Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi

ECZ 344/8. Ders 22.05.2014

Prof.Dr. Dilek AKYÖNTEM SEÇİMİ VE DEĞERLENDİRME

1

Yöntem Seçimi

Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için yöntem seçiminde validasyon

parametreleri, hız ve kolaylık için farklı gereksinimler söz konusudur.

Örneğin,

aşırı doz için yapılan işlemlerde bol miktarda plazma numunesi ile

ekstraksiyon, kromatografik saflaştırma ve analiz basamakları izlenir.

Yüksek düzeyde kesinlik ve duyarlılık gerektiğinde ucuz olmayan ve

uzmanlık gerektiren yöntemlere ihtiyaç duyulur.

Analitik verilerin çok önemli olmadığı durumlarda ucuz bir yöntem veya

rutin bir deney protokolü kullanılır.

2

Yöntem Seçimi

İlacı sentezleyen kimyacı NMR ve kütle spektrumu yardımı ile gerekli yapısal

bilgileri sağlar.

UV spektrumu bilindiğinde sonraki kromatografik çalışmanın saptama

basamağı için önemli bir veri elde edilir.

ITK ile ön ilaç formu, yan ürünler ve parçalanma ürünleri veya metabolitler

ilgili bileşikten ayrılabilir.

Stabilite hakkında bilgi sahibi olmak çok önemlidir.

3

Analitik Profil

Bileşiğin Karakterizasyonu

Fizikokimyasal karakteristikleri

UV-görünür bölge spektrumu

Floresans spektrumu

ITK

HPLC

GC

Kütle Spektrometri

NMR

Çözünürlük

4

Fizikokimyasal Karakteristikler

Çalışılan bileşik için,

Çeşitli çözücülerde çözünürlük

İyonize olabiliyorsa bileşiğe ait pKa değeri

Molekül ağırlığı

Optikçe aktif formun varlığı

analizi yürüten tarafından bilinmelidir.

5

Ultraviyole-Görünür Bölge Spektrometri

Absorpsiyon düzeyi incelenir, yüksek mi? HPLC’de UV detektör dalga

boyuna buradan karar verilir.

Spektrum pH değişikliklerinden etkilenir mi? Absorpsiyonu ve duyarlılığı

artırmak için yararlıdır.

Absorpsiyon spektrumu spesifik değildir, ancak spesifik bir ekstraksiyon

işleminden sonra veya ilaç metabolizmaya uğramadığında uygulanabilir.

Absorpsiyon spektrumu metabolizmadan az etkilenir.

6

Floresans Spektrum

Floresans ışın yayma özelliği olan maddeler, kendilerine özgü dalga

boyundaki ışınlarla uyarılabilir ve tayin edilebilirler.

Floresans özelliği olmayan maddeler, üzerinde taşıdığı çeşitli fonksiyonel

gruplar kullanılarak türev oluşturabilen ajanlar ile türevi oluşturulduktan

sonra tayin edilebilir. Örn primer amin grubu taşıyan maddeler, floreskamin

ve dansil klorür ile türev yapılabilir. Ancak türevin kolayca oluşması ve

stabilitesi değerlendirilmelidir.

Metabolizma floresans karakteristiklerini değiştirebilir.

7

ITK

Analog ve potansiyel metabolitlerin yanı sıra parçalanma ürünleri ile ilgili

veri sağlar.

Lekelerin görünürleştirilmesinde kullanılan sprey reaktifler olası kolorimetrik

tayin için fikir verebilir.

Kantitatif sonuçlar için uygun değil (!)

Plazma analizi için nadiren densitometre ile kullanılır.

Densitometre, özellikle idrar numunelerinde ilaç suistimalinin

araştırılmasında, kolay, ucuz ve kullanışlı bir yol ile incelemeye imkan sağlar.

8

HPLC

Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için en uygun yöntemdir. Özellikle ters-faz

sistemler (C8 ve C18 kolon ile) ayırma ve tayin başarıyla gerçekleştirilir.

Metabolitler polardır ve ana bileşikten önce elüe olur.

Kısa analiz süresi için yöntem optimize edilebilir.

pH etkisi dikkate alınmalı, iyon çifti kromatografi uygulanabilir.

Türevlendirme nadiren kullanılır

9

GC

Uçucu olmayan veya labil bileşiklerin türevleri için uygulanır.

Nonpolar sabit fazlar ( örn. OV-1)

Seçici sabit fazlar (örn. OV-101)

Türevlerin alıkonma karakteristikleri kullanılır.

Cihaz karakteristikleri biyolojik analizler için uygundur.

GC için bir yöntem geliştirilemiyorsa HPLC nin uygulanması da zordur.

10

Kütle Spektrometri

Bileşiklerin kütle spektrumları standart koşullarda belirlenmelidir.

KS nin bir cihaz olarak ilk uygulamaları biyolojik sıvılarda ilaç analizinde

saflaştırılmış metabolitlerin karakterizasyonu ile ilgilidir. Daha sonra daha

basit rutin işlemlerin spesifikliğini değerlendirmek için spesifik bir detektör

olarak kullanılmıştır.

Selective ion monitoring ve Tandem mass spectrometry’nin kullanılması,

KS’nin spesifikliğinin analiz yöntemlerinde hayati olduğunu göstermiştir.

Farklı tipteki iyonlaştırma işlemleri ve farklı türevler spesifik iyon verimini

artırmak için kullanılır ve eğer spektrum elde edilebiliyorsa analitik profil

derlemesinde yerini alabilir.

11

NMR

Biyolojik örneklerde ilaç analizi için fazla değerli bir yöntem değildi.

Kütle Spektrometri gibi, metabolitlerin karakterizasyonu için kullanılırdı. İzole

edilen metabolitin miktarı cihazdaki analiz için yetersiz düzeyde olurdu.

Modern yüksek alanlı cihazlar, bilgisayar teknikleri, NMR spektroskopisinin

daha iyi anlaşılması ile NMR kullanımı temel teknikler arasında yer

almaktadır.

12

Çözünürlük

Belirli çözücüler kullanılarak ilacın çözünürlüğü incelenmelidir, böylece en

iyi ekstraksiyon yöntemi belirlenebilir.

En uygun ekstraksiyon çözücüsü “ilacın tamamını yada büyük bir kısmını

endojen bileşik veya metabolitlerden çekip alan” çözücüdür.

Ekstraksiyonda geri kazanım düşük ise kesinlik de düşüktür

Zayıf asit ve bazlar için pH seçimi önemlidir.

pH-çözünürlük profili çıkarılmalıdır. Organik çözücü ile belirli bir pH deki

tampon çözelti arasında ilacın dağılımı için organik faza geçen ilaç miktarı

ölçülerek pH ya karşı grafiği çizilir. İlacın radyoaktif işaretlenmiş formu ile bu

işlemleri yapmak özelikle düşük derişimlerde kolaylık sağlar.

13

Yöntemin Seçimi

Ekstraksiyon koşulları

İç standart kullanımı

14

Ekstraksiyon Koşulları

Ekstraksiyon koşullarının teorisi lipofil özellik ve zayıf asit/bazların iyonizasyonunadayanır ve tamponlanmış biyolojik sıvıdan ilacın ektraksiyonu için optimum koşullar fizikokimyasal özelliklerden tahmin edebilir. Ancak metabolitler ve endojen bileşikler varlığında bu basit bir konu değildir.

Mevcut literatür bilgisi (pKa, logP, plazma proteinlerine bağlanma karakteristikleri) ve benzer yapılar için oluşturulmuş ekstraksiyon şemalarından yararlanılabilir.

Analitik profil verileri ve verimli bir ekstraksiyon şemasına karar verildikten sonra seçici ölçüme olanak sağlayan bir ayırma tekniği ile biyolojik sıvıdaki uygulamalara geçilir.

Bu aşamada biyolojik sıvının kendisi ve ilaç katılmış hali için uygun yanıtlar alındığı takdirde metabolitler eklenerek işlemlere devam edilir.

15

Ekstraksiyon Koşulları

Olası sorunlar şunlarla ilgili olabilir:

İlacın proteinlere kuvvetli bağlanması (plazmadan kolayca ekstre edilemez).

Numunenin denaturasyonu sırasında çökmüş proteinlere ilacın istenmeyen absorpsiyonu

Endojen bileşiklerden kaynaklanan girişim (kromatografi ve ekstraksiyon sırasında bunların yeterince uzaklaşmaması).

Kromatografik sistemin yeniden gözden geçirilmesi ve daha seçici dedektörlerinkullanılması çözüm olabilir.

Uygun bir sistem belirlendikten sonra miktar tayini yapılır. Yüzde geri kazanım belirlenir. Kör numuneye bilinen miktar ilaç katılarak olası kayıplar kontrol edilir. Tekrar edilebilir sonuçların eldesi partisyon düşük olsa bile değişkenlerin yönteme etkisini azaltacaktır.

16

İç Standart (IS) Kullanımı

Özellikle kromatografik yöntemlerde uygun kullanımla kesinlik artar.

IS,

analite benzer yapıda olmalı,

bilinen derişimde olmalı,

analizden önce bilinen derişimlerde numuneye katılmalı,

derişimi analitinkine yakın olmalı,

ölçümler sonunda geri kazanım yüzdesi analitin yanıtlarını düzeltmek için

kullanılabilmelidir.

17

İç Standart (IS) Kullanımı

En yaygın uygulama analizden hemen önce final ekstreye katılmasıdır.

Ancak bu uygulama ekstraksiyon ile ilgili değişkenlikleri yansıtmaz.

Daha doğru bir uygulama IS nin orijinal biyolojik örneğe katılması ve tüm

işlemlerde yer almasıdır ve gerçek amaca daha uygundur.

18

İç Standart (IS) Kullanımı

Fizikokimyasal özellikleri analite yakın bir kimyasal yapıya sahip IS seçildiğinde, ilgili pH değerinde sulu ve organik fazlarda partisyonu, kullanılan koşulların tamamında stabilitesi, türevlerin dönüşümü, cam kaplara absorpsiyon ve benzer protein bağlanma özellikleri uyumlu olacaktır.

Geniş bir aralıkta görülen geri kazanım değerlerini düzeltme kapasitesi ile analizler arasında görülen ve kanıtlanamayan farklılıkları telafi etmek için kullanılmalıdır.

Klinik çalışmalarda en uygun IS birlikte alınan bir ilaç olabilir.

Ölçümlerde hem IS hem analit sinyali (pik alanı veya pik yüksekliği) ölçülerek iki bileşiğin yanıt oranları hesaplanır ve standart için aynı koşullarda hazırlanan kalibrasyon eğrisi eşitliğinde çözülerek miktarları hesaplanır.

IS nin kesin değerinin bilinmesine gerek yoktur ancak numune ve standartlara aynı miktarda katılması önemlidir.

19

İç Standart Kullanımı

pH partisyon profiline dikkat edilmeli, benzer ekstraksiyon karakteristikleri için ilaç ve IS’nin partisyon profilleri (pH ya karşı ekstre edilen fraksiyon grafiği) oluşturulmalıdır.

Analitik işlemlerin bir parçası olan bir transformasyon varsa İS de buna maruz kalmalıdır.

Türevlendirmede sterik etkiler dikkate alınmalıdır.

IS, duyarlılıktaki değişimleri yansıtmalıdır.

Patolojik numunelerle çalışırken dikkat edilmelidir. Normal numunelerde olmayan, farklı bileşenler analizi etkileyebilir.

İS seçerken yapısına dikkat edilmelidir.

Kalibrasyon ve deneysel örneklere aynı miktar katılması önem taşır, tam derişiminin bilinmesine gerek yoktur.

20

Yöntemin Değerlendirilmesi

Toksikoloji ve metabolizma çalışmalarında çalışılan türler için girişim veya

metabolizmada farklar nedeniyle değerlendirme gerekir.

Mevcut literatür bilgisinden hareketle uygulanacak yöntem seçilerek

analizin yapılacağı laboratuvar koşullarına uygun hale getirilmelidir. Bunun

için,

Kesinlik

Doğruluk

Spesifiklik

LOD

21

Kesinlik

Bir yöntemin kesinliği tekrarlı ölçümler arasındaki uyum olarak tanımlanır.

SD, RSD ile ifade edilir.

Beklenen derişim aralığında 6 derişimde 6 tekrar analizi tavsiye edilir, gün içi

ve günler arası kesinlik oluşturulur. RSD farklı derişimlerdeki kesinliğin

değerlendirilmesinde daha iyi fikir verir.

Günler arası kesinlik, rutin analizlerin yapıldığı laboratuvarlar için çok

önemlidir.

Analizcinin yetenek ve deneyimi ile cihazın güvenirliğini gösterir.

22

Doğruluk

Bulunan miktarlar ile gerçek değer arasındaki uyumdur. Deney sonucu

bulunan değerlerin bilinen değerler ile karşılaştırılması ile belirlenir.

Materyalin bilinen miktarlarını biyolojik ortama katarak veya aynı

numuneye referans yöntem uygulayarak belirlenir.

Kalibrasyon grafiği analizci tarafından hazırlanmış ise ve bu doğruluk

belirlenmesinde kullanılıyorsa bu durum ifade edilmelidir.

23

Spesifiklik

Endojen bileşikler ve metabolitler varlığında analitik yöntemin tayini

amaçlanan bileşik için yanıt üretme yeteneğidir.

Kromatografik çalışmalarda pikin yerinin kör çalışmada boş olması gerekir.

Analiz edilen ilaç ile metabolit piki üstüste geldiği zaman teşhis için kütle

spektrumları standart maddelerinki ile karşılaştırılmalıdır.

Metabolitler ve diğer ilaçlarla ilgili olası girişim için yöntem test edilmelidir.

24

Saptama Sınırı (LOD)

Körden (blank) farklılaşan ölçülebilen en küçük derişim değeridir.

Bu terim duyarlılık olarak da ifade edilir ancak LOD daha doğrudur.

Duyarlılık derişim yanıt kalibrasyon grafiğinde eğimi tanımlamak için de

kullanılır.

%20 bağıl standart sapma kabul edilebilir kesinlik değeridir.

25

Analitik Yöntem Raporu

Beklenen duyarlık düzeyi ile birlikte problemin genel ifadesi

Önerilen yöntemin detaylı tarifi

Yöntem geliştirme

Ekstraksiyon koşulları

Çözücülerde ilacın stabilitesi

Kromatografik sistemin seçimi

Saptama sisteminin seçimi

Yöntemin değerlendirilmesi

Yöntemin geri kazanımı

Kesinlik

Doğruluk

Spesifiklik

Duyarlılık

Uygulama

26