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Cambios en la distribución de las poblaciones linfoides B circulantes en
pacientes con gammapatías monoclonales
Servicios de Citometría y HematologíaCentro de Investigación del Cáncer
Universidad de Salamanca y Hospital Universitario de Salamanca
Sesión IVb. Línea de Tumores Hematológicos – Subgrupo de Mieloma
Introducción
Aunque la célula tumoral del MM es la CP, podríaexistir un precursor clonal más inmaduro presente
en las células B circulantes
PRECURSOR LINFOIDE BPRECURSOR LINFOIDE B CCÉÉLULAS PLASMLULAS PLASMÁÁTICAS (TICAS (CPsCPs))
Pilarski et al Clin Cancer Res 2000Tarte et al Blood 2002
Rasmussen et al Leuk Lymphoma 2004
Introducción
El estudio de la diferenciación B en MO y ganglio linfático ha permitido identificar la existencia de poblaciones en distintos estadios madurativos
Sin embargo, en la SP la información acerca de las distintas subpoblaciones B circulantes es muy limitada
1. Estandarizar una estrategia sencilla, rápida y reproducible de identificación de las diferentes subpoblaciones linfoides Bpresentes en SP
2. Analizar su distribución en SP de adultos sanos
3. Comparar la distribución de las subpoblaciones B circulantes de pacientes con gammapatías monoclonales (GMSI, mieloma quiescente y MM sintomático) con adultos sanos de edad similar
4. Determinar la posible correlación entre el número absoluto de las diferentes subpoblaciones B circulantes y el componente monoclonal (CM) en las gammapatías monoclonales
Objetivos
48 adultos sanos79 pacientes con GM
-Técnica de inmunofluorescencia directa: marcajes múltiples con AcMo:PB/ AmCyan/ FITC/ PE/PerCPCy5.5/ PECy7/ APC/ AF700
CD20/ CD45/ sIgM/ sIgG/ CD19/ CD10/ CD27/ CD38 CD20/ CD45/ sIgM/ sIgA/ CD19/ CD10/ CD27/ CD38
- Adquisición en un citómetro de flujo FACSCanto II:Ventana de análisis por CD19 y/o CD38hi (linfocitos B y células plasmáticas) ≥1x106 células totales
AnAnáálisis lisis inmunofenotinmunofenotíípicopico de poblaciones linfoides B en SP:de poblaciones linfoides B en SP:
50.000 células>100.000 células CD19+
24 GMSI17 MM quiescente (MMq)38 MM sintomático (MM)
Material y Métodos
RESULTADOS
LB Memoria LB Memoria CD27CD27++ / CD38/ CD38--LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos CD27CD27++ / CD38/ CD38++
Contacto con el antContacto con el antíígenogeno
LB LB NaNaïïvevesIgMsIgM++ / CD27/ CD27--
LB inmaduros LB inmaduros CD10CD10++ / CD38/ CD38++
Poblaciones B circulantes en SP según su estadio madurativo
Alexa 700: CD38
Alexa 700: CD38
APC
: CD
27
APC
: CD
27
APC
: CD
27
FITC: sIgM
FITC: sIgM
PE-C
y7:
CD10
Poblaciones B circulantes en SP según el isotipo de la IgHLB
Mem
oria
Linf
opla
smoc
itos
APC
: CD
27
FITC: sIgM
LB M
emor
iaLi
nfop
lasm
ocit
os
APC
: CD
27
FITC: sIgM
FITC
: sI
gM
FITC
: sI
gM
FITC
: sI
gM
FITC
: sI
gM
PE: sIgG PE: sIgA
PE: sIgG
LB Memoria
PE: sIgA
Linfoplasmocitos
Poblaciones B circulantes en SP según el isotipo de la IgH
Identificación de subpoblaciones linfoides B circulantes mediante análisis inmunofenotípico
Linfocito B inmaduro/”naive”(CD10+, sIgM+,CD38++, CD20++, CD27-)
Linfocito B maduro/”naive”(CD10-, sIgM+, sIgD+, CD38+, CD20++, CD27-)
Linfocito B maduro de memoria(CD10-, sIgG+*, CD38d, CD20++, CD27+)
Linfocito B maduro de memoria(CD10-, sIgM+, CD38d, CD20++, CD27+)
Linfoplasmocito(CD10-, sIgG+, cIgG+, CD38++, CD20+, CD27+)
Linfoplasmocito(CD10-, sIgM+, cIgM+, CD38++, CD20+, CD27+)
Célula plasmática(CD10-, sIg-, cIgG+, CD38++, CD20-, CD27+)
Célula plasmática(CD10-, sIg-, cIgM+, CD38++, CD20-, CD27+)
*IgG o IgA o IgE
DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones linfoides B linfoides B circulantes en adultos sanos (n=48)circulantes en adultos sanos (n=48)
Frecuencia dentro de los LB
% (LB) Cells/uL
Mediana Rango Mediana Rango
LB inmaduros 3 (0.3-9) 3 (0.3-15)LB Naïve 63 (38-88) 81 (20-350)LB Memoria 33 (8-56) 43 (4-189)
IgM+ 16 (3-48) 22 (1-164)IgG+ 6 (1-18) 8 (1-54)IgA+ 5 (1-20) 8 (1-49)
Linfoplasmocitos 1 (0.2-9) 1 (0.1-11)
Nº Absoluto (células/uL)
Nº
Abs
cells
/uL
IgAIgA++IgGIgG++IgMIgM++
200200
100100
5050
1010
00
<40a<40a(n=21)(n=21)
[40[40--60]a60]a(n=11)(n=11)
>60a>60a(n=16)(n=16)
*p<0.05 vs. <40
# p<0.05 vs. [40-60]
350
300
250
200
150
100
5040
30
LB LB TotalesTotales
InmadurosInmaduros NaNaïïveve MemoriaMemoria LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos
*
*
*
#
#
* #
NNºº
AbsAbs
cells
cells
// µµLL
DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones linfoides B circulantes linfoides B circulantes de adultos sanos segde adultos sanos segúún la edadn la edad
100
50
20
10
0
*p<0.05 vs. <40
# p<0.05 vs. [40-60]
IgAIgA++IgGIgG++IgMIgM++
* #
#* #
IgAIgA++IgGIgG++IgMIgM++
* #* #
*
6
3
1
0.5
0
LinfoplasmocitosLinfoplasmocitosLB MemoriaLB Memoria
<40a<40a(n=21)(n=21)
[40[40--60]a60]a((n=11)n=11)
>60a>60a(n=16)(n=16)
NNºº
AbsAbs
cells
cells
// µµLL
DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones linfoides B circulantes linfoides B circulantes de adultos sanos segde adultos sanos segúún la edad e isotipon la edad e isotipo
DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones B de SP en adultos B de SP en adultos sanos >60a sanos >60a vsvs pacientes con GMpacientes con GM
LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos CCéélulas lulas PlasmPlasmááticasticas
GMGM(n=81)(n=81)
Adultos Adultos SanosSanos
>60a (n=16)>60a (n=16)
LB LB TotalesTotales
InmadurosInmaduros NaNaïïveve MemoriaMemoria
NNºº
AbsAbs
cells
cells
// µµLL
300
200
100
40
4
# p<0.05 vs. AS>60a
# #
300
200
100
20
0
LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos CCéélulas lulas PlasmPlasmááticasticas
Adultos Adultos SanosSanos
>60a (n=16)>60a (n=16)
LB LB TotalesTotales
InmadurosInmaduros NaNaïïveve MemoriaMemoria
NNºº
AbsAbs
cells
cells
// µµLL
GMSIGMSI(n=24)(n=24)
MMqMMq(n=17)(n=17)
MMMM(n=40)(n=40)
# p<0.05 vs. AS>60a
#
#
#
#
#
#
#
DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones B de SP en adultos B de SP en adultos sanos >60a sanos >60a vsvs pacientes con GMpacientes con GM
0
50
40
30
20
10
DISTRIBUCION DE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DISTRIBUCION DE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES EN ADULTOS SANOS >60a EN ADULTOS SANOS >60a vs. vs. PACIENTES GM PACIENTES GM IgGIgG
0,3
0,2
0,1
0
#
LB Memoria IgG+
NNºº
AbsAbs
cells
cells
// µµLL
NNºº
AbsAbs
cells
cells
// µµLL
Linfoplasmocitos IgG+
Adultos Adultos SanosSanos
>60a (n=16)>60a (n=16)
GMSIGMSI(n=14)(n=14)
MMqMMq(n=6)(n=6)
MMMM(n=19)(n=19)
# p<0.05 vs. AS>60a
DISTRIBUCION DE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DISTRIBUCION DE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES EN ADULTOS SANOS >60a EN ADULTOS SANOS >60a vs. vs. PACIENTES GM PACIENTES GM IgAIgA
LB Memoria IgA+
NNºº
AbsAbs
cells
cells
// µµLL
Linfoplasmocitos IgA+
Adultos Adultos SanosSanos
>60a (n=16)>60a (n=16)
GMSIGMSI(n=7)(n=7)
MMqMMq(n=4)(n=4)
MMMM(n=11)(n=11)
50
40
30
20
10
2
1
1NNºº
AbsAbs
cells
cells
// µµLL
#
# p<0.05 vs. AS>60a
#
CORRELACICORRELACIÓÓN ENTRE SUBPOBLACIONES B N ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES CIRCULANTES vs. vs. CONCENTRACION DE CM EN CONCENTRACION DE CM EN MGUS MGUS
LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos
21
2
1
0
Concentración de CM (g/dL)
R2= 0.57
NNºº AbsAbs((cellscells//µµL)L)
p=0.005
Concentración de CM (g/dL)
p=0.02
LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos
InmadurosInmaduros
NaNaïïveve
MemoriaMemoria
NNºº AbsAbs((cellscells//µµL)L)
54321
1
0
R2= 0.613
CORRELACICORRELACIÓÓN ENTRE SUBPOBLACIONES B N ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES CIRCULANTES vs. vs. CONCENTRACION DE CM EN CONCENTRACION DE CM EN MMqMMq
5432
0.5
0.25
0
R2= 0.978
NNºº AbsAbs((cellscells//µµL)L)
LB Memoria LB Memoria IgAIgA++
LB Memoria LB Memoria
p=0.02
CORRELACICORRELACIÓÓN ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DE N ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DE ACUERDO CON EL ISOTIPO ACUERDO CON EL ISOTIPO vs. vs. CONCENTRACION DE CM EN CONCENTRACION DE CM EN MMqMMq
Concentración de CM (g/dL)
LB Memoria LB Memoria IgGIgG++
LB Memoria LB Memoria
4.53.52.51.5
0.25
0.15
0
p=0.09
R2= 0.6
NNºº AbsAbs((cellscells//µµL)L)
Concentración de CM (g/dL)
MM quiescente MM quiescente IgAIgA (n=4)(n=4)
MM quiescente MM quiescente IgGIgG (n=6)(n=6)
CORRELACICORRELACIÓÓN ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DE ACUERDO N ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DE ACUERDO CON EL ISOTIPO CON EL ISOTIPO vs. vs. CONCENTRACION DE CM EN CONCENTRACION DE CM EN MMMM IgGIgG
108642
% L
B M
emor
ia
100
80
60
40
20
0
p=0.002
R2= 0.6108642
% L
B M
em I
gG+
30
20
10
0p=0.007
R2= 0.46
108642% L
B M
em I
gA+ 20
15
10
5
0
108642% L
B M
em I
gM+ 40
30
20
10
0
P=0.005
R2= 0.5
p=0.02
R2= 0.35
1 Los LB de SP de adultos sanos son muy heterogéneos, identificándose hasta 10 subpoblaciones B diferentes
2 El número de LB circulantes varía con la edad, disminuyendo en adultos sanos con mas de 60 años debido al descenso de las subpoblaciones de Memoria y Linfoplasmocitos
3 Los pacientes con GM tienen una disminución significativa de LB que no han reconocido antígeno (B inmaduras en todos los grupos y naive en MMq)
4 En pacientes con MMq, una elevada concentración de CMse correlaciona con un menor número de LB de memoria que expresan el mismo isotipo de cadena pesada que las células mielomatosas, mientras que en el MM sintomáticola correlación es directa
Conclusiones
¿Existen células B clonales -con el mismo patrón de reordenamiento VDJ en IgH que las células plasmáticas neoplásicas- en las distintas subpoblaciones linfoides B circulantes
en pacientes con MM?
PRECURSOR LINFOIDE BPRECURSOR LINFOIDE B CCÉÉLULAS PLASMLULAS PLASMÁÁTICAS (TICAS (CPsCPs))
Estrategias de separación de las subpoblaciones linfoides B circulantes en un citómetro-separador (FACSAria; BDB)
Purezas >98%
¿Existen células B clonales en las distintas subpoblaciones B de SP en pacientes con el MM?
FASE DE ESTANDARIZACIFASE DE ESTANDARIZACIÓÓN DE LA TN DE LA TÉÉCNICA (PCR): CNICA (PCR): Realizada sobre muestras de SP de pacientes con LLCRealizada sobre muestras de SP de pacientes con LLC--BB
Potencia de la técnica(Nº mínimo de células)
#1 50 células 2/210 células 2/2
#2 50 células 3/510 células 1/2
#3 50 células 3/3
#4 50 células 2/3
Sensibilidad *(con 50 células clonales)
#5 5% 1/11% 1/10.1% 1/1
#6 5% 1/11% 1/10.1% 1/1
* No comprobada por secuenciaciónsino por tamaño