Cellule staminali mesenchimali dell’amnios equino per il ... · RIASSUNTO La medicina rigenerativa si basa sulla biologia e la manipolazio- ... (Solomon et al., 2005) e modula l’an-giogenesi

Ippologia, Anno 22, n. 3, Settembre 2011 13

❚ Ortopedia

Cellule staminali mesenchimali dell’amniosequino per il trattamento delle tendinopatiedel cavallo sportivo: prima segnalazioneAnna Lange Consiglio1, Stefano Tassan2, Bruna Corradetti3, Davide Bizzaro3,Andrea Bignotti1, Fausto Cremonesi11 Università degli Studi di Milano, Ospedale Grandi Animali, Azienda “Polo Veterinario” di Lodi, Sezione di Riproduzione, Lodi Italia2 Libero professionista3 Università Politecnica Marche, Dipartimento Biochimica Biologia e Genetica, Ancona Italia

INTRODUZIONE

Il cavallo atleta è continuamente sottoposto a sollecita-zioni meccaniche che spesso possono determinare le-sioni all’apparato muscolo-scheletrico, in particolaretendini e legamenti, che costituiscono la più comunecausa di ritiro dei soggetti sportivi dall’attività agonistica(Lam et al., 2007). Per queste lesioni muscolo-tendinee leterapie tradizionali conservative mediante, per esempio,iniezioni intralesionali di steroidi (Kapetanos 1982), diacido ialuronico (Foland et al., 1992) o di glicosaminogli-cani polisolfati (PSGAG) (Marr et al., 1993), nonché tera-pie chirurgiche quali lo splitting transcutaneo accompa-gnato da desmotomia della briglia radiale, associate a ri-poso dell’animale per diversi mesi, conseguono nella for-mazione di tessuto cicatriziale con matrice connettivalepovera e fibrille collagene con diametri ridotti che necompromettono la guarigione (Woo et al., 1999). Infatti,in seguito a lesioni tendinee, il tessuto cicatriziale che siforma nel focolaio di rottura rappresenta una causa dicalo di prestazioni e di aumento del rischio di recidivache ammonta al 56% per i cavalli da salto e al 66% perquelli da corsa (Dyson 2004).Poiché è noto che il tessuto cicatriziale non consente ilripristino di una condizione anatomo-funzionale prossi-ma a quella precedente il trauma, nel corso di questi ul-timi anni sono state sviluppate numerose strategie tera-peutiche finalizzate ad accelerare i tempi e, soprattutto,la qualità dei processi riparativi tendinei. In quest’ottica,del tutto innovativo e promettente è il recente ricorso,anche in medicina veterinaria, alla terapia rigenerativa,nuovo emergente campo multidisciplinare, che sfrutta labiologia e la manipolazione cellulare per lo sviluppo distrategie atte a ripristinare la funzione di organi o tessu-ti compromessi da eventi patologici.La terapia cellulare è basata sulla capacità delle cellulestaminali mesenchimali (MSCs) ottenute da midollo os-seo (BM) o tessuto adiposo, di differenziare in diverse li-nee cellulari. In medicina veterinaria, approcci terapeuti-

RIASSUNTO

La medicina rigenerativa si basa sulla biologia e la manipolazio-ne cellulare per lo sviluppo di strategie atte a mantenere o ri-pristinare la funzione di organi e tessuti che sono stati compro-messi da patologie. Grazie alla loro capacità di differenziare indiverse linee cellulari, le cellule staminali giocano, indubbiamen-te, un ruolo fondamentale nello sviluppo di questi obiettivi. Lecellule staminali embrionali sono totipotenti, ma il loro isola-mento implica la distruzione dell’embrione e la loro applicazio-ne è limitata dall’alto indice oncogenico. Le cellule staminali me-senchimali di origine adulta prevedono tecniche di prelievo in-vasive, non prive di complicazioni, la loro coltura ed espansionein vitro richiede diverse settimane e, inoltre, possiedono limita-te capacità di proliferazione e differenziazione che sono inver-samente proporzionali all’età del donatore. Da queste conside-razioni emerge l’interesse, per il clinico, di fonti alternative dielementi multipotenti. Le cellule provenienti dagli annessi fetalipotrebbero rappresentare una possibilità per superare alcunedi queste limitazioni, aprendo nuove prospettive per lo svilup-po della medicina rigenerativa. Scopo di questo studio è statoquello di isolare, caratterizzare e differenziare per la prima vol-ta cellule mesenchimali di amnios nella specie equina, valutan-done l’impiego nella terapia delle lesioni tendinee. Dai risultatiemerge che è stata isolata una popolazione di elementi multi-potenti di origine fetale extra-embrionale caratterizzati dal-l’espressione dei marker di staminalità, dall’assenza di espres-sione di marker di immunogenicità, da un’intensa capacità pro-liferativa e differenziativa nella linea mesodermica ed ectoder-mica, ed in grado di tollerare la crioconservazione. Queste pro-prietà rendono la popolazione cellulare derivata dagli annessifetali extra-embrionali una fonte ideale per i trattamenti rigene-rativi. Nel presente lavoro, per la prima volta, è segnalato il trat-tamento di lesioni tendinee acute nel cavallo con cellule mesen-chimali allogeniche amniotiche. Nei soggetti trattati è stato ri-scontrato un quadro ecografico indicativo di una rapida evolu-zione, probabilmente stimolata anche da un’intrinseca attivitàantinfiammatoria di questa popolazione cellulare. La possibilitàdi trattare aree lesionali in tempo reale, prima del verificarsi dialterazioni ultrastrutturali, e l’assenza di reazioni al trapianto al-logenico rappresentano i punti di maggior interesse di quest’in-novativo approccio biotecnologico alle tendinopatie equine. “Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione l’11/02/2011 ed accet-

tato per la pubblicazione dopo revisione il 16/09/2011”.

ci per trattare danni ai tessuti muscolo-scheletricisono stati sviluppati usando MSCs multipotenti(Smith et al., 2003; Pacini et al., 2007; Crovace et al.,2007; Fortier e Smith, 2008; Guest 2008). Si ipotizza che le MSCs impiantate in una lesionetendinea possano influire sulla rigenerazione tissu-tale secondo due meccanismi: differenziandosi intenociti e secernendo matrice extracellulare ten-dinea, oppure, secernendo fattori di crescita cheinducano le cellule impiantate o quelle residenti aprodurre tale matrice (Murphy et al., 2003; Caplane Dennis 2006). I risultati ottenuti da diverse pro-ve di applicazione delle MSCs per la rigenerazionedi tessuti danneggiati di varia natura sono positivi,sia dal punto di vista della ricostituzione dellastruttura sia del recupero della funzionalità. Diver-si studi hanno dimostrato che, in seguito ad inocu-lazione di MSC da BM in lesioni tendinee del ten-dine flessore superficiale delle falangi, in tempi re-lativamente brevi (40-100 giorni) si è verificata lacompleta ricostituzione dell’architettura e dellastruttura del tessuto, valutata mediante tecnica ul-trasonografica, istologica ed immunoistochimica(Smith et al., 2003; Koch et al., 2008; Lacitignola etal., 2008; Crovace et al., 2010).Nonostante l’incremento della terapia cellulareper trattare problemi di natura ortopedica nel-l’equino, molte problematiche rimangono senza ri-sposta relativamente alla fonte ottimale di cellulemesenchimali, ai tempi ed alle modalità di tratta-mento in base al tipo di lesione, alla valutazionedella sicurezza delle terapie in termini di potenzia-le tumorigenico ed all’efficacia del trattamento(Berg et al., 2009). Il BM è stato considerato, per lungo tempo, laprincipale fonte di MSCs adulte. In numerosi studiè stato dimostrato come l’inoculo di cellule pro-venienti da BM in tendini anche gravemente dan-neggiati producesse una significativa rigenerazionein luogo di una riparazione cicatriziale (Caplan2007). Per queste loro attitudini, l’uso di cellulestaminali mesenchimali isolate da BM o talvolta, inmodo più empirico, l’impiego di BM tal quale, èstato introdotto tra le terapie delle tendinopatie edelle desmopatie del cavallo (Smith et al., 2003;Crovace et al., 2007; Pacini et al., 2007; Wilke et al.,2007; Fortier e Smith 2008; Guest 2008). Il BM talquale contiene, però, anche derivati e precursoriossei e cellule adipose che potrebbero essere de-leteri per la guarigione innescando la formazionedi mineralizzazioni distrofiche o metaplasie nellasede di inoculo. Inoltre, è riportato in letteraturache le cellule derivanti da BM mostrano una limi-tata capacità di proliferazione (circa 32 giorni perl’espansione fra l’isolamento e l’impianto) e diffe-renziamento (Guest et al., 2010) che aumenta conl’età del donatore ed il numero di passaggi in vitro(Digirolamo et al., 1999; Guillot et al., 2007) e nondanno miglioramenti funzionali a lungo termine(Paris e Stout, 2010). Infine, la raccolta di BM ri-

chiede una procedura invasiva che è stata associa-ta occasionalmente nell’equino a pneumopericar-diti (Durando et al., 2006). Altra fonte di MSCs èrappresentata dal tessuto adiposo, ma alcuni ricer-catori hanno evidenziato che queste cellule pos-seggono un minor potenziale osteogenico e con-drogenico (Winter et al., 2003; Muschler et al.,2004; Im et al., 2005).Le cellule provenienti dagli annessi fetali potrebbe-ro rappresentare una valida alternativa per supera-re alcune di queste limitazioni, aprendo nuove pro-spettive per lo sviluppo della medicina rigenerativa.In medicina umana, la membrana amniotica isolatadalla placenta a termine è una fonte particolar-mente attraente di cellule staminali mesenchimaliperché è solitamente eliminata alla nascita, il suoutilizzo non comporta conflitti etici e permette unrecupero molto efficiente di MSCs senza richiede-re procedure invasive. Il fatto che la placenta siafondamentale per il mantenimento della tolleran-za materno-fetale durante la gravidanza suggeri-sce, inoltre, che le cellule presenti nel tessuto pla-centare possano avere caratteristiche immuno-modulatorie che riducono i rischi del rigetto im-munologico delle cellule staminali trapiantate daparte del ricevente (Evangelista et al., 2008). Infat-ti, la membrana amniotica umana e le cellule epi-teliali amniotiche isolate da essa hanno mostratola capacità di sopravvivere per lungo tempo in ani-mali immunocompetenti quali conigli (Avila et al.,2001), ratti (Kubo et al., 2001), porcellini d’India(Yuge et al., 2004) e scimmie (Sankar e Muthusa-my, 2003). Recenti studi hanno anche dimostratoche cellule mesenchimali di amnios umano posso-no fortemente inibire la proliferazione dei linfoci-ti T (Magatti et al., 2008) e mostrare bassa immu-nogenicità (Bailo et al., 2004). Inoltre, è stato ri-portato che tali cellule posseggono l’abilità di dif-ferenziarsi in più linee cellulari (Ilancheran et al.,2007; Evangelista et al., 2008) ed avere funzioni an-ti-infiammatorie (Sarugaser et al., 2005).In medicina veterinaria, la membrana amniotica intoto è stata usata in terapie cliniche per la rico-struzione della superficie oculare in cavalli (Olli-vier et al., 2006; Plummer 2009) e cani (Arcelli etal., 2009) poiché è una struttura avascolare, pro-muove la riepitelizzazione, decresce infiammazio-ne e fibrosi (Solomon et al., 2005) e modula l’an-giogenesi (Dua et al., 2004). Considerando che ilprocesso di guarigione richiede fattori di crescitache stimolano l’angiogenesi, la mitogenesi e la for-mazione di matrice, le cellule derivanti dall’amniospotrebbero rappresentare un prezioso strumentoper la terapia cellulare in ambito veterinario.Lo scopo di questa sperimentazione è stato lamessa a punto di un protocollo per l’isolamentodi cellule mesenchimali dalla membrana amnioticae la caratterizzazione delle presunte cellule stami-nali sulla base della loro capacità proliferativa edifferenziativa in senso osteogenico, adipogenico,

Cellule staminali mesenchimali dell’amnios equino per il trattamento delle tendinopatie del cavallo sportivo: prima segnalazione14

❚ Ortopedia


❚ Ortopedia

condrogenico e neurogenico, anche in seguito acrioconservazione. Inoltre, per la prima volta, unulteriore obiettivo di questo studio è stato l’im-piego di cellule mesenchimali allogeniche di deri-vazione amniotica per il trattamento delle patolo-gie dell’apparato muscolo-scheletrico nel cavallo.

MATERIALI E METODI

Tutti i reagenti impiegati in questa sperimentazio-ne, se non diversamente indicato, sono stati acqui-stati dalla Sigma Aldrich, Milano, Italia.

Raccolta della membranaallanto-amnioticaPer questo studio sono stati lavorati cinque cam-pioni di membrana amniotica prelevati al momen-to del parto. I campioni sono stati posti a 4°C intampone fosfato salino privo di calcio e magnesio(PBS, Euroclone, Milano, Italia), supplementato con100 U/ml penicillina, 100 µg/ml streptomicina e0,25 µg/ml amfotericina B e processati entro 12ore dal prelievo.La membrana amniotica, sottile e trasparente, è sta-ta separata meccanicamente dall’allantoide vascola-rizzata (Fig. 1) e sottoposta a digestione enzimatica.

Isolamento di cellule amniotichemesenchimali I frammenti di ogni campione di amnios sono statiincubati per 9 minuti a 37°C in PBS contenente 2,4U/ml dispasi (Becton Dickinson and Company, Mi-lano, Italia). Dopo un periodo di 5-10 minuti a tem-peratura ambiente in High Glucose - Dulbecco’sModified Eagle’s Medium (HG-DMEM; Euroclone),addizionato con 10% di siero fetale bovino (FBS,Fetal Bovine Serum) e 2 mM L-glutammina, i fram-menti sono stati digeriti con 0,93 mg/ml collagena-si tipo I e 20 µg/ml DNAsi (Roche, Mannheim,Germany) per circa 3 ore a 37°C. Il prodotto del-la digestione è stato filtrato utilizzando un filtro da100 µm. Il filtrato è stato centrifugato a 200xg per10 minuti per raccogliere le cellule mesenchimali

isolate. Queste cellule sono state denominate cel-lule mesenchimali amniotiche (AMCs).Il numero delle cellule vitali isolate è stato conta-to mediante saggio di esclusione con il coloranteTrypan blue, usando la camera di Bürker.

Coltura, espansione e conta cellulareSuccessivamente all’isolamento, le AMCs sonostate seminate alla densità di 1x105 cell/cm2 e lecolture cellulari sono state mantenute con HG-DMEM addizionato con 10% FBS, 10 ng/ml epi-dermal growth factor (EGF), 100 U/ml penicillina,100 µg/ml streptomicina, 0,25 µg/ml amfotericinaB e 2 mM L-glutammina.Le colture cellulari sono state mantenute in incu-batore ad un’atmosfera al 5% CO2 e 90% umidi-tà, ed alla temperatura di 38,5°C per gli esperi-menti descritti in seguito. Il terreno di coltura èstato cambiato per la prima volta dopo 72 oredalla semina per eliminare le cellule non aderen-ti. Il mantenimento delle colture cellulari ha pre-visto la rimozione del terreno di coltura due vol-te la settimana. Al raggiungimento di una confluenza pari a circal’80% della superficie della fiasca a passaggio 0 (P0)la coltura primaria è stata espansa, staccando lecellule dal fondo della fiasca con 0,05% tripsi-na/0,02% EDTA in tampone fosfato (Euroclone) a37°C per 2-3 minuti. Dopo la conta, la sospensione cellulare è stata ri-distribuita in fiasche di coltura più ampie in rap-porto 1:2 (P1) seminando circa 1x104 cell/cm2 alfine di mantenere ed espandere la coltura fino aldecimo passaggio.

Analisi della proliferazionecellulareDoubling Time (DT)Per l’analisi del DT è stata utilizzata la metodicadella conta seriale, cioè le cellule sono state con-tate a passaggi successivi da P1 a P10. Per questoscopo, le AMCs sono state seminate alla densità di3x103 cell/cm2 ed il cambio di terreno è stato ese-guito ogni tre giorni sino al raggiungimento di cir-ca l’80% di confluenza, momento in cui le cellulesono state tripsinizzate, contate e seminate allastessa densità.Il DT è stato ottenuto a ciascun passaggio accor-dandosi alle formule CD = log (Nf/Ni)/log2, e DT= CT/CD, dove CD rappresenta il fattore di dupli-cazione cellulare, Nf è il numero finale di cellule aconfluenza, Ni è il numero iniziale di cellule semi-nate, CT rappresenta il tempo di mantenimentodella coltura.

Analisi delle unità formanti coloniefibroblastoidi (CFU-F)Per il test delle CFU-F, le AMCs sono state semi-nate, subito dopo il loro isolamento (P0) a densi-

FIGURA 1 - La membrana amniotica è separata meccani-camente dalla sovrastante membrana allantoidea. La frec-cia indica il punto di sovrapposizione delle membrane.

tà differente (100, 250, 500 e 1000 cell/cm2) emantenute in incubatore a 38,5°C, in un’atmosfe-ra con il 5% CO2 e 90% umidità, per 2 settimanein terreno HG-DMEM arricchito come descrittoprecedentemente. Le colonie sono state fissate informalina al 4%, colorate con 1% di Blu di Metile-ne (Serva, Heidelberg, Germania) in tampone bo-rato 10mM (pH 8,8; Fluka, BioChemika, Buchs,Svizzera) a temperatura ambiente e lavate con ac-qua distillata per due volte. Le colonie compren-denti un numero di cellule nucleate maggiore di16-20 sono state contate utilizzando un microsco-pio rovesciato Olympus BX71.

Differenziamenti in vitroLo studio prevedeva di analizzare il potenziale pla-stico delle cellule isolate, mediante induzione deldifferenziamento osteogenico, adipogenico, con-drogenico e neurogenico.Per tale studio, le cellule isolate da amnios sonostate espanse e a P3 sono state seminate alla den-sità di 3x103 cellule/cm2 per il trattamento diffe-renziativo e ad una densità di 1x103 cellule/cm2

per il controllo. Per i primi 3-4 giorni, le cellule so-no state incubate con il terreno utilizzato per laloro espansione (HG-DMEM arricchito) in mododa permetterne l’adesione ed il raggiungimentodella confluenza, momento in cui sono stati avvia-ti i trattamenti differenziativi.

Differenziamento osteogenicoPer il differenziamento osteogenico, le colture cel-lulari sono state incubate in HG-DMEM addizio-nato con 10% FBS, 100 U/ml penicillina, 100 µg/mlstreptomicina, 0,25 µg/ml amfotericina B, 2 mM L-glutammina, 10 mM β-glicerofosfato, 0,1 µM desa-metasone, 250 µM acido ascorbico.Il differenziamento osteogenico è stato condottoincubando le cellule per 3 settimane a 38,5°C inun’atmosfera con il 5% CO2. Per il controllo è sta-to utilizzato il terreno di espansione cellulare dibase per il mantenimento delle cellule amniotichein coltura. Al 21° giorno, l’osteogenesi è stata va-lutata con la convenzionale colorazione von Kos-sa usando 1% di nitrato d’argento e 5% di tiosol-fato di sodio per la determinazione dei depositi dicalcio.

Differenziamento adipogenicoPer indurre il differenziamento adipogenico, le cel-lule sono state stimolate con tre cicli di induzio-ne/mantenimento. Ogni ciclo prevedeva una coltu-ra di 3 giorni con un terreno di induzione specifi-co per l’adipogenesi ed un altro periodo di 3 gior-ni con un terreno di mantenimento.Il terreno di induzione era costituito da HG-DMEM, supplementato con il 10% FBS, 100 U/mlpenicillina, 100 µg/ml streptomicina, 0,25 µg/mlamfotericina B, 2 mM L-glutammina, 10 µg/ml in-sulina, 150 µM indometacina, 1 µM desametasone

e 500 µM 3-isobutil-metil-xantina (IBMX). Il terre-no di mantenimento era costituito da HG-DMEM,supplementato con il 10% FBS e 10 µg/ml insulina.Le cellule di controllo sono state coltivate per lostesso periodo di tempo unicamente nel terrenodi mantenimento. Dopo 3 settimane, il trattamen-to differenziativo è stato bloccato e l’adipogenesiè stata analizzata usando la colorazione conven-zionale Oil red O (0,1% di Oil red O in 60% di iso-propanolo) per visualizzare le gocce lipidiche.

Differenziamento condrogenicoIl differenziamento condrogenico è stato indottoincubando le cellule in monostrato per 2-3 setti-mane in DMEM low-glucose (LG-DMEM, Euroclo-ne), supplementato con 100 nM desametasone, 50µg/ml acido-L-ascorbico-2-fosfato, 1 mM sodio pi-ruvato (BDH Chemicals Ltd., Poole, UK), 40 µg/mlprolina, ITS (insulina 5 µg/ml, transferrina 5 µg/ml,selenito di sodio 5 ng/ml) e 5 ng/ml TGF-β3 (Pe-provet, DBA Italia). Le cellule di controllo sonostate coltivate per lo stesso periodo di tempo nelterreno di crescita standard per le cellule amnio-tiche (HG-DMEM supplementato). Dopo 3 setti-mane, la presenza di matrice metacromatica è sta-ta dimostrata dalla colorazione con Alcian BluepH 2,5.

Differenziamento neurogenicoIl differenziamento neurogenico è stato eseguitocon una pre-induzione di 24 ore in un terreno co-stituito da HG-DMEM addizionato con 20% FBS e1 mM β-mercaptoetanolo (BME) (Mitchell et al.,2003). Successivamente, l’induzione neurogenica èstata effettuata con un terreno costituito da HG-DMEM supplementato con 2% FBS, 2% DMSO e200 µM idrossianisolo butilato (BHA) per 3 gior-ni. Le cellule di controllo sono state mantenuteper lo stesso periodo di tempo nel terreno di col-tura standard delle cellule amniotiche. Il differen-ziamento neurogenico è stato valutato attraversola morfologia delle cellule e la colorazione di Nissl(0,1% Cresyl violetto) che mostra l’incremento dicorpi tigroidi.

Analisi dei marker di espressioneattraverso RT-PCRMediante RT-PCR, è stata indagata sia l’espressio-ne di marker specifici (CD34, CD29, CD44, CD166,CD105, MHC I e MHC II) caratterizzanti le AMCsindifferenziate a P1 e P5, sia l’espressione di mar-ker specifici espressi dalle cellule differenziate ot-tenute dopo specifica induzione. L’RNA totale è stato estratto a P1 e P5 dalleAMCs indifferenziate usando TRIZOL® Reagent(Invitrogen Carlsbag, CA, USA) seguito da untrattamento con DNasi accordandosi alle specifi-che tecniche del produttore. La concentrazione e la purezza di RNA sono state misurate usandolo spettrofotometro NanoDrop (NanoDrop


❚ Ortopedia


❚ Ortopedia

ND1000). Il cDNA è stato sintetizzato dall’RNAtotale usando il kit iScript retrotranscription kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). LaPCR convenzionale è stata effettuata in un volu-me finale di 25 µl con DreamTaq DNA Polymera-se (Fermentas GmbH, St. Leon Rot, Germany). Iprimer oligonucleotidici specifici per l’equino so-no stati disegnati tramite il software PerlPrimerv.1.1.17, basandosi sulle sequenze disponibilipresso l’NCBI per la specie Equus caballus o susequenze consenso costruite mediante multi-alli-neamento di geni omologhi di interesse nei mam-miferi. Le sequenze oligonucleotidiche sono statedisegnate a cavallo tra esoni, con lo scopo di evi-tare l’amplificazione del DNA genomico.Per gli esperimenti di differenziamento, l’RNA to-tale è stato estratto da cellule indifferenziate (cel-lule di controllo) e da cellule indotte ai differenzia-menti. L’analisi della RT-PCR è stata effettuata co-me precedentemente descritto. Tessuti di equinoadulto (osseo, adiposo, cartilagineo e midollo spi-nale) sono stati impiegati come controllo positivoper analizzare l’espressione dei marker osteogeni-ci (osteocalcina [BGLAP] ed osteopontina [OPN]),adipogenici (peroxisome proliferator actived re-ceptor-γ [PPAR-γ] e adiponectina [ADIPQ]), con-drogenici (collagene tipo 2α1 [COL2A1] ed aggre-cano [ACAN]) e neurogenici (Nestina [NES] e Pro-teina Acida Glio Fibrillare [GFAP]).I primer sono stati utilizzati ad una concentrazio-ne finale pari a 200 nM. Il GAPDH è stato utilizza-to come gene di riferimento.

ImmunocitochimicaSono stati valutati gli antigeni Oct-4, TRA 1-60 eSSEA-4, a P3, in quanto marker di pluripotenza ti-pici delle cellule staminali embrionali (ESCs). Glianticorpi sono stati scelti sulla base dei risultatiottenuti da Hoynowski et al. (2007). Gli anticorpiprimari sono stati acquistati dalla ditta Abcam,(Cambridge, UK), mentre quelli secondari sonostati forniti da Invitrogen.Per l’immunocitochimica le cellule sono state fis-sate in 3,7% paraformaldeide per 15 minuti e lava-te tre volte in PBS. Per valutare la presenza del-l’antigene Oct-4, le cellule sono state permeabiliz-zate in 0,4% Triton-X100 diluito in PBS per 10 mi-nuti a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi conPBS, tutte le cellule sono state bloccate in PBS ad-dizionato con il 2% di albumina sierica bovina(BSA) per 4 ore a 4°C, e sono state, quindi, incu-bate con gli anticorpi primari per 12 ore a 4°C.Successivamente, sono stati effettuati tre lavaggi ele cellule sono state incubate con gli anticorpi se-condari coniugati con il fluoroforo AlexaFluor-488(Invitrogen, diluizione 1:250) per 1 ora. Infine, perla colorazione nucleare, l’Hoechst 33342 (1mg/ml) è stato diluito 1:100 in PBS e caricato suicampioni per 15 minuti. Tutte le analisi sono statebasate su cellule di controllo incubate con isotipi

specifici IgGs per stabilire il segnale di back-ground. Le immagini sono state visualizzate attra-verso il microscopio Olympus BX 51.

Istologia dell’allantoamnios Opportuni campioni di allantoamnios sono statifissati in 10% formalina a temperatura ambienteper 24 ore, inclusi in paraffina e tagliati con micro-tomo (Leica Instruments GmbH) per ottenere se-zioni dello spessore di 5-7 µm. I vetrini sono staticolorati con Ematossilina/Eosina col metodo diMallory.

CrioconservazioneLe cellule sono state congelate a P0 in HG-DMEM con il 50% di FBS ed il 10% di DMSO per6 mesi a -80°C. Dopo scongelamento alcune cel-lule sono state usate per lo studio del doubling ti-me, mentre altre cellule sono state espanse fino aP3 per gli studi di immunocitochimica e per valu-tare l’espressione dei marker specifici di mesen-chimalità e di differenziamento multilineare. I ri-sultati sono stati confrontati con quelli delle cel-lule fresche.

Casi cliniciIn questo studio sono stati impiegati 3 cavalli aiquali è stata diagnosticata una lesione spontanea alivello delle strutture teno-legamentose degli arti.Nello specifico sono riportati i seguenti casi: ilprimo cavallo (caso 1) era affetto da una lesionetraumatica acuta del tendine flessore superficialedel dito (SDFT) coinvolgente l’80% della sezionetrasversale del tendine (Fig. 10, caso 1 A, B); nelsecondo caso (caso 2) è stata individuata unalesione severa di 0,58 cm2 nel medesimo tendine(Fig. 10, caso 2 A, B); il terzo caso erarappresentato da un cavallo con una lesione acutadel legamento accessorio del tendine flessoreprofondo (AL-DDFT) la cui area danneggiata èstata quantificata in 2,32 cm2 (Fig. 10, caso 3 A, B).

Impianto delle MSCs all’internodella struttura teno-legamentosaPrevio consenso informato dei proprietari, 1 mi-lione di cellule mesenchimali allogeniche a P3 di-luite in 100 µl di plasma autologo sono state ino-culate per via intradermica in alcuni cavalli conanamnesi conosciuta, per valutare eventuali rea-zioni avverse. L’osservazione è durata 6 mesi. In seguito, nelle lesioni dei tre casi clinici prece-dentemente descritti, sono state impiantate ali-quote di 1 milione di AMCs allogeniche sempre aP3, diluite in 800 µl di plasma autologo.La procedura prevedeva la tricotomia della regio-ne in cui era presente la lesione, in modo da po-ter effettuare un’ecografia di controllo prima diprocedere all’impianto. I soggetti sono stati sedaticon Detomidina (0,01 mg/kg) e successivamentesi è proceduto alla preparazione del campo chi-

FIGURA 3 - DT a differenti passaggi durante la coltura cellulare delle AMCs.Legenda: asterischi all’interno del grafico indicano differenze statisticamente signi-ficative (P<0,05) rispetto a P1 per le cellule fresche.

rurgico previa anestesia tronculare, o cerchiante,prossimale rispetto al sito di lesione impiegandouna soluzione di Mepivacaina al 2%. La sonda del-l’ecografo è stata inserita all’interno di una guainasterile o all’interno di un guanto sterile e l’area ve-niva cosparsa di alcool a 90% per permettere ladiffusione delle onde ultrasonore. Le iniezioni so-no state eseguite sotto controllo ecografico. I ten-dini flessori superficiali delle falangi (SDFT) sonostati iniettati con tecnica longitudinale (preferita inquesti casi dall’operatore) con un ago 20 gauge e70 mm, in direzione prossimale-distale. Le lesionia carico di tutte le altre strutture sono state ese-guite con tecnica trasversale usando un ago 21gauge e 40 mm, inserito lateralmente.L’arto è stato poi fasciato con cotone garzato ste-rile e fasce elastiche (Vetrap®). Tale fasciatura èstata mantenuta per 48 h ed i cavalli sono staticonfinati in box, prima di consentire 15 minuti dipasso a mano per 15 giorni, aumentati a 30 minu-ti per un medesimo periodo. Non sono stati maisomministrati antibiotici o farmaci anti-infiamma-tori non steroidei (FANS).

RISULTATI

Raccolta delle membraneamniotiche ed isolamento di AMCsDalla porzione lavorata di ciascun amnios equinoa termine sono state generalmente isolate circa

25x106 di AMCs. La vitalità iniziale è stata pari al75%. Tutte le cellule isolate sono state seminate edurante la coltura si sono selezionate cellule inbase alla loro capacità di aderire alla piastra. LeAMCs hanno mostrato una morfologia fibroblast-like (Fig. 2A). Le colonie cellulari, osservate ai pri-mi stadi di coltura, hanno avuto la capacità di for-mare cluster (Fig. 2B).Dopo scongelamento (a P0), la vitalità delle cellu-le è stata dell’80% per le AMCs che hanno conser-vato la loro forma fibroblast-like.

Analisi della proliferazionecellulare

Doubling TimeLa capacità proliferativa delle AMCs è diminuita apartire dal P8 (p<0,05), ma è stata molto intensatra P4 e P6. Il valore medio di DT è stato di1,17±0,15 giorni (Fig. 3).Dopo scongelamento il DT medio osservato èstato di 1,88 ± 0,51 giorni.

Analisi delle unità formanti coloniefibroblastoidiNelle AMCs è stato osservato un incremento sta-tisticamente significativo (p<0,05) della frequenzadi CFU-F all’aumentare della densità di semina(Tabella 1). Un esempio di colonia è rappresenta-to nella Fig. 4.

Differenziamenti in vitroÈ stato valutato il potenziale multidifferenziativodelle AMCs (Fig. 5).

Differenziamento osteogenicoDopo 10 giorni di induzione il differenziamentoosteogenico delle AMCs è stato confermato dallacolorazione Von Kossa, che ha evidenziato i depo-siti di calcio. Le cellule, inoltre, hanno modificato lapropria morfologia aumentando anche le propriedimensioni. Il controllo è risultato, invece, negati-vo alla colorazione non mostrando matrice mine-ralizzata. L’analisi dell’espressione dei marker


❚ Ortopedia

FIGURA 2 - (A) Monostrato di AMCs, 10X e (B) AMCs con un piccolo cluster,20X. Scale bar 20 microns

FIGURA 4 - Colonia cellulare (CFU-F, 20x).

A B


❚ Ortopedia

osteogenici BGLAP e OPN attraverso RT-PCR haconfermato l’induzione osteogenica.

Differenziamento adipogenicoLe AMCs hanno mostrato la capacità di differen-ziare nella linea adipogenica, come dimostrato dalrisultato positivo della colorazione con Red Oil Oeffettuata dopo 3 settimane di coltura nel terrenoadipogenico. Le cellule mantenute nel terrenostandard non hanno mostrato depositi lipidici e,quindi, la colorazione è risultata negativa. L’analisidell’espressione dei marker adipogenici PPAR-γ eADIPQ attraverso RT-PCR ha confermato l’indu-zione adipogenica. Le cellule indotte al differenzia-mento hanno rivelato un’aumentata espressionedi PPAR-γ e adiponectina rispetto al controllo. Iltessuto adiposo è stato usato come controllo po-sitivo di espressione dei marker adipogenici.

Differenziamento condrogenicoLe AMCs hanno mostrato la capacità di diffe-renziare nella linea condrogenica, come è risul-

TABELLA 1CFU-F per le AMCs a P0

Densità cell/cm2 CFU-F 1 CFU-F ogni

100 1,33±0,58 712,50a

250 20,33±2,52 116,80b

500 59,67±4,93 79,61c

1000 74,67±2,52 127,23d

Legenda: lettere diverse all’interno della stessa colonna indicano differenze stati-sticamente significative per P<0,05.

FIGURA 5 - Differenziamenti nelle linee mesodermiche ed ectodermica confermate da colorazioni morfologiche edespressione genica dei geni specifici delle linee cellulari di induzione.

FIGURA 6 - Analisi con RT-PCR per l’espressione di specifici marker di mesenchi-malità (CD105, CD29, CD166, CD44 e CD34) e di immunogenicità (MHC-I e MHC-II) su AMCs prima e dopo crioconservazione. Il GAPDH è stato usato come genedi riferimento.

tato dalla colorazione con Alcian Blue. Il con-trollo ha dato esito negativo alla colorazione,come atteso.L’analisi dell’espressione dei marker condrogeni-ci, COL2A1 e ACAN attraverso RT-PCR ha confer-mato l’avvenuta induzione. Le cellule indotte aldifferenziamento hanno mostrato un’aumentataespressione di COL2A1 e ACAN rispetto al con-trollo, che non ha mostrato l’espressione deimarker. Il tessuto cartilagineo è stato usato co-me controllo positivo di espressione dei markercondrogenici.

Differenziamento neurogenicoDopo 3 giorni di induzione, il differenziamentoneurogenico è stato confermato non solo dallamorfologia assunta dalle cellule in piastra, ma an-che dalla positività alla colorazione di Nissl. LeAMCs hanno mostrato la tipica morfologia deineuroni con processi axon-like e dendrite-like e lapresenza dei processi primitivi tipici, come quelliosservati nei neuroni. L’espressione del gene GFAPha indicato, però, che in queste condizioni di col-tura le cellule amniotiche probabilmente sono sta-te indotte a differenziare in cellule gliali per lamancata espressione della nestina (NES).Il GAPDH è stato impiegato come gene riferimento.Le cellule scongelate sono state in grado di diffe-renziarsi verso le stesse linee testate per le cellu-le fresche isolate (dati non mostrati).

Analisi dei marker di espressioneattraverso RT-PCRL’analisi RT-PCR ha permesso di evidenziare, adifferenti passaggi (a P1 e P5), la presenza degliRNA messaggeri di marker specifici per le MSCs

(CD29, CD44, CD166, CD105) e l’assenza delmarker ematopoietico (CD34) (Fig. 6). Tuttavia, lecellule hanno cominciato ad esprimere quest’ul-timo marker a P5 (dati non mostrati). Le AMCshanno espresso l’antigene di immunoistocompa-tibilità I (MHC-I) sino a P5, mentre non si è mani-festata espressione dell’antigene di immunoisto-compatibilità II (MHC-II) a P1, che si è espresso alpassaggio P5. Il GAPDH è stato usato come genedi riferimento. Nei campioni congelati è stata os-servata una ridotta espressione del CD105 ri-spetto alle cellule fresche e l’assenza di espres-sione del CD166 (Fig. 6).

ImmunocitochimicaÈ stata indagata l’espressione dei marker di pluri-potenza: Oct-4, SSEA-4 e TRA 1-60. Le AMCs han-no rivelato gli antigeni studiati, come mostratonella Fig. 7.Oct-4 è espresso nel citoplasma e nel nucleomentre SSEA-4 e TRA 1-60 sono espressi sulla su-perficie cellulare come riportato in Fig. 7. L’espres-sione di TRA 1-60 è risultata molto debole. Lapresenza combinata degli antigeni Oct-4, SSEA-4 eTRA 1-60 attribuisce alle cellule amniotiche un fe-notipo primitivo.Gli stessi risultati sono stati ottenuti dopo scon-gelamento (dati non mostrati).

Istologia dell’allantoamniosL’amnios e l’allantoide delle membrane fetali a ter-mine sono caratterizzati ciascuno da uno stratoepiteliale e da uno strato mesenchimale (Fig. 8).L’amnios è un unico tessuto privo di vasi sangui-gni, costituito da cellule epiteliali cuboidali nellostrato epiteliale (Fig. 9A) e da cellule stromali nel-lo strato mesenchimale (Fig. 9B). Le cellule amnio-tiche epiteliali, sul versante esterno dell’amnios,sono a diretto contatto con il liquido amniotico.


❚ Ortopedia

FIGURA 7 - Presenza degli antigeni associati alla pluripotenza (Oct-4, SSEA-4 eTRA-1-60) nelle cellule mesenchimali amniotiche equine. 20X. Scala: 20 micron.

FIGURA 8 - Morfologia delle membrane fetali equine atermine (colorazione con ematossilina-eosina). (A) fo-glietto amniotico epiteliale; (B) foglietto amniotico me-senchimale; (C) foglietto allantoideo mesenchimale; (D)foglietto allantoideo epiteliale. La regione di contatto traamnios e allantoide è mostrata dalla freccia. Si può osser-vare la presenza di un vaso sanguigno nella parte allantoi-dea della membrana.

FIGURA 10 - Tre casi di lesioni tendinee prima e dopo trapianto di cellule mesenchimali allogeniche di derivazione amniotica.Caso 1: lesione traumatica acuta del tendine flessore superficiale del dito (SDFT). Le freccie mostrano un’ampia area anecogena nell’ecografia insezione trasversale (A) e longitudinale (B). Le frecce in C e D mostrano un’omogenea area ecogenica rispettivamente nell’immagine ecograficatrasversale e longitudinale nella stessa lesione dopo 50 giorni dall’impianto.Caso 2: lesione severa del SDFT. Le frecce indicano un’area anecoica nell’ecografia in sezione trasversale (A) e longitudinale (B), ed una leggeraarea ipoecoica rispettivamente nella sezione trasversale (C) e longitudinale (D) della stessa lesione dopo 50 giorni dall’impianto.Case 3: Lesione acuta del legamento accessorio del tendine flessore profondo (AL-DDFT). Le frecce mostrano un’area ipoecoica nell’ecografia in se-zione trasversale (A) e longitudinale (B) e un’area ecogenica in sezione trasversale (C) e longitudinale (D) rilevabile dopo 50 giorni dall’impianto.


❚ Ortopedia

Impianto delle MSCs nellastruttura teno-legamentosaA seguito delle iniezioni intradermiche, effettuateper valutare eventuali reazioni avverse, non si so-no verificate alterazioni, quindi, dopo questa fase siè proceduto agli impianti intralesionali.I soggetti hanno ben tollerato gli impianti intrale-sionali di cellule mesenchimali allogeniche isolateda amnios equino. Non si sono verificate reazionialgiche o infiammatorie. Si è verificata, inoltre, già

dai primi giorni, una sostanziale riduzione di volu-me, una diminuita algia alla palpazione del trattointeressato ed una significativa riduzione del gra-do di zoppia. Ad un primo controllo ecografico a15 giorni si è evidenziata, in tutti i casi, una preco-ce riduzione dell’area totale di sezione (T-CSA).Specificatamente, nel caso 1 l’area anecoica rap-presentativa della lesione è migliorata marcata-mente. L’aspetto ecogenico e l’architettura tissu-tale nella sezione longitudinale dell’ecografia rive-lano un chiaro processo di evoluzione dopo unperiodo di 70 giorni (Fig. 10, caso 1 C, D).Nel secondo caso la lesione anecoica che misura-va 0,58 cm2 si è ridotta in un’area ipoecoica di0,18 cm2 unitamente ad un aspetto soddisfacentedell’architettura delle fibre in scansione longitudi-nale dopo i primi 60 giorni (Fig. 10, caso 2 C, D).Nel terzo caso un’acuta e severa lesione di 2,32cm2 del legamento accessorio del tendine flessoreprofondo delle falangi (AL-DDFT) presentava unaspetto ecografico strutturato ed organizzato acirca 60 giorni (Fig. 10, caso 3 C, D).Inoltre, un follow up è stato condotto, dopo la ri-presa dell’attività agonistica, in tutti i casi fino a 12mesi dopo il trattamento e non sono state osser-vate recidive.

FIGURA 9 - Sezione istologica della membrana amnioti-ca con la regione epiteliale (A) e mesenchimale (B).

DISCUSSIONE

Terapie basate sul trapianto cellulare sono emersecome un nuovo potenziale approccio negli ultimianni in svariati settori della medicina rigenerativa.Le MSCs possono essere isolate da molteplici tes-suti e possiedono proprietà differenti, in base allafonte di origine ed al loro grado di differenziamen-to. Le MSCs ottenute dal BM sono le più studiatee conosciute, come dimostrano i lavori scientificidell’ultimo decennio (Digirolamo et al., 1999;Gronthos et al., 2003; Vidal et al., 2011). Per talemotivo, esse sono anche le più utilizzate per la te-rapia rigenerativa tissutale ed, in particolare, inmedicina veterinaria, per trattare le patologie del-l’apparato muscolo-scheletrico e del sistema ema-topoietico.Le problematiche relative al prelievo ed alle carat-teristiche delle cellule mesenchimali isolate da BMhanno portato, però, alla necessità di individuarenuove fonti di cellule staminali. La recente scoperta in campo umano dell’esi-stenza di MSCs in annessi fetali, di facile accessoe privi di controversie etico-morali, rende questecellule interessanti agli occhi dell’intera comuni-tà scientifica e questo vale soprattutto per il fat-to che questa popolazione cellulare si colloca inuna posizione ontogenetica intermedia tra leESCs e le cellule staminali adulte (Bajada et al.,2008; Siegel et al., 2007). Infatti, le cellule isolateda queste fonti, in campo umano, sono caratte-rizzate da proliferazione più rapida, una maggio-re espansione in vitro, dall’espressione dell’enzimatelomerasi (Mitchell et al., 2003) e da un notevo-le potenziale differenziativo, rispecchiando, quin-di, i criteri di staminalità definiti dal Comitatodelle cellule staminali.È con questi obiettivi che è stato affrontato que-sto studio, nel quale, per la prima volta nella spe-cie equina, la membrana amniotica a termine, chesolitamente è scartata ed è di facile raccolta, èstata da noi considerata come una fonte alterna-tiva di cellule con proprietà staminali in campomedico-veterinario. In medicina veterinaria, lamembrana amniotica è usata in terapia clinicaper la ricostruzione della superficie oculare co-me membrana in toto, ma a parte quest’uso nonsono mai state ottenute cellule amniotiche dal-l’amnios equino per possibile uso terapeutico. Inseguito a digestione enzimatica del tessuto am-niotico, sono state isolate cellule amnioticheequine di natura mesenchimale che sono stateespanse in coltura per 10 passaggi, sono state ca-ratterizzate, differenziate e, dopo inoculo nei sitidi lesione, valutate per la loro potenzialità rige-nerativa. Essendo questa una prima indagine co-noscitiva su quest’invoglio fetale, è stato effettua-to uno studio dettagliato relativo alla morfologiadi questa membrana ed alla caratterizzazionedelle sue cellule.

Dallo studio istologico è emerso che la membra-na amniotica equina è composta da uno stratoepiteliale e da uno stroma avascolare nel quale èpresente una rete di cellule mesenchimali fibrobla-stoidi. Nelle nostre condizioni, dopo digestione, lavitalità iniziale delle cellule isolate è stata più altadel 75%, che è considerata un ottimo valore dellaqualità a lungo termine di queste cellule sia in vi-sta dell’efficienza di semina sia per la crescita cel-lulare. Durante le fasi di coltura, le cellule che so-no rimaste adese alle piastre sono state espansefino al passaggio P10 ed i nostri risultati hanno di-mostrato la presenza di un gruppo di cellule capa-ci di aderire tenacemente al substrato colturale edi proliferare intensamente in vitro. Le cellule amniotiche equine, in generale, hannodimostrato un’alta capacità proliferativa fino al 6°-8° passaggio. Dopo questo periodo, la proliferazio-ne è diminuita, anche se il DT si è attestato, co-munque, a valori non superiori alle 48 ore. Co-munque, una robusta proliferazione fino al passag-gio P6 è stata riportata anche da altri autori per lecellule amniotiche umane (Soncini et al., 2007; Mi-ki et al., 2010).Le AMCs mantenute in coltura in alta densità han-no sviluppato strutture sferoidali senza mostrareinibizione da contatto. Queste strutture sferoidalisi sono sviluppate tridimensionalmente al di sopradel monostrato e sono state descritte nella coltu-ra delle ESCs (Miki e Strom, 2006) ed individuateanche da Carlin et al., (2006) nella coltura dellecellule della matrice del cordone di suino. Miki etal. (2005) hanno suggerito che il monostrato dicellule amniotiche, adese alla piastra di coltura, po-trebbe giocare il ruolo di monostrato cellulare disostegno autologo servendo come substrato perl’adesione del cluster o per fornire fattori che po-trebbero indurre o mantenere indifferenziate lecellule amniotiche che costituiscono le strutturesferoidali. Le cellule amniotiche in vitro hanno mostrato an-che l’abilità di formare cloni, popolazioni omoge-nee di cellule generate da un unico capostipite.Questa caratteristica, definita clonogenicità, è un at-tributo essenziale delle cellule staminali le quali,contrariamente a quanto avviene con cellule diffe-renziate, sono in grado di ripristinare in tempibrevi una popolazione di cellule uguali tra loro an-che quando seminate a diluizioni estremamenteelevate. La frequenza di formazione delle CFU-F èaumentata con l’incrementare della densità di se-mina indicando l’esistenza di qualche segnale para-crino, fra le cellule amniotiche, che avrebbe poten-ziato la formazione delle CFU-F nella coltura pri-maria a P0 (Sarugaser et al., 2005).Le cellule amniotiche equine hanno rivelato ilcaratteristico modello di espressione degli anti-geni delle MSCs espanse in coltura. L’analisi è sta-ta eseguita mediante RT-PCR basata su un pannel-lo di primer oligonucleotidici specificatamente di-


❚ Ortopedia


❚ Ortopedia

segnati sulla sequenza genica di questa specie. Ilpannello di marker realizzato rappresenta un utilestrumento nella ricerca delle cellule staminaliequine, poiché molti anticorpi, marker di stamina-lità descritti nelle altre specie, mostrano poca onulla reattività nella specie equina, rendendo cosìdifficoltoso il loro utilizzo in questo campo.Queste cellule hanno manifestato positività ai piùcomuni marker che definiscono le MSCs: CD29,CD44, CD105, CD166 e MHC-I ma non MHC-II. Lanatura non ematopoietica delle cellule staminali èstata suggerita dalla mancata espressione del mar-ker CD34 che ha iniziato ad esprimersi a P5. Que-st’ultimo dato potrebbe essere un’evidenza che lecellule amniotiche hanno un potenziale angiogeni-co così come è stato riportato in medicina umanada Alviano et al. (2007). A P5 anche il markerMHC-II ha iniziato ad essere espresso mentre ilmarker CD105 non era più espresso. La scarsa sta-bilità dei marker di superficie potrebbe indicarefenomeni epigenetici associati con la coltura cellu-lare che potrebbero influenzare le presunte cellu-le staminali amniotiche. Ulteriori caratterizzazionidi queste cellule saranno necessarie per compren-dere meglio questi cambiamenti.È importante sottolineare come l’assenza diespressione del marker MHC-II, almeno fino alquinto passaggio, renda queste cellule ipo-immuno-gene e, quindi, possibilmente utilizzabili nei passag-gi precoci per terapie cellulari di tipo allogenico.In aggiunta ai caratteristici marker di superficie, lecellule amniotiche hanno mostrato immunopositi-vità a Oct-4, TRA-1-60 e SSEA-4. Questi markersono tipici delle ESCs, ma rilevati anche in altrepopolazioni cellulari derivanti da annessi fetaliquali il cordone ombelicale (Carlin et al., 2006;Hoynowsky et al., 2007), la membrana amnioticaed il liquido amniotico umani (Miki et al., 2005;Portmann-Lanz et al., 2006; De Coppi et al., 2007;Ilancheran et al., 2007; Kim et al., 2007; Wolbank etal., 2007). È stato ipotizzato che la presenza di po-polazioni cellulari con tali caratteristiche possa es-sere messa in relazione ad uno stato di “primitivi-tà” del tessuto stesso e ad uno stadio cellulareprivo di differenziamento, ma caratterizzato dapluripotenza (Miki et al., 2005; Portmann-Lanz etal., 2006; De Coppi et al., 2007; Kim et al., 2007;Ilancheran et al., 2007; Wolbank et al., 2007). Le no-stre positività potrebbero ricalcare queste ipotesi.Lo studio del differenziamento in vitro suggerisceche queste cellule hanno fenotipo pluripotente,come supportato dalle differenziazioni nelle lineemesodermica ed ectodermica. In particolare, daquesto lavoro emerge la capacità di queste celluleamniotiche di differenziarsi nelle linee osteogeni-ca, adipogenica e condrogenica, come riportato daIn’t Anker et al. (2004) per l’amnios umano, ma an-che in cellule della linea gliale come mostrato daMiki et al. (2005) sempre in campo umano, dove il95% delle cellule stromali amniotiche ha espresso

immunolocalizzazione di GFAP. Osservando i datirelativi al potenziale proliferativo e differenziativodelle cellule amniotiche mesenchimali, si può pen-sare che questa membrana possa offrire vantaggicome una straordinaria fonte di presunte cellulestaminali disponibili per i futuri sforzi nell’ambitodella terapia cellulare. È per queste caratteristicheche ci è sembrato di notevole interesse un primostudio di queste cellule in vivo, per capirne gli even-tuali meccanismi riparativi. Gli effetti benefici diqueste cellule in questo test iniziale sottolineanoil loro potenziale applicativo nella medicina rige-nerativa veterinaria.Attraverso studi di trapianto cellulare in vivo, ab-biamo osservato che il trapianto allologo di cellu-le mesenchimali derivanti da amnios è ben tolle-rato dal cavallo e che tutti i dati clinici (riduzionedello spessore nelle dimensioni del tendine; sen-sibilità alla palpazione, misure delle aree delle se-zioni trasversali nell’ecografia) forniscono com-pleta evidenza nel supportare l’azione beneficadelle cellule iniettate. L’evoluzione ecografica ri-portata per l’architettura di tendini e legamenti èsimile a quella che è stata precedentemente ri-portata dopo applicazione di altre colture cellula-ri multipotenti mesenchimali ed autologhe (Ri-chardson et al., 2007). La possibilità di inoculo te-rapeutico immediato nelle lesioni di cellule chesono prontamente disponibili prima che ognicambiamento ultrastrutturale avvenga, e l’effettoplastico dimostrato da queste cellule, rappresen-tano i maggiori aspetti di interesse di questo nuo-vo approccio biotecnologico nel campo delle ten-dinopatie nei cavalli. Ovviamente, questo studionon è stato un trial pre-clinico, ma un’analisi discoperte preliminari ottenute con le cellule di de-rivazione amniotica nella specie equina. Inoltre,un punto debole di questo studio è la mancanzadi un gruppo di controllo e di una valutazioneistologica, quindi, ulteriori studi applicati ad unmaggior numero di animali saranno necessari perconfermare questi risultati. Infine, abbiamo dimostrato che le cellule amnioti-che equine possono essere congelate, conservatee recuperate senza la perdita della loro integritàfunzionale in termini di morfologia, presenza dispecifici marker e potenziale differenziativo, seb-bene la capacità proliferativa sia stata più bassa diquella osservata nelle cellule fresche. Da questopunto di vista i protocolli di crioconservazionedovrebbero essere migliorati al fine di permetterela creazione di un servizio di banca cellulare.

CONCLUSIONI

Questo studio è il primo a documentare le carat-teristiche di presunte cellule staminali isolate dal-la membrana amniotica equina ed il loro uso in vi-vo. Questi risultati ci conducono a sviluppare pro-

tocolli d’isolamento che possano essere utili in fu-turo per ottimizzare la raccolta e l’espansione diqueste cellule ai fini del loro utilizzo e ad ipotizza-re la costituzione di riserve crio-preservate utiliz-zabili in medicina rigenerativa.

RINGRAZIAMENTI

Si ringrazia la prof. Silvana Arrighi, Dipartimento diScienze Veterinarie per la Salute Animale e la Sicu-rezza Alimentare, per le sezioni istologiche del-l’amnios e la Clinica Veterinaria Equicenter, Mon-teleone (PV) per l’assistenza nel prelievo dellemembrane amniotiche.

Parole chiaveAmnios equino, MSCs, tendinopatie, medicina rige-nerativa.

❚ Amniotic mesenchymal-derived cellsfor the treatment of tendinopathy inthe horse: first report

SummaryRegenerative medicine is an emerging and multi-disciplinary field which draws on biology, medicineand genetic manipulation for the development ofstrategies aimed at maintaining, enhancing orrestoring the function of tissues or organs thathave been compromised by disease or injury. Be-cause of their ability to differentiate into differentcell lines, stem cells undoubtedly play a key role indeveloping such strategies. The embryonic cellsare totipotent, but their isolation involves the de-struction of the embryo and the application is lim-ited from their oncogenic potential. Adult stem


❚ Ortopedia

cells (i.e. from bone marrow, BM) have a limitedpotential compared to embryonic stem cells interms of both in vitro proliferation ability and dif-ferentiation capacity, and do not appear to notice-ably improve long-term functionality.Stem/progenitor cells derived from extra-fetalsources may represent attractive alternative can-didates with the potential to circumvent many ofthese limitations, opening new perspectives fordevelopmental biology and regenerative medicine.The aims of this work were to provide, for thefirst time, an isolation protocol for horse amnion-derived cells, to investigate the biological proper-ties of these cells and to assess whether horseamnion-derived cells can be tolerated and exertbeneficial effects in vivo when allogenically trans-planted into horses with tendon injuries.Our results have shown that these cells have highprolificacy and plasticity, differentiating in vitro to-ward mesodermic and ectodermic lineages, andown ability to be frozen without loss of theircharacteristics.Through cell transplantation stud-ies in vivo, we found that the transplanted equineamnion-derived cells were well-tolerated by hors-es, and all of the clinical findings reported provid-ed compelling evidence to support the exertion ofbeneficial effects by the injected cells. The possibil-ity of administering an immediate intralesionaltreatment which is available before any ultrastruc-tural change is observed within the injured ten-don, together with the plasticity effect of amniot-ic MSCs, represent the major features of interestfor this novel biotechnological approach to equinetendinopathies.

Key wordsAmnion, equine, MSCs, tendinopathies, regenerativemedicine.

B I B L I O G R A F I A

Alviano F, Fossati V, Marchionni C, Arpinati M, Bonsi L, Franchina M, Lanzo-ni G, Cantoni S, Cavallini C, Tazzari P L., Pasquinelli G, Foroni L, Ven-tura C, Grossi A, Bagnara GP (2007) Term amniotic membrane is ahigh throughput source for multipotent mesenchymal stem cellswith the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMCDev. Biol. 7, 11.

Arcelli R, Tibaldini P, Angeli G, Bellezza E (2009) Equine amniotic membra-ne transplantation in some ocular surface diseases in the dog andcat: a preliminary study. Vet. Res. Commun. 33 Suppl. 1, 169-171.

Avila M, Espana M, Moreno C, Peña C. (2001) Reconstruction of ocularsurface with heterologous limbal epithelium and amniotic membra-ne in a rabbit model. Cornea 20, 414-420.

Bailo M, Soncini M, Vertua E, Signoroni P Bonassi, Sanzone S, Lombardi G,Arienti D, Calamani F, Zatti D, Paul P, Albertini A, Zorzi F, Cavagnini A,Candotti F, Wengler GS, Parolini O (2004) Engraftment potential ofhuman amnion and chorion cells derived from term placenta. Tran-splantation 78, 1439-1448.

Bajada S, Mazakova I, Richardson JB Ashammakhi N. (2008) Updates onstem cells and their applications in regenerative medicine. J. TissueEngineering and Regenerative Medicine 2, 169-183.

Berg L, Koch T, Heerkens T, Besonov K, Thomsen PD, Betts DH (2009)Chondrogenic potential of mesenchymal stromal cells derived fromequine bone marrow and umbilical cord blood. Vet. Comp. Orthop.Traumatol. 22, 363-370.

Caplan (2007) Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versusregenerative medicine. Journal of Cellular Physiology 213, 341-347.

Caplan AI, Dennis JE (2006) Mesenchymal stem cells as trophic mediators.J. Cell. Biochem. 98, 1076-1084.

Carlin R, Davis D, Weiss M, Schultz B, Troyer D (2006) Expression of earlytranscription factors Oct-4, Sox-2 and Nanog by porcine umbilicalcord (PUC) matrix cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 4, 8.

Cremonesi F, Violini S, Lange Consiglio A, Ramelli P, Ranzenigo G, Mariani P(2008) Isolation, in vitro culture and characterization of foal umbili-cal cord stem cells at birth. Vet. Res. Commun. 32, 139-142.

Crovace A, Lacitignola L, De Siena R, Rossi G, Francioso E (2007) Cell the-rapy for tendon repair in horses: an experimental study. Vet. Res.Commun. 31, 281-283.

Crovace A, Lacitignola L, Rossi G, Francioso E (2010) Histological and im-munohistochemical evaluation of autologous cultured bone marrowmesenchymal stemcells and bone marrow mononucleated cells in


❚ Ortopedia

collagenase-induced tendinitis of equine superficial digital flexor ten-don. Veterinary Medicine International, Epub 22 marzo, Articolo ID250978.

De Coppi P, Bartsch G, Siddiqui MM, Xu T, Santos CC, Perin L, Mostoslav-sky G, Serre AC, Snyder EY, Yoo JJ, Furth ME, Soker S, Atala A (2007)Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat.Biotecn. 25, 100-106.

Digirolamo CM, Stokes D, Colter D, Phinney DG, Class R, Prockop DJ(1999) Propagation and senescence of human marrow stromal cellsin culture: a simple colony-forming assay identifies samples with thegreatest potential to propagate and differentiate. Br. J. Haematol. 107,275-281.

Dua HS, Gomes JA, King AJ, Maharajan VS (2004) The amniotic membranein ophthalmology, Surv Ophthalmol. 49, 51-77.

Durando MM, Zarucco L, Schaer TP, Ross M, Reef VB (2006) Pneumoperi-cardium in a horse secondary to sternal bone marrow aspiration,Equine Vet. Educ. 18, 75-79.

Dyson SJ (2004) Medical management of superficial digital flexor tendoni-tis: a comparative study in 219 horses (1992-2000). Equine Vet. J. 36,415-419.

Evangelista M, Soncini M, Parolini O (2008) Placenta-derived stem cells:new hope for cell therapy? Cytotechnology 58, 33-42.

Foland JW, Trotter GW, Powers BE (1992). Effect of sodium hyaluronate incollagenase-induced superficial digital flexor tendinitis in horses. Am.J. Vet. Res. 53, 2371-2376.

Fortier LA, Smith RK (2008) Regenerative medicine for tendinous and li-gamentous injuries of sport horses. Vet. Clin. North Am. EquinePract. 24, 191-201.

Gronthos S, Zannettino AC, Hay SJ, Shi S, Graves SE, Kortesidis A, SimmonsPJ (2003) Molecular and cellular characterisation of highly purifiedstromal stem cells derived from human bone marrow. J. Cell. Sci. 116,:1827-1835.

Guest D J (2008) Defining the expression of marker genes in equine me-senchymal stromal cells. Stem Cells and Cloning: Advances and Ap-plications 1, 1-9.

Guest DJ, Smith MR, Allen WR (2010) Equine embryonic stem-like cellsand mesenchymal stromal cells have different survival rates and mi-gration patterns following their injection into damaged superficial di-gital flexor tendon. Equine Vet. J. 42, 636-642.

Guillot PV, Gotherstrom C, Chan J, Kurata H, Fisk NM (2007) Humanfirst-trimester fetal MSC express pluripotency marker and growfaster and have longer telomeres than adult MSC. Stem Cells 25,646-654.

Hoynowski SM, Fry MM, Gardner BM, Leming MT, Tucker JR, Black L, SandT, Mitchell KE. (2007) Characterization and differentiation of equineumbilical cord-derived matrix cells. Biochem. Biophys. Res. Commun.362, 347-353.

Ilancheran S, Michalska A, Peh G, Wallace EM, Pera M, Manuelpillai U (2007)Stem cells derived from human fetal membranes display multilineagedifferentiation potential. Biol. Reprod. 77, 577-588.

Im G I, Shin Y W, Lee K B (2005) Do adipose tissue-derived mesenchymalstem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential asbone marrow-derived cells? Osteoarthr. Cart. 13, 845-853.

In’t Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg-van der Keur C, De Groot SwingsGM, Claas FH, Fibbe WE, Kanhai HH (2004) Isolation of mesenchy-mal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. StemCell 22, 1338-1345.

Kapetanos G (1982) The effect of the local corticosteroids on the healingand biomechanical properties of the partially injured tendon. Clin.Orthop. 163, 170-179.

Kim J, Lee Y, Kim H, Hwang KJ, Kwon HC, Kim SK, Cho DJ, Kang SG, You J(2007) Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristicsof multipotent stem cells. Cell. Prolif. 40, 75-90.

Kisiday JD, Kopesky PW, Evans CH, Grodzinsky AJ, McIlwraith CW, FrisbieDD (2008) Evaluation of adult equine bone marrow- and adipose-derived progenitor cell chondrogenesis in hydrogel cultures. J. Or-thop. Res. 26, 322-331.

Koch GT, Berg CL, Betts DH (2008) Concepts for the clinical use of stemcells in equine medicine. Can. Vet. J. 49,1009-1017

Koerner J, Nesic D, Romero JD, Brehm W, Mainil-Varlet P, Grogan SP(2006) Equine peripheral blood-derived progenitors in comparisonto bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells 24,1613-1619.

Kubo M, Sonoda Y, Muramatsu R, Usui M (2001) Immunogenicity of humanamniotic membrane in experimental xenotransplantation. InvestOphthalmol. Vis. Sci. 42, 1539-1546.

Lacitignola L, Crovace A, Rossi G, Francioso E (2008) Cell therapy for ten-dinitis, experimental and clinical report Vet. Res. Commun. 32 (Suppl1), S33-S38.

Lam K, Parkin T, Riggs C, Morgan K (2007) Content analysis of free-textclinical records: their use in identifying syndromes and analyzing he-alth data. Vet. Rec. 161, 547-551.

Magatti M, De Munari S, Vertua E, Gibelli L, Wengler GS, Parolini O (2008);Human amnion mesenchyme harbors cells with allogeneic T-cell sup-pression and stimulation capabilities. Stem Cells 26, 182-192.

Marr C, Love S, Boyd J, McKellar Q (1993) Factors affecting the clinicaloutcome of injuries to the superficial digital flexor tendon in Natio-nal Hunt and point-to-point racehorses. Vet. Rec. 132, 476-479.

Miki T, Lehmann T, Cai H, Stolz D B, Strom SC (2005) Stem cell characte-ristics of amniotic epithelial cells. Stem Cell 23, 1549-1559.

Miki T, Marongiu F, Dorko K, Ellis EC, Strom SC (2010) Isolation of amnio-tic epithelial stem cells. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 1: Unit1E 3.

Miki T, Strom SC (2006) Amnion-derived pluripotent/multipotent stemcells. Stem Cell Rev. 2, 133-142.

Mitchell KE, Weiss ML, Mitchell BM, Martin P, Davis D, Morales L, Helwig B,Hildreth T, Troyer D (2003) Matrix cells from Wharton’s jelly formneurons and glia. Stem Cell 21, 50-60.

Murphy AJ, Fink DJ, Hunziker EB (2003) Stem cell therapy in a caprine mo-del of osteoarthritis. Arthr. Rheum. 48, 3464-3474.

Muschler G F, Nakamoto C, Griffith L G (2004) Engineering principles ofclinical cell-based tissue engineering. J. Bone Joint Surg. Am. 86-A,1541-1558.

Ollivier FJ, Kallberg ME, Plummer CE, Barrie KP, O’Reilly SO, Taylor DP, Ge-latt KN, Brooks DE. (2006) Amniotic membrane transplantation forcorneal surface reconstruction after excision of corneolimbal squa-mous cell carcinomas in nine horses. Vet. Ophthalmol 9, 404-413.

Pacini S, Spinabella S, Trombi L, Fazzi R, Galimberti S, Dini F, Carlucci F, Pe-trini M (2007) Suspension of bone marrow-derived undifferentiatedmesenchymal stromal cells for repair of superficial digital flexor ten-don in race horses. Tissue Eng. 13, 2949-2955.

Paris DB, Stout TA. (2010) Equine embryos and embryonic stem cells: de-fining reliable marker of pluripotency. Theriogenology 74, 516-524.

Passeri S, Nocchi F, Lamanna R,Lapi S, Miragliotta V, Giannessi E, Abramo F,Stornelli MR, Matarazzo M, Plenteda D, Urcioli P, Scatena F, Coli A(2009) Isolation and expansion of equine umbilical cord-derived ma-trix cells (EUCMCs). Cell Biol. Int. 33, 100-105.

Plummer CE (2009) The use of amniotic membrane transplantation forocular surface reconstruction: a review and series of 58 equine clini-cal cases (2002–2008), Veterinary Ophthalmology 12, 17-24.

Portmann-Lanz CB, Schoeberlein A, Huber A (2006) Placental mesenchy-mal stem cells as potential autologous graft for pre- and perinatalneuroregeneration. Am. J. Obstet. Gynecol. 194, 664-673.

Reed SA, Johnson SE (2008) Equine umbilical cord blood contains a popu-lation of stem cells that express Oct4 and differentiate into meso-dermal and endodermal cell types. J. Cell Physiol. 215, 329-336.

Richardson LE, Dudhia J, Clegg PD, Smith R (2007) Stem cells in veterina-ry medicine—attempts at regenerating equine tendon after injury.Trends Biotechnol. 25, 409-416.

Sankar V, Muthusamy R (2003) Role of human amniotic epithelial cell tran-splantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience 118,11-17.

Sarugaser R, Lickorish D, Baksh D, Hosseini MM, Davies JE (2005) Humanumbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymalprogenitors. Stem Cells 23, 220-229.

Shi S, Gronthos S (2003) Perivascular niche of postnatal mesenchymalstem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res.18, 696-704.

Siegel N, Rosner M, Hanneder M, Valli A, Hengstschlager M (2007) Stemcells in amniotic fluid as a new tools to study human genetic disea-ses. Stem Cell Review 3, 256-264.

Simmons PJ, Torok-Storb B (1991) Identification of stromal cell precursorsin human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1.Blood 78, 55-62.

Smith RK, Korda M, Blunn GW, Goodship AE (2003) Isolation and implan-tation of autologous equine mesenchymal stem cells from bone mar-


❚ Ortopedia

row into the superficial digital flexor tendon as a potential novel tre-atment. Eq. Vet. J. 35, 99-102.

Smith RK, Korda M, Blunn GW, Goodship AE (2003) Isolation and implan-tation of autologous equine mesenchymal stem cells from bone mar-row into the superficial digital flexor tendon as a potential novel tre-atment. Eq. Vet. J. 35, 99-102.

Solomon A, Wajngarten M, Alviano F, Anteby I, Elchalal U, Pe’er J, Levi-Schaf-fer F (2005) Suppression of inflammatory and fibrotic responses inallergic inflammation by the amniotic membrane stromal matrix.Clin. Exp. Allergy 35, 941-948.

Soncini M, Vertua E, Gibelli L, Zorzi F, Denegri M, Alberini A, Wengler GS,Parolini O (2007) Isolation and characterization of mesenchymalcells from human fetal membranes. J. Tiss. Eng. Regen. Med. 1, 296-305.

Vidal MA, Kilroy GE, Johnson JR, Lopez MJ, Moore RM, Gimble JM (2006)Cell growth characteristics and differentiation frequency of adherentequine bone marrow-derived mesenchymal stromal cells: adipogenicand osteogenic capacity. Vet. Surg. 35: 601-610.

Vidal MA, Walker NJ, Napoli E, Borjesson DL. (2011) Evaluation of sene-scence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone mar-

row, adipose tissue, and umbilical cord tissue stem cells develop-ment. Stem cells and Development doi:10.1089/scd.2010.0589.

Wilke MM, Nydam DV, Nixon AJ (2007) Enhanced early chondrogenesis inarticular defects following arthroscopic mesenchymal stem cell im-plantation in an equine model. J. Orthop. Res. 25, 913-925.

Winter A, Breit S, Parsch D (2003) Cartilage-like gene expression in diffe-rentiated human stem cell spheroids: a comparison of bone marrow-derived and adipose tissue-derived stromal cells. Arthr. Rheum. 48,418-429.

Wolbank S, Peterbauer A, Fahrner M (2007) Dose-dependent immunomo-dulatory effect of human stem cells from amniotic membrane: acomparison with human mesenchymal stem cells from adipose tis-sue. Tiss. Eng. 13, 1173-1183.

Woo SL-Y, Hilebrand, K, Watanabe N, Fenwick JA, Papageorgiou CD, WangJH-C (1999) Tissue engineering of ligament and tendon healing. Clin.Orthop. Rel. Res. 367 Suppl., S312-S323.

Yuge I, Takumi Y, Koyabu K, Hashimoto S, Takashima S, Fukuyama T, NikaidoT, Usami S (2004) Transplanted human amniotic epithelial cells ex-press connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the innerear. Transplantation 77, 1452-1454.

Per informazioni: Bando e modulo della domanda: www.unifi.itCattedra di NPI: Prof.ssa A. Pasquinelli, Dr.ssa P. Allori, Tel 055.4298433-425, Fax 055.4298432, [email protected]

Segreteria Master: Tel 055.4598771-775-767, Fax 055.4598928, [email protected] “Lapo” ONLUS: Dr.ssa C. Mannini, Sig.ra D. Gamuzza, Tel 055.4298431, 347.5398994, www.associazione-lapo.it

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE - FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIADIPARTIMENTO DI SCIENZE NEUROLOGICHE E PSICHIATRICHE

CATTEDRA DI NEUROPSICHIATRIA INFANTILEin collaborazione con ASSOCIAZIONE “LAPO” ONLUS

Anni Accademici 2011/2012-2012/2013 – VI EDIZIONE

MASTER UNIVERSITARIO DI 1° LIVELLO IN RIABILITAZIONE EQUESTRE

Formazione del profilo professionale di “COORDINATORE TECNICO DI RIABILITAZIONE EQUESTRE”

COORDINATORE: Prof.ssa Anna Pasquinelli, Prof. Associato Cattedra Neuropsi-chiatria Infantile (NPI)

OBIETTIVI: Fornire la preparazione culturale ed applicativa neurologica, psi-chiatrica, neuropsicologica, riabilitativa e dell’equitazione necessaria per lo svol-gimento della Riabilitazione Equestre (RE) e le competenze teorico-pratiche perl’integrazione multidisciplinare del lavoro in Équipe. Formazione delle compe-tenze della figura professionale del “Coordinatore Tecnico di Riabilitazione Eque-stre”: impianto, organizzazione, gestione operativa di Centri di RE, direzione, con-duzione, verifica dell’attività di RE

DOCENTI: Docenti Cattedre NPI, Neurologia, Psichiatria, Audiologia, Oculistica;Fisioterapisti, Logopedisti, Tiflologi, Terapisti di Centri di RE; Istruttori di Equita-zione di II, III Livello, I.F. Volteggio, Giudici F.I.S.E.; Veterinari

STRUTTURE PER STAGE E TIROCINI:Centri di RE accreditati; Centri Ippici F.I.S.E.

MODALITÀ DIDATTICHE: durata biennale per complessive 590 ore;inizio Febbraio 2012

• Didattica accademica e attività teorico/pratica 440 ore: 8 settimane full im-mersion in sede - Firenze - e 3 fuori sede:

1) Stage Teorico/Pratico di Volteggio e Volteggio per Disabili a Mantova

2) Stage Teorico/Pratico di approfondimento RE e Sport per Disabili a Nus (AO)

3) Stage di Equitazione e di Equitazione per Disabili a Cernusco sul Naviglio(MI)

• Tirocinio di Riabilitazione Equestre 150 ore: Aprile 2012 / Ottobre 2013

TITOLI PER L’AMMISSIONE

• Laurea vecchio ordinamento, 1° Livello, Specialistica; Diplomi Professioni Sa-nitarie, Assistente Sociale, ISEF, Accademia Belle Arti, Conservatorio

• Equitazione: Patenti F.I.S.E. “B” o superiori, o competenza nelle tre andature (laPatente “B” va comunque acquisita entro il 1° anno)

POSTI DISPONIBILI: 30

ISCRIZIONE entro il 20/12/2011

QUOTA D’ISCRIZIONE per il biennio € 4.900

MODALITÀ DI SELEZIONE: Valutazione requisiti curriculari e di equitazione ecolloquio inerente la preparazione di base

NUMERO CREDITI: 90 CFU(esenzione dall’obbligo di acquisizione dei crediti ECM per il biennio)

TITOLO DI STUDIO: Diploma di “Master di 1° livello in Riabilitazione Equestre”rilasciato dal Rettore

Documents

Cellule staminali mesenchimali dell’amnios equino per il ... · RIASSUNTO La medicina rigenerativa si basa sulla biologia e la manipolazio- ... (Solomon et al., 2005) e modula l’an-giogenesi