl- tworzy się chlorowodorek hematyny – hemina.

10.1.3.Otrzymanie hematyny zasadowej i hemochromogenuWykonanie oznaczenia:Odczynniki:10-krotnie rozcieńczona krew 5%NaOH Na2S2O3krystaliczny

Do probówki wlać około 2 ml rozcieńczonej krwi dodać 5 kropli 5% NaOH i łagodnie podgrzać. Zawartość probówki przybiera zabarwienie brunatne wskutek utworzenia hematyny zasadowej. Po dodaniu kilku kryształków Na2S2O4 barwa zmienia się na czerwoną w wyniku powstania hemochromogenu. Reakcję oglądać pod światłem!. Dwutionian sodu redukuje hematynę do hemu , który ze zdenaturowaną globiną tworzy hemochromogen.

10. PRODUKRY ROZKŁADU HEMU

Normalne krwinki czerwone (erytrocyty) człowieka żyją około 120 dni. Stare komórki są usuwane z obiegu i rozkładane przez śledzionę. Część białkowa hemoglobiny ulega hydrolizie do składników – aminokwasów. Pierwszy etap rozpadu grupy hemowej do bilirubiny to rozszczepienie jej mostka -metinowego i utworzenie biliwerdyny, łańcuchowego tetrapirolu. Powstająca biliwerdyna (o barwie zielononiebieskiej) występuje w dwóch formach tautomerycznych ; jedna z nich zawiera dwie grupy –OH na końcu układu, zaś druga dwie grupy karbonylowe. W następnej reakcji biliwerdyna pod wpływem specyficznej reduktazy biliwerdyny współdziałającej z NADPH + H+ , jest zredukowana do bilirubiny ( o barwie pomarańczowo-żółtej).

Degradacja hemu do bilirubiny

-54-

Bilirubina wytworzona w śledzionie oraz w innych tkankach poza wątrobowych musi być dostarczona do wątroby , tam bowiem zachodzi jej dalszy metabolizm. Tak więc bilirubina w kompleksie z albuminą surowicy jest transportowana do wątroby, gdzie staje się bardziej rozpuszczalna przez przyłączenie reszt cukru . Produkt sprzężenia bilirubiny z dwoma glukuronianami, zwany diglukuronidem bilirubiny , dostaje się do żółci, a następnie wraz z nią przedostaje się do jelita.

W ostatnim odcinku jelita cienkiego i na początku jelita grubego, pod wpływem bakteryjnej hydrolizy następuje hydroliza mono- jak i diglukuronianów bilirubiny. Uwolniona wtedy bilirubina jest następnie zredukowana do mezobilirubiny (związku o barwie żółtej). W trakcie dalszych reakcji następuje redukcja grup metanowych, a także dochodzi do likwidacji wiązań podwójnych w pierścieniach pirolowych, co ostatecznie prowadzi do powstania bezbarwnego urobilinogenu ( zwanego także sterkobilinogenem). Większość tworzonego urobilinogenu jest w jelicie grubym przy udziale enzymów bakteryjnych utleniana do barwnej urobiliny i wydalana z kałem.

-55-

11.1.Reakcje charakterystyczne dla barwników żółciowych

11.1.1.Próba GmelinaZasada: stężony kwas azotowy utlenia barwniki żółciowe na pochodne o zmieniającej się barwie od zielonej, poprzez niebieską, fioletową, czerwoną do żółtej. Barwy te odpowiadają kolejnym produktom utlenienia bilirubiny.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki rozcieńczona żółć HNO3 stężony

Do probówki wlać około 1 ml rozcieńczonej żółci, a następnie bardzo ostrożnie! po ściankach probówki wlać 1 ml stężonego kwasu azotowego. Ostrożnie ,ale bardzo dokładnie wymieszać zawartość probówki.. Po 5 do 10 minutach na pograniczu obu płynów powstaje warstwa czerwona i zielona.

11.1.2 .Próba RosinaZasada: próba polega na utlenieniu barwników żółciowych barwnikiem utleniającym w tej reakcji jest roztwór jodu.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: rozcieńczona żółć 5% roztwór jodu

Do probówki wlać około 1 ml rozcieńczonej żółci, a następnie ostrożnie dodać 2-3 kropli jodu. Bilirubina utlenia się na zieloną biliwerdynę.

11.1.3 Próba Cole’a Zasada: barwniki żółciowe mogą zostać zaadsorbowane przez siarczan baru (BaSO4) w kwaśnym, etanolowym roztworze. Dodając chloran potasu (KClO3), można utlenić bilirubinę i biliwerdynę na połączenie o charakterystycznym niebieskim zabarwieniu. Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: rozcieńczona żółć MgSO4 nasycony 10%BaCl2

etanol H2SO4 stężony 2%KClO3

W erlenmajerce zagotować 5 ml żółci, następnie dodać 2 krople nasyconego MgSO4 i około 1ml 10% chlorku baru (BaCl2). Wytrąca się osad. Roztwór z osadem ponownie zagotować. Po zagotowaniu przesączyć roztwór do probówki. Pobrać trochę osadu z sączka przy pomocy bagietki szklanej lub metalowej do kolejnej probówki , dodać 4 ml etanolu oraz 3 krople stężonego H 2SO4 i kroplę KCLO3. Nie mieszać!!!!.Gotować na płytce nad palnikiem przez 30 sek., po czym odstawić probówkę na 2 -5 minut. Po opadnięciu osadu BaSO4 warstwa etanolu zabarwia się na kolor zielono –niebieski. Jest to utleniona bilirubina i biliwerdyna.

11.1.4.Próba SchlesingeraZasada: jest to próba pozwalająca wykryć obecność urobiliny w moczu, jako produkt utleniania urobilinogenu. Urobilina z solami cynku daje zieloną fluorescencję.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: mocz 5 % roztwór J2

10% alkoholowy roztwór octanu cynku

Do probówki wlać około 3 ml moczu a następnie dodać 1-3 kropel 5% roztworu jodu. Odstawić na 5 minut , po czym dodać 3 ml 10% roztworu octanu cynku. Wymieszać i pozostawić do opadnięcia osadu .Oglądać zieloną fluorescencję pod lampą kwarcową !

-56-

12.WITAMINY

Witaminy są cząsteczkami organicznymi, niezbędnymi w małych ilościach w pożywieniu zwierząt wyższych. Spełniają one prawie taka sama rolę we wszystkich organizmach , ale tylko zwierzęta wyższe utraciły zdolność ich syntezy. Witaminy dzielimy na rozpuszczalne w wodzie i rozpuszczalne w tłuszczach Rozpuszczalnymi w wodzie są: witamina C, grupa związków znana jako witaminy B kompleks oraz witamina H.Witamina C to zjonizowana forma kwasu askorbinowego. Objawem awitaminozy kwasu askorbinowego jest schorzenie nazywane szkorbutem (gnilecem). Są to uszkodzenia naczyń włosowatych i związane z tym krwawienie dziąseł i wypadaniem zębów. Występuje głownie w świeżych owocach i warzywach. Kwas askorbinowy spełnia w organizmie funkcje czynnika redukujcego w wielu reakcjach do których zalicza się syntezę kolagenu, amin katecholowych oraz biosyntezę kwasów żółciowych.

Tiamina (witamina B1, aneuryna) Pirofosforan tiaminy jej ufosforylowana forma jest koenzymem transferaz. Awitaminoza witaminy B1, nosi nazwę beri-beri i występuje przy odżywianiu się wyłącznie odtłuszczonym ryżem. Jest poważnym problemem w krajach Dalekiego Wschodu. Podczas tej choroby występują schorzenia neurologiczne i kardiologiczne, które objawiają się uszkodzeniami obwodowego układu nerwowego, bólem nóg i rąk, osłabieniem mięśni i zmianami wrażliwości skóry Serce może być powiększone i występuje niewydolność krążenia. Beri-beri jest schorzeniem które spotkać można u chronicznie niedożywionych alkoholików.

Ryboflawina (witamina B2) jest grupa czynną koenzymów oksydoredukcyjnych (FMN, FAD) Awitaminoza tej witaminy powoduje u zwierząt zahamowanie wzrostu i schorzenia skórne, u człowieka są to zapalenia skóry oraz zmiany zapalne w okolicy warg.

-57-

Amid kwasu nikotynowego (niacyna, witamina PP) to amid kwasu pirydyno-3-karboksylowego jest grupą czynną koenzymów osydoredukcyjnych (NAD+, NADP+). Niedobór kwasu nikotynowego prowadzi do zmian skórnych zwanych pelegrą oraz do biegunki i delirium.

Kwas pantotenowy (kompleks B2) jest dwupeptydem , który w połączeniu z cysteaminą tworzy pantoteinę będącą składnikiem koenzymu A. Pełni funkcję jego prekursora. Brak kwasu pantotenowego powoduje siwienie włosów u szczurów, pelagrę u drobiu. U człowieka jednak objawy nie są znane.

Folian (kompleks B2 ) jest pochodną pterydyny, a formą czynną biochemicznie jest kwas tetrahydrfoliowy , który jest koenzymem transferaz. U człowieka niedobór folianu objawia się przede wszystkim zamianami obrazu krwi – anemią. Przyczyną tych zmian patologicznych jest nie tyle niedobór folianu w pokarmie , ile zaburzenia w jego wykorzystaniu..

Pirydoksyna (witamina B6) jest pochodną pirydyny i stanowi składnik fosforanu pirydoksalu, będącego ważnym koenzymem w przemianie aminokwasów .Niedobór witaminy B6 nie daje typowego obrazu chorobowego. U dzieci obserwowane są drgawki epileptyczne, które spowodowane są zaburzeniami w przemianie kwasu glutaminowego. Niekiedy występują również objawy łojotoku .

-58-

Kobalamina (B12) jest czynnikiem zapobiegającym anemii złośliwej. Już małe jej ilości leczą u człowieka objawy tej choroby, która przejawia się znacznym zmniejszeniem ilości erytrocytów we krwi. Awitaminoza ta spowodowana jest jednak nie brakiem witaminy w pożywieniu, a zaburzeniami w resorpcji jej z przewodu pokarmowego .Pochodne kobalaminy uczestniczą w reakcjach przekształceń wewnątrzcząsteczkowych. Funkcjonują miedzy innymi jako koenzymy w reakcji przekształcania metylomalonylo-CoA do bursztynylo-CoA

-Biotyna (witamina H) jest koenzymem transferaz.. U zwierząt objawy awitaminozy polegają na zmianach skórnych i wypadaniu włosów. Awitaminozę tę powoduje podawanie specyficznego białka awidyny (białko jaja kurzego) które silnie wiąże biotynę i w ten sposób ją inaktywuje.

Rozpuszczalne w tłuszczach to witaminy A, D, E i K

Witamina A (retinol) jest prekursorem retinolu, wrażliwej na światło rodopsyny i innych barwników wzrokowych. Brak tej witaminy prowadzi do niedowidzenia o zmierzchu (tzw. kurzej ślepoty). Ponadto młode zwierzęta potrzebują witaminy A do wzrostu. Kwas retinowy, aktywuje transkrypcję specyficznych genów, które pośredniczą we wzroście i rozwoju.

-59-

Cholesterol jest prekursorem witaminy D , która odgrywa zasadniczą rolę w kontrolowaniu metabolizmu wapnia i fosforu. 7-dehydrocholesterol (prowitamina D3)), w wyniku reakcji fotochemicznej zachodzącej pod wpływem promieniowania nadfioletowego, zmienia się w witaminę D3. .Brak witaminy D w dzieciństwie powoduje krzywicę charakteryzującą się zaburzeniami w wapnieniu chrząstek i kości. U dorosłych brak tej witaminy prowadzi do rozmiękania i osłabiania kości w procesie zwanym ostemolacją.

Witaminę E (-tokoferol) odkryto jako czynnik zapobiegający bezpłodności samic szczura. Objawami niedoboru tej witaminy są: u samic resorpcja płodu a u samców atrofia męskich gruczołów rozrodczych i dystrofia mięśni.

Witamina K , jest potrzebna do prawidłowego krzepnięcia krwi . Spośród czynników biorących udział w procesie krzepnięcia zmiany dotyczą przede wszystkim protrombiny, która w przypadku niedoboru tej witaminy nie jest syntetyzowana w wystarczającej ilości.

-60-

12.1.Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w wodzie:

12.1.1.Wykrywanie obecności witaminy B1 – metoda JensenaZasada: jest to metoda tiochromu polegająca na łagodnym utlenieniu witaminy B1 żelazicyjankiem potasu K3Fe(CN)6 w środowisku alkalicznym. Powstały produkt utlenienia tiaminy – tiochrom silnie fluoryzuje na niebiesko w świetle nadfiołkowym.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór witaminy B1

metanol 1%K3Fe(CN)6

30% NaOH alkohol izobutylowy

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B1 a następnie dodać 1 ml metanolu oraz przy ciągłym mieszaniu 0,1ml 1% roztworu K3Fe(CN)6 i 1 ml NaOH. Tak przygotowaną mieszaninę odstawić do statywu na około 1 minutę. Po upływie tego czasu dodać 6 ml alkoholu izobutylowego i silnie wytrząsnąć. Po oddzieleniu warstwy alkoholowej oglądać reakcję pod lampą kwarcową

11.1.2.Wykrywanie obecności witaminy B2 – metoda Eulera i AdleraZasada: roztwory wodne witaminy B2, w środowisku obojętnym dają żółto-zieloną fluorescencjęWykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór wodny witaminy B2

mieszanina pirydyny, wody i metanolu

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B2 dodać 2 ml mieszaniny pirydyny , wody i metanolu. Reakcję oglądać pod lampą kwarcową – widoczna jest żółto-zielona fluorescencja witaminy B2.

12.1.3.Wykrywanie witaminy B6 – metoda GreenaZasada: Witamina B6 z chlorkiem żelazowym tworzy połączenia o barwie czerwonej.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: roztwór witaminy B6

10% FeCl3

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B6 dodać kilka kropel 10 % FeCl3 - powstaje czerwone zabarwienie.

12.2.Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w tłuszczach;

12.2.1. Wykrywanie witaminy A - metoda Carra i Price’aZasada: chloroformowy roztwór witaminy A z odczynnikiem Cara i Price’a (chloroformowy roztwór trójchlorku antymonu SbCl3) daje niebieskie zabarwienie.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: chloroformowy roztwór witaminy A odczynnik Cara i Price’a

Do probówki nalać 1 ml odczynnika Carra i Price’a a następnie 3 do 5 kropel witaminy A – pojawia się niebieskie zabarwienie.

-61-

12.2.2.Wykrywanie witaminy D3 w tranie .

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: chloroformowy roztwór tranu (1:1) chloroformowy roztwór bromu (1: 60)

Do suchej probówki wlać 1 ml chloroformowego roztworu tranu i 1 ml roztworu bromu. Przez krótki okres czasu utrzymuje się zielone zabarwienie.

12.2.3.Wykrywanie obecności witaminy E za pomocą Fe +3 Zasada: podczas utleniania tokoferolu za pomocą Fe+3 przechodzi on w tokoferolochinon o zabarwieniu czerwonym.Wykonanie oznaczenia: Odczynniki: etanolowy roztwór witaminy E 0,2% FeCl3 (w bezwodnym etanolu)

Do probówki wlać 2 ml roztworu witaminy E dodać 0,5 ml roztworu FeCl 3 . Po dokładnym wymieszaniu pojawia się czerwone zabarwienie.

-62-

12.3. Ilościowe oznaczanie witaminy C w liściach kapusty

Zasada: Metoda oznaczania oparta jest na wykorzystaniu własności redukujących kwasu askorbinowego. Ilość kwasu askorbinowego w analizowanym materiale biologicznym oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem soli sodowej 2,6-dichlorofenoloindofenolem. Jest to barwnik będący równocześnie wskaźnikiem końcowego punktu miareczkowania. W środowisku kwaśnym przybiera on barwę różową , a w zasadowym – niebieską.

Barwnik utlenia kwas askorbinowy do 2,3-dehydroaskorbinowego, a sam redukuje się do bezbarwnego związku. Analizowana próbka pozostaje bezbarwna, dopóki zawiera kwas askorbinowy. Nadmiar barwnika, nie ulegający redukcji, powoduje wystąpienie różowego zabarwienia roztworu.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: liście kapusty 2% kwas szczawiowy 2,6 –dichlorofenoloindofenol

Odważyć 12,5 g pokrojonych liści kapusty. Rozetrzeć bardzo dokładnie odważoną kapustę w moździerzu porcelanowym z 20 ml 2 % roztworu kwasu szczawiowego. Rozdrobniony materiał przenieść ilościowo do 50 ml cylindra miarowego i uzupełnić do objętości 50 ml 2% roztworem kwasu szczawiowego. Wymieszać bardzo dokładnie i przesączyć przez sączek do suchej zlewki.Z przesączu odpipetować do dwóch 50 ml kolbek po 5 ml przesączu i szybko !!!!! miareczkować roztworem barwnika do momentu wystąpienia różowego trwałego zabarwienia.Wiedząc, że 1 ml barwnika utlenia 88 m g kwasu askorbinowego , obliczyć stężenie kwasu askorbinowego w analizowanym materiale. Wyniki podać w mg/100mg

12.4.Ilościowe oznaczenie witaminy C w mlekuWykonanie oznaczenia: Odczynniki : mleko CH3COOH lodowaty 2,6 –dichlorofenoloindofenol

Do 200 ml kolbki odpipetować 10 ml mleka , dodać 1 ml kwasu octowego lodowatego i 40 ml wody destylowanej. Wymieszać i natychmiast miareczkować roztworem 2,6-dichlorofenoloindofenolem aż do uzyskania różowego zabarwienia analizowanej próbki. Wyniki podać w mg/100ml mleka.Sprawozdanie z ćwiczeń:

Napisać sprawozdanie z ćwiczeń w którym przedstawić obliczenia stężenie witaminy C w kapuście i w mleku.

-63-

13.ENZYMY

Enzymy to białka o własnościach katalitycznych, które posiadają zdolność zwiększania szybkości reakcji chemicznej. Obniżają energie aktywacji , same jednak nie ulegają przemianie , dlatego też nie zużywają się bezpośrednio w wyniku reakcji. Większość enzymów składa się z części białkowej czyli apoenzymu oraz z części niebiałkowej czyli grupy prostetycznej lub koenzymu. Na powierzchni enzymu znajduje się zagłębienie będące miejscem wiązania substratu nazywane centrum aktywnym. Przestrzenne dopasowanie substratu do centrum aktywnego enzymu umożliwia ich związanie i wytworzenie kompleksu enzym substrat (ES)Ogólnie równanie reakcji enzymatycznej można przedstawić w następujący sposób:

Zgodnie z zaleceniami Komisji Enzymowej Unii Biochemicznej enzymy klasyfikujemy według typu reakcji katalizowanej:Klasa 1: Oksydoreduktazy – enzymy katalizujące reakcje utleniania i redukcji (np. dehydrogenaza, reduktaza, oksydaza, oksygenaza, katalaza, peroksydaza)Klasa 2: Transferazy- enzymy katalizujące przenoszenie określonych grup pomiędzy poszczególnymi związkami (np. transaldolaza, transketolaza, , amino-, petptydylo-,acylo-, metylo-, glukozylo-, fosfo-transferaza, kinaza)Klasa 3: Hydrolazy – enzymy katalizujące rozkład różnych wiązań chemicznych z udziałem cząsteczki wody ( np. esteraza, fosfataza, fosfodiesteraza, nukleaza, rybonukleaza, lipaza, amylaza, peptydaza)Klasa 4: Liazy (syntazy) – enzymy katalizujavce odłączenie grup od substratu bez udziału cząsteczki wody lub dołączenie grup do wiązań podwójnych (np. dekarboksylaza, aldolaza, hydrataza, dehydrtataza)Klasa 5: Izomerazy – enzymy katalizujące reakacje izomeracji ( np.racemaza, epimeraza)Klasa 6: Ligazy ( syntetazy) – enzymy katalizujące wytworzenie wiązań pomiędzy atomami w cząsteczkach substratów (np. karboksylaza, ligaza DNA, polimeraza DNA)Aktywność enzymu:

1. Międzynarodowa jednostka enzymu (U)– jest to aktywność enzymu która katalizuje przemianę 1 mikromola substratu w ciągu 1 minuty w temp. 300C w optymalnych warunkach

2. Katal (kat)- aktywność enzymu który przekształca 1 mol substratu w casie 1 sekundy w temperaturze 30o C w optymalnych warunkach.

Stężenie enzymu wyraża się jako stężenie aktywności w płynie biologicznym czyli liczbę zawartych w 1 l roztworu (U/l lub kat/l) bądź w mol/l (M) . W celach diagnostycznych w płynach biologicznych (surowica, mocz) oznacza się stężenie enzymów takich jak fosfataza alkaliczna, kwaśna, amylaza, dehydrogenza mleczanowa, aminonotransferaza asparaginowa i alaninowa)

Mechanizm katalizowanej reakcji z udziałem jednego substratu

E - enzym, S - substrat, P - produkt, k1 i k2 - stałe szybkości reakcji przebiegających w prawą stronę, k-1 i k-2 - stałe szybkości reakcji zachodzących w lewą stronę. W założeniach modelu kinetyki Michaelis-Mentena zakłada się, że produkt (P) nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat, w reakcji ze stałą szybkości k-2

-64-

13.1.Kinetyka reakcji enzymatycznychBadaniem szybkości reakcji chemicznych zajmuje się kinetyka. Poznanie kinetycznych zależności pozwala na podanie szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu. Szybkość reakcji zależy od wielu różnych czynników, a mianowicie od chemicznej struktury reagujących substancji, od ich stężeń oraz od środowiska w jakim zachodzi reakcja (pH roztworu) od temperatury a także od rodzaju katalizatora jak również od jego aktywatorów bądź inhibitorów.Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności między szybkością reakcji , a czasem jej trwania. Poznanie tej zależności pozwala podać szybkość reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu enzymu.Szybkość reakcji chemicznej jest w każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji reagujących i oznacza stosunek przyrostu stężenia produktu reakcji ( lub ubytku stężenia) do czasu w którym ten przyrost (ubytek) nastąpił.

r x V = r tV = szybkość reakcji enzymatycznejx = stężenie produktut = czas (min. sek)

Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu

W reakcjach I rzędu szybkość reakcji jest funkcja stężenia substratu i można ja przedstawić następująco: rx V = = k (a –x) rtr = przyrostv = prędkośćt = czasa = stężenie substratux = stężenie produktuk = stała reakcji

powyższy wzór można zapisać jako równanie : rx/ rt = k( a-x )aby wyliczyć k – czyli stała reakcji należy zcałkować powyższe równanie :

k = 1 ln a = 2.303 x log a t a –x t a - x

aby przejść z logarytmu naturalnego (ln) należy pomnożyć przez 2.303 a log a - x k = x 2.303 -1

t k – wyraża się w jednostce odwrotności czasu np. min -1, sek -1 itd.

-65-

Wykres stałej k dla reakcji I rzędu

13.1.1. Badanie szybkości reakcji I rzędu i wyznaczenie stałej k na przykładzie hydrolizy sacharozyZasada : sacharoza ulega hydrolizie w środowisku kwaśnym i stopień hydrolizy mierzy się ilością cukrów redukujących pojawiających się w czasie trwania hydrolizy. Oznaczyć można ilość powstającego produktu lub ubytek substratu w trakcie reakcji. Stężenie produktu lub substratu wyraża się w dowolnych jednostkach.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: 0,2% roztwór sacharozy (świeżo sporządzony) 6 M HCL 10% NaOH 0,25% roztwór glukozo-fruktozy( jednakowe ilości glukozy i fruktozy) 1% kwas pikrynowy

Przygotować 7 probówek do których wlać po 3 ml 10% NaOH. Zmieszać 5 ml 0,2% sacharozy i 5 ml 6 M HCL i natychmiast !!! po wymieszaniu przenieść 1ml hydrolizatu do pierwszej probówki z roztworem NaOH ( czas t = O). Do kolejnych probówek z 10% NaOH wprowadzać po 1 ml hydrolizatu po upływie: 5, 10, 15, 20, 25, i 30 minut.Następnie dodać do wszystkich probówek po 2ml 1% kwasu pikrynowego dokładnie wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Po 5 minutach probówki ostudzić i dodać do każdej po 4 ml wody, próbki są gotowe do pomiaru absorbancji. Wartość absorbancji oznaczyć przy l = 530 wobec próbki pierwszej (czas t = O).Ilości mg glukozo-fruktozy wyzwolonych po określonym czasie hydrolizy odczytać z wykresu sporządzonego na podstawie krzywej standardowej :

Wykonanie krzywej standardowejStandardy glukozo- fruktozy : 1. – 0,25 mg/ml ; 2- 0,50 mg/ml; 3- 0,75 mg/ml; 4-- 1.00mg/ml i 5 – 1,25mg/ml.

Przygotować próbki zgodnie z poniższa tabelą¯

Nr .probówki

Standard(ml)

H2O(ml)

10%NaOH(ml)

6M HCL(ml)

1% kwaspikrynowy

(ml)

ŁaźniaWodna1000C

H2O(ml)

„0” 0 0,5 3 0,5 2

5 min.

4

1 0,1 0,4 3 0,5 2 4

2 0,2 0,3 3 0,5 2 4

3 0,3 0,2 3 0,5 2 4

4 0,4 0,1 3 0,5 2 4

5 0,5 O 3 0,5 2 4

-66-

0znaczyć wartość absorbancji przy l = 530 nm wobec próbki „O” (ślepa odczynnikowa), a następnie: wykreślić krzywą standardową na papierze milimetrowym na podstawie podanego poniżej przykładu

po odczytaniu stężenia w badanych próbkach wypełnić poniższą tabelę:

Czas(t)

( min.)

Stężenieproduktu

(x)

Stężeniesubstratu

(a – x)

aa-x

a Log

a - xK V

O

5

10

15

20

25

30

Wykonać sprawozdanie z przeprowadzonych ćwiczeń: Obliczyć metodą matematyczną i przedstawić graficznie:

1. Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu2. stałą k dla reakcji I rzędu

-67-

13.2 .Enzymy - reakcje barwne

I. Oksydoreduktazy:Katalaza i peroksydazaEnzymy te są białkami złożonymi, należącymi do hemoprotein. Katalaza występuje głównie w erytrocytach, a także w komórkach wątroby i nerek. Enzym ten usuwa toksyczny H 2O2 ze środowiska reakcji, zapobiega tworzeniu rodnika hydroksylowego, uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. Katalaza przyspiesza reakcję, w trakcie której jedna cząsteczka nadtlenku wodoru jest dawcą (donorem), zaś druga biorcą (akceptorem ) elektronów. Reakcja utleniania i redukcji przebiega zgodnie z równaniem H2O2 + H2O2 ¾¾¾ O2 + 2H2OPeroksydaza występuje w erytrocytach, a także komórkach tkanki płuc, tarczycy, trzustki. Enzym ten podobnie jak katalaza uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. W reakcjach katalizowanych przez ten enzym substratami oddającymi elektrony i protony mogą być różne związki, natomiast akceptorem elektronów jest wyłącznie nadtlenek wodoru . AH2 + H2O2 ¾¾¾ A + 2H2O

13.2.1. Wykrywanie katalazyZasada: efektem działania katalazy jest wydzielenie się banieczek gazu - tlenu z nadtlenku wodoru po dodaniu kilku kropli krwiWykonanie oznaczenia:Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10 3% H2O2

Przygotować dwie probówki do których wlać około 0,5 ml rozcieńczonej krwi . Do pierwszej probówki wlewamy około 1 ml 3% H2O2..Pod działaniem katalazy następuje obfite wydzielanie tlenu (banieczki gazu), natomiast drugą probówkę z krwią ogrzewamy do wrzenia, oziębiamy (pod kranem z wodą) i dodajemy 1 ml 3% H2O2. Banieczki gazu nie wydobywają się z roztworu, ponieważ enzym uległ dezaktywacji przy zagotowaniu.

13.2.2. Wykrywanie peroksydazyZasada: katalityczną aktywność peroksydazy można wykryć na drodze przeniesienia tlenu z nadtlenku wodoru na benzydynę, która zostaje utleniona do niebieskiego barwnika.

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10 CH3COOH 3% H2O2

benzydyna – nasycony roztwór

Do probówki wlać 0,5 ml rozcieńczonej krwi , dodać 1 kroplę kwasu octowego, następnie 5 kropli 3% H2O2 i 3 krople benzydyny. Roztwór barwi się na kolor niebieski.

II.OksydazyOksydazy, są enzymami, które katalizują utlenianie substratu przez odebranie wodoru (protonów i elektronów), przy czym akceptorem wodorów jest tlen atomowy bądź cząsteczkowy. W obrębie komórki tego typu enzymy występują w mitochondriach oraz peroksysomach, a także w siateczce śródplazmatycznej. W mitochondriach akceptorem wodorów jest zawsze tlen atomowy, co prowadzi do powstania wody zgodnie z równaniem: AH2 + ½ O2 ¾¾¾ A + H2O

-68-

13.2.3.Wykrywanie oksydazy fenolowej

Zasada: enzym ten katalizuje proces utleniania fenolu. Fenol utlenia się najpierw do pirokatcholu, a następnie do chinonu, który daje pochodne o barwie brązowej.

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: sok – miąższ ziemniaczany 1% roztwór fenolu

Na tarce jarzynowej utrzeć kawałek ziemniaka i trochę miąższu umieścić w probówce, a następnie dodać 10 kropli 1% roztworu fenolu. Po pewnym czasie miąższ ziemniaka przyjmuje zabarwienie brązowe, które z czasem nasila się.

13.2.4. Wykrywanie oksydazy polifenolowejZasada: oksydaza polifenolowa katalizuje utlenianie wielofenoli do barwnych chinonów, które dalej kondensują na pochodne, zabarwione żółto lub brązowo. Z pirogallolu powstaje żółta purpurogallina. Enzym ten jest metaloproteidem zawierającym Cu +2.. Występuje w wielu warzywach i owocach.

Wykonanie oznaczeniaOdczynniki: sok, lub miąższ ziemniaczany 1% roztwór pirogallolu

Utarty na tarce miąższ ziemniaka przenieść do probówki , a następnie dodać 10 kropli pirogallolu. W wyniku reakcji powstaje żółte zabarwienie.

III. HydrolazyHydrolazy są enzymami, które katalizują rozszczepienie substratu przy udziale cząsteczek wody, w wyniku czego z substratu powstają dwa produkty o mniejszej masie cząsteczkowej.

13.2.5.Rozkład mocznika pod wpływem ureazy.Zasada: ureaza rozkłada mocznik na dwutlenek węgla i amoniak. Optimum działania enzymu to pH 7,8 – 7,9. W wodnym roztworze CO2 i NH3 ulegają kondensacji z utworzeniem węglanu amonowego. Na skutek tej reakcji odczyn reakcji jest zasadowy: NH2

CO + H2O ¾ CO2 + 2NH3 ¾¾¾¾ (NH4)2CO3 + H2O

NH2 Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: mocznik ureaza fenoloftaleina

Do probówki wlać 1 ml mocznika ,a następnie dodać 1 ml roztworu urazy oraz 2 krople fenoloftaleiny. Bezbarwny początkowo roztwór czerwienieje po paru minutach.

-69-13.2.6. Hydroliza sacharozy przez inwertazęZasada: Inwertaza należy do glikozydaz (podklasa hydrolaz). Enzym ten katalizuje reakcję hydrolizy

wiązania pomiędzy -D-glukopiranozą i -D-fruktofuranozą w sacharozie, która jest nieredukującym disacharydem. . Enzym ten występuje w drożdżach.Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: świeże drożdże 1% roztwór sacharozy Fehling I i II

Grudkę drożdży rozdrobnić w około 5 ml wody, a uzyskaną zawiesinę drożdży rozdzielić do trzech probówek (1,2,3)

Probówka – 1 Probówka - 2 Probówka - 3

1ml zawiesiny drożdży 1ml zawiesiny drożdży 1ml zawiesiny drożdży

2 ml sacharozy 2 ml wody zagotować nad palnikiem

Łaźnia wodna 370C -2 min Odstawić do statywu 2 ml sacharozy; odstawić

Reakcja Fehlingaä

Reakcja dodatniaReakcja FehlingaReakcja ujemna

Reakcja FehlingaReakcja ujemna

äReakcja Fehlinga: do probówki wlać 1 ml Fehlinga I i 1ml Fehlinga II oraz 1 ml z zawartość probówki -1, powtórzyć tę samą czynność z probówkami 2 i 3 . Następnie probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. O obecności cukrów redukujących świadczy pomarańczowo ceglasty osad. Jest to dodatni wynik reakcji Fehlinga.

Reakcja i zabarwienie pierwszej probówki (1) wskazuje na obecność enzymu inwertazy w drożdżach ponieważ nastąpiła hydroliza sacharozy na cukry proste posiadające własności redukujące. W probówce drugiej (2) wykazano ,że sam roztwór drożdży nie zawiera substancji redukujących .Reakcja w próbówce trzeciej (3) wykazała że drożdże posiadają zdolność hydrolizy sacharozy, lecz enzymy biorące udział w tej reakcji są nieczynne pod wpływem wysokiej temperatury.

13.2.7. Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą WolghemutaZasada: amylaza śliny to enzym zaliczany do hydrolaz (podklasa glikozydazy) jest aktywowana jonami chlorkowymi. Katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych typu -1,4 wewnątrz cząsteczek łańcucha polisacharydowego skrobi.Wyróżniamy: i - amylazy-amylaza (endoamylaza dekstrynotwórcza) hydrolizuje cząsteczkę skrobi od środka łańcucha, rozrywając wiązania -1-4-glikozydowe z pominięciem -1-6 glikozydowych. Powstają wówczas nisko-cząsteczkowe dekstryny oraz -maltoza, nie dająca zabarwienia z jodem-amylaza (egzoamylaza dekstyrnotwórcza) hydrolizuje co drugie wiązanie -1-4 glikozydowe, począwszy od końca nie aldehydowego, w wyniku czego następuje hydroliza łańcucha skrobi i powstaje -maltoza i wysoko-cząsteczkowe dekstryny dające zabarwienie z jodemOprócz śliny amylaza występuje również w trzustce.

Za jednostkę wzorcową aktywności amylazy przyjmuje się w metodzie Wolghemuta taką ilość enzymu, które w czasie 30 minut rozkłada do stadium achrodekstryn (nie dających zabarwienia z jodem) 1 mg skrobiWynik podaje się w ml 1% skrobi rozłożonej w czasie 30 minut przez 1 ml śliny

-70-

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: bufor cytrynianowo-fosforanowy o pH 6,5 1 % roztwór skrobi w 0,9% NaCl 0,02 mol/l J2w KJ ślina

Do probówki wlać 1 ml śliny (nie sączonej), a następnie dodać 4 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego i wymieszać. Uzyskuje się w ten sposób 5-cio krotne rozcieńczenie śliny. W statywie przygotować 10 probówek, do pierwszej wlać 4 ml przygotowanej mieszaniny (ślina z buforem) a do następnych po 2 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego. Z probówki pierwszej pobrać 2 ml mieszaniny i przenieść do probówki drugiej (wymieszać!). Z drugiej probówki pobrać 2 ml i przenieść do probówki trzeciej i wymieszać! itd. Z probówki dziesiątej odrzucić 2 ml roztworu.

Uzyskuje się w ten sposób następujące rozcieńczenia śliny probówkach:1 : 5; 1: 10; 1:20; 1 : 40; 1 : 80; 1: 160 itd. Odpowiadają one następującym ilościom śliny w probówkach: 0,4 ; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,012 ml itd.

Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 380C na 5 minut, po czym do każdej probówki dodać po 2 ml 1 % roztworu skrobi w 0,9% NaCl. Zawartość probówek bardzo dokładnie wymieszać!!!!, i wstawić do łaźni wodnej (380C) na okres 30 minut. Po upływie tego czasy do każdej probówki wlać po 3 krople J2w KJ.( zacząć dodawać od probówki w której ślina jest najbardziej rozcieńczona).Zaobserwować w której probówce reakcja z jodem jest ujemna (stadium dekstryn nie dających zabarwienia za jodem)Obliczyć aktywność amylazy śliny wyrażając ją liczbą równą ilości ml 1 % roztworu skrobi rozłożonej w ciągu 30 minut.

Obliczenie wyników - przykładPrzypuśćmy , ze stadium dekstryn nie dających zabarwienia z jodem , wystąpił już w probówce trzeciej. Ilość skrobi 1% w tej probówce równa jest 2 ml, czyli w probówce 3-ciej po 30 minutach nastąpił rozkład 2-ch ml 1% roztworu skrobi. Ponieważ ta probówka zawierała 0,1 ml śliny otrzymujemy proporcję:

0,1 ml śliny rozkłada po 30 minutach ¾¾ 2 ml 1% skrobi1 ml śliny rozkłada po 30 minutach ¾¾ x ml skrobi

2 ml X = = 20 ml 1 % skrobi 0,1ml

czyli 1 ml śliny rozłożył 20 ml 1% skrobi = 20 mg skrobi w czasie 30 minut.Aktywność amylazy wynosi więc 20 jednostek.

-71-

13.2.8. Oznaczenie aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi zwierząt gospodarskich

Fosfatazy stanowią w organizmie ssaków grupę szeroko rozpowszechnionych enzymów które katalizują reakcje hydrolizy estrów fosforanowych. Różnią się one właściwościami fizykochemicznymi , a przede wszystkim optimum pH, dlatego wyróżnia się fosfatazy kwaśne(pH 4-6) i zasadowe (pH 8-9). Fosfatazy kwaśne występują w większych ilościach w kościach, jelicie oraz w wątrobie. Fosfataza zasadowa występuje w wątrobie , nerkach a także w śledzionie , łożysku i erytrocytach. W obrębie komórek fosfatazy znajdują się przede wszystkim w lizosomach, siateczce śródplazmatycznej, aparacie Goldiego oraz w cytoplaźmie.Aktywność fosfataz oznacza się za pomocą syntetycznych substratów jak β-glicerofosforan, fenylofosforan. W zależności od stosowanego substratu oznaczenie aktywności enzymu opiera się na określeniu ilości uwolnionego po hydrolizie fosforu (metoda Bodeńskiego) lub ilości odszczepionego fenolu (metoda Folina Ciocaltou).

W metodzie Bodańskiego fosfatazy surowicy krwi rozkładają β-glicerfosforan na glicerol i nieorganiczny fosforan. Przebieg reakcji jest następujący:

Zasada: po inkubacji w temp. 370C w środowisku zasadowym oznacza się ilość odszczepionego fosforu nieorganicznego. Po dodaniu molibdenianu amonu w środowisku kwaśnym powstaje kwas fosfomolibdenianowy , który redukuje się . Po dodaniu kwasu 1,2,4 –aminonaftosulfonowego powstaje związek o niebieskim zabarwieniu.

Wykonanie oznaczenia:Odczynniki: surowica KH2PO4 (zawiera 8μg fosforu w 1 ml) 0,5% β- glicerofosforan sodu 60% CCL3 COOH 2,5% molibdenian amonu 0,25% eikonogen (kwas 1,2,4 –aminonaftosulfonowy)

Sporządzenie krzywe standardowej:

KH2 PO4

(ml)H2O(ml)

Stężenie P w probówkach

Probówka 1 0,5 2,5 → 4 μg P /3 ml

Probówka 2 1,0 2,0 → 8 μg P /3ml

Probówka 3 2,0 1,0 → 16 μg P/3 ml

Probówka 4 3,0 - → 24 μg P/ 3ml

-72-

Ślepa próba odczynnikowa:Do probówki odmierzyć 500μl H2O , a następnie 4 ml β-glicerofosforanu i 500 μl 60%

CCl3COOH. Po dokładnym wymieszaniu odpipetować 1ml mieszaniny do probówki nr 5 a następnie dodać 2 ml H2O.

Ślepa próba surowicy:Służy do oznaczenia ilości fosforu występującego w stanie wolny w surowicy.Do probówki dajemy 500μl surowicy i 4 ml β-glicerofosforanu i natychmiast!!!! 500μl CCl3COOH (w celu przerwania reakcji enzymatycznej). Próbkę przesączamy do kolejnej probówki a następnie odpipetowujemy 1ml przesączu do probówki nr 6 i dodajemy 2ml H2O

Właściwe oznaczenie fosfatazy zasadowej w surowicy Do probówki odmierzyć 500 μl surowicy i 4 ml β-glicerofosforanu , a następnie umieścić probówkę w łaźni wodnej (370C) na okres 30 minut. Po upływie tego czasu reakcję przerywamy dodając 500ml CCl3COOH. Następnie próbkę przesączamy. 1ml przesączu odpipetowujemy do probówki nr 7 i dodajemy 2 ml H2O

Ustawiamy probówki od 1-7 w statywie i w celu wywołania reakcji barwnej dodajemy do wszystkich probówek 800 μl roztworu molibdenianu amonu i 200 μl eikonogenu. Bardzo dokładnie próbki mieszamy i pozostawiamy na 10 minut w temperaturze pokojowej. Po tym okresie mierzymy absorbancję próbek przy fali o długości λ = 660nm wobec próby ślepej odczynnikowej

Na podstawie odczytanych wartości absorbancji wykreślić na papierze milimetrowym krzywą standardową i odczytać ilość μg P znajdującego się w ślepej próbie surowicy i próbie właściwej. Od ilości fosforu w badanej próbce odjąć wartość uzyskaną dla ślepej próby surowicy (ilość fosforu występująca w stanie wolnym w surowicy). Różnica odpowiada ilości μg fosforu odszczepionego czasie inkubacji przez enzymatyczną hydrolizę β-glicerofosfaranu pod wpływem alkalicznej fosfatazy zawartej w 100μl surowicy

Stwierdzona ilość μg P/ 100 μl surowicy ilość mg P/ 100ml surowicy = ilość jednostek Bodeńskiego

Jednostka Bodeńskiego - jest to ilość fosfatazy zasadowej ,która powoduje odszczepienie1 mg fosforu z β-glicerofosforanu w środowisku o pH 8,6 w ciągu godziny w temp. 370C.