biokim_enzim

1

1. PENDAHULUAN

1.1. Tinjauan Pustaka

Enzim adalah suatu katalis biologis yang dapat mempercepat terjadinya keseimbangan

suatu reaksi kimia. Bisa pula dikatakan enzim sebagai protein dengan sifat katalitik,

dimana sifat katalitiknya jauh lebih besar daripada katalis sintetis yang dibuat secara

kimia oleh manusia. Enzim juga memiliki spesifitas tinggi terhadap substrat, atau

dengan kata lain hanya mau mengkatalis reaksi tertentu dengan substrat tertentu saja.

Kelebihan enzim sebagai pengkatalis adalah dapat mempercepat reaksi kimia spesifik

tanpa pembentukan produk samping. Umumnya enzim punya berat molekul jauh lebih

besar daripada substrat yang dikatalisnya ( Winarno, 1995 ).

Enzim adalah substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan beperan sebagai

katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme. Katalisator adalah

substansi yang mempercepat reaksi tetapi pada hasil reaksi, substansi tersebut tidak

berubah. Kebanyakan enzim diberi nama dengan menambahkan akhiran –ase pada kata

yang menunjukkan senyawa asal yang diubah oleh enzim atau pada nama jenis reaksi

kimia yang dikatalisis oleh enzim. Sebagai contoh enzim protease memecah protein,

enzim lipase memecah lipida (Gaman & Sherrington, 1994).

Enzim adalah sebuah katalisator yang dihasilkan oleh organisme hidup yang digunakan

untuk mendukung/mempercepat reaksi kimia. Kebanyakan dari semua enzim disusun

oleh protein, kecuali ribozymes. Ribozymes adalah molekul dari asam nukleat yang

mengkatalisa reaksi yang terjadi pada ikatan fosfodiester dari RNA lain. Enzim dapat

ditemukan pada setiap jaringan dan cairan tubuh (Birch, 2002). Enzim merupakan

protein yang khusus disintesis oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi yang

berlangsung didalamnya. Fungsi khusus dari enzim adalah untuk menurunkan energi

aktivasi, mempercepat reaksi pada suhu dan tekanan yang tetap tanpa mengubah

besarnya tetapan keseimbangan sebagai pengendali reaksinya (Martoharsono, 1994).

Enzim adalah protein yang mempunyai sifat katalitik, yang menyebabkan enzim

berguna dalam telaah analitik. Beberapa enzim hanya terdiri atas protein, tetapi

2

kebanyakan enzim mengandung non-protein tambahan seperti karbohidrat, lipid, logam,

fosfat, atau beberapa bagian organik yang lain. Beberapa enzim dipakai sebagai

indikator dalam metode analitik, fosfatase misalnya, dipakai dalam uji fosfatase susu

yang dipasteurisasi, selain itu sebagai alat bantu pemrosesan pada pemanufakturan

makanan (de Man, 1997).

Disamping pengelompokan secara resmi ada pula pengelompokan yang berdasarkan

akhiran pada nama enzim tersebut, yaitu :

• Akhiran ase, semua enzim yang memakai akhiran ini memiliki fungsi mengkatalisis

hidrolisis substrat tertentu.

• Akhiran in, semua enzim yang memakai akhiran ini berarti menerangkan substrat apa

yang diuraikan oleh enzim tersebut (Martoharsono,1994).

Ada beberapa keuntungan dalam memanfaatkan enzim sebagai katalisator biologis.

Pertama beberapa enzim relatif mudah diekstraksi dan dimurnikan secara parsial dalam

bentuk konsentrat dari bahan biologis. Kedua, enzim memperlihatkan aktivitas optimum

panda kondisi yang berbeda dengan lingkungan asalnya. Ketiga, enzim memiliki derajat

spesifitas tinggi dalam reaksi yang dikatalisa, dan kebanyakan kasus hanya satu jenis

reaksi saja enzim dapat bekerja khususnya di bidang teknologi pangan. Akhirnya enzim

lebih efisien daripada katalisator kimia yaitu sebesar 105-108 kalinya (Tranggono &

Sutardi , 1989).

Beberapa bagian pada enzim yaitu :

☺ Kofaktor

Bila enzim dalam melakukan aktivitasnya membutuhkan zat kimia tertentu, dan zat

kimia tertentu itu disebut kofaktor. Dimana kofaktor itu terikat kuat pada enzim.

Disamping itu kofaktor stabil selama pemanasan.

☺ Koenzim

Bagian kofaktor yang berupa molekul organik seperti tiamin pirofosfat, flavin, adenin

dinukleotida, NAD, koenzim A, piridoksal fosfat, biositin, tetrahidrofolat, dan

sebagainya.

☺ Apoenzim

3

Bagian enzim yang merupakan protein yang menempati porsi terbesar dalam enzim.

Apoenzim memiliki sifat seperti protein, salah satu sifat yang utama yaitu apoenzim

akan terdenaturasi selama pemanasan (Martoharsono,1994).

Enzim dapat digolongkan menjadi enam kelas berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisa

yaitu:

1. Kelas oksidoreduktase, reaksi yang dikatalisis adalah reaksi pemindahan elektron.

2. Kelas transferase, reaksi yang dikatalisis adalah reaksi pemindahan gugus fungsional.

3. Kelas hidrolase, reaksi yang dikatalisis yaitu reaksi hidrolisis atau reaksi pemindahan

gugus fungsional ke dalam air.

4. Kelas liase, reaksi yang dikatalisis adalah reaksi penambahan gugus ke dalam ikatan

rangkap atau sebaliknya.

5. Kelas isomerase, reaksi yang dikatalisis adalah reaksi pemindahan gugus di dalam

molekul menghasilkan bentuk isomer.

6. Kelas ligase, reaksi yang dikatalisis yaitu reaksi pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O,

dan C-N oleh reaksi kondensasi yang berkaitan dengan penguraian ATP

(Martoharsono,1994).

Potensi penggunaan enzim amylase sangat besar, namun masih terdapat kendala, yaitu

enzim tersebut masih harus diimpor dengan harga relatif mahal. Untuk memproduksi

sendiri juga masih menghadapi beberapa kendala antara lain tidak tersedianya strain

mikrobaunggul penghasil enzim amylase dan kurangnya pengetahuan tentang teknologi

produksi enzim. Usaha meningkatkan produksi enzim dari mikroorganisme telah

dilakukan, baik dengan manipulasi lingkungan maupun sifat mikroba tersebut

(Richana,et al., 2002).

Ekstraksi enzim dapat dilakukan dengan prinsip bahwa protein enzim dapat diendapkan

dengan penambahan aseton, etanol, sodium sulfat atau ammonium sulfat. Sifat ini

digunakan sebagai prinsip dari isolasi enzim. Enzim ini dapat diekstrak dan kemudian

proses pengendapannya dapat dilakukan dengan penambahan garam (NH4)2 SO4

(ammonium sulfat) (Rahman, 1992).

4

Ekstrak kasar enzim desaturase diisolasi dengan pemacahan sel fungi menggunakan

blender dan penambahan salin buffer fofat (PBS) ph 7,2 dengan nisbah biomassa : PBS

-1 ;2 (b/v). homogenate disentrifuse pada kecapatan 5000 rpm selam 15 menit. Ekstrak

enzim kasar dipisahkan dari pecahan sel dengan penyaringan menggunkan kertas saring

pada corong buchner dan dibantu dengan pompa vakum. Supernatant yang berisi

ekstrak kasar desaturese diamobilisasi untuk pengujian lebih lanjut (Panji et al., 2005).

Ekstraksi yang dilakukan biasanya dengan menggunakan pelarut organik, namun

terkadang juga bisa menggunakan pelarut organik sebagai pemurni dengan prinsip sama

dengan ekstraksi. Pada dasarnya pelarut sifatnya lebih fleksibel. Pelarut yang digunakan

harus memenuhi berbagai ketentuan yaitu :

Kelarutan

Pelarut haruslah memiliki kemampuan melarutkan yang tinggi

Kerapatan

Konsentrasi pelarut haruslah berbeda jauh dengan konsentrasi ekstrak enzim yang

akan dipisahkan dari larutannya.

Spesifitas

Pelarut haruslah hanya dapat melarutkan zat yang dituju.

Reaktifitas

Pelarut haruslah tidak menyebabkan reaksi pada bahan yang akan diekstrak.

( Gaman & Sherrington, 1994 ).

Cara untuk mendapatkan ekstrak enzim kasar dari masing - masing makhluk hidup pun

berbeda - beda. Bila sumber enzim berasal dari tanaman atau hewan maka jaringan

tanaman dan hewan tersebut dihancurkan sampai rata dalam air / buffer. Bagian yang

tidak larut dipisahkan dengan sentrifugasi / penyaringan sehingga diperoleh ekstrak

berupa cairan. Sedangkan untuk sumber enzim berasal dari mikrobia, maka sel mikrobia

dipanen dari kulltur medianya kemudian sel dipecah dengan cara menggiling / lisis

kemudian dilakukan ekstraksi dengan air / buffer. Enzim ekstraselular mikrobia

diperoleh dengan cara menyaring / sentrifugasi untuk memisahkan sel / miselia dan

bahan padat lainnya dari kultur medianya (Tranggono & Sutardi, 1990). Ekstraksi

dengan cara penggojogan atau sentrifugasi. Akan didapatkan dua bagian, yaitu

5

supernatan dan residu ( Winarno, 1995 ). Enzim yang terlarut dalam air dan bersifat

polar mengakibatkan sebagian sisi aktif enzim terhalang untuk melakukan kontak

dengan substrat (Panji et al., 2005).

Filtrasi atau penyaringan adalah salah satu cara untuk memisahkan antar partikel padat

dengan partikel cair termasuk gas. Pada penyaringan campuran yang terdiri atas partikel

padat yang terdispersi dalam fase cair atau gas, dilewatkan dengan melalui medium

berpori. Partikel padat yang tidak lolos pada pori - pori medium akan tertahan

sedangkan cairan akan lolos melalui pori - pori medium tersebut. Cairan yang lolos dari

medium tersebut disebut dengan filtrat dan partikel padatan yang tertahan dikenal

dengan ' cake '. Sebagai medium penyaring, dapat digunakan kain saring, anyaman

kawat, dan anyaman plastik (Tranggono & Sutardi, 1989 ).

Larutan buffer adalah larutan yang tahan panas terhadap perubahan pH dengan

penambahan asam atau basa. Larutan seperti itu digunakan dalam berbagai percobaan

biokimia dimana dibutuhkan pH yang terkontrol dan tepat (Fardiaz, 1992). Buffer dapat

mempertahankan kondisi enzim presipitat agar tidak terjadi perubahan pH dan

mencegah agar enzim tidak mengalami inaktivasi. Penambahan ammonium sulfat

kering pada enzim cair untuk mengurangi ketersediaan air sehingga mengendapkan

protein. Dengan adanya pengadukan, ketersediaan air yang berinteraksi dengan protein

berkurang sehingga protein terpresipitasi ( salting out ). Pada saat terjadi salting out,

protein atau enzim mudah dipisahkan. Tujuan pemblenderan adalah memudahkan dalam

pengekstraksian, karena dengan adanya proses penghalusan bahan, maka luas

permukaan bahan tersebut akan menjadi semakin luas, sehingga enzim yang terdapat

dalam bahan tersebut akan mudah bereaksi dengan buffer, sehingga enzim tidak akan

mengalami inaktivasi ( Winarno, 1995 ).

Buffer dibutuhkan untuk melindungi enzim dari sejumlah besar asam yang dilepaskan

dari vakuola pada sel yang terputus dan untuk menyesuaikan serta memantapkan pH

makanan dengan pH yang diinginkan. Daya ionisasi yang tinggi dibutuhkan untuk

menyerap enzim dari dinding sel. Pada tanaman yang mengandung sejumlah besar

komponen phenol, poliethylene glycol atau polivinilpyrolidone mungkin bergabung

6

menjadi ekstrak cairan untuk perlindungan melawan enzim inaktif melalui reaksi

dengan komponen phenol yang dilepaskan (Whitaker, 1994).

Larutan buffer pH 6,0 dan amonium sulfat kering sering ditambahkan untuk

mempertahankan kondisi presipitat enzim pada pH tertentu agar selama penyimpanan

tidak mudah terdenaturasi oleh karena perubahan pH, dimana selama proses

penyimpanan, pH cenderung tidak stabil dan dapat terjadi perubahan suhu. Oleh karena

itu penyimpanan dilakukan pada suhu rendah untuk mencegah proses inaktivasi enzim

tersebut ( Winarno, 1995 ).

Salah satu cara untuk mengetahui adanya zat kimia pada suatu medium adalah dengan

cara spektrofotometri. Cara ini dilakukan dengan melewatkan suatu cahaya atau sinar

putih pada medium tertentu. Yang akan tampak adalah cahaya yang telah diabsorbsi dan

diteruskan untuk setiap konsentrasi yang berbeda sehingga akan terjadi perbedaan

warna. Analisa secara spektrofotometri merupakan pengukuran seberapa jauh emisi

radiasi yang akan diserap/diabsorbsi oleh suatu sistem sebagai fungsi panjang

gelombang dari radiasi maupun pengurangan absorbansi suatu panjang gelombang

(Ewing, 1985). Debu dapat mengganggu bekerjanya sistem optik, hal ini dapat

mengakibatkan kesalahan, kesalahan ini dapat dihindari dengan melindungi peralatan

dari debu. Kesalahan dapat meliputi kesalahan penimbangan, pengendalian pH yang

keliru, pengukuran volume serta ketidakstabilan warna pada reaksi (Khopkar, 2002).

Sifat-sifat enzim antara lain :

1. Spesifitas

Enzim hanya dapat bekerja pada substrat tertentu karena enzim mempunyai spesifitas

substrat yang tinggi. Pada konsentrasi substrat yang rendah maka kecepatan reaksinya

juga rendah dan kecepatan reaksi akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi

substrat. Namun pada suatu saat akan tercapai suatu titik batas sehingga jika melampaui

titik itu maka akan menunjukkan peningkatan yang kecil dengan bertambahnya

konsentrasi substrat dan titik batas tersebut disebut titik optimum. Kecepatan reaksi

katalitik enzim dapat mencapai kecepatan maksimal jika semua enzim menjadi bentuk

enzim substrat dan konsentrasi enzim berkurang (Tranggono & Sutarrdi, 1989).

7

2. Pengaruh suhu

Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu. Untuk enzim pada umumnya suhu

optimal antara 35°C dan 40°C, yaitu suhu tubuh. Pada suhu di atas dan di bawah

optimalnya, aktivitas enzim berkurang. Di atas suhu 50°C enzim secara bertahap

menjadi inaktif karena protein terdenaturasi. Pada suhu 100°C semua enzim rusak. Pada

suhu yang sangat rendah, enzim tidak benar-benar rusak tetapi aktivitasnya sangat

banyak berkurang (Gaman & Sherrington, 1994).

Dengan bertambahnya suhu dapat mengakibatkan percepatan reaksi bertambah. Saat

suhu meningkat, proses denaturasi semakin lama merusak reaksi aktif dari molekul

enzim. Ini terjadi karena tidak melipatnya rantai protein setelah pemutusan dari rantai

lemah jadi kecepatan reaksi jadi lambat. Untuk beberapa protein denaturasi mulai terjadi

pada suhu 45-500C. Dalam kisaran suhu tersebut enzim mulai tidak aktif, karena

denaturasi apoenzim. Ketidakaktifan enzim berlangsung secara cepat pada suhu diatas

500C. Pada suhu rendah aktivitas enzim berlangsung secara lambat. Kebanyakan enzim

menunjukkan aktivitas optimal pada kisaran suhu 30-200C (Lee, 1992).

Suhu yang tinggi akan menaikkan aktivitas enzim namun sebaliknya juga akan

mendenaturasi enzim (Martoharsono, 1994). Peningkatan temperatur dapat

meningkatkan kecepatan reaksi karena molekul atom mempunyai energi yang lebih

besar dan mempunyai kecenderungan untuk berpindah. Ketika temperatur meningkat,

proses denaturasi juga mulai berlangsung dan menghancurkan aktivitas molekul enzim.

Hal ini dikarenakan adanya rantai protein yang tidak terlipat setelah pemutusan ikatan

yang lemah sehingga secara keseluruhan kecepatan reaksi akan menurun (Lee, 1992).

3. Pengaruh pH

Enzim merupakan protein yang tersusun atas asam amino, oleh karena itu pengaruh pH

berhubungan erat dengan sifat asam basa yang dimiliki oleh protein. Pada umumnya,

enzim menunjukkan titik optimum aktivitas pada pH tertentu (Martoharsono, 1994).

Masing-masing reaksi yang dikatalisis oleh enzim paling cepat terjadi pada pH yang

tertentu. Untuk kebanyakan enzim pH optimal adalah sekitar pH 7 (netral) dan jika

medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim mengalami inaktivasi. Akan

tetapi beberapa enzim hanya beroperasi dalam keadaan asam atau alkalis. Sebagai

contoh, pepsin, enzim yang dikeluarkan ke lambung, hanya dapat berfungsi dalam

kondisi asam, dengan pH optimal 2 (Gaman & Sherrington, 1994).

8

Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim yaitu pada suhu rendah sekitar –10oC sampai –

20oC aktivitas enzim akan berlangsung secara lambat. Kebanyakan enzim menunjukkan

aktivitas optimal pada kisaran suhu 30o – 40oC. Dalam kisaran suhu 45o – 50oC, enzim

mulai mengalami denaturasi. Faktor lain seperti pH juga mempengaruhi aktibvitas

enzim, dimana pH optimum enzim pada pH 4,5 – 8. Secara umum aktivitas enzim

terjadi hanya pada kisaran pH yang sempit, oleh sebab itu media enzim harus benar-

benar dipelihara dengan menggunakan buffer ( larutan penyangga ) ( Tranggono &

Sutardi, 1990 ).

Enzim dibagi menjadi 2 macam berdasarkan komposisinya, yaitu enzim sederhana dan

enzim kompleks. Enzim kompleks dikenal sebagai haloenzim yang terdiri dari

komponen protein dan molekul organik kecil lainnya. Komponen protein disebut

dengan apoenzim dan molekul organik kecil lainnya (non enzim) dikenal sebagai

koenzim. Meskipun merupakan katalisator, enzim tidak selalu dapat mengkatalisa

substrat. Misalnya ADH selalu mengkatalisa reaksi oksidasi-reduksi tetapi memecahkan

nomor dari alkohol yang berbeda dari metanol menjadi butanol (Birch, 2002).

Enzim memiliki konstanta disosiasi pada gugus asam ataupun gugus basa terutama pada

residu terminal karboksil dan asam aminonya. Namun dalam suatu reaksi kimia, pH

untuk suatu enzim tidak boleh terlalu asam maupun terlalu basa karena akan

menurunkan kecepatan reaksi dengan terjadinya denaturasi. Enzim memiliki pH

optimum tertentu, misalnya enzim amylase mempunyai pH optimum sekitar 5–7, lalu

pepsin pada pH 2 dan pada kisaran pH tersebut enzim tersebut mempunyai kestabilan

yang tinggi (Williamson & Fieser, 1992).

Penyimpanan enzim yang dilakukan didalam pendingin sebelum digunakan dalam

percobaan aktivitasi enzim adalah untuk mencegah terjadinya kehilangan aktivitas

akibat denaturasi enzim atau hilangnya kofaktor yang penting. Dimana dengan

perlakuan ini akan menjamin kehilangan aktivitas enzim lebih minimal. Sedangkan

pembekuan dan thawing sebaiknya dicegah karena dapat menginaktifkan enzim dengan

cepat. Dan aktivitas dari enzim papain ini adalah sebagai pelunak daging dengan

melakukan pemecahan protein ( Gaman & Sherrington, 1994 ).

9

Pengujian aktivitas enzim amilase dapat dilakukan secara kuantitatif dan secara

kualitatif. Dalam pengujian kualitatif dapat digunakan larutan pati/amilum sebagai

substratnya. Pada nilai pH sekitar 6-7 dan dengan adanya kehadiran ion clorida, maka

amilase akan mengkatalisis hidrolisa pati dan menghasilkan dekstrin dan turunannya.

Pati dan dekstrin yang mempunyai berat molekul (BM) yang tinggi akan memberikan

warna biru ungu jika direaksikan dengan iodine. Sedangkan dekstrin dengan BM rendah

tidak akan bereaksi dengan iodine. Dengan demikian, kerja amilase dapat diamati

dengan perubahan yang terjadi. Achromic point adalah suatu keadaan dimana campuran

reaktan tidak membentuk warna lagi dengan iodine. Selain itu, pengujian enzim secara

kuantitatif adalah pengujian aktivitas enzim berdasarkan jumlah substrat yang berubah

sesuai dengan perubahan waktu (Tranggono & Setiaji, 1989).

Enzim amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber yaitu tanaman, hewan dan

mikroorganisme. Enzim amilase banyak terdapat dalam biji-bijian atau serealia. Enzim

pengurai pati ini terdiri dari 3 golongan, yaitu :

1. Alfa amilase (α-1.4 glukan glukanohidrolase)

Enzim ini menghidrolisa molekul pati dengan memecah ikatan α-1.4 glikosidik secara

acak mulai dari tengah bagian dalam molekul (endoamilase). Enzim ini menghidrolisis

amilopektin menjadi oligosakarida dan mengandung 2–6 satuan glukosa. Sedangkan

beta amilase merupakan endoenzim dan memutuskan satuan maltosa yang berurutan

dari ujung yang tidak mereduksi pada rantai glikosida. Kerjanya dihentikan pada titik

cabang yang mempunyai ikatan α–1,6 glukosida dan tidak dapat diputuskan oleh α

amilase. Senyawa yang dihasilkan dinamai dekstrin batas. Beta amilase hanya

ditemukan pada tumbuhan tingkat tinggi.

2. Beta amilase (α-1.4 glukan maltohidrolase)

Enzim ini menghidrolisa molekul pati dengan memecah ikatan α-1.4 glikosidik mulai

dari ujung molekul non pereduksi dan menghasilkan unit-unit maltosa (eksoamilase).

3. Amiloglukosidase (α-1.4 glukan glukohidrolase)

Enzim ini memisahkan glukosa molekul pati dari ujung non pereduksi (eksoamilase).

Produk yang terbentuk glukosa saja. Kerja gabungan α dan β-amilase dapat

meningkatkan aktivitas amilase. Kerja dan tujuan enzim amilase pada bahan makanan

10

khususnya bahan makanan yang mengandung karbohidrat adalah mengubah pati

menjadi dekstrin, gula dan meningkatkan penyerapan air (deMan, 1997).

Reaksi spesifik yang terjadi pada saat pati ditambah dengan iod akan memberi warna

biru tua, lalu pati dihidrolisis menjadi dekstrin dan jika direaksikan dengan iod akan

memberikan warna ungu untuk yang berat molekulnya besar dan warna merah coklat

jika berat molekulnya kecil. Jika dekstrin dihidrolisa lebih lanjut maka akan

menghasilkan maltosa dan glukosa yang jika direaksikan dengan dengan iod, tidak

memberi warna. Sehingga dapat kita ketahui bahwa larutan iodium merupakan indikator

warna (Noor, 1990).

Secara kuantitatif, terjadinya reaksi hidrolisis pati oleh enzim amilase dapat diketahui

dengan uji iodin (Riawan, 1990). Pada uji iodin, karbohidrat golongan pati akan

memberikan reaksi dengan larutan iodin dan memberi warna spesifik tergantung dari

jenis karbohidratnya. Amilosa dengan iodin akan berwarna biru, amilopektin dengan

iodin akan berwarna merah violet, glikogen maupun dekstrin dengan iodin akan

berwarna merah coklat (Sudarmadji et al., 1989).

Bila zat pati ditetesi larutan iodium akan timbul warna biru. Terjadinya warna ini

disebabkan oleh amylase yang mengabsorbsi iodium tersebut. (Ismail, 1990). Pati

berwarna putih dan berbentuk serbuk tidak larut dalam air karena lapisan luar granula-

granula yang terkandung di dalamnya tersusun amat rapat sehingga tidak tertembus oleh

air dingin. Pati tidak larut dalam air dingin karena ukurannya yang besar serta

membentuk dispersi koloid dengan air panas. Pati dapat dideteksi dengan larutan iod

dan dapat diubah menjadi glukosa dengan pemanasan air dan penambahan sedikit asam

(HCl atau H2SO4). Penggunaan iodine untuk reaksi terhadap pati untuk mengetahui

adanya amilum dalam suatu bahan pangan (Gaman & Sherington, 1994).

Enzim amilase ini juga banyak diproduksi oleh kapang. Kapang Aspergillus dan

Rhizopus merupakan jenis kapang yang banyak digunakan dalam produk fermentasi

seperti tempe, oncom, sake dan lain-lain (Andini, 1999). Kapang tersebut mempunyai

11

kemampuan tinggi dalam memproduksi enzim amilase yang merupakan campuran dari

α-amilase dan glukoamilase (Andini,1999).

Enzim proteolitik sangat penting dalam banyak prosedur pemrosesan makanan industri.

Reaksi yang dikatalisis oleh enzim proteolitik adalah hidrolisis ikatan peptida protein.

Enzim proteolitik dapat dibagi menjadi empat golongan yaitu :

1. Protease asam : merupakan kelompok enzim dengan pH optimum rendah. Yang

termasuk di dalamnya adalah pepsin, renin (kimosin), dan sejumlah besar protease

mikroba dan fungus. Renin, enzim murni yang terdapat dalam renet, adalah ekstrak

lambung anak sapi yang telah dipakai selama beribu – ribu tahun sebagai

pengkoagulasi dalam pembuatan keju. Aktivitas optimum renin adalah pada pH 3,5,

tetapi paling stabil pada pH 5 dan penggumpalan susu keju dilakukan pada pH 5,5 –

6,5. koagulasi atau penggumpalan susu oleh renin terjadi dalam dua tahap yaitu :

a. Tahap enzim, enzim bekerja terhadap k-kasein sehingga kasein ini tidak dapat lagi

menstabilkan misel kasein.

b. Tahap nonenzim, melibatkan penggumpalan misel kasein yang sudah

dimodifikasi oleh ion kalsium.

Pepsin dibentuk dalam mukosa lapis lambung berbentuk pepsinogen. Keasaman isi

lambung yang tinggi membantu pada pengubahan menjadi pepsin secara

autokatalitik. Protease asam dipakai pada pembuatan keju termasuk sediaan yang

diperoleh dari organisme Endothia parasitica, Mucor miehei, dan Mucor pusillus.

2. Protease serina : mencakup kimotripsin, tripsin, elastase, trombin, dan subtilisin.

Nama golongan ini mengacu ke bagian seril yang terlibat pada tapak aktif.

Kimotripsin, tripsin, dan elastase adalah enzim pankreas yang melaksanakan

fungsinya dalam saluran usus. Enzim ini diproduksi sebagai zimogen inaktif dan

diubah menjadi bentuk aktif oleh proteolisis terbatas.

3. Protease sulfhidril : memperoleh kenyataan bahwa gugus sulfhidril dalam molekul

sangat penting untuk aktivitasnya. Kebanyakan berasal dari tumbuhan dan dipakai

secara luas dalam industri makanan. Protease sulfhidril yang berasal dari hewan

hanya dua katepsin, yang terdapat dalam jaringan sebagai enzim intrasel. Enzim

yang terpenting dalam golongan ini adalah papain, fisin, dan bromelain. Protease

sulfhidril dipakai secara niaga termasuk penstabilan dan pembuatan bir tahan dingin.

12

4. Protease yang mengandung logam : enzim ini memerlukan logam untuk aktivitasnya

dan dihambat oleh senyawa yang mengkelat logam. Enzim ini merupakan

eksopeptidase dan termasuk karboksipeptidase A (peptidil-L-asam amino hidrolase)

dan B (peptidil-L-lisina hidrolase), yang menghilangkan asam amino dari ujung

rantai peptida yang mengandung gugus -karboksil bebas.

(de Man, 1997).

1.2. Tujuan Praktikum

Tujuan praktikum ini adalah mengetahui aktivitas enzim pada berbagai bahan pangan

dan cara mengekstrak enzim amilase dan protease pada bahan pangan tersebut. Selain

itu untuk mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim.

13

2. MATERI METODE

2.1. Materi

2.1.1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah sentrifuge, tabung sentrifus,

mortar, gelas beker, kain mori, pengaduk, tabung reaksi, waterbath, vortex, pipet volum,

pompa pilleus, pipet tetes, hot plate, gelas arloji, timbangan, baskom, penjepit, dan

spektrofotometer.

2.1.2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah es batu, tape singkong,

ketela, kecambah kacang hijau, nanas, pepaya muda, kedelai, buffer sitrat fosfat (pH 4,

pH 5, pH 6, dan pH 8), aquades, amilum 1%, iodine 0,01 N, azokasein, asam

trikloroasetat 10% dan NaOH 0,5 M.

2.2. Metode

Setiap kelompok melakukan ekstraksi enzim, uji aktivitas enzim amilase, dan protease

serta poin berikut:

Kelompok 1 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase

Kelompok 2 Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim amilase

Kelompok 3 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase

Kelompok 4 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim protease

Kelompok 5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim protease

Kelompok 6 Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim protease

2.2.1. Ekstraksi Enzim

Sampel setiap kelompok dihancurkan lalu ditimbang sebanyak 25 gram. Kemudian

ditambah dengan 50 ml buffer sitrat fosfat pH 4 yang mengandung NaCl 2%. Kemudian

14

diaduk di dalam selama 1 jam. Setelah itu disaring menggunakan kain mori. Hasil

penyaringan disentrifuge pada 1000 rpm selama 40 menit. Setelah sentrifugasi

supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan disimpan disuhu

dingin.

2.2.2. Pengukuran Aktivitas Amilase

Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 1 ml larutan buffer sitrat pH 5 yang mengandung

amilum 1% untuk diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 menit. Setelah itu ditambah

dengan 0,1 ml ekstrak enzim dan diinkubasi lagi pada suhu 37 oC selama 10 menit.

Setelah 10 menit, larutan ditambah dengan 0,5 ml iodine 0,01 N. Kemudian larutan

diencerkan dengan 9,4 ml aquades, lalu divortex sampai homogen. Kemudian setelah itu

diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm.

Untuk kontrol 1 ml buffer sitrat fosfat yang mengandung amilum 1% ditambah dengan

0,5 ml iod 0,01 N dan diencerkan dengan 8,5 aquades di dalam tabung reaksi.

Sedangkan untuk blanko 0,5 ml iod 0,01 N dimasukkan dalam tabung reaksi dan

ditambah dengan 9,5 ml aquades.

2.2.3. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Amilase

Disiapkan 3 tabung reaksi, yang mana tabung 1 berisi 1 ml larutan buffer sitrat pH 4

yang mengandung amilum 0,5%, tabung 2 berisi 1 ml larutan buffer sitrat pH 6 yang

mengandung amilum 0,5%, dan tabung 3 berisi 1 ml larutan buffer sitrat pH 8 yang

mengandung amilum 0,5%, yang selanjutnya ketiga tabung reaksi tersebut akan

diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 menit. Setelah itu ditambah dengan 0,1 ml ekstrak

enzim dan diinkubasi lagi pada suhu 37oC selama 10 menit. Setelah 10 menit, larutan

ditambah dengan 0,5 ml iodine 0,01 N. Kemudian larutan diencerkan dengan 9,4 ml

aquades, lalu divortex sampai homogen. Kemudian absorbansinya diukur dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm.



2.2.4. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Amilase

15

Disiapkan 3 tabung reaksi yang masing-masing diisi dengan 1 ml buffer fosfat pH 5

yang mengandung amilum 1% untuk diinkubasi pada suhu 37 oC selama 2 menit.

Setelah itu ditambah dengan 0,1 ml ekstrak enzim untuk masing-masing tabung.

Kemudian ketiga tabung dipanaskan dengan rincian tabung 1 pada suhu 40oC selama 10

menit di waterbath, tabung 2 pada suhu 100oC selama 10 menit di hotplate, dan tabung

3 dibiarkan pada suhu kamar (30oC) selama 30 menit. Setelah itu larutan ditambah

dengan 0,5 ml iodine 0,01 N. Kemudian larutan diencerkan dengan 9,4 ml aquades, lalu

divortex sampai homogen. Kemudian absorbansinya diukur dengan spektrofotometer

pada panjang gelombang 620 nm.



Rumus yang digunakan :

2.2.5. Pengukuran Aktivitas Protease

Tabung reaksi diisi dengan 1,2 ml azokasein dan 1,8 ml buffer sitrat fosfat pH 6.

Kemudian ditambah dengan 0,6 ml ekstrak enzim lalu diinkubasi dalam waterbath pada

suhu 37oC selama 2 menit. Setelah 2 menit larutan diambil sebanyak 1,2 ml dan

dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge yang sebelumnya diisi dengan 0,8 ml larutan

trikloroasetat 10%, lalu disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit.

Setelah sentrifugasi supernatant diambil sebanyak 1,6 ml dan ditambah dengan 1,6 ml

NaOH 0,5 M, lalu divortex. Setelah itu diukur absorbansinya dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 440 nm.

Untuk blanko dibuat dengan 1,2 ml azokasein dan 2,4 ml buffer sitrat fosfat pH 6.

2.2.6. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Protease

Disiapkan 3 tabung reaksi yang sudah diisi dengan 1,2 ml azokasein. Masing-masing

dari tabung reaksi tersebut kemudian ditambah 1 ml larutan buffer sitrat pH 4 untuk

16

tabung 1, 1 ml larutan buffer sitrat pH 6 untuk tabung 2, dan 1 ml larutan buffer sitrat

pH 8 untuk tabung 3. 0,6 ml ekstrak enzim lalu ditambahkan pada masing-masing

tabung dan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37oC selama 2 menit. Setelah 2

menit, larutan diambil sebanyak 1,2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge

yang sebelumnya diisi dengan 0,8 ml larutan trikloroasetat 10%, yang kemdian

disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Setelah sentrifugasi,

supernatant diambil sebanyak 1,6 ml dan ditambah dengan 1,6 ml NaOH 0,5 M, lalu

divortex. Setelah itu diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang 440 nm.


2.2.7. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Protease

Tiga tabung reaksi masing-masing diisi dengan 1,2 ml azokasein dan 1,8 ml buffer sitrat

fosfat pH 6. Kemudian ditambah dengan 0,6 ml ekstrak enzim untuk diberi perlakuan

tabung 1 pada suhu 40oC selama 10 menit di waterbath, tabung 2 pada suhu 100oC

selama 10 menit di hotplate, dan tabung 3 dibiarkan pada suhu kamar (30oC) selama 30

menit. Kemudian larutan tersebut diambil sebanyak 1,2 ml dan dimasukkan ke dalam

tabung sentrifuge yang sebelumnya diisi dengan 0,8 ml larutan trikloroasetat 10%, dan

disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Setelah sentrifugasi,

supernatant diambil sebanyak 1,6 ml dan ditambah dengan 1,6 ml NaOH 0,5 M, lalu

divortex. Setelah itu diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang 440 nm.


17

3. HASIL PENGAMATAN

Tabel 1. Pengukuran Aktivitas Enzim

Kelompok BahanAbsorbansi Aktivitas (mg/menit) Aktivitas Enzim Spesifik

Amilase Protease Amilase Protease Amilase ProteaseBlanko Kontrol

0,0890 - -

A1 Tape singkong

0,1018 -0,5255 -0,0101 -0,5255 -7,2142x10-7 -3,7535x10-5

A2 Ketela 0,0862 0,0826 2,202x10-3 0,0826 7,593x10-8 2,848x10-6

A3 Kecambah kacang hijau

0,1216 0,1210 -0,0256 0,1210 -8,827x10-7 4,172x10-6

A4 Nanas 0,1139 0,3895 -0,0195 0,3895 -4,875x10-6 9,737x10-5

A5 Pepaya Muda -0,0109 0,1184 0,0786 0,1184 1,288x10-5 1,9409x10-5

A6 Kedelai 0,3303 0,0737 -0,1898 0,0737 -4,8904x10-7 1,898x1--7

Pada tabel di atas dapat dilihat bahwa pada kelompok A1 yang menggunakan bahan

tape singkong diperoleh nilai absorbansi 0,1018 untuk enzim amilase dan -0,5255 untuk

enzim protease. Setelah dihitung aktivitas enzim amilase adalah -0,0101 mg/menit,

sedangkan untuk aktivitas enzim protease bernilai sama dengan nilai absorbansinya.

Untuk aktivitas enzim spesifiknya -7,2142x10-7 untuk enzim amilase dan -3,7535x10-5

untuk enzim protease. Pada kelompok A2 yang menggunakan ketela diperoleh nilai

absorbansi 0,0862 untuk enzim amilase dan 0,0826 untuk enzim protease. Setelah

dihitung aktivitas enzim amilase adalah 2,02x10-3 mg/menit, sedangkan untuk aktivitas

enzim spesifiknya 7,593x10-8 untuk enzim amilase dan 2,848x10-6 untuk enzim

protease.

Kelompok A3 yang menggunakan kecambah kacang hijau diperoleh nilai absorbansi

0,1216 untuk enzim amilase dan 0,1210 untuk enzim protease. Setelah dihitung

aktivitas enzim amilase adalah -0,0256 mg/menit. Untuk aktivitas enzim spesifiknya -

8,827x10-7 untuk enzim amilase dan 4,172x10-6 untuk enzim protease. Kelompok A4

yang menggunakan nanas diperoleh nilai absorbansi 0,1139 untuk enzim amilase dan

0,3895 untuk enzim protease. Setelah dihitung aktivitas enzim amilase adalah -0,0195

mg/menit. Untuk aktivitas enzim spesifiknya -4,875x10-6 untuk enzim amilase dan

9,737x10-5 untuk enzim protease.

18

Pada kelompok A5 yang menggunakan pepaya muda diperoleh nilai absorbansi -0,0109

untuk enzim amilase dan 0,1184 untuk enzim protease. Setelah dihitung aktivitas enzim

amilase adalah 0,0786 mg/menit. Untuk aktivitas enzim spesifiknya 1,288x10-5 untuk

enzim amilase dan 1,9409x10-5 untuk enzim protease. Sedangkan pada kelompok A6

diperoleh nilai absorbansi 0,3303 untuk enzim amilase dan 0,0737 untuk enzim

protease. Setelah dihitung aktivitas enzim amilase adalah -0,1898 mg/menit. Untuk

aktivitas enzim spesifiknya -4,8904x10-7 untuk enzim amilase dan 1,898x10-7 untuk

enzim protease. Pada percobaan ini juga diperoleh nilai absorbansi blanko kontrol

sebesar 0,0890.

19

Tabel 2. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim

Kelompok BahanpH 4 pH 6 pH 8

Absorbansi AktivitasAktivitas spesifik



A1 Tape singkong

0,0259 0,0496 3,542x10-6 0,0844 3,617x10-3 2,583x10-7 0,0311 0,0455 3,25x10-6

A3 Kecambah kacang hijau

0,0568 0,0253 8,724x10-7 0,1202 -0,2453 -8,458x10-6 0,0314 0,0453 1,562x10-6

A4 Nanas 0,0846 0,0846 2,115x10-5 0,2643 0,2643 6,607x10-3 0,6342 0,6342 1,585x10-4

Pada tabel di atas dapat dilihat bahwa pada kelompok A1, pada pH 4 diperoleh nilai absorbansi 0,0259 dan aktivitas enzim amilase adalah

0,0496 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya 3,542x10-6. Sedangkan pada pH 6 diperoleh nilai absorbansi 0,0844 dan aktivitas enzim

amilase adalah 3,617x10-3 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya 2,583x10-7. Dan untuk pH 8 diperoleh nilai absorbansi 0,0311 dan

aktivitas enzim amilase adalah 0,0455 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya 3,25x10 -6. Pada kelompok A3, pada pH 4 diperoleh nilai

absorbansi 0,0568 dan aktivitas enzim amilase adalah 0,0253 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya 8,724x10-7. Sedangkan pada pH 6

diperoleh nilai absorbansi 0,1202 dan aktivitas enzim amilase adalah -0,2453 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya -8,458x10 -6. Dan

untuk pH 8 diperoleh nilai absorbansi 0,0314 dan aktivitas enzim amilase adalah 0,0453 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya

1,562x10-6. Sedangkan pada kelompok A4, pada pH 4 diperoleh nilai absorbansi 0,0846 dan aktivitas enzim protease adalah sama dengan

nilai absorbansinya serta aktivitas enzim spesifiknya 2,115x10-5. Sedangkan pada pH 6 diperoleh nilai absorbansi 0,2643 dan aktivitas

enzim spesifiknya 6,607x10-3. Dan untuk pH 8 diperoleh nilai absorbansi 0,6342 dan aktivitas enzim spesifiknya 1,585x10-4.

20

Tabel 3. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim

Kelompok Bahan300C 400C 1000C




A2 Ketela 0,0909 -0,6449 -2,223x10-5 0,1135 -0,0192 -6,62x10-7 0,2268 -0,1083 -3,734x10-6

A5 Pepaya muda 0,0795 0,0795 1,303x10-5 0,3159 0,3159 5,178x10-5 0,0986 0,0986 1,616x10-5

A6 Kedelai 0,1295 0,1295 3,336x10-7 0,0377 0,0377 9,713x10-8 0,0815 0,0815 2,099x10-7

Pada tabel di atas dapat dilihat bahwa pada kelompok A2, pada suhu 300C diperoleh nilai absorbansi 0,0909 dan aktivitas enzim amilase

adalah -0,6449 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya -2,223x10-5. Sedangkan pada suhu 400C diperoleh nilai absorbansi 0,1135 dan

aktivitas enzim amilase adalah -0,0192 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya -6,62x10-7. Dan untuk suhu 1000C diperoleh nilai

absorbansi 0,2268 dan aktivitas enzim amilase adalah -0,1083 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya -3,734x10-6. Pada kelompok A5,

pada suhu 300C diperoleh nilai absorbansi 0,0795 dan aktivitas enzim protease adalah sama dengan nilai absorbansinya serta aktivitas

enzim spesifiknya 1,303x10-5. Sedangkan pada suhu 400C diperoleh nilai absorbansi 0,3159 dan aktivitas enzim spesifiknya 5,178x10 -5.

Dan untuk suhu 1000C diperoleh nilai absorbansi 0,0986 dan aktivitas enzim spesifiknya 1,616x10-5. Sedangkan pada kelompok A6, pada

suhu 300C diperoleh nilai absorbansi 0,1295 dan aktivitas enzim protease adalah sama dengan nilai absorbansinya serta aktivitas enzim

spesifiknya 3,336x10-7. Sedangkan pada suhu 400C diperoleh nilai absorbansi 0,0377 dan aktivitas enzim spesifiknya 9,713x10-8. Dan

untuk suhu 1000C diperoleh nilai absorbansi 0,0815 dan aktivitas enzim spesifiknya 2,099x10-7.

21

4. PEMBAHASAN

Dalam praktikum kali ini akan dibahas lebih dalam mengenai enzim, yang lebih

khusunya praktikan akan membahas mengenai enzim amilase dan protease. Ada

berbagai macam pengertian enzim. Menurut Winarno, enzim adalah suatu katalis

biologis yang dapat mempercepat terjadinya keseimbangan suatu reaksi kimia. Ada juga

yang mengatakan enzim adalah substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan

beperan sebagai katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme.

Karena perannya sebagai katalisator, maka enzim dapat mempercepat suatu reaksi,

tetapi tidak menimbulkan produk samping karena katalisator adalah substansi yang

mempercepat reaksi tetapi pada hasil reaksi, substansi tersebut tidak berubah. Enzim

juga memiliki spesifitas tinggi terhadap substrat, atau dengan kata lain hanya mau

mengkatalis reaksi tertentu dengan substrat tertentu saja.

Ada beberapa keuntungan dalam memanfaatkan enzim sebagai katalisator biologis.

Pertama beberapa enzim relatif mudah diekstraksi dan dimurnikan secara parsial dalam

bentuk konsentrat dari bahan biologis. Kedua, enzim memperlihatkan aktivitas optimum

panda kondisi yang berbeda dengan lingkungan asalnya. Ketiga, enzim memiliki derajat

spesifitas tinggi dalam reaksi yang dikatalisa, dan kebanyakan kasus hanya satu jenis

reaksi saja enzim dapat bekerja khususnya di bidang teknologi pangan. Akhirnya enzim

lebih efisien daripada katalisator kimia yaitu sebesar 105-108 kalinya (Tranggono &

Sutardi , 1989).

Kebanyakan dari semua enzim disusun oleh protein, kecuali ribozymes. Ribozymes

adalah molekul dari asam nukleat yang mengkatalisa reaksi yang terjadi pada ikatan

fosfodiester dari RNA lain. Beberapa enzim hanya terdiri atas protein, tetapi

kebanyakan enzim mengandung non-protein tambahan seperti karbohidrat, lipid, logam,

fosfat, atau beberapa bagian organik yang lain. Beberapa bagian pada enzim yaitu :

Kofaktor

Bila enzim dalam melakukan aktivitasnya membutuhkan zat kimia tertentu, dan zat

kimia tertentu itu disebut kofaktor. Dimana kofaktor itu terikat kuat pada enzim.

Disamping itu kofaktor stabil selama pemanasan.

22

Koenzim

Bagian kofaktor yang berupa molekul organik seperti tiamin pirofosfat, flavin, adenin

dinukleotida, NAD, koenzim A, piridoksal fosfat, biositin, tetrahidrofolat, dan

sebagainya.

Apoenzim

Bagian enzim yang merupakan protein yang menempati porsi terbesar dalam enzim.

Apoenzim memiliki sifat seperti protein, salah satu sifat yang utama yaitu apoenzim

akan terdenaturasi selama pemanasan (Martoharsono,1994).

Disamping pengelompokan secara resmi ada pula pengelompokan yang berdasarkan

akhiran pada nama enzim tersebut, yaitu :

• Akhiran ase, semua enzim yang memakai akhiran ini memiliki fungsi mengkatalisis

hidrolisis substrat tertentu.

• Akhiran in, semua enzim yang memakai akhiran ini berarti menerangkan substrat apa

yang diuraikan oleh enzim tersebut (Martoharsono,1994).

Enzim dapat digolongkan menjadi enam kelas berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisa

yaitu:

1. Kelas oksidoreduktase, reaksi yang dikatalisis adalah reaksi pemindahan elektron.

2. Kelas transferase, reaksi yang dikatalisis adalah reaksi pemindahan gugus fungsional.

3. Kelas hidrolase, reaksi yang dikatalisis yaitu reaksi hidrolisis atau reaksi pemindahan

gugus fungsional ke dalam air.

4. Kelas liase, reaksi yang dikatalisis adalah reaksi penambahan gugus ke dalam ikatan

rangkap atau sebaliknya.

5. Kelas isomerase, reaksi yang dikatalisis adalah reaksi pemindahan gugus di dalam

molekul menghasilkan bentuk isomer.

6. Kelas ligase, reaksi yang dikatalisis yaitu reaksi pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O,

dan C-N oleh reaksi kondensasi yang berkaitan dengan penguraian ATP

(Martoharsono,1994).

Dalam percobaan kali ini, dilakukan berbagai macam pengujian. Pengujian dimulai

dengan ekstraksi enzim, kemudian uji pengukuran aktivitas enzim amilase dan protease,

23

uji pengaruh pH terhadap aktivitas enzim amilase dan protease, dan uji pengaruh suhu

terhadap aktivitas enzim amilase dan protease. Setelah bahan dan alat dipersiapkan,

ekstraksi enzim dimulai dengan sampel setiap kelompok dihancurkan lalu ditimbang

sebanyak 25 gram, kemudian ditambah dengan 50 ml buffer sitrat fosfat pH 4 yang

mengandung NaCl 2% dan diaduk di dalam selama 1 jam. Setelah itu disaring

menggunakan kain mori. Hasil penyaringan disentrifuge pada 1000 rpm selama 40

menit. Setelah sentrifugasi supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi

dan disimpan disuhu dingin.

Filtrasi atau penyaringan adalah salah satu cara untuk memisahkan antar partikel padat

dengan partikel cair termasuk gas. Pada penyaringan campuran yang terdiri atas partikel

padat yang terdispersi dalam fase cair atau gas, dilewatkan dengan melalui medium

berpori. Partikel padat yang tidak lolos pada pori - pori medium akan tertahan

sedangkan cairan akan lolos melalui pori - pori medium tersebut. Cairan yang lolos dari

medium tersebut disebut dengan filtrat dan partikel padatan yang tertahan dikenal

dengan ' cake '. Sebagai medium penyaring, dapat digunakan kain saring, anyaman

kawat, dan anyaman plastik (Tranggono & Sutardi, 1989 ).

Cara untuk mendapatkan ekstrak enzim kasar dari masing - masing makhluk hidup pun

berbeda - beda. Bila sumber enzim berasal dari tanaman atau hewan maka jaringan

tanaman dan hewan tersebut dihancurkan sampai rata dalam air/buffer. Bagian yang

tidak larut dipisahkan dengan sentrifugasi/penyaringan sehingga diperoleh ekstrak

berupa cairan. Sedangkan untuk sumber enzim berasal dari mikrobia, maka sel mikrobia

dipanen dari kulltur medianya kemudian sel dipecah dengan cara menggiling/lisis

kemudian dilakukan ekstraksi dengan air/buffer. Enzim ekstraselular mikrobia diperoleh

dengan cara menyaring/sentrifugasi untuk memisahkan sel/miselia dan bahan padat

lainnya dari kultur medianya (Tranggono & Sutardi, 1990). Ekstraksi dengan cara

penggojogan atau sentrifugasi. Akan didapatkan dua bagian, yaitu supernatan dan residu

(Winarno, 1995).

24



akibat denaturasi enzim atau hilangnya kofaktor yang penting. Dimana dengan

perlakuan ini akan menjamin kehilangan aktivitas enzim lebih minimal. Sedangkan

pembekuan dan thawing sebaiknya dicegah karena dapat menginaktifkan enzim dengan

cepat ( Gaman & Sherrington, 1994 ).

Ekstraksi yang dilakukan biasanya dengan menggunakan pelarut organik, namun

terkadang juga bisa menggunakan pelarut organik sebagai pemurni dengan prinsip sama

dengan ekstraksi. Pada dasarnya pelarut sifatnya lebih fleksibel. Pelarut yang digunakan

harus memenuhi berbagai ketentuan yaitu :

Kelarutan

Pelarut haruslah memiliki kemampuan melarutkan yang tinggi

Kerapatan

Konsentrasi pelarut haruslah berbeda jauh dengan konsentrasi ekstrak enzim yang

akan dipisahkan dari larutannya.

Spesifitas

Pelarut haruslah hanya dapat melarutkan zat yang dituju.

Reaktifitas

Pelarut haruslah tidak menyebabkan reaksi pada bahan yang akan diekstrak.

( Gaman & Sherrington, 1994 ).

Untuk selanjutnya dilakukan pengujian pengukuran aktivitas enzim amilase dan

protease. Hasil absorbansi yang didapat adalah kelompok A6 memiliki nilai absorbansi

enzim amilase yang paling besar di antara semua kelompok yaitu 0,3303 sedangkan

yang memiliki nilai absorbansi enzim amilase yang paling kecil adalah kelompok A5

sebesar -0,0109. Sedangkan nilai absorbansi enzim protease yang sekaligus nilai

aktivitas enzim protease yang paling besar adalah kelompok A4 yaitu 0,3895 sedangkan

yang memiliki nilai absorbansi enzim protease yang paling kecil adalah kelompok A1

yaitu -0,5255. Untuk nilai aktivitas enzim amilase yang terbesar adalah kelompok A5

yaitu 0,0786 dan yang terkecil adalah kelompok A6 sebesar -0,1898. Untuk nilai

aktivitas enzim spesifik amilase yang terbesar adalah kelompok A5 yaitu 1,288x10 -5,

25

sedangkan yang paling kecil adalah kelompok A1 sebesar -7,2142x10-7 dan untuk nilai

aktivitas enzim spesifik protease yang terbesar adalah kelompok A4 yaitu 9,737x10 -5

sedangkan yang terkecil adalah kelompok A1 yaitu -3,7535x10-5.

Salah satu cara untuk mengetahui adanya zat kimia pada suatu medium adalah dengan

cara spektrofotometri. Cara ini dilakukan dengan melewatkan suatu cahaya atau sinar

putih pada medium tertentu. Yang akan tampak adalah cahaya yang telah diabsorbsi dan

diteruskan untuk setiap konsentrasi yang berbeda sehingga akan terjadi perbedaan

warna. Analisa secara spektrofotometri merupakan pengukuran seberapa jauh emisi

radiasi yang akan diserap/diabsorbsi oleh suatu sistem sebagai fungsi panjang

gelombang dari radiasi maupun pengurangan absorbansi suatu panjang gelombang

(Ewing, 1982). Untuk hasil yang memiliki nilai minus (-) hal ini bisa dikarenakan debu

yang dapat mengganggu bekerjanya sistem optik, hal ini dapat mengakibatkan

kesalahan, kesalahan ini dapat dihindari dengan melindungi peralatan dari debu.

Kesalahan dapat meliputi kesalahan penimbangan, pengendalian pH yang keliru,

pengukuran volume serta ketidakstabilan warna pada reaksi (Khopkar, 2002).

Secara kuantitatif, terjadinya reaksi hidrolisis pati oleh enzim amilase dapat diketahui

dengan uji iodin (Riawan, 1990). Reaksi spesifik yang terjadi pada saat pati ditambah

dengan iod akan memberi warna biru tua, lalu pati dihidrolisis menjadi dekstrin dan jika

direaksikan dengan iod akan memberikan warna ungu untuk yang berat molekulnya

besar dan warna merah coklat jika berat molekulnya kecil. Jika dekstrin dihidrolisa

lebih lanjut maka akan menghasilkan maltosa dan glukosa yang jika direaksikan dengan

dengan iod, tidak memberi warna. Sehingga dapat kita ketahui bahwa larutan iodium

merupakan indikator warna (Noor, 1990).

Enzim amilase ini juga banyak diproduksi oleh kapang. Kapang Aspergillus dan

Rhizopus merupakan jenis kapang yang banyak digunakan dalam produk fermentasi

seperti tempe, oncom, sake dan lain-lain (Andini, 1999). Kapang tersebut mempunyai

kemampuan tinggi dalam memproduksi enzim amilase yang merupakan campuran dari

α-amilase dan glukoamilase (Andini,1999). Pada uji aktivitas enzim amilase kali ini,

seharusnya kelompok A1 memiliki nilai aktivitas yang cukup tinggi karena memang

26

bahan tape singkong yang digunakan adalah sebuah produk fermentasi dari ketela.

Namun mungkin dikarenakan kesalahan praktikan ataupun karena debu yang dapat

mengganggu bekerjanya sistem optik, hal ini dapat mengakibatkan kesalahan, kesalahan

ini dapat dihindari dengan melindungi peralatan dari debu. Kesalahan dapat meliputi

kesalahan penimbangan, pengendalian pH yang keliru, pengukuran volume serta

ketidakstabilan warna pada reaksi (Khopkar, 2002), sehingga hasil yang didapat tidak

maksimal.

Untuk kelompok A4 yang menggunakan nanas yang memiliki nilai absorbansi terbesar,

hal ini menunjukkan bahwa nanas mengandung enzim protease paling banyak, yang

mana jenis enzim protease yang dikandung adalah jenis enzim protease sufhidril. Enzim

protease sufhidril merupakan salah satu jenis enzim protease yang banyak terdapat pada

jaringan buah. Enzim jenis ini memiliki gugus sufhidril yang sangat berperan dalam

meningkatkan aktivitas enzim. Oleh sebab itulah, keberadaan gugus sufhidril

tersebutlah yang diduga menyebabkan nilai aktivitas enzim protease pada nanas lebih

besar bila dibandingkan dengan keempat bahan lainnya. Hal ini sesuai dengan pendapat

yang diutarakan oleh de Man (1997) bahwa gugus sulfhidril dalam molekul enzim

protease jenis sufhidril sangat penting untuk aktivitasnya.

Untuk pengujian selanjutnya yaitu pengaruh pH terhadap aktivitas enzim, didapatkan

hasil bahwa pada kelompok A1, pada pH 4 diperoleh nilai absorbansi 0,0259 dan

aktivitas enzim amilase adalah 0,0496 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya

3,542x10-6. Sedangkan pada pH 6 diperoleh nilai absorbansi 0,0844 dan aktivitas enzim

amilase adalah 3,617x10-3 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya 2,583x10-7. Dan

untuk pH 8 diperoleh nilai absorbansi 0,0311 dan aktivitas enzim amilase adalah 0,0455

mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya 3,25x10-6. Pada kelompok A3, pada pH 4

diperoleh nilai absorbansi 0,0568 dan aktivitas enzim amilase adalah 0,0253 mg/menit

serta aktivitas enzim spesifiknya 8,724x10-7. Sedangkan pada pH 6 diperoleh nilai

absorbansi 0,1202 dan aktivitas enzim amilase adalah -0,2453 mg/menit serta aktivitas

enzim spesifiknya -8,458x10-6. Dan untuk pH 8 diperoleh nilai absorbansi 0,0314 dan

aktivitas enzim amilase adalah 0,0453 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya

1,562x10-6. Sedangkan pada kelompok A4, pada pH 4 diperoleh nilai absorbansi 0,0846

27

dan aktivitas enzim protease adalah sama dengan nilai absorbansinya serta aktivitas

enzim spesifiknya 2,115x10-5. Sedangkan pada pH 6 diperoleh nilai absorbansi 0,2643

dan aktivitas enzim spesifiknya 6,607x10-3. Dan untuk pH 8 diperoleh nilai absorbansi

0,6342 dan aktivitas enzim spesifiknya 1,585x10-4.

Pada pH 6, nilai absorbansi semua kelompok menunjukkan nilai absorbansi yang

teroptimal. Hal ini sesuai dengan teori yang dikemukakan oleh Williamson & Fieser

(1992), sebenarnya enzim juga memiliki pH optimum tertentu, pada umumnya sekitar

4,5–8, dan pada kisaran pH tersebut enzim mempunyai kestabilan yang tinggi. Jika

medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim mengalami inaktivasi.

Tranggono & Sutardi (1990) menambahkan, bahwa suasana yang terlalu asam atau

alkalis menyebabkan denaturasi protein dan hilangnya secara total aktivitas aktivitas

enzim. Pada sel hidup, perubahan pH sangat kecil. Enzim hanya aktif pada kisaran pH

yang sempit. Oleh karena itu media harus benar – benar dipelihara dengan

menggunakan buffer (larutan penyangga). Jika enzim memiliki lebih dari satu substrat,

maka pH optimumnya akan berbeda pada suatu substrat.

Sedangkan untuk pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim, menghasilkan hasil

bahwa pada kelompok A2, pada suhu 300C diperoleh nilai absorbansi 0,0909 dan

aktivitas enzim amilase adalah -0,6449 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya -

2,223x10-5. Sedangkan pada suhu 400C diperoleh nilai absorbansi 0,1135 dan aktivitas

enzim amilase adalah -0,0192 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya -6,62x10-7.

Dan untuk suhu 1000C diperoleh nilai absorbansi 0,2268 dan aktivitas enzim amilase

adalah -0,1083 mg/menit serta aktivitas enzim spesifiknya -3,734x10 -6. Pada kelompok

A5, pada suhu 300C diperoleh nilai absorbansi 0,0795 dan aktivitas enzim protease

adalah sama dengan nilai absorbansinya serta aktivitas enzim spesifiknya 1,303x10 -5.

Sedangkan pada suhu 400C diperoleh nilai absorbansi 0,3159 dan aktivitas enzim

spesifiknya 5,178x10-5. Dan untuk suhu 1000C diperoleh nilai absorbansi 0,0986 dan

aktivitas enzim spesifiknya 1,616x10-5. Sedangkan pada kelompok A6, pada suhu 300C

diperoleh nilai absorbansi 0,1295 dan aktivitas enzim protease adalah sama dengan nilai

absorbansinya serta aktivitas enzim spesifiknya 3,336x10-7. Sedangkan pada suhu 400C

diperoleh nilai absorbansi 0,0377 dan aktivitas enzim spesifiknya 9,713x10-8. Dan untuk

28

suhu 1000C diperoleh nilai absorbansi 0,0815 dan aktivitas enzim spesifiknya

2,099x10-7.

Pada suhu 40oC aktivitas enzim bernilai paling besar. Hal ini menunjukkan bahwa pada

kisaran suhu tersebut enzim bekerja secara optimum sehingga nilai kuantitatif

aktivitasnya besar. Hal ini sesuai dengan teori yang dikemukakan Gaman & Sherrington

(1994) menurutnya, aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu. Suhu optimal enzim

berkisar antara 30- 40 ºC, yaitu suhu tubuh. Pada suhu diatas dan dibawah optimalnya,

aktifitas enzim berkurang. Diatas suhu 50 ºC enzim secara bertahap menjadi inaktif

karena protein terdenaturasi. Pada suhu 100 ºC semua enzim rusak. Pada suhu sangat

rendah, enzim tidak benar - benar rusak tetapi aktifitasnya sangat banyak berkurang.

Pada setiap pengujian selalu digunakan larutan buffer. Larutan buffer adalah larutan

yang tahan panas terhadap perubahan pH dengan penambahan asam atau basa. Larutan

seperti itu digunakan dalam berbagai percobaan biokimia dimana dibutuhkan pH yang

terkontrol dan tepat (Fardiaz, 1992). Buffer dapat mempertahankan kondisi enzim

presipitat agar tidak terjadi perubahan pH dan mencegah agar enzim tidak mengalami

inaktivasi. Larutan buffer pH 6,0 dan amonium sulfat kering sering ditambahkan untuk

mempertahankan kondisi presipitat enzim pada pH tertentu agar selama penyimpanan

tidak mudah terdenaturasi oleh karena perubahan pH, dimana selama proses

penyimpanan, pH cenderung tidak stabil dan dapat terjadi perubahan suhu. Oleh karena

itu penyimpanan dilakukan pada suhu rendah untuk mencegah proses inaktivasi enzim

tersebut ( Winarno, 1995 ).

Dalam perhitungan untuk menentukan aktivitas enzim amilase dan menentukan

aktivitas enzim spesifik baik enzim amilase maupun protease digunakan rumus :

29

5. KESIMPULAN

Enzim adalah substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan berperan sebagai

katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme.

Katalisator adalah substansi yang mempercepat reaksi tetapi pada hasil reaksi,

substansi tersebut tidak berubah.

Enzim juga memiliki spesifitas tinggi terhadap substrat, atau dengan kata lain

hanya mau mengkatalis reaksi tertentu dengan substrat tertentu saja.

Filtrasi atau penyaringan adalah salah satu cara untuk memisahkan antar partikel

padat dengan partikel cair termasuk gas.



akibat denaturasi enzim atau hilangnya kofaktor yang penting.

Salah satu cara untuk mengetahui adanya zat kimia pada suatu medium adalah

dengan cara spektrofotometri.

Debu dapat mengganggu bekerjanya sistem optik, hal ini dapat mengakibatkan

kesalahan yang meliputi kesalahan penimbangan, pengendalian pH yang keliru,

pengukuran volume serta ketidakstabilan warna pada reaksi.

Secara kuantitatif, terjadinya reaksi hidrolisis pati oleh enzim amilase dapat

diketahui dengan uji iodin.

Pada pH 6, nilai absorbansi semua kelompok menunjukkan nilai absorbansi yang

teroptimal.

Enzim memiliki pH optimum tertentu, pada umumnya sekitar 4,5–8, dan pada

kisaran pH tersebut enzim mempunyai kestabilan yang tinggi.

Jika medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim mengalami inaktivasi.

Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu optimal enzim berkisar antara 30- 40 ºC,

yaitu suhu tubuh.

30

Diatas suhu 50 ºC enzim secara bertahap menjadi inaktif karena protein

terdenaturasi dan pada suhu 100 ºC semua enzim rusak, sedangkan pada suhu

sangat rendah, enzim tidak benar - benar rusak tetapi aktifitasnya sangat banyak

berkurang.

Larutan buffer adalah larutan yang tahan panas terhadap perubahan pH dengan

penambahan asam atau basa.

Larutan buffer pH 6,0 dan amonium sulfat kering sering ditambahkan untuk

mempertahankan kondisi presipitat enzim pada pH tertentu agar selama

penyimpanan tidak mudah terdenaturasi oleh karena perubahan pH, dimana

selama proses penyimpanan, pH cenderung tidak stabil dan dapat terjadi

perubahan suhu.

Semarang, 28 Agustus 2009 Asisten dosen :

Praktikan Kelompok A1 : - Oeij Ling Shia

1. Hendri Gunawan / 08.70.0017 - Shierly Gunawan

2. Felisia Danika / 08.70.0044

3. M. M. Citra Dewi / 08.70.0079

4. Martha Intan B. / 08.70.0127

31

6. DAFTAR PUSTAKA

Andini, L. S. (1999). Seleksi Kapang Iradiasi Untuk Produksi Enzim Amilase Pada Substrat Sagu. Sainteks Vol. VI No. 2.

Birch, P. (2002). Enzyme Kinetics.University of Paisley. www.medicine.indstate.edu

de Man, J. M. (1997). Kimia Makanan edisi kedua. ITB. Bandung.

Ewing, G.W. (1985). Instrumental Methods of Chemical Analysis. McGraw-Hill Book Company. USA.

Fardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka. Jakarta.

Gaman, P. M. & K. B. Sherrington. (1994). Ilmu Pangan, Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi dan Mikrobiologi. Universitas Gadjah Mada press. Yogyakarta.

Ismail, S.D. (1990). Nutrisi Dan Kesehatan. Universitas Gajah Mada. Yogyakarta

Khopkar,S.M . (2002) . Konsep Dasar Kimia Analitik . Universitas Indonesia Pers . Jakarta.

Lee, J. M. (1992). Biochemical Engineering. Prentice Hall Inc. New Jersey.

Martoharsono, S. (1994). Biokimia I. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Noor, Z. (1990). Biokimia Nutrisi. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Jakarta.

Panji, Tri, Suharyanto, Gunawan & Khaswar Syamsu. 2005. Biokonversi Minyak Sawit Kasar Menggunakan Desaturase Amobil Sistem Curah pada Skala Semipilot. Menara Perkebunan :63-73. www.ipard.com.publikasi/e-jurnal/biotek/MP70-02-03.pdf

Rahman, A. (1992). Teknologi Fermentasi. Penerbit Arcan. Jakarta.

Riawan, S. (1990). Kimia Organik edisi 1. Binarupa Aksara. Jakarta.

Richana, Nur, Ahmad Thontowi & Pia Lestina. 2002. Teknik Produksi Amilase Skala Pilot dari Isolat Rekombinan Pembawa Gen Amilase.http://www.indobiogen.or.id/terbitan/prosiding/fulltext_pdf/prosiding2002_365-372_nurrichana.pdf

http://www.ipard.com.publikasi/e-jurnal/biotek/MP70-02-03.pdf

http://www.medicine.indstate.edu/

32

Sudarmadji, S; B. Haryono; & Suhardi. (1989). Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty. Yogyakarta.

Tranggono & B. Setiaji. (1989). Biokimia Pangan. Gadjahmada University Press. Yogyakarta.

Tranggono & Sutardi. (1989). Biokimia dan Teknologi Pasca Panen. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Tranggono, B. S. & B. Sutardi. (1990). Biokimia dan Teknologi Pasca Panen. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Whitaker, J.R. (1994). Principles of Enzymology for the Food Sciences. Marcel Dekker Inc. California.

Williamson, K. L & L. F. Fieser. (1992). Organic experiment 7 th edition. D.C. Health Company. United States of America.

Winarno, F. G. (1995). Enzim Pangan. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

33

7. LAMPIRAN

7.1. Perhitungan

Tabel 1. Pengujian Aktifitas Enzim

Perhitungan:

Aktivitas Enzim amilase :

Aktivitas Enzim spesifik :

A1 A2

Kadar Protein : 14000 ppm Kadar Protein : 29000 ppm

Aktivitas Enzim amilase: Aktivitas Enzim amilase:

= -0,0101

=2,202x10-3

Aktivitas Enzim spesifik amilase: Aktivitas Enzim spesifik amilase:

= -7,2141x10-7 = 7,5931x10-8

Aktivitas Enzim spesifik protease: Aktivitas Enzim spesifik protease:

= -3,7535x10-5 = 2,8482x10-6

A3 A4



= -0,0256 = -0,0195


= -8,8275x10-7 = -4,875x10-6


= 4,1724x10-6 = 9,7375x10-5

34

A5 A6



= 0,0786 =-0,1898


= 1,2885x10-5 = -4,8904x10-7


= 1,9409x10-5 = 1,8989x10-7

Tabel 2 Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim

Perhitungan:



A1 A3


pH 4 pH 4


= 0,0496 =0,0253


= 3,542x10-6 = 8,724x10-7

pH 6 pH 6


= 3,6179x10-3 =-0,2453


= 2,583x10-7 = -8,458x10-6

35

pH 8 pH 8


= 0,0455 =0,0453


= 3,542x10-6 = 1,562x10-6

A4

Kadar Protein : 4000 ppm

pH 4

Aktivitas Enzim spesifik protease:

= 2,115x10-5

pH 6


= 6,607x10-5

pH 8


= 1,585x10-4

Tabel 3 Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim

Perhitungan:



A2 A5


Suhu 300C Suhu 300C

Aktivitas Enzim amilase: Aktivitas Enzim spesifik protease:

36

= -0,6449 = 1,303x10-5

Aktivitas Enzim spesifik amilase: Suhu 400C

= -2.223x10-5 Aktivitas Enzim spesifik protease:

Suhu 400C = 5,178x10-5

Aktivitas Enzim amilase: Suhu 1000C

= -0,0192 Aktivitas Enzim spesifik protease:

Aktivitas Enzim spesifik amilase: = 1,616x10-5

= -6,62x10-7

Suhu 1000C

Aktivitas Enzim amilase:

= -0,1083

Aktivitas Enzim spesifik amilase:

= -3,734x10-6

A6

Kadar protein : 388100 ppm

Suhu 300C


= 3,336x10-7

Suhu 400C


= 9,713x10-8

Suhu 1000C


37

= 2,099x10-7

7.2. Laporan Sementara

Documents

biokim_enzim