L i nói đ uờ ầ

Công ngh DNA tái t h p (còn g i là k thu t di truy n hay k thu t gen) làệ ổ ợ ọ ỹ ậ ề ỹ ậ m t b ph n quan tr ng và là công ngh chìa khóa (key technology) c a lĩnh v c côngộ ộ ậ ọ ệ ủ ự ngh sinh h c. Công ngh DNA tái t h p đ c ra đ i trên c s các thành t u c aệ ọ ệ ổ ợ ượ ờ ơ ở ự ủ sinh h c phân t và hi n nay đang đóng vai trò cách m ng đ i v i s phát tri n c aọ ử ệ ạ ố ớ ự ể ủ sinh h c cũng nh c i t o sinh gi i. ọ ư ả ạ ớ

Các k thu t tái t h p DNA đã cho phép các nhà công ngh sinh h c phân l pỹ ậ ổ ợ ệ ọ ậ và khu ch đ i m t gen đ n t genome c a m t sinh v t đ có th nghiên c u, bi nế ạ ộ ơ ừ ủ ộ ậ ể ể ứ ế đ i và chuy n nó vào trong m t c th sinh v t khác. Các k thu t này còn đ c g iổ ể ộ ơ ể ậ ỹ ậ ượ ọ là t o dòng gen do nó có th s n xu t ra m t s l ng l n các gen xác đ nh. ạ ể ả ấ ộ ố ượ ớ ị

Bên c nh các giáo trình nh : sinh h c phân t , nh p môn công ngh sinh h c,ạ ư ọ ử ậ ệ ọ công ngh t bào, công ngh chuy n gen… giáo trình công ngh DNA tái t h p sệ ế ệ ể ệ ổ ợ ẽ giúp sinh viên ti p c n thêm m t lĩnh v c khác c a công ngh sinh h c thông qua vi cế ậ ộ ự ủ ệ ọ ệ cung c p nh ng ki n th c c b n theo h ng t o dòng và bi u hi n gen nh sau:ấ ữ ế ứ ơ ả ướ ạ ể ệ ư

- Các enzyme dùng trong t o dòng phân t .ạ ử

- Các h th ng vector.ệ ố

- M t s k thu t c b n trong t o dòng gen: đi n di, PCR… ộ ố ỹ ậ ơ ả ạ ệ

- T o dòng và xây d ng các th vi n genomic DNA và cDNA.ạ ự ư ệ

- Bi u hi n các gen đ c t o dòng trong ể ệ ượ ạ E. coli.

Do giáo trình này m i đ c xu t b n l n đ u tiên, h n n a lĩnh v c công nghớ ượ ấ ả ầ ầ ơ ữ ự ệ DNA tái t h p l i r t ph c t p, nên khó tránh kh i thi u sót ho c ch a đáp ng đ cổ ợ ạ ấ ứ ạ ỏ ế ặ ư ứ ượ yêu c u b n đ c. Vì th , chúng tôi r t mong nh n đ c nhi u ý ki n đóng góp đ l nầ ạ ọ ế ấ ậ ượ ề ế ể ầ xu t b n sau đ c hoàn thi n h n. ấ ả ượ ệ ơ

Chúng tôi chân thành c m n Qu Nâng cao ch t l ng-D án Giáo d c đ i h cả ơ ỹ ấ ượ ự ụ ạ ọ đã h tr chúng tôi biên so n giáo trình này, PGS. TS. Lê Tr n Bình đã đ c b n th oỗ ợ ạ ầ ọ ả ả và góp nhi u ý ki n quý báu.ề ế

Các tác giả

Ph l cụ ụ

M t s thu t ng c b nộ ố ậ ữ ơ ả

Adapter. M t oligodeoxyribonucleotide tông h p t ng t linker, nh ng có m tộ ợ ươ ự ư ộ đ u b ng và m t đ u l i 5’ t ng ng v i m t v trí c t h n ch ầ ằ ộ ầ ồ ươ ứ ớ ộ ị ắ ạ ế cho phép nôi cDNA s i đôi v i cac plasmid vector hoăc bacteriophage ợ ớ λ vector có đ u t ng đ ng (xemầ ươ ồ thêm linker).

Adenosine diphosphate (ADP). M t ribonucleoside 5’-diphosphate đ c c u t oộ ượ ấ ạ t adenine, đ ng ribose (5C) và hai g c phosphate. ADP có tác d ng nh n phosphateừ ườ ố ụ ậ trong chu trình năng l ng c a t bào.ượ ủ ế

Adenosine triphosphate (ATP). M t ribonucleoside 5’-triphosphate đ c c uộ ượ ấ t o t adenine, đ ng ribose (5C) và ba g c phosphate. ATP là phân t ch a năngạ ừ ườ ố ử ứ l ng hóa h c chính c a t bào, chu yêu đ c tâp h p trong ty thê (mitochondria) vaượ ọ ủ ế ượ ợ l p thê (chloroplast). Các g c phosphate c a ATP có mang các liên k t khi b th y phânạ ố ủ ế ị ủ s phóng thích m t năng l ng t do l n. Năng l ng c a qua trinh hô hâp hoăc quangẽ ộ ượ ự ớ ượ ủ h p đ c s dung đê tao thanh ATP t ADP. Sau đo, ATP đ c biên đôi ng c tr laiợ ượ ử ừ ượ ượ ở thanh ADP nhiêu vung khac nhau cua tê bao, năng l ng phong thích ra đ c dung đê ở ượ ượ điêu khiên cac phan ng hóa sinh n i bao. Đôi khi cũng xay ra s th y phân tiêp ADP ứ ộ ự ủ thanh nh ng AMP (adenosine monophosphate) đ phóng thích năng l ng nhi u h n. ữ ể ượ ề ơ

Amino acid. Là m t phân t nh mang m t g c amine (-NHộ ử ỏ ộ ố 3) và m t g cộ ố carboxyl (-COOH) liên k t v i cùng m t nguyên t carbon. Amino acid là đ n v c uế ớ ộ ử ơ ị ấ trúc c s c a chu i polypeptide. Có 20 amino acid khác nhau trên các chu iơ ở ủ ỗ ỗ polypeptide co trong t nhiên. Trinh t săp xêp cua cac amino acid trên chu i ự ự ỗ polypeptide quyêt đinh câu truc va ch c năng cua polypeptide va protein ma no tao ứ thanh.

Ampicillin (Amp). Chât khang sinh ban tông h p đ c dung trong môi tr ng ợ ượ ườ chon l c đê chon cac tê bao mang đôt biên khuyêt d ng hoăc chon dong tê bao (tái t ọ ươ ổ h p) mang đoan DNA đ c t o dong. ợ ượ ạ

BAC (bacteria artificial chromosome). Nhi m s c th nhân t o c a vi khu n,ễ ắ ể ạ ủ ẩ d a trên c s plasmid F-factor, đ c s d ng làm vector t o dòng. BAC có th táiự ơ ở ượ ử ụ ạ ể b n trong ả E. coli v i các đo n chèn DNA có kích th c lên đ n 300 kb. ớ ạ ướ ế

B n đ c t h n ch (restriction map).ả ồ ắ ạ ế Trình t các v trí nh n bi t (recognitionự ị ậ ế sites) c a t t c các enzyme h n ch (restriction enzyme hay restriction endonuclease,ủ ấ ả ạ ế RE) trên m t phân t DNA.ộ ử

Baz đông đăng (analog base).ơ Chât hóa hoc co câu truc phân t rât giông cac ử base binh th ng cua DNA. Chung co thê thay thê cac nitrogen base binh th ng trong ườ ườ DNA va hoat đông nh m t tac nhân đôt biên. Trong lân sao chep tiêp theo cua DNA, ư ộ base đông đăng co thê b t căp sai v i môt base binh th ng, tao nên đôt biên điêm. Ví ắ ớ ườ d : base đông đăng cua adenine (A) la 2-aminopurine (AP) co thê g n vao DNA vi triụ ắ ở c a adenine; trong lân sao chep tiêp đo co thê b t căp v i cytosine (C), trong lân saoủ ắ ớ chep tiêp theo n a C kêt căp v i guanine (G). Nh vây đa diên ra s thay thê c p A-T ữ ớ ư ự ặ băng căp G-C.

Baz nit (nitrogen base).ơ ơ Loai phân t c u tao nên nucleic acid (DNA và RNA). ử ấ Cac nitrogen base co trong nucleic acid là adenine, guanine, cytosine và thymine (DNA) ho c uracil (RNA). Trinh t săp xêp cua chung doc theo phân t nucleic acid đã tao nênặ ự ử thông tin di truyên c a c th sinh v t. ủ ơ ể ậ

B t c p b sung ắ ặ ổ (complementary base pairing). S k t h p thành t ng đôiự ế ợ ừ gi a các nitrogen base n m trên hai m ch đ n c a chu i xo n kép DNA-DNA, DNA-ữ ằ ạ ơ ủ ỗ ắRNA ho c RNA-RNA ặ thông qua các m i liên k t hydrogen. S b t c p đó mang tínhố ế ự ắ ặ đ c hi u: guanine b t c p v i cytosine, còn adenine b t c p v i thymine trên DNAặ ệ ắ ặ ớ ắ ặ ớ ho c uracil trên RNA.ặ

Bi n n p (transformation).ế ạ Là quá trình truy n DNA ngo i lai vào m t t bàoề ạ ộ ế nh n, ch ng h n sphaeroplast ho c protoplast, và có th h p nh t trong nhi m s c thậ ẳ ạ ặ ể ợ ấ ễ ắ ể nh s tái t h p t ng đ ng ho c đ c bi n đ i trong m t đ n v sao chép t trờ ự ổ ợ ươ ồ ặ ượ ế ổ ộ ơ ị ự ị (autonomous replicon). S bi n n p có th xu t hi n trong các đi u ki n t nhiên ự ế ạ ể ấ ệ ề ệ ự ở m t s vi khu n (ví d : ộ ố ẩ ụ Bacillus, Haemophilus, Neisseria và Streptococcus), nh ng ư ở nhi u vi khu n (ví d : ề ẩ ụ E. coli) và các c th sinh v t eukaryote s bi n n p ch có thơ ể ậ ự ế ạ ỉ ể xu t hi n nh ng t bào “th m” đ c DNA b ng các ph ng pháp nhân t o nh :ấ ệ ở ữ ế ấ ượ ằ ươ ạ ư hóa bi n n p, đi n bi n n p... ế ạ ệ ế ạ

Bi n n p b ng đi nế ạ ằ ệ (electroporation). K thu t dùng xung đi n t o ra các lỹ ậ ệ ạ ỗ th ng t m th i trên màng sinh ch t đ đ a DNA ngo i lai vào bên trong t bào v tủ ạ ờ ấ ể ư ạ ế ậ ch . ủ

Bi n tính (denaturation).ế Là hi n t ng chuy n t d ng m ch kép sang d ngệ ượ ể ừ ạ ạ ạ m ch đ n c a DNA và RNA th ng do nhi t gây nên. Bi n tính c a protein là hi nạ ơ ủ ườ ệ ế ủ ệ t ng chuy n t c u hình ho t đ ng thành d ng không ho t đ ng.ượ ể ừ ấ ạ ộ ạ ạ ộ

Bi u hi n c a gen (gene ể ệ ủ expression). Là các quá trình phiên mã (transcription) và d ch mã (translation) c a m t gen đ t o ra s n ph m protein c a nó. ị ủ ộ ể ạ ả ẩ ủ

C p base (base pair, bp). ặ Là liên k t A-T ho c C-G trên m t phân t DNAế ặ ộ ử m ch kép, và là đ n v đo chi u dài c a m t phân t DNA.ạ ơ ị ề ủ ộ ử

Chromosome walking. K thu t ỹ ậ này dùng đ l p b n đ nhi m s c th t t pể ậ ả ồ ễ ắ ể ừ ậ h p các đo n ợ ạ DNA c t h n ch ch ng lên nhauắ ạ ế ồ (overlapping). B t đ u t m t thắ ầ ừ ộ ư vi n trong đó ch a các đo n DNA nói trên đã đ c t o dòng. M t đo n DNA mangệ ứ ạ ượ ạ ộ ạ

m t gen đã bi t đ c l a ch n và s d ng nh m t m u dò đ nh n d ng (ví d :ộ ế ượ ự ọ ử ụ ư ộ ẫ ể ậ ạ ụ b ng cách lai khu n l c) các đo n khác, là các đo n ch ng lên nhau ch a cùng m tằ ẩ ạ ạ ạ ồ ứ ộ gen. Sau đó, trình t nucleotide c a các đo n này s đ c phân tích và nh v y có thự ủ ạ ẽ ượ ờ ậ ể xác đ nh đ c toàn b các đo n c a nhi m s c th . T đó, b n đ c a m t vùng đ cị ượ ộ ạ ủ ễ ắ ể ừ ả ồ ủ ộ ặ bi t s đ c xây d ng d n d n.ệ ẽ ượ ự ầ ầ

Chu trình sinh tan (lylic cycle). M t ki u chu trình s ng c a th c khu n thộ ể ố ủ ự ẩ ể (bacteriophage) khi nó xâm nhi m vi khu n, đi u khi n các ho t đ ng sinh s n và sinhễ ẩ ề ể ạ ộ ả tr ng b ng các gen c a nó và sinh ra các bacteriophage th h con, chui ra khoi tê baoưở ằ ủ ế ệ vi khuân sau khi pha v tê bao đo. ơ

Chu trinh tiêm tan (lysogenic cycle). Là hi n t ng h gen c a bacteriophageệ ượ ệ ủ hi n di n tr ng thái n đ nh và không sinh tan trong t bào v t ch s ng c a nó. Cácệ ệ ở ạ ổ ị ế ậ ủ ố ủ t bào v t ch có th ti p t c sinh tr ng và phân chia, và s sao chép c a h genế ậ ủ ể ế ụ ưở ự ủ ệ bacteriophage (prophage) đ c ph i h p v i nhi m s c th c a v t ch sao cho khi tượ ố ợ ớ ễ ắ ể ủ ậ ủ ế bào phân chia thì prophage cũng đ c chuy n vào trong c hai t bào con. Prophageượ ể ả ế đ c duy trì b ng cách ho c h p nh t trong nhi m s c th v t ch (ví d :ượ ằ ặ ợ ấ ễ ắ ể ậ ủ ụ bacteriophage λ, bacteriophage Φ105) ho c nh là m t plasmid bên ngoài nhi m s cặ ư ộ ễ ắ th (ví d : bacteriophage P1 và bacteriophage F116). T bào v t ch có th ho cể ụ ế ậ ủ ể ặ không th bi u hi n ra m t ki u hình bi n đ i.ể ể ệ ộ ể ế ổ

Chu i contig (contiguous sequence).ỗ Môt đoan trình t dai đ c hinh thanh t ự ượ ừ môt sô cac đoan phân t ngăn chông lên nhau (overlapping). ử

Chuôi kham (concatemer). Phân t DNA bao gôm nhiêu đoan ca biêt nôi v iử ớ nhau thông qua cac đâu dinh.

Chu i mã hóa (coding sequence).ỗ Đo n phân t DNA mang mã di truy n xácạ ử ề đ nh đ phiên mã thành mRNA và sau đó d ch mã thành chu i polypeptide. ị ể ị ỗ

Chuyên gen (transgenic). Quá trình chuy n m t đoan DNA ngo i lai (foreignể ộ ạ DNA) b ng các k thu t khác nhau (ằ ỹ ậ Agrobacterium, vi tiêm, b n gen, xung đi n...) vàoắ ệ m t c th v t ch (vi sinh v t, đ ng v t ho c th c v t). ộ ơ ể ậ ủ ậ ộ ậ ặ ự ậ

Chuy n nhi m (transfection).ể ễ K thu t đ a DNA phage ho c DNA virus vàoỹ ậ ư ặ các t bào v t ch .ế ậ ủ

Cosmid. Vector lai (hybrid vector) đ c câu thanh t cac đoan trinh t c aượ ừ ự ủ plasmid va cac v trí ị cos (đâu dinh) cua bacteriophage λ.

Công ngh DNA tái t h p (DNA recombinant technology). ệ ổ ợ H th ng cácệ ố ph ng pháp phòng thí nghi m cho phép c t đo n DNA t m t sinh v t đ ghép n iươ ệ ắ ạ ừ ộ ậ ể ố vào DNA c a m t sinh v t khác t o ra phân t DNA tái t h p. Phân t này đ c đ aủ ộ ậ ạ ử ổ ợ ử ượ ư vào các sinh v t khác nhau đ t o ra nh ng gi ng ch ng vi sinh v t, th c v t và đ ngậ ể ạ ữ ố ủ ậ ự ậ ộ v t m i có nh ng ph m ch t đ c bi t, đáp ng nhu c u ngày càng cao c a s n xu tậ ớ ữ ẩ ấ ặ ệ ứ ầ ủ ả ấ và đ i s ng con ng i. Công ngh này có ng d ng r ng rãi trong y h c, d c h c,ờ ố ườ ệ ứ ụ ộ ọ ượ ọ nông nghi p và nhi u ngành công nghi p khác.ệ ề ệ

Công ngh sinh h c (biotechnology). ệ ọ Theo nghĩa r ng là các quá trình côngộ nghi p có s d ng vi sinh v t ho c các t bào đ ng v t và th c v t (công ngh sinhệ ử ụ ậ ặ ế ộ ậ ự ậ ệ h c truyên thông). Theo nghĩa ph bi n hi n nay đó là nh ng quá trình s n xu t sọ ổ ế ệ ữ ả ấ ử d ng các gi ng sinh v t m i, đ c t o ra b i công ngh DNA tái t h p (công nghụ ố ậ ớ ượ ạ ở ệ ổ ợ ệ sinh h c hiên đai).ọ

Trong công ngh sinh h c truyên thông (lên men san xuât r u, bia, u chua th cệ ọ ượ ự phâm, lam phomát, trông trot, chăn nuôi...) tr c tiên con ng i chon l a cac đôi t ng ướ ườ ự ượ san xuât thích h p (chung vi sinh vât, cây trông và vât nuôi) thông qua th c tiên san xuât ợ ự va sau nay băng cac ph ng pháp khoa hoc nh gây đôt biên, phân lâp… ươ ư

Ngay nay, băng cach thay đôi gen nh công ngh DNA tai tô h p ng i ta đa tao ờ ệ ợ ườ ra cac đôi t ng san xuât thích h p h n, có th thay đôi ca vê l ng va chât nhiêu qua ượ ợ ơ ể ượ trinh san xuât b ng công ngh sinh h c truyên thông tr c đây, nâng chung lên v trí ằ ệ ọ ướ ị cao h n va m ra nh ng triên vong l n cho cac linh v c hoat đông cua công ngh sinhơ ở ữ ớ ự ệ h c. ọ

Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP). Tiên chât đa đ c triphosphoryl hóa ượ (“năng l ng cao”) cân thiêt cho qua trinh tông h p DNA. N đ c ký hi u cho m tượ ợ ượ ệ ộ trong bôn nitrogen base (A, G, T hoăc C).

Deoxyribonuclease (DNase). Loai enzyme nuclease th y phân (phân h y) DNA ủ ủ s i đôi ho c DNA s i đ n.ợ ặ ợ ơ

Deoxyribonucleic acid (DNA). DNA la đai phân t sinh hoc co câu truc xoăn đôi, ử tôn tai chu yêu trong nhân tê bao, trên cac nhiêm săc thê, mang thông tin di truyên cua sinh vât. Phân t DNA gôm hai chuôi polynucleotide, chuôi no xoăn quanh chuôi kia tao ử nên chuôi xoăn kep. Trong cac nucleotide, theo chiêu doc cac g c phosphate nôi xen ke ố v i cac phân t đ ng deoxyribose tao nên bô khung bên ngoai cua chuôi xoăn kep,ớ ử ườ theo chiêu ngang môi phân t đ ng đêu kêt h p v i môt trong bôn nitrogen base: ử ườ ợ ớ adenine, guanine, cytosine hoăc thymine.

DNA không tr c tiêp thê hiên ch c năng sinh hoc ma gian tiêp qua protein do noự ứ ma hóa. DNA tao RNA, RNA tao protein. RNA cung la acid nhân (nucleic acid). No co thanh phân câu tao kha giông DNA, ngoai tr gôc thymine (T) trong DNA đ c thay thê ừ ượ b i gôc uracil (U), va RNA dang s i đ n ch không phai dang xoăn kép nh DNA.ở ở ợ ơ ứ ở ư

Qua trinh đoc ma di truyên ch a trong DNA đê tông h p protein goi la s phiên ứ ợ ự mã (transcription) tao ra RNA mang thông tin di truyên là mRNA (messenger RNA). mRNA kêt h p v i m t c quan t trong tê bao la ribosome đê tao ra protein trong qua ợ ớ ộ ơ ử trinh d ch ma (translation). Qua trinh trên đ c g i la qua trinh sinh hoc căn ban. ị ượ ọ

Năm 1962, Watson (M ) và Crick (Anh) đã chia s Gi i Nobel v i Wilkins (Anh)ỹ ẻ ả ớ v phát minh ra c u trúc không gian c a DNA và ý nghĩa c a nó trong vi c truy nề ấ ủ ủ ệ ề thông tin di truy n. Đi u đáng ti c là Franklin, ng i đã có nh ng đóng góp đáng kề ề ế ườ ữ ể

cho phát minh này đã m t tr c đó. Theo qui đ nh thì Gi i Nobel không d c phépấ ướ ị ả ượ t ng cho ng i đã m t.ặ ườ ấ

Dich chuyên điêm đ t (nick translation). ứ Ph ng phap đanh dâu DNA băngươ phong xa [ α-32P]dCTP nh enzyme DNA polymerase I c aờ ủ E. coli.

Dich ma (translation). S tông h p protein trên khuôn mRNA. Quá trình chuy nự ợ ể thông tin di truy n trong trình t base c a mRNA sang trình t amino acid c a chu iề ự ủ ự ủ ỗ polypeptide trong t bào còn g i là quá trình sinh t ng h p protein.ế ọ ổ ợ

D ch mã ng c (reverse translation)ị ượ . Là k thu t phân l p các gen nh khỹ ậ ậ ờ ả năng c a chúng trong vi c lai v i m t đo n mã oligonucleotide nào đó, đo n này đ củ ệ ớ ộ ạ ạ ượ chu n b b ng cách d đoán đo n mã nucleic acid t nh ng đo n mã hóa c a proteinẩ ị ằ ự ạ ừ ữ ạ ủ bi t tr c.ế ướ

Dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP). Môt đ ng phân cua dNTP dung ồ đê kêt thuc m t chuôi DNA trong cac thi nghiêm xac đinh trình t gen (sequencing). ộ ự

Dimer. La môt hôn h p đ c tao ra gi a hai phân t đông nhât nh ng kh i l ng ợ ượ ữ ử ư ố ượ phân t thi gâp đôi so v i phân t nguyên th y.ử ớ ử ủ

DNA bô sung (complementary DNA, cDNA). DNA đ c tông h p trên khuônượ ợ m u mRNA nh quá trình phiên ma ng c (reverse transcription). Do vây, no co trinhẫ ờ ượ t săp xêp cac nucleotide b sung v i trinh t cac nucleotide trên mRNA. Ví du: trênự ổ ớ ự mRNA trinh t đo la UUGAAG thi trên cac DNA bô sung se co trinh t t ng ng là ự ự ươ ứ AACTTC. DNA bô sung đ c t ng h p t nhiên trong chu trinh sông cua virus mang ượ ổ ợ ự vât chât truyên la RNA. Ví d : HIV, virus cum va cac retrovirus noi chung. DNA bô sung ụ đ c tông h p nhân t o trong cac phong thi nghiêm đê xây d ng th vi n cDNAượ ợ ạ ự ư ệ (cDNA library).

DNA khuôn m u (template DNA).ẫ S i DNA ma trinh t cac nucleotide cua noợ ự đ c dung lam khuôn m u đê tông h p nên s i DNA m i trong qua trinh tái b n (saoượ ẫ ợ ợ ớ ả chép) ho c khu ch đ i DNA (PCR) hoăc đê tông h p nên s i RNA m i trong qua trinhặ ế ạ ợ ợ ớ phiên ma.

DNA polymerase. Enzyme tông h p ban sao DNA trên khuôn m u DNA b ng ợ ẫ ằ cách xuc tac phan ng găn t ng nucleotide riêng biêt vao đâu chuôi DNA đang đ c ứ ừ ượ tông h p. ợ

Năm 1959, hai nhà khoa h c ng i M là Kornberg và Ochoa đã đ c nh n Gi iọ ườ ỹ ượ ậ ả Nobel v nh ng nghiên c u đã làm sáng t c ch c b n c a quá trình sao chép DNAề ữ ứ ỏ ơ ế ơ ả ủ liên quan đ n DNA polymerase I.ế

DNA siêu xo n (supercoiled DNA).ắ DNA xo n l i trên b n thân nó, th ng làắ ạ ả ườ k t qu c a s g p khúc, m xo n ho c xo n l i c a chu i xo n kép DNA.ế ả ủ ự ấ ở ắ ặ ắ ạ ủ ỗ ắ

DNA vê tinh (satellite DNA). Là nh ng đo n DNA mang các trình t l p l i n iữ ạ ự ặ ạ ố ti p có thành ph n khác v i tr s trung bình c a DNA h gen. DNA v tinh tao thanhế ầ ớ ị ố ủ ệ ệ băng theo gradient ty trong và dê dang phân biêt v i băng cua phân l n DNA hê gen do ớ ớ

DNA vê tinh co ty trong nho h n. Ban sao cua DNA v tinh lăp lai hang triêu lân trong ơ ệ hê gen, tâp trung chu yêu vung tâm đông va hai đâu cua nhiêm săc thê. ở

Dòng (clone). T p h p các t bào ho c phân t gi ng h t nhau cùng b t ngu nậ ợ ế ặ ử ố ệ ắ ồ t m t t bào hay phân t ban đ u.ừ ộ ế ử ầ

Dot blot. Là ky thuât trong đo cac vêt tron nho (hoăc cac điêm) co ch a nucleic ứ acid đ c đăt lên mang nitrocellulose hoăc nylon đê lai v i đo n m i DNA có đánh d uượ ớ ạ ồ ấ đ ng v phóng x . ồ ị ạ

Đa hinh đô dai cac đoan c t han ch (restriction fragment length ắ ế polymorphism, RFLP). Tính đa hình chi u dài các đo n c t h n ch đ ch các saiề ạ ắ ạ ế ể ỉ bi t di truy n v trí nh n bi t c a các enzyme h n ch (ch ng h n nh do s thayệ ề ở ị ậ ế ủ ạ ế ẳ ạ ư ự đ i m t nucleotide) d n đ n s sai bi t trong chi u dài c a các đo n hình thành tổ ộ ẫ ế ự ệ ề ủ ạ ừ ph n ng c t h n ch DNA v i cùng m t enzyme. RFLP th ng đ c dùng đ thi tả ứ ắ ạ ế ớ ộ ườ ượ ể ế l p b n đ di truy n v i m t s marker di truy n bi t tr c.ậ ả ồ ề ớ ộ ố ề ế ướ

Đanh dâu đuôi (end labelling). ơ Bô sung phân t phong xa vao đuôi cua môt ử polynucleotide nh enzyme T4 polynucleotide kinase.ờ

Đâu băng (blunt end). Cac đâu cua DNA s i đôi không co cac đâu 3’ hoăc 5’ l i ợ ồ ra (protruding ends).

Đâu dinh (cohesive ends ho cặ sticky ends). Cac đâu cua phân t DNA co cac ử trinh t bô sung ngăn co thê dinh k t lai đê nôi hai phân t DNA v i nhau. Cac đâu dinh ự ế ử ớ th ng do cac enzyme han ch tao ra.ườ ế

Đ u t n cùng C (C terminus). ầ ậ G c carboxyl (COOH) t do v trí t n cùng cuaố ự ở ị ậ môt phân t protein ho c chu i polypeptide. ử ặ ỗ

Đ u t n cùng N (N terminus).ầ ậ G c amine (NHố 2) v trí t n cùng c a m t phânở ị ậ ủ ộ t protein ho c chu i polypeptide. T t c các polypeptide đ u đ c t ng h p t đ uử ặ ỗ ấ ả ề ượ ổ ợ ừ ầ t n cùng N đ n đ u t n cùng C. ậ ế ầ ậ

Điêm đ t (nick). ứ Điêm đ t gãy m t s i đ n trên DNA s i đôi. ứ ở ộ ợ ơ ợ

Đi n di trên gel (gel electrophoresis).ệ K thu t dùng đ phân tách các phân tỹ ậ ể ử nucleic acid ho c protein d a vào s d ch chuy n c a chúng trên giá th d ng gelặ ự ự ị ể ủ ể ạ (agarose ho c polyacrylamide) d i nh h ng c a đi n tr ng. S d ch chuy n c aặ ướ ả ưở ủ ệ ườ ự ị ể ủ các phân t này ph thu c vào đi n tích, c u hình, kích th c và kh i l ng phân tử ụ ộ ệ ấ ướ ố ượ ử c a nucleic acid ho c protein cũng nh dung môi và n ng đ c a ch t dùng làm giáủ ặ ư ồ ộ ủ ấ th .ể

Đo n c t h n ch (restriction fragment).ạ ắ ạ ế Các đo n DNA nh đ c sinh ra sauạ ỏ ượ khi x lý đo n DNA l n b ng enzyme h n ch .ử ạ ớ ằ ạ ế

Đo n k t thúc phiên mã (terminator ạ ế hay transcription terminator). Trình tự nucleotide n m cu i gen ho t đ ng nh m t tín hi u k t thúc s phiên mã. Nó raằ ở ố ạ ộ ư ộ ệ ế ự hi u cho RNA polymerase gi i phóng phân t RNA m i đ c t o thành ra kh i gen.ệ ả ử ớ ượ ạ ỏ

L u ý không đ c nh m v i các b ba k t thúc (terminator codons hay stop codons:ư ượ ầ ớ ộ ế UAG, UAA và UGA), xu t hi n trong mRNA, là tín hi u d ng c a s d ch mã (xemấ ệ ệ ừ ủ ự ị mã vô nghĩa). Có hai lo i terminator ph bi n: Rho-independent terminator (th ng làạ ổ ế ườ m t c u trúc thân-quai (stem-loop structure) trong RNA đ c phiên mã) n m đ uộ ấ ượ ằ ở ầ c a các operons, và Rho-dependent terminator (vùng không có c u trúc đ c tr ng c aủ ấ ặ ư ủ RNA, khi không đ c d ch mã, nó đ c xem nh là y u t Rho) là nguyên nhân gây raượ ị ượ ư ế ố chi u phân c c c a s d ch mã (translational polarity).ề ự ủ ự ị

Đoan Klenow (Klenow fra gment). Còn g i là đoan l n cua DNA polymerase I.ọ ớ Đây là m t đoan cua DNA polymerase I (kh i l ng phân t 76.000) c a ộ ố ượ ử ủ E. coli đã bi mât hoat tinh exonuclease 5’ →3’.

Đo n m i (primer). ạ ồ M t trình t DNA hay RNA ng n, b t c p v i m t m chộ ự ắ ắ ặ ớ ộ ạ c a DNA khuôn m u và có mang m t đ u 3’-OH t do giúp DNA polymerase b t đ uủ ẫ ộ ầ ự ắ ầ t ng h p m t chu i DNA m i.ổ ợ ộ ỗ ớ

Đo n nh i (stuffer fragment). ạ ồ Còn g i là vùng đ m hay vùng trung tâm. Là m tọ ệ ộ ph n c a phage ầ ủ λ có th đ c lo i b và thay th b ng đo n chèn DNA (insert DNA)ể ượ ạ ỏ ế ằ ạ mà không nh h ng đ n kh năng sinh s n c a phage trong t bào v t ch .ả ưở ế ả ả ủ ế ậ ủ

Đoan xuôi ng c nh nhau ượ ư (palindrome). Đo n DNA m ch kép có trình t s pạ ạ ự ắ x p các base trên hai m ch đ n gi ng h t nhau n u cùng đ c đ c theo m t chi uế ạ ơ ố ệ ế ượ ọ ộ ề (ch ng h n 5’ẳ ạ →3’). Ví d : các đo n nh n bi t c a enzyme h n ch . ụ ạ ậ ế ủ ạ ế

Đóng d u (replica plating). ấ Ph ng pháp chuy n nguyên m u các khu n l cươ ể ẫ ẩ ạ ho c v t tan t m t đĩa th ch g c sang đĩa th ch m i b ng cách dùng màng nylon (víặ ế ừ ộ ạ ố ạ ớ ằ d : màng Hybond-N+) v a khít áp lên m t th ch c a đĩa g c đ dính l y các t bàoụ ừ ặ ạ ủ ố ể ấ ế trong các khu n l c (colony) ho c v t tan (plaque) c a đĩa g c, r i đ a màng này ápẩ ạ ặ ế ủ ố ồ ư lên m t th ch m i.ặ ạ ớ

Đ n vi phiên ma ơ (transcriptional unit). Đoan DNA ma hóa cho phân t RNA, băt ử đâu t điêm kh i đâu phiên ma đên điêm k t thúc phiên ma, nó có th dài h n m t gen. ừ ở ế ể ơ ộ

Đ n v sao chép (replicon).ơ ị Đo n DNA b t đ u t đi m kh i đ u sao chép kéoạ ắ ầ ừ ể ở ầ dài v hai phía t i hai đi m k t thúc sao chép.ề ớ ể ế

Đ n v tái t h p (recon).ơ ị ổ ợ Đo n DNA c a gen có chi u dài đ ng n đ s traoạ ủ ề ủ ắ ể ự đ i chéo không th di n ra bên trong nó đ c n a. Hi n nay, đ c bi t đó là m tổ ể ễ ở ượ ữ ệ ượ ế ộ c p nucleotide.ặ

Đuôi polyA (polyA tail). Đo n trình t dài 50-200 nucleotide adenine đ c bạ ự ượ ổ sung vào đ u 3’ c a h u h t các mRNA eukaryote sau khi phiên mã. ầ ủ ầ ế

E. coli (Escherichia coli). Vi khu n th ng có trong ru t non c a đ ng v t cóẩ ườ ộ ủ ộ ậ x ng s ng. ươ ố E. coli đ c coi nh sinh v t m u cho vi c nghiên c u ho t đ ng c a tượ ư ậ ẫ ệ ứ ạ ộ ủ ế bào. Đây là vi khu n Gram âm có kích th c genome kho n 4×10ẩ ướ ả 6 base-pair. Các quá trình bi u hi n gen (phiên mã và d ch mã) đi đôi v i nhau, sinh ra s i mRNA đ c t ngể ệ ị ớ ợ ượ ổ

h p m i và đ c s d ng ngay cho quá trình d ch mã. Không có hi n t ng bi n đ iợ ớ ượ ử ụ ị ệ ượ ế ổ sau d ch mã (post-translation). Vì th , ị ế E. coli đ c xem là m t trong nh ng t bào v tượ ộ ữ ế ậ ch đ n gi n nh t. R t nhi u thí nghi m t o dòng gen đang đ c th c hi n hàng ngàyủ ơ ả ấ ấ ề ệ ạ ượ ự ệ t i các phòng thí nghi m đ u s d ng ạ ệ ề ử ụ E. coli làm v t ch v i nhi u ch ng khác nhauậ ủ ớ ề ủ v m t di truy n và cho nh ng ng d ng đ c bi t.ề ặ ề ữ ứ ụ ặ ệ

Endonuclease. Là enzyme nuclease căt bên trong phân t nucleic acid, ng c v i ử ượ ớ exonuclease la enzyme phân giai DNA t môt đ u hoăc ca hai đâu. Nuclease th y phân ừ ầ ủ nh ng liên k t phosphodiester gi a các nucleotide c a m t phân t nucleic acid. Cácữ ế ữ ủ ộ ử nuclease có th đ c hi u đ i v i DNA (deoxyribonuclease) ho c đ c hi u đ i v iể ặ ệ ố ớ ặ ặ ệ ố ớ RNA (ribonuclease).

Enzyme. Ch t xúc tác sinh h c, là các phân t sinh hoc co ban chât protein đongấ ọ ử vai tro chât xuc tac cho cac phan ng biên đôi hóa sinh. ứ

Enzyme g n DNA (DNA ligase).ắ Enzyme dung đê nôi cac phân t DNA v i nhau ử ớ băng cach tao ra môi liên kêt phosphodiester gi a nhom 5’-phosphate va nhom 3’- ữ hydroxyl trong qua trinh tái b n hoăc s a ch a DNA. ả ử ữ

Enzyme han ch ế (restriction enzyme, RE). Loai endonuclease co kha năng căt DNA tai nh ng đoan trinh t nh t đ nh mà chung nhân biêt. Enzyme h n ch đ c phát ữ ự ấ ị ạ ế ượ hi n vào năm 1970, chúng t n t i trong t bào vi khu n, có tác d ng c t DNA ngo iệ ồ ạ ế ẩ ụ ắ ạ lai (ví d : DNA c a phage) t i nh ng đi m xác đ nh, đ tiêu di t DNA này. Cho đ nụ ủ ạ ữ ể ị ể ệ ế nay h n 900 enzyme h n ch đã đ c tìm th y. Các enzyme h n ch đ c s d ngơ ạ ế ượ ấ ạ ế ượ ử ụ r ng rãi trong các phòng thí nghi m thao tác gen nh nh ng “chi c kéo” c t DNA t iộ ệ ư ữ ế ắ ạ nh ng đi m đ c hi u. V trí c t ph thu c vào lo i enzyme h n ch đ c l a ch n. ữ ể ặ ệ ị ắ ụ ộ ạ ạ ế ượ ự ọ

Năm 1978, Arber (Th y Sĩ), Nathans (M ) và Smith (M ) đã đ c nh n Gi iụ ỹ ỹ ượ ậ ả Nobel nh phát hi n ra enzyme h n ch và nh ng ng d ng c a chúng đ gi i quy tờ ệ ạ ế ữ ứ ụ ủ ể ả ế nhi u v n đ quan tr ng c a sinh h c phân t . Các enzyme này là nh ng “chi c kéoề ấ ề ọ ủ ọ ử ữ ế phân t ” có th c t DNA thành nh ng đo n xác đ nh, đã m ra m t th i kỳ phát tri nử ể ắ ữ ạ ị ở ộ ờ ể m i c a sinh h c hi n đ i-Th i kỳ thao tác gen.ớ ủ ọ ệ ạ ờ

Enzyme phiên ma ng c (reverse transcriptase). ượ DNA polymerase phu thuôc RNA (RNA-dependent DNA polymerase) co trong cac RNA virus (retrovirus) đ c dung ượ đê tông h p cDNA trong đi u ki n ợ ề ệ in vitro.

Exon. Các đo n DNA trong gen có ch c năng phiên mã. Exon t n t i c sinhạ ứ ồ ạ ở ả v t prokaryote và eukaryote. Riêng sinh v t eukaryote các exon n m xen k v i cácậ ở ậ ằ ẽ ớ đo n intron. Các intron chi m t i 90% t ng s DNA c a t bào eukaryote và không cóạ ế ớ ổ ố ủ ế ch c năng phiên mã. ứ

Eukaryote. Sinh v t có t bào mang nhân đi n hình (nhân th t) nghĩa là nhânậ ế ể ậ đ c bao b c b i màng nhân và tham gia vào hai c ch phân bào quan tr ng là nguyênượ ọ ở ơ ế ọ phân và gi m phân.ả

Exonuclease. Lo i enzyme nuclease ch tác đ ng vào đ u t n cùng c a phân tạ ỉ ộ ầ ậ ủ ử nucleic acid, c t ra t ng nucleotide m t theo th i gian. Chúng có th chuy n hóa theoắ ừ ộ ờ ể ể đ u 5’ ho c 3’ c a s i DNA.ầ ặ ủ ợ

Ex vivo. Thu t ng dùng đ ch các thí nghi m th c hi n trên t bào nuôi c y,ậ ữ ể ỉ ệ ự ệ ế ấ các t bào này sau đó s đ c đ a vào m t c th s ng. ế ẽ ượ ư ộ ơ ể ố

β -galactosidase. Enzyme đ c mã hóa b i gen ượ ở lacZ. Enzyme này th y phânủ lactose thành glucose và galactose.

Gen (gene). Là đ n v di truy n, y u t quy t đ nh m t tính tr ng c th . Thôngơ ị ề ế ố ế ị ộ ạ ơ ể tin di truy n c a các gen đ c mã hóa trong DNA quy t đ nh tính bi n d c a loài vàề ủ ượ ế ị ế ị ủ c a cá th . DNA là m t chu i bao g m các đ n v nucleotide, có b n lo i nucleotideủ ể ộ ỗ ồ ơ ị ố ạ mang b n nitrogen base khác nhau là adenine (A), guanine (G), cytosine (C), và thymineố (T). Trình t các nucleotide c a m t gen xác đ nh m t polypeptide ho c m t RNA. Genự ủ ộ ị ộ ặ ộ có kh năng b đ t bi n. Các gen ch y u n m d c theo nhi m s c th trong nhân tả ị ộ ế ủ ế ằ ọ ễ ắ ể ở ế bào. M i gen chi m m t v trí xác đ nh trên nhi m s c th g i là locus. Gen có th t nỗ ế ộ ị ị ễ ắ ể ọ ể ồ t i nhi u d ng g i là các allele. Các gen bi u hi n thông qua các phân t do chúngạ ở ề ạ ọ ể ệ ử sinh ra là RNA (trong quá trình phiên mã) và protein (trong quá trình d ch mã).ị

Gen ch th (reporter gene).ỉ ị Là m t gen mã hóa mà s n ph m c a nó đ c tr cộ ả ẩ ủ ượ ắ nghi m m t cách d dàng (ví d chloramphenicol acetyltranferase). Gen ch th có thệ ộ ễ ụ ỉ ị ể đ c g n v i b t kỳ m t promoter nào sao cho s bi u hi n c a nó có th đ c dùngượ ắ ớ ấ ộ ự ể ệ ủ ể ượ đ th nghi m ch c năng c a promoter.ể ử ệ ứ ủ

Gen lacZ. Gen c a ủ E. coli mã hóa β-galactosidase thích h p cho ch n l c thợ ọ ọ ể bi n n p b ng khu n l c xanh (ế ạ ằ ẩ ạ β-galactosidase s k t h p v i IPTG và X-gal đ cẽ ế ợ ớ ượ b sung trong môi tr ng nuôi c y) và ổ ườ ấ khu n l c ẩ ạ tr ng (đo n DNA ngo i lai xen vàoắ ạ ạ gi a gen ữ lacZ làm cho gen này m t ho t tính vì th không s n xu t đ c ấ ạ ế ả ấ ượ β-galactosidase).

Ghép đôi l chệ (mismatch). S ghép đôi không đúng v i quy lu t b sung gi aự ớ ậ ổ ữ các nucleotide thu c hai s i đ n DNA trong m ch kép.ộ ợ ơ ạ

Ghép exon hay splicing (RNA). Quá trình c t b nh ng intron và n i các exonắ ỏ ữ ố c a s n ph m phiên mã ban đ u (ti n thân mRNA) đ t o thành mRNA hoàn ch nhủ ả ẩ ầ ề ể ạ ỉ (mature mRNA). Quá trình bi n đ i này x y ra trong nhân t bào.ế ổ ả ế

G c tái b n (origin, ố ả ori). Trình t nucleotide ho c v trí trên DNA mà đó b tự ặ ị ở ắ đ u s tái b n (sao chép).ầ ự ả

Gradient. Bi n thiên c a m t đ i l ng theo m t h ng nào đó. M t gradientế ủ ộ ạ ượ ộ ướ ộ m t đ đ c xác l p trong m t s tr ng h p ly tâm. M t gradient proton ho c ionậ ộ ượ ậ ộ ố ườ ợ ộ ặ đ c t o ra qua m t màng nh s v n chuy n tích c c đòi h i năng l ng. ượ ạ ộ ờ ự ậ ể ự ỏ ượ

H gen (genome). ệ Là t p h p các gen có trong m t t bào đ n b i eukaryote,ậ ợ ộ ế ơ ộ trong m t t bào prokaryote ho c trong m t virus. Hê gen ch a toan bô DNA cua cộ ế ặ ộ ứ ơ thê, vi du: h gen ng i ch a DNA dai khoang 1,6 m nh ng chi rông khoang 5 phân ti ệ ườ ứ ư mm. ng i, sô DNA noi trên đ c chia lam 46 phân co đô dai ngăn khac nhau goi laƠ ườ ượ nhiêm săc thê (chromosome), la tâp h p DNA dang nen chăt đên kich th c đ ng ợ ở ướ ườ kinh chi con 3-4 phân triêu met. Tuy nho nh vây, nh ng nhiêm săc thê ng i co đên 3 ư ư ườ t gôc nucleotide. S săp xêp đăc thu cua chung quyêt đinh ban chât sinh hoc cua c thê.ỷ ự ơ

Ho t tính phóng x đ c hi uạ ạ ặ ệ (specific radioactivity). Là ho t đ phóng x trênạ ộ ạ m t đ n v nguyên li u, ch ng h n: m t m u dò đánh d u phóng x có th có ho tộ ơ ị ệ ẳ ạ ộ ẫ ấ ạ ể ạ tính đ c hi u 106 l n đ m/phút trên microgram. Ho t tính đ c hi u cũng đ c dùngặ ệ ầ ế ạ ặ ệ ượ đ xác đ nh ho t đ c a enzyme.ể ị ạ ộ ủ

Huỳnh quang (fluorescence). Hi n t ng phát m t sóng ánh sáng có b c sóngệ ượ ộ ướ khác v i b c sóng đã đ c h p th tr c đó. M t s phân t đ c g i là th huỳnhớ ướ ượ ấ ụ ướ ộ ố ử ượ ọ ể quang (ví d : enzyme luciferase con đom đóm) do có đ c tính này.ụ ở ặ

In d u DNAấ (DNA fingerprinting) hay in d u di truy n (geneticấ ề fingerprinting). Là ph ng pháp dùng các m u dò phóng x ho c dùng k thu t PCRươ ẫ ạ ặ ỹ ậ đ nh n d ng các băng DNA có các đo n l p l i v i t n s cao. B n m u hình cácể ậ ạ ạ ặ ạ ớ ầ ố ả ẫ băng DNA là duy nh t đ i v i m i cá th , và do v y có th dùng đ xác đ nh đ cấ ố ớ ỗ ể ậ ể ể ị ặ tr ng cá th ho c quan h huy t th ng. ư ể ặ ệ ế ố

In d u chân DNAấ (DNA footprinting). Ph ng pháp nh n d ng các vùng DNAươ ậ ạ mà các protein đi u hòa bám vào.ề

Intron. Nh ng đo n DNA nh sinh v t eukaryote không mang thông tin mã hóaữ ạ ỏ ở ậ amino acid, phân b r i rác d c theo phân t DNA. Sau khi thông tin t DNA đ cố ả ọ ử ừ ượ phiên mã sang mRNA thì các intron trên mRNA b c t b , các đo n mRNA còn l i g mị ắ ỏ ạ ạ ồ toàn các exon đ c n i l i v i nhau và chuy n đ n ribosome đ dùng làm khuôn m uượ ố ạ ớ ể ế ể ẫ cho quá trình d ch mã. ị Intron không th y có sinh v t prokaryote.ấ ở ậ

In vitro và in vivo. La thu t ng mô ta thi nghiêm trong ông nghiêm ( ậ ữ in vitro) va trong c thê (ơ in vivo). Cung v i s phát tri n ng dung cua may tinh, hiên nay cac nha ớ ự ể ứ khoa hoc con tiên hanh thi nghiêm mô phong băng computer. Qua trinh nay goi la thi nghiêm in silico.

Kéo dài đo n m iạ ồ (primer extension). S t ng h p m t b n sao nucleic acidự ổ ợ ộ ả b t đ u t đo n m i. Đ c s d ng đ đánh d u phóng x đo n DNA làm m u dòắ ầ ừ ạ ồ ượ ử ụ ể ấ ạ ạ ẫ ho c khu ch đ i m t đo n DNA b ng k thu t PCR. ặ ế ạ ộ ạ ằ ỹ ậ

Kháng nguyên (antigen). Phân t th ng tìm th y trên b m t t bào, có tácử ườ ấ ề ặ ế d ng kích thích s t o thành kháng th . Do v y, nó đ c dùng đ gây nên m t ph nụ ự ạ ể ậ ượ ể ộ ả

ng mi n d ch.ứ ễ ị

Kháng th (antiboby).ể M t protein (immunoglobulin) do b ch c u lympho Bộ ạ ầ c a h th ng mi n d ch s n sinh, có tác d ng nh n bi t m t kháng nguyên ngo i nh pủ ệ ố ễ ị ả ụ ậ ế ộ ạ ậ đ c hi u và g n v i nó, n u kháng nguyên n m trên b m t t bào thì vi c g n k tặ ệ ắ ớ ế ằ ề ặ ế ệ ắ ế này s d n t i s k t c m t bào và làm b t ho t kháng nguyên.ẽ ẫ ớ ự ế ụ ế ấ ạ

Kháng th đ n dòng (monoclonal antibody). ể ơ Khang thê xuât hiên trong phan ng miên dich co nhiêm vu găn va tham gia loai bo chât la (antigen) lot vao c thê.ứ ơ

Thông th ng, trong phan ng miên dich co măt hôn h p c a nhiêu lo i khang thê. Tuyườ ứ ợ ủ ạ nhiên, nh tê bao lai hybridoma ng i ta co thê tao ra môt loai khang thê goi la khangờ ườ thê đ n dong. Khang thê đ n dong chu yêu đ c s dung cho muc đich chân đoan bênh. ơ ơ ượ ử

Khu ch đ i (amplification.)ế ạ S s n xu t nhi u b n sao c a m t trình t DNAự ả ấ ề ả ủ ộ ự nh k thu t PCR. ờ ỹ ậ

Khung đ c m (open reading frame, ORF). ọ ơ Là m t trình t mã hóa chu iộ ự ỗ polypeptide đ c b t đ u v i mã kh i đ u (initiation codon) và k t thúc b ng m t mãượ ắ ầ ớ ở ầ ế ằ ộ d ng (stop codon). M t khung đ c m b ngăn ch n n u m t stop codon đ c đ nh vừ ộ ọ ở ị ậ ế ộ ượ ị ị g n v i mã kh i đ u. M c dù v lý thuy t ma di truyên đ c xây d ng d a trên b baầ ớ ở ầ ặ ề ế ượ ự ự ộ nucleotide, do đó s co ba khung đ c co thê co trên môi s i DNA, tuy nhiên trong th cẽ ọ ợ ự t khung đ c chính xác đ c xác đ nh b i m t đi m b t đ u c đ nh. ế ọ ượ ị ở ộ ể ắ ầ ố ị

Khuy t đo n (deletion, deficiency). ế ạ Đ t bi n nhi m s c th d n đ n làm m tộ ế ễ ắ ể ẫ ế ấ m t đo n v t ch t di truy n và thông tin di truy n ch a trong nó r i kh i nhi m s cộ ạ ậ ấ ề ề ứ ờ ỏ ễ ắ th .ể

Ki u hoang d i (wild type).ể ạ D ng th ng th y nh t c a m t gen trong qu nạ ườ ấ ấ ủ ộ ầ th hoang d i. Allele ki u hoang d i đ c ký hi u b ng m t ch in hoa ho c thêmể ạ ể ạ ượ ệ ằ ộ ữ ặ d u c ng sau ch vi t th ng, ví d : A hay aấ ộ ữ ế ườ ụ +. Allele ki u hoang d i th ng là tr i vàể ạ ườ ộ cho ki u hình bình th ng.ể ườ

Kilobase (kb). 1000 base (ho c c p base), đ c dùng nh đ n v đ đo ho c xácặ ặ ượ ư ơ ị ể ặ đ nh chi u dài c a các phân t DNA ho c RNA.ị ề ủ ử ặ

Kinase. Các enzyme xúc tác ph n ng phosphoryl hóa m t phân t nh n nhả ứ ộ ử ậ ờ ATP.

K thu t di truy n (genetic engineering).ỹ ậ ề Còn g i là công ngh DNA tái tọ ệ ổ h p. Bao g m h th ng các ph ng pháp di truy n phân t dùng đ thao tác v t ch tợ ồ ệ ố ươ ề ử ể ậ ấ di truy n, v i ba b c chính g m ba khâu chính. 1) Tách chi t DNA t nh ng sinh v tề ớ ướ ồ ế ừ ữ ậ khác nhau; 2) C t và n i DNA nh ng đi m đ c hi u đ t o ra DNA tái t h pắ ố ở ữ ể ặ ệ ể ạ ổ ợ (DNA mang các gen có ngu n g c khác nhau), ví d : DNA plasmid có mang gen c aồ ố ụ ủ ng i; 3) Đ a DNA tái t h p vào ho t đ ng trong các t bào ho c c th s ng đườ ư ổ ợ ạ ộ ế ặ ơ ể ố ể sinh ra nh ng s n ph m đ c bi t c n thi t cho con ng i, ví d : DNA plasmid mangữ ả ẩ ặ ệ ầ ế ườ ụ gen t o insulin c a ng i đ c đ a vào vi khu n ạ ủ ườ ượ ư ẩ E. coli đ s n xu t. ể ả ấ

Lai khu n l c (colony hyẩ ạ bridization). Ky thuât lai in situ đê xac đinh vi khuân mang vector kh m (chimeric vector) ma DNA cua vector nay t ng đông v i m t đoanả ươ ớ ộ ma hóa đăc biêt nao đo.

Lai phân t (molecular hybridization). ử Quá trình trong đó hai m ch nucleic acidạ b sung (A-T, G-C) b t c p hình thành nên m t m ch kép. Đây là m t k thu t h uổ ắ ặ ộ ạ ộ ỹ ậ ữ ích đ phát hi n m t trình t nucleotide chuyên bi t.ể ệ ộ ự ệ

Lai t i ch (ạ ỗ in situ hybridization). Quá trình b t c p gi a m u dò (là m t trìnhắ ặ ữ ẫ ộ t DNA s i đ n hay RNA) v i DNA c a t bào đ c c đ nh trên lam kính.ự ợ ơ ớ ủ ế ượ ố ị

L p b n đ h n ch (restriction mapping).ậ ả ồ ạ ế K thu t dùng đ xác đ nh v tríỹ ậ ể ị ị các đi m c t h n ch trên phân t DNA.ể ắ ạ ế ử

Linker. M t oligonucleotide t ng h p có hai đ u b ng, ộ ổ ợ ầ ằ ch a môt hoăc nhiêu viứ tri căt han chê cho phép nôi cDNA s i đôi v i cac plasmid vector hoăc bacteriophage ợ ớ λ vector. cDNA s i đôi ợ tr c đó ướ đ c x ly v i DNA polymerase cua bacteriophage T4ượ ử ớ hoăc DNA polymerase I cua E. coli đ t o đ u b ng. Các linker sau khi g n v i haiể ạ ầ ằ ắ ớ đ u b ng c a đo n cDNA nh DNA ligase s đ c c t h n ch đ t o ra đ u so leầ ằ ủ ạ ờ ẽ ượ ắ ạ ế ể ạ ầ t ng đ ng v i hai đ u c a vector. Ph n ng g n gi a đo n cDNA có mang linker ươ ồ ớ ầ ủ ả ứ ắ ữ ạ ở hai đ u v i vector cũng đ c xúc tác nh DNA ligase.ầ ớ ượ ờ

Lysosome. M t bào quan có màng bao b c trong t bào ch t c a nh ng t bàoộ ọ ở ế ấ ủ ữ ế eukaryote. Lysosome ch a nhi u enzyme th y phân.ứ ề ủ

Ly tâm theo gradient m t đ (density gradient centrifugation).ậ ộ K thu t táchỹ ậ các h p ch t d a vào s khác nhau v m t đ c a chúng đ c th c hi n b ngợ ấ ự ự ề ậ ộ ủ ượ ự ệ ằ ph ng pháp ly tâm đ làm l ng các ch t qua m t gradient n ng đ c a saccharoseươ ể ắ ấ ộ ồ ộ ủ ho c CsCl. ặ

Mã di truy n ề (codon). Nhóm ba nucleotide n m k nhau (b ba) trên phân tằ ề ộ ử mRNA xác đ nh m t amino acid trên chu i polypeptide, ho c là tín hi u k t thúc vi cị ộ ỗ ặ ệ ế ệ t ng h p polypeptide.ổ ợ

Mã thoái bi n (degenerate ế codon). Mã di truy n mà đó m t amino acid đ cề ở ộ ượ quy đ nh b i m t s b ba nitrogen base, ch không ph i ch b i m t b ba. Thoáiị ở ộ ố ộ ứ ả ỉ ở ộ ộ bi n là đ c đi m v n có c a mã di truy n t n t i ph bi n sinh gi i.ế ặ ể ố ủ ề ồ ạ ổ ế ở ớ

Ma vô nghia (nonsense codon) hay mã d ng (stop codon). ừ Là codon ma đo ở qua trinh dich ma d ng lai (n i kêt thuc cua chuôi polypeptide). Co tât ca ba codon vô ừ ơ nghia v i cac tên goi la amber (UAG), ocher (UAA) va opal (UGA) ớ

Maturation. Quá trình trong đó các mRNA v a đ c phiên mã tr i qua m t sừ ượ ả ộ ố bi n đ i hóa h c đ tr thành mRNA hoàn ch nh s n sàng làm khuôn m u cho vi cế ổ ọ ể ở ỉ ẵ ẫ ệ t ng h p protein.ổ ợ

Máy đ m nh p nháy (scintillation counter).ế ấ Máy dùng đ xác đ nh ho t tínhể ị ạ phóng x trong m t m u thí nghi m.ạ ộ ẫ ệ

M u dò (probe). ẫ M t đo n RNA hay DNA chuyên bi t đ c đánh d u b ngộ ạ ệ ượ ấ ằ đ ng v phóng x hay b ng hóa ch t (ch t phát huỳnh quang ho c enzyme), dùng đồ ị ạ ằ ấ ấ ặ ể đ nh v m t trình t nucleic acid nh t đ nh thông qua k thu t lai phân t (xem Northernị ị ộ ự ấ ị ỹ ậ ử blot, Southern blot...)

M t đ quang (optical density).ậ ộ Thông s cho phép đo đ h p th ánh sáng ố ộ ấ ụ ở m t b c sóng nào đó c a m t môi tr ng ho c dung d ch. ộ ướ ủ ộ ườ ặ ị

Monomer. Là các phân t đ n v nh , có th liên k t v i các phân t đ n vử ơ ị ỏ ể ế ớ ử ơ ị gi ng nó đ hình thành nh ng phân t l n h n (polymer). Ví d : các nucleotide là cácố ể ữ ử ớ ơ ụ monomer c a nucleic acid và các amino acid là monomer c a protein. ủ ủ

N m men ấ Saccharomyces cerevisiae. Là m t vi sinh v t nhân th t đ c s d ngộ ậ ậ ượ ử ụ nhi u trong công ngh DNA tái t h p. Genome c a n m men ề ệ ổ ợ ủ ấ S. cerevisiae kho ngả 1,35×107 base-pair nhi u h n ề ơ E. coli kho ng 3,5 l n. N m men th ng đ c dùng làmả ầ ấ ườ ượ t bào v t ch đ bi u hi n nh ng protein có c u trúc ph c t p c n quá trình h u d chế ậ ủ ể ể ệ ữ ấ ứ ạ ầ ậ ị mã mà vi khu n ẩ E. coli không th đáp ng.ể ứ

Nhân t ki m soát phiên mã (transcription control element). ố ể Đo n nucleotideạ n m xung quanh đi m b t đ u và k t thúc c a m i gen, tham gia vào s đi u hòa ho tằ ể ắ ầ ế ủ ỗ ự ề ạ đ ng bi u hi n c a gen.ộ ể ệ ủ

Nhi t đ nóng ch y (melting temperature, ệ ộ ả Tm). Là nhi t đ mà đó có m tệ ộ ở ộ n a s phân t c a m t trình t DNA b bi n tính.ử ố ử ủ ộ ự ị ế

Northern blot. K thu t chuy n và c đ nh RNA t formaldehyde agarose gelỹ ậ ể ố ị ừ (sau khi đ c phân đo n b ng đi n di) lên màng lai b ng nylon ho c nitrocellulose đượ ạ ằ ệ ằ ặ ể lai v i m u dò đ c đánh d u đ ng v phóng x [ớ ẫ ượ ấ ồ ị ạ α-32P]dCTP ho c digoxigenin-dUTP.ặ

Nucleic acids. Nh ng polynucleotide sinh h c thiên nhiên, trong đó nh ng đ n vữ ọ ữ ơ ị nucleotide đ c k t h p v i nhau b i nh ng liên k t phosphodieste thành trình tượ ế ợ ớ ở ữ ế ự DNA ho c RNA riêng bi t. ặ ệ

Nucleoside. M t h p ch t g m m t base purine ho c pyrimidine k t h p đ ngộ ợ ấ ồ ộ ặ ế ợ ồ hóa tr v i m t phân t đ ng pentose.ị ớ ộ ử ườ

Nucleotide. M t nucleoside phosphoryl hóa v i m t trong nh ng hydroxyl c aộ ớ ộ ữ ủ pentose. Phân t đóng vai trò c u trúc c s c a DNA và RNA, g m ba ph n: đ ngử ấ ơ ở ủ ồ ầ ườ pentose (ribose trong RNA, deoxyribose trong DNA), nitrogen base và g c phosphate.ố

Nucleolytic. Phan ng th y phân môt câu nôi phosphodiester trong môt nucleic ứ ủ acid.

Nuclease Bal 31. M t lo i enzyme exonuclease th y phân c hai s i c a phân tộ ạ ủ ả ợ ủ ử DNA cùng m t lúc. ộ

Oligo. Ti p đ u ng có nghĩa là “ít”, ví d : oligonucleotide (polynucleotide) có ítế ầ ữ ụ nucleotide ho c oligopeptide (polypeptide) có ít peptide.ặ

Oligo(dT)-cellulose. M t đo n ng n g m các g c deoxy-thymidine liên k t v iộ ạ ắ ồ ố ế ớ c ch t cellulose, đ c s d ng đ tinh s ch mRNA eukaryote b ng ph ng pháp s cơ ấ ượ ử ụ ể ạ ằ ươ ắ ký c t.ộ

Oligomer. Thu t ng chung đ ch m t đo n ng n các monomer.ậ ữ ể ỉ ộ ạ ắ

Oligonucleotide. M t đo n ng n các monomer là nucleotide, th ng t 20-30ộ ạ ắ ườ ừ nucleotide.

Ôn hòa (temperate). Tr ng thái ti m tan c a các bacteriophage t bào v t ch . ạ ề ủ ế ậ ủ

α-peptide. M t ph n c a protein ộ ầ ủ β-galactosidase, đ c mã hóa b i đo n genượ ở ạ lacZ.

Phage. Vi t t t c a bacteriophage (th c khu n th ), là lo i virus xâm nhi m vàế ắ ủ ự ẩ ể ạ ễ sinh s n bên trong vi khu n. Phage th ng có v b c protein, ph c h p bao g m ph nả ẩ ườ ỏ ọ ứ ợ ồ ầ đ u có hình đa di n ch a nucleic acid và đuôi mà qua đó nucleic acid xâm nh p vào viầ ệ ứ ậ khu n ch . Sau quá trình nhân lên c a nucleic acid c a phage, t bào vi khu n chẩ ủ ủ ủ ế ẩ ủ th ng b tan bi n. Lo i phage luôn luôn làm tan t bào vi khu n khi chúng xâm nhi mườ ị ế ạ ế ẩ ễ vi khu n g i là phage đ c. Ví d : phage T4. Ng c l i, còn có phage ôn hòa, khi xâmẩ ọ ộ ụ ượ ạ nhi m vi khu n nó gây nên ph n ng ti m tan, nghĩa là h gen c a phage g n vàoễ ẩ ả ứ ề ệ ủ ắ nhi m s c th vi khu n và đ c sao chép cùng v i nhi m s c th đó. H gen c aễ ắ ể ẩ ượ ớ ễ ắ ể ệ ủ phage tr ng thái g n nh v y v i nhi m s c th vi khu n g i là prophage. ở ạ ắ ư ậ ớ ễ ắ ể ẩ ọ

Phagemid. Là m t lo i plasmid vector có mang các đo n trình t c a phage.ộ ạ ạ ự ủ

Ph n ng chu i polymerase (polymerase chain reaction, PCR).ả ứ ỗ Ph ng phápươ dùng trong phòng thí nghi m đ khu ch đ i các đo n DNA đ c bi t lên hàng tri u l nệ ể ế ạ ạ ặ ệ ệ ầ trong vòng vài gi thông qua 20-30 chu kỳ nhi t, m i chu kỳ bao g m ba m c nhi t đ :ờ ệ ỗ ồ ứ ệ ộ bi n tính 90-95ế ở oC, b t c p v i m i 40-65ắ ặ ớ ồ ở oC ho c h n và t ng h p m ch m i nhặ ơ ổ ợ ạ ớ ờ DNA polymerase ch u nhi t (Taq polymerase) 70-72ị ệ ở oC. PCR có ng d ng r ng rãiứ ụ ộ trong ch n đoán y h c, phân tích s đa d ng sinh h c, ch n gi ng và trong nhi u lĩnhẩ ọ ự ạ ọ ọ ố ề v c khác. ự

Nhà khoa h c M (Ti n sĩ Mullis) ng i phát minh ra k thu t PCR đã nh n gi iọ ỹ ế ườ ỹ ậ ậ ả Nobel năm 1993. Cùng chia s Gi i Nobel v i Mullis là Smith (Canada) do có nh ngẻ ả ớ ữ đóng góp mang tính n n t ng cho vi c gây đ t bi n đi m đ nh h ng, d a trên cácề ả ệ ộ ế ể ị ướ ự oligonucleotide và vi c phát tri n chúng trong các nghiên c u protein.ệ ể ứ

Phân tích trình t gen (gene sequencing).ự Là k thu t xác đ nh trình t theo c uỹ ậ ị ự ấ trúc b c m t c a chu i các nucleotide trong m t phân t nucleic acid. Phân tích trình tậ ộ ủ ỗ ộ ử ự c a DNA có các ph ng pháp hóa h c c a Maxam-Gilbert và ph ng pháp enzymeủ ươ ọ ủ ươ c a Sanger. Trong nh ng năm g n đây, m t s ph ng pháp xác đ nh trình t m i nhủ ữ ầ ộ ố ươ ị ự ớ ờ s h tr c a máy tính đã xu t hi n. Bên c nh k thu t thông th ng s d ng cácự ỗ ợ ủ ấ ệ ạ ỹ ậ ườ ử ụ polyacrylamide gel đ phân ly các phân t DNA có đ dài khác nhau, các k thu t m iể ử ộ ỹ ậ ớ liên quan đ n phát hi n huỳnh quang c a các nucleotide đ c đánh d u, phân tích trìnhế ệ ủ ượ ấ

t DNA b ng kh i ph , đi n di mao d n ho c lai v i các đo n oligonucleotide đ cự ằ ố ổ ệ ẫ ặ ớ ạ ượ t ng h p nhân t o cũng đã ra đ i. ổ ợ ạ ờ

Năm 1980, Sanger (Anh) và Gilbert (M ) đã đ c trao gi i Nobel do đã có nh ngỹ ượ ả ữ đóng góp quan tr ng v ph ng pháp xác đ nh trình t các nucleotide trong phân tọ ề ươ ị ự ử DNA. Đóng góp này là m c l ch s to l n trong sinh h c phân t , là nguyên lý c a t tố ị ử ớ ọ ử ủ ấ c các máy xác đ nh trình t DNA t đ ng đang s d ng hi n nay trên kh p th gi i.ả ị ự ự ộ ử ụ ệ ắ ế ớ

Ph n cu i (telomere).ầ ố Đo n cu i, ph n cu i c a m t nhi m s c th th ng c aạ ố ầ ố ủ ộ ễ ắ ể ẳ ủ eukaryote, bao g m nh ng trình t DNA ng n đ c l p l i nhi u l n. ồ ữ ự ắ ượ ặ ạ ề ầ

Ph n tâm (centromere). ầ Ph n co th t đ c th y trên nhi m s c th kỳ gi a,ầ ắ ượ ấ ễ ắ ể ở ữ đó là n i hai nhi m s c t đính v i nhau. ơ ễ ắ ử ớ

Phiên mã (transcription). Là quá trình đ c xúc tác b i enzyme phiên mã RNAượ ở polymerase đ t ng h p mRNA t khuôn m u DNA.ể ổ ợ ừ ẫ

Phiên mã ng c (reverse transcription).ượ Quá trình t ng h p DNA t khuônổ ợ ừ m u mRNA nh enzyme phiên mã ng c (reverse transcriptase).ẫ ờ ượ

Phóng x t ghi (autoradiography).ạ ự K thu t phát hi n các phân t có đánhỹ ậ ệ ử d u phóng x thông qua hi u ng t o nh c a các phân t này trên phim X-quang.ấ ạ ệ ứ ạ ả ủ ử

Phosphatase ki m (alkaline phosphatase).ề Enzyme lo i b các nhóm 5’-ạ ỏphosphate t đ u c a các phân t DNA và đ l i các nhóm 5’-hydroxyl.ừ ầ ủ ử ể ạ

Plasmid. La DNA vi khuân có c u trúc m ch vòng kép, n m trong t bào ch t và ấ ạ ằ ế ấ ngoài nhân, có kh năng sao chép đ c l p đ i v i nhi m s c th c a t bào. T n t iả ộ ậ ố ớ ễ ắ ể ủ ế ồ ạ c sinh v t prokaryote và eukaryote. Ngày nay, các plasmid thi t k nhân t o đ cả ở ậ ế ế ạ ượ s d ng r ng rãi nh là các vector dùng trong các k thu t t o dòng và bi u hi n gen.ử ụ ộ ư ỹ ậ ạ ể ệ

Plasmid không ti p h p (non-conjugative plasmid).ế ợ Ví d : plasmid ụ ColE1, là lo i plasmid không dùng s ti p h p cho quá trình s ng, thông th ng là các plasmidạ ự ế ợ ố ườ có kích th c bé, t n t i v i m t s l ng nhi u. C ch nhân lên (nhi u b n sao)ướ ồ ạ ớ ộ ố ượ ề ơ ế ề ả c a chúng cũng khác hoàn toàn v i plasmid ti p h p.ủ ớ ế ợ

Plasmid không t ng h p (incompatible plasmid).ươ ợ Là nh ng plasmid có thữ ể cùng t n t i v i nhau trong m t vài th h t bào v t ch , sau đó trong quá trìnhồ ạ ớ ộ ế ệ ở ế ậ ủ phân chia c a t bào, m t s trong chúng s b th i lo i. Mu n t ng h p trong cùngủ ế ộ ố ẽ ị ả ạ ố ươ ợ m t t bào v t ch , các plasmid khác nhau ph i có chung m t s đ c đi m trong quáộ ế ậ ủ ả ộ ố ặ ể trình t n t i.ồ ạ

Plasmid ti p h p (conjugative plasmid) ế ợ hay plasmid F (fertility (F) plasmid). Là các plasmid chuy n giao nh ng b n sao DNA c a chúng t vi khu n này sang viể ữ ả ủ ừ ẩ khu n khác nh ph ng th c ti p h p (do chúng có t h p gen đ s n xu t các ngẩ ờ ươ ứ ế ợ ổ ợ ể ả ấ ố protein hay còn g i là lông gi i tính (sex pile) làm c u n i gi a hai t bào vi khu n v iọ ớ ầ ố ữ ế ẩ ớ nhau). DNA c a plasmid, th m chí c DNA c a h gen vi khu n, thông qua các ngủ ậ ả ủ ệ ẩ ố protein này đ chuy n t t bào vi khu n “cho” sang t bào vi khu n “nh n”. Cácể ể ừ ế ẩ ế ẩ ậ plasmid, ngoài vi c chuy n giao DNA c a riêng chúng, còn có kh năng chuy n giaoệ ể ủ ả ể

m t ph n hay nhi u ph n h gen c a t bào vi khu n v t ch đ n t bào vi khu nộ ầ ề ầ ệ ủ ế ẩ ậ ủ ế ế ẩ “nh n” khác. Do v y, chúng đ c g i là các nhân t gi i tính (sex factor) c a vi khu nậ ậ ượ ọ ố ớ ủ ẩ v t ch , có vai trò quan tr ng trong b o t n di truy n c a vi khu n theo ph ng th cậ ủ ọ ả ồ ề ủ ẩ ươ ứ này.

Plasmid t ng h p (compatible plasmid).ươ ợ Là nh ng lo i plasmid có trong cùngữ ạ m t t bào v t ch nh ng không nh h ng l n nhau. Khi t bào v t ch phân chia,ộ ế ậ ủ ư ả ưở ẫ ế ậ ủ chúng cùng đ ng th i phân chia và t n t i vĩnh vi n.ồ ờ ồ ạ ễ

Polyacrylamide. Là polymer c a acrylamide và bisacrylamide có c u trúc g mủ ấ ồ các liên k t chéo t o ra m t m ng x p (gi ng b t bi n). Các ch t ph i chui vào l gelế ạ ộ ả ố ố ọ ể ấ ả ỗ m i ra đ c, vì v y nh ng ch t nào có kh i l ng phân t nh s ra tr c và ng cớ ượ ậ ữ ấ ố ượ ử ỏ ẽ ướ ượ l i.ạ

Polynucleotide. Trình t nh ng nucleotide n i đ ng hóa tr v i nhau, trong đó vự ữ ố ồ ị ớ ị trí 3’ c a pentose c a m t trong nh ng nucleotide đ c n i v i m t liên k tủ ủ ộ ữ ượ ố ớ ộ ế phosphodieste v trí 5’ c a pentose c a nucleotide ti p theo.ở ị ủ ủ ế

Polypeptide. M t chu i dài nh ng amino acid n i v i nhau b i nh ng liên k tộ ỗ ữ ố ớ ở ữ ế peptide.

Prokaryote. Sinh v t đ n bào không có nhân t bào đi n hình, DNA n m trongậ ơ ế ể ằ t bào ch t không có màng bao b c, không có nguyên phân và gi m phân; đ i di nế ấ ọ ả ạ ệ đi n hình là vi khu n.ể ẩ

Prophage. Phage ôn hòa đã xen vào nhi m s c th c a vi khu n ti m tan. Nó saoễ ắ ể ủ ẩ ề chép đ ng th i v i nhi m s c th c a t bào vi khu n ch .ồ ờ ớ ễ ắ ể ủ ế ẩ ủ

Protein. M t phân t l n g m m t ho c nhi u chu i polypeptide, m i chu i cóộ ử ớ ồ ộ ặ ề ỗ ỗ ỗ m t trình t amino acid và m t kh i l ng phân t đ c tr ng. Protein là h p ch t quanộ ự ộ ố ượ ử ặ ư ợ ấ tr ng b c nh t đ i v i c th s ng. V c u trúc, protein là phân t m ch dài g m cácọ ậ ấ ố ớ ơ ể ố ề ấ ử ạ ồ đ n v c u trúc nh là các amino acid n i v i nhau qua m i liên k t peptide. Kh iơ ị ấ ỏ ố ớ ố ế ố l ng phân t c a protein t vài nghìn đ n vài tri u. Có kho ng 20 lo i amino acid.ượ ử ủ ừ ế ệ ả ạ Các lo i protein ph c t p h n có liên k t thêm v i các nhóm b sung.ạ ứ ạ ơ ế ớ ổ

Protein dung h p (fusion protein). ợ Là m t protein tái t h p lai đ c mã hóaộ ổ ợ ượ b i m t gen lai (fusion gene) do s dung h p ở ộ ự ợ in vitro các đo n gen khác nhau trênạ plasmid vector và sau đó bi n n p vào vi sinh v t ch (ch ng h n ế ạ ậ ủ ẳ ạ E. coli). Vì v y,ậ protein dung h p s mang trình t amino acid c a hai protein khác bi t đ c t ng h pợ ẽ ự ủ ệ ượ ổ ợ t đ u N c a vector bi u hi n. ừ ầ ủ ể ệ

Protein nguyên th (native protein).ể Là m t protein tái t h p đ c mã hóa b iộ ổ ợ ượ ở m t gen ngo i lai (foreign gene) trong vi sinh v t ch . Khác v i protein dung h p,ộ ạ ậ ủ ớ ợ protein nguyên th đ c t ng h p t đ u N c a nó ch không ph i t đ u N c aể ượ ổ ợ ừ ầ ủ ứ ả ừ ầ ủ vector.

Purine. M t h p ch t d vòng, ki m, có nitrogen, là thành ph n c a nh ngộ ợ ấ ị ề ầ ủ ữ nucleotide và nucleic acid. Purine ch a m t nhân pyrimidine k t h p v i m t nhânứ ộ ế ợ ớ ộ imidazol.

Pyrimidine. M t nitrogen base d vòng có trong các nucleotide và nucleic acid. ộ ị ở

Retrovirus. Là lo i virus RNA ch a enzyme reverse transcriptase và sinh s nạ ứ ả d i d ng DNA m ch kép. Chúng có kh năng xâm nhi m t bào v t ch cao. Khiướ ạ ạ ả ễ ế ậ ủ xâm nhi m nó có kh năng g n h gen c a virus v i h gen c a t bào v t ch , là cễ ả ắ ệ ủ ớ ệ ủ ế ậ ủ ơ s đ thi t k các vector li u pháp gen hi u qu .ở ể ế ế ệ ệ ả

Ribonuclease. Enzyme xúc tác đ c hi u vi c phân h y RNA b ng cách c t cácặ ệ ệ ủ ằ ắ m i liên k t phosphodiester trên RNA.ố ế

Ribonucleic acid (RNA). Th ng là phân t đa phân m ch đ n g m các đ n vườ ử ạ ơ ồ ơ ị c u trúc c s là ribonucleotide. V m t hóa h c RNA r t gi ng v i DNA. RNA là vâtấ ơ ở ề ặ ọ ấ ố ớ chât di truyên cua môt sô virus va la cac phân t trung gian trong qua trinh tông h p ử ợ protein ma thông tin vê trinh t amino acid cua chung đa đ c ma hóa trong DNA. ự ượ

Ribonucleotide. Đ n v c u trúc c s c a RNA, g m ba thành ph n: đ ngơ ị ấ ơ ở ủ ồ ầ ườ ribose, nitrogen base và nhóm phosphate.

Ribosome. La c quan t khi kêt h p v i mRNA tao ra bô may tông h p protein. ơ ử ợ ớ ợ Trong tê bao th ng co hang nghin ribosome, ribosome cua moi tê bao đêu gôm môt tiêu ườ đ n vi nho va môt tiêu đ n vi l n. Môi tiêu đ n vi co mang nhiêu protein va rRNAơ ơ ớ ơ (trong đó rRNA là thành ph n ch y u chi m kho ng 65%) co kich th c khac nhau.ầ ủ ế ế ả ướ Ng i ta cũng th y ribosome trong ty th , đó có s t ng h p m t s protein ty th .ườ ấ ể ở ự ổ ợ ộ ố ể

RNA b sung (complementary RNA). ổ RNA sinh ra băng cach phiên ma t khuôn ừ m u s i đ n DNA t ng ng.ẫ ợ ơ ươ ứ

RNA ligase. Enzyme nôi cac đoan RNA v i nhau sau khi cac intron đ c căt r i ớ ượ ờ khoi tiên chât cua mRNA (pre-mRNA) cac sinh vât eukaryote, tao ra mRNA hoàn ở ch nh săn sang tham gia vao qua trinh dich ma diên ra trên ribosome.ỉ

RNA polymerase. Con goi la RNA polymerase phu thuôc DNA (DNA-dependent RNA polymerase), xuc tac viêc t ng h p RNA trên khuôn m u DNA trong qua trinh ổ ợ ẫ phiên ma.

RNA ribosome (ribosomal RNA, rRNA). La thanh phân c ban cua ribosome, ơ đong vai tro xuc tac va câu truc trong tông h p protein. Tùy theo hê sô lăng rRNA đ c ợ ượ chia thanh nhiêu loai: eukaryote co rRNA 28S; 18S; 5,8S va 5S; con cac rRNA ở ở E. coli co ba loai: 23S, 16S va 5S. rRNA chiêm nhiêu nhât trong b n loai RNA (kho ng ố ả 80% tông sô RNA tê bao), tiêp đên la tRNA kho ng 16%, mRNA chi kho ng 2%. Ngoài ả ả ra, tê bao sinh vât eukaryote con ch a nh ng phân t RNA kích th c nho c a nhân ứ ữ ử ướ ủ (small nuclear, snRNA) chi m kho ng <1% tham gia vao ghep nôi cac exon. ế ả

RNA thông tin (messenger RNA, mRNA). M t lo i RNA đ c phiên mã t m tộ ạ ượ ừ ộ trình t DNA. mRNA truy n thông tin di truy n t nhi m s c th t i ribosome đ tôngự ề ề ừ ễ ắ ể ớ ể h p protein. Trong qua trinh đo môt s i cua chuôi xoăn kep DNA đ c dung lam khuônợ ợ ượ m u, doc theo no các nucleotide cua mRNA bô sung đ c xêp thanh hang, nôi v i nhauẫ ượ ớ tao nên môt polynucleotide giông hêt s i DNA không lam khuôn m u ngo i tr thymine ợ ẫ ạ ừ đ c thay băng uracil. Qua trinh nay goi la phiên ma và phân t mRNA mang ma diượ ử truyên đ c dung đê điêu khiên s hinh thanh protein trên ribosome. ượ ự

RNA vân chuyên (transfer RNA, tRNA) . Loai RNA mang cac amino acid đên ribosome va săp xêp chung doc theo phân t mRNA đa năm săn đo. Tai đây, cac amino ử ở acid nôi v i nhau băng liên kêt peptide đê tao thanh phân t protein. Môi amino acid co ớ ử m t phân t RNA vân chuyên riêng v i bô ba đăc tr ng và nh vây cac amino acidộ ử ớ ư ư đ c săp xêp theo trât t c a cac nitrogen base trên mRNA trong qua trinh dich ma.ượ ự ủ

RNA kích th c nh c a nhân (small nuclear RNA, snRNA).ướ ỏ ủ Ngoài mRNA, tRNA Và rRNA, tê bao eukaryote con ch a nh ng phân t RNA kích th c nho c a ứ ữ ử ướ ủ nhân (chi m kho ng <1%) tham gia vao ghep nôi cac exon. ế ả

Sàng l c (screening).ọ K thu t nh n d ng m t dòng DNA trong m t th vi nỹ ậ ậ ạ ộ ộ ư ệ h gen (genomic library) ho c th vi n cDNA (cDNA library) b ng m t ph ng phápệ ặ ư ệ ằ ộ ươ lai m u dò có đánh d u [ẫ ấ α-32P]dCTP v i các v t tan (tr ng h p dùng bacteriophage λớ ế ườ ợ làm vector t o dòng và cho xâm nhi m vào vi khu n ạ ễ ẩ E. coli) ho c khu n l c (dùngặ ẩ ạ plasmid làm vector t o dòng) c a các th vi n đó trên màng nylon ho c nitrocellulose.ạ ủ ư ệ ặ Tín hi u lai đ c phát hi n b ng phóng x t ghi trên phim X-quang. ệ ượ ệ ằ ạ ự

Sinh h c phân t (molecular biology). ọ ử Khoa h c nghiên c u các hi n t ngọ ứ ệ ượ s ng m c đ phân t . Lĩnh v c khoa h c tr tu i này là đi m g p nhau c a các khoaố ở ứ ộ ử ự ọ ẻ ổ ể ặ ủ h c kinh đi n nh di truy n h c, hóa sinh h c, t bào h c, v t lý h c, hóa h c h u cọ ể ư ề ọ ọ ế ọ ậ ọ ọ ữ ơ và hóa lý. Theo cách hi u ph bi n hi n nay, sinh h c phân t là khoa h c nghiên c uể ổ ế ệ ọ ử ọ ứ các gen và ho t đ ng c a chúng m c đ phân t , bao g m phiên mã, d ch mã, saoạ ộ ủ ở ứ ộ ử ồ ị chép, đi u hòa bi u hi n gen, tái t h p và chuy n gen...ề ể ệ ổ ợ ể

Sinh t ng h p protein (protein synthesis).ổ ợ Ph n ng hóa h c di n ra trênả ứ ọ ễ ribosome t o nên các phân t protein t các amino acid trên c s thông tin di truy nạ ử ừ ơ ở ề nh n đ c t trong nhân t bào thông qua mRNA. ậ ượ ừ ế

Southern blot. K thu t chuy n và c đ nh DNA đã bi n tính t agarose gel (sauỹ ậ ể ố ị ế ừ khi đ c phân đo n b ng đi n di) lên màng lai b ng nylon hay nitrocellulose đ lai v iượ ạ ằ ệ ằ ể ớ m u dò đ c đánh d u đ ng v phóng x [ẫ ượ ấ ồ ị ạ α-32P]dCTP ho c digoxigenin-dUTP.ặ

S b n sao (copy number).ố ả (1) S các phân t plasmid có trong m t t bào viố ử ộ ế khu n. (2) S l ng các b n sao c a m t gen trong h gen c a m t sinh v t.ẩ ố ượ ả ủ ộ ệ ủ ộ ậ

S đ phóng x t ghi (autoradiogram). ơ ồ ạ ự Hình nh sinh ra trên phim X-quangả do s phát x c a các h t phóng x . ự ạ ủ ạ ạ

Tái t h p (recombination).ổ ợ Quá trình mà trong đó nhi m s c th hay phân tễ ắ ể ử DNA đ t ra r i các ph n đ t đ c n i l i theo m t t h p m i. Quá trình này có thứ ồ ầ ứ ượ ố ạ ộ ổ ợ ớ ể x y ra trong t bào s ng (qua s trao đ i chéo trong phân bào gi m nhi m) hay trongả ế ố ự ổ ả ễ

ng nghi m nh các enzyme c t và n i DNA.ố ệ ờ ắ ố

T o dòng gen (gene cloning).ạ Còn g i là nhân dòng, tách dòng hay dòng hóa, làọ s s n sinh nhi u b n sao c a m t phân t DNA, th ng là phân t DNA tái t h pự ả ề ả ủ ộ ử ườ ử ổ ợ trong plasmid vector, b ng cách sao chép phân t đó trong m t v t ch thích h p ch ngằ ử ộ ậ ủ ợ ẳ h n vi khu nạ ẩ E. coli.

Terminal transferase. Enzyme b sung các g c nucleotide vào đ u 3’ c aổ ố ầ ủ oligonucleotide ho c polynucleotide.ặ

T bào kh bi nế ả ế (competent cell). Các t bào vi khu n có kh năng ti p nh nế ẩ ả ế ậ DNA ngo i lai trong quá trình bi n n p.ạ ế ạ

Th bi n n p (transformant).ể ế ạ T bào ho c sinh v t nh n đ c gen c a m tế ặ ậ ậ ượ ủ ộ sinh v t khác trong quá trình bi n n p và bi u hi n ch c năng c a gen đó ra ki u hình.ậ ế ạ ể ệ ứ ủ ể

Thê đa hinh (polymorphism). Mô ta s co măt đông th i cua quân thê trong h ự ờ ệ gen biêu hiên biên di co tinh chât allele, co thê quan sat trên các allele tao ra cac kiêu hinh khac nhau, hoăc s thay đôi cua DNA anh h ng đên ki u c t h n ch (restriction ự ưở ể ắ ạ ế patterns).

Th tái t h p (recombinant). ể ổ ợ Các cá th ho c t bào mang các t h p genể ặ ế ổ ợ khác v i cha m c a chúng do các quá trình tái t h p di truy n sinh ra.ớ ẹ ủ ổ ợ ề

Thông tin di truy n (genetic information).ề Thông tin đ c l u tr trong cácượ ư ữ phân t DNA c a sinh v t d ng trình t s p x p c a b n nucleotide ký hi u là A, T,ử ủ ậ ở ạ ự ắ ế ủ ố ệ C và G đóng vai trò nh nh ng ”ch cái” c a ”ngôn ng ” di truy n. Trong ngôn ngư ữ ữ ủ ữ ề ữ này, m i t ch có ba ch cái g i là m t b ba. Nghĩa c a m i t là m t amino acid cóỗ ừ ỉ ữ ọ ộ ộ ủ ỗ ừ ộ m t trên phân t protein t ng ng. M i ”câu” c a ngôn ng di truy n là m t genặ ử ươ ứ ỗ ủ ữ ề ộ ch a đ ng thông tin di truy n đ đ m nhi m m t ch c năng tr n v n. M i ch c năngứ ự ề ể ả ệ ộ ứ ọ ẹ ỗ ứ là m t đ c tính sinh lý, hình thái hay c u trúc c a s s ng. Do c ch sao chép theoộ ặ ấ ủ ự ố ơ ế ki u n a b o toàn c a DNA mà thông tin di truy n đ c truy n chính xác t th hể ử ả ủ ề ượ ề ừ ế ệ n sang th h kia h u nh không thay đ i.ọ ế ệ ầ ư ổ

Th vi n cDNA (cDNA library). ư ệ T p h p các dòng DNA đ c t o ra t mRNAậ ợ ượ ạ ừ c a m t t bào ho c m t mô c th trong bacteriophage vector, đ i di n cho thông tinủ ộ ế ặ ộ ụ ể ạ ệ di truy n mà các t bào đó bi u hi n.ề ế ể ệ

Th vi n h gen (genomic library). ư ệ ệ T p h p t t c các đo n DNA đ c t o raậ ợ ấ ả ạ ượ ạ t ph n ng c t h n ch genome trong bacteriophage vector, đ i di n đ c cho toànừ ả ứ ắ ạ ế ạ ệ ượ b cho thông tin di truy n c a m t h gen.ộ ề ủ ộ ệ

Trì hoãn gel (gel retardation). Ph ng pháp xác đ nh đi m bám c a protein trênươ ị ể ủ các đo n DNA, d a vào đ di chuy n ch m c a chúng so v i DNA không b proteinạ ự ộ ể ậ ủ ớ ị bám trong các thí nghi m đi n di trên gel.ệ ệ

Trình t d n đ u (leader sequence).ự ẫ ầ M t trong ba ph n ch y u c a m t phânộ ầ ủ ế ủ ộ t mRNA. Trình t này n m đ u 5’ c a mRNA và mang thông tin đ ribosome vàử ự ằ ở ầ ủ ể các protein đ c hi u nh n bi t b t đ u quá trình t ng h p polypeptide, trình t d nặ ệ ậ ế ắ ầ ổ ợ ự ẫ đ u không đ c d ch mã thành trình t các amino acid.ầ ượ ị ự

Trình t đi u hòa (regulatory sequence).ự ề M t trình t c a DNA tham gia vàoộ ự ủ quá trình đi u hòa c a gen. Ví d : trình t promoter ho c operator.ề ủ ụ ự ặ

Trình t kh i đ ng (promoter). ự ơ ộ Trình t nucleotide đ c hi u n m trong thànhự ặ ệ ằ ph n operon, có ch c năng đi u hòa ho t đ ng c a operon, n i RNA polymerase bámầ ứ ề ạ ộ ủ ơ vào đ b t đ u quá trình phiên mã. Trình t đ c tr ng c a promoter có kho ng 20-200ể ắ ầ ự ặ ư ủ ả nitrogen base.

Trình t Shine-Dalgarno (ự Shine Dalgarno sequence, SD). Còn g i là vùng liênọ k t ribosome (RBS), là m t ph n c a trình t nucleotide đ u 5’ c a m t mRNAế ộ ầ ủ ự ở ầ ủ ộ prokaryote có th k t h p b sung c p base v i đ u 3’ c a 16S rRNA, dùng làm tínể ế ợ ổ ặ ớ ầ ủ hi u cho s kh i đ u d ch mã. ệ ự ở ầ ị

Trình t tăng c ng (enhancer).ự ườ Trình t nucleotide d ng ự ạ cis làm tăng c ngườ đ phiên mã c a promoter trong gen eukaryote. Nó có th n m cách promoter hàngộ ủ ể ằ ngàn c p base và ho t đ ng theo c hai h ng b t kỳ v trí nào so v i promoter. ặ ạ ộ ả ướ ở ấ ị ớ

đ g n m i (annealing).Ủ ể ắ ồ Dung đê chi s băt căp cua khuôn m u DNA s i đ n ự ẫ ợ ơ v i primer (m i) đê t ng h p nên m t s i DNA b sung b ng cách s d ng các dNTPớ ồ ổ ợ ộ ợ ổ ằ ử ụ có trong môi tr ng đ kéo dài primer nh s xúc tác c a enzyme Taq DNAườ ể ờ ự ủ polymerase (trong khu ch đ i PCR) ho c DNA polymerase I (trong t ng h p cDNA). ế ạ ặ ổ ợ

c ch amber (amber suppresser).Ứ ế La cac gen đôt biên (ma hóa cho tRNA) ma nh ng anticodons cua no đa đ c kich hoat đê co thê nhân UAG codon cung nh cacữ ượ ư codon tr c đo. ướ

V t ch (host).ậ ủ T bào dùng đ nhân các phân t DNA lên nhi u l n.ế ể ử ề ầ

Vector. Là các phân t DNA đử c s dung trong tao dong ượ ử và bi u hi n ể ệ gen, va nhân ban chung trong t bào v t ch ( ế ậ ủ E. coli ho c n m men). Có ba nhóm vector chínhặ ấ g m: (1) Nhóm plasmid, (2) Nhóm phage/phagemid, và (3) Nhóm nhi m s c th nhânồ ễ ắ ể t o (artificial chromosome: BAC, YAC…). Y t ng vê vector chuyên gen băt nguôn tạ ưở ừ cac plasmid cua vi khuân. Vector chuyên gen la các phân t DNA co kha năng t tai sinh, ử ự tôn tai đôc lâp trong tê bao va mang đ c cac gen cân chuyên. ượ

Vector t o dòng (cloning vector).ạ Phân t DNA m ch kép có kh năng t saoử ạ ả ự chép trong t bào v t ch . Có th g n vào phân t này m t đo n ho c m t vài đo nế ậ ủ ể ắ ử ộ ạ ặ ộ ạ DNA khác ngu n t o nên phân t DNA tái t h p dùng đ nhân dòng.ồ ạ ử ổ ợ ể

Vector bi u hi n (expression vector). ể ệ Phân t DNA m ch kép có mang các tínử ạ hi u c n thi t (promoter, terminator và vùng liên k t ribosome) cho s bi u hi n c aệ ầ ế ế ự ể ệ ủ

m t khung đ c m (gen) s đ c nhân dòng và s n xu t protein t ng ng trong tộ ọ ở ẽ ượ ả ấ ươ ứ ế bào v t ch . ậ ủ

V t tan (pế laque). Vòng tròn trong su t xu t hi n trên th m đ c c a các viố ấ ệ ả ụ ủ khu n m c trên môi tr ng th ch đ c, do s tan v l p l i nhi u chu kỳ c a các tẩ ọ ườ ạ ặ ự ơ ặ ạ ề ủ ế bào vi khu n b bacteriophage xâm nhi m và sinh tan.ẩ ị ễ

Virus. Ph c h p ch a nucleic acid (DNA ho c RNA) n m trong m t v b cứ ợ ứ ặ ằ ộ ỏ ọ protein, có kh năng gây nhi m và tái b n bên trong t bào v t ch đ c hi u, t o raả ễ ả ế ậ ủ ặ ệ ạ nhi u virus, lan truy n t t bào này sang t bào khác. Virus là d ng s ng không cóề ề ừ ế ế ạ ố c u trúc t bào, có kh năng xâm nh p vào các t bào s ng xác đ nh và ch sinh s n ấ ế ả ậ ế ố ị ỉ ả ở bên trong các t bào đó. Gi ng nh t t c cá sinh v t khác, virus có b máy di truy nế ố ư ấ ả ậ ộ ề c a riêng mình, mã hóa vi c t ng h p các h t virus t các ch t có trong t bào v tủ ệ ổ ợ ạ ừ ấ ế ậ ch . Nh v y, virus là nh ng v t ký sinh n i bào. Virus phân b kh p n i trong tủ ư ậ ữ ậ ộ ố ở ắ ơ ự nhiên, xâm nh p vào t t c các nhóm sinh v t. Ng i ta đã bi t kho ng 500 lo i virusậ ấ ả ậ ườ ế ả ạ xâm nh p đ ng v t máu nóng, 300 lo i xâm nh p th c v t b c cao. M t s kh i u ungậ ộ ậ ạ ậ ự ậ ậ ộ ố ố th đ ng v t và ng i có th do virus. Virus t n t i hai d ng: d ng ngh hayư ở ộ ậ ở ườ ể ồ ạ ở ạ ạ ỉ ngo i bào và d ng sinh s n hay n i bào. Kích th c c a các h t virus t 15-350 nm,ạ ạ ả ộ ướ ủ ạ ừ chi u dài c a m t s lo i virus có th đ t t i 2000 nm. Ph n l n virus ch nhìn th yề ủ ộ ố ạ ể ạ ớ ầ ớ ỉ ấ đ c qua kính hi n vi đi n t . Ch t mang thông tin di truy n c a virus là nucleic acid:ượ ể ể ử ấ ề ủ DNA ho c RNA. Vì v y, có th phân virus thành hai lo i: lo i mang DNA và lo iặ ậ ể ạ ạ ạ mang RNA.

V trí ị cos (cos site) hay đ u ầ cos (cos end). Trình t nucleotide đ c c t ra đ t oự ượ ắ ể ạ thành các ph n m r ng s i đ n, k t dính hai đ u cu i c a các phân t DNA m chầ ở ộ ợ ơ ế ở ầ ố ủ ử ạ th ng c a m t phage nào đó (ví d : phage ẳ ủ ộ ụ λ).

Vòng c p tóc (hairpin loop).ặ Vùng chu i đ n b sung t o n p g p ch a các c pỗ ơ ổ ạ ế ấ ứ ặ base t o thành xo n kép, đ c dung lam môi (primer) cho qua trinh tông h p s i cDNAạ ắ ượ ợ ợ th hai.ứ

Vùng cùng h ng (downtream).ướ Đ c p đ n v trí c a m t đo n trình t nàoề ậ ế ị ủ ộ ạ ự đó n m phía đ u 3’ c a gen ho c m t đo n gen quan tâm.ằ ở ầ ủ ặ ộ ạ

Vùng liên k t ribosome (ribosome binding sites, RBS). ế Là trình t nuleotideự trên phân t mRNA giup cho no bam vao ribosome trong qua trinh dich ma (xem trình tử ự Shine-Dalgarno).

Vùng ng c h ng (upstream region). ượ ướ V trí c a m t trình t nucleotide nàoị ủ ộ ự đó n m phía đ u 5’ c a phân t DNA so v i gen quan tâm.ằ ở ầ ủ ử ớ

Vùng t o dòng (multiple cloning sites, MCS) ạ hay vùng đa n i (polylinker ố hay polycloning sites). Đoan DNA ngăn trong môt vector th h th ba (ví d : các nhóm ế ệ ứ ụ pUC, pGEM, pBluescript…) co ch a cac vi tri nhân biêt cho m t s enzyme c t h n ứ ộ ố ắ ạ ch thông d ng, đ c thi t k đ chèn đo n DNA ngo i lai vào đây.ế ụ ượ ế ế ể ạ ạ

Western blot. K thu t chuy n protein t ng s đã đ c phân tách b ng đi n diỹ ậ ể ổ ố ượ ằ ệ SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) lên màng nylon ho c nitrocellulose đ lai v i kháng th m t đ c hi u và sau đó là kháng th haiặ ể ớ ể ộ ặ ệ ể có đánh d u enzyme nh m phát hi n protein kháng nguyên t ng ng c a nó. ấ ằ ệ ươ ứ ủ

YAC (Yeast artificial chromosome). Nhi m s c th nhân t o c a n m men,ễ ắ ể ạ ủ ấ đ c dùng làm vector đ t o dòng nh ng đo n DNA có kích th c r t l n trong n mượ ể ạ ữ ạ ướ ấ ớ ấ men.

Tài li u tham kh o/đ c thêmệ ả ọ

1. Ban T đi n-NXB Khoa h c và K thu t.ừ ể ọ ỹ ậ 2002. T đi n Bách khoa Sinh h c. ừ ể ọ NXB

Khoa h c và K thu tọ ỹ ậ , Hà N i.ộ

2. Lawrence E. 1995. Henderson’s Dictionary of Biological Terms. 7th ed. Longman

Group Ltd. Singapore.

3. Nill K. 2002. Glossary of Biotechnology Term. 3rd ed. CRC Press LLC, USA.

4. Old RW and Primrose SB. 1994. Principles of Gene Manipulation. Blackwell

Scientific Publications, Osney Mead, Oxford, UK.

5. Singleton P and Sainsbury D. 2001. Dictionary of Microbiology and Molecular

Biology. 3rd ed. John Wiley & Sons, Ltd. UK.

Ch ng 1ươ

Các enzyme dùng trong t o dòng phân tạ ử

I. Cac enzyme h n chê ạ

Cac enzyme han chê đ c phân lâp t các sinh v t prokaryote, co kha năng phân ượ ừ ậ huy DNA c a bacteriophage đ han chê kha năng sinh tr ng cua chúng trong vi ủ ể ưở ở khuân. Hiên nay, ng i ta đã tìm th y h n 900 enzyme han chê khac nhau t kho ng ườ ấ ơ ừ ả 250 ch ng vi sinh v t.ủ ậ

Các enzyme h n ch có ba lo i (type): I, II và III. Các enzyme đ c dùng phạ ế ạ ượ ổ bi n hi n nay thu c type II, có c ch tác đ ng đ n gi n nh t. Đây là các nuclease c tế ệ ộ ơ ế ộ ơ ả ấ ắ

m t v trí đ c hi u n m bên trong s i DNA (ch không phân h y DNA t hai đ u),ở ộ ị ặ ệ ằ ợ ứ ủ ừ ầ nên đ c g i là endonuclease. Tên g i đ y đ c a chúng là các restrictionượ ọ ọ ầ ủ ủ endonuclease type II, hay đ c g i đ n gi n là enzyme h n ch (restriction enzyme,ượ ọ ơ ả ạ ế RE).

1. Các enzyme h n ch type IIạ ế

Cách g i tên các enzyme h n ch d a trên các qui c qu c t . Tên chi và tênọ ạ ế ự ướ ố ế loài c a sinh v t, mà đó tìm th y enzyme, đ c dùng đ đ t cho ph n đ u c a tênủ ậ ở ấ ượ ể ặ ầ ầ ủ enzyme (vi t nghiêng) bao g m: ch th nh t c a tên chi và hai ch đ u c a tên loài.ế ồ ữ ứ ấ ủ ữ ầ ủ Ví d : enzyme đ c tách chi t t vi khu n ụ ượ ế ừ ẩ Escherichia coli thì có tên là Eco, còn enzyme đ c tách chi t t vi khu n ượ ế ừ ẩ Bacillus globigii thì vi t là ế Bgl… Ngoài ra, tên g iọ enzyme h n ch còn đ c b sung thêm ph n sau (vi t th ng), tùy thu c vào ch ng viạ ế ượ ổ ầ ế ẳ ộ ủ khu n liên quan và tùy thu c vào s có m t hay không c a các y u t ngoài nhi m s cẩ ộ ự ặ ủ ế ố ễ ắ th . Ví d : RI trong enzyme ể ụ EcoRI có nghĩa nh sau: R là vi t t t c a ch ng RY13, Iư ế ắ ủ ủ là b c xác đ nh đ u tiên trong vi khu n (first identified order in bacterium).ậ ị ầ ẩ

Giá tr c a enzyme h n ch là tính đ c hi u c a chúng. Cac enzyme nay cătị ủ ạ ế ở ặ ệ ủ DNA cac v trí nhân biêt riêng bi t bao gôm t 4-6 căp nucleotide co trinh t đôi x ngở ị ệ ừ ự ứ đao ng c nhau, cac đoan ngăn nay goi là palindrome (đoan đôi x ng: la đoan DNA co ượ ứ hai s i hoan toan đôi x ng giông hêt nhau nêu lât ng c đâu đuôi). Vi duợ ứ ượ : enzyme EcoRI nhân biêt chuôi hexanucleotide (6 nucleotide):

Giông nh ư EcoRI, nhiêu enzyme h n ch đa tao ra cac đoan DNA v i đâu lôi ạ ế ớ (protruding) 5’. Môt sô enzyme h n ch khác (ví d : ạ ế ụ PstI) tao ra cac đoan DNA co đâu lôi 5’. Trong khi đó, môt sô enzyme h n ch (ví du: ạ ế SmaI) l i căt truc đôi x ng đê taoạ ở ứ ra cac đoan DNA mang đâu băng (DNA mach đôi co hai đâu s i đ n băng nhau) (Bang ợ ơ 1.1).

Bang 1.1. Trinh t nhân biêt cua môt sô enzyme han chê tiêu bi u ự ể

V i b n lo i nitrogen base trong phân t DNA và gi thi t r ng trình t s p x pớ ố ạ ử ả ế ằ ự ắ ế c a chúng là ng u nhiên, thì t n s mong đ i (kỳ v ng) c a b t kỳ đo n trình t xácủ ẫ ầ ố ợ ọ ủ ấ ạ ự đ nh nào, theo tính toán s là 4ị ẽ n, n đây là chi u dài c a đo n nh n bi t. T đó, có thở ề ủ ạ ậ ế ừ ể th y r ng v i các đo n có b n nucleotide thì c cách 256 c p base chúng l p l i m tấ ằ ớ ạ ố ứ ặ ặ ạ ộ l n, các đo n sáu nucleotide thì cách 4096 c p base m i l p l i. T t nhiên, các giá trầ ạ ặ ớ ặ ạ ấ ị này có th dao đ ng r t l n, nh ng nói chung chi u dài c a các đo n sinh ra đ u g nể ộ ấ ớ ư ề ủ ạ ề ầ v i các giá tr tính toán. Ch ng h n, m t enzyme nh n bi t đo n trình t b nớ ị ẳ ạ ộ ậ ế ạ ự ố nucleotide s s n sinh ra các đo n ng n h n so v i đo n sáu nucleotide.ẽ ả ạ ắ ơ ớ ạ

2. Găn cac đâu tân cung đ c căt b i enzyme h n ch ượ ơ ạ ế

- Các đâu dinh (cohesive ends) , còn g i là đ u l i hay đ u so le.ọ ầ ồ ầ

Ví d : đ u dính đ c t o ra nh ụ ầ ượ ạ ờ PstI

- Các đâu băng (blunt ends) , còn g i là đ u thôọ ầ

Ví d : đ u b ng đ c t o ra nh ụ ầ ằ ượ ạ ờ HaeIII

- Dung enzyme DNA ligase cua phage T4 co thê g n lai cac đâu dinh hoăc đâu ắ băng. Tuy nhiên, tr ng h p đâu băng th ng cho hiêu qua thâp vi thê ng i ta co thê ườ ợ ườ ườ dung cac biên phap khac nh : ư

+ Găn vào đ u b ng môt đoan bô sung đê tao ra đâu dinh. ầ ằ Vi du: găn đoan linker (đo n n i) b ng cách tông h p nh ng trình t oligonucleotide nhân tao có t 10-20ạ ố ằ ợ ữ ự ừ nucleotide đê lam linker nh sau: ư

5' NN GAATTC NN 3'

3' NN CTTAAG NN 5'

+ Dung terminal transferase. Enzyme nay se tao đ u 3’ c a DNA s i đôi môt ở ầ ủ ợ homopolymer (xem ch ng 6).ươ

3. Isochizomer

Noi chung, cac RE khac nhau nhân biêt cac trình t khac nhau (Bang 1.1), tuy ự nhiên cung co môt sô tr ng h p cho thây co nh ng enzyme đ c phân lâp t nhiêu ườ ợ ữ ượ ừ nguôn khac nhau nh ng lai căt trong môt trình t , cac enzyme đo đ c goi la ư ự ượ isochizomer. H n n a, môt vai enzyme nhân biêt cac chuôi tetranucleotide (4 nucleotide)ơ ữ ma trong môt sô tr ng h p cac tetranucleotide nay lai xuât hiên trong cac chuôi ườ ợ hexanucleotide cua cac enzyme khac.

Vi du:

- MboI va Sau3AI cùng nhân biêt trình t : ự

- Trong khi đo BamHI nhân biêt trình t : ự

Trong môt vai tr ng h p khác cac đoan đ c tao ra nh m t enzyme h n ch ườ ợ ượ ờ ộ ạ ế nay khi găn v i cac đoan đ c tao ra nh m t enzyme h n ch khac đa hinh thanh cac ớ ượ ờ ộ ạ ế thê lai (hybrid) ma cac enzyme bô me không th nhân biêt đ c. Vi du: ể ượ SalI căt trình t ự (G↓TCGAC) va XhoI c t trình t (ắ ự C↓TCGAG), cac trình t đ c sinh ra nay đa găn v i ự ượ ớ

nhau tao thanh thê lai ma cac vi tri căt han chê cua chung không thê nhân biêt b i cac ở enzyme SalI va XhoI:

4. Methyl hóa

S methyl hoa (methylation) nhăm m c đích bao vê DNA cua cac đoanự ụ palindrome, nghia la găn gôc methyl (CH 3) vi tri cân thiêt nên không bi RE căt. Vi du:ở EcoRI nhân biêt chuôi:

Khi co s methyl hoa thi enzyme không nhân biêt đ c vi tri căt han chê va do đo ự ượ DNA không bi căt, nh ng DNA cua phage không co găn gôc methyl se bi căt b i RE. ữ ở Trong ky thuât gen, enzyme methyl hoa đ c goi la methylase enzyme. Methylase đ c ượ ượ dung đê bao vê đoan DNA cân găn vao.

Tât ca cac chung E. coli đêu ch a hai enzyme methyl hoa DNA la: ứ dam va dcm.

- dam (DNA adenine methylase)

Enzyme methylase nay găn cac nhom methyl vi tri N ở 6 cua adenine trong chuôi 5’…GmeATC…3’ . Nh ng DNA c a eukaryote không bi methyl hoa vi tri Nư ủ ở 6 cua adenine.

- dcm (DNA cystosine methylase)

Enzyme methylase nay găn cac nhom methyl vi tri C ở 5 cua cytosine bên trong cac chuôi 5’…C meCAGG…3’ hoăc 5’…C meCTGG…3’ . Enzyme ch y u anh h ng đên sủ ế ưở ự methyl hoa dcm la EcoRII, enzyme BstNI co thê nhân biêt chinh xac cung m t trình t ộ ự nh ư EcoRII (măc du no căt DNA vi tri xac đinh khac trong chuôi nay). Nêu không thê ở thay BstNI cho EcoRII thi DNA phai đ c chuân bi t cac chung ượ ừ E. coli dcm.

5. Căt DNA băng enzyme h n ch ạ ế5.1. Các lo i đ m dùng trong ph n ng c t DNAạ ệ ả ứ ắ

Môi enzyme h n ch co m t điêu kiên phan ng tôi u, nhiêt đô u va thanh phân ạ ế ộ ứ ư cua dung dich đêm la nh ng yêu tô quan trong. Nhiêt đô yêu câu kha chinh xac con s ữ ự khac nhau gi a cac dung dich đêm th ng la không đang kê. Đê thuân tiên trong nghiên ữ ườ c u ng i ta chia cac enzyme ra lam ba nhom:ứ ườ

- Nhom đêm cao (H). Hoat đông tôt nhât cac dung dich đêm co hoat đô ion cao. ở

- Nhom đêm trung binh (M). Thich h p v i cac dung dich đêm co hoat đô ion ợ ớ trung binh.

- Nhom đêm thâp (L). Thich h p v i cac dung dich đêm co hoat đô ion thâp. ợ ớ

Nh vây, theo cach phân chia nay chi co ba loai đêm stock la cân chuân bi choư ph n ng c t DNA b ng RE (Bang 1.2). Th ng cac đêm stock trong bang 1.2 đ cả ứ ắ ằ ườ ượ pha nông đô ( ´ 10), va co thê gi nhiêt đô 4ở ữ ở oC/1-2 tuân hoăc -20 oC/không han đinh.

Bang 1.2. Cac loai dung dich đêm cho phan ng căt DNA b ng RE ư ằ

Chu y

Riêng enzyme SmaI không thê s dung cac loai đêm trên mà c n ph i pha dung ử ở ầ ả dich đêm đăc biêt, bao g m: 20 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (pH 8), 10 mM MgCl ồ 2, và 1 mM dithiothreitol.

5.2. Ph ng phap căt DNA b ng enzyme h n chươ ằ ạ ế

Cac phan ng đăc tr ng dung khoang 0,2-1 ứ ư µg DNA/20 µL dung dich ph n ng ả ứ hoăc it h n. Vi du: ơ

a. Pha dung dich DNA băng n c cât hai lân vô trung trong eppendorf tube vô trung t i ướ ớ dung tich 17 µL.

b. Bô sung 2 µL đêm ph n ng ( ×10) thich h p c a RE va trôn đêu (vortex). ả ứ ợ ủ Ví d :ụ

BstXI : Dung đêm cao 10×(H)

XbaI : 10×(H)

EcoRI : 10×(H)

c. Bô sung 1 unit/ µL RE va lăc đêu nhe. M t unit (đ n vi, ký hi u là u) RE đ c xac ộ ơ ệ ượ đinh nh la sô l ng yêu câu đu đê thuy phân hoan toan 1 ư ượ µg DNA plasmid/1 gi ờ ở dung dich đêm va nhiêt đô thich h p trong 20 ợ µL phan ng. ứ

d. U nhiêt đô thich h p, th i gian tuy thuôc vao yêu câu. Vi du: ở ợ ờ

BstXI : 1-2 gi /50ờ oC

XbaI : 1 gi /37ờ oC

EcoRI : 1 gi /37ờ oC

e. D ng phan ng băng cach bô sung 0,5 M EDTA (pH 7,5) đê đat t i nông đô cuôi cungừ ứ ớ la 10 mM.

- Nêu DNA sau khi căt băng RE, đ c phân tich tr c tiêp trên gel thi bô sung 1 ượ ự μ L ( × 10) gel-loading-dye I, trôn đêu va chay điên di.

- Nêu DNA sau khi căt băng RE, cân đ c tinh sach thi chiêt m t lân v i phenol, ượ ộ ớ m t lân v i phenol:chloroform (1:1), m t lân v i chloroform va kêt tua DNA băng haiộ ớ ộ ớ thê tich ethanol hoăc m t thê tich isopropanol. ộ

Chu y

- Kêt qua hoat đông cua enzyme han chê phu thuôc rât nhiêu vao đô sach cua DNA. Cac chê phâm DNA con lân đêm chiêt, phenol hoăc EtOH s lam giam chât l ng hoat ẽ ượ đông cua enzyme.

- Enzyme han chê đ c gi -20 ượ ữ ở oC (ho c -80ặ o C n u b o qu n lâu dài). Nêu lâyế ả ả enzyme ra khoi tu lanh sâu trong m t th i gian ngăn đê dung thi phai đăt trên đa tuyêt ộ ờ (ice bath).

II. Các enzyme trùng h pợ1. DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase)

DNA polymerase đ c dung đê tông h p DNA trong c thê hoăc trong đi u ki nượ ợ ơ ề ệ in vitro.

1.1. DNA polymerase I cua E. coli

Enzyme nay dich chuy n điêm đ t (nick) cua DNA, nick la điêm đ t trên m t s i ể ứ ứ ộ ợ cua DNA s i đôi. Ch c năng chinh cua enzyme la s a sai doc theo phân t DNA. Nêu ợ ứ ử ử găp chô sai sot, no se đi ng c lai đê căt bo sau đo m i tông h p DNA. DNA ượ ớ ợ polymerase I cua E. coli mang chuôi polypeptide co kh i l ng phân t (M) la 109.000 ố ượ ử Da v i ba hoat tinh riêng biêt:ớ

- Ho t tính polyạ merase 5’→3’ . DNA polymerase I cua E. coli xúc tác cho sự t ng h p DNA theo chi u 5’ổ ợ ề →3’ b ng cách bô sung cac gôc nucleotide vao đâu tân cungằ 3’-OH đ c tao ra khi môt s i cua phân t DNA s i đôi bi đ t.ượ ợ ử ợ ứ

- Ho t tính exonuclease ạ 3’→5’. DNA polymerase I cua E. coli c t các chu iắ ỗ nucleotide các đ u t do c a DNA, xúc tác cho s thoái bi n b c thang t đ u 3’ c aở ầ ự ủ ự ế ậ ừ ầ ủ c DNA s i đôi và s i đ n khi không có dNTPs. Trong tr ng h p có dNTPs, ho t tínhả ợ ợ ơ ườ ợ ạ exonuclease trên s i đôi s b c ch b i ho t tính polymerase. Trong quá trình t ngợ ẽ ị ứ ế ở ạ ổ h p DNA, ho t tính exonuclease th c hi n ch c năng đ c s a (proofreading) b ngợ ạ ự ệ ứ ọ ử ằ cách c t b nh ng nucleotide l p ráp sai.ắ ỏ ữ ắ

- Hoat tinh exonuclease 5’→3’. DNA polymerase I cua E. coli co thê chuyên chô cac nucleotide t phia 5’ cua điêm đ t va bô sung t c th i cac nucleotide t phia 3’ tao ừ ứ ứ ờ ừ ra chuyên đông cua điêm đ t doc theo DNA. ứ

- ng dung chínhỨ

+ Đanh dâu đo n DNA đ làm m u dò băng dich chuy n điêm đ t. ạ ể ẫ ể ứ

+ Kh i đâu cho s tông h p s i th hai trong tao dong cDNA.ở ự ợ ợ ứ

+ Xac đinh trinh t DNA băng ph ng phap dideoxynucleotide. ự ươ

1.2. Đoan Klenow cua DNA polymerase I cua E. coli

Enzyme này co tac dung lâp đây cac đâu khuy t 3’ cua DNA s i đôi. Do DNA ế ợ polymerase I co ba hoat tinh, nh ng hoat tinh exonuclease 5’ ư →3’ it s dung nên Klenow ử đã dung protease đê căt b t đoan co hoat tinh đo. Vi vây, kh i l ng phân t c a ớ ố ượ ử ủ enzyme ch con lai 76.000 Da (đ c g i là đoan l n cua DNA polymerase I).ỉ ượ ọ ớ

- ng d ng chínhỨ ụ

+ Làm đ y đ u khuy t 3’ do enzyme h n ch t o ra.ầ ầ ế ạ ế ạ

+ Đanh dâu đâu tân cung c a các đo n DNA băng cách dùng [ a - ủ ạ 32P]dNTPs để làm đ y đ u khuy t 3’.ầ ầ ế

+ Đanh dâu đâu t n cùng c a các phân t DNA mang đ u l i 3’. Đ u tiên, ho t ậ ủ ử ầ ồ ầ ạ tính exonuclease 3’→5’ lo i b đ u l i 3’ đ t o ra đ u khuy t 3’. Sau đó, nh s cóạ ỏ ầ ồ ể ạ ầ ế ờ ự m t n ng đ cao c a m t ti n ch t đ c đánh d u đ ng v phóng x , s thoái bi nặ ở ồ ộ ủ ộ ề ấ ượ ấ ồ ị ạ ự ế b c thang đ c cân b ng do s h p nh t c a các dNTP đ u 3’.ậ ượ ằ ự ợ ấ ủ ở ầ

+ Tông h p s i th hai cua cDNA trong t o dòng cDNA. ợ ợ ứ ạ

+ T ng h p DNA s i đôi t các khuôn m u s i đ n trong phát sinh đ t bi n ổ ợ ợ ừ ẫ ợ ơ ộ ế in vitro.

1.3. DNA polymerase cua bacteriophage T4

(T4-infected E. coli)

Enzyme nay giông đoan Klenow cua DNA polymerase I cua E. coli . DNA polymerase c a phage T4 (M = 114.000 Da) co ủ hoat tinh polymerase 5’→3’ va exonuclease 3’→5’ . Tuy nhiên, hoat tinh exonuclease cua DNA polymerase phage T4 l n h n cua DNA polymerase I đên 200 lân. Đoan Klenow ph i cân co đo n m iớ ơ ả ạ ồ (primer) m i tông h p DNA đ c, con DNA polymerase phage T4 thi không cân m iớ ợ ượ ồ cung tông h p đ c DNA. ợ ượ

- ng d ng chínhỨ ụ

+ Làm đ y ho c đánh d u đ u khuy t 3’ do enzyme h n ch t o ra.ầ ặ ấ ầ ế ạ ế ạ

+ Đanh dâu đâu t n cùng c a các phân t DNA mang đ u l i 3’, t ng t nh ậ ủ ử ầ ồ ươ ự ư ng d ng c a đo n Klenow.ứ ụ ủ ạ

+ Đánh d u các đo n DNA đ làm m u dò.ấ ạ ể ẫ

+ Bi n đ i đ u sole c a DNA s i đôi thành đ u b ng.ế ổ ầ ủ ợ ầ ằ

1.4. Taq DNA polymerase

(Thermus aquaticus)

Taq DNA polymerase (Taq pol) la môt loai DNA polymerase chiu nhiêt (M = 65.000 Da) c a vi khuân ủ Thermus aquaticus. Enzyme nay đ c dung đê ki m tra s có ượ ể ự m t ho c không c a m t gen b ng cách xúc tác cho s t ng h p gen đó điêu kiên ặ ặ ủ ộ ằ ự ổ ợ ở in vitro nh phan ng chu i polymerase (PCR) (xem ch ng 3). Taq pol thay th choờ ứ ỗ ươ ế DNA polymerase I c a ủ E. coli do có kh năng ch u nhi t cao phù h p v i đi u ki nả ị ệ ợ ớ ề ệ ph n ng c a PCR, và nó có th t ng h p m t s i DNA dài 1 kb trong vòng 30 giây ả ứ ủ ể ổ ợ ộ ợ ở 72oC.

- M t trong nh ng h n ch c a Taq pol là s chính xác không cao trong quá trìnhộ ữ ạ ế ủ ự sao chép c a nó do b m t c ch đ c s a (ho t tính exonuclease 3’ủ ị ấ ơ ế ọ ử ạ →5’). Enzyme Taq pol th ng m i có t l sao chép l i 1/10.000 nucleotide, và có th t o ra 16% s nươ ạ ỷ ệ ỗ ể ạ ả ph m PCR dài 1 kb b đ t bi n trong ph n ng khu ch đ i. M c dù có nh c đi mẩ ị ộ ế ả ứ ế ạ ặ ượ ể trên, Taq pol v n có th đ c dùng trong các thí nghi m đòi h i m t trình t di truy nẫ ể ượ ệ ỏ ộ ự ề chính xác (nh trong t o dòng phân t ). Tuy nhiên, k t qu cho ra m t vector mangư ạ ử ế ả ộ đo n chèn (s n ph m PCR) c n ph i đ c ki m tra b ng sequencing.ạ ả ẩ ầ ả ượ ể ằ

- u đi m c a Taq pol là s n xu t các đo n gen mang hai đ u l i A. Đi u nàyƯ ể ủ ả ấ ạ ầ ồ ề đ c bi t h u ích trong “TA cloning” là k thu t mà vector (plasmid) đ c s d ng đãặ ệ ữ ỹ ậ ượ ử ụ

có s n hai đ u l i T b sung v i hai đ u l i A c a s n ph m PCR, nh đó đã làm tăngẵ ầ ồ ổ ớ ầ ồ ủ ả ẩ ờ hi u qu c a ph n ng g n.ệ ả ủ ả ứ ắ

Ngoài Taq pol, nhi u DNA polymerase ch u nhi t khác đã đ c đ a ra th tr ngề ị ệ ượ ư ị ườ v i các ch c năng chuyên bi t hay hoàn thi n h n. Ch ng h n: ớ ứ ệ ệ ơ ẳ ạ Pfu DNA polymerase (Pfu pol) đ c tách chi t tượ ế ừ Pyrococcus furiosus, th ng đ c dùng thay cho, ho c k tườ ượ ặ ế h p, v i Taq pol. Enzyme này n nhi t h n và có kh năng đ c s a, vì th cho t lợ ớ ổ ệ ơ ả ọ ử ế ỷ ệ sao chép l i th p. Ho c ỗ ấ ặ Tth DNA polymerase (Tth pol), đ c tách chi t t ượ ế ừ Thermus thermophilus, có kh năng ho t đ ng nh m t enzyme phiên mã ng c khi có m t RNAả ạ ộ ư ộ ượ ặ khuôn m u và ion Mnẫ 2+; nh ng n u có s hi n di n c a DNA khuôn m u và ion Mgư ế ự ệ ệ ủ ẫ 2+, thì Tth pol l i xúc tác ph n ng khu ch đ i DNA. Enzyme này cho phép khu ch đ i khuônạ ả ứ ế ạ ế ạ m u là RNA thông qua s hình thành cDNA.ẫ ự

2. RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase)

(Bacteriophage SP6-infected Salmonella typhimurium LT2, bacteriophage T7 hoăc T3-infected E. coli)

Cac bacteriophage SP6, T7 va T3 s n xu t enzyme RNA polymerase đê kh i đâu ả ấ ở tông h p RNA trên khuôn mâu DNA s i đôi co mang promoter đăc tr ng bacteriophage. ợ ợ ư Quá trình t ng h p này không c n m i.ổ ợ ầ ồ

- ng d ng chínhỨ ụ

+ S n xu t RNA đ làm m u dò.ả ấ ể ẫ

+ Xác đ nh trình t c a m t phân t DNA đ c t o dòng trong m t vector cóị ự ủ ộ ử ượ ạ ộ mang promoter đ c tr ng cho bacteriophage SP6, T7 ho c T3.ặ ư ặ

+ S n xu t m t l ng l n RNA t m t phân t DNA đ c t o dòng đ nghiênả ấ ộ ượ ớ ừ ộ ử ượ ạ ể c u v c u trúc, đi u hòa và các m i t ng tác c a phiên b n RNA.ứ ề ấ ề ố ươ ủ ả

3. Enzyme phiên mã ng cượ (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase)

Đây la enzyme tông h p DNA t khuôn mâu RNA. Enzyme nay co trong cac ợ ừ ở virus: AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (moloney murine leukemia virus) thuôc nhom virus ng c (retrovirus: virus mang RNA) va co cac hoat tinh sau: ượ

- Hoat tinh polymerase 5’ →3’. T ng h p DNA theo chi u 5’ổ ợ ề →3’. C chât cua noơ la RNA hay DNA (s i đ n ho c s i đôi): ợ ơ ặ ợ

- Hoat tinh RNase H. Bao g m hai hoat tinh exoribonuclease 5’ồ →3’ va 3’ →5’ phân h y cac DNA hoăc RNA trong tô h p lai.ủ ợ

Enzyme nay đ c dung trong ky thuât di truyên la nh vao kha năng tông h p ượ ờ ợ đ c cDNA c a chúng (xem ch ng 6).ượ ủ ươ

Ng i ta co thê tách chiêt mRNA nh ng tê bao tông h p protein manh, sau đoườ ở ữ ợ dung enzyme reverse transcriptase đê tông h p cDNA. Co thê tông h p nên ợ ợ oligonucleotide rôi dung no đê xac đinh trinh t cua DNA. ự

4. Terminal transferase

(Tuy n c c a bê)ế ứ ủ

Hoat tinh cua enzyme nay la xúc tác g n các nucleotide vào đâu 3’-OH t do c a ắ ự ủ DNA s i đôi lam lôi ra môt đâu cuôi s i DNA. Ph n ng g n này là ng u nhiên, doợ ở ợ ả ứ ắ ẫ đó thành ph n nucleotide c a đ u l i ph thu c vào n ng đ c a b n lo i nucleotideầ ủ ầ ồ ụ ộ ồ ộ ủ ố ạ có trong ph n ng.ả ứ

- ng d ng chínhỨ ụ

+ Thêm đuôi đ ng trùng h p (homopolymer) đ t o ra đ u so le cho phân tồ ợ ể ạ ầ ử DNA dùng trong t o dòng (xem ch ng 6).ạ ươ

+ Đánh d u đ u 3’-OH c a DNA trong k thu t xác đ nh trình t gen theoấ ầ ủ ỹ ậ ị ự Maxam và Gilbert.

III. Các enzyme g nắ

Enzyme ligase th ng dung la cua phage T4 xâm nhi m trong ườ ễ E. coli. Ch c năngứ cua enzyme này la nôi cac đoan h băng liên kêt công hoa tri, s dung năng l ng ATP. ở ử ượ

1. Bacteriophage T4 DNA ligase

(Bacteriophage T4-infected E. coli)

Enzyme nay là m t chu i polypeptide (M = 68.000 Da) xuc tac cho s tao thanh ộ ỗ ự liên k t phosphodiester gi a đâu 3’-OH t do c a m t phân t DNA này v i đâu cu iế ữ ự ủ ộ ử ớ ố 5’-PO4 c a m t phân t DNA khác. DNA ligase có tác d ng cho c tr ng h p đ u soủ ộ ử ụ ả ườ ợ ầ le l n đ u b ng, tuy nhiên đ i v i đ u b ng enzyme đòi h i n ng đ cao h n và đi uẫ ầ ằ ố ớ ầ ằ ỏ ồ ộ ơ ề ki n ph n ng cũng khác.ệ ả ứ

2. Bacteriophage T4 RNA ligase

(Bacteriophage T4-infected E. coli)

Enzyme này xuc tac cho môi liên kêt c ng hoa tri gi a nhóm 5’-PO ộ ữ 4 c a DNA s iủ ợ đ n hoăc RNA v i nhóm 3’-OH c a DNA s i đ n ho c RNA. Do c ch t thích h pơ ớ ủ ợ ơ ặ ơ ấ ợ cho enzyme này là các phân t nh nên nó th ng đ c dùng đ đánh d u đ u 3’ c aử ỏ ườ ượ ể ấ ầ ủ các phân t RNA s d ng làm m u dò.ử ử ụ ẫ

3. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase

(Bacteriophage T4-infected E. coli)

Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuy n nhóm γ-phosphateể c a ATP t i đ u 5’ c a DNA ho c RNA. Hai lo i ph n ng th ng có th x y ra làủ ớ ầ ủ ặ ạ ả ứ ườ ể ả ph n ng thu n và ph n ng trao đ i. Trong ph n ng thu n, nhóm γ-phosphate đ cả ứ ậ ả ứ ổ ả ứ ậ ượ chuy n t i đ u 5’ c a DNA đã đ c dephosphoryl hóa (m t nhóm phosphate). Trongể ớ ầ ủ ượ ấ

ph n ng trao đ i, khi có m t ADP th a, enzyme s chuy n nhóm 5’ phosphate tả ứ ổ ộ ừ ẽ ể ừ DNA đã đ c phosphoryl hóa t i ADP, DNA sau đó s đ c phosphoryl hóa tr l iượ ớ ẽ ượ ở ạ b ng cách nh n m t nhóm γ-phosphate đã đ c đánh d u đ ng v phóng x t m tằ ậ ộ ượ ấ ồ ị ạ ừ ộ phân t [γ-ử 32P]ATP.

- ng d ng chínhỨ ụ

+ Đánh d u phóng x đ u 5’ c a DNA đ phân tích trình t b ng ph ng phápấ ạ ầ ủ ể ự ằ ươ Maxam và Gilbert (1977), dùng làm m u dò trong các k thu t lai phân t (xem ch ngẫ ỹ ậ ử ươ 5).

+ Phosphoryl hóa các đo n n i (linker) và các đo n DNA không có nhóm 5’ạ ố ạ phosphate đ chu n b cho ph n ng g n trong ph ng pháp t o dòng.ể ẩ ị ả ứ ắ ươ ạ

4. Alkaline phosphatase

(E. coli và ru t bê)ộ

C hai enzyme alkaline c a vi khu n (bacteria alkaline phosphatase, BAP) và ru tả ủ ẩ ộ bê (calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) đ u xúc tác lo i b nhóm 5’ phosphateề ạ ỏ kh i DNA và RNA.ỏ

- ng d ng chínhỨ ụ

+ Lo i b nhóm 5’ phosphate kh i DNA ho c RNA tr c khi đánh d u đ u 5’ạ ỏ ỏ ặ ướ ấ ầ b ng ằ 32P.

+ Lo i b nhóm 5’ phosphate kh i các đo n DNA đ ngăn c n s t g n. Trongạ ỏ ỏ ạ ể ả ự ự ắ k thu t t o dòng, khi m t vector đ c m vòng DNA b ng m t RE r i sau đó đ cỹ ậ ạ ộ ượ ở ằ ộ ồ ượ lo i b nhóm 5’ phosphate thì nó không th t g n l i (t tái t o l i vòng). Ch khi cóạ ỏ ể ự ắ ạ ự ạ ạ ỉ đo n DNA ngo i lai mang các đ u 5’ phosphate c n thi t đ c đ a vào thì ph n ngạ ạ ầ ầ ế ượ ư ả ứ g n gi a vector và DNA ngo i lai m i x y ra.ắ ữ ạ ớ ả

IV. Các enzyme phân c tắ

Là nhóm các enzyme xúc tác th y phân liên k t phosphodiester trong phân tủ ế ử DNA ho c RNA, bao g m các endonuclease (c t bên trong phân t nucleic acid) vàặ ồ ắ ử exonuclease (c t bên ngoài phân t nucleic acid). Các RE cũng là các endonuclease,ắ ử nh ng chúng có tính đ c hi u r t cao cho t ng trình t 4 ho c 6 nucleotide. D i đâyư ặ ệ ấ ừ ự ặ ướ là các nuclease chính th ng đ c s d ng:ườ ượ ử ụ

1. Deoxyribonuclease I (DNase I)

(T y bò)ụ

DNase I xúc tác th y phân DNA s i đ n ho c s i đôi các liên k tủ ợ ơ ặ ợ ở ế phosphodiester n m bên c nh các pyrimidine nucleotide, t o ra các oligonucleotide vàằ ạ ạ các oligonucleotide có đ u t n cùng 5' monophosphate. Khi có m t Mgầ ậ ặ 2+, DNase I tác d ng đ c l p trên m i s i DNA, và các v trí c t đ c phân b ng u nhiên.ụ ộ ậ ỗ ợ ị ắ ượ ố ẫ

Khi có m t Mnặ 2+, DNase I s c t c hai s i DNA g n nh cùng m t v trí đẽ ắ ả ợ ầ ư ở ộ ị ể t o ra các đo n DNA đ u b ng ho c đ u l i nh ng ch nhô ra m t ho c haiạ ạ ầ ằ ặ ầ ồ ư ỉ ộ ặ nucleotide.

- ng d ng chínhỨ ụ

+ T o ra các đi m đ t (nick) trên DNA s i đôi đ đánh d u m u dò đ ng vạ ể ứ ợ ể ấ ẫ ồ ị phóng x b ng ph ng pháp d ch chuy n đi m đ t.ạ ằ ươ ị ể ể ứ

+ T o ra các dòng ng u nhiên đ phân tích trình t trong bacteriophage M13ạ ẫ ể ự vector.

+ Phân tích ph c h p protein:DNA (DNase footprinting).ứ ợ

+ Lo i b DNA trong các phân đo n RNA hay protein.ạ ỏ ạ

2. Nuclease S1

(Aspergillus oryzae)

Enzyme nuclease S1 căt DNA s i đ n hoăc RNA đê tao ra đâu 5’ monophosphate ợ ơ hoăc cac oligonucleotide. DNA s i đôi va thê lai DNA:RNA it chiu tac dung cua enzyme ợ nay. Tuy nhiên, cac nucleic acid s i đôi se bi nuclease S1 căt hoan toan nêu chung bi x ợ ử ly v i môt l ng rât l n enzyme. Môt l ng v a đu cua enzyme se tach cac nucleic acid ớ ượ ớ ượ ừ s i đôi cac điêm đ t hoăc cac lô hông nho thanh hai hoăc nhiêu đoan.ợ ở ứ

- ng d ng chínhỨ ụ

+ Phân tich câu truc thê lai DNA:RNA.

+ Loai bo cac ph n s i đ n trên đ u sole ra khoi đoan DNA s i đôi đê tao ra cac ầ ợ ơ ầ ợ đâu băng.

+ M vong căp toc xuât hiên trong qua trinh tông h p cDNA s i đôi.ở ợ ợ

M t enzyme có ho t tính t ng t nuclease S1 là mung-bean nucleaseộ ạ ươ ự (endonuclease) đ c tách chi t t m m đ u xanh (ượ ế ừ ầ ậ Phaseolus aureus).

3. Exonuclease III (Exo III)

(E. coli)

Exo III xúc tác lo i b các 5’ mononucleotide t đ u 3’ OH c a DNA s i đôiạ ỏ ừ ầ ủ ợ (DNA m ch th ng ho c m ch vòng ch a các đi m đ t ho c l h ng). Ho t tínhạ ẳ ặ ạ ứ ể ứ ặ ỗ ổ ạ enzyme cho k t qu t o thành các vùng s i đ n dài trong DNA s i đôi. Enzyme này cóế ả ạ ợ ơ ợ 3 ho t tính khác nhau: endonuclease đ c hi u cho apurinic DNA, RNase H và 3’ạ ặ ệ phosphatase (lo i b đ u 3’ phosphate nh ng không c t các liên k t phosphodiester bênạ ỏ ầ ư ắ ế trong). Exo III không c t các DNA s i đ n ho c DNA s i đôi có đ u l i 3’.ắ ợ ơ ặ ợ ầ ồ

- ng d ng chínhỨ ụ

+ T o ra các c u trúc s i đ n m t s vùng trên phân t DNA dùng làm c ch tạ ấ ợ ơ ở ộ ố ử ơ ấ cho đo n Klenow c a DNA polymerase I (đ s n xu t m u dò đ c tr ng cho t ngạ ủ ể ả ấ ẫ ặ ư ừ s i).ợ

+ T o ra các đ t bi n khuy t đo n (deletion) t i các trình t t n cùng c a DNAạ ộ ế ế ạ ạ ự ậ ủ s i đôi m ch th ng. ợ ạ ẳ Ph n ng này th ng ph i h p v i mung-bean nuclease ho cả ứ ườ ố ợ ớ ặ nuclease S1.

M t exonuclease t ng t là nuclease BAL31, có ho t tính exonuclease 5’ộ ươ ự ạ →3’ và 3’→5’, có kh năng t o các DNA s i đôi đ u b ng mà không c n s hi n di n c aả ạ ợ ầ ằ ầ ự ệ ệ ủ nuclease S1.

4. Ribonuclease (RNase A)

(T y bò)ụ

Enzyme xúc tác th y phân RNA thành các đo n nh h n. RNase A có ho t tínhủ ạ ỏ ơ ạ r t m nh, hi n di n m i n i và r t b n v ng (không b m t ho t tính khi b x lý ấ ạ ệ ệ ở ọ ơ ấ ề ữ ị ấ ạ ị ử ở 90°C trong 1 gi ). RNase A c t liên k t phosphodiester n m ngay sau m t pyrimidineờ ắ ế ằ ộ c a m t RNA s i đ n.ủ ộ ợ ơ

- ng d ng chínhỨ ụ

+ Lo i b RNA trong các ch ph m DNA hay protein.ạ ỏ ế ẩ

+ Lo i b các vùng không b t c p trên RNA trong th lai RNA:DNA.ạ ỏ ắ ặ ể

5. RNase H

Enzyme RNase H là m t lo i ribonuclease có kh năng c t liên k t 3’-O-P c aộ ạ ả ắ ế ủ RNA trong s i đôi c a th lai DNA:RNA đ t o ra các s n ph m có đ u t n cùng 3’-ợ ủ ể ể ạ ả ẩ ầ ậOH và 5’-PO4. RNase H là m t endonuclease không đ c hi u, xúc tác c t RNA thôngộ ặ ệ ắ qua c ch th y phân nh m t ion kim lo i hóa tr 2 liên k t v i enzyme.ơ ế ủ ờ ộ ạ ị ế ớ

Trong t o dòng phân t , RNase H xúc tác c t đ c hi u RNA trong th l iạ ử ắ ặ ệ ể ạ RNA:DNA mà không c t DNA ho c RNA không trong th lai, enzyme này th ngắ ặ ở ể ườ đ c dùng đ phá h y khuôn m u RNA sau khi t ng h p s i cDNA th nh t b ngượ ể ủ ẫ ổ ợ ợ ứ ấ ằ phiên mã ng c, đ ti p t c t ng h p s i cDNA th hai t o thành m t s i đôi cDNA.ượ ể ế ụ ổ ợ ợ ứ ạ ộ ợ

V. Cac protein liên kêt DNA s i đ n ợ ơ

Cac protein liên k t DNA s i đ n (single stranded DNA-binding proteins, SSB) ế ợ ơ kêt h p v i DNA s i đ n nh ng không kêt h p v i DNA s i đôi. Chung đ c xem nhợ ớ ợ ơ ư ợ ớ ợ ượ ư la cac chât phan ng trong tao dong phân t xuât phat t chô chung co kha năng pha v ứ ử ừ ơ s ôn đinh cua cac câu truc th câp bên trong s i nucleotide; tăng nhanh s tai u cua cacự ứ ợ ự polynucleotide bô sung va tăng hoat tinh cua cac enzyme DNA polymerase băng cach loai bo cac câu truc th câp bên trong s i la nh ng yêu tô ngăn can s tiên triên cua cac ứ ợ ữ ự enzyme nay. Nh tinh chât nay, cac protein SSB tr thanh cac chât phan ng h u ich ờ ở ứ ữ trong xac đinh trinh t DNA. ự

- ng d ng chínhỨ ụ

+ Phat sinh đôt biên điêm tr c tiêp bao gôm D-loops. ự

+ Tăng chiêu dai chuôi cua san phâm trong moi phan ng đ c xuc tac b i DNA ứ ượ ở polymerase trên cac khuôn mâu dai. Cac protein SSB đăc biêt co thê kich thich cac DNA polymerase đăc hi u dung trong cac phan ng phân tich trinh t chuôi DNA. ệ ứ ự

Tai liêu tham kh o/đ c thêm ả ọ

1. H Huỳnh Thùy D ng. ồ ươ 1998. Sinh h c phân t . ọ ử NXB Giáo d cụ , Hà N i.ộ

2. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl

K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.

3. Brown TA. 2001. Gene Cloning-An Introduction. 4th ed. Blackwell Science, Oxford,

UK.

4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and

Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA.

5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory

Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA.

6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood

Cliffs, New Jersey, USA.

7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed.

Blackwell Science, Oxford, UK.

Ch ng 2ươ

Điên di gel

I. Nguyên lý chung

Điên di la ky thuât đ c dùng đ phân tách và m t đôi khi đ tinh s ch cac đ i ượ ể ộ ể ạ ạ phân t -đ c bi t là các protein và cac nucleic acid-trên c s kích th c/khôi l ng,ử ặ ệ ơ ở ướ ượ điên tich và c u hình cua chung. ấ

Khi các phân t tích đi n đ c đ t trong m t đi n tr ng, chúng s d ch chuy nử ệ ượ ặ ộ ệ ườ ẽ ị ể h ng đ n c c d ng (+) ho c c c âm (-) tùy theo đi n tích c a chúng. Ng c v iướ ế ự ươ ặ ự ệ ủ ượ ớ protein, lo i phân t có đi n tích th c ho c d ng ho c âm, các nucleic acid có m tạ ử ệ ự ặ ươ ặ ộ đi n tích âm không đ i nh khung phosphate c a mình, và vì th ch d ch chuy nệ ổ ờ ủ ế ỉ ị ể h ng đ n c c d ng.ướ ế ự ươ

Các phân t protein và nucleic acid có th đ c ch y đi n di trên m t khuôn đử ể ượ ạ ệ ộ ơ (support matrix) nh gi y, cellulose acetate, gel tinh b t, agarose ho c polyacrylamideư ấ ộ ặ

gel. Trong đó gel c a agarose và polyacrylamide đ c s d ng ph bi n nh t. Thôngủ ượ ử ụ ổ ế ấ th ng, gel là m t khuôn đúc d ng phi n m ng có các gi ng đ n p (loading) m u.ườ ộ ạ ế ỏ ế ể ạ ẫ Gel đ c ngâm trong đ m đi n di cung c p các ion đ d n truy n dòng đi n và m tượ ệ ệ ấ ể ẫ ề ệ ộ vài lo i đ m đ duy trì pH m t giá tr không đ i t ng đ i.ạ ệ ể ở ộ ị ổ ươ ố

II. Điên di agarose gel

Agarose (polysaccharide) có kh i l ng phân t x p x 120.000 Da (Hình 2.1) làố ượ ử ấ ỉ m t trong hai thành ph n chính c a agarộ ầ ủ 1 chi m kho ng 70%, ph n kia là agaropectinế ả ầ chi m kho ng 30%. Agarose là m t polymer m ch th ng không b sulphate hóa ch aế ả ộ ạ ẳ ị ứ hai g c xen k nhau là ố ẽ D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose. Agarose gel là m t ch tộ ấ trong su t (transparent) ho c trong m (transluent) gi ng nh agar, đ c t o thành khiố ặ ờ ố ư ượ ạ h n h p agarose và n c (ho c đ m đi n di) đ c đun nóng t i >100ỗ ợ ướ ặ ệ ệ ượ ớ oC và sau đó đ c làm l nh; d ng gel xu t hi n kho ng 40-45ượ ạ ạ ấ ệ ở ả oC. Agarose gel đ c ng d ngượ ứ ụ r ng rãi đ làm giá th cho các nucleic acid trong k thu t đi n di ngang (horizontalộ ể ể ỹ ậ ệ electrophoresis) ho c làm giá th cho môi tr ng nuôi c y bacteriophage (top agarose).ặ ể ườ ấ

Hình 2.1. C u trúc phân t c a agarose. ấ ử ủ Đ n v agarobiose (ví d : hai phân t đ ng) làơ ị ụ ử ườ m t monomer trong agarose polymer. Có kho ng 400 monomer trên m t chu i polymer.ộ ả ộ ỗ

Cac phân t nucleic acid co khôi l ng va điên tich khac nhau đ c tach ra khi di ử ượ ượ chuyên t c c âm sang c c d ng cua hê điên di trong môt điên tr ng co điên thê va ừ ự ự ươ ườ c ng đô thich h p. Ky thuât nay đ n gian va th c hiên nhanh. H n n a, vi tri cuaườ ợ ơ ự ơ ữ DNA trong gel đ c xac đinh tr c tiêp: cac băng DNA trong gel đ c nhuôm nông đôượ ự ượ ở thâp cua thuôc nhuôm huynh quang ethidium bromide (EtBr) và co thê phát hi n d i ệ ướ anh sang t ngoai (ultraviolet-UV ử ).

Điên di agarose gel đ c s d ng trong các tr ng h p sau: ượ ử ụ ườ ợ

- c l ng kích th c c a các phân t DNA sau khi th c hi n ph n ng c tƯớ ượ ướ ủ ử ự ệ ả ứ ắ h n ch (ví d : l p b n đ h n ch c a DNA đ c t o dòng…).ạ ế ụ ậ ả ồ ạ ế ủ ượ ạ

- Phân tích các s n ph m PCR (ví d : trong ch n đoán di truy n phân t ho c inả ẩ ụ ẩ ề ử ặ d u di truy n…). ấ ề

- Phân tách DNA h gen đã đ c c t h n ch tr c khi th m tích Southern, ho cệ ượ ắ ạ ế ướ ẩ ặ RNA tr c khi th m tích Northern.ướ ẩ

u đi m c a ph ng pháp này là gel đ c rót d dàng, không gây bi n tínhƯ ể ủ ươ ượ ễ ế m u, và b n v ng v t lý h n polyacrylamide. M u cũng d thu h i. Nh c đi m làẫ ề ữ ậ ơ ẫ ễ ồ ượ ể agarose gel có th b nóng ch y trong quá trình đi n di, đ m có th b tiêu hao, và cácể ị ả ệ ệ ể ị d ng khác nhau c a nucleic acid có th ch y không n đ nh.ạ ủ ể ạ ổ ị

1. Cac y u t anh h ng đên tôc đô dich chuyên điên ế ố ươ di trong agarose gel1.1. Kich th c cua phân t ướ ử

Cac phân t DNA mach thăng s i đôi đi qua ban gel cac tôc đô ty lê nghich v i ử ợ ở ớ ham log 10 cua kh i l ng phân t cua chung (Hinh 2.2). Do đó, các phân t DNA có ố ượ ử ử kích th c càng l n (kh i l ng phân t l n) thì t c đ d ch chuy n càng ch m.ướ ớ ố ượ ử ớ ố ộ ị ể ậ

Hinh 2.2. Môi quan hê gi a kich th c ữ ướ DNA va đ linh đông điên di cua no ộ

1.2. Nông đô agarose

Đoan DNA mang kich th c nh t đinh s dich chuyên cac tôc đô khac nhau qua ướ ấ ẽ ở cac ban gel ch a cac nông đô agarose khac nhau. Môi quan hê tuyên tinh gi a ham ứ ữ logarithm cua đô linh đông điên di cua DNA ( µ) va nông đô gel ( τ ) đ c biêu di n b ngượ ễ ằ bi u th c:ể ứ

Trong đó

µo: đô linh đông điên di t do. ự

Kr: hê sô trì hoãn đi n di (retardation), đ c thiêt lâp thông qua môi liên quan gi a cac ệ ượ ữ

tinh chât cua gel v i hinh dang va kich th c cua cac phân t dich chuyên. ớ ướ ử

Nh vây, dung gel cac nông đô khac nhau co thê phân tách đ c cac đoan DNAư ở ượ co kich th c khac nhau (Bang 2.1). N ng đ agarose cao có kh năng phân tách các ướ ồ ộ ả đo n DNA nh , trong khi đó n ng đ agarose th p l i cho phép phân tách các đo nạ ỏ ồ ộ ấ ạ ạ DNA l n h n.ớ ơ

Bang 2.1. Cac thông sô điên di DNA băng agarose gel

Hình 2.3 minh h a s d ch chuy n c a t p h p các đo n DNA trong hai m u ọ ự ị ể ủ ậ ợ ạ ẫ ở ba n ng đ khác nhau c a agarose, t t c chúng trong m t khay gel và đ c đi n diồ ộ ủ ấ ả ở ộ ượ ệ

cùng m t đi n áp (voltage) trong m t th i gian xác đ nh. K t qu cho th y, các đo nở ộ ệ ộ ờ ị ế ả ấ ạ l n đ c phân tách t t h n gel 1%, trong khi các đo n nh thích h p v i gel 2%.ớ ượ ố ơ ở ạ ỏ ợ ớ

Hình 2.3. Đi n di các m u DNA gi ng nhau các n ng đ agarose khác nhau.ệ ẫ ố ơ ồ ộ A: 1%, B:

1,5% và C: 2%.

1.3. Câu hinh cua DNA

Cac DNA dang vong đong (form-I), vong đ t (form-II) va mach thăng (form-III) co ứ cung môt kh i l ng phân t se dich chuyên trên agarose gel cac tôc đô khac nhau. ố ượ ử ở Nhìn chung, DNA c a các plasmid m ch vòng d ch chuy n nhanh h n DNA c aủ ạ ị ể ơ ủ plasmid cùng lo i nh ng có d ng m ch th ng. H u h t plasmid m ch vòng ch a ítạ ư ạ ạ ẳ ầ ế ạ ứ nh t hai d ng DNA có c u trúc không gian khác nhau là d ng vòng đóng (siêu xo n) vàấ ạ ấ ạ ắ vòng đ t. Hình 2.4 minh h a k t qu đi n di v i plasmid m ch vòng bên trái vàứ ọ ế ả ệ ớ ạ plasmid cùng lo i m ch th ng bên ph i.ạ ạ ẳ ở ả

Hình 2.4. Đi n di các plasmid có c u hình khác nhauệ ấ

1.4. Thanh phân base va nhiêt đô

Tâp tinh điên di cua DNA trong agarose gel không bi anh h ng ro rêt b i thanh ưở ở phân base cua DNA hoăc nhiêt đô ma đo gel đ c chay. Trong agarose gel, tinh linh ở ượ đông điên di t ng đôi cua cac đoan DNA co kich th c khac nhau không thay đôi trong ươ ướ kho ng t 4ả ừ oC đ n 30ế oC. Noi chung, agarose gel th ng đ c chay nhiêt đô phong. ườ ượ ở

2. Ph ng phap điên di agarose gelươ

2.1. Đêm pH

Môt sô đêm điên di thich h p cho DNA s i đôi th ng đ c dùng la Tris-acetate- ợ ợ ườ ượ EDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) nông đôở khoang 50 mM va pH 7,5-7,8 (B ng 2.2). Th ng do thoi quen, TAE đ c s dung ả ườ ượ ử nhiêu nhât, nh ng kha năng đêm cua no lai thâp. Đêm TBE và TPE đêu co kha năng hoa ư tan tôt cac đoan DNA va co kha năng đêm cao h n môt cach ro rêt. Các đo n DNA s ơ ạ ẽ d ch chuy n v i các t c đ h i khác nhau m t chút trong ba lo i đ m trên do s khácị ể ớ ố ộ ơ ộ ạ ệ ự nhau v c ng l c ion c a đ m. Đ m không nh ng thi t l p m t giá tr pH, mà cònề ườ ự ủ ệ ệ ữ ế ậ ộ ị cung c p các ion đ h tr cho đ d n (conductivity). N u chúng ta dùng n c thay vìấ ể ỗ ợ ộ ẫ ế ướ là đ m trong quá trình đi n di, thì s không có s d ch chuy n c n thi t c a DNAệ ệ ẽ ự ị ể ầ ế ủ trong gel. Ng c l i, n u s d ng đ m n ng đ đ m đ c (ví d : dung d ch stock ×10),ượ ạ ế ử ụ ệ ồ ộ ậ ặ ụ ị thì nhi t đ trong gel có th tăng cao và làm nóng ch y nó.ệ ộ ể ả

2.2. Chuân bi agaro se gel

Co nhiêu loai agarose khac nhau thich h p đê chay điên di, loai agarose dung tôt ợ nhât trong thi nghiêm la type-II-agarose co nôi thâm thâu thâp (low-endo-osmotic). No dê dang chay ra va tao thanh môt dung dich trong suôt, kêt qua la gel đan hôi thâm chi cac ở nông đô thâp. Tuy nhiên, type-II-agarose dê bi bân b i sulphate polysaccharides (SP), ở h n n a SP con c chê cac enzyme nh ligase, polymerase va RE. Vi thê, cac đoan DNAơ ữ ứ ư dung ly t nh ng gel nh thê phai đ c lam sach cân thân tr c khi chung đ c dungừ ữ ư ượ ướ ượ nh la cac khuôn mâu hoăc c chât cho cac enzyme nay.ư ơ

Bang 2.2. Cac đêm s dung phô biên trong điên di ư

2.3. Nhuôm DNA trong agarose gel

Ph ng phap quan sat DNA trong agarose gel thuân l i nhât la dung thuôc nhuômươ ợ

huynh quang EtBr. EtBr đ c dung đê phát hi n DNA s i đôi va RNA s i đ n. Tuy ượ ệ ợ ợ ơ

nhiên, ai l c (affinity) cua thuôc nhuôm đôi v i nucleic acid s i đ n la t ng đôi thâp ự ớ ợ ơ ươ

va co hiêu suât huynh quang không cao. Sau khi nhu m, EtBr s xen vào gi a các base ộ ẽ ữ

c a nucleic acid và cho phép phát hi n d dàng chúng trong gel. ủ ệ ễ ở

Th ng EtBr (0,5 ườ µg/mL) đ c đ a vao trong agarose gel đ ph n ng nhu mượ ư ể ả ứ ộ

x y ra trong su t quá trình đi n di. Măc du tinh linh đông điên di cua DNA s i đôi machả ố ệ ợ

thăng giam khi co măt thuôc nhuôm (khoang 15%), nh ng kha năng xac đinh gel tr c ư ự

tiêp d i anh sang UV trong suôt qua trinh đi n di hoăc giai đoan cuôi co u thê ro ướ ệ ở ư rêt. Tuy nhiên, nêu cân co thê ch y đi n di gel không co EtBr va chi nhuôm DNA ho c ạ ệ ặ

RNA sau khi điên di xong. Gel đ c ngâm trong đêm điên di hoăc H ượ 2O ch a EtBr (0,5ứ

µg/mL)/45 phut nhiêt đô phong. ở

Chu y

Ethidium bromide la môt tac nhân gây đôt biên manh. Vì th , luôn luôn đeo găng tay ế

khi câm gel hoăc dung dich ch a thuôc nhuôm. ứ

2.4. Thu hôi DNA t agarose gel ừ

Nhiêu ph ng phap đa đ c xây d ng đê thu hôi DNA t agarose gel, nh ng ươ ượ ự ừ ư

không co ph ng phap nao la hoan toan tôi u. Co hai vân đê chinh: th nhât đa sô ươ ư ứ cac loai agarose đêu bi nhiêm bân b i sulphate polysaccharides, cac san phâm sau đo ở đ c chiêt t gel cung v i DNA, chung la nhân tô c chê co ho t tính cua nhiêu loaiượ ừ ớ ứ ạ enzyme (RE, ligase, kinase, polymerase) dung trong cac b c tao dong tiêp theo sau; ướ

th hai hiêu suât chiêt DNA t agarose gel phu thuôc vao kh i l ng phân t cuaứ ừ ố ượ ử

no, cac đoan DNA co chiêu dai <1 kb co thê đ c thu hôi hoàn toàn, khi kh i l ng ượ ố ượ

phân t cua DNA tăng thi hiêu suât chiêt giam, cac đoan DNA co kich th c >20 kbử ướ

đ c thu hôi kem (khoang h n 20% san l ng). Có nhi u ph ng pháp thu h i vàượ ơ ượ ề ươ ồ

tinh s ch DNA t agarose gel, d i đây là m t vài ph ng pháp chính:ạ ừ ướ ộ ươ

2.4.1. Dùng agarose có nhi t đ nóng ch y th p (low melting temperature) ệ ộ ả ấ

M u agarose gel có nhi t đ nóng ch y th p ch a đo n DNA quan tâm đ c c t raẫ ệ ộ ả ấ ứ ạ ượ ắ kh i b n gel và cho vào trong đ m v i t l 1:1, b sung mu i đ n n ng đ 0,5 M, sau đóỏ ả ệ ớ ỷ ệ ổ ố ế ồ ộ đ c nóng ch y 70ượ ả ở oC đ hòa tan hoàn toàn trong đ m. Dung d ch gel có DNA đ cể ệ ị ượ chi t b ng phenol/chloroform và k t t a. L u ý DNA đ c tách chi t b ng ph ng phápế ằ ế ủ ư ượ ế ằ ươ này không thích h p cho m i ph ng th c thao tác ti p theo, do s hi n di n c a các nhânợ ọ ươ ứ ế ự ệ ệ ủ t c ch trong agarose.ố ứ ế

2.4.2. Ly tâm

M u agarose gel có ch a băng DNA quan tâm đ c c t ra và cho vào đ m chi t,ẫ ứ ượ ắ ệ ế làm nóng đ hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung d ch gel lên trên m t l p (màng) bôngể ị ộ ớ th y tinh đã silicon hóa đ t trong m t c t l c nh lo i 0,5 mL (còn g i là spin column).ủ ặ ộ ộ ọ ỏ ạ ọ C t này đ c cho vào m t tube vi ly tâm lo i 1,5 mL và đ c ly tâm t c đ caoộ ượ ộ ạ ượ ở ố ộ 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút. DNA s liên k t v i màng còn dung d ch đ m sẽ ế ớ ị ệ ẽ đi qua l p bông th y tinh vào tube vi ly tâm. Cho đ m r a vào c t và r a c t vài l nớ ủ ệ ử ộ ử ộ ầ b ng cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm m i, cho đ m hòa tan DNA vào c t và lyằ ớ ệ ộ tâm đ dung ly (elution) DNA ra kh i màng vào tube. Dung d ch DNA thu đ c có thể ỏ ị ượ ể đ c tinh s ch thêm n u c n. Cũng có th đông l nh m u gel tr c khi dùng ph ngượ ạ ế ầ ể ạ ẫ ướ ươ pháp ly tâm đ c i thi n hi u su t thu h i DNA.ể ả ệ ệ ấ ồ

2.4.3. Đi n di vào b y ệ ẫ

M t cái rãnh nh đ c c t trong agarose gel ngay phía tr c c a băng DNA quanộ ỏ ượ ắ ướ ủ tâm. Rãnh này đ c làm đ y b ng glycerol và gel đ c đi n di nhanh tr l i đượ ầ ằ ượ ệ ở ạ ể

chuy n DNA t gel vào trong dung d ch glycerol (quá trình đi n di có th đ c ki mể ừ ị ệ ể ượ ể soát b ng UV). Dung d ch glycerol-DNA sau đó đ c chi t b ng pipette.ằ ị ượ ế ằ

Ho c sau khi đi n di, m t khe nh đ c c t trong gel ngay phía tr c băng DNAặ ệ ộ ỏ ượ ắ ướ quan tâm và đ t trong khe m t m u gi y lo i NA-45. Gel sau đó đ c đi n di tr l iặ ộ ẫ ấ ạ ượ ệ ở ạ và băng DNA quan tâm s d ch chuy n vào trong m u gi y. M u gi y sau đó đ c r aẽ ị ể ẫ ấ ẫ ấ ượ ử và DNA đ c dung ly trong đ m b ng cách đun nóng m u gi y t i 70ượ ệ ằ ẫ ấ ớ oC. DNA sau đó có th đ c tách chi t b ng phenol và k t t a.ể ượ ế ằ ế ủ

2.4.4. Dùng h t th y tinh ạ ủ

M u gel quan tâm đ c hòa tan trong dung d ch mu i NaI (m t lo i chaotropicẫ ượ ị ố ộ ạ salt) n ng đ kho ng 4 M. Các h t th y tinh sau đó đ c b sung vào dung d ch đở ồ ộ ả ạ ủ ượ ổ ị ể liên k t hi u qu v i các đo n DNA đ c phóng thích n ng đ đã cho c a NaI.ế ệ ả ớ ạ ượ ở ồ ộ ủ RNA, protein và các t p ch t khác không liên k t v i các h t th y tinh. Ti p theo làạ ấ ế ớ ạ ủ ế các chu kỳ r a và k t t a ti u th , DNA tinh s ch đ c dung ly kh i h t th y tinhử ế ủ ể ể ạ ượ ỏ ạ ủ trong đ m mu i th p. Tuy nhiên, ph ng pháp này m c dù nhanh và hi u qu nh ngệ ố ấ ươ ặ ệ ả ư l i có ph m vi t i u h p. Thu h i các đo n DNA nh (500-800 bp) là không hi u quạ ạ ố ư ẹ ồ ạ ỏ ệ ả l m và các đo n l n (>15 kb) có th liên k t v i các h t th y tinh khác nhau và các s iắ ạ ớ ể ế ớ ạ ủ ợ DNA có th b phá v trong su t các chu kỳ r a.ể ị ơ ố ử

3. Quy trinh điên di

3.1. Chuân bi agarose gel

Cho 1% type-II-agarose vao 100 mL đêm 0,5 × TAE (nêu khuôn đ gel l n thi tăng ổ ớ theo ty lê trên). Đun trong n i kh trùng hoăc lò vi sóng cho đên khi agarose tan hoan ồ ử toan. Nêu qua trinh đun mât n c qua nhiêu thi phai thêm n c cho đu 100 mL. Đê ướ ướ nguôi khoang 60 oC va đô vao bu ng điên di co cai s n l c. Chiêu day gel khoang 5 ồ ẵ ượ mm la thich h p. Sau 30-40 phut, khi gel đa đông c ng, co thê g l c ra. ợ ứ ơ ượ

3.2. Đăt mâu DNA vao giêng

Tuy thuôc vao t ng muc đich điên di khac nhau co thê s dung nông đô DNA cao ừ ử hoăc thâp. Chăng han theo ty lê sau:

DNA (1 µg/1 µL) 1 µL Đêm mau bromophenol ( ×10 loading dye)

1 µL

N c cât 2 lânướ 9 µL T ng sổ ố 11 µ L

Dung micropipette hut 11 µL dung dich trên cho vao giêng. L u ý mâu chay điên ư di phai co dung tich ≤ thê tich cua giêng.

Th ng đăt mâu sau khi đa đô dich đêm 0,5ườ × TAE vao bu ng điên di cho ngâp gel, ồ it khi đăt mâu tr c rôi đô đêm sau (nap khô). Đê dê lam viêc nên dung micropipette ướ lo i 20-200 ạ µL va đăt bu ng điên di trên ban co nên đen. Khi tăng đi n áp c a quá trình ồ ệ ủ đi n di, các đo n DNA l n th ng d ch chuy n nhanh h n so v i các đo n nh . Tuyệ ạ ớ ườ ị ể ơ ớ ạ ỏ nhiên, đ có đ phân gi i (resolution) t t nh t đ i v i các đo n DNA có kích th cể ộ ả ố ấ ố ớ ạ ướ l n h n 2 kb thì điên áp đ c s d ng ph i nh h n 5 V/cm (giá tr cm đ c tinh theoớ ơ ượ ử ụ ả ỏ ơ ị ượ khoang cach gi a hai điên c c ch không ph i là chi u dài c a gel). DNA d ch chuyên ữ ự ứ ả ề ủ ị t c c âm đên c c d ng. Quan sat s d ch chuyên băng mau bromophenol đê biêt lucừ ự ự ươ ự ị nao cân ng ng điên di (Hình 2.5). ừ

3.3. Nhuôm DNA băng EtBr

Sau khi chay điên di xong lây nhe ban gel ra khoi khuôn va ngâm vao dung dich EtBr

nông đô 0,5 µg/mL, trong th i gian 30-45 phut, tôt nhât trên m t may lăc nhe (đô 10 vong/ờ ộ phut ). Đô dich nhuôm EtBr vao m t binh riêng đê x ly va r a ban gel băng cach ngâm ộ ử ử

trong n c cât hai lân, môi lân 15-20 phut. EtBr th ng pha săn dang đâm đăc 5 mg/mLướ ườ ở

va gi 4 ữ ở oC trong tôi.

Hình 2.5. S đ minh h a các b c trong quá trình đi n di agarose gelơ ồ ọ ướ ệ

3.4. Quan sat va chup anh

Ban gel sau khi nhuôm EtBr đ c quan sat d i anh sang t ngoai ( ượ ướ ử λ = 302 nm)

(Hình 2.6). Dung thiêt bi chuyên dung đ phân tích và l u tr hình nh DNA (Gel ể ư ữ ả

Documentation System).

Chu y

Không nhin vao anh sang t ngoai nêu không co kinh loc thich h p. ử ợ

Hình 2.6. Hình nh đi n di DNA ch y trên agarose gel 1%, 3 Volts/cm và nhu m b ngả ệ ạ ộ ằ

EtBr. Các băng DNA có màu sáng. SM: Chu n kích th c c a DNA (1 kb ladder). Các đ ngẩ ướ ủ ườ

1, 2 và 3: m u plasmid DNA đ c c t b ng 3 enzyme h n ch khác nhau.ẫ ượ ắ ằ ạ ế

III. Điên di polyacrylamide gel

Acrylamide la môt monomer co câu truc nh sau: ư

Khi co măt cac gôc t do, đ c cung câp b i ammonium persulphate va ôn ự ượ ở đinh b i TEMED ( ở N,N,N’,N’-tetramethylethylene-diamine), phan ng chuôi đ c ứ ượ băt đâu trong đo cac acrylamide monomer đ c polymer hoa (trung h p) thanh môt ượ ợ chuôi dai. Khi bisacrylamide ( N,N’-methylenebisacrylamide) đ c bô sung trongượ phan ng polymer hoa, cac chuôi se liên kêt cheo (cross-linking) đê tao thanh dang ứ gel. Đô xôp cua gel đ c xac đinh b i chiêu dai cua chuôi va m c đô liên kêt cheo. ượ ở ứ Chiêu dai cua chuôi polyacrylamide đ c xac đinh băng nông đô acrylamide trong phan ượ

ng polymer hoa (gi a 3,5% va 20%).ứ ữ

Ngoài protein, polyacrylamide gel cũng đ c dùng đ đi n di DNA (k c RNAượ ể ệ ể ả và DNA/RNA). Gel phai đ c rot vao gi a hai tâm kinh (gel plates) đ c ngăn cach b i ượ ữ ượ ở cac miêng đêm (gel spacers) (Hình 2.7). Hâu hêt cac dung dich acrylamide đ c ngăn ượ không tiêp xuc v i không khi đê han chê s c chê trung h p gây ra b i oxygen. Gel co ớ ự ứ ợ ở thê dai t 10-100 cm tuy thuôc vao yêu câu phân tich va chung th ng đ c chay trong ừ ườ ượ ph ng thăng đ ng.ươ ứ

Hình 2.7. S đ và hình nh c a bu ng đi n di polyacrylamide gelơ ồ ả ủ ồ ệ

Ph m vi kích th c phân t và đ phân gi i c a quá trình phân tách tùy thu cạ ướ ử ộ ả ủ ộ vào n ng đ c a acrylamide và bis-acrylamide (và t l c a chúng) do chúng t o raồ ộ ủ ỷ ệ ủ ạ khuôn gel v i các ph n trăm khác nhau c a acrylamide và b c c a liên k t chéo. N ngớ ầ ủ ậ ủ ế ồ đ th p t o ra các l có kích th c l n h n và vì th có th phân tách các phân t l nộ ấ ạ ỗ ướ ớ ơ ế ể ử ớ h n. Liên k t chéo c a các monomer và các tác nhân liên k t có th đ c đi u ch nhơ ế ủ ế ể ượ ề ỉ đ ki m soát m c đ x p c a khuôn gel. Đi u này cho phép t i u hóa m t khuôn gelể ể ứ ộ ố ủ ề ố ư ộ đ phân tách m t ph m vi kích th c đ c bi t c a các phân t protein.ể ộ ạ ướ ặ ệ ủ ử

1. Đi n di nucleic acidệ

Đi n di polyacrylamide gel đ c dung đê phân tách va thu h i cac đoan DNAệ ượ ồ co chiêu dai t 5-2.000 bp. N ng đ polyacrylamide gel đ c s d ng trong kho ng ừ ồ ộ ượ ử ụ ả t 3,5-20% tuy thuôc vao kich th c cua đoan DNA quan tâm. Hai loaiừ ướ polyacrylamide gel th ng đ c s dung la:ườ ượ ử

- Polyacrylamide gel không biên tinh dung đê phân tách va tinh sach cac đoan DNA s i đôi. ợ

- Polyacrylamide gel biên tinh b ng urea và formamide (sequencing gel) dung đê ằ phân tách va tinh sach cac đoan DNA s i đ n. ợ ơ

Ph n này ch gi i thi u polyacrylamide gel không bi n tính ầ ỉ ớ ệ ế là lo i gel hay đ cạ ượ s d ng nh t. ử ụ ấ Hiêu qua cua s phân tách DNA trong lo i gel này phu thuôc vào nông ự ạ đô cua acrylamide (Bang 2.3), kích th c và đi n tích c a DNA. ướ ệ ủ

Bang 2.3. Hiêu qua cua s phân tách DNA trong polyacrylamide gel không biên tinh ư

1.1. Chuân bi polyacrylamide gel không biên tinh

Kich th c phô biên cua tâm kinh đô gel th ng la 20 cm ướ ườ × 40 cm. Miêng đêm day khoang 0,5 mm-2,0 mm. Cac gel day h n th ng nong lên trong qua trinh điên ơ ườ di nên se lam nhoe cac băng DNA, vi thê ng i ta th ng s dung cac gel mong. ườ ườ ử Tuy nhiên, khi khi chay môt l ng l n DNA (>1 ượ ớ µg/băng) thi cân chuân bi gel day. D i đây mô ta các b c chuân bi va s dung polyacrylamide gel không biên tinh:ướ ướ ử

1.1.1. Chuân bi cac dung dich sau:

- 30% acrylamide (bao gôm bis-acrylamide)

- 1× TBE

- 10% ammonium persulphate

1.1.2. Lau sach hai tâm kinh dung lam khuôn gel va miêng đêm băng KOH/methanol hoăc ethanol. X ly bê măt cua hai tâm kinh băng dung dich silicon đê ngăn gel dinh chăt ử vao hai tâm kinh gây rach gel lúc lây no ra khoi khuôn sau khi điên di xong.

1.1.3. Tinh toan thê tich cua cac dung dich dung đ tao polyacrylamide gel trên c s ể ơ ở kich th c tâm kinh, đô day cua mi ng đ m (xem bang 2.4). ướ ế ệ

1.1.4. Bô sung 35 µL TEMED vao môi 100 mL dung dich tao polyacrylamide gel, trôn hôn h p băng cach vortex. Rot dung dich tao gel vao gi a hai tâm kinh. Găn nhanh l c ợ ữ ượ

vao, tranh bot khi răng l c (giêng). Đinh cua răng l c phai h i cao h n mep gel. ở ượ ượ ơ ơ Nêu cân, bô sung thêm môt it dung dich tao gel đê lam đây mep gel.

Bang 2.4. Dung tich cua cac chât dung cho polyacrylamide gel

1.1.5. Cho phep acrylamide polymer hoa trong khoang 60 phut nhiêt đô phong, bô sung ở thêm dung dich tao gel nêu thây gel co vao nhiêu.

1.1.6. Sau khi polymer hoa hoan toan, rút l c cân thân, thao băng dinh ra khoi đay ượ khuôn gel. Găn khuôn gel vao bu ng điên di va lam đây bu ng điên di băng đêm 1 ồ ồ ×

TBE, dung Pasteur pipette đê pha cac bot khi ra khoi đay gel va cac giêng băng đêm 1 ×

TBE.

1.1.7. Trôn cac mâu DNA v i m t l ng thich h p cua đêm 6 ớ ộ ượ ợ × gel-loading dye. Đăt mâu vao trong giêng băng micropipette hoăc Hamilton syringe.

1.8. Nôi buông điên di v i bô nguôn. Polyacrylamide gel không biên tinh th ng chay ớ ườ điên di trong khoang 1 V/cm đên 8 V/cm. Chay gel cho đên khi thuôc nhuôm chi thi dich chuyên đên vi tri mong muôn. Tăt nguôn, lây khuôn gel ra va đăt lên ban. Thao tâm kinh nho măt tr c ra, tâm kinh l n phia sau đ c dung lam gia đ , va chuân bi nhuôm ở ướ ớ ở ượ ơ gel.

1.2. Phat hiên DNA trong polyacrylamide gel

1.2.1. Nhuôm băng ethidium bromide

Polyacrylamide co thê lam mât huynh quang cua EtBr, do đo không thê phat hiên cac băng DNA băng ph ng phap nay nêu ham l ng cua no thâp h n 10 ng. Ngâm nhe ươ ượ ơ gel cung v i tâm kinh đ vao trong dung dich nhuôm (0,5 ớ ơ µg/mL EtBr trong 1⋅ TBE). Cho v a đu dung dich nhuôm phu hoan toan lên bê măt gel. Sau khi nhuôm 30-45 phut ừ ở nhiêt đô phong, lây gel va tâm kinh đ ra, cân thân thâm khô bê măt gel b ng giây thâm ơ ằ Kimwipe. Phu lên bê măt gel băng gi y nylon (Saran wrap), tranh tao ra bot khi hoăc nêp ấ gâp cua Saran wrap. Sau đó lât ng c gel va đăt no trên may soi t ngoai ultraviolet ượ ử transilluminator (Gel Documentation System), lây tâm kinh đ ra đê tiên hanh chup anh. ơ

1.2.2. Nhu m b ng thu c nhu m b cộ ằ ố ộ ạ

Thu c nhu m b c đ c s d ng t nh ng năm 1980, cho phép phát hi n m tố ộ ạ ượ ử ụ ừ ữ ệ ộ l ng protein r t nh d ng v t trong polyacrylamide gel. Sau đó, lo i thu c nhu mượ ấ ỏ ở ạ ế ạ ố ộ này đ c hoàn thi n và m r ng ph m vi ng d ng cho các phân t nucleic acid. Haiượ ệ ở ộ ạ ứ ụ ử ph ng pháp nhu m b c th ng đ c s d ng là: 1) Dùng các dung d ch diamineươ ộ ạ ườ ượ ử ụ ị silver ho c ammonical silver cho th m vào gel và pha loãng các dung d ch acid c aặ ấ ị ủ formaldehyde đ phát tri n hình nh. 2) Th m dung d ch silver nitrate vào gel trong môiể ể ả ấ ị tr ng acid y u và dùng formaldehyde kh có ch n l c các ion b c thành b c kim lo iườ ế ử ọ ọ ạ ạ ạ d i đi u ki n ki m. Nhìn chung, ph ng pháp diamine ki m kém nh y h n nh ngướ ề ệ ề ươ ề ạ ơ ư thích h p đ i v i các gel dày, trong khi ph ng pháp acid nhanh và b t màu t t h nợ ố ớ ươ ắ ố ơ đ i v i các gel m ng.ố ớ ỏ

Thu c nhu m b c đ c s d ng hi u qu đ phát hi n m t l ng nhố ộ ạ ượ ử ụ ệ ả ể ệ ộ ượ ỏ (picogram, pg) nucleic acid. Gi i h n phát hi n DNA s i đôi khi quan sát b ng m tớ ạ ệ ợ ằ ắ th ng là vào kho ng 1 pg/mmườ ả 2 m t c t ngang c a băng DNA, nh y g p 1.000-10.000ặ ắ ủ ạ ấ l n ph ng pháp nhu m b ng EtBr. M c đ phát hi n này có th so sánh v i ph ngầ ươ ộ ằ ứ ộ ệ ể ớ ươ pháp đánh d u đ ng v phóng x ho c huỳnh quang. Quá trình nhu m bao g m cácấ ồ ị ạ ặ ộ ồ b c sau: ướ

- C đ nh nucleic acid trong acetic acid 7,5% t i thi u 5 phút đ ngăn c n số ị ố ể ể ả ự khu ch tán c a các phân t nucleic acid đã đ c phân tách trong gel, lo i b và trungế ủ ử ượ ạ ỏ hòa các hóa ch t không mong mu n (urea và đ m). ấ ố ệ

- R a gel trong n c kh ion t i thi u 2 phút đ lo i b acetic acid, các ch t b nử ướ ử ố ể ể ạ ỏ ấ ẩ d ng v t và ph n th a c a các thành ph n gel hòa tan sau khi c đ nh.ạ ế ầ ừ ủ ầ ố ị

- Nhu m gel trong dung d ch b c v i s có m t c a formaldehyde đ c i thi nộ ị ạ ớ ự ặ ủ ể ả ệ đ nh y và đ t ng ph n. Th i gian nhu m t i u kho ng 20 phút. Tuy nhiên, đ iộ ạ ộ ươ ả ờ ộ ố ư ả ố

v i lo i gel có t m đ polyester (8×10 cm) thì ch c n 10 phút là đ đ có ch t l ngớ ạ ấ ơ ỉ ầ ủ ể ấ ượ hình nh cao mà không làm gi m đ nh y. ả ả ộ ạ

- R a gel sau khi nhu m b c đ lo i b thu c nhu m th a có th gây ra k t t aử ộ ạ ể ạ ỏ ố ộ ừ ể ế ủ màu nâu trong quá trình phát tri n màu. Thông th ng, có th dùng dung d ch phát tri nể ườ ể ị ể màu đ r a gel.ể ử

- Phát tri n màu c a gel b ng h n h p dung d ch sodium carbonate (4 g/L),ể ủ ằ ỗ ợ ị sodium thiosulfate (4 µM) và formaldehyde (kho ng 0,028-0,111%) đ gi m cácả ể ả background không đ c hi u m t cách hi u qu . Nhi t đ r a thích h p t 8-10ặ ệ ộ ệ ả ệ ộ ử ợ ừ oC, th iờ gian r a thay đ i tùy thu c vào thành ph n c a dung d ch phát tri n màu trong kho ngử ổ ộ ầ ủ ị ể ả t vài giây đ n vài phút.ừ ế

- D ng ph n ng phát tri n màu khi thu đ c hình nh t i u càng nhanh càngừ ả ứ ể ượ ả ố ư t t b ng cách dùng acetic acid l nh (4ố ằ ạ oC) 7,5%.

1.2.3. Phong xa t ghi ự+ Không cô đinh, lam âm gel

Nêu mu n thu h i băng DNA co hoat tinh phong xa t gel thi gel phai đ c cô ố ồ ừ ượ đinh hoăc lam khô. N u ch mu n quan sát k t qu đi n di thì có th ti n hành nhanh ế ỉ ố ế ả ệ ể ế nh sau:ư

- Goi ban gel cung v i tâm kinh đ trong giây nylon Saran wrap. Tranh tao bot khi ớ ơ hoăc nêp gâp cua Saran wrap. Đanh dâu băng m c phong xa lên bê măt Saran wrap. ự

- Lât ng c gel va u v i phim X-quang (tiên hanh trong phong tôi) -70 ượ ớ ở oC trong khoang th i gian thich h p. ờ ợ

+ Cô đinh, lam khô gel

Cac polyacrylamide gel ch a DNA co hoat tinh phong xa co thê đ c cô đinh va ứ ượ lam khô tr c khi phong xa t ghi. ướ ự

- Ngâm gel cung v i tâm kinh đ trong acetic acid 7% trong 5 phut. Lây gel khoi ớ ơ thuôc ham mau môt cach cân thân băng cach câm nhe tâm kinh ra khoi chât long.

- R a nhanh gel trong n c kh ion. Dung giây thâm Kimwipe đê thâm khô bêử ướ ử măt gel (không dung giây thâm th ng). Boc gel va tâm kinh đ trong Saran wrap, thiêt ườ ơ kê phong xa t ghi nh trên. Môt cach khac la lam khô gel trên giây Whatman 3MM ự ư băng cach dung may lam khô gel (s y 80 ấ ở oC trong đi u ki n chân không t 1-2 gi ).ề ệ ừ ờ Lam khô gel cân thiêt chi khi gel ch a DNA đ c đanh d u đông vi phat xa ứ ượ ấ β yêu nh ư 35S hoăc môt l ng nho ượ 32P (cân phai u phim 24 gi hoăc lâu h n) (Hình 2.8). ờ ơ

1.3. Phân lâp cac đoan DNA t polyacrylamide gel ừ

Ph ng phap tôt nhât đê phân lâp DNA t polyacrylamide gel la ky thuât “ép vàươ ừ ngâm” (crush and soak) cua Maxam và Gilbert (1977). DNA thu đ c co đô tinh sach ượ cao va không ch a cac chât nhiêm bân c chê enzyme. Măc du ph ng phap nay phai ứ ứ ươ tiên hanh qua nhiêu b c va không hiêu qua (it h n 30% san l ng cac đoan DNA >3 ướ ơ ượ kb), nh ng no co thê đ c dung đê phân lâp ca hai loai DNA s i đôi va s i đ n t cacư ượ ợ ợ ơ ừ polyacrylamide gel không bi n tinh va bi n tính, t ng ng. Ph ng th c sau đâyế ế ươ ứ ươ ứ đ c cai ti n t ky thuât cua Maxam va Gilbert (1977):ượ ế ừ

- Chay điên di polyacrylamide gel. Xac đinh vi tri cua DNA quan tâm băng phong xa t ghi hoăc băng EtBr quan sat d i anh sang UV. ự ướ

- Dung dao căt manh gel ch a băng DNA quan tâm. Không loai bo Saran wrap ứ kh i gel tr c khi căt, căt ca gel l n Saran wrap, sau đo boc manh gel nho co ch a DNAỏ ướ ẫ ứ quan tâm ra khoi Saran wrap.

- Chuyên manh gel vao trong E-tube (eppendorf tube), dung tip cua micropipette đê ep manh gel theo thanh cua tube.

- Tinh toan thê tich thich h p cua manh gel va bô sung 1-2 thê tich cua đêm chiêt (0,5 ợ M ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM EDTA pH 8 va 0,1% SDS) vao E- tube.

- Đong tube va u 37 ở oC kem theo lăc vong nhe. Đoan DNA nho (<500 bp) đ c ượ dung ly trong khoang 3-4 gi , đoan l n h n mât khoang 12-16 gi . ờ ớ ơ ờ

- Ly tâm 12.000 g trong 1 phut 4 ở oC. Chuyên thê nôi vao E-tube sach.

- Bô sung thêm 0,5 thê tich đêm chiêt vao E-tube cu co manh polyacrylamide gel, vortex nhanh va ly tâm. Trôn hai thê nôi lai v i nhau. ớ

- Bô sung hai thê tich ethanol 4 ở oC, bao quan dung dich trên đa tuyêt 30 phut. Thu hôi DNA băng cach ly tâm 12.000 g trong 10 phut 4 ở oC.

- Hòa tan tr lai DNA trong 200 ở µL đêm TE (pH 7,6) va bô sung 25 µL cua 3 M sodium acetate (pH 5,2) va kêt tua DNA v i hai thê tich ethanol nh b c trên. ớ ư ướ

- R a cân thân tiêu thê v i ethanol 70% va hòa tan tr lai DNA trong đêm TE (pHử ớ ở 7,6) t i thê tich cuôi cung la 10 ớ µL.

- Kiêm tra sô l ng va chât l ng cua đoan DNA băng điên di polyacrylamide gel. ượ ượ Lây môt thê tich nho tôi thiêu (đ c c l ng khoang 50 ng DNA) trôn v i 10 ượ ướ ượ ớ µL TE (pH 7,6), bô sung thêm 2 µL gel-loading dye. Nap mâu va chay điên di polyacrylamide gel nông đô thich h p băng cach dung cac DNA marker chuân đa biêt sô l ng. Cacở ợ ượ đoan DNA phân lâp se cung dich chuyên v i DNA marker trong qua trinh điên di. ớ

2. Đi n di proteinệ

2.1. Đi n di SDS-PAGEệ

2.1.1. Ph ng th cươ ứ

Đi n di trên polyacrylamide gel v i s có m t c a SDS (sodium dodecyl sulfate)ệ ớ ự ặ ủ là k thu t dùng trong hóa sinh, di truy n và sinh h c phân t đ phân tách các proteinỹ ậ ề ọ ử ể theo tính linh đ ng đi n di c a chúng (ph thu c vào chi u dài c a chu i polypeptideộ ệ ủ ụ ộ ề ủ ỗ ho c kh i l ng phân t , c u hình (xo n) c a protein, các bi n đ i h u d ch mã và cácặ ố ượ ử ấ ắ ủ ế ổ ậ ị nhân t khác). ố

Đi n SDS cho phép phân ly các phân t protein có kh i l ng khác nhau. SDS cóệ ử ố ượ đi n tích âm r t l n và có kh năng liên k t v i m ch peptide đ bi n tính các c u trúcệ ấ ớ ả ế ớ ạ ể ế ấ b c hai và b c ba (không liên k t b ng c u disulfide) c a protein b ng cách b c xungậ ậ ế ằ ầ ủ ằ ọ quanh khung polypeptide. Nh v y, s l ng SDS t ng tác v i protein t l v i kh iư ậ ố ượ ươ ớ ỷ ệ ớ ố l ng/kích th c phân t protein và đi n tích c a SDS bám vào có th làm b t cượ ướ ử ệ ủ ể ấ ứ phân t protein nào cũng chuy n đ ng trong đi n tr ng t c c âm (-) sang c c d ngử ể ộ ệ ườ ừ ự ự ươ (+). Do đó, b ng ph ng pháp đi n di, có th phân tách riêng bi t các phân t proteinằ ươ ệ ể ệ ử có kh i l ng phân t khác nhau. ố ượ ử

Không có SDS, các protein khác nhau có kh i l ng phân t t ng t s d chố ượ ử ươ ự ẽ ị chuy n khác nhau do s khác nhau v cu n xo n, b i vì nh ng khác nhau trong cácể ự ề ộ ắ ở ữ ki u cu n xo n s làm cho m t vài phân t protein thích h p t t h n v i khuôn gel soể ộ ắ ẽ ộ ử ợ ố ơ ớ v i nh ng phân t protein khác. B sung SDS giúp gi i quy t v n đ này, vì nó làmớ ữ ử ổ ả ế ấ ề cho các phân t protein tr thành m ch th ng sao cho chúng có th phân tách hoàn toànử ở ạ ẳ ể theo kh i l ng phân t (c u trúc s c p, ho c s l ng (và kích th c) c a cácố ượ ử ấ ơ ấ ặ ố ượ ướ ủ amino acid). SDS liên k t v i protein theo t l kho ng 1,4 g SDS trên 1,0 g proteinế ớ ỷ ệ ả (m c dù t l liên k t có th thay đ i t 1,1-2,2 g/SDS/g protein) t o ra m t t l kh iặ ỷ ệ ế ể ổ ừ ạ ộ ỷ ệ ố

l ng/đi n tích th ng nh t cho m i phân t protein đ s d ch chuy n qua gel ch liênượ ệ ố ấ ọ ử ể ự ị ể ỉ quan đ n kích th c c a protein. M t lo i thu c nhu m v t có th đ c b sung vàoế ướ ủ ộ ạ ố ộ ế ể ượ ổ dung d ch protein cho phép theo dõi ti n đ c a d ch chuy n protein qua gel trong su tị ế ộ ủ ị ể ố quá trình đi n di. ệ

Hình 2.9. Đi n di protein b ng k thu t SDS-PAGE và nhu m b ng Coomassie blue.ệ ằ ỹ ậ ộ ằ WM: Chu n kh i l ng phân t c a protein. Các đ ng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8: M u protein.ẩ ố ượ ử ủ ườ ẫ

2.1.2. Kh SDS-PAGEử

Bên c nh vi c b sung SDS, protein có th đ c đun nóng nhanh g n đ n sôiạ ệ ổ ể ượ ầ ế v i s có m t c a m t tác nhân kh , ví d nh dithiothreitol (DTT) ho c 2-ớ ự ặ ủ ộ ử ụ ư ặmercaptoethanol (BME), đ bi n tính thêm protein b ng cách kh các liên k t disulfide,ể ế ằ ử ế vì th kh c ph c đ c m t vài d ng cu n xo n b c ba c a protein, và b gãy c u trúcế ắ ụ ượ ộ ạ ộ ắ ậ ủ ẻ ấ b c b n c a protein (các ti u đ n v oligomer). Ph ng th c này đ c xem nh là khậ ố ủ ể ơ ị ươ ứ ượ ư ử SDS-PAGE, và đ c s d ng ph bi n nh t. Tr ng h p không kh SDS-PAGEượ ử ụ ổ ế ấ ườ ợ ử (không đun sôi và không có tác nhân kh ) có th đ c dùng khi c u trúc nguyên th làử ể ượ ấ ể quan tr ng trong phân tích v sau (ch ng h n nh ho t tính enzyme, đ c trình bàyọ ề ẳ ạ ư ạ ượ b ng vi c s d ng zymogram). Đi n di polyacrylamide gel liên t c nguyên th pha chằ ệ ử ụ ệ ụ ể ế đ nh l ng (quantitative preparative native continuous polyacrylamide gelị ượ electrophoresis, QPNC-PAGE) là m t ph ng pháp m i đ phân tách cácộ ươ ớ ể metalloprotein nguyên th trong các khuôn sinh h c ph c t p.ể ọ ứ ạ

2.1.3. Đi n di và nhu mệ ộ

Các protein bi n tính sau đó đ c n p vào m t đ u c a khuôn polyacrylamideế ượ ạ ộ ầ ủ gel đ t trong đ m thích h p. Dòng đi n đ c s d ng t đ u này đ n đ u kia c a gel,ặ ệ ợ ệ ượ ử ụ ừ ầ ế ầ ủ s làm cho các protein tích đi n âm d ch chuy n qua gel. Tùy thu c vào kích th c c aẽ ệ ị ể ộ ướ ủ chúng, m i protein s d ch chuy n v i các t c đ khác nhau qua khuôn gel: proteinỗ ẽ ị ể ớ ố ộ

ng n d dàng đi qua các l c a gel, trong khi protein l n h n s g p khó khăn h n.ắ ễ ỗ ủ ớ ơ ẽ ặ ơ Sau m t vài gi (tùy thu c đi n áp s d ng trên gel, n u đi n áp cao protein ch yộ ờ ộ ệ ử ụ ế ệ ạ nhanh h n nh ng s cho đ phân gi i kém h n), các protein s có s d ch chuy n khácơ ư ẽ ộ ả ơ ẽ ự ị ể nhau d a trên kích th c c a chúng, các protein nh h n s đi nhanh h n xu ng phíaự ướ ủ ỏ ơ ẽ ơ ố d i c a gel, trong khi các phân t l n v n còn v trí g n v i đi m xu t phát. Vì th ,ướ ủ ử ớ ẫ ở ị ầ ớ ể ấ ế protein có th đ c phân tách theo kích th c (và vì th , theo kh i l ng phân t ). Sauể ượ ướ ế ố ượ ử đi n di, gel đ c nhu m (ph bi n nh t là Coomassie Brilliant Blue ho c thu cệ ượ ộ ổ ế ấ ặ ố nhu m b c), cho phép quan sát các protein đ c phân tách, ho c nh ng ti n trình xaộ ạ ượ ặ ữ ế h n (ví d : Western blot, xem ch ng 7). Sau khi nhu m, các protein khác nhau sơ ụ ươ ộ ẽ xu t hi n các băng phân bi t trong gel. Quá trình đi n di th ng đ c ch y kèm v iấ ệ ở ệ ệ ườ ượ ạ ớ protein marker c a các kh i l ng phân t đã bi t m t đ ng riêng bi t trong gel,ủ ố ượ ử ế ở ộ ườ ệ đ canh ch nh gel và xác đ nh kh i l ng c a protein ch a bi t b ng cách so sánh v iể ỉ ị ố ượ ủ ư ế ằ ớ kho ng cách d ch chuy n liên quan v i marker.ả ị ể ớ

Đi n di polyacrylamide gel th ng là ch n l a đ u tiên khi th nghi m s tinhệ ườ ọ ự ầ ử ệ ự s ch protein do tính đáng tin c y và d dàng c a nó. S có m t c a SDS và b c gâyạ ậ ễ ủ ự ặ ủ ướ bi n tính làm cho các protein đ c phân tách đ n đ c d a trên kích th c. Các tácế ượ ơ ộ ự ướ nhân b n cũng có th cùng d ch chuy n và xu t hi n m t băng không mong mu nẩ ể ị ể ấ ệ ộ ố t ng t protein. S đ ng d ch chuy n này cũng có th làm cho m t protein s ch y ươ ự ự ồ ị ể ể ộ ẽ ạ ở m t v trí khác ho c không th xâm nh p vào gel. Đây là đi u quan tr ng đ nhu mộ ị ặ ể ậ ề ọ ể ộ gel hoàn toàn bao g m ph n stacking. Coomassie blue có ái l c liên k t y u v iồ ầ ự ế ế ớ glycoprotein và các protein d ng s i, đã làm c n tr ch t l ng đi n di.ạ ợ ả ở ấ ượ ệ

2.1.4. H th ng đ mệ ố ệ

H u h t đi n di phân tách protein đ c th c hi n v i m t h th ng đ m khôngầ ế ệ ượ ự ệ ớ ộ ệ ố ệ liên t c tăng c ng m t cách ý nghĩa hình d ng c a băng trong gel. Trong su t quáụ ườ ộ ạ ủ ố trình đi n di h th ng gel không liên t c, m t gradient ion đ c t o thành trong giaiệ ở ệ ố ụ ộ ượ ạ đo n s m c a đi n di làm cho t t c protein t p trung trong m t băng d ng đ n. ạ ớ ủ ệ ấ ả ậ ộ ạ ơ

Nhi u ng i s d ng liên t c đ m Tris-glycine ho c Laemmli t p trung và phânề ườ ử ụ ụ ệ ặ ậ gi i pH 8,3-9,0. Các pH này kh i đ ng s t o thành c u n i disulfide gi a các g cả ở ở ộ ự ạ ầ ố ữ ố cysteine trong protein, đ c bi t khi chúng hi n di n n ng đ cao do pKa c a cysteineặ ệ ệ ệ ở ồ ộ ủ n m trong ph m vi t 8-9 và b i vì tác nhân kh hi n di n trong đ m n p (loadingằ ạ ừ ở ử ệ ệ ệ ạ buffer) không đ ng d ch chuy n v i các protein. Nh ng ti n b g n đây trong côngồ ị ể ớ ữ ế ộ ầ ngh đ m đã làm nh b t v n đ này b ng cách hòa tan protein pH t t d i pKaệ ệ ẹ ớ ấ ề ằ ở ố ướ c a cysteine (ví d : bis-Tris, pH 6,5) và bao g m các tác nhân kh (ví d : sodiumủ ụ ồ ử ụ bisulfite) là y u t di chuy n vào gel phía tr c các protein đ duy trì m t môi tr ngế ố ể ướ ể ộ ườ kh . M t l i ích n a c a đ m đ c s d ng v i các pH th p là acrylamide gel n đ nhử ộ ợ ữ ủ ệ ượ ử ụ ớ ấ ổ ị h n vì th gel có th đ c b o qu n trong m t th i gian dài tr c khi s d ng.ơ ế ể ượ ả ả ộ ờ ướ ử ụ

2.2. Đi n di 2D-PAGEệ

Ngoài đi n di SDS, có th đi n di các protein tùy theo đi m đ ng đi nệ ể ệ ể ẳ ệ (isoelectric point, IEP) c a chúng. Ph ng pháp này đ c g i là đi n di t p trung đ ngủ ươ ượ ọ ệ ậ ẳ đi n (isoelectric focusing, IEF). Trong dung d ch đ m có pH bi n thiên liên t cệ ị ệ ế ụ (gradient pH), các protein s phân ly đ n v trí t ng thích v i đi m đ ng đi n c aẽ ế ị ươ ớ ể ẳ ệ ủ mình.

M t h n h p protein ph c t p đ c n p vào gi a c a m t trái, đó pH làộ ỗ ợ ứ ạ ượ ạ ở ữ ủ ặ ở trung tính và m t đi n áp đ c s d ng trên khuôn gel. Các protein sau đó d ch chuy nộ ệ ượ ử ụ ị ể thông qua gel cho đ n khi chúng h ng t i đi m đ ng đi n c a mình, là đi m mà đóế ướ ớ ể ẳ ệ ủ ể ở đi n tích c a chúng t ng t nh pH vùng chung quanh. Gel sau đó đ c ngâm trongệ ủ ươ ự ư ở ượ dung d ch bi n tính (đ làm cho các protein không cu n xo n) ch a ch t t y là SDS.ị ế ể ộ ắ ứ ấ ẩ Phân t này tích đi n âm r t m nh và liên k t v i t t c protein, làm cho t t c chúngử ệ ấ ạ ế ớ ấ ả ấ ả đ u mang đi n âm. M t đi n áp sau đó đ c s d ng trên khuôn gel t đ u này đ nề ệ ộ ệ ượ ử ụ ừ ầ ế đ u kia đ t t c protein s chuy n đ ng h ng t i anode, nh ng nh ng protein nhầ ể ấ ả ẽ ể ộ ướ ớ ư ữ ỏ h n s chuy n đ ng qua gel nhanh h n, vì th các protein đ c phân tách theo kíchơ ẽ ể ộ ơ ế ượ th c c a chúng.ướ ủ

K thu t đi n di 2 chi u (2D-PAGE, 2 dimension polyacryamide gelỹ ậ ệ ề electrophoesis) đ c dùng đ phân tách h n h p protein, và đ c bi t h u ích cho vi cượ ể ỗ ợ ặ ệ ữ ệ so sánh các m u liên quan nh m u mô bình th ng và m u mô đ t bi n. Comparativeẫ ư ẫ ườ ẫ ộ ế 2D-PAGE cũng có th đ c dùng đ tìm ki m các protein mà s bi u hi n c a chúngể ượ ể ế ự ể ệ ủ r t t ng đ ng d i cùng m t t p h p các đi u ki n (nh ng y u t này có các ch cấ ươ ồ ướ ộ ậ ợ ề ệ ữ ế ố ứ năng liên quan) và nh n d ng các protein đ c s n xu t trong ph n ng v i li u phápậ ạ ượ ả ấ ả ứ ớ ệ thu c.ố

Hình 2.10. Đi n di protein hai chi uệ ề

Có kho ng 10.000 protein khác nhau trong t bào, t p trung trong h n sáu lo iả ế ậ ơ ạ quan tr ng. K thu t 2D-PAGE không đ nh y đ phát hi n các protein hi m và nhi uọ ỹ ậ ủ ạ ể ệ ế ề protein s không đ c phân gi i. Vì th , c n ph i phân c t m u trong các ph n khácẽ ượ ả ế ầ ả ắ ẫ ầ nhau đ làm gi m s ph c t p c a h n h p protein tr c khi th c hi n 2D-PAGE.ể ả ự ứ ạ ủ ỗ ợ ướ ự ệ

Hai ph ng pháp đi n di theo kh i l ng phân t và đi m đ ng đi n có th k tươ ệ ố ượ ử ể ẳ ệ ể ế h p v i nhau t o nên k thu t đi n di 2 chi u. Đi n di protein trên polyacrylamide gelợ ớ ạ ỹ ậ ệ ề ệ cho phép phân đo n, xác đ nh kh i l ng phân t và phân l p protein. Ngoài ra, kh iạ ị ố ượ ử ậ ố l ng protein còn đ c xác đ nh chính xác b ng ph ng pháp s c ký kh i ph .ượ ượ ị ằ ươ ắ ố ổ

Tài li u tham kh o/đ c thêmệ ả ọ

1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl

K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.

2. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 2000. Molecular Cloning-A Laboratory

Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA.

3. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press

Inc. New Jersey, USA.

4. Rickwood D and Hames BD. 1984. Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. IRL Press

Ltd. Oxford, UK.

5. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin,

Heidelberg, Germany.

6. Westermeier R. 2005. Electrophoresis in Practice. 4th ed. Wiley-VCH Verlag GmbH &

Co. KgaA. Weinheim, Germany.

1Agar: m t galactan ph c h p tách chi t t m t s loài t o đ nh ộ ứ ợ ế ừ ộ ố ả ỏ ư Gelidium và Gracilaria spp., đ c s d ng r ng rãi d ng gel làm giá th r n ho c bán r n choượ ử ụ ộ ở ạ ể ắ ặ ắ môi tr ng nuôi c y vi sinh v t và th c v t.ườ ấ ậ ự ậ

Ch ng 3ươ

Khuêch đai in vitro DNA băngphan ng ư chu i ỗ polymerase (PCR)

PCR (polymerase chain reaction) là m t k thu t đ c s d ng ph bi n trongộ ỹ ậ ượ ử ụ ổ ế công ngh sinh h c hi n đ i và đã đóng góp r t l n cho nh ng ti n b v sinh h cệ ọ ệ ạ ấ ớ ữ ế ộ ề ọ phân t , đánh d u m t b c ti n vô cung quan tr ng t ng đ ng v i vi c khám pháử ấ ộ ướ ế ọ ươ ươ ớ ệ ra các enzyme h n ch (xem ch ng 1) và k thu t Southern blot (xem ch ng 5). ạ ế ươ ỹ ậ ươ

PCR d a trên c s phan ng kéo dài primer nh enzyme Taq polymerase đêự ơ ở ứ ờ khuêch đai in vitro cac nucleic acid đăc hi u trong thi t b đi u nhi t tu n hoàn ệ ế ị ề ệ ầ (thermocycler) còn g i là máy PCR (Hình 3.1). PCR cho phep khuêch đai theo ham muọ lên đên hang triêu lân cac đoan DNA co chiêu dai t 200-3.000 bp. Đoan DNA đ c ừ ượ khuêch đai (DNA đich) đ c nhân d ng nh căp primer đăc hi u (oligonucleotide) ượ ạ ờ ệ th ng co chi u dai khoang 20 nucleotide.ườ ề

Hình 3.1. Thi t b đi u nhi t tu n hoàn ế ị ề ệ ầ

I. Nguyên t c c a PCRắ ủ

Taq polymerase (xem ch ng 1) là m t lo i enzyme DNA polymerase ch u nhi tươ ộ ạ ị ệ (có vi khu n ch u nhi t đ cao ở ẩ ị ệ ộ Thermus aquaticus) đ c dùng đ t ng h p các đo nượ ể ổ ợ ạ DNA m i trong môi tr ng co b n lo i deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP vàớ ườ ố ạ dTTP) và hai primer, trên c s khuôn m u c a m t đo n DNA nh t đ nh đa biêt hoăcơ ở ẫ ủ ộ ạ ấ ị ch a biêt trinh t . Các đo n DNA m i hình thành l i đ c s d ng làm khuôn m u.ư ự ạ ớ ạ ượ ử ụ ẫ Sau nhi u chu ky, s l ng đo n DNA nói trên đ c nhân lên g p nhiêu lân, nh v yề ố ượ ạ ượ ấ ờ ậ có th đ s l ng đ tách ra, phân tích trình t ho c t o dòng... Primer bên trai tacể ủ ố ượ ể ự ặ ạ ở đông trên s i DNA 3’-5’ đ c goi la primer thuân (forward primer, ky hiêu la F). Primer ợ ượ

bên phai tac đông trên s i DNA 5’-3’ đ c goi la primer ng c (reverse primer, kyở ợ ượ ượ hiêu la R).

Nguyên t c c a PCR đ c trình bày trong hình 3.2 và 3.3. Theo đó, t chu ky thắ ủ ượ ừ ứ hai Taq DNA polymerase (g i t t là Taq pol) b t đ u t o ra các đo n DNA có chi u dàiọ ắ ắ ầ ạ ạ ề xác đ nh. Các primer th ng là môt oligonucleotide t ng h p (synthetic oligonucleotide)ị ườ ổ ợ có kho ng 10-20 nucleotide ho c h n. N u bi t trình t c a đo n gen c n khu ch đ iả ặ ơ ế ế ự ủ ạ ầ ế ạ thì có th t ng h p nhân t o các primer t ng ng đ th c hi n PCR và tách chúng raể ổ ợ ạ ươ ứ ể ự ệ b ng k thu t đi n di. PCR th ng ti n hành khoang 25-35 chu ky, qua đó t 10ằ ỹ ậ ệ ườ ế ừ -6 µg DNA ban đ u có th khu ch đ i (amplification) lên t i trên 1 ầ ể ế ạ ớ µg (kho ng 2 kb). M iả ỗ chu ky PCR bao g m ba giai đo n có nhi t đ khác nhau: ồ ạ ệ ộ

- Gây bi n tính (denaturation) ế 90-95ở oC

Trong giai đo n bi n tính, phân t DNA khuôn m u d ng xo n kép đ c táchạ ế ử ẫ ở ạ ắ ượ thành hai s i đ n (single strands). T t c các ph n ng enzyme trong giai đo n này đ uợ ơ ấ ả ả ứ ạ ề b d ng l i (ví d : ph n ng t ng h p DNA t chu kỳ tr c đó).ị ừ ạ ụ ả ứ ổ ợ ừ ướ

- G n m i (annealing) ắ ồ 40-65ở oC

Trong giai đo n này các primer g n vào các v trí có trình t t ng đ ng DNAạ ắ ị ự ươ ồ ở khuôn m u. Các primer b l c nh chung quanh do chuy n đ ng Brown vì th các liênẫ ị ắ ẹ ể ộ ế k t ion đ c t o thành và b đ t gãy liên t c gi a primer s i đ n và DNA khuôn m uế ượ ạ ị ứ ụ ữ ợ ơ ẫ s i đ n. Các liên k t ion n đ nh h n tao thanh m t đo n nh (các primer đã l p rapợ ơ ế ổ ị ơ ộ ạ ỏ ắ chính xác) và trên các đo n nho DNA s i đôi đó (khuôn m u và primer) Taq pol có thạ ợ ẫ ể b t đ u quá trình sao chép khuôn m u. giai đo n này ph m vi nhi t đ đ c sắ ầ ẫ Ơ ạ ạ ệ ộ ượ ử d ng có th r t r ng tùy thu c vào trình t nucleotide c a primer, thông th ngụ ể ấ ộ ộ ự ủ ườ kho ng 55ả oC, nh ng có khi ch 35ư ỉ oC ho c đôi lúc lên đ n 68ặ ế oC.

- Kéo dài phân t (extension)ử nhi t đô 70-72ở ệ oC.

Đây là kho ng nhi t đ t i thích cho Taq pol ti n hành t ng h p DNA b ng cáchả ệ ộ ố ế ổ ợ ằ b sung các dNTP b t đ u t các v trí có primer theo chi u 5’ổ ắ ầ ừ ị ề →3’. Các primer có m tộ vài base g n vào khuôn mâu có m i liên k t ion m nh h n l c phá v các liên k t nàyắ ố ế ạ ơ ự ơ ế se không bi đ t gay. Các primer các v trí không b t c p chính xác l i b r i ra (do ứ ở ị ắ ặ ạ ị ờ nhi t đô cao) kh i khuôn m u đa không tông h p đ c DNA. ệ ỏ ẫ ợ ượ

Hình 3.2. S đô ph n ng chu i polymeraseơ ả ứ ỗ

Hình 3.3. Các chu kỳ c a k thu t PCRủ ỹ ậ

Co ba ky thuât PCR thông d ng: PCR chuân, PCR mo neo va PCR đao ng c. ụ ượ Trong PCR chuân (standard PCR) , DNA khuôn mâu đ c m xoăn kep, sau đo hai ượ ở primer tac đông hai đâu s i đ n, rôi DNA m i đ c tông h p nh Taq pol v i 4 lo i ở ợ ơ ớ ượ ợ ờ ớ ạ deoxyribonucleotide (Hình 3.4).

Hình 3.4. S đ k thu t PCR chu nơ ồ ỹ ậ ẩ

PCR mo neo (anchored PCR) , k thu t này yêu c u ch c n bi t trình tỹ ậ ầ ỉ ầ ế ự nucleotide m t đ u c a khuôn m u và g n m t đuôi đ ng trùng h p nhân t o (ví d :ở ộ ầ ủ ẫ ắ ộ ồ ợ ạ ụ dA) vao đâu kia (ch a bi t trình t ). Sau đó đo n DNA đ c khuêch đai nhiêu lân nh ư ế ự ạ ượ ờ môt primer co trinh t đa biêt tr c va môt primer th hai co oligo(dT) (Hình 3.5). ự ướ ứ

PCR đao ng c (inverse PCR) ượ , đ c dung đê khuêch đai các đoan phân t kêượ ử cân v i đo n có trinh t DNA đa biêt tr c, phân t DNA nay đ c căt h n ch va nôi ớ ạ ự ướ ử ượ ạ ế lai nh enzyme DNA ligase đê tao thanh môt vong tron co tinh chât monomer, sau đo ờ đo n DNA đ c khuêch đai nh hai primer t ng đông v i đâu cua trinh t đã biêtạ ượ ờ ươ ớ ự tr c (Hinh 3.6).ướ

II. Quy trình PCR

1. Thành ph n ph n ngầ ả ư

- Phân t DNA có ch a đo n DNA c n khu ch đ iử ứ ạ ầ ế ạ

- 2 primer (F và R)

- Taq pol

- 4 lo i dNTPạ

- Đ m và các mu i khoángệ ố

Hình 3.5. S đ k thu t PCR m neoơ ồ ỹ ậ ỏ

2. Th c hi n ph n ngự ệ ả ư

D i đây la vi du minh h a cho môt phan ng khuêch đai:ướ ọ ứ

2.1. Chu n b dung dich master mix và cho vào eppendorf tube (E-tube) lo i 0,5 mL,ẩ ị ạ tr n đ u các thành ph n sau:ộ ề ầ

Đ m 10× PCRệ 4,5 µL H n h p 4 dNTP (2,5 mM môi loai)ỗ ợ 4 µL Primer-F (10 pmol/µL) 2,5 µL Primer-R (10 pmol/µL) 2,5 µL Thêm H2O t i ớ 40 µL

2.2. Chu n b dung dich pha loang cua ẩ ị Taq pol:

Đêm ×10 2 µL Taq pol (5 units/µL) 1 µL Thêm H2O t iớ 20 µL

Hinh 3.6. S đ ky thuât PCR đao ng c ơ ồ ượ

2.3. B sung 5 ổ µL DNA khuôn m u (100 ng) vào 40 ẫ µL dung d ch c a master mix tube.ị ủ

2.4. Bô sung 2 µL/1 tube dung dich pha loang cua Taq pol.

2.5. Đ t E-tube đ ng dung d ch ph n ng vào heating block c a máy PCR đ th c hi nặ ự ị ả ứ ủ ể ự ệ ch đ nhi t theo chu kỳ nh sau:ế ộ ệ ư

- Start program

- 95oC/5 phút

- Th c hiên 30 chu ky: 95ự oC/30 giây, 50oC/30 giây va 72 oC/1 phút

- 72oC/10 phút

- Gi san ph m PCR 4ữ ẩ ở oC

- Ch y đi n di đ kiêm tra k t q a PCR (Hinh 3.7)ạ ệ ể ế ủ

- Nêu ch a chay điên di thi bao quan san ph m PCR -20 ư ẩ ở oC

Chú y

- Các thành phân và đi u ki n c a phan ng nh : Đô dài c a primer, ch đô nhi t trong ề ệ ủ ứ ư ủ ế ệ môt chu ky, sô chu ky đôi v i m i đôi t ng có th thay đôi ít nhi u b ng th c nghi m. Các ớ ỗ ượ ể ề ằ ự ệ thông sô trên chi có y nghia tham kh o ả .

- N u làm nhi u mâu, có th trôn chung các thành phân khác tr DNA và Taq pol, sau đóế ề ể ừ chia ra t ng tube r i cho DNA và Taq pol vao sau cùng.ừ ồ

- Thao tác trong t c y vô trùng (ho c không).ủ ấ ặ

Hình 3.7. Đi n di các s n ph m PCR. ệ ả ẩ SM: Chu n kích th c DNA. Cac đ ng sô 1, 2, 3, 4ẩ ướ ườ

va 5: Các san phâm PCR khác nhau.

III. Tôi u hoa cac điêu kiên cho PCR ư

1. Trinh t cua ự primer

Đôi v i genome cua eukaryote ng i ta th ng dung cac primer dai khoang 18 ớ ườ ườ nucleotide tr lên. Tuy nhiên, cung tuy t ng tr ng h p, co nh ng primer cua cac ch thở ừ ườ ợ ữ ỉ ị phân t ngâu nhiên nh RAPDử ư 1 rât ngăn (10-16 mer) hoăc STS 2 cân primer dài h n (20- ơ24 mer). Noi chung, genomic DNA không hoan toan la môt trinh t ngâu nhiên ma no ự con mang đăc tinh cua cac ho gen, nh ng nhân tô co tinh lăp lai (s lăp đoan đ n gian ữ ự ơ hay ph c tap). Tuy theo loai sinh vât va tuy theo cach thê hiên cua trinh t DNA khuônứ ự mâu, ng i ta se thiêt kê trinh t cua primer va đôi chiêu cân thân no v i sô liêu l u tr ườ ự ớ ư ữ tr c đây nhăm loai tr cac sai sot vê ky thuât. Gân đây, ng i ta th ng s dung phânướ ừ ườ ườ ử mêm trong computer đê thiêt kê cac primer thich h p cho t ng muc tiêu nghiên c u va ợ ừ ứ co thê giup loai bo cac căp primer đ c thiêt kê không tôi u. ượ ư

Khi thiêt kê primer cân chu y môt sô điêm nh sau: Cô găng chon trinh t primer ư ự co khoang 50% GC. Tranh G va C đâu 3’ cua primer vi no co thê lam tăng c hôi tao ra ở ơ hiên t ng primer-dimers (hai primer băt căp v i nhau). Tranh chon cac vung co trinh t ượ ớ ự t ng đông đê han chê cac primer t găn v i nhau. Tinh toan nhi t đ nóng ch yươ ự ớ ệ ộ ả (Tm) cua primer v i tông sô 4 ớ oC cho GC va 2 oC cho AT, sau đo tr đi 5 ừ oC t gia tri nay va đâyừ chinh la nhiêt đô u ( Ta) cua primer. Noi chung, nhiêt đô u co gia tri thâp h n nhiêt đô ơ nóng ch y c a primer. S khac nhau t 4-6ả ủ ự ừ oC gi a ữ Tm primer va Ta d ng nh khôngườ ư anh h ng đên hiêu suât cua PCR. ưở

2. Nhiêt đô cua qua trinh u

Nhiêt đô u thich h p là nhi t đ sao cho đó đo 1/2 sô primer se găn v i DNA ợ ệ ộ ở ớ khuôn mâu. Công th c d i đây ng dung trong tr ng h p primer co khoang 20 ứ ướ ứ ườ ợ oligonucleotide:

Ta = 4 (G + C) + 2 (A + T) – 5oC (1)

Tuy nhiên, công th c nay chi co tinh t ng đôi, băng kinh nghiêm nghiên c uứ ươ ứ chung ta m i co thê co sô liêu đung vê nhiêt đô cho qua trinh u. Sô base cua primer cang ớ it thi nhiêt đô nay cang thâp va ng c lai. ượ

3. Magnesium

Nông đô cua Mg 2+ (đ c cung câp d i dang MgClượ ướ 2) co thê anh h ng đên nhiêt ưở đô biên tinh DNA khuôn mâu, qua trinh u cua primer, tinh đăc hi u cua san phâm PCR, ệ hoat tinh cua Taq pol va đô chinh xac cua kêt qua. Nông đô thich h p cua Mg ợ 2+ la t 0,5- ừ2,5 mM ng v i nông đô dNTP tông sô đa cho. Nông đô Mgứ ớ 2+ cao se lam cho phân t ử DNA s i đôi ôn đinh h n va ngăn ng a đ c s biên chât hoan toan (m xoăn đê giaiợ ơ ừ ượ ự ở phong s i đ n cua san phâm PCR trong môi chu ky) lam cho kêt qua PCR ngheo đi. Măt ợ ơ khac, no con lam cho hiên t ng băt căp gia (tai nh ng vi tri không t ng đông) ôn đinh ượ ữ ươ h n dân đên xuât hiên nh ng san phâm PCR không đăc hi u v i sô l ng kha l n.ơ ữ ệ ớ ượ ớ Ng c lai, nêu nông đô Mgượ 2+ qua thâp se anh h ng xâu đên qua trinh tông h p DNA ưở ợ (Mg2+ đong vai tro la môt co-factor cua Taq pol). Do đo, cân phai xac đinh nông đô tôi u ư cua Mg 2+ nhăm đam bao hiêu suât khuêch đai va tinh đăc hi u cua san phâm PCR. ệ

4. Cac deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs)

Dung dich stock c a các dNTP phai co pH 7, nông đô th ng dung la 10 mM (2,5 ủ ườ mM môi loai) đ c bao quan -20 ượ ở oC. Ham l ng cua các dNTP trong khoang 20-200 ượ µM cho kêt qua ôn đinh, chinh xac va đăc hi u. Bôn loai dNTP đ c s dung cân co ệ ượ ử nông đô t ng đ ng nhau đê giam thiêu tôi đa hiên t ng sai biêt do kêt h p sai ươ ươ ượ ợ (misincorporation) ma di truyên nao đo.

5. Enzyme Taq pol

Nông đô Taq pol thich h p la t 1-2,5 unit cho 100 ợ ừ µL dung dich phan ng. Thông ứ th ng co thê s dung 0,5 unit/25 ườ ử µL. Nêu nông đô Taq pol qua cao, co thê xuât hiên cac san phâm PCR không đăc hi u va lam sai lêch kêt qua. Nêu nông đô Taq pol qua thâp, se ệ không đu l ng enzyme đê xuc tac tao ra san phâm PCR mong muôn. ượ

6. Đêm ôn đinh hoat đông cua Taq pol

Nh ng chât ôn đinh Taq pol đ c s dung la gelatin va Triston X-100 trong đêmữ ượ ử bao quan enzyme. Nông đô th ng dung la 0,01% gelatin va 0,1% (v/v) Triston X-100. ườ

7. Nông đô cac primer

Trong hâu hêt cac ng dung cua PCR, hai primer F va R đêu phai co nông đô băng ứ nhau. Nông đô cuôi cung cua môi primer la 0,1 µM, t ng đ ng v i 2,5 pmol (16,25ươ ươ ớ ng cua 20-mer) trong 25 µL dung dich phan ng. S dung nông đô primer cao không cân ứ ử thiêt va th ng tao ra bât l i, vi qua th a primer se co hiên t ng primer-dimers va hiên ườ ợ ừ ượ t ng găn primer nhâm vi tri trên khuôn mâu.ượ

8. Nông đô DNA khuôn mâu

PCR bao gôm hai giai đoan: giai đoan sang loc va giai đoan khuêch đai. Nêu cac chât trong thanh phân phan ng (bao gôm primer) co nông đô cao trong khi DNA khuôn ứ mâu lai co nông đô thâp thi giai đoan sang loc cua PCR se tr nên kho khăn h n, vi tân ở ơ suât đê primer va DNA khuôn mâu găp nhau giam ro rêt, trong khi s tiêp xuc gi a ự ữ primer va primer lai tăng lên gây ra hiên t ng primer-dimers trong giai đoan khuêch ươ đai. Thông th ng, n ng đ DNA khuôn m u đ c s d ng trong kho ng t 10-100 ườ ồ ộ ẫ ượ ử ụ ả ừ ng/25 µL dung d ch ph n ng.ị ả ứ

9. Ty lê gi a primer va DNA khuôn mâu ư

Môt trong nh ng yêu tô quan trong nhât cua PCR la ty lê tôi u gi a primer va ữ ư ữ DNA khuôn mâu. Nêu ty lê nay qua cao thi hiên t ng primer-dimers se xuât hiên, giông ượ nh tr ng h p mâu DNA qua loang. Nêu ty lê nay qua thâp kêt qua san phâm PCR seư ườ ợ không nhiêu. Trong hâu hêt cac tr ng h p ap dung PCR, ng i ta đêu dung nông đô ườ ợ ườ primer không qua 0,5 µM (12,5 pmol/25 µL) va tinh toan nông đô DNA khuôn mâu đê tranh hiên t ng primer-dimers. ượ

10. Kh i đ ng nóng PCR ơ ộ

Kh i đông nong PCR (“host-start” PCR) la ph ng phap san xuât cac san phâmở ươ PCR sach h n. DNA khuôn mâu va primer đ c trôn v i nhau va gi nhiêt đô trên ơ ượ ớ ữ ở ng ng cua liên kêt không đăc hiêu gi a primer va khuôn mâu. Tât ca cac thanh phânươ ữ

cua PCR đ c bô sung tr c ngoai tr môt chât then chôt (th ng la Taq pol). Chi ượ ướ ừ ườ tr c khi đi vao chu ky khuêch đai, thanh phân ch a co m i đ c bô sung đê cho phepướ ư ớ ượ phan ng xay ra nhiêt đô cao h n. Do không co hiên t ng lai không đăc hi u cua ứ ở ơ ượ ệ primer v i khuôn mâu, nên cac băng DNA đ c khuêch đai tr nên sang h n, cac đoanớ ượ ở ơ primer không co c hôi đê găn v i nhau. Ky thuât nay đ c tiên hanh băng cach lam ơ ớ ượ lanh cac tube trên đá tuyêt (ice bath) trong khi bô sung hôn h p thanh phân cua PCR. Sau ợ đo, đăt tube trong may PCR đa đ c lam nong ngay tr c khi bô sung thanh phân cuôi ượ ướ cung. D i đây la vi du minh h a cho kh i đ ng nóng PCR. ướ ọ ở ộ

10.1. Chu n b dung dich master mix và cho vào E-tube lo i 0,5 mL và tr n đ u cácẩ ị ạ ộ ề thành ph n sau:ầ

Đ m 10× PCRệ 4,5 µL H n h p 4 dNTP (2,5 mM môi loai)ỗ ợ 4 µL Primer-F (10 pmol/µL) 2,5 µL Primer-R (10 pmol/µL) 2,5 µL Thêm H2O t iớ 40 µL

10.2. Chu n b dung dich pha loang cua Taq pol:ẩ ị

Đêm ×10 2 µL Taq pol (5 units/µL) 1 µL Thêm H2O t iớ 20 µL

10.3. B sung 5 ổ µL DNA khuôn m u (100 ng) vào 40 ẫ µL dung d ch c a master mixị ủ tube.

10.4. Đ t E-tube đ ng dung d ch ph n ng vào heat block c a máy PCR đ th c hi nặ ự ị ả ứ ủ ể ự ệ ch đ nhi t theo chu kỳ nh sau:ế ộ ệ ư

- Start program

- “Hot start”: Kho ng 80ả oC/10 giây «pause»

- Bô sung 2 µL/1 tube dung dich pha loang cua T aq pol.

- Restart

- 94oC/5 phút

- Th c hiên 30 chu ky: 94ự oC/30 giây, 54oC/30 phút va 72 oC/1 phút.

- 72oC/10 phút

- Gi san ph m PCR 4ữ ẩ ở oC

- Ch y đi n di đ kiêm tra k t q a PCRạ ệ ể ế ủ

- Nêu ch a chay điên di thi bao quan san ph m PCR -20 ư ẩ ở oC

IV. Thiêt kê primer

Viêc chon l a môt primer có m t ý nghĩa quan tr ng khi muôn ng dung PCR co ự ộ ọ ứ hiêu qua va đô chinh xac cao. Vi thê, chung ta phai co môt thiêt kê chinh xac vê oligonucleotide primer. Trinh t cua primer đ c chon xac đinh kich th c và vi tri cua ự ượ ướ san phâm PCR, cung nh ư Tm c a vung đ c khuêch đai. Primer đ c thiêt kê đung coủ ượ ượ thê giup chung ta tranh tao ra nh ng san phâm PCR không đăc hi u (non-specific). ữ ệ

Muc đich cua vi c thiêt kê primer la co đ c môt s cân băng gi a hai kêt qua: s ệ ượ ự ữ ự đăc hi u va hiêu suât khuêch đai. S đăc hi u đ c xem xet trên c s xuât hiên bao ệ ự ệ ượ ơ ở nhiêu lân hiên t ng găn primer nhâm (mis-priming) trên tông sô lân găn primer ượ (priming) t c la s lai gi a primer va khuôn mâu tai vi tri đich cua no. Hiêu suât la sứ ự ữ ự tiêp cân v i ly thuyêt vê kêt qua san phâm, trong môi chu ky PCR, môt căp primer co thê ớ khuêch đai ra môt san phâm. V i môt trinh t DNA đa đ c cung câp ng i ta co thê ớ ự ượ ườ phân tich primer trên computer đê co môt kêt qua cân băng gi a hai muc tiêu noi trên. ữ

1. Chiêu dai primer

Tinh đăc hi u cua san phâm PCR th ng phu thuôc vao chiêu dai cua primer va ệ ườ nhiêt đô u. Cac oligonucleotide co kich th c khoang 18-24 base co xu h ng tr thanh ướ ướ ở nh ng trinh t rât đăc hi u nêu nhiêt đô u cua PCR đ c thiêt kê sai khac chi vai đô soữ ự ệ ượ v i ớ Tm cua primer (nhiêt đô ly thuyêt). Primer có chi u dài càng l n thì kha năng găn ề ớ c a primer càng nh . Trong khi khu ch đ i, m t s c nào đó c a quá trình cũng sủ ỏ ế ạ ộ ự ố ủ ủ ẽ làm gi m k t qu PCR. Đ t i u hóa PCR, ng i ta s d ng primer có chi u dài t iả ế ả ể ố ư ườ ử ụ ề ố thi u sao cho đ m b o ể ả ả Tm kho ng 54ả oC ho c h n chút ít, đi u này s cung c p nh ngặ ơ ề ẽ ấ ữ c h i t t nh t đ duy trì tinh đ c tr ng c a s n ph m PCR và hi u su t ph n ngơ ộ ố ấ ể ặ ư ủ ả ẩ ệ ấ ả ứ cao. Nh ng oligonucleotide ng n (15 base ho c ng n h n) đ c s dung h n chữ ắ ặ ắ ơ ượ ử ạ ế trong nhi u quy trình PCR. Chi u dài primer t i thi u cho h u h t các ng d ng PCRề ề ố ể ầ ế ứ ụ là khoang 18 nucleotide va ng i ta th ng thi t k cac primer có đ dài 18-24 mer. ườ ườ ế ế ộ Primer càng ng n thì quá trình g n gi a primer và khuôn mâu DNA càng nhanh, t oắ ắ ữ ạ thành s i đôi n đ nh trong t ng h p DNA. Thông th ng, cac primer có 28-35 mer c nợ ổ ị ổ ợ ườ ầ cho vi c khu ch đ i các trình t có m c đ d h p cao.ệ ế ạ ự ứ ộ ị ợ

Đ i v i nh ng primer ng n h n 20 mer, có th s d ng công th c tính ố ớ ữ ắ ơ ể ử ụ ứ Tm liên hệ v i các base: ớ Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T). Trong khi primer dài h n công th c này ch cóơ ứ ỉ giá tr g n đúng.ị ầ

2. Nucleotide cuôi cung cua primer

V trí đ u 3’ c a primer nên đ c xác đ nh c n th n, vì nó có tính ch t quy tị ầ ủ ượ ị ẩ ậ ấ ế đ nh cho s thành công c a PCR. Khi chúng ta xác đ nh đ c m t amino acid, hai baseị ự ủ ị ượ ộ đ u tiên trong codon c a nó ho c ba base trong tr ng h p nó đ c mã hóa b ngầ ủ ặ ườ ợ ượ ằ codon đ n (methionin và tryptophan) thì hai ho c ba base đ u tiên này đ c dùng nhơ ặ ầ ượ ư đ u 3’. Nh ng c p base hoàn ch nh gi a nh ng đ u 3’ c a primer và khuôn m u choầ ữ ặ ỉ ữ ữ ầ ủ ẫ phép chúng ta có đ c k t qu mong mu n, và gi m thi u t i đa hi n t ng b t c pượ ế ả ố ả ể ố ệ ượ ắ ặ sai (mismatch) trong kho ng 5-6 nucleotide t i đ u 3’ c a primer. Thông th ng, viêcả ạ ầ ủ ườ thêm vào môt trình t không liên quan t i đ u 5’ c a primer v n không làm thay đ i ự ạ ầ ủ ẫ ổ quá trình g n m i. ắ ồ

Nhi m v c a đ u 3’ trong primer là ki m soát hi n t ng g n primer nh m vaệ ụ ủ ầ ể ệ ượ ắ ầ ngăn can hi n t ng t ng đ ng trong cùng m t c p primer. N u không th n tr ng ệ ượ ươ ồ ộ ặ ế ậ ọ trong vi c xác đ nh đ u 3’ thi hi n t ng primer-dimers s x y ra, va v i tính ch t bệ ị ầ ệ ượ ẽ ả ớ ấ ổ sung cho nhau s n ph m PCR lúc b y gi se là m t s khu ch đ i c a chính primerả ẩ ấ ờ ộ ự ế ạ ủ ch không ph i cua DNA khuôn m u mà ta mong mu n. Trong tr ng h p có nhi uứ ả ẫ ố ườ ợ ề c p primer đ a vào trong cùng m t ph n ng (multiplex PCR), chúng ta c n ph i ki mặ ư ộ ả ứ ầ ả ể tra g p đôi hi n t ng b sung cho nhau c a t t c primer.ấ ệ ượ ổ ủ ấ ả

3. Ham l ng GC va nhiêt đô nong chay T ượ m

Primer c a PCR ph i duy trì đ c hàm l ng GC đ n m c có th đ c. Nh ngủ ả ượ ượ ế ứ ể ượ ữ oligonucleotide có 20 base v i 50% GC th ng có giá tr ớ ườ ị Tm trong kho ng 56-62ả oC se t o đi u ki n đ quá trình đ t k t qu tôt. Hàm l ng GC và ạ ề ệ ể ủ ạ ế ả ượ Tm ph i kh p v i m tả ớ ớ ộ c p primer đ c thi t k . N u giá tr ặ ượ ế ế ế ị Tm càng l n thi c h i cho hi n t ng g nớ ơ ộ ệ ượ ắ primer nh m càng cao. Do đó, khi thi t k primer cân ph i l u ý đăc biêt đ n hàmầ ế ế ả ư ế l ng GC.ượ

V. K thu t RT-PCRỹ ậ

Ph n ng RT-PCR là ph n ng khu ch đ i m t đo n khuôn m u RNA theoả ứ ả ứ ế ạ ộ ạ ẫ nguyên lý c a PCR, bao g m hai giai đo n: ủ ồ ạ

Giai đo n th nh t.ạ ứ ấ Phiên mã ng c khuôn m u RNA thành s i DNA th nh t,ượ ẫ ợ ứ ấ sau đó dùng s i này làm khuôn m u đ t ng h p s i DNA th hai (t ng t nh giaiợ ẫ ể ổ ợ ợ ứ ươ ự ư đo n th nh t và th hai c a quá trình t ng h p cDNA-xem ch ng 6). ạ ứ ấ ứ ủ ổ ợ ươ

Giai đo n th hai.ạ ứ Dùng DNA s i đôi làm khuôn m u đ th c hi n ph n ngợ ẫ ể ự ệ ả ứ PCR nh đã trình bày trên.ư ở

RNA đ c c u t o nh b n lo i nucleotide (adenine, guanine, cytosine và uracil)ượ ấ ạ ờ ố ạ liên k t v i nhau t o thành m t chu i đ n. Khi chu i nucleotide này đ c bi n đ iế ớ ạ ộ ỗ ơ ỗ ượ ế ổ thành DNA thì uracil (U) đ c thay th b ng thymine (T). Ph n ng bi n đ i RNA hượ ế ằ ả ứ ế ổ ệ gen thành s i DNA th nh t ph i nh đ n m t enzyme phiên mã ng c (reverseợ ứ ấ ả ờ ế ộ ượ

transcriptase) do v y giai đo n này đ c g i là phiên mã ng c (RT), sau đó quá trìnhậ ạ ượ ọ ượ t ng h p s i DNA th hai l i nh m t enzyme khác là DNA polymerase I (th ngổ ợ ợ ứ ạ ờ ộ ườ dùng đo n Klenow). Khi đã có DNA s i đôi t khuôn m u RNA thì ph n ng ti p theoạ ợ ừ ẫ ả ứ ế s là khu ch đ i gen nh k thu t PCR đ c th c hi n v i ba m c nhi t đ phù h pẽ ế ạ ờ ỹ ậ ượ ự ệ ớ ứ ệ ộ ợ

m i chu kỳ. Toàn b ph n ng khu ch đ i m t đo n DNA t khuôn m u RNA tr iở ỗ ộ ả ứ ế ạ ộ ạ ừ ẫ ả qua hai giai đo n nói trên đ c g i là RT-PCR.ạ ượ ọ

Do trong t nhiên m t s virus có h gen là RNA (retrovirus) nên mu n khu chự ộ ố ệ ố ế đ i m t đo n gen c a nó thì ng i ta ph i dùng k thu t RT-PCR. M t s nghiên c uạ ộ ạ ủ ườ ả ỹ ậ ộ ố ứ khác v mRNA cũng c n đ n RT-PCR đ bi n đ i s i RNA thành DNA cho quá trìnhề ầ ế ể ế ổ ợ t o dòng đ phân tích trình t gen (gene sequencing) hay tái t h p (recombination)ạ ể ự ổ ợ trong nghiên c u bi u hi n gen.ứ ể ệ

VI. Real-time PCR

1. Gi i thi u chungớ ệ

Trong PCR truy n th ng, s n ph m khu ch đ i đ c phát hi n nh s phân tíchề ố ả ẩ ế ạ ượ ệ ờ ự đ u cu i (end-point) b ng cách ch y đi n di DNA trên agarose gel sau khi ph n ngầ ố ằ ạ ệ ả ứ k t thúc. Ng c l i, ph ng pháp real-time PCR cho phép phát hi n và đ nh l ng s nế ượ ạ ươ ệ ị ượ ả ph m khu ch đ i khi ti n trình ph n ng đang di n ra d a trên c s ph n ng huỳnhẩ ế ạ ế ả ứ ễ ự ơ ở ả ứ quang, trong đó s tăng lên v s l ng DNA t ng ng v i s tăng lên c a tín hi uự ề ố ượ ươ ứ ớ ự ủ ệ huỳnh quang.

Trong real-time PCR, ng i ta th ng s d ng các lo i thu c nhu m liên k tườ ườ ử ụ ạ ố ộ ế DNA s i đôi (SYBR Green) đ phát huỳnh quang, và các probe ho c primer đ c hi uợ ể ặ ặ ệ chu i (trình t ) đ c đánh d u huỳnh quang (TaqMan PCR). Thi t b n nhi t chu kỳỗ ự ượ ấ ế ị ổ ệ (máy PCR) đ c bi t đ c g n v i m t module phát hi n tín hi u huỳnh quang đ theoặ ệ ượ ắ ớ ộ ệ ệ ể dõi ti n trình ph n ng khi s khu ch đ i x y ra. Tín hi u huỳnh quang đo đ c ph nế ả ứ ự ế ạ ả ệ ượ ả ánh s l ng s n ph m đ c khu ch đ i trong m i chu kỳ. ố ượ ả ẩ ượ ế ạ ỗ

Real-time PCR có u đi m chính so v i PCR truy n th ng là cho phép chúng taư ể ớ ề ố đ nh l ng s copy kh i đ u c a khuôn m u v i đ chính xác và đ nh y cao trênị ượ ố ở ầ ủ ẫ ớ ộ ộ ạ m t ph m vi đ ng h c l n. Các k t qu c a real-time PCR có th là ch t l ng (s cóộ ạ ộ ọ ớ ế ả ủ ể ấ ượ ự m t ho c không c a trình t đích) ho c đ nh l ng (s b n copy c a DNA). Real-timeặ ặ ủ ự ặ ị ượ ố ả ủ PCR đ nh l ng còn đ c bi t nh là qPCR. S li u c a real-time PCR có th đánhị ượ ượ ế ư ố ệ ủ ể giá mà không c n đi n di gel, th i gian thí nghi m đ c rút ng n và s l ng nguyênầ ệ ờ ệ ượ ắ ố ượ li u đ a vào quá trình đ c tăng lên. Cu i cùng, do các ph n ng đ c ch y và sệ ư ượ ố ả ứ ượ ạ ố li u đ c đánh giá trong m t h th ng tube đóng kín, nên các c h i nhi m b n đ cệ ượ ộ ệ ố ơ ộ ễ ẩ ượ gi m thi u và s c n thi t c a các thao tác h u khu ch đ i đ c lo i b .ả ể ự ầ ế ủ ậ ế ạ ượ ạ ỏ

2. Phân tích t ng quát m t ph n ng real-time PCR ổ ộ ả ư

Đ hi u đ c real-time PCR nh th nào, chúng ta b t đ u b ng m t đ ngể ể ượ ư ế ắ ầ ằ ộ ườ cong khu ch đ i m u (Hình 3.9). Trong hình này, s chu kỳ PCR đ c trình bày trênế ạ ẫ ố ượ tr c x, và tín hi u huỳnh quang t ph n ng khu ch đ i, t l v i s l ng s n ph mụ ệ ừ ả ứ ế ạ ỷ ệ ớ ố ượ ả ẩ đ c khu ch đ i trong tube, đ c trình bày tr c y.ượ ế ạ ượ ở ụ

Đ ng cong khu ch đ i có 2 pha, m t pha hàm mũ (exponential phase) đ c ti pườ ế ạ ộ ượ ế theo b i m t pha n đ nh (plateau phase). Trong su t pha hàm mũ, s l ng s n ph mở ộ ổ ị ố ố ượ ả ẩ PCR x p x g p đôi trong m i chu kỳ. Tuy nhiên, khi ph n ng di n ra thành ph nấ ỉ ấ ỗ ả ứ ễ ầ ph n ng s b tiêu hao, cu i cùng làm cho m t ho c nhi u thành ph n b h n ch . ả ứ ẽ ị ố ộ ặ ề ầ ị ạ ế Ơ đi m này ph n ng ch m l i và đi vào pha n đ nh (các chu kỳ 28-40, Hình 3.9). ể ả ứ ậ ạ ổ ị

Hình 3.9. Đ ng cong khu ch đ i.ườ ế ạ Tín hi u huỳnh quang đ c trình bày đã tr đ ng n nệ ượ ừ ườ ề (baseline).

Đ u tiên, tín hi u huỳnh quang duy trì m c đ n n (background), và vi c tăngầ ệ ở ứ ộ ề ệ tín hi u huỳnh quang là không th phát hi n đ c (các chu kỳ 1-18, Hình 3.9) cho dùệ ể ệ ượ s n ph m tích lũy theo hàm mũ. Sau đó, s n ph m khu ch đ i tích lũy đ đ đ t t iả ẩ ả ẩ ế ạ ủ ể ạ ớ m t hi u su t cho phép phát hi n đ c tín hi u huỳnh quang. S chu kỳ đ đ t đ cộ ệ ấ ệ ượ ệ ố ể ạ ượ hi u su t này g i là chu kỳ ng ng (threshold cycle, Cệ ấ ọ ươ T). Do giá tr Cị T đ c đo trongượ pha hàm mũ khi các tác nhân ph n ng không b h n ch , nên real-time qPCR có thả ứ ị ạ ế ể đ c s d ng đ tính toán chính xác và tin c y s l ng kh i đ u c a khuôn m uượ ử ụ ể ậ ố ượ ở ầ ủ ẫ hi n di n trong ph n ng.ệ ệ ả ứ

CT đ c xác đ nh ch y u b i s l ng c a khuôn m u hi n di n lúc b t đ uượ ị ủ ế ở ố ượ ủ ẫ ệ ệ ở ắ ầ ph n ng khu ch đ i. Khi l ng khuôn m u nhi u thì ch c n m t vài chu kỳ khu chả ứ ế ạ ượ ẫ ề ỉ ầ ộ ế đ i đ tích lũy s n ph m đ cho m t tín hi u huỳnh quang trên background. Vì v y,ạ ể ả ẩ ủ ộ ệ ở ậ ph n ng s có Cả ứ ẽ T th p h n ho c s m. Ng c l i, n u l ng khuôn m u lúc b t đ uấ ơ ặ ớ ượ ạ ế ượ ẫ ắ ầ

ph n ng quá ít, thì s chu kỳ khu ch đ i c n nhi u h n đ tín hi u huỳnh quang tăngả ứ ố ế ạ ầ ề ơ ể ệ trên background. Vì v y, ph n ng s có Cậ ả ứ ẽ T cao ho c mu n. Các d ng quan h này làặ ộ ạ ệ c s cho h ng đ nh l ng c a real-time PCR.ơ ở ướ ị ượ ủ

3. M t s ng d ng chính c a real-time PCRộ ố ư ụ ủ

- Nghiên c u bi u hi n gen. ứ ể ệ Xác đ nh s ho t đ ng c a gen và đ nh l ng m cị ự ạ ộ ủ ị ượ ứ đ bi u hi n c a nó thông qua RNA b ng k thu t RT-PCR. ộ ể ệ ủ ằ ỹ ậ

- Ch n đoán phân t .ẩ ử Nghiên c u m c đ nhi m virus và vi khu n đ ch nứ ứ ộ ễ ẩ ể ẩ đoán các b nh viêm nhi m.ệ ễ

- Xét nghi m phân bi t allele.ệ ệ Là ph ng pháp xét nghi m đ u cu i đ c dùngươ ệ ầ ố ượ đ xác đ nh ki u gen c a m u v t (đ ng h p t : ch có allele 1 ho c ch có allele 2, dể ị ể ủ ẫ ậ ồ ợ ử ỉ ặ ỉ ị h p t : có c hai allele 1 và 2) và phân bi t s đa hình nucleotide đ n (single nucleotideợ ử ả ệ ự ơ polymorhism, SNP).

VII. Môt sô ng dung cua PCR ứ

PCR có pham vi ng dung r t rông trong công ngh sinh h c hi n đ i. Theo ứ ấ ệ ọ ệ ạ nguyên t c trên, đa có nhi u bô sung va cai tiên đ dung PCR cho nhi u muc đich khácắ ề ể ề nhau. đây chi gi i thi u môt sô ng dung chính:Ơ ớ ệ ứ

- Trong nghiên c u genomeứ

+ Nhân ban phân t băng PCR ử

+ PCR tai tô h p ợ

+ Ky thuât footprinting DNase I

+ Sang loc th viên λgt11 ư

+ Multiplex PCR...

- Trong y hoc

+ Phat hiên tê bao T/virus gây bênh ung th mau ư

+ Phat hiên virus viêm gan B

+ Phat hiên virus Dengue gây bênh sôt xuât huyêt

+ Phat hiên vi khuân lao...

1. S dung PCR đê tao nhanh cac gen tông h pư ợ

S dung ph ng phap PCR hai giai đoan (two-step PCR) đê tao nhanh cac genử ươ tông h p. Ph ng phap này đ c xây d ng trên c s nh ng nucleotide chông lên nhau ợ ươ ượ ự ơ ở ữ (overlapping), do đó co thê đ c s dung đê tao ra đo n DNA tông h p thông qua nhiêu ượ ử ạ ợ vong khuêch đai PCR. Kha năng tao ra DNA tông h p co nhiêu ng dung tuy thuôc vao ợ ứ

thiêt kê cua chung ta. Ng i ta co thê thiêt kê môt gen tông h p co ch a codon đ c ườ ợ ứ ượ dung đê biêu hiên protein trong c thê sinh vât. Ph ng phap nay đ c hoan tât nh s ơ ươ ượ ờ ự giai ma ng c chuôi amino acid cua protein mong muôn. Đê thay đôi câu truc cua ượ codon, gen tông h p co thê đ c thiêt kê co nh ng vi tri căt han chê thuân l i phuc vu ợ ượ ữ ợ cho thi nghiêm tao dong vê sau.

Nguyên tăc cua PCR hai giai đoan đo la hai phan ng PCR xay ra liên nhau, phan ứ ng th nhât cua PCR phat sinh ra s i khuôn mâu t ng ng v i gen tông h p va sauứ ứ ợ ươ ứ ớ ợ

đo no đ c khuêch đai trong phan ng PCR lân th hai (Hình 3.10). Tr c khi băt đâu ượ ứ ứ ướ qua trinh nay, ng i ta ph i thiêt kê câu truc va xac đinh trinh t nucleotide cua gen tông ườ ả ự h p ma minh mong muôn. Sau đo, trinh t các oligonucleotide (primers) theo chiêu daiợ ự cua gen phai đ c thiêt kê va tông h p. Thông th ng, ng i ta tông h p các ượ ợ ườ ườ ợ oligonucleotide theo sô ch n v i chiêu dai khoang 16-30 nucleotide. ẵ ớ

2. Tao dong cDNA băng PCR

Ky thuât tao dong kinh điên cDNA đoi hoi nhiêu công s c vê xây d ng th viên đê ứ ự ư bao quan bacteriophage hoăc plasmid, no cân môt khôi l ng công viêc ch n l c môt sô ượ ọ ọ l ng l n cac phage hoăc plasmid co tinh chât tai tô h p. Co ba han chê trong ph ngượ ớ ợ ươ phap nay:

- Cân co môt l ng c chât (it nhât 1 µg) mRNA tinh sach lam vât liêu kh i đâu đê ượ ơ ở xây d ng th viên v i m c đô đa dang đây đu cho nghiên c u.ự ư ớ ứ ứ

- Kho khăn thuôc vê ban chât bên trong cua nh ng phan ng enzyme tiêp nôi nhau ữ ứ lam cho viêc tao dong cDNA co kêt qua thâp, va nh ng dong gen bi đ t đoan. ữ ứ

- Viêc sang loc môt th viên v i ky thuât lai đoi hoi nhiêu th i gian. ư ớ ờ

Ky thuât PCR hiên nay co thê giup chung ta khăc phuc nh ng nh c điêm noi trên, ữ ượ lam cho vi c tao dong cDNA tr nên dê dang h n. S dung hai primer đăc hiêu cua gen, ệ ở ơ ử m t cDNA co trinh t đa đ c biêt ro, ng i ta cho khuêch đai trong PCR. Tuy nhiên,ộ ự ượ ườ cai kho la lam sao phân lâp đ c nh ng ban sao cua cDNA hoàn ch nh (full-length) t ượ ữ ỉ ừ mRNA, trên c s thông tin vê trinh t rât han chê. Trinh t ch a biêt nay năm kê môtơ ở ự ự ư đoan nho cua trinh t đa biêt ro. Trinh t ch a biêt không thê khuêch đai băng ph ng ự ự ư ươ phap PCR thông th ng. Do đó, ph ng phap PCR mo neo va ph ng phap PCR đao ườ ươ ươ ng c đa đ c phat triên trong th i gian g n đây đê giai quyêt vân đê nay.ượ ượ ờ ầ

Hình 3.10. S đ minh h a m t ph n ng t o nhanh gen t ng h p thông qua ph ngơ ồ ọ ộ ả ứ ạ ổ ợ ươ

pháp PCR hai giai đo n. ạ Gen quan tâm đ c khu ch đ i trong ph n ng PCR th nh t v iượ ế ạ ả ứ ứ ấ ớ

c p oligonucleotide đ c hi u gen nh ng có đ a vào vùng ch ng lên nhau (primer A và primerặ ặ ệ ư ư ồ

B). Trong ph n ng PCR th hai, các primer m r ng C và D g n v i vùng ch ng lên nhau c aả ứ ứ ở ộ ắ ớ ồ ủ

s n ph m PCR l n th nh t và b sung t t c các nhân t đi u hòa c n thi t cho s phiên mãả ẩ ầ ứ ấ ổ ấ ả ố ề ầ ế ự

và d ch mã. S n ph m PCR l n th nh t đ c pha loãng 200 l n đ làm khuôn m u cho ph nị ả ẩ ầ ứ ấ ượ ầ ể ẫ ả

ng PCR th hai.ứ ứ

2.1. PCR mo neo

Ky thuât PCR mo neo co môt điêm chung la: Tao dong DNA đi t môt đoan trinh ừ t đa biêt rôi t i đoan trinh t kê cân ch a biêt nh s giup đ cua môt primer đăc hiêuự ớ ự ư ờ ự ơ đôi v i gen tai môt đâu s i đ n va môt primer tông h p tai môt đâu s i đ n khac. Do ớ ợ ơ ợ ợ ơ chi co primer đăc hiêu đôi v i gen m i co thê neo trong PCR lam dê dang h n cho viêc ớ ớ ơ thu thâp môt l ng l n san phâm khuêch đai không đăc hi u so v i PCR chu n. K ượ ớ ệ ớ ẩ ỹ thu t này khac v i PCR chuân la chi cân môt primer đ c hi u cho phan ng. Trong kyậ ớ ặ ệ ứ thuât PCR m neo, môt đuôi nhân tao cua cac gôc dA đ c thêm vao đoan cuôi cua ỏ ượ DNA khuôn m u. S khuêch đai DNA xay ra khi co primer cua môt trinh t đa biêtẫ ự ự tr c va môt primer th hai co cac gôc oligo(dT).ướ ứ

2.2. PCR đao ng c ượ

Ph ng phap PCR đao ng c co thuân l i l n h n nh khuêch đai trinh t kê cânươ ượ ợ ớ ơ ờ ự ch a biêt băng hai primer đăc hi u cua gen. PCR đao ng c hoat đông theo nguyên tăcư ệ ượ tao dong s i đ n môt trinh t DNA. Sau đo, DNA nay đ c căt băng RE vi tri t ng ợ ơ ự ượ ở ươ

ng đê tao ra DNA đich, ti p theo no hoat đông theo chu trinh co tinh chât monomer.ứ ế DNA nay đ c khuêch đai lên băng cac primer t ng đông tai hai đâu s i đ n cua DNA ượ ươ ợ ơ co trinh t đa biêt. ự

Hinh 3.11. ng dung PCR đao ng c. Ứ ượ Hai primer đ c hi u đ c g n vào trình t đã bi t vaặ ệ ượ ắ ự ế sau đo DNA đ c khu ch đ i theo chiêu mui tên. ượ ế ạ

Ban đâu la s i 5’ ợ →3’cua mRNA cho vao phan ng phiên ma ng c thanh s i đ n ứ ượ ợ ơ cDNA 3’→5’, tiêp tuc tông h p s i đ n cua cDNA lân th hai, cho ra s i đôi cDNA ợ ợ ơ ứ ợ (5’→3’va 3’ →5’). S i nay co ch a môt trinh t đa biêt ro. Ky thuât tao dong lam choợ ứ ự cDNA thăng biên thanh cDNA vong s i đôi. Ti p đên, m vong nh RE căt trinh t ợ ế ở ờ ự đ c biêt lam đôi, môt n a đâu s i thăng bên nay, môt n a bên kia. Keo thăng s iượ ử ở ợ ử ợ DNA va khuêch đai trong PCR (Hinh 3.11).

3. ng dung trong di truy nƯ ề

PCR giúp đ c l c cho vi c l p ban đô gen (gene mapping) c a sinh v t. Ph ngắ ự ệ ậ ủ ậ ươ pháp này có tên là phân tích DNA đa hình đ c khu ch đ i ngâu nhiên (RAPD). Trongượ ế ạ ph ng pháp RAPD, PCR đ c th c hi n v i các primer ch n ngâu nhiên. K t qua làươ ượ ự ệ ớ ọ ế t o ra môt sô đo n DNA có chi u dài khác nhau đ c tr ng cho m i loài, th m chí m iạ ạ ề ặ ư ỗ ậ ỗ cá th . So sánh đi n di san ph m PCR c a nhi u giông có đ c đi m khác nhau trongể ệ ẩ ủ ề ặ ể cùng loài, v i nhi u primer khác nhau có th giúp xác đ nh ban đô gen c a sinh v t. ớ ề ể ị ủ ậ

Hi n nay, ngoài RAPD còn có nhi u lo i chi th phân t (molecular marker) khácệ ề ạ ị ử đa đ c phát tri n nh đa hình chi u dài các đo n c t h n ch (restriction fragment ượ ể ư ề ạ ắ ạ ế

length polymorphism, RFLP), vi v tinh (microsatellite) hay còn g i là s l p l i cácệ ọ ự ặ ạ đo n nucleotide đ n gian (simple sequence repeats, SSR), và đa hình chi u dài đo nạ ơ ề ạ DNA đ c khuêch đai ch n l c (amplified fragment length polymorphism, AFLP). Cácượ ọ ọ k thu t này đ c xây d ng trên c s PCR (ngo i tr RFLP) có tri n v ng r t l nỹ ậ ượ ự ơ ở ạ ừ ể ọ ấ ớ trong nghiên c u da d ng di truy n (genetic diversity), đ nh v gen (gene location) vàứ ạ ề ị ị l p ban đô gen do chúng đ n gian v m t k thu t, ti t ki m th i gian và có hi u quaậ ơ ề ặ ỹ ậ ế ệ ờ ệ cao. PCR hi n nay con đ c dùng thay th cho đi n di isozyme đ phân lo i th c v t,ệ ượ ế ệ ể ạ ự ậ xác đ nh môi quan h c a chúng môt cách chính xác.ị ệ ủ

4. ng d ng trong ch n đoán lâm sàngƯ ụ ẩ

Tr c đây, k thu t phân tích RFLP th ng đ c s d ng đ xác đ nh các đ tướ ỹ ậ ườ ượ ử ụ ể ị ộ bi n d n t i các b nh di truy n ng i. Tuy nhiên, k thu t này ch áp d ng đ cế ẫ ớ ệ ề ở ườ ỹ ậ ỉ ụ ượ trong tr ng h p đ t bi n đó d n đ n s thay đ i trình t có th phát hi n đ c trênườ ợ ộ ế ẫ ế ự ổ ự ể ệ ượ c s đ dài c a đo n DNA. Ng c l i, tr ng h p m t s đ t bi n gây ra b nh diơ ở ộ ủ ạ ượ ạ ườ ợ ộ ố ộ ế ệ truy n nh ng không t o ra các đo n DNA c t h n ch khác nhau khi phân tích RFLPề ư ạ ạ ắ ạ ế thì ch có th phát hi n n u xác đ nh đ c trình t đo n DNA ch a đi m đ t bi n.ỉ ể ệ ế ị ượ ự ạ ứ ể ộ ế Nh v y, chúng ta bu c ph i xây d ng th vi n h gen (xem ch ng 5) cho m iư ậ ộ ả ự ư ệ ệ ươ ỗ ng i, sau đó t o dòng và xác đ nh trình t nucleotide c a dòng gen đ t bi n, vì thườ ạ ị ự ủ ộ ế ế ph ng pháp này đòi h i t n nhi u th i gian. ươ ỏ ố ề ờ

K thu t PCR cho phép đ a ra m t ch n l a khác đ n gi n h n cho phép thuỹ ậ ư ộ ọ ự ơ ả ơ nh n thông tin v trình t gen r t nhanh b ng cách khu ch đ i đo n gen ch a đi mậ ề ự ấ ằ ế ạ ạ ứ ể đ t bi n và sau đó phân tích tr c ti p các s n ph m PCR thu đ c. Kh năng nh nộ ế ự ế ả ẩ ượ ả ậ d ng nhanh các đ t bi n không ch quan tr ng trong ch n đoán lâm sàng, mà còn đ yạ ộ ế ỉ ọ ẩ ẩ nhanh vi c nghiên c u các b nh di truy n. ệ ứ ệ ề

Đ nh y cao c a k thu t PCR cho phép ng d ng d dàng trong các ch n đoánộ ạ ủ ỹ ậ ứ ụ ễ ẩ b nh nhi m trùng. Ví d : vi c khu ch đ i m t s l ng l n DNA virus trong các m uệ ễ ụ ệ ế ạ ộ ố ượ ớ ẫ b nh cho kh năng ch n đoán b nh s m h n tr c khi tri u ch ng b nh b t đ u xu tệ ả ẩ ệ ớ ơ ướ ệ ứ ệ ắ ầ ấ hi n. Đi u này giúp cho th y thu c có phác đ đi u tr b nh thích h p, đ c bi t cácệ ề ầ ố ồ ề ị ệ ợ ặ ệ b nh ung th do virus gây ra (ví d : ung th vòm h ng do papillomavirus ng i gây ra)ệ ư ụ ư ọ ườ và thông th ng có k t qu h n n u nh b t đ u đi u tr giai đo n s m.ườ ế ả ơ ế ư ắ ầ ề ị ở ạ ớ

Tai liêu tham kh o/đ c thêm ả ọ1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl

K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.

2. Chen BY and Janes HW. 2002. PCR Cloning Protocols. 2nd ed. Humana Press Inc. New Jersey, USA.

3. Dieffenbach CW and Dveksler GS. 2003. PCR Primer: A Laboratory Manual. 2nd

Edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, NewYork, USA.

4. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ and White TJ. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, New York, USA.

5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA.

6. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc. New Jersey, USA.

7. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany.

1RAPD (random amplified polymorphic DNA): DNA đa hình đ c khu ch đ i ngâu nhiênượ ế ạ .2STS (sequence-tagged site): STS primer đ c thi t k trên c s các trình t c a RAPDượ ế ế ơ ở ự ủ markers.

Ch ng 4ươ

Cac h thông vector ệ Co ba nhóm vector chính đ c s dung trong tao dong DNA va nhân ban chung ượ ử

trong t bào v t ch (ế ậ ủ E. coli ho c n m men), bao g m: 1) Nhóm plasmid, 2) Nhómặ ấ ồ phage/phagemid, và 3) Nhóm nhi m s c th nhân t o (artificial chromosome: BAC vàễ ắ ể ạ YAC). Y t ng vê vector chuyên gen băt nguôn t cac plasmid cua vi khuân. Vector ưở ừ chuyên gen la phân t DNA co kha năng t tai sinh, tôn tai đôc lâp trong tê bao va mang ử ự đ c cac gen cân chuyên. Cac vector chuyên gen phai thoa man cac yêu câu tôi thiêuượ sau:

- Co trinh t kh i đ u sao chep ự ở ầ (ori) đê co thê t sao chep ma tôn tai đôc lâp. ự

- Co các v trí nhân biêt đ n (single recognition sites-SRS), n i ma cac enzyme han ị ơ ơ chê nhân biêt đê căt r i lam chô lăp rap đoan gen ngoai lai vao. Cac trinh t nay th ng ờ ự ườ năm xa điêm kh i đ u sao chep đê tranh bi căt nhâm. ở ầ

- Co trinh t kh i đ ng (promoter) đ ti n hành phiên ma gen ngo i lai. ự ở ộ ể ế ạ

- Đam bao s di truyên bên v ng cua DNA tai tô h p dang đôc lâp hay găn vao ự ữ ợ ở nhiêm săc thê cua tê bao vât chu.

- Co cac gen ch th (marker genes) đê dê dang phat hiên ra th tái t h p. ỉ ị ể ổ ợ

Ngoai ra, chung con phai co nh ng đăc tinh bô sung khac đê cho viêc tao dong dê ữ th c hiên nh là:ự ư

- Ch a cac gen lam vô hiêu hoa đoan DNA không mong muôn đ c găn vao.ứ ượ

- Co nhiêu ban sao đê đ c tách ra khoi tê bao v i sô l ng l n va đam bao s ượ ớ ượ ớ ự khuêch đai cua gen ngo i lai. ạ

- Ngoai promoter cân co thêm cac trinh t nucleotide khac cân thiêt cho s biêu ự ự hiên cua gen, chăng han nh : RBS (ribosome binding sites-vùng liên kêt v i ribosome đê ư ớ dich ma).

Gia tri cua vector chô no đ c thiêt kê sao cho th t thuân tiên v i các muc đich ở ượ ậ ớ s dung khác nhau. Không co vector toan năng cho chuyên gen, ma cân co s chon l aử ự ự tuy m c đích và kich th c c a đoan gen đ c tao dong. Chung đ c thiêt kê v i nhiêu ụ ướ ủ ượ ượ ớ ch c năng chuyên biêt đê mang đ c cac trinh t nucleotide nh mong muôn. Cacứ ượ ự ư vector chuyên gen co năm ng dung quan trong chu yêu: ứ

- Tao dong (cloning) va khuêch đai (amplification) m t đo n trinh t cua DNA ộ ạ ự (nhiêu ban sao giông nhau).

- Nghiên c u s biêu hiên cua môt đoan trinh t DNA.ứ ự ự

- Đ a gen vao cac tê bao vi sinh vât hay cac đông-th c vât .ư ự

- San xuât RNA.

- San xuât protein t gen đ c tao dong. ừ ượ

Ch ng này gi i thi u sáu lo i vector ph bi n (thu c ba nhóm vector: plasmid,ươ ớ ệ ạ ổ ế ộ phage/phagemid và nhi m s c th nhân t o) dùng trong t o dòng gen (gene cloning):ễ ắ ể ạ ạ plasmid, bacteriophage λ , cosmid, bacteriophage M13, BAC và YAC.

I. Plasmid vector1. Đăc điêm cua plasmid

Plasmid la cac thông tin di truyên ngoai nhân, đ c tim thây trong nhiêu loai vi ượ khuân khac nhau. Chung la nh ng phân t DNA mach vong, s i đôi, kich th c t 1- ³ ữ ử ợ ướ ừ 200 kb, co kha năng t sao chep đê tôn tai đôc lâp trong tê bao. Cac plasmid co thê mang ự môt sô gen cua vi khuân va cac gen nay co thê biêu hiên ra protein. M t s ki u hình ộ ố ể khác nhau c a plasmid nh :ủ ư

- Khang cac ch t khang sinh ấ

- Kháng kim lo i n ngạ ặ

- San xuât cac ch t khang sinh ấ

- Thuy phân cac h p chât h u c ph c tap ợ ữ ơ ứ

- San xuât đ c t đ ng ru t enterotoxin ộ ố ườ ộ

- S n xu t ch t di t khu n bacteriocinả ấ ấ ệ ẩ

- San xuât cac colicin 1

- S n xu t haemolysinả ấ 2

- San xuât cac enzyme s a đôi ử 3 va enzyme han chê 4.

M t lo i vi khu n v t ch th ng ch a hai ho c nhi u lo i plasmid cùng t nộ ạ ẩ ậ ủ ườ ứ ặ ề ạ ồ t i. Chúng có th là các plasmid t ng h p (compatible plasmid) ho c không t ngạ ể ươ ợ ặ ươ

h p (incompatible plasmid). Ng i ta có th chia plasmid làm hai lo i d a trên đ cợ ườ ể ạ ự ặ đi m sinh s n và ph ng th c s ng c a chúng, đó là: plasmid ti p h p (conjugativeể ả ươ ứ ố ủ ế ợ plasmid) và plasmid không ti p h p (non-conjugative plasmid).ế ợ

Trong t nhiên, plasmid xâm nhâp vao tê bao vât chu nh s tiêp h pự ờ ự ợ (conjugation) cua vi khuân, nh ng trong nghiên c u th c nghiêm cac plasmid đ c ư ứ ự ượ chuyên nap vao vi khuân băng môt quy trinh nhân tao goi la biên nap gen (gene transformation). Kiêu hinh m i cua thê nhân (recipient) do plasmid đem đên (Vi du: ớ plasmid khang khang sinh) cho phep chon loc xac đinh cac nhân tô biên nap va duy tri plasmid trong quân thê vi khuân. cac vi tri căt han chê c a plasmid, DNA ngoai lai Ơ ủ (foreign DNA) co thê chèn vao va đ c xac đinh v i gen ma hoa cho cac marker chon ượ ớ loc. M t trong các v ector hay đ c s dung tr c đây la pBR 322 mang hai gen khang ộ ượ ử ướ ampicillin (Ampr) va tetracycline ( Tetr) cung môt sô vi tri căt han chê thuân l i. Co hai ợ dang phân chia t pBR 322 thich h p cho s tai ban la cac vector pAT 153 va pXf 3. ừ ợ ự

Cac plasmid kich th c nho co sô l ng ban sao l n h n va mân cam h n v i vi ướ ượ ớ ơ ơ ớ khuân. Tuy nhiên, viêc giam kich th c cua plasmid co thê làm m t cac vi tri tao dong ướ ấ (multiple cloning sites, MCS) h u ich. ữ Vi du : pXf 3 thiêu cac vi tri BalI va AvaI (cac vi tri nay co trong pBR 322 va pAT 153).

Môt sô plasmid không đ c s dung rông rai nh pBR 322, ma chi đ c s dung ượ ử ư ượ ử trong cac muc đich đăc biêt, vi du:

- pMK 16: ch a cac vi tri nhân biêt đ n ứ ơ SmaI va XhoI trong gen ma hoa tinh khang kanamycin.

- pKC 7 va pACYC 184: mang cac vi tri tao dong h u ich va gen ma hoa tinh ữ khang chloramphenicol.

- Cac plasmid có kích th c l n ướ ớ pCR1 (11,4 kb) va pSC 101 ( 9,9 kb): không đ c dung th ng xuyên trong cac thi nghiêm tao dong.ượ ườ

Thông th ng, s sao chep DNA plasmid đ c tiên hanh nh cac enzyme tai banườ ự ượ ờ nhi m s c th vi khuân. môt sô plasmid d ng stringent controlễ ắ ể Ơ ạ 5 s sao chep cuaự chung khá ít ho c b gi i h n, ch gâp đôi s sao chep cua t bào vât chu va chi môt ặ ị ớ ạ ỉ ự ế hoăc môt sô ban sao cua chung co măt trong môi tê bao vi khuân. Cac plasmid d ng ạ relaxed control6 co sô l ng ban sao trong môi tê bao nhiêu h n stringent plasmid, ượ ơ khoang 10-20 va co khi lên đên hang ngan b n sao nêu nh s tông h p protein bi d ng ả ư ự ợ ừ lai (Vi du: băng cach x ly chloramphenicol). Nêu thiêu s tông h p protein thi s sao ử ự ợ ự chep cua cac relaxed plasmid đ c tiêp tuc, trong khi s sao chep cua DNA nhi m s c ượ ự ễ ắ th va cua cac stringent plasmid bi d ng lai. Cac plasmid dung lam vector tao dong phaiể ừ co môt sô tinh chât sau:

- Kich th c t ng đôi nho va phai tai ban trong d ng relaxed plasmid. ướ ươ ạ

- Mang môt hoăc nhiêu marker chon loc (selectable marker) cho phep xac đinh cac nhân tô biên nap va duy tri plasmid trong quân thê vi khuân.

- Ch a cac vi tri nhân biêt đ n cho môt hoăc nhiêu enzyme han chê.ứ ơ

Đ n nay, cac plasmid đa đ c cai tiên đê ngay cang thuân tiên h n cho ky thuât taiế ượ ơ tô h p DNA, tr i qua ba thê hê: ợ ả

- Thê hê đâu tiên. La cac plasmid t nhiên đên nay hâu nh không con s dung ự ư ử n a.ữ

- Thê hê th hai. ư La cac plasmid đ c câu tao ph c tap h n. Môt trong nh ng ượ ứ ơ ữ plasmid th ng đ c s dung la pBR 322 (Hinh 4.1) co nguôn gôc t môt plasmid nhoườ ượ ử ừ ColE1. No đ c thiêt kê t nhiêu đoan cua cac plasmid khac nhau đê v a co cac gen ượ ừ ừ khang thuôc ( Ampr va Tetr), trinh t kh i đ u sao chep ( ự ở ầ ori), v a co cac v trí nhân biêtừ ị cho cac enzyme han chê nh ư Eco RI , Hin dIII , Bam HI , Sal I ,... đoan gen Ơ Amp r co b n điêm nhân biêt, gen ố ở Tet r co tám điêm nhân biêt, nh ng điêm nay giup dê phat hiên ữ cac plasmid co gen ngoai lai găn vao. Vi du : nêu căt plasmid băng enzyme BamHI (375) rôi găn DNA ngoai lai vao chô căt thi gen Tetr bi phân đôi do chèn đoan DNA la, vì th ế tê bao mât kha năng khang tetracycline nh ng vân khang ampicillin. Plasmid nay co kha ư năng sao chep đôc lâp v i tê bao ớ E. coli va tôn tai v i sô l ng trung binh 20-30 ban sao ớ ượ cho môi tê bao. Trong nh ng điêu kiên nuôi cây nhât đinh co thê khuêch đai co chon loc ữ lam tăng sô plasmid đên h n 1.000 ban sao cho môt tê bao. ơ

Hinh 4.1. Plasmid vector pBR 322. Apr (hay Ampr) và Tetr: gen kháng ampicillin và tetracycline, ori: trình t kh i đ u sao chép, và m t s v trí nh n bi t cho các RE.ự ở ầ ộ ố ị ậ ế

- Thê hê th ba ư . L a cac plasmid đa năng (polycloning plasmid) va chuyên dung. Đê tiên cho viêc s dung nhiêu lo ai RE khac nhau, nhiêu trinh t nhân biêt cua chung ử ự đ c xêp nôi tiêp nhau thanh môt đoan dai goi la polylinkers (vùng đa nôi) hay multipleượ cloning sites (cac vi tri tao dong). Cac plasmid vi khuân co thê ch a đoan DNA ngoai lai ứ

khoang 3-10 kb. Co 3 nhom plasmid thông dung hiên đang đ c ban rông rai trên thi ượ tr ng nh :ườ ư

+ Nhom cac plasmid pUC. Kich th c khoang 2.600 bp, mang gen ướ Apr va môt phân gen lacZ’, xen vao gi a gen ữ lacZ’ la polylinker (Hinh 4.2). Cac thanh viên cua nhom nay chi khac nhau do đô dai va chiêu cua polylinker. Cac u điêm cua nhom nay: ư

* Kich th c nho. ướ

* S co măt cua gen ự lacZ’ 7 rât thuân ti n cho viêc phat hiên vector tai tô h p. ệ ợ

* Vung polylinker cho phep chèn vào gân nh bât ky môt trinh t DNA la nao. ư ự

Hinh 4.2. Plasmid vector pUC19 . V trí t o dòng (t 396-447) đ c g n vàoị ạ ừ ượ ắ gen lacZ’, nh ng không can thi p vào ch c năng c a gen.ư ệ ứ ủ

+ Nhóm cac plasmid pGEM : Kich th c khoang 3.000 bp, mang gen ướ Ampr, gen lacZ, polylinker và promoter đăc tr ng cho cac RNA polymerase (SP6, T7) hai bên ư ở vung polylinker cho phep phiên ma đoan DNA găn trong vector thanh nhiêu RNA (Hinh 4.3). Cac RNA nay th ng dung lam probe (mâu do) hay dung trong nghiên c u câu truc ườ ứ va ch c năng cua RNA. ứ

Hinh 4.3. Plasmid vector pGEM . Nhóm vector này đ c m vòng s n mang 2 đ u Tượ ở ẵ ầ vùng MCS, đ c tr ng cho vi c g n các s n ph m PCR mang 2 đ u A.ở ặ ư ệ ắ ả ẩ ầ

+ Nhóm cac plasmid pBluescript : Kich th c khoang 3 . 000 bp, cac plasmid nay kêt ướ h p đ c tât ca nh ng u điêm cua mây nhom v a kê va đ c xem la nhom co tiêmợ ượ ữ ư ừ ượ năng ng d ng l n nhât hiên nay (Hinh 4.4).ứ ụ ớ

2. Tao dong trong plasmid

Vê nguyên tăc, DNA plasmid bi căt b i enzyme h n ch va g n ở ạ ế ắ in vitro v i đoanớ DNA ngoai lai tao ra cac plasmid tai tô h p, sau đo chung đ c dung đê biên nap vao vi ợ ượ khuân. Kho khăn l n nhât la phân biêt gi a cac plasmid ch a cac đoan DNA ngoai lai- ớ ữ ứ thê tai tô h p (recombinant) va cac phân t DNA vector đa tai tao lai vong ợ ử (recircularization). S tai tao lai vong cua plasmid co thê đ c han chê băng cach điêuự ượ chinh nông đô DNA ngoai lai va DNA vector trong phan ng găn (ligation). Môt sô ứ ph ng th c đ c dung đê phân biêt gi a cac thê tai tô h p va tai tao lai vong nh sau:ươ ứ ượ ữ ợ ư

Hinh 4.4. Plasmid vector pBluescript II SK (+ /- ). Vector này mang vùng t oạ dòng v trí t 598-826 trên gen ở ị ừ lacZ’, gen kháng ampicillin, các promoter T3 và T7, và các v trí g n cho các c p primer khác nhau dùng trong phân tích trình t đo n DNAị ắ ặ ự ạ ngo i lai.ạ

2.1. Kh hoat tinh băng chèn đoan (insertional inactivation)ử

Ph ng phap nay dung cho cac plasmid mang hai hoăc nhiêu marker (ví d : ươ ụ Ampr, lacZ). DNA ngoai lai va DNA plasmid đ c thuy phân cùng m t lo i enzyme h n ch ượ ộ ạ ạ ế va tinh sach, sau đo găn hai DNA v i nhau, hôn h p găn đ c dung đê biên nap vao ớ ợ ượ E. coli mân cam Amp đê chon loc thê biên nap nh tinh khang Amp cua plasmid và ho t ờ ạ tính b -galactosidase c a gen ủ lacZ. Các khuân lac ch a cac plasmid tai tô h p sinh ứ ợ tr ng trên môi tr ng co măt Amp và isopropyl-thiogalactoside (IPTG) cùng v i cưở ườ ớ ơ chât nhiêm s c thê X-gal s có màu tr ng do đo n DNA ngo i lai xen vào gi a gen ắ ẽ ắ ạ ạ ữ lacZ làm gen này m t ho t tính. Trong khi đó các khuân lac ch a DNA plasmid tai taoấ ạ ứ lai vong s có màu xanh do gen ẽ lacZ không b m t ho t tính (Hình 4.5 và 4.6).ị ấ ạ

Hình 4.5. C ch tác d ng c a ß -galactosidaseơ ế ụ ủ

2.2. Tao dong đinh h ng (directional cloning) ướ

Hâu hêt cac plasmid vector mang hai hoăc nhiêu vi tri nhân biêt enzyme h n ch , ạ ế vi d : vector pBR 322 ch a cac vi tri nh n bi t đ n ụ ứ ậ ế ơ HindIII va BamHI sau khi căt băng hai enzyme h n ch t ng ng, đoan DNA plasmid l n h n co thê đ c tinh sach băngạ ế ươ ứ ớ ơ ượ điên di agarose gel va găn v i môt đoan DNA ngoai lai mang cac đâu kêt dính t ng ớ ươ đông v i no cung đ c căt b i ớ ượ ở BamHI va HindIII. Kêt qua, thê tai tô h p dang vong ợ mang tinh khang Amp sau đó đ c dung đê biên nap vao ượ E. coli. Do thiêu s bô tr gi a ự ợ ữ cac đâu lôi HindIII va BamHI nên đoan vector l n h n không thê tái tao l i vong môt ớ ơ ạ cach hiêu qua đ c vi thê no biên nap vao ượ E. coli rât kém. Di nhiên, cac tô h p khac cua ợ enzyme cung co thê đ c s dung tuy thuôc vao cac v trí nh n bi t (RS-recognition ượ ử ị ậ ế sites) trong vector va c a đoan DNA ngoai lai (Hình 4.7). ủ

Hình 4.6. T o dòng theo ph ng th c kh ho t tính b ng chèn đo n. ạ ươ ứ ử ạ ằ ạ Amp r : gen kháng ampicillin, lacZ: gen mã hóa enzyme β -galactosidase.

Hình 4.7. T o dòng đ nh h ng. ạ ị ướ Tet r : gen kháng tetracycline, Tets : gen kháng tetracycline b khuy t đo n và m t ho t tính.ị ế ạ ấ ạ

2.3. Bi n n p vector tái t h p vào vi khu n/t bào v t ch ế ạ ổ ợ ẩ ế ậ ủ

Sau khi t o đ c vector tái t h p mang gen ngo i lai, vi c ti p theo là bi n n pạ ượ ổ ợ ạ ệ ế ế ạ nó vào t bào v t ch . Trong tr ng h p này t bào v t ch th ng đ c s d ng làế ậ ủ ườ ợ ế ậ ủ ườ ượ ử ụ vi khu n ẩ E. coli đ khu ch đ i m t l ng l n DNA plasmid tái t h p dùng cho cácể ế ạ ộ ượ ớ ổ ợ phân tích v sau.ề

Hai ph ng pháp đ c dùng đ bi n n p vector tái t h p vào ươ ượ ể ế ạ ổ ợ E. coli là đi nệ bi n n p (electroporation transformantion) và hóa bi n n p (chemical transformation).ế ạ ế ạ

2.3.1. Đi n bi n n pệ ế ạ

Đây là k thu t hi u qu nh t đ bi n n p vi khu n. Hai thông s quan tr ngỹ ậ ệ ả ấ ể ế ạ ẩ ố ọ c a ph ng th c này là lo i t bào vi khu n và t n s xung đi n c n thi t. Th tíchủ ươ ứ ạ ế ẩ ầ ố ệ ầ ế ể c a dung d ch t bào th ng đ c dùng là 30 µL (t ng ng v i n ng đ 10ủ ị ế ườ ượ ươ ứ ớ ồ ộ 10 t bàoế E. coli/mL) có b sung 5 ng plasmid trong m t cuvette có kho ng tr ng đi n c cổ ộ ả ố ệ ự (electrode gap) 0,1 cm. Hi u su t bi n n p c a ph ng th c này l n h n 1×10ệ ấ ế ạ ủ ươ ứ ớ ơ 9 thể bi n n p/µg plasmid siêu xo n và kho ng 1×10ế ạ ắ ả 8 th bi n n p/µg plasmid đ c dùngể ế ạ ượ trong ph n ng g n. T n s bi n n p kho ng 0,02 cho c hai lo i plasmid. T n sả ứ ắ ầ ố ế ạ ả ả ạ ầ ố bi n n p th p đã ngăn c n đ c s đ ng bi n n p (co-transformation) vào vi khu nế ạ ấ ả ượ ự ồ ế ạ ẩ c a hai ho c nhi u phân t plasmid.ủ ặ ề ử

Ph ng pháp đi n bi n n p có m t s u đi m sau:ươ ệ ế ạ ộ ố ư ể

- Hi u su t bi n n p cao.ệ ấ ế ạ

- Có th dùng m t th tích d ch t bào nh . Th tích d ch t bào kho ng 20 µLể ộ ể ị ế ỏ ể ị ế ả có th cho hi u su t kho ng 10ể ệ ấ ả 9 th bi n n p.ể ế ạ

- Ph ng pháp chu n b t bào bi n n p r t đ n gi n, không s d ng các kươ ẩ ị ế ế ạ ấ ơ ả ử ụ ỹ thu t ph c t p và t n th i gian. H n n a, các t bào dùng đ bi n n p có th đ cậ ứ ạ ố ờ ơ ữ ế ể ế ạ ể ượ chu n b tr c và b o qu n vô h n đ nh mà không m t tính kh bi n.ẩ ị ướ ả ả ạ ị ấ ả ế

- T n s đi n bi n n p v i DNA siêu xo n và DNA m ch vòng là gi ng nhau.ầ ố ệ ế ạ ớ ắ ạ ố Do đó, không c n thi t ph i dùng vector đ c tinh s ch cao trong các ph n ng g n.ầ ế ả ượ ạ ả ứ ắ

- Hi u su t bi n n p phân t cho DNA m ch vòng r t cao đ i v i các plasmid cóệ ấ ế ạ ử ạ ấ ố ớ kích th c lên đ n 50 kb.ướ ế

Tuy nhiên, nh c đi m c a ph ng pháp này là đòi h i thi t b bi n n p đ tượ ể ủ ươ ỏ ế ị ế ạ ắ ti n.ề

2.3.2. Hóa bi n n pế ạ

Đây là ph ng th c kinh đi n đ bi n n p DNA plasmid vào t bàoươ ứ ể ể ế ạ ế E. coli. Các t bào đ c trong dung d ch CaClế ượ ủ ị 2 đ tr thành t bào kh bi n giúp cho chúng dể ở ế ả ế ễ ti p nh n DNA plasmid. DNA plasmid đ a vào b ng cách shock nhi t nhanh (40-50ế ậ ư ằ ệ giây), các t bào bi n n p sau đó đ c ch n l c b ng ph ng pháp ch n l c d ngế ế ạ ượ ọ ọ ằ ươ ọ ọ ươ tính trên đĩa agar ch a môi tr ng LB v i kháng sinh thích h p. M i khu n l c trên đĩaứ ườ ớ ợ ỗ ẩ ạ kháng sinh đ i di n cho m t th bi n n p đ n. Các t bào ch a plasmid mang DNAạ ệ ộ ể ế ạ ơ ế ứ ngo i lai có th xác đ nh b ng m t trên đĩa môi tr ng có b sung thêm c ch t nhi mạ ể ị ằ ắ ườ ổ ơ ấ ễ s c th cho β-galactosidase (X-gal) vì chúng là các khu n l c không màu do s khắ ể ẩ ạ ự ử ho t tính c a enzyme b ng cách chèn đo n DNA ngo i lai.ạ ủ ằ ạ ạ

Ph ng pháp chu n b và b o qu n t bào kh bi n trong hóa bi n n p cũng r tươ ẩ ị ả ả ế ả ế ế ạ ấ đ n gi n. Hi u su t bi n n p c a ph ng pháp này trong kho ng 10ơ ả ệ ấ ế ạ ủ ươ ả 4-106 th bi nể ế n p/µg plasmid, tùy thu c vào kích th c c a đo n DNA chèn (insert DNA) và ch ngạ ộ ướ ủ ạ ủ vi khu n đ c s d ng. Hi u su t này thích h p cho các ph ng th c t o dòng truy nẩ ượ ử ụ ệ ấ ợ ươ ứ ạ ề th ng. Đ i v i các ph ng th c c n hi u su t bi n n p cao h n (ví d : xây d ng thố ố ớ ươ ứ ầ ệ ấ ế ạ ơ ụ ự ư vi n cDNA, xây d ng th vi n phân tích trình t DNA...) thì t t h n h t là dùngệ ự ư ệ ự ố ơ ế ph ng pháp đi n bi n n p. Tuy nhiên, n u không có s n thi t b bi n n p b ng đi nươ ệ ế ạ ế ẵ ế ị ế ạ ằ ệ thì v n có th thu đ c hi u su t bi n n p cao b ng cách dùng các ch ng vi khu nẫ ể ượ ệ ấ ế ạ ằ ủ ẩ thích h p h n cho m c đích này và có th thu đ c hi u su t 10ợ ơ ụ ể ượ ệ ấ 9 th bi n n p/µgể ế ạ plasmid.

II. Bacteriophage λ vector

Phage l la môt virus mang DNA s i đôi co kich th c khoang 50 kb, DNA cua no ợ ướ dang phân t mach thăng co hai đâu bô tr s i đ n dai 12 nucleotide (đ c dung lamở ử ợ ợ ơ ượ

đâu cos). Sau khi xâm nhiêm vao vi khuân vât chu, DNA tao vong ngay lâp t c băng ứ cach ghep hai đâu kêt dinh cos nh enzyme DNA ligase cua vât chu (Hinh 4.8). Cac giaiờ đoan tiêp đo co thê dân đên viêc hoăc lam tan (lysis) tê bao vât chu (bao gôm viêc san xuât va giai phong cac phage thê hê con) hoăc la gây ra hiên t ng tiêm tan (lysogeny) ượ (trong giai đoan nay λ DNA h p nhât vao trong chromosome cua vât chu). ợ

Cac phage co kha năng th c hiên tai nap mang gen t tê bao vi khuân cho (donor) ự ừ sang tê bao nhân (recipient). Vector phage λ đ c s dung rông rai đê xây d ng th viên ượ ử ự ư gen (gene library), vi no mang đ c đoan DNA ngo i lai l n h n (15-23 kb) so v i ượ ạ ớ ơ ớ plasmid, dê bao quan, dê tach ra đê phân tich. u điêm nôi bât cua cac phage λ la chung Ư co hê thông t đông xâm nhâp va sinh san trong tê bao vi khuân v i môt hiêu qua cao ự ớ h n nhiêu so v i viêc đ a plasmid vao tê bao vi khuân băng biên nap. Tuy nhiên cacơ ớ ư thao tac ban đâu co ph c tap h n. ứ ơ

Hinh 4.8. Ban đô đ n gian cua bacteriophage λ genome. ơ Các gen liên quan đ nế các ch c năng khác nhau đã đ c trình bày trên s đ . ứ ượ ơ ồ cIII, N, cI, cro và cII: các gen liên quan đ n ho t đ ng đi u hòa, mi n d ch ti n phage, siêu nhi m. ế ạ ộ ề ễ ị ề ễ O và P: các gen t ng h p DNA. ổ ợ Q: gen đi u hòa ch c năng mu n. ề ứ ộ S và R: các gen phân gi i t bào v tả ế ậ ch . Pủ L: promoter bên trái, PR: promoter bên ph i, L-cos: đ u k t dính bên trái, R-cos:ả ầ ế đ u k t dính bên ph i.ầ ế ả

1. Đ c đi m cua bacteriophage ặ ể λ

Tr c đây, ng i ta nghi răng viêc s dung phage λ lam vector la rât bât tiên doướ ườ ử DNA cua no qua dai (50 kb), muôn căt ra nhiêu đoan thi phai co nhiêu trinh t căt. Tuy ự nhiên, vê sau ng i ta đa phat hiên gi a DNA cua phage λ co vung đêm (stuffer) hay ườ ở ữ con goi la vung trung tâm có chi u dài b ng kho ng 1/3 chi u dài c a phage λ , vung ề ằ ả ề ủ nay không quan trong va nêu căt no đi thi vân không anh h ng đên kha năng sinh san ưở cua phage l trong tê bao vi khuân chu va kh năng lam tan tê bao chu. Vì th , ng i ta ả ế ườ đa căt bo đo n stuffer đê lăp cac đoan gen ngoai lai vao. Do DNA phage λ co dang mach ạ thăng nên khi bi căt gi a se tach r i lam thanh hai nhanh (arms): phai va trai. Đoan gen ở ữ ờ ngoai lai đ c găn vao gi a sao cho DNA tai tô h p không l n h n 105% hay nho h n ượ ữ ợ ớ ơ ơ 78% cua bô gen binh th ng cua phage λ . Kha năng co thê mang môt DNA ngoai lai dai ườ h n cua plasmid la môt u thê cua phage λ . Điêu đo co nghia răng khi lây đoan stufferơ ư ra (chi con 60% chiêu dai binh th ng cua phage λ ) thi no qua ngăn đê lăp vao đâu, no ườ chi l p đ c khi DNA ngoai lai g n thêm vao chô trông. Nh vây, dê xac đinh DNA ắ ượ ắ ờ ngoai lai đa găn vao phage λ hay ch a va đông th i tinh chât nay cung giup loai bo cac ư ờ phage λ khi đoan DNA ngoai lai bi căt r i ra. ờ

Trên vector phage λ ng i ta cũng đa chon đ c cac v trí nhân biêt cho cacườ ượ ị enzyme c t han chê, va xây d ng ph ng phap đong goiắ ự ươ in vitro (in vitro packing) để đ a đoan DNA đa đ c găn vao đâu cua phage.ư ượ

2. Tao dong trong bacteriophage λ

Bacteriophage λ v i genome ph c tap va l n đ c dung nh môt vector, DNA cuaớ ứ ớ ượ ư no ch a môt sô vi tri thich h p cho cac RE cân thiêt đê tao dong. Cac b c tao dong ứ ợ ướ trong phage λ đ c tóm t t nh sau (Hình 4.9 và 4.10):ượ ắ ư

- Tinh sach DNA vector băng ly tâm theo gradient tôc đô hoăc điên di gel sau khi đa đ c căt băng RE. ượ

- Cac nhanh phai va trai sau đo đ c liên kêt v i DNA ngoai lai kích th c ượ ớ ướ kho ng 20 kb co đâu kêt thuc t ng đông v i đâu cua cac nhanh.ả ươ ớ

- Kêt qua cac DNA tai tô h p đ c đong goi ợ ượ in vitro trong cac phage λ .

- Cac phage tai tô h p mang cac đo n DNA ngoai lai mong muôn đ c xac đinh ợ ạ ượ băng ph ng pháp lai nucleic acid. ươ

- Tinh sach va chon tê bao vât chu ( E. coli) cho no sinh san đê duy tri va phân tich các đoan DNA ngo i lai. ạ

2.1. Chon vector λ thich h p ợ

Co hai yêu tô anh h ng đên s chon loc, đó là enzyme c t h n ch đ c s ưở ự ắ ạ ế ượ ử d ng và kich th c DNA ngoai lai. Chi khoang 60% genome (nhanh trai và nhanh phai)ụ ướ la cân thiêt cho s sinh tan cua phage. Kha năng sông sot cua phage giam khi DNA dai ự h n 105% hoăc ngăn h n 78% so v i genome t nhiên đa đ c đong goi. Điêu quanơ ơ ớ ự ượ trong la chon vector va DNA ngoai lai nh thê nao đê kich th c cua phage tai tô h p ư ướ ợ năm trong gi i han cho phep. ớ

Hình 4.9. Các b c t o dòng trong bacteriophage ướ ạ λ . DNA ngu n đ c c tồ ượ ắ b ng ằ BamHI và đ c phân đo n theo kích th c (kho ng 20 kb). Bacteriophage l cũngượ ạ ướ ả

đ c phân c t b ng ượ ắ ằ BamHI. Hai m u này đ c tr n vào nhau và x lý b ng T4 DNAẫ ượ ộ ử ằ ligase. Ph n ng g n x y ra t o m t bacteriophage λ m i (tái t h p): đo n stufferả ứ ắ ả ạ ộ ớ ổ ợ ạ đ c thay b ng đo n DNA ngo i lai. Nh ng phân t này đóng gói ượ ằ ạ ạ ữ ử in vitro trong đ uầ c a phage λ , và chúng có th gây nhi m sau khi đ c thêm ph n đuôiủ ể ễ ượ ầ

Hình 4. 10 . Phân t DNA c a phage ử ủ λ . A: T tái b n DNA t d ng vòng c a λự ả ừ ạ ủ làm cho nó tr thành d ng dây th ng, hình thành các đo n ch ng l p lên nhau, v i đở ạ ẳ ạ ồ ấ ớ ộ dài kho ng 50 kb. B: M i đ u đ u ch a đ y 50 kb đ n v c a l DNA , tr c khi đuôiả ỗ ầ ề ứ ầ ơ ị ủ ướ đ c t ng h p g n vào sau.ượ ổ ợ ắ

Môt sô vector λ đa đ c thiêt k thuân l i cho sinh tr ng cua chúng trong ượ ế ợ ưở E. coli mang prophage P2, phenotype nay đ c goi la ượ Spi+. Cac chung λ thiêu hai gen cân thiêt trong tai tô h p ( ợ red va gam) biêu hiên phenotype Spi - se sinh tr ng tôt trong cac thê ưở tiêm tan P2 ch ng nao ma chung con mang chuôi ừ chi (chi la c chât cho s tai tô h p ơ ự ợ đ c xuc tac b i hê thông ượ ở recA).

Tao dong các vector λ L47.1, λ 1059 hoăc λ BF101 đa đ c tiên hanh băng cách ở ượ lo i b đoan stuffer ch a ạ ỏ ứ red va gam. Kêt qua thu đ c phage tai tô h p la ượ ợ Spi - va chung co thê đ c nhân biêt hoăc chon loc băng kha năng sinh tr ng cua chung trên ượ ưở cac thê tiêm tan P2 recA+ cua E. coli .

Hâu hêt cac vector thay thê mât gen gam khi đoan stuffer bi lo i b . Cac thê tai tô ạ ỏ h p đ c tao thanh v i cac vector nh thê phai đ c sinh san trong vi khuân ợ ượ ớ ư ượ recA+. Phage l sep6-lac5 mang cac gen red va gam trong nhanh phai cua no và cac thê tai tô h p ợ đ c tao thanh v i vector nay có phenotype ượ ớ Spi+ co thê đ c nhân lên trong vi khuân ượ mang đôt biên recA-.

2.2. Nh ng vector λ đ c c i ti nữ ượ ả ế

Nh ng vector λ th ng đ c c i ti n nh m m c đích:ữ ườ ượ ả ế ằ ụ

- Tăng kh năng thích ng c a các đo n DNA ngo i lai khác nhau v i các RE.ả ứ ủ ạ ạ ớ

- Cho phép ch n l a ph ng th c tái t h p mong mu n.ọ ự ươ ứ ổ ợ ố

- Cho phép có đ c các RNA probe s n sàng cho vi c chuy n mã c a DNAượ ẵ ệ ể ủ ngo i lai g n vào vector. Đi u này giúp chúng ta d dàng sàng l c các th vi n trongạ ắ ề ễ ọ ư ệ quá trình chromosome walking, ví d nh λ ZAP.ụ ư

- Phát tri n các vector trong quá trình g n vào cDNA c a sinh v t b c cao, d iể ắ ủ ậ ậ ướ hình th c m t polypeptide dung h p v i β-galactosidase. Hình th c này r t h u íchứ ộ ợ ớ ứ ấ ữ trong vi c ch n l c kháng th , ví d nh vector λgt11.ệ ọ ọ ể ụ ư

Hình 4.11. Vector EMBL3 và EMBL4 đ c thi t k t phage l mang các vượ ế ế ừ ị trí nh n bi t cho các enzyme ậ ế SalI, BamHI và EcoRI

Th h g n đây nh t c a vector l là EMBL3 và EMBL4 (Hình 4.11), chúng mangế ệ ầ ấ ủ các trình t có tính ch t polylinker n m g n đo n có th thay th đ c. Các phage v iự ấ ằ ầ ạ ể ế ượ ớ nh ng th insert đính bên trong nó có th đ c ch n l c b ng ki u hình ữ ể ể ượ ọ ọ ằ ể Spi -, chính là chi+. Th c i ti n t EMBL3 có nh ng đ t bi n EMBL3 ể ả ế ừ ữ ộ ế Sam, EMBL3 Aam Sam. Nh ng đ t bi n trong vector không ch làm gia tăng kh năng ch a c a nó, mà cònữ ộ ế ỉ ả ứ ủ đ c s d ng trong h th ng ch n l c nh ng trình t DNA đ c phân l p, liên k tượ ử ụ ệ ố ọ ọ ữ ự ượ ậ ế v i các gen c ch (suppressor).ớ ứ ế

III . Cosmid vector1. Đ c đi m c a cosmidặ ể ủ

Cosmid la cac vector đăc biêt đ c xây d ng b i plasmid + đ u ượ ự ở ầ cos dùng đê tao dong cac đoan DNA kích th c l n cua eukaryote (Hình 4.12). Cac thanh phân không ướ ớ thê thay thê cua cac cosmid vector bao gôm:

- Các marker khang kháng sinh va môt trình t ự ori cua plasmid.

- Đoan DNA mang đâu dinh cos cua phage l .

- Kich th c nho sao cho cac đoan DNA eukaryote dai kho ng 45 kb co thê thich ướ ả ng.ứ

Hình 4.12. B n đ và vùng t o dòng c a vector cosmid pWEB-TNC. ả ồ ạ ủ V tríị t o dòng ạ SmaI n m bên c nh các c p ằ ạ ặ BamHI, NotI và EcoRI. Chlr: gen kháng chloramphenicol.

2. T o dòng trong cosmidạ

Cac nguyên tăc c ban cua ph ng phap tao dong trong cosmid đ c trinh bay ơ ươ ượ ở hinh 4.13. Tr c h t cosmid đ c c t v i RE th nh t ( ướ ế ượ ắ ớ ứ ấ ScaI) đ t o thành m chể ạ ạ th ng, sau đó phân t m ch th ng đ c c t ti p v i RE th hai (ẳ ử ạ ẳ ượ ắ ế ớ ứ BamHI) đ làm thànhể hai nhánh (nhánh l n và nhánh nh ). M t nhánh ch a đ u ớ ỏ ộ ứ ầ cos, gen kháng kháng sinh và vùng ori; nhánh còn l i ch ch a đ u ạ ỉ ứ ầ cos th hai. Hai nhánh này k t h p v i genomicứ ế ợ ớ DNA đã đ c c t v i RE (cùng lo i v i RE th hai c t cosmid thành hai nhánh) nhượ ắ ớ ạ ớ ứ ắ ờ

DNA ligase, cu i cùng t t c chúng đ c đóng gói ố ấ ả ượ in vitro trong đ u c a các ti u thầ ủ ể ể phage l tr ng thành. S đong goi cac phân t tai tô h p trong cac tiêu thê phage chưở ự ử ợ ỉ th c hi n cho cac thê tai tô h p co kich th c khoang 40-50 kb. Cac cosmid vectorự ệ ợ ướ đ c thiêt kê tôi u nhât co chiêu dai t 4-6 kb va vi thê chung co thê thich h p v iượ ư ừ ợ ớ DNA ngoai lai có kích th c kho ng 45 kb. ướ ả

Măc du co nh ng thuân l i vê kich th c, cac cosmid dung lam vector cung co ữ ợ ướ môt sô kho khăn sau:

- Găn vector v i vector: s tai tô h p trong phân t (intramolecular) gi a hai hoăc ớ ự ợ ử ữ nhiêu vector trong môt cosmid đ n co thê dân đên căt bo DNA cua cosmid vector va cuôi ơ cung mât cosmid do phân ly.

- S chât đông lôn xôn (scrambling): xuât hiên do s xâm nhiêm vao trong cungự ự môt vector cua hai hoăc nhiêu đoan không canh v i đoan DNA mong muôn trong bô ở ớ gen gôc (original genome).

- Kho khăn trong viêc sang loc môt sô l ng l n khuân lac vi khuân. ượ ớ

S tiên l i cua ph ng phap tao dong cac đoan DNA l n trong cosmid đa đ cự ợ ươ ớ ượ Royal va cs. (1979) công bô đâu tiên. Ông co thê phân lâp t th viên cosmid cua DNA ừ ư ga hai đoan ch ng lên nhau (overlapping) mang gen ovalbumin va hai gen giông ồ ovalbumin. Gân đây h n, cac th viên gen dùng cosmid vector mang DNA ruôi giâm, ơ ư DNA chuôt, DNA ng i cung đa đ c xây d ng. ườ ượ ự

Hình 4.13 cho th y cosmid có ch a v trí ấ ứ ị ori c a ủ E. coli (cho phép cosmid đ cượ duy trì nh m t plasmid trong ư ộ E. coli). Hai đ u ầ cos g n v trí c t h n ch ầ ị ắ ạ ế ScaI và BamHI. DNA ngu n đ c c t b i ồ ượ ắ ở BamHI đ phân đo n có kích th c kho ng 40 kb.ể ạ ướ ả Gen kháng Tet (Tet r ) đ nh v g n ị ị ầ cos. Phân t d ng plasmid đ c c t b i ử ạ ượ ắ ở BamHI và ScaI. Ba m u DNA này đ c tr n vào nhau và đ c g n b ng T4 DNA ligase. Sau khiẫ ượ ộ ượ ắ ằ g n xong, nh ng phân t này đ c đóng gói trong ph n đ u c a phage l , và nh ngắ ữ ử ượ ầ ầ ủ ữ ph n t có th lây nhi m s đ c hình thành sau khi t o đuôi.ầ ử ể ễ ẽ ượ ạ

Hình 4.13. T o dòng trong cosmidạ

IV. Bacteriophage M13 vector1. Đ c đi m c a bacteriophage M13ặ ể ủ

M13 la phage dang s i (filamentous bacteriophage) v i DNA vong đong, dai ợ ớ khoang 6.500 nucleotide (Hình 4.14). M13 đ c xem nh là môt vât truyên tao dong ượ ư (cloning vehicle), cac vector M13 va cac DNA primer đăc biêt đa đ c xây d ng cho ượ ự

phep tao dòng đo n DNA l n h n 350 bp t môt dong đ n. Tao dòng cac đoan DNA dai ạ ớ ơ ừ ơ đ c tiên hanh băng cach tao dòng t ng đo n ng n ch ng lên nhau.ượ ừ ạ ắ ồ

2. T o dòng trong bacteriophage M13ạ

Vân đê chinh trong tao dong M13 la s không ôn đinh cua cac đoan DNA ngoai lai ự có kích th c l n, cac trình t l n h n 1.000 nucleotide th ng không ôn đinh va lamướ ớ ự ớ ơ ườ tăng cac đoan khuyêt trong quá trình sinh san cua bacteriophage. Tuy nhiên, cac đoan DNA ngoai lai gôm 300-400 nucleotide th ng la ôn đinh đê tiên hanh cac ng dung ườ ứ nh đa noi trên.ư ở

Ngoai tr vung 507 nucleotide đ c biêt nh la chuôi liên gen (intergenic ừ ượ ư sequence-IS) con tât c hê gen cua M13 đêu ch a thông tin di truyên không thay thê cho ả ứ s sao chep cua virus. Vung IS nhân cac đoan DNA ngoai lai nh ng không anh h ngự ư ưở đên kha năng sông sot cua tê bao. Trong cac dang phân chia cua M13 co hai chuôi (trình t ) xâm nhiêm:ự

- Đâu tiên la chuôi operon lac cua E. coli ch a gen điêu hoa (regulator) va ma hoaứ thông tin cho 146 amino acid đâu tiên cua gen ß -galactosidase ( Z). Phân amino đâu tân ở cung cua protein ß -galactosidase co thê bô tr (bô tr α ) gen b -galactosidase sai hong ợ ợ (defective) co măt trong episome F trong tê bao vât chu. S bô tr nay san xuât ß ự ợ -galactosidase hoat đông lam tăng mau xanh khi phage va cac tê bao sinh tr ng trong ưở môi tr ng co nhân tô cam ng isopropyl-thiogalactoside (IPTG) va c chât nhiêm s cườ ứ ơ ắ thê X-gal.

- Loai chuôi th hai la đoan DNA nho, polylinker có ch a môt sô vi tri căt han chê ứ ứ đa đ c găn trong đâu tân cung amino cua gen ß -galactosidase. S xâm nhiêm nay ượ ự không anh h ng đên kha năng bô tr cua chuôi peptide ß -galactosidase cho đôt biên ß - ưở ợ galactosidase. Cac phage mang cac đoan chèn đã lam tăng cac vêt không mau khi sinh tr ng trên môi tr ng co măt IPTG va X-gal.ưở ườ

Hình 4.14. D ng t nhiên c a bacteriophage M13ạ ự ủ . Các gen t 1-10 có cácừ ch c năng khác nhau liên quan đ n c u trúc v protein và phát sinh hình thái c a phage.ứ ế ấ ỏ ủ

Vector tao dong M13 đung tiêu chuân (phagemid) đ c trinh bay hinh 4.15, cac ượ ở vector tao dong M13 khac loai vector kê trên là cac vi tri căt han chê trong polylinker. ở

Đăc biêt, cac đoan DNA nho co vai tro nh môt primer cung đ c tao dong trên ư ượ plasmid hoăc đ c tông h p hoa hoc. Cac primer nh vây t ng đông v i vector M13 ượ ợ ư ươ ớ trong đoan gen b -galactosidase canh đoan polylinker. ở

Hình 4.15. Vector M13mp18 (phagemid). Đây là m t trong các vector đ c sộ ượ ử d ng ph bi n c a nhóm vector M13mp.ụ ổ ế ủ

V. BAC vector1. Đ c đi m c a BACặ ể ủ

H th ng nhi m s c th nhân t o c a vi khu n (bacterial artificial chromosome-ệ ố ễ ắ ể ạ ủ ẩBAC) d a trên c s plasmid F-factor, nó có th tái b n trong ự ơ ở ể ả E. coli v i các đo n chènớ ạ có kích th c lên đ n 300 kb. Th tái t h p BAC đ c bi n n p vào trong t bào viướ ế ể ổ ợ ượ ế ạ ế khu n b ng xung đi n (electroporation)ẩ ằ ệ 8. Các BAC thu n l i cho vi c xây d ng thậ ợ ệ ự ư vi n, l p b n đ và phân tích genome. Chúng có hi u su t t o dòng cao, các đo n chènệ ậ ả ồ ệ ấ ạ ạ DNA đ c thao tác d dàng và duy trì n đ nh.ượ ễ ổ ị

M t plasmid F c b n bao g m b n vùng c n thi t có ch c năng n đ nh plasmidộ ơ ả ồ ố ầ ế ứ ổ ị và quy t đ nh s l ng b n sao. Đó là ế ị ố ượ ả parA, parB, oriS và repF. C hai ả parA và parB đ u c n cho vi c phân đo n và n đ nh plasmid. Ngoài ra, ề ầ ệ ạ ổ ị parB còn c n cho vi c k tầ ệ ế h p v i các F-factor khác, ợ ớ oriS là g c tái b n DNA, ố ả repF mang tín hi u c a protein Eệ ủ c n cho quá trình t tái b n t ầ ự ả ừ oriS và quá trình ki m soát s l ng b n sao. Trênể ố ượ ả plasmid F ng i ta còn b sung thêm gen kháng chloramphenicol (ườ ổ CMr ho c ặ Chlr) và

gen lacZ đ làm marker ch n l c các th bi n n p. Ch ng ể ọ ọ ể ế ạ ủ E. coli đ c s d ng phượ ử ụ ổ bi n cho k thu t t o dòng BAC là DH10B, đ c đi m chính c a nó là mang nh ng đ tế ỹ ậ ạ ặ ể ủ ữ ộ bi n ngăn c n:ế ả

- S phân c t DNA l b i h enzyme n i sinh (ự ắ ạ ở ệ ộ hsd/RMS).

- S phân c t DNA có g c methyl (5’-methyl cytosine, 5’-hydromethylcytosine,ự ắ ố g c methyladenine) (ố mcrA, mcrB, mcrC và mrr).

- S tái t h p (ự ổ ợ recA1).

Nhìn chung, các BAC vector có các đ c đi m t ng t v i các plasmid vectorặ ể ươ ự ớ tiêu chu n c a ẩ ủ E. coli, nh :ư

- Ch a vùng ứ ori c n thi t cho tái b n c a plasmid.ầ ế ả ủ

- Có ngu n g c t m t plasmid l n trong t nhiên: F-factor.ồ ố ừ ộ ớ ự

- Có s l ng b n sao th p (1-2 b n sao/t bào).ố ượ ả ấ ả ế

- Hi u su t bi n n p th p đã đ c kh c ph c b ng ph ng pháp xung đi n đệ ấ ế ạ ấ ượ ắ ụ ằ ươ ệ ể đ a DNA tái t h p vào t bào ư ổ ợ ế E. coli.

M t s u đi m c a h th ng BAC so v i YAC:ộ ố ư ể ủ ệ ố ớ

- n đ nh.Ổ ị

- D bi n n p.ễ ế ạ

- T c đ sinh tr ng c a v t ch ố ộ ưở ủ ậ ủ E. coli nhanh.

- D tinh s ch.ễ ạ

Vì th , h u h t genome ng i đ u đ c phân tích trình t b ng cách dùng cácế ầ ế ườ ề ượ ự ằ dòng BAC h n là các dòng YAC.ơ

2. T o dòng trong BACạ

Quá trình t o dòng trong BAC vector đ c trình bày trong hình 4.16, bao g m cácạ ượ ồ b c sau:ướ

Hình 4.16. T o dòng trong BAC vectorạ

- BAC vector đ c c t b ng enzyme h n ch ượ ắ ằ ạ ế HindIII (có v trí nh n bi t n mị ậ ế ằ trên gen lacZ), sau đó hai đ u ầ HindIII c a vector đ c dephosphoryl hóa b ngủ ượ ằ phosphatase đ ngăn c n s tái t o l i vòng.ể ả ự ạ ạ

- DNA có kh i l ng phân t cao đ c b c trong agarose và sau đó phân đo nố ượ ử ượ ọ ạ cũng b ng ằ HindIII nh tr ng h p vector.ư ườ ợ

- G n vector và các đo n DNA có kích th c >150 kb b ng enzyme T4 DNAắ ạ ướ ằ ligase, sau đó bi n n p vào ế ạ E. coli b ng xung đi n.ằ ệ

- Ch n l c th tái t h p trên môi tr ng nuôi c y có b sung CM và IPTG. Cácọ ọ ể ổ ợ ườ ấ ổ khu n l c có màu tr ng là khu n l c mang th tái t h p, còn các khu n l c có màuẩ ạ ắ ẩ ạ ể ổ ợ ẩ ạ xanh là khu n l c không mang th tái t h p.ẩ ạ ể ổ ợ

VI. YAC vector1. Đ c đi m c a YACặ ể ủ

Nhi m s c th nhân t o c a n m men (yeast artificial chromosome-YAC) là cácễ ắ ể ạ ủ ấ vector t o dòng m ch th ng d a trên c u trúc nhi m s c th t nhiên c a n m men.ạ ạ ẳ ự ấ ễ ắ ể ự ủ ấ Chúng có th đ c c t thành hai đo n ho c hai nhánh nhi m s c th đ nh n cácể ượ ắ ạ ặ ễ ắ ể ể ậ đo n r t l n có kích th c lên đ n 2.000 kb. C u trúc c a YAC sau đó có th đ a vàoạ ấ ớ ướ ế ấ ủ ể ư các t bào n m men có thành t bào đã b lo i b (spheroplast), đó chúng đ c duyế ấ ế ị ạ ỏ ở ượ trì n đ nh nh các nhi m s c th t tr (autonomous). Th vi n YAC đ c l p ráp vàổ ị ư ễ ắ ể ự ị ư ệ ượ ắ s d ng cho vi c l p b n đ các vùng có kích th c l n c a DNA ng i. Do kíchử ụ ệ ậ ả ồ ướ ớ ủ ườ th c l n c a chúng cho nên k thu t phân tích thích h p h n c là đi n di gel tr ngướ ớ ủ ỹ ậ ợ ơ ả ệ ườ gián đo n (pulsed field gel electrophoresis-PFGE). Nh c đi m c a YAC là hi u su tạ ượ ể ủ ệ ấ t o dòng c a m t vài h th ng t ng đ i th p, s xu t hi n các dòng kh m (các tạ ủ ộ ệ ố ươ ố ấ ự ấ ệ ả ế bào bi n n p ch a hai m u DNA không li n k nhau), s không n đ nh c a đo nế ạ ứ ẫ ề ề ự ổ ị ủ ạ chèn và thao tác chúng t ng đ i khó khăn so v i các h th ng vi khu n.ươ ố ớ ệ ố ẩ

Tr c năm 1987, các h th ng t o dòng thích h p ch y u d a trên ướ ệ ố ạ ợ ủ ế ự E. coli và chỉ có th nh n các đo n DNA t ng đ i nh . Các vector vi khu n có kh năng l n nh tể ậ ạ ươ ố ỏ ẩ ả ớ ấ cũng ch có th nh n các đo n DNA trong ph m vi kích th c t 35-45 kb. Tuy nhiên,ỉ ể ậ ạ ạ ướ ừ các YAC vector có th t o dòng các đo n DNA có kích th c t 100-2.000 kb. Sauể ạ ạ ướ ừ này, ng i ta cũng đã phát tri n các vector vi khu n m i có kh năng t o dòng cácườ ể ẩ ớ ả ạ đo n DNA l n h n, nh ng cho đ n nay v n ch a th đ t đ c kh năng nh cácạ ớ ơ ư ế ẫ ư ể ạ ượ ả ư YAC. Kh năng r t l n này c a YAC đã đ c khai thác đ xây d ng các b n đ v tả ấ ớ ủ ượ ể ự ả ồ ậ lý th h th nh t và th hai c a genome ng i.ế ệ ứ ấ ứ ủ ườ

B ng 4.1. So sánh m t s đ c đi m c a các vector t o dòngả ộ ố ặ ể ủ ạ

2. T o dòng trong YACạ

Vector YAC đ c s d ng r ng rãi nh t đ xây d ng các th vi n YAC làượ ử ụ ộ ấ ể ự ư ệ pYAC4 (Hình 4.17). C t plasmid m ch vòng dài 11 kb b ng enzyme h n ch ắ ạ ằ ạ ế BamHI t o thành m t phân t m ch th ng có các trình t telomere (TEL) c hai đ u. Đo nạ ộ ử ạ ẳ ự ở ả ầ ạ n m gi a hai v trí ch a gen ằ ữ ị ứ his3 là đo n “stuffer” dài 1,8 kb đã đ c lo i b .ạ ượ ạ ỏ

V trí t o dòng đ chèn đo n DNA ngo i lai là ị ạ ể ạ ạ EcoRI. Đây là v trí c t phân tị ắ ử m ch th ng thành hai nhánh c a YAC, nhánh ph i là m t đo n dài 3,4 kb và nhánh tráiạ ẳ ủ ả ộ ạ dài 6 kb ch a các nhân t CEN4 và ARS1. V trí ứ ố ị EcoRI n m trong gen ằ sup4. S n ph mả ẩ c a gen này là m t tRNA đ t bi n c ch s đ t bi n ochre (nonsense) trong gen ủ ộ ộ ế ứ ế ự ộ ế ade2. Khi m t đo n DNA đ c t o dòng trong gen ộ ạ ượ ạ sup4 thì s c ch b đào th i và quáự ứ ế ị ả trình chuy n hóa adenine b gián đo n, d n đ n tích lũy ti n ch t trao đ i có màu để ị ạ ẫ ế ề ấ ổ ỏ (phosphoribosyl-aminoimidazole) cho ra các dòng tái t h p màu đ đ phân bi t.ổ ợ ỏ ể ệ

Hình 4.17. Vector pYAC4. V trí t o dòng ị ạ EcoRI trong gen ở sup4. trp1 và ura3 là các marker ch n l c nhánh trái và ph i c a YAC t ng ng. TEL là hai trình tọ ọ ở ả ủ ươ ứ ự telomere và CEN4 cung c p ch c năng ph n tâm.ấ ứ ầ

Hai marker ch n l c c a n m men, ọ ọ ủ ấ trp1 và ura3 các nhánh trái và ph i t ngở ả ươ ng, mã hóa các enzyme cho phép các t bào n m men mang YAC đ s n xu tứ ế ấ ể ả ấ

tryptophan và uracil đi u ki nở ề ệ de novo. Dòng n m men v t ch ấ ậ ủ S. cerevisiae AB 1380 (MATaψ+, ura3, trp1, ade2-1, can1-100, lys2-1, his5) không có kh năng này, vàả sinh tr ng c a n m men này trong môi tr ng thi u các ch t chuy n hóa nh th choưở ủ ấ ườ ế ấ ể ư ế phép ch n l c d ng tính đ i v i các phân t tái t h p ch a c hai nhánh c a YAC.ọ ọ ươ ố ớ ử ổ ợ ứ ả ủ

Tai liêu tham kh o/đ c thêm ả ọ

1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl

K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.

2. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and

Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press. USA.

3. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory

Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA.

4. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed.

Blackwell Science, Oxford, UK.

5. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press

Inc. New Jersey, USA.

6. Singleton P and Sainsbury D. 2001. Dictionary of Microbiology and Molecular

Biology. 3rd ed. John Wiley & Sons, Ltd. UK.

1Colicin: Môt nhóm bât ky cua cac protein đ c san xuât b i cac vi khuân khac nhau c ượ ở ứ chê sinh tr ng hoăc giêt chêt cac vi khuân khac. ưở 2Haemolysin: dung huy t t , ch t gây tan máu, ch t tiêu h ng c u.ế ố ấ ấ ồ ầ3Enzyme s a đôi (modification enzymes): là các enzyme tác đ ng qua l i v i DNA đử ộ ạ ớ ể s a đ i c u trúc ho c s a ch a các t n th ng đã x y ra v i phân t DNA.ử ổ ấ ặ ử ữ ổ ươ ả ớ ử4Enzyme han chê (restriction enzymes hay restriction endonuclease, RE): xem ch ng 1. ươ5Stringent control: Còn g i là ki m soát sao chép ch t ch (stringent replicationọ ể ặ ẽ control), mô ta s gi i han nhân b n cua cac plasmid v i s sao chep c a chromosome ự ớ ả ớ ự ủ vi khuân.6 Relaxed control: Con goi la kiêm soat sao chep l ng l o (relaxed replication control): ỏ ẽ liên quan đên kha năng cua môt sô plasmid tiêp tuc sao chep sau khi vi khuân ng ng ừ phân chia.7Gen lacZ': gen c a ủ E. coli mã hóa b - galactosidase thích h p cho ch n l c th bi nợ ọ ọ ể ế n p b ng khu n l c xanh ( b -galactosidase s k t h p v i IPTG và X-gal đ c bạ ằ ẩ ạ ẽ ế ợ ớ ượ ổ sung trong môi tr ng nuôi c y) và tr ng (đo n DNA ngo i lai xen vào gi a gen ườ ấ ắ ạ ạ ữ lac ZZ làm cho gen này m t ho t tính vì th không s n xu t đ c b -galactosidase).ấ ạ ế ả ấ ượ8Chromosome walking: K thu t dùng đ l p b n đ nhi m s c th t t p h p cácỹ ậ ể ậ ả ồ ễ ắ ể ừ ậ ợ đo n c t h n ch ch ng lên nhau. B t đ u t chu i DNA đã bi t có th phát hi nạ ắ ạ ế ồ ắ ầ ừ ỗ ế ể ệ đ c các đo n c t h n ch khác và b n đ m t vùng đ c bi t đ c xây d ng d nượ ạ ắ ạ ế ả ồ ộ ặ ệ ượ ự ầ d n.ầ9 đi n áp cao tính th m c a màng t bào đ c tăng lên s giúp cho DNA ngo i laiƠ ệ ấ ủ ế ượ ẽ ạ d dàng đi vào bên trong.ễ10P1 bacteriophage vector.11Nhi m s c th nhân t o có ngu n g c t P1 (P1-derived artificial chromosome). ễ ắ ể ạ ồ ố ừ

Ch ng 5 ươ

Tao dong genomic DNA cua eukaryote va xây d ng th ự ư viên genomic DNA

Th viên genomic DNA la môt tâp h p cac đoan DNA cung đai diên cho môtư ợ genome nguyên ven (hoăc gân nguyên ven) cua ca thê ma DNA đ c băt nguôn t đo. ượ ừ

Cac đoan nay năm trong cac vector t sao chep cho phep chung đ c duy tri va sinh san ự ượ cung v i tê bao cua c thê vi sinh vât, nh vi khuân ớ ơ ư Escherichia coli hoăc nâm men Saccharomyces cerevisiae. Nh ng th viên nh thê co thê bao quan nh la môt nguônữ ư ư ư cô đinh cua cac đo n DNA đai diên cho môt c thê đăc biêt. Môt phong thi nghiêm nay ạ ơ co thê thu thâp th viên genome t môt phong thi nghiêm khac hoăc t môt nguôn ư ừ ừ th ng mai nh la môt cach l a chon đê xây d ng th viên riêng cua minh.ươ ư ự ự ư

Môt khi thu đ c, cac th viên đ c dung chu yêu hoăc đê sang loc theo cac ượ ư ượ ph ng phap khac nhau nhăm phân lâp môt (cac) trình t nucleotide quan tâm đăc biêt,ươ ự hoăc đê xac đinh vi tri va th t cua cac trình t trong genome ma t đo th viên đ c ứ ự ự ừ ư ượ xây d ng (physical mapping).ự

Xây d ng môt th viên genomic DNA bao gôm b n giai đoan chinh (Hinh 5.1):ự ư ố Căt DNA, găn DNA vao vector, đong goi cac dong tai tô h p trong v protein cua virus ợ ỏ đê lam b c trung gian tr c khi xâm nhi m vao tê bao vât chu, va chuyên câu truc đo ướ ướ ễ vao tê bao vât chu.

I. Căt genomic DNA băng cac enzyme h n ch ạ ế

Đê đ a toan bô cac gen cua genome vao môt th viên, tr c hêt genome phai ư ư ướ đ c căt b i enzyme han ch thanh cac đoan DNA co kich th c thich h p tuy thuôcượ ở ế ướ ợ vao loai vector nhân chung. Genomic DNA th ng đ c căt băng enzyme han ch co ườ ượ ế trinh t nhân biêt 4 bp, ví d nh ự ụ ư MboI nhân biêt trinh t 5’-GATC-3’ . Tuy nhiên, ự không phai dê dang thu đ c môt gen nguyên ven năm trên môt đoan DNA. Trong th c ượ ự tê, môt gen th ng bi căt thanh nhiêu đoan DNA do vi tri nhân biêt cua enzyme năm ườ ngay trong gen.

Hinh 5.1. Xây d ng th viên genomic DNA. ự ư Cac giai đoan trong xây d ng th viên ự ư DNA trong vector bacteriophage l . a, b, c và d trình bày s khác nhau (nh ng ch ng lênự ư ồ nhau) c a các đo n DNA trong genome, đ c h p nh t trong các vector riêng r và đ iủ ạ ượ ợ ấ ẽ ạ di n nh là các dòng riêng bi t trong m t th vi n.ệ ư ệ ộ ư ệ

Thông th ng, môt phan ng căt t ng phân genomic DNA đ c tiên hanh băngườ ứ ừ ượ cach dung môt l ng tôi thiêu enzyme va u trong môt th i gian ngăn sao cho moi vi tri ượ ờ nhân biêt không bi căt đông th i . Do cac vi tri căt đ c phân bô ngâu nhiên nên môt gen ờ ượ vân co thê đ c bao toan nguyên ven ngay khi no ch a vi tri nhân biêt trong gen. DNA ượ ứ sau đo đ c phân đoan va chi co cac đoan co kich th c năm trong pham vi mong muôn ượ ướ đ c chon loc. Cac đoan DNA đ c đ a vao vector thich h p. Tâp h p cac vector ch aượ ượ ư ợ ợ ứ cac đoan genomic DNA tao thanh th viên genomic DNA. Môi đoan DNA ch a trong ư ứ vector cua th viên đ c goi la môt dong (clone). Tùy thuôc vao kich th c cua cac ư ượ ướ đoan DNA ma chon vector la phage (co thê ch a đoan DNA dai t 15-23 kb), cosmid (45 ứ ừ kb) hay BAC (>100 kb).

Co thê s dung DNA tach t cac mô khac nhau đê xây d ng th viên genomic ử ừ ự ư DNA. Cac th viên genomic DNA cua môt c thê chi ch a cac đoan DNA dai ngăn khac ư ơ ứ nhau nh ng thông tin di truyên không thay đôi. Ng c lai, th viên cDNA đ c xâyư ượ ư ượ d ng t cac mRNA. Trong c thê co nh ng gen chi hoat đông trong nh ng loai tê baoự ừ ơ ữ ữ

nhât đinh, do đo gi a cac mô khac nhau co thê thu đ c cac phân t mRNA khac nhau. ữ ượ ử Vi vây, môt c thê co nhiêu th viên cDNA khac nhau đăc tr ng cho t ng loai tô ch c ơ ư ư ừ ứ chuyên hoa (xem ch ng 6). ươ

II. T o dòng các đo n DNA đ xây d ng th vi n genomeạ ạ ể ự ư ệ

Cac đoan DNA thu đ c t phan ng căt han ch đ c găn đông hóa tri ượ ừ ứ ế ượ in vitro vao vector tao dong băng cach dung enzyme DNA ligase. Tr c khi găn, vector đ c căt ướ ượ ra môt vi tri đ n, thông th ng la cung v i enzyme đ c dung đê căt DNA nguôn,ở ơ ườ ớ ượ nhăm tao cac đâu kêt dinh bô tr cho cac đâu cua cac đoan chèn DNA. Môt đôi khi, ợ vector va DNA nguôn đ c căt v i tô h p hai enzyme khac nhau đê ngăn can môi loai ượ ớ ợ phân t t găn lai. S t tai tao lai vong cua vector cung co thê giam thiêu băng cach xử ự ự ự ử ly v i enzyme alkaline phosphatase đê loai nhom 5’ phosphate khoi cac đâu cua vector. ớ

Môt sô l ng l n cac vector tao dong đ c phat triên cho viêc xây d ng cac th ượ ớ ượ ự ư viên DNA, chon l a vector nao phu thuôc vao pham vi kich th c cua cac đoan DNA ự ướ đ c tao dong, va cac ng dung tiêp theo.ượ ứ

1. Cac plasmid vector

Cac plasmid la các phân t DNA mach vòng đong c ng hóa tri, siêu xoăn và co ử ộ kich th c vai kilobase (ch ng 4). Măc du cac plasmid xuât hiên t nhiên, chu yêu vi ướ ươ ự ở khuân, nh ng nh ng plasmid dung trong xây d ng cac th viên DNA th ng đ c thiêt ư ữ ự ư ườ ượ kê co chu đinh v i cac câu truc nhân tao. Cac vector tao dong nay ch a cac vi tri nhân ớ ứ biêt đ n cho môt enzyme han ch ma tai đo cac DNA ngoai lai co thê đ c chèn vào ơ ế ượ (insertion). Cac vi tri cho nhiêu enzyme khac nhau co thê đ c tâp h p lai trong vùng ượ ợ tao dong (multiple cloning sites) hoăc vùng đa n i (polylinker). ố

Cac plasmid mang bô sung môt hoăc nhiêu gen ch th (marker gene), nh cac gen ỉ ị ư khang khang sinh, cho phep chi co cac tê bao ch a plasmid sinh tr ng trên môi tr ng ứ ưở ườ chon loc, va cac gen cho enzyme nh β-galactosidase cho phep cac phân t tai tô h p ư ử ợ ch a đoan chèn DNA đ c phân biêt v i cac thê không tai tô h p.ứ ượ ớ ợ

Nh c điêm cua cac plasmid đ c dung lam cac vector tao dong la kha năng ch aượ ượ ứ cua chung bi gi i han chi thich h p v i nh ng đoan DNA ngoai lai co kich th c nho ớ ợ ớ ữ ướ vai kilobase (kb) va hiêu suât biên nap cua chung vao tê bao vât chu t ng đôi thâp. ươ

2. Cac bacteriophage λ vector

Cac bacteriophage la cac virus xâm nhiêm vao vi khuân. Genome cua chung co thê la DNA s i đôi mach vong hoăc mach thăng, va đ c boc băng vo protein lam trung ợ ượ gian cho s xâm nhâp cua chung vao tê bao vât chu.ự

Bacteriophage λ la môt trong cac vector tao dong có ngu n g c virus thông dung ồ ố nhât đ c dung trong xây d ng th viên. Genome cua no bao gôm môt phân t DNA ượ ự ư ử s i đôi mach thăng dai kho ng 50 kb, phân t nay xâm nhiêm vao ợ ả ử E. coli va tao vong băng cach ghep cac đâu dinh (xem ch ng 4). Trong chu ky sinh tan (lytic cycle), cac ươ

phân t d ng vòng cua λ genome s đ c sao chép va sau đo đ c căt vi tri đăc biêtử ạ ẽ ượ ượ ở (vi tri cos) đê tao ra cac λ monomer se đong goi trong cac đâu protein hoan chinh. Cũng có khi phage λ không đi vào chu ky tan, mà chuy n sang giai đoan tiêm tan (lysogenic), ể trong suôt giai đoan nay no h p nhât ôn đinh trong nhi m s c th cua tê bao v t ch ợ ễ ắ ể ậ ủ E. coli . Cac gen đoi hoi cho ch c năng sinh tan đ c tâp h p lai trong đo n stuffer, va ứ ượ ợ ạ đ c loai bo khi xây d ng cac vector tao dong co nguôn gôc λ đê co thê nhân cac đo nượ ự ạ DNA có kich th c lên đên 20 kb. Cac vector λ tai tô h p bao gôm nhanh trai, nhanh ướ ợ phai va đoan DNA ngoai lai đ c găn vao gi a hai nhanh. Kêt qua cac thê tai tô h p sau ượ ữ ợ đo đ c đong goi trong vo protein băng cach dung hê thông đong goi ượ in vitro cho phep xâm nhiêm vao tê bao vât chu v i hiêu suât cao. ớ

Đôi v i genome đăc tr ng cua đông vât co vu dai 3 ớ ư × 109 bp, xâp x khoang 7 ỉ × 105 thê tai tô h p λ mang các đo n chèn co kich th c trung binh kho ng 20 kb s đ m ợ ạ ướ ả ẽ ả bao xac suât 99% moi đo n DNA c n thi t hiên diên trong th viên. ạ ầ ế ư

3. Cac cosmid vector

Cosmid la plasmid vector mang đ u ầ cos cua λ (ch ng 4). Vi thê, cac cosmid co ươ thê đ c đong goi trong cac tiêu thê λ v i hiêu suât cao. Sau khi xâm nhiêm vào tê bao ượ ớ vât chu, DNA tai tô h p mach thăng tao vong đ u ợ ở ầ cos va ti p đo đ c nhân lên nh la ế ượ ư môt plasmid l n. Giông nh plasmid, cosmid t ng đôi dê thao tac, nh ng co thê nhân ớ ư ươ ư cac đoan chèn genomic DNA co kich th c khoang 40-45 kb, l n h n kh năng c a ướ ớ ơ ả ủ phage λ.

4. Các BAC vector

Các BAC vector hi n nay đ c xem nh công c h u hi u nh t trong vi c xâyệ ượ ư ụ ữ ệ ấ ệ d ng các th vi n genome, do chúng có các u đi m sau:ự ư ệ ư ể

- Có kh năng g n các đ i phân t DNA 100-300 kb.ả ắ ạ ử

- Ít hình thành th kh m (chimera).ể ả

- Có hi u qu cao trong t o dòng và thu h i DNA.ệ ả ạ ồ

- Duy trì s n đ nh c a các DNA đ c g n vào vector.ự ổ ị ủ ượ ắ

Nh nh ng u đi m trên nên h th ng BAC th ng đ c dùng đ xây d ng b nờ ữ ư ể ệ ố ườ ượ ể ự ả đ v t lý. DNA có th d dàng đ c phân l p trong các dòng BAC, các dòng phân l pồ ậ ể ễ ượ ậ ậ đ c t lai khu n l c s đ c ki m tra b ng k thu t DNA fingerprinting thông quaượ ừ ẩ ạ ẽ ượ ể ằ ỹ ậ ph n ng c t c a enzyme h n ch ả ứ ắ ủ ạ ế HindIII. K thu t fingerprinting cung c p choỹ ậ ấ chúng ta thông tin v nh ng ph n trùng l p (overlapping) và không trùng l p c a BAC.ề ữ ầ ặ ặ ủ Nh v y, có th hoàn thi n b n đ v t lý có ch t l ng cao, ph c v cho vi c phânờ ậ ể ệ ả ồ ậ ấ ượ ụ ụ ệ tích genome và chuy n n p gen sau này.ể ạ

5. Các YAC vector

Các YAC là các nhi m s c th nhân t o c a n m men và cũng là các vector t oễ ắ ể ạ ủ ấ ạ dòng đ c s d ng trong phân tích genome. Chúng mang các đo n telomere (ph nượ ử ụ ạ ầ cu i) và centromere (ph n tâm) c a m t nhi m s c th trong n m men. C hai nhân tố ầ ủ ộ ễ ắ ể ấ ả ố này c n thi t cho s tái b n c a nhi m s c th trong các t bào n m men: n u khôngầ ế ự ả ủ ễ ắ ể ế ấ ế có telomere, thì sau đó các đ u c a nhi m s c th có kh năng b r i ra ho c g n vàoầ ủ ễ ắ ể ả ị ờ ặ ắ các nhi m s c th khác. N u không có centromere, thì sau đó các nhi m s c th m iễ ắ ể ế ễ ắ ể ớ đ c t o thành s không đ c đ y vào trong các t bào m i c a quá trình phân chia tượ ạ ẽ ượ ẩ ế ớ ủ ế bào. Ngoài ra, còn ph i có m t g c tái b n đ sao chép DNA.ả ộ ố ả ể

Các nhân t này đ c đ t trong m t đo n DNA đ n, đ c dùng nh m t vectorố ượ ặ ộ ạ ơ ượ ư ộ đ t o dòng DNA ngo i lai trong n m men. u đi m c a YAC là có th nh n cácể ạ ạ ở ấ Ư ể ủ ể ậ đo n DNA có kích th c l n. Nh v y, trong khi t o dòng vi khu n theo ph ng phápạ ướ ớ ư ậ ạ ẩ ươ truy n th ng b ng cách dùng bacteriophage ho c các plasmid th ng b gi i h n b iề ố ằ ặ ườ ị ớ ạ ở kích th c c a các đo n DNA đ c t o dòng (ch vài ch c kilobase), thì các YAC cóướ ủ ạ ượ ạ ỉ ụ th t o dòng các đo n DNA dài hàng ngàn kilobase. Đi u này giúp cho vi c l p b nể ạ ạ ề ệ ậ ả đ genome hoàn ch nh d dàng h n nhi u.ồ ỉ ễ ơ ề

Nh c đi m c a các YAC đó là k thu t thao tác còn nhi u khó khăn, và m tượ ể ủ ỹ ậ ề ộ v n đ chung là DNA t hai vùng khác nhau c a genome g c có th k t thúc trong m tấ ề ừ ủ ố ể ế ộ YAC, d n đ n xu t hi n s liên k t sai mà k t qu là t o ra m t dòng kh m.ẫ ế ấ ệ ự ế ế ả ạ ộ ả

III. Đóng gói in vitro DNA tái t h p và xâm nhi m vào t bào v t chổ ợ ễ ế ậ ủ

Tr ng h p s d ng vector mang gen ngo i lai là bacteriophage λ ho c cosmidườ ợ ử ụ ạ ặ đ xây d ng th vi n genome, thì th tái t h p tr n (naked recombinant) c a các lo iể ự ư ệ ể ổ ợ ầ ủ ạ vector này không th chuy n vào trong vi khu n đ c. Do đó, ng i ta c n ph i đóngể ể ẩ ượ ườ ầ ả gói in vitro DNA c a chúng trong m t đ u r ng c a phage λ , r i sau đó m i cho chúngủ ộ ầ ỗ ủ ồ ớ xâm nhi m vào các t bào vi khu n.ễ ế ẩ

Nguyên lý c a s đóng gói ủ ự in vitro (in vitro packaging) là nh vào kh năng mangờ ả các đ u ầ cos c a phage λ hai đ u 5’ và 3’ c a các vector tái t h p đ đóng gói chúngủ ở ầ ủ ổ ợ ể khi có m t các đ u r ng c a phage và các protein đóng gói. Ph ng th c này đòi h iặ ầ ỗ ủ ươ ứ ỏ các phân t vector tái t h p ph i có chi u dài ít nh t là 38 kb và không đ c l n h nử ổ ợ ả ề ấ ượ ớ ơ 52 kb. Các đ u phage đ c đóng gói s hoàn thi n trong các ti u th phage xâm nhi mầ ượ ẽ ệ ể ể ễ in vitro khi có m t các s n ph m c a các gen W và FII, và các đuôi c a phage. T t cặ ả ẩ ủ ủ ấ ả protein c n thi t cho đóng gói có th thu đ c t các ch ng ầ ế ể ượ ừ ủ E. coli BHB2688 và BHB2690. Các h n h p đóng gói ch c n chu n b m t l n và có th b o qu n ỗ ợ ỉ ầ ẩ ị ộ ầ ể ả ả ở -80oC.

Tùy thu c vào lo i vector mà có th dùng m t l ng thích h p ch ng ộ ạ ể ộ ượ ợ ủ E. coli cho vi c xâm nhi m. Các ch ng này đ c cho “đói” (starve) tr c khi s d ng, ho c b ngệ ễ ủ ượ ướ ử ụ ặ ằ cách sinh tr ng trên môi tr ng t i thi u và sau đó x lý v i dung d ch CaClưở ườ ố ể ử ớ ị 2 0,1 M, ho c b ng cách r a trong dung d ch CaClặ ằ ử ị 2 0,1 M sau khi nhân lên trong môi tr ngườ LB1. Ph ng th c x lý này c m ng s t ng h p các λ receptor (protein ươ ứ ử ả ứ ự ổ ợ lamB) trên b m t t bào và tăng đáng k s h p th phage vào các t bào ề ặ ế ể ự ấ ụ ế E. coli. Các ti u thể ể

phage xâm nhi m, thu đ c khi có m t các protein phage và các h p ph n c a đuôiễ ượ ặ ợ ầ ủ phage, s đ c dùng đ xâm nhi m các vi khu n m n c m (susceptible bacteria). Cácẽ ượ ể ễ ẩ ẫ ả dòng tái t h p đ c ch n l c trên c s tính kháng kháng sinh c a chúng và sau đó cóổ ợ ượ ọ ọ ơ ở ủ th đ c khu ch đ i ti p.ể ượ ế ạ ế

S xâm nhi m đ c th c hi n b ng cách h n h p các ti u th phage xâmự ễ ượ ự ệ ằ ủ ỗ ợ ể ể nhi m thu đ c sau khi đóng gói ễ ượ in vitro các phân t DNA tái t h p v i các t bàoử ổ ợ ớ ế m n c m (sensitive cell) c a vi khu n đ c ti n x lý. Ti p theo b c này là khu chẫ ả ủ ẩ ượ ề ử ế ướ ế đ i th vi n sau khi đã chu n đ (titration) các th tái t h p.ạ ư ệ ẩ ộ ể ổ ợ

Th vi n gen sau khi đ c xây d ng có th b o qu n trong m t vài năm d iư ệ ượ ự ể ả ả ộ ướ d ng d ch huy n phù 4ạ ị ề ở oC, ho c lâu h n trong dung d ch stock có b sung glycerolặ ơ ị ổ (kho ng 30%) -80ả ở oC.

IV. Phân tich genomic DNA băng lai Southern

Viêc phat hiên va xac đinh cac chuôi nucleic acid đăc tr ng la công viêc th ng ư ườ xuyên trong nghiên c u sinh hoc phân t . Nguyên tăc cua ky thuât nay la d a vao s laiứ ử ự ự phân t (molecular hybridization), d i cac điêu kiên thich h p hai chuôi nucleic acidử ướ ợ đ n tao thanh môt phân t lai. Phan ng lai phu thuôc rât nhiêu vao m c đô t ng đôngơ ử ứ ứ ươ cua hai trình t nucleotide. Viêc tao thanh phân t s i đôi nh thê xay ra chu yêu thông ự ử ợ ư qua liên kêt hydrogen gi a cac base G v i C, va A v i T. Thanh phân va s phân bô cua ữ ớ ớ ự cac base không giông ro rêt v i cac phân t nucleic acid cho kêt qua cac tinh chât lai ớ ử khac nhau, vi thê liên kêt hydrogen (hoăc lai phân t gi a cac base t ng đông) khi ử ữ ươ đ c ghep căp thich h p đa cung câp môt công cu co gia tri đê xac đinh cac chuôi liênượ ợ quan hoăc đông nhât v i chuôi nucleic acid quan tâm (m u dò). ớ ẫ

Trong sô cac ky thuât khac nhau s dung lai phân t đê phân tich nucleic acid, thi ử ử ky thuât đ c s dung phô biên nhât la lai mâu do nucleic acid đ c đanh dâu v i ượ ử ượ ớ nucleic acid đich đ c cô đinh trên môt vât đ răn, th ng la mang nitrocellulose hoăc ượ ơ ườ nylon.

Trinh t cua ky thuât lai Southern blot bao gôm cac b c sau: (1) phân tách cac ự ướ đoan căt han chê cua genomic DNA băng điên di agarose gel, (2) chuyên DNA t agarose ừ gel lên mang lai, (3) lai cac mâu do đ c đanh dâu đông vi phong xa ượ 32P v i cac nucleicớ acid đ c cô đinh trên mang lai (Hinh 5.2).ượ

1. Phân tách cac đoan căt han chê cua genomic DNA băng điên di agarose gel

DNA mang chuôi đich (chăng han genomic DNA) đ c căt băng môt hoăc môt vai ượ enzyme han ch se cho môt tâp h p cac đoan co cac chiêu dai khac nhau đ c phân ế ợ ượ đo n theo kich th c băng điên di trên agarose gel. tr ng h p genomic DNA hinhạ ướ Ơ ườ ợ anh điên di se cho môt vêt dai (smear) trên gel (Hình 5.3).

L ng DNA dung cho phan ng căt han ch tùy thuôc vao m c đô phong phu cuaượ ứ ế ứ chuôi đich (target) co trong mâu. Tr ng h p genomic DNA, ta cân th y phân môt ườ ợ ủ

l ng t ng đôi l n DNA (2-10 m g). Nh ng nêu mâu DNA đ c tao dong trong cacượ ươ ớ ư ượ plasmid hoăc phage thi chi cân môt l ng DNA it h n nhiêu (môt vai picogram) la đu. ượ ơ

Anh gel nhuôm EtBr đ c xêp thăng hang v i th c huynh quang tr c khi thâm ượ ớ ướ ướ tich la b c quan trong đê đanh gia cac kich th c cua cac băng DNA đ c lai v i ch ướ ướ ượ ớ ỉ th kích th c chu n c a DNA (DNA size-marker). DNA cua bacteriophage l đ c phânị ướ ẩ ủ ượ c t băng ắ HindIII hoăc 1-kb ladder DNA la cac ch th kích th c chu n c a DNA thông ỉ ị ướ ẩ ủ dung nhât cho Southern blot.

Hinh 5.2. S đô cua ky thuât lai Southern blot. ơ Các m u DNA đích và genomicẫ DNA trong ví d này đ c c t b ng ụ ượ ắ ằ EcoRI và đ c phân đo n b ng đi n di trênượ ạ ằ ệ agarose gel. Các v trí c t h n ch liên quan và trình t b sung v i m u dò (đo n dày)ị ắ ạ ế ự ổ ớ ẫ ạ cũng đã đ c trình bày (A và B). DNA c a plasmid mang đo n chèn DNA dùng làmượ ủ ạ m u dò (C) đ c c t và đi n di đ làm đ i ch ng d ng tính. Sau khi bi n tính vàẫ ượ ắ ệ ể ố ứ ươ ế trung hòa, DNA s i đ n đ c chuy n lên màng lai, b ng ph ng th c th m tích maoợ ơ ượ ể ằ ươ ứ ẩ d n (capillary) ho c b ng ph ng th c th m tích n a khô (semi-dry) nh dòng đi n,ẫ ặ ằ ươ ứ ẩ ử ờ ệ và đ c c đ nh. Đ chu n b m u dò, đo n chèn DNA (đo n dày đ m trong C) đ cượ ố ị ể ẩ ị ẫ ạ ạ ậ ượ tinh s ch t vector b ng cách c t và thu h i sau khi đi n di trên agarose gel, đánh d uạ ừ ằ ắ ồ ệ ấ b ng ằ 32P và gây bi n tính. Ti p theo, màng lai đã liên k t DNA đ c lai v i m u dò,ế ế ế ượ ớ ẫ

tín hi u không đ c tr ng b lo i b , màng lai v i phim X-quang. Sau khi r a phim,ệ ặ ư ị ạ ỏ ủ ớ ử các đo n DNA b sung v i m u dò đ c phát hi n nh là các băng phóng x t ghi.ạ ổ ớ ẫ ượ ệ ư ạ ự Trên hình này, nguyên lý c b n c a đa hình chi u dài các đo n c t h n ch đã đ cơ ả ủ ề ạ ắ ạ ế ượ mô t . Các DNA đ c tách chi t t hai m u riêng bi t (A và B), trong đó m u B cóả ượ ế ừ ẫ ệ ẫ thêm m t v trí ộ ị EcoRI chu i đích. S khác nhau nh th trong genome s đ c phátở ỗ ự ư ế ẽ ượ hi n b i các ki u lai khác nhau. Nguyên t c này đ c khai thác trong nhi u ng d ngệ ở ể ắ ượ ề ứ ụ c a sinh h c phân t .ủ ọ ử

Hình 5.3. Hình nh đi n di c a genomic DNA sau khi đ c phân c t b ngả ệ ủ ượ ắ ằ enzyme h n ch . ạ ế SM: Ch th kích th c chu n c a DNA. PC: đ i ch ng d ng tínhỉ ị ướ ẩ ủ ố ứ ươ (đo n DNA đ c dùng đ đánh d u ạ ượ ể ấ 32P làm m u dò). Các đ ng 1, 2, 3, 4, 5 và 6: cácẫ ườ m u genomic DNA đ c c t b ng enzyme h n ch .ẫ ượ ắ ằ ạ ế

2. Chuyên DNA t agarose gel lên mang lai ư

Sau khi điên di gel va tr c khi thâm tich, DNA se đ c kh purin (depurination) ướ ượ ử băng dung d ch HCl loang đê căt nh DNA tao điêu kiên dê dang đê chuyên cac đoan ị ỏ DNA có kích th c l n lên mang. Nhìn chung, b c nay kho kiêm soat va co thê lamướ ớ ướ mât cac đoan DNA nho h n. Vì th , nêu có cach kh c ph c viêc đanh gia hinh anh ơ ế ắ ụ phóng x t ghi thì có th b qua b c này. Tuy nhiên, kh purin v n cân thiêt khiạ ự ể ỏ ướ ử ẫ phân tich Southern cac đoan DNA co kich th c rât l n. ướ ớ

Cac loai mang lai đ c s dung trong Southern la mang nitrocellulose hoăc mang ượ ử nylon. Tuy nhiên mang nylon co s c chiu đ ng cao h n mang nitrocellulose vi thê co thê ứ ự ơ tai s dung môt vai lân nên chung đ c s dung phô biên h n. H n n a, mang nylon co ử ượ ử ơ ơ ữ thê găn cac đoan DNA ngăn (<500 bp) hiêu qua h n mang nitrocellulose, va DNA sau ơ

khi đ c thâm tich lên mang co thê đ c liên kêt đông hóa tri băng chi u xa UV trongượ ượ ế th i gian ngăn (khoang 1-2 phut) 2000 J trong khi đo màng nitrocellulose cân đun nongờ ở

80ở oC trong điêu kiên chân không khoang 2 gi . Mang nylon tich điên cung thuân l i va ờ ợ thich h p cho thâm tích kiêm (alkali-bloting), ví d : NaOH, do DNA liên kêt c ng hóa ợ ụ ộ tri v i mang d i cac điêu kiên nay ma không cân bât ky môt x ly nao n a. Trong qua ớ ướ ử ữ trinh thâm tich, thông th ng đ m chuy n có nông đô muôi cao đ c dung cho ườ ệ ể ượ genomic DNA, trong khi đo DNA c a plasmid hoăc cac đoan PCR đ c dung v i cac ủ ượ ớ đ m có nông đô muôi thâp.ệ

Hình 5.4. S đ th m tích n a khô b ng đi n chuy n DNA t agarose gelơ ồ ẩ ử ằ ệ ể ừ lên màng lai

Hình 5.5. S đ th m tích mao d n chuy n DNA t agarose gel lên màng laiơ ồ ẩ ẫ ể ừ

3. Lai cac mâu do đ c đanh dâu đông vi phong xa v i cac nucleic acid đ c cô đinh ượ ớ ượ trên mang lai

Cac điêu kiên tiên lai va lai đ c thiêt kê đê tăng tôi đa phan ng lai đăc hiêu cua ượ ứ mâu do v i cac chuôi đich va giam thiêu cac liên kêt không đăc hiêu v i mang va DNA ớ ớ không phai chuôi đich. Noi chung, cac đêm lai cân co c ng l c ion cao (nhân tô quan ườ ự trong đôi v i kha năng ôn đinh lai). Môt vai loai tac nhân ngăn ch n co thê đ c dung ớ ậ ượ đê c chê cac liên kêt không đăc hiêu, băng cach đo đa han chê tin hiêu nên. Dung dich ứ

Denhardt va s a khô không có ch t béo (nonfat dried milk) đ c s dung phô biên đê ữ ấ ượ ử ngăn can (blocking) liên kêt gi a mâu do v i mang lai, chât tây SDS cũng đ c dung ữ ớ ượ trong tr ng h p này. Salmon sperm DNA (DNA tinh trùng cá h i) va calf thymus DNAườ ợ ồ (DNA tuy n c c a bê) đ c dung đê ngăn can cac t ng tac không đăc hiêu gi a cácế ứ ủ ượ ươ ữ DNA không ph i chu i đích găn trên mang lai v i mâu do.ả ỗ ớ

Trong gi i han th c hanh chi co nh ng nhân tô anh h ng đ n s ôn đinh nhiêtớ ự ữ ưở ế ự cua cac phân t nucleic acid lai m i thê hiên vai tro quyêt đinh trong hâu hêt thi nghiêm ử ớ lai trên mang. Nhiêt đô nong chay ( Tm) cua nucleic acid s i đôi cho bi t nhiêt đ ma ợ ế ộ ở đo DNA s i đôi bi biên tinh 50% d i cac điêu kiên đa cho, va no la kêt qua cua viêc đo ợ ướ tr c tiêp kha năng ôn đinh cua viêc lai nucleic acid.ự

Nhi t đ nóng ch y cua DNA s i đôi co thê đ c đanh gia thông qua bi u th cệ ộ ả ợ ượ ể ứ 1:

Trong khi bi u th c 2 co thê đ c dung cho th lai RNA-DNA:ể ứ ượ ể

Trong đo

M la nông đô phân t cua cac cation hóa tri 1 (đăc tr ng la Na ử ư +)

(%G + C) la nông đô ph n trăm cua guanine va cytosine ầ

(%f) la phân trăm cua formamide

n la chiêu dai cua thê lai (theo base).

C ng l c dùng trong các thí nghi m lai là s ngh ch đ o c a giá tr chu n ườ ự ệ ố ị ả ủ ị ẩ C (criterion value) đ c đ a ra b i bi u th c 3:ượ ư ở ể ứ

Trong đó

Ti là nhi t đ thí nghi m, khi ệ ộ ệ Ti th p thì ấ C cao và lúc đó c ng l c s th p, vàườ ự ẽ ấ ng c l i. Các chu i DNA đích có đ t ng đ ng gi ng y h t ho c g n gi ng v iượ ạ ỗ ộ ươ ồ ố ệ ặ ầ ố ớ m u dò có th đ c xác đ nh d i các đi u ki n c ng l c cao (ví d : 5ẫ ể ượ ị ướ ề ệ ườ ự ụ oC<C <10oC), các đi u ki n c ng l c th p thích h p cho các chu i ít t ng đ ng.ề ệ ườ ự ấ ợ ỗ ươ ồ

Thông th ng, ph n ng lai và các b c r a đ u tiên đ c ti n hành đi uườ ả ứ ướ ử ầ ượ ế ở ề ki n c ng l c th p (ví d : ệ ườ ự ấ ụ Tm = 30oC) và c ng l c đ c tăng lên d n trong cácườ ự ượ ầ b c r a ti p theo.ướ ử ế

Bi u th c 1 và 2 ch chính xác trong tr ng h p các DNA s i đôi dài h n 100-ể ứ ỉ ườ ợ ợ ơ200 nucleotide. Các m u dò oligonucleotide đ c dùng th ng xuyên đ sàng l c cácẫ ượ ườ ể ọ th vi n cDNA ho c genomic DNA và phân tích Northern, và đôi khi chúng cũng đ cư ệ ặ ượ

dùng trong các thí nghi m lai Southern. Các phân t lai ng n có đ n đ nh th p (ngayệ ử ắ ộ ổ ị ấ c khi đ t ng đ ng 100%), đ c bi t trong su t các b c r a, b i vì n ng đ m uả ộ ươ ồ ặ ệ ố ướ ử ở ồ ộ ẫ dò trong đ m r a h u nh là b ng không. Nh v y, các b c r a c n ti n hành trongệ ử ầ ư ằ ư ậ ướ ử ầ ế th i gian ng n (2-5 phút).ờ ắ

H n n a, đ n đ nh c a các s i đôi oligonucleotide b nh h ng l n b i thànhơ ữ ộ ổ ị ủ ợ ị ả ưở ớ ở ph n nucleotide và b i hi n t ng ghép đôi không t ng x ng. ầ ở ệ ượ ươ ứ Tm c a các m u dòủ ẫ oligonucleotide ng n h n 50 nucleotide th ng đ c tính b ng bi u th c 4:ắ ơ ườ ượ ằ ể ứ

Tm (oC) = 4 (G + C) + 2(A + T) (4)

Trong đó

A, C, G và T là s các nucleotide t ng ng. Tuy nhiên, thông th ng các đi uố ươ ứ ườ ề ki n thí nghi m c a ph n ng lai đích th c v i các m u dò oligonucleotide (đ c bi tệ ệ ủ ả ứ ự ớ ẫ ặ ệ khi phân tích các genome l n) ph i đ c xác đ nh trên c s kinh nghi m.ớ ả ượ ị ơ ở ệ

Các thí nghi m lai trên màng th ng đ c ti n hành b ng cách đánh d u m u dòệ ườ ượ ế ằ ấ ẫ b ng ằ 32P (m c dù các đ ng v phóng x khác nh ặ ồ ị ạ ư 35S cũng có th đ c s d ng). Ph nể ượ ử ụ ả

ng lai c a Southern đòi h i ho t tính đ c hi u c a m u dò t i thi u ph i là 10ứ ủ ỏ ạ ặ ệ ủ ẫ ố ể ả 9 dpm/ μ g, m c dù ho t tính 10ặ ạ 8 dpm/ μ g có th đ c xem nh là ch p nh n đ c trong cácể ượ ư ấ ậ ượ

ng d ng c n c ng l c th p. Các ph ng pháp không dùng đ ng v phóng x (ví d :ứ ụ ầ ườ ự ấ ươ ồ ị ạ ụ digoxigenin-dUTP) ngày càng đ c s d ng ph bi n h n m c dù đ nh y c a chúngượ ử ụ ổ ế ơ ặ ộ ạ ủ là không th so v i các ph ng th c dùng đ ng v phóng x (Hình 5.6). Nh ng các kể ớ ươ ứ ồ ị ạ ư ỹ thu t không dùng đ ng v phóng x an toàn h n cho nghiên c u viên, t o ra các m uậ ồ ị ạ ơ ứ ạ ẫ dò có th đ c b o qu n trong th i gian dài tr c khi dùng và k t qu phát hi n cácể ượ ả ả ờ ướ ế ả ệ tín hi u lai nhanh h n.ệ ơ

Hình 5.6. Hình nh phân tích Southern blot c a hai thí nghi m khác nhau.ả ủ ệ (A) Hình nh phóng x t ghi trên phim X-quang v i m u dò đ c đánh d u ả ạ ự ớ ẫ ượ ấ 32P. (B) Hình nh b t màu trên màng lai Hybond-N v i m u dò đ c đánh d u digoxigenin-ả ắ ớ ẫ ượ ấdUTP. Các băng màu đen là tín hi u lai gi a DNA đích và m u dò.ệ ữ ẫ

V. Sàng l c th vi n genomic DNAọ ư ệ

DNA đ c t o dòng trong các vector có ngu n g c plasmid ho c các vectorượ ạ ồ ố ặ nhi m s c th nhân t o (BAC, YAC) s n xu t ra các khu n l c (vi khu n ho c n mễ ắ ể ạ ả ấ ẩ ạ ẩ ặ ấ men) khi các nuôi c y bi n n p đ c dàn m ng trên đĩa agar ch a môi tr ng sinhấ ế ạ ượ ỏ ứ ườ tr ng và nuôi d i nh ng đi u ki n thích h p. Trong khi đó, các vector có ngu n g cưở ướ ữ ề ệ ợ ồ ố virus (bacteriophage) s sinh tan t bào b chúng xâm nhi m và s n xu t ra các plaqueẽ ế ị ễ ả ấ (v t tan) có d ng hình tròn chu vi kho ng 2-3 mm có màu sáng trên th m vi khu nế ạ ả ả ẩ (bacterial lawn) c a đĩa agar (Hình 5.7).ủ

Hình 5.7. Các v t tan c a phage l trên th m vi khu n ế ủ ả ẩ E. coli. Các phage l đ c tr n v i các t bào ượ ộ ớ ế E. coli trong môi tr ng nuôi r i dàn m ng (plating) lên đĩaườ ồ ỏ petri ch a bottom agar (nuôi c y top agar). Sau khi qua đêm 37ứ ấ ủ ở oC, các t bào viế khu n m c t o nên th m vi khu n, trên đó các vùng b nhi m phage l hình thành nênẩ ọ ạ ả ẩ ở ị ễ các v t trong, do hi n t ng sinh tan vi khu n c a phage, g i là v t tan.ế ệ ươ ẩ ủ ọ ế

Các vector, nh mô t trên, th ng ch a các gen ch th cho phép ch n l cư ả ở ườ ứ ỉ ị ọ ọ nh ng t bào v t ch mang vector (th bi n n p). Thông th ng các ch th này là genữ ế ậ ủ ể ế ạ ườ ỉ ị kháng kháng sinh và các t bào bi n n p sinh tr ng trên môi tr ng ch a kháng sinhế ế ạ ưở ườ ứ t ng ng.ươ ứ

Ngoài ra, các vector còn ch a các gen b sung đ phân bi t các t bào bi n n pứ ổ ể ệ ế ế ạ ch a đo n chèn c a DNA ngo i lai v i các t bào ch a các vector t tái t o l i vòng.ứ ạ ủ ạ ớ ế ứ ự ạ ạ Ví d : vector mã hóa gen β-galactosidase xúc tác s n sinh ra các s n ph m màu xanh tụ ả ả ẩ ừ c ch t không màu X-gal cho k t qu sinh tr ng c a các khu n l c màu xanh. Đo nơ ấ ế ả ưở ủ ẩ ạ ạ chèn c a DNA ngo i lai đã làm m t ho t tính c a gen cho k t qu s n xu t ra cácủ ạ ấ ạ ủ ế ả ả ấ khu n l c màu tr ng.ẩ ạ ắ

M t dòng ch a các chu i DNA quan tâm đ c bi t có th đ c xác đ nh b i laiộ ứ ỗ ặ ệ ể ượ ị ở khu n l c. M t l ng nh khu n l c bi n n p ho c v t tan đ c chuy n lên màngẩ ạ ộ ượ ỏ ẩ ạ ế ạ ặ ế ượ ể nitrocellulose ho c nylon đã đ c ph lên (overlay) trên đĩa agar tr c đó. DNA đ cặ ượ ủ ướ ượ bi n tính và c đ nh trên màng b ng cách đun nóng (baking) ho c chi u tia c c tímế ố ị ằ ặ ế ự (UV-crosslinking), và sau đó đ c lai trong đ m ch a m u dò đ c đánh d u đ ng vượ ệ ứ ẫ ượ ấ ồ ị

phóng x có trình t b sung m t ph n c a chu i đ c xác đ nh. Ví d : Có th m tạ ự ổ ộ ầ ủ ỗ ượ ị ụ ể ộ oligonucleotide t ng h p nhân t o, có ngu n g c t genomic DNA t ng ph n, cDNAổ ợ ạ ồ ố ừ ừ ầ ho c chu i protein ho c s n ph m PCR. M t vài tr ng h p m u dò có th đ cặ ỗ ặ ả ẩ ộ ườ ợ ẫ ể ượ thi t k d a trên trình t b t ngu n t gen t ng đ ng c a các loài khác và th ngế ế ự ự ắ ồ ừ ươ ồ ủ ườ đ c lai v i c ng l c th p. Các m u dò th a đ c r a kh i màng đ v i phim X-ượ ớ ườ ự ấ ẫ ừ ượ ử ỏ ể ủ ớquang. Theo h ng c a phim (sau khi r a) v i s đ i chi u đĩa agar g c, sau đó s cóướ ủ ử ớ ự ố ế ố ẽ kh năng g n k t các khu n l c th c t v i các khu n l c lai d ng tính t ng ngả ắ ế ẩ ạ ự ế ớ ẩ ạ ươ ươ ứ trên phim X-quang (Hình 5.8).

Hình 5.8. Sàng l c (screening) th vi n gen trong khu n l c vi khu n ho cọ ư ệ ẩ ạ ẩ ặ v t tan c a bacteriophage lế ủ

G n đây, m t ph ng pháp sàng l c khác đã đ c thi t k . Theo h ng này cácầ ộ ươ ọ ượ ế ế ướ khu n l c vi khu n ho c n m men đ c nh t riêng r và ch m ngay ng n thành hàngẩ ạ ẩ ặ ấ ượ ặ ẽ ấ ắ lên màng ho c trong gi ng c a đĩa microtiter. M i dòng có th đ c xác đ nh b ng t aặ ế ủ ỗ ể ượ ị ằ ọ đ đ ng k riêng r c a nó. So v i các ph ng pháp truy n th ng, ph ng pháp m iộ ườ ẻ ẽ ủ ớ ươ ề ố ươ ớ này d dàng h n trong vi c t đ ng hóa, s p x p các th vi n và đ i chi u s li uễ ơ ệ ự ộ ắ ế ư ệ ố ế ố ệ gi a các phòng thí nghi m khác nhau.ữ ệ

N u dòng mong mu n bi u hi n m t protein đ c bi t ho c m t đo n protein, thìế ố ể ệ ộ ặ ệ ặ ộ ạ sau đó b ng cách xây d ng th vi n v i m t vector bi u hi n ch a các tín hi u phiênằ ự ư ệ ớ ộ ể ệ ứ ệ mã và d ch mã ng i ta có th sàng l c tr c ti p đ i v i protein đ c bi u hi n. Víị ườ ể ọ ự ế ố ớ ượ ể ệ d : n u protein t ng ng đ y đ là thích h p, thì kháng th đ c hi u có th đ cụ ế ươ ứ ầ ủ ợ ể ặ ệ ể ượ t o ra, đ c đánh d u và s d ng đ phát hi n y u t quy t đ nh kháng nguyên trênạ ượ ấ ử ụ ể ệ ế ố ế ị protein đ c bi u hi n t các khu n l c đ c dung ly. N u đo n chèn đ c yêu c uượ ể ệ ừ ẩ ạ ượ ế ạ ượ ầ mã hóa m t ho t tính sinh h c, thì sau đó vi c sàng l c có th đ c th c hi n b ngộ ạ ọ ệ ọ ể ượ ự ệ ằ các th nghi m cho ho t tính đó, ho c b ng cách ch n l c tr c ti p, ví d : ch n l cử ệ ạ ặ ằ ọ ọ ự ế ụ ọ ọ

trên môi tr ng sinh tr ng không hoàn ch nh đ i v i enzyme sinh t ng h p c n thi tườ ưở ỉ ố ớ ổ ợ ầ ế cho s sinh tr ng. Tuy nhiên, các h ng d a trên s bi u hi n nói chung d ngự ưở ướ ự ự ể ệ ễ ứ d ng cho th vi n cDNA h n là th vi n genomic DNA.ụ ư ệ ơ ư ệ

VI. Các ph ng pháp đánh d u đo n DNA b ng phóng xươ ấ ạ ằ ạ

M c đích c a b c này là s n xu t các đo n DNA có đ phóng x và ho t tínhụ ủ ướ ả ấ ạ ộ ạ ạ đ c hi u cao đ làm m u dò dùng trong các thí nghi m lai phân t . Trong tr ng h pặ ệ ể ẫ ệ ử ườ ợ này d u phóng x th ng đ c s d ng là ấ ạ ườ ượ ử ụ 32P phát x b năng l ng cao. D i đây làạ ượ ướ m t s ph ng pháp đánh d u ph bi n đ c trong k thu t gen.ộ ố ươ ấ ổ ế ượ ỹ ậ

1. Đánh d u đuôiấ ơ

Enzyme polynucleotide kinase xúc tác đ chuy n nhóm phosphate n m cu i ATPể ể ằ ố sang g c 5’-OH c a các phân t nucleic acid đã đ c dephosphoryl hóa. N u nh ATPố ủ ử ượ ế ư đ c đánh d u phóng x , thì nó s t o ra nucleic acid đ c đánh d u phóng x . Tuyượ ấ ạ ẽ ạ ượ ấ ạ nhiên, ho t tính đ c hi u c a chúng t ng đ i th p, do ch có ph n đuôi c a m i phânạ ặ ệ ủ ươ ố ấ ỉ ầ ủ ỗ t DNA đ c đánh d u (Hình 5.9).ử ượ ấ

Hình 5.9. Đánh d u đuôi c a đo n DNA nh enzyme polynucleotide kinaseấ ơ ủ ạ ờ (PNK). (a) DNA đ c dephosphoryl hóa b ng enzyme phosphatase đ t o ra các nhómượ ằ ể ạ 5’-OH. (b) Ti p đó, đuôi phosphate c a [ g -ế ủ 32P]ATP (vòng tròn đ m trên hình) đ cậ ượ chuy n sang g c 5’-OH nh PNK. Đây là ph n ng trao đ i các nhóm 5’-POể ố ờ ả ứ ổ 4.

2. Đánh d u b ng d ch chuy n đi m đ tấ ằ ị ể ể ư

Ph ng pháp này d a vào enzyme DNA polymerase I c a ươ ự ủ E. coli có kh năngả dich chuy n điêm đ t cua DNA (xem ch ng 1). Các đi m đ t có th xu t hi n t ể ứ ươ ể ứ ể ấ ệ ự nhiên và cũng có th do tác d ng c a enzyme DNase Iể ụ ủ 2 n ng đ th p trong h n h pở ồ ộ ấ ỗ ợ ph n ng. Enzyme DNA polymerase I xúc tác ph n ng thay th s i b ng cách xen cácả ứ ả ứ ế ợ ằ dNTP m i vào chu i DNA. N u m t trong các dNTP đã đánh d u phóng x (ví d : [ aớ ỗ ế ộ ấ ạ ụ -32P]dCTP) , thì k t qu là phân t DNA s đ c đánh d u v i ho t tính đ c hi u caoế ả ử ẽ ượ ấ ớ ạ ặ ệ (Hình 5.10).

3. Đánh d u b ng kéo dài đo n m iấ ằ ạ ồ

Đo n DNA c n đánh d u đ c bi n tính b ng nhi t, sau đó các đo n m iạ ầ ấ ượ ế ằ ệ ạ ồ oligonucleotide (th ng là các phân t hexadeoxyribonucleotide) đ c g n vào cácườ ử ượ ắ DNA s i đ n. S d ng enzyme DNA polymerase I có th t ng h p nên b n sao m iợ ơ ử ụ ể ổ ợ ả ớ c a s i khuôn m u. N u nh m t dNTP đã đánh d u phóng x (ví d : [ a -ủ ợ ẫ ế ư ộ ấ ạ ụ 32P]dCTP) đ c g n vào, thì b n sao DNA mang ho t h at tính đ c hi u r t cao s đ c t o raượ ắ ả ạ ọ ặ ệ ấ ẽ ượ ạ (Hình 5.11). Cũng có th dùng k thu t PCR đ đánh d u phóng x đo n DNA trongể ỹ ậ ể ấ ạ ạ tr ng h p mu n t o ra m t s l ng l n m u dò. Lúc này, enzyme DNA polymeraseườ ợ ố ạ ộ ố ượ ớ ẫ I s đ c thay b ng DNA Taq polymerase.ẽ ượ ằ

Hình 5.10. Đánh d u DNA b ng d ch chuy n đi m đ t. ấ ằ ị ể ể ứ (a) Dùng DNase I t oạ ra m t đi m đ t trên s i đ n c a chu i DNA s i đôi. (b) Ti p đó enzyme DNAộ ể ứ ợ ơ ủ ỗ ợ ế polymerase I t ng h p m t b n sao m i c a s i khuôn m u khi phân h y s i có đi mổ ợ ộ ả ớ ủ ợ ẫ ủ ợ ể đ t nh ho t tính exonuclease 5’ - 3’ c a nó. N u [ a -ứ ờ ạ ủ ế 32P]dCTP đ c cung c p thì nóượ ấ s g n vào b n sao m i (các hình tròn bôi đen).ẽ ắ ả ớ

Trong ph n ng đánh d u phóng x , thông th ng c n tách DNA đã đ c đánhả ứ ấ ạ ườ ầ ượ d u kh i các nucleotide không đ c đánh d u còn th a trong h n h p ph n ng. Ho tấ ỏ ượ ấ ừ ỗ ợ ả ứ ạ tính phóng x c a m u dò c n đ c đánh giá b ng ph ng pháp đ m nh p nháy l ngạ ủ ẫ ầ ượ ằ ươ ế ấ ỏ (liquid scintillation). Các s li u sau đó đ c dùng đ tính toán l ng m u dò c nố ệ ượ ể ượ ẫ ầ thi t cho các ph n ng lai phân t (ví d : Southern blot, Northern blot, screening…).ế ả ứ ử ụ

Hình 5.11. Đánh d u DNA b ng cách kéo dài đo n m i. ấ ằ ạ ồ (a) DNA đ c bi nượ ế tính đ t o ra các phân t s i đ n. (b) M t đo n m i oligonucleotide đ c b sung để ạ ử ợ ơ ộ ạ ồ ượ ổ ể g n v i s i DNA khuôn m u. (c) Enzyme DNA polymerase I xúc tác t ng h p m t b nắ ớ ợ ẫ ổ ợ ộ ả sao m i c a s i khuôn m u b ng cách kéo dài đo n m i, trong quá trình đó các [ aớ ủ ợ ẫ ằ ạ ồ -32P]dCTP (các vòng bôi đen) s đ c đính vào b n sao các v trí có G.ẽ ượ ả ở ị

VII. ng d ng c a th vi n genomic DNAỨ ụ ủ ư ệ

Th vi n genomic DNA có các ng d ng trong ph m vi r ng đ l p b n đ v tư ệ ứ ụ ạ ộ ể ậ ả ồ ậ lý c a DNA và xác đ nh các gen gây b nh ho c các chu i DNA quan tâm cho nh ngủ ị ệ ặ ỗ ữ phân tích xa h n n a.ơ ữ

S n xu t ra các dòng mang các đo n chèn DNA khác nhau nh ng g i ch ng lênả ấ ạ ư ố ồ nhau có nhi u thu n l i và th vi n có th đ c s d ng trong quá trình chromosomeề ậ ợ ư ệ ể ượ ử ụ walking. Ph ng th c này cho phép xúc ti n t đi m kh i đ u trên nhi m s c th (víươ ứ ế ừ ể ở ầ ễ ắ ể d : gen ch th liên k t v i b nh) t i locus không xác đ nh g n đó (ví d : gen gây raụ ỉ ị ế ớ ệ ớ ị ở ầ ụ chính b nh đó) b ng cách ti n hành các chu kỳ l p l i c a t o dòng, mô t đ c đi mệ ằ ế ặ ạ ủ ạ ả ặ ể và lai phân t b ng cách dùng các dòng nh là m u dò đ xác đ nh các dòng xa h n v iử ằ ư ẫ ể ị ơ ớ th vi n mang chu i g n k t DNA g c. Chromosome walking th ng đ c th cư ệ ỗ ầ ề ừ ố ườ ượ ự hi n v i th vi n c a cosmid, l ho c YAC.ệ ớ ư ệ ủ ặ

Chromosome walking cũng cho phép xây d ng m t c u trúc “clone contig” (m tự ộ ấ ộ chu i tu n t các dòng DNA g i ch ng lên nhau cùng v i s hi n di n c a vùng li nỗ ầ ự ố ồ ớ ự ệ ệ ủ ề k c a genomic DNA). C u trúc clone contig th ng t o thành m t ph n c n thi tề ủ ấ ườ ạ ộ ầ ầ ế c a vi c phân tích các chu i DNA đ c t o ra trong su t quá trình xây d ng b n đủ ệ ỗ ượ ạ ố ự ả ồ v t lý c a DNA và xác đ nh các gen gây b nh b ng t o dòng v trí (positional cloning).ậ ủ ị ệ ằ ạ ị C u trúc clone contig đ c xây d ng b ng các vector khác nhau, bao g m l , BAC,ấ ượ ự ằ ồ YAC…

Xác đ nh gen gây x nang đã minh h a cho vi c s d ng th vi n genomic DNAị ơ ọ ệ ử ụ ư ệ đ xác đ nh b ng cách t o dòng v trí. Các th vi n genomic DNA cũng h u ích trongể ị ằ ạ ị ư ệ ữ vi c xác đ nh các gen gây b nh b ng cách t o dòng ch c năng (functional cloning).ệ ị ệ ằ ạ ứ Theo h ng này, thông tin v ch c năng c a gen đ c khai thác đ phân l p gen mongướ ề ứ ủ ượ ể ậ

mu n t th vi n. M t oligonucleotide có trình t d a trên chu i amino acid t ngố ừ ư ệ ộ ự ự ỗ ừ ph n đ c dùng nh là m t m u dò đ phân l p dòng cDNA b ng cách sàng l c thầ ượ ư ộ ẫ ể ậ ằ ọ ư vi n cDNA. Dòng cDNA này sau đó có th đ c dùng trong sàng l c th vi n genomeệ ể ượ ọ ư ệ đ phân l p các dòng genomic DNA và cho phép quan sát đ c đi m c a chu i genomeể ậ ặ ể ủ ỗ hoàn ch nh. H ng này đ c dùng đ xác đ nh gen hemophilia A (nhân t VIII). Cácỉ ướ ượ ể ị ố m u dò oligonucleotide d a trên chu i amino acid c a protein nhân t VIII c a l nẫ ự ỗ ủ ố ủ ợ đ c s d ng tr c đ phân l p dòng t genome (nhân t VIII c a l n), sau đó nóượ ử ụ ướ ể ậ ừ ố ủ ợ đ c dùng nh là m t m u dò cho th vi n DNA ng i đ xác đ nh gen ng i.ượ ư ộ ẫ ư ệ ườ ể ị ở ườ

VII. Phân tích trình t c a đo n DNA đ c t o dòngự ủ ạ ượ ạ

T cu i nh ng năm 1970, trình t các nucleotide trên phân t DNA đ c xácừ ố ữ ự ử ượ đ nh m t cách đ n gi n và nhanh chóng nh s ra đ i c a hai ph ng pháp khác nhau:ị ộ ơ ả ờ ự ờ ủ ươ ph ng pháp hóa h c và ph ng pháp enzyme. Tuy nhiên, t nh ng năm cu i c a thươ ọ ươ ừ ữ ố ủ ế k 20, trình t nucleotide đ c xác đ nh trên máy đ c t đ ng nh tr giúp c aỷ ự ượ ị ọ ự ộ ờ ợ ủ computer ngày càng ph bi n. u đi m c a ph ng pháp này là gi m các thao tác, ti tổ ế Ư ể ủ ươ ả ế ki m hóa ch t và trình t đ c đ c dài h n h n so v i các ph ng pháp tr c đó.ệ ấ ự ọ ượ ơ ẳ ớ ươ ướ

1. Ph ng pháp hóa h c Maxam-Gilbertươ ọ

Đ u tiên phân t DNA s i đôi đ c đánh d u ầ ử ợ ượ ấ 32P t i đ u 5’. Sau đó, hai s i đ nạ ầ ợ ơ tách r i nhau do bi n tính nhi t. Chúng đ c x lý v i các ch t hóa h c sao cho chờ ế ệ ượ ử ớ ấ ọ ỉ m t lo i nucleotide b phá h y. Trên hình 5.12 đó là nucleotide A. N ng đ các ch tộ ạ ị ủ ồ ộ ấ hóa h c đ c ki m tra ch t ch sao cho ch m t nucleotide b phá h y trên m i s iọ ượ ể ặ ẽ ỉ ộ ị ủ ỗ ợ đ n DNA. K t qu hàng lo t các đo n DNA có kích th c khác nhau đ c t o thành.ơ ế ả ạ ạ ướ ượ ạ

Các đo n DNA t o ra do b b gãy đ c phân ly trên polyacrylamide gel và ch cóạ ạ ị ẻ ượ ỉ đo n nào b g n ạ ị ắ 32P đ u 5’ m i quan sát đ c. Kích th c c a chúng t ng ng v iở ầ ớ ượ ướ ủ ươ ứ ớ kho ng cách t đ u 5’ có đánh d u đ n v trí c a các nucleotide b b gãy trên phân tả ừ ầ ấ ế ị ủ ị ẻ ử DNA. S d ng các ch t hóa h c khác nhau phá h y b n lo i nucleotide b ng b nử ụ ấ ọ ủ ố ạ ằ ố ph n ng riêng bi t. S n ph m thu đ c c a b n ph n ng này đ c phân ly trênả ứ ệ ả ẩ ượ ủ ố ả ứ ượ cùng m t gel. Đo n DNA ng n nh t có đánh d u phóng x ch y nhanh nh t d i tácộ ạ ắ ấ ấ ạ ạ ấ ướ d ng c a đi n tr ng. Căn c vào v trí các v ch trên gel mà xác đ nh trình t cácụ ủ ệ ườ ứ ị ạ ị ự nucleotide (Hình 5.12).

Hình 5.12. Xác đ nh trình t nucleotide b ng ph ng pháp hóa h c. ị ự ằ ươ ọ A: ti nế hành b n ph n ng đ c l p, s d ng b n lo i hóa ch t khác nhau, m i hóa ch t chố ả ứ ộ ậ ử ụ ố ạ ấ ỗ ấ ỉ phá h y m t lo i nucleotide nh t đ nh (trong hình v đó là A). B: S n ph m c a b nủ ộ ạ ấ ị ẽ ả ẩ ủ ố ph n ng đ c ch y đi n di đ ng th i trên polyacrylamide gel. Trình t nucleotideả ứ ượ ạ ệ ồ ờ ừ đ c t d i lên theo chi u 5’ - 3’.ọ ừ ướ ề

2. Ph ng pháp enzyme Sangerươ

Đây là ph ng pháp t o đ u t n cùng c a chu i (chain terminator method).ươ ạ ầ ậ ủ ỗ Nguyên lý c a ph n ng này là s d ng dideoxynucleotide không có nhóm OH v tríủ ả ứ ử ụ ở ị 3’ trong ph n ng t ng h p DNA. Do đó, khi DNA polymerase g n chúng vào s iả ứ ổ ợ ắ ợ DNA thì quá trình t ng h p b ng ng l i. Vì v y, ph ng pháp này còn g i là ph ngổ ợ ị ừ ạ ậ ươ ọ ươ pháp dideoxy (dideoxy method).

Đ u tiên s i đôi DNA (s i khuôn c n đ c trình t ) b bi n tính tách thành hai s iầ ợ ợ ầ ọ ự ị ế ợ đ n và đ c lai v i primer. Primer là m t s i đ n g m vài ch c nucleotide có th liênơ ượ ớ ộ ợ ơ ồ ụ ể k t v i m t trong hai s i đ n DNA theo nguyên t c t o c p b sung. Sau đó, b nế ớ ộ ợ ơ ắ ạ ặ ổ ố ph n ng riêng r đ c ti n hành đ ng th i. M i ph n ng là h n h p c a DNAả ứ ẽ ượ ế ồ ờ ỗ ả ứ ỗ ợ ủ khuôn m u, primer, DNA polymerase, m t lo i dideoxynucleotide và b n lo iẫ ộ ạ ố ạ deoxynucleotide theo t l 1:100. Các s i đ n DNA đ c t ng h p có đ dài khácỷ ệ ợ ơ ượ ổ ợ ộ nhau do dideoxynucleotide g n ng u nhiên làm d ng ph n ng. S n ph m c a b nắ ẫ ừ ả ứ ả ẩ ủ ố ph n ng cùng đ c phân ly trên polyacrylamide gel cho phép phân bi t hai s i đ nả ứ ượ ệ ợ ơ DNA h n kém nhau m t nucleotide. Các v ch DNA quan sát đ c nh có g n phóngơ ộ ạ ượ ờ ắ x ạ 32P vào m i ho c vào m t trong b n lo i lo i nucleotide bình th ng (Hình 5.13).ồ ặ ộ ố ạ ạ ườ

3. Xác đ nh trình t nucleotide trên máy t đ ngị ự ự ộ

Trong nh ng năm g n đây, m t s ph ng pháp xác đ nh trình t m i đã xu tữ ầ ộ ố ươ ị ự ớ ấ hi n. Bên c nh k thu t thông th ng s d ng các gel đ phân ly các phân t DNA cóệ ạ ỹ ậ ườ ử ụ ể ử đ dài khác nhau, các k thu t m i liên quan đ n phát hi n huỳnh quang c a cácộ ỹ ậ ớ ế ệ ủ nucleotide đ c đánh d u, phân tích trình t DNA b ng kh i ph , đi n di mao qu nượ ấ ự ằ ố ổ ệ ả ho c lai v i các đo n oligonucleotide đ c t ng h p nhân t o. Nh ng ti n b nhanhặ ớ ạ ượ ổ ợ ạ ữ ế ộ chóng trong lĩnh v c kính hi n vi đi n t cho phép quan sát chi ti t c u trúc b m tự ể ệ ử ế ấ ề ặ c a phân t nucleic acid và phân bi t t ng nucleotide. Ngoài ra, k thu t lai s d ngủ ử ệ ừ ỹ ậ ử ụ t m chip g n c đ nh các oligonucleotide cho phép phân bi t đ c h n 50.000 phân tấ ắ ố ị ệ ượ ơ ử DNA khác nhau. Trong t ng lai g n, k thu t lai này có th g n hàng nghìn oligo trênươ ầ ỹ ậ ể ắ m t t m chip nh và trình t nucleotide đ c phân tích t đ ng b ng các ch ng trìnhộ ấ ỏ ự ượ ự ộ ằ ươ c a computer. Đi u đó cho phép xác đ nh trình t m t cách nhanh chóng.ủ ề ị ự ộ

Hình 5.13. Xác đ nh trình t nucleotide b ng ph ng pháp enzyme (Sanger).ị ự ằ ươ Dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) g n vào s i DNA đang t ng h p s làmắ ợ ổ ợ ẽ ng ng ph n ng. Nh đó thu đ c các đo n DNA h n kém nhau ch m t nucleotide.ừ ả ứ ờ ượ ạ ơ ỉ ộ Các đo n này đ c quan sát trên polyacrylamide gel khi primer đ c đánh d u phóngạ ượ ượ ấ x ạ 32P ho c đánh d u huỳnh quang.ặ ấ

Ph ng pháp t o đ u t n cùng c a chu i đ c c i ti n cho phép xác đ nh trìnhươ ạ ầ ậ ủ ỗ ượ ả ế ị t trên máy đ c t đ ng (automatic sequencer), s d ng các b Kit khác nhau, trong đóự ọ ự ộ ử ụ ộ đ u t n cùng đ c đánh d u b ng các ch t phát huỳnh quang màu (dye terminator).ầ ậ ượ ấ ằ ấ Ph n ng g n các nucleotide đánh d u vào s i DNA t ng h p trên khuôn m u đ cả ứ ắ ấ ợ ổ ợ ẫ ượ ti n hành trong máy PCR. Vì v y, k thu t này còn đ c g i là ph n ng chu i đ cế ậ ỹ ậ ượ ọ ả ứ ỗ ọ trình t . Sau đó, s n ph m PCR đ c đi n di trên polyacrylamide gel có đ phân gi iự ả ẩ ượ ệ ộ ả cao, cho phép phân bi t đ c các s i đ n DNA h n kém nhau m t nucleotide. Quáệ ượ ợ ơ ơ ộ trình ch y đi n di đ c th c hi n trên máy t đ ng và k t qu đ c phân tích b ngạ ệ ượ ự ệ ự ộ ế ả ượ ằ các ch ng trình computer chuyên d ng (Hình 5.14).ươ ụ

Trên các máy đ c t đ ng hi n đ i, thông th ng b n lo i nucleotide đ c đánhọ ự ộ ệ ạ ườ ố ạ ượ d u b ng các ch t phát huỳnh quang khác nhau. Đ u đ c laser trong máy s kích ho tấ ằ ấ ầ ọ ẽ ạ các ch t này khi n chúng h p th và phát ra các màu, m i màu ng v i m t lo iấ ế ấ ụ ỗ ứ ớ ộ ạ nucleotide và đ c hi n th b ng m t đ nh. Thông th ng, ph n ng g n nucleotideượ ể ị ằ ộ ỉ ườ ả ứ ắ vào s i DNA t ng h p trên s i khuôn m u đ c th c hi n b ng PCR. Hai lo iợ ổ ợ ợ ẫ ượ ự ệ ằ ạ nucleotide dGTP và dTTP đ c thay th b ng dITP và dUTP nh m h n ch s trùngượ ế ằ ằ ạ ế ự l p các đ nh. S n ph m PCR th ng đ c tinh s ch, lo i b các nucleotide và primerặ ỉ ả ẩ ườ ượ ạ ạ ỏ th a tr c khi đ a vào máy đ c t đ ng. Trình t đ c đ c trên máy t đ ng th ngừ ướ ư ọ ự ộ ự ọ ượ ự ộ ườ dài kho ng 600-1.000 bp. u đi m c a ph ng pháp này là k t qu đ c đ c đ aả Ư ể ủ ươ ế ả ọ ượ ư tr c ti p vào ch ng trình computer, gi m b t sai sót do đ c b ng m t gây ra. H nự ế ươ ả ớ ọ ằ ắ ơ n a, ph n ng PCR không đòi h i l ng DNA khuôn m u (d ng s i đôi) nhi u nh ngữ ả ứ ỏ ượ ẫ ạ ợ ề ư các s i đ n DNA c n đ c l i đ c khu ch đ i lên r t nhi u l n.ợ ơ ầ ọ ạ ượ ế ạ ấ ề ầ

Hình 5.14. Máy phân tích trình t nucleotide t đ ng và hình nh đi n di cácự ự ộ ả ệ băng DNA phát huỳnh quang quan sát đ c trên computerượ

Trình t h gen cũng nh các lo i DNA đ c xác đ nh ngày càng nhi u cácự ệ ư ạ ượ ị ề ở sinh v t khác nhau. Do đó, vi c l u tr s li u, phân tích, so sánh và s p x p chúng đãậ ệ ư ữ ố ệ ắ ế thúc đ y hình thành m t h ng nghiên c u m i đó là tin sinh h c (bioinformatics). M iẩ ộ ướ ứ ớ ọ ố liên quan m t thi t gi a trình t nucleotide và protein đã khi n lĩnh v c m i này phátậ ế ữ ự ế ự ớ tri n r t nhanh chóng. Ba ngân hàng d li u chính hi n nay l u tr h u h t các thôngể ấ ữ ệ ệ ư ữ ầ ế

tin v DNA là EMBL (thu c European Informatics Institute), GenBank (thu c USề ộ ộ National Centre for Biotechnology Information) và DDBJ (thu c DNA Database Bank ofộ Japan). M t ngân hàng d li u khác l u tr thông tin v protein là Swiss Proteinộ ữ ệ ư ữ ề Database (Th y Sĩ).ụ

Hình 5.15. Minh h a trình t nucleotide m t đo n DNA đã đ c phân tíchọ ự ộ ạ ượ trình tự

Tai liêu tham kh o/đ c thêm ả ọ

1. Võ Th Th ng Lanị ươ . 2002. Sinh h c phân t . ọ ử NXB Đ i h c Qu c gia Hà N iạ ọ ố ộ , Hà

N i.ộ

2. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl

K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.

3. Brown TA. 2001. Gene Cloning-An Introduction. 4th ed. Blackwell Science, Oxford,

UK.

4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and

Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA.

5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory

Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA.

6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood

Cliffs, New Jersey, USA.

7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed.

Blackwell Science, Oxford, UK.

8. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press

Inc. New Jersey, USA.

9. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin,

Heidelberg, Germany.

1LB: lysogeny broth, m t môi tr ng giàu dinh d ng đ c dùng ch y u cho s sinh tr ngộ ườ ươ ượ ủ ế ự ưở c a vi khu n. Môi tr ng LB còn đ c g i là Luria broth ho c Luria-Bertani broth.ủ ẩ ườ ượ ọ ặ2DNase I (t y c a bò): enzyme xúc tác ph n ng th y phân liên k t n m ngay sau m tụ ủ ả ứ ủ ế ằ ộ pyrimidine trên chu i DNA. Trong tr ng h p DNA s i đôi, ch c t có th x y ra trênỗ ưở ợ ợ ỗ ắ ể ả m t hay trên c hay s i (xem ch ng 1).ộ ả ợ ươ

Ch ng 6ươ

Tao dong va xây d ng th viên cDNA ự ư

I. Tach chiêt, tinh sach và phân tích RNA

1. Tách chi t và tinh s ch RNAế ạ

1.1. Tach chiêt RNA tông sô

- Kiêm soat hoat tinh ribonuclease. Cac phân t RNA không bên, dê bi phân h y ử ủ b i cac ribonuclease (RNase). Đê thu đ c dich chiêt RNA có ch t l ng t t, cân ph iở ượ ấ ượ ố ả giam thiêu hoat tinh cua RNase đ c giai phong trong suôt qua trinh sinh tan tê bao hoăc ượ t cac nguôn tiêm tang khac trong phong thi nghiêm (dung cu, ban lam viêc, ban tay cuaừ ky thuât viên...) băng cac nhân tô c chê RNase, bao gôm cac nhân tô c chê protein cua ứ ứ RNase, cac ph c h p vanadyl-ribonucleoside ho c macaloid. ứ ợ ặ

- Nguyên ly. Ph ng phap tach chiêt RNA tông sô bao gôm cac b c c banươ ướ ơ giông nh tách chi t DNA. Tê bao hoăc mô đ c nghiên trong dung dich co ch a chât ư ế ượ ứ tây manh la SDS (sodium dodecyl sulphate, sarcocyl) nông đô cao, cac dung dich muôi ở manh (guanidinium thiocyanate-GTC) đê hòa tan RNA va kêt tua cac protein bi biên tinh

cung môt th i gian, và môt chât kh (ở ờ ử β-mercaptoethanol). Hai loai chât sau co tac dung c chê cac RNase nôi bao va tach cac protein liên kêt khoi phân t RNA. Bên canh ứ ử đo, co thê bô sung cac protease (chăng han protease K) đê gây biên tinh cac thanh phân protein cua ph c chât RNA-protein. Cac protein đ c loai bo khoi mâu b ng cách chiêt ứ ượ ằ

(ly tâm) v i phenol, phenol:chloroform va chloroform. RNA hòa tan trong pha n cớ ướ đ c k t tua băng ethanol (hoăc isopropanol) va đ c thu nhân lai qua ly tâm. RNAượ ế ượ đ c bao quan trên môt năm -70ượ ở oC trong n c co ch a RNasin (nhân tô c chêướ ứ ứ RNase).

1.2. Phân l p RNA poly(A)ậ +

RNA tông sô cua tê bao ch a khoang 90-99% rRNA va tRNA, trong đo rRNA ứ chiêm khoang 80-85% va tRNA chiêm khoang 15-20%. Cac RNA nay co kich th c va ướ trinh t xac đinh va co thê đ c tach riêng dê dang băng điên di hoăc ly tâm. Riêng ự ượ mRNA chi chiêm khoang 1-5% RNA tông sô cua tê bao, lai co kich th c va trinh t rât ướ ự đa dang. Tuy nhiên, chung co môt điêm chung la câu truc đuôi polyA (co thê lên t i ớ 100A). D a vao câu truc nay va đăc tinh liên kêt bô sung A-T cua nucleic acid, co thêự tach mRNA ra khoi mâu băng săc ky ai l c trên côt oligo(dT)-cellulose. Cac mRNA se ự bam lên côt thông qua liên kêt bô sung v i oligo(dT) va đ c thu nhân lai qua ly tâm. ớ ượ Ky thuât nay cho phep thu nhân mRNA t nh ng mâu co khôi l ng rât nho. ừ ữ ượ

Hình 6.1. S đ quy trình tinh s ch mRNA t RNA t ng sơ ồ ạ ừ ổ ố

2. Phân tích RNA

2.1. Lai Northern (Northern hybridization)

Phân tich RNA la công viêc quan trong cua nhiêu nghiên c u vê sinh hoc phân t , ứ ử vi no co thê cung câp thông tin vê s biêu hiên cua gen trong c thê sông. Lai băng mang ự ơ loc (nylon hoăc nitrocellulose) cac RNA đ c phân đoan v i đoan môi la nucleic acid ượ ớ đanh dâu đông vi phong xa 32P (ho c digoxigenin-dUTP) đ c goi la ph ng pháp thâmặ ượ ươ tich Northern (Northern blot). Ph ng th c nay băt nguôn t phân tich Southern blot ươ ứ ừ (xem ch ng 5), d a trên c s kha năng bô sung cua cac nucleic acid s i đ n đê taoươ ự ơ ở ợ ơ thanh cac phân t lai. Môt cach tom tăt, RNA đ c phân chia theo kich th c trên ử ượ ướ agarose gel d i cac điêu kiên biên tinh, thâm tich va liên kêt không thuân nghich v iướ ớ

mang nylon hoăc nitrocellulose, lai v i đoan môi nucleic acid đ c đanh dâu ớ ượ 32P. Sau khi r a trôi đoan môi không liên kêt hoăc liên kêt không đăc hiêu, cac phân t RNA lai đ cử ử ượ phat hiên nh la cac băng phong xa t ghi trên phim X-quang (Hình 6.2). ư ự

Hình 6.2. Phân tích s bi u hi n c a gen b ng lai Northern. ự ể ệ ủ ằ Hình phía d i là đi n di RNAướ ệ

t ng s trên agarose gel đ c bi n tính b ng formamide. Hình phía trên là tín hi u phóng xổ ố ượ ế ằ ệ ạ

thu đ c t ph n ng lai gi a RNA t ng s v i m u dò đ c đánh d u b ng ượ ừ ả ứ ữ ổ ố ớ ẫ ượ ấ ằ 32P.

Thâm tich Northern la ph ng pháp quan trong đê nghiên c u biêu hiên cua gen, ươ ứ do cac RNA hiên diên trong tê bao hoăc loai mô quy đinh mô ta khai quát môt phân cua genome đ c biêu hiên trong tê bao hoăc mô đo. Phân tích Northern cho th y m c đượ ấ ứ ộ ôn đinh cua s tich lũy chuôi RNA qui đinh (th ng la mRNA) trong mâu nghiên c u. ự ườ ứ Vi thê, phân tich Northern cho phep ng i ta liên kêt cac m c đô bi u hi n mRNA v i ườ ứ ể ệ ớ cac tinh chât hinh thai va sinh ly cua c thê sông. Ky thuât lai Northern là m t ph ng ơ ộ ươ pháp đ c ng dung rông rai cho viêc phân tich biêu hiên gen. Vi du: ky thuât nay đaượ ứ đ c s dung cho viêc mô ta đăc đi m cua cac cDNA va gen đ c tao dong, nghiênượ ử ể ượ c u đăc tr ng c quan/mô cua s biêu hiên gen, phân tich hoat tinh cua cac gen nôi vaứ ư ơ ự ngoai sinh trong c thê chuyên gen, va nghiên c u s biêu hiên cua gen trong môi liên ơ ứ ự quan v i s phat triên va cac yêu tô vô sinh va h u sinh.ớ ự ữ

2.2. Lai Dot (Dot hybridization)

Lai dot đ c Kafatos và cs. (1979) th c hi n đ u tiên b ng cách ch m các m uượ ự ệ ầ ằ ấ ẫ nh c a dung d ch RNA lên màng nitrocellulose, sau đó màng đ c làm khô, lai v iỏ ủ ị ượ ớ m u dò đ c tr ng RNA ho c DNA có đánh d u ẫ ặ ư ặ ấ 32P, và v i phim X-quang. M c dùủ ớ ặ khó đ nh l ng chính xác do kích th c c a các ch m l n và khác nhau, nh ng trongị ượ ướ ủ ấ ớ ư nhi u tr ng h p có th thu đ c m t ý t ng t t v c ng đ bi u hi n c a m tề ườ ợ ể ượ ộ ưở ố ề ườ ộ ể ệ ủ ộ gen đ c bi t nào đó trong các mô đ c tr ng ho c các t bào nuôi c y (Hình 6.3).ặ ệ ặ ư ặ ế ấ

Hình 6.3. Phân tích dot đ đ nh l ng RNA. ể ị ượ Hàng phía d i là các n ng đ RNA chu n đãướ ồ ộ ẩ

bi t. Hàng trên là các n ng đ RNA khác nhau đ c tách chi t t mô/c quan.ế ồ ộ ượ ế ừ ơ

II. Tông h p cDNA (complementary DNA) ợ

Ph ng phap t ng h p cDNA co nhiêu thuân l i do: (1) Lây mRNA đung cua gen.ươ ổ ợ ợ (2) Không tôn công phân tich nh ng đoan gen trung lăp. (3) Chon loc dê dang trong môt ữ sô tr ng h p. ườ ợ

đây chi trinh bay ph ng phap tông h p cDNA. Qua trinh tông h p cDNA quaƠ ươ ợ ợ ba giai đoan nh sau: (1) Tông h p s i th nhât băng enzyme reverse transcriptase. (2) ư ợ ợ ứ Bi n tính và căt RNA trong thê lai mRNA-cDNA tu n t băng nhi t và enzyme RNaseế ầ ự ệ H c aủ E. coli. Thay thê khuôn m u là chuôi RNA băng chuôi cDNA th nh t va tông ẫ ứ ấ h p s i cDNA th hai nh DNA polymerase I c a ợ ợ ứ ờ ủ E. coli. (3) C t vòng c p tóc cuaắ ặ cDNA s i đôi nh nuclease S1 và s a ch a hai đ u b ng đo n Klenow (Hình 6.4).ợ ờ ử ữ ầ ằ ạ

1. Tông h p s i cDNA th nhât ợ ợ ư

1.1. Enzyme phiên mã ng c (reverse transcriptase)ượ

Nhân tô quan trong nhât trong tông h p cDNA la chât l ng cua enzyme phiên ợ ượ mã ng c đ c s dung trong phan ng. Măc du chât l ng cua enzyme đ c sượ ượ ử ứ ượ ượ ử dung noi chung la tôt, song vân kho loai tr đ c RNase bân. Tr ngai nay co thê ừ ượ ở khăc phuc băng cach dung cac nhân tô c chê manh RNase (RNase inhibitor), vi du ứ nh : vanadyl-ribonucleoside hoăc RNasin, trong phan ng phiên mã ng c.ư ứ ượ

Ty lê enzyme phiên mã ng c dung cho khuôn mâu mRNA cung co anh h ng ượ ưở khac nhau đên hiêu suât tông h p cDNA hoàn chinh. Nêu sô l ng khuôn mâu nhiêu ợ ượ thi hiêu suât cua san phâm phiên ma cDNA se tăng lên cung v i viêc tăng sô l ng ớ ượ enzyme reverse transcriptase. Trong nghiên c u, hiêu suât tôi đa cua cac san phâmứ phiên ma cDNA hoàn chinh đat đên 80 tiêu phân enzyme/ µg cua khuôn mâu, ty lê enzyme cao nh thê đoi hoi phai s dung enzyme tinh sach cao va bao gôm ca cacư ử nhân tô c chê RNase trong phan ng. ứ ứ

1.2. Oligo dT primer

Cac oligo dT primer đ c s dung đê lam m i cho phan ng tông h p s i ượ ử ồ ứ ợ ợ cDNA th nhât d a trên khuôn mâu cua mRNA. Cac oligo dT primer se liên kêt v iứ ự ớ đuôi polyA cua mRNA.

1.3. Deoxynucleoside triphosphate (dNTP)

Nông đô cua b n loai dNTP la yêu tô đăc biêt quan trong anh h ng đên hiêu ố ưở suât tông h p cDNA. Nêu nông đô cua m t trong b n dNTP giam xuông d i 10-50 ợ ộ ố ướ µM thi hiêu suât cua san phâm phiên ma giam ro rêt. Khi s dung RNA cua avian ử myeloblastosis virus lam khuôn mâu thi viêc san xuât cac cDNA hoàn chinh tăng tôi đa nông đô 75 ở µM cua ca b n lo i dNTP. Nông đô cua dNTP t 200-250 ố ạ ừ µM đang đ c dung phô biên.ượ

1.4. Cac cation hoa tri 1 va hoa tri 2

Cac điêu kiên ion anh h ng thât s đên hiêu qua phiên ma cua cac khuôn mâu ưở ự khac nhau. Đôi v i cac san phâm phiên ma dai thi ion K ớ + co hiêu qua cao h n ion ơ Na+. Nông đô K + tôi u cho qua trinh tông h p va keo dai kich th c cDNA la ư ợ ướ khoang t 140-150 mM. Cac cation hóa tri 2 la yêu câu tuyêt đôi cho hoat tinh cua ừ enzyme phiên ma ng c. Không co hoat tinh nao đ c tim thây nông đô <4 mM ượ ượ ở cua ion Mg 2+, nông đô ion Mg 2+ tôi u cho qua trinh san xuât cac san phâm phiên ma ư hoàn chinh la khoang 6-10 mM.

1.5. pH cua dung dich phan ng ứ

Giá tr pH 8,3 la tôi u đê san xuât hiêu qua cac san phâm phiên ma cDNA hoànị ư chinh. Trong qua trinh san xuât cac san phâm phiên ma, môt sô đêm đa đ c th nghiêm ượ ử nh ng không tôt h n đêm Tris.HCl.ư ơ

2. Tông h p s i cDNA th hai ợ ợ ư

Gây biên tinh (đun sôi) thê lai mRNA-cDNA đê căt RNA băng RNase H c a ủ E. coli. Thông th ng, đâu tân cung 3’ cua cac cDNA s i đ n co kha năng tao thanh cacườ ợ ơ câu truc vòng căp toc (hairpin loop) 1 va vi thê co thê đ c s dung đê lam môi (primer) ượ ử

cho qua trinh tông h p s i cDNA th hai băng DNA polymerase I cua ợ ợ ứ E. coli hoăc reverse transcriptase (Hinh 6.4). Măc du ng i ta đa d đoan câu truc vong đôi đâu tân ườ ự ở cung cua cac cDNA va c chê phat sinh cua chung, nh ng hiên t ng tông h p s i ơ ư ượ ợ ợ cDNA th hai vân ch a đ c nghiên c u môt cach hê thông.ứ ư ượ ứ

Tông h p s i cDNA th hai băng DNA polymerase I đa đ c s dung rông rai. ợ ợ ứ ượ ử Đoan Klenow cua DNA polymerase I thiêu hoat tinh exonuclease 5' −3' cung đ c s ượ ử dung thanh công đê tông h p s i cDNA th hai. ợ ợ ứ

Nhiêu tac gia đa s dung reverse transcriptase đê tông h p s i cDNA th hai. Măc ử ợ ợ ứ du co tac gia cho răng AMV reverse transcriptase không thê dung đê tông h p s i th ợ ợ ứ hai cua cDNA immunoglobulin, nh ng thanh công cua nhiêu thi nghiêm dung reverse ư transcriptase đê tông h p s i cDNA th hai đa cho thây viêc s dung ca hai enzyme đêu ợ ợ ứ ử co thê cho k t qu t t. DNA polymerase I va reverse transcriptase co thê tam ng ng ế ả ố ừ hoăc ng ng lai cac chuôi khac nhau. Vi vây, cac s i th hai đ c tông h p môt cach ừ ở ợ ứ ượ ợ đăc biêt, chung đ c san xuât nh môt enzyme va đ c m rông hoàn toan nh môt ượ ờ ượ ở ờ enzyme khac.

Hinh 6.4. S đô tông h p đo n cDNA t khuôn m u mRNAơ ợ ạ ừ ẫ

3. Căt vong căp toc nh nuclease S1 ơ

Sau khi tông h p cDNA hoàn toan, s i th nhât va th hai đ c liên kêt c ng hoa ợ ợ ứ ứ ượ ộ tri b i vòng căp toc va vong căp toc dê bi căt b i nuclease S1. Sau đó, đo n cDNA đ c ở ở ạ ượ s a ch a b ng enzyme Klenow, kêt qua la hai đâu tân cung la đâu băng.ử ữ ằ

S i đôi cDNA sau đo đ c tach thanh cac tiêu phân theo kich th c va cac phânợ ượ ướ t l n nhât đ c găn vao cac plasmid cua vi khuân. Hoăc la môt tâp h p đây đu cac kichử ớ ượ ợ th c cua cDNA s i đôi đ c tao dong trong bacteriophage ướ ợ ượ λ đê xây d ng th viên ự ư cDNA (cDNA library). Tuy nhiên, viêc đ a cac đâu băng vao vector s gây kho khăn ư ẽ trong viêc lây chung ra khoi vector môt cach nguyên ven sau này. Do đo cac linker th ng đ c nôi vao hai đâu cua cac cDNA nh DNA ligase. Linker la nh ng đoanườ ượ ờ ữ nucleotide ngăn co ch a vi tri nhân biêt cua m t loai RE (vi du: ứ ộ EcoRI) đ c tông h pượ ợ nhân tao t ng ng v i vi tri nhân biêt RE (vi du: ươ ứ ớ EcoRI) cua vector. Sau đo, cac cDNA mang linker va vector se đ c căt b i cung m t enzyme (vi du: ượ ở ộ EcoRI). Nh đo cacờ cDNA va vector đêu co đâu sole t ng đông (đ u dính) va cDNA se dê dang găn cung ươ ầ nh lây ra khoi vector môt cach nguyên ven.ư

III. Tao dong phân t cua cDNA s i đôi ử ợ

Co nhiêu ph ng phap khac nhau đ c dung đê liên kêt cDNA s i đôi v i cac ươ ượ ợ ớ plasmid vector. Đa sô đ c dung theo các ph ng pháp sau: ượ ươ

- Bô sung cac đuôi đông trung h p (homopolymetric tailing) ợ cho cDNA s i đôiợ va cho DNA c a plasmid vector. DNA vector va cDNA sau đo đ c nôi băng liên kêt ủ ượ hydrogen gi a cac đuôi đông trung h p bô sung. S tao thanh vong DNA đong băngữ ợ ự enzyme găn in vitro (DNA ligase) la cân thiêt đê hinh thanh nên cac plasmid tai tô h p ợ trong E. coli.

- Bô sung cac đo n n i nhân tao (synthetic linkers) ạ ố cho đâu tân cung cua DNA s i đôi. Sau khi phân căt băng RE thich h p, cac phân t DNA đ c chuyên vao trongợ ợ ử ượ plasmid DNA cung đa đ c căt v i cùng m t enzyme. ượ ớ ộ

1. Đuôi đông trung h p ợ

1.1. Đuôi dA:dT

Enzyme terminal transferase xuc tac cho s bô sung cua cac deoxyrinucleotide ự triphosphate (dNTP) vao đâu 3’-OH cua DNA s i đôi hoăc s i đ n, đ c dung đê đ a ợ ợ ơ ượ ư DNA tai tô h p vao trong ợ E. coli băng cách nôi dA:dT. Thông th ng t 50-150 gôc dA ườ ừ đ c bô sung vao vector DNA va môt sô t ng ng cua cac gôc dT vao cDNA s i đôi,ượ ươ ứ ợ cDNA s i đôi đ c đ a vao trong cac plasmid vector qua ph ng th c nôi dA:dT. Tuyợ ượ ư ươ ứ

nhiên, đuôi đông trung h p dA:dT it khi đ c dung đê tao dong cDNA, ly do chinh la ợ ượ không co ph ng th c thich h p đê căt cDNA găn trong plasmid nh đuôi dA:dT. ươ ứ ợ ờ

1.2. Đuôi dC:dG

Ph ng pháp đ c s dung rông rai h n đê tao dong cac cDNA băng đuôi đôngươ ượ ử ơ trung h p đoi hoi bô sung cac đuôi dC cho cDNA s i đôi va cac đuôi dG đ c bô sung ợ ợ ượ vao plasmid vector đa đ c căt han chê băng ượ PstI. Enzyme PstI căt chuôi 5’… CTGCAG…3’ tao ra đâu 3’ tân cung la c chât ly t ng cho viêc bô sung cac đuôi đông ơ ưở trung h p. Cac dong cDNA mang cac đuôi dC:dG co thê dê dang tach ra khoi plasmid ợ băng cach thuy phân nh ờ PstI (Hinh 6.5).

Sô l ng cac gôc dA:dT va dC:dG cân thiêt đê cho hiêu suât găn tôi thich cDNA ượ vao plasmid vector đa đ c xac đinh, sô l ng cac gôc trên plasmid va cDNA phai xâp ượ ượ x nhau, v i khoang 100 gôc đ c bô sung t i môi DNA đê nôi dA:dT va khoang 20 gôcỉ ớ ượ ớ đê nôi dC:dG.

2. Cac linker va adapter nhân tao

Cac linker ch a môt hoăc nhiêu vi tri căt han chê cho phép nôi cDNA s i đôi v i ứ ợ ớ cac plasmid vector hoăc bacteriophage λ vector. cDNA s i đôi đ c x ly v i DNAợ ượ ử ớ polymerase cua bacteriophage T4 hoăc DNA polymerase I cua E. coli, cac enzyme nay loai bo đâu tân cung 3’ s i đ n so le băng hoat tinh exonuclease 3’ ợ ơ → 5’ va lâp đây cac đâu tân cung 3’-OH bi khuyêt băng hoat tinh trung h p (polymerization). S phôi h p ợ ự ợ cua cac hoat tinh nay đa tao ra cac phân t DNA đâu băng, sau đo cac cDNA nay đ c u ử ượ v i môt sô l ng l n cac phân t linker v i s co măt cua bacteriophage T4 DNA ligaseớ ượ ớ ử ớ ự (enzyme xuc tac cho qua trinh găn cua cac phân t DNA đâu l i v i linker) (Hình 6.6). ử ồ ớ

Hinh 6.5. Tao dong cDNA s i đôi băng đuôi đông trung h p dG:dC. ợ ợ Enzyme terminal

transferase co hoat tinh tao nhom homopolymer đâu 3’-OH cua DNA s i đôi lam lôi ra m t ở ợ ộ

đâu cuôi c chât cua no la DNA s i đ n. ở ơ ợ ơ

Hình 6.6. Minh h a m t linker. ọ ộ (a) Đo n 5’-CCGGATCCGG-3’ mang v trí nh n bi tạ ị ậ ế

cho BamHI. (b) Linker này đ c g n vào cDNA đ u b ng nh DNA ligase. (c) C u trúc nàyượ ắ ầ ằ ờ ấ

sau đó đ c c t b ng ượ ắ ằ BamHI đ t o ra đ u 5’ l i.ể ạ ầ ồ

Cac phân t DNA s i đôi mang cac đâu kêt dính nhân tao đ c căt vi tri c t han ử ợ ượ ở ắ ch trong linker, tinh sach, va sau đo găn v i vector cung đ c căt băng RE t ng ngế ớ ượ ươ ứ tao ra cac đâu dinh t ng đông v i cac đâu cua linker. Co thê han chê s tai tao lai vong ươ ớ ự cua plasmid vector (không tai tô h p) băng cach x ly cac vector đ c căt băng enzyme ợ ử ượ phosphatase (calf intestinal alkaline phosphatase-CIAP) tr c khi th c hiên phan ngướ ự ứ găn v i cDNA. ớ

Viêc s dung adapter co hiêu qua h n linker. Cac adapter co kich th c ngăn, la ử ơ ướ cac oligonucleotide s i đôi mang môt đâu băng (đê găn v i cDNA s i đôi) va môt đâu ợ ớ ợ tân cung kêt dinh (đê găn v i đâu tân cung t ng ng trong vector). Không giông nh ớ ươ ứ ư linker, cac adapter không đoi hoi phai căt băng cac RE sau khi chung đ c găn v i ượ ớ cDNA s i đôi. Tuy nhiên, cac phân t cDNA mang cac adapter đ c phosphoryl hóaợ ử ượ (phosphorylation) co thê tao thanh cac phân t mach vong đong băng liên kêt c ng hóa ử ộ tri (dang không thê tao dong) hoăc cac phân t mach thăng dang kham (dang hoàn toan ử không mong muôn) trong suôt phan ng găn tuân t v i s co măt cua vector DNA đa ứ ự ớ ự đ c dephosphoryl hóa (Hình 6.7).ượ

Hình 6.7. Minh h a m t adapter.ọ ộ (a) Adapter, có đ u t n cùng 5’ t ng ng v i enzymeầ ậ ươ ứ ớ

HindIII, đ c g n vào cDNA đ u b ng nh DNA ligase. (b) Đ u 5’ c a adapter có th đ cượ ắ ầ ằ ờ ầ ủ ể ượ

dephosphoryl hóa đ ngăn c n s t k t n i l i.ể ả ự ự ế ố ạ

Khi nôi cac linker hoăc adapter v i cac phân t cDNA s i đôi đâu băng, phan ng ớ ử ợ ứ găn cân đ c tiên hanh trong môt dung tich tôi thiêu (đê duy tri môt nông đô cao cua ượ linker/adapter). Nông đô phân t cua linker/adapter phai l n h n nông đô cua đâu tân ử ớ ơ cung cua cDNA it nhât la 100 lân. Cuôi cung, tr c khi đoan cDNA đ c găn vao ướ ượ vector, cac adapter không co phan ng va cac san phâm co trong l ng phân t thâp (do ứ ượ ử phan ng căt han chê tao ra) cân đ c loai bo băng săc ky côt, điên di agarose hoăc ứ ượ polyacrylamide gel.

IV. Cac ph ng phap tao dong cDNA khac ươ

1. Tao dong mRNA -cDNA

Môt ph ng phap khac đê tao dong cDNA la biên nap vao ươ E. coli cac thê lai mRNA-cDNA đa đ c găn v i cac plasmid vector. Cac vi khuân vât chu loai bo mRNA ượ ớ va thay thê no băng DNA. Sau khi s i cDNA đâu tiên đ c tông h p theo cach thông ợ ượ ợ th ng, cac gôc dA đ c bô sung cho thê lai mRNA-cDNA sau đo đ c u v i plasmidườ ượ ượ ớ mang cac đuôi dT. Do đâu tân cung 3’-OH cua RNA kem it nhât 10 lân trong phan ng ứ t ng đông v i DNA nên hâu hêt cac gôc dA đ c bô sung cho thê lai đêu phôi h p ươ ớ ượ ợ ở đâu 3’ cua DNA. Viêc nôi cac đâu khac cua thê lai v i vector co kha năng thanh công do ớ môi liên kêt hydrogen gi a poly(A) t nhiên đâu 3’ cua mRNA va plasmid co đuôi dT. ữ ự ở Ph ng pháp nay có m t s thu n l i sau: ươ ộ ố ậ ợ

- Không c n tông h p s i cDNA th hai. ầ ợ ợ ứ

- Căt vong căp toc DNA băng nuclease S1 la không cân thiêt.

Tuy nhiên, han chê cua ph ng pháp nay la co hiêu qua kem it nhât 10 lân so v i ươ ớ ph ng phap tao dong cDNA s i đôi va vi thê không thich h p cho viêc xây d ng môtươ ợ ợ ự sô l ng l n cac dong cDNA. ượ ớ

2. Bô sung tuân t cac linker khac nhau ự

cDNA s i đôi, đ c tông h p băng c chê t môi (self-priming), đ c găn vaoợ ượ ợ ơ ự ượ môt loai linker nhân tao tr c khi vong căp toc trong cDNA bi căt. Vi thê, cac linker chi ướ đ c bô sung môt đâu cua cDNA s i đôi (đâu t ng ng v i đâu tân cung 3’ cuaượ ở ợ ươ ứ ớ mRNA). Sau đo cDNA đ c tinh sach khoi cac linker th a, vong căp toc đ c căt băng ượ ừ ượ nuclease S1 va s a ch a băng đoan Klenow cua DNA polymerase I cua ử ữ E. coli tr c khiướ

loai linker th hai đ c găn vao cDNA. Cac linker nay se đ c găn vao ca hai đâu cua ứ ượ ượ cDNA. cDNA đ c găn linker kep sau đo đ c x ly v i cac RE thich h p va găn vaoượ ượ ử ớ ợ trong vector băng ph ng phap tao dong đinh h ng (Hinh 6.8). ươ ướ

Ph ng phap nay đ c dung đê găn cDNA theo h ng chinh xac cua cacươ ượ ướ promoter cho phep biêu hiên cac đoan chèn (inserted sequences) trong vi khuân. Cac bacteriophage λ vector cho phep tao dong đinh h ng cung đa đ c phát tri n trong ướ ượ ể th i gian gân đây.ờ

3. Tao dong cDNA băng cac primer-adapter

Ngay nay, viêc san xuât dê dang cac oligonucleotide primer cua cac trinh t xac ự đinh đa cho phep phat triên cac ph ng phap tao dong s dung primer-adapter ch a m t ươ ử ứ ộ vung cua DNA đông trung h p đâu tân cung 3’ va môt vi tri căt han ch đâu tân ợ ở ế ở cung 5’. Cac chuôi đông trung h p đ c dung lam môi đê tông h p s i th nhât va s i ợ ượ ợ ợ ứ ợ th hai cua cDNA, va cac vi tri căt han ch bên canh đ c s dung đê đ a cac phân tứ ế ượ ử ư ử cDNA s i đôi cuôi cung vao trong môt vector thich h p. Trong mô hinh đ n gian nhât,ợ ợ ơ ph ng phap nay cho phep cac cDNA đ c tao dong v i hiêu suât cao (Hinh 6.9).ươ ượ ớ

Hinh 6.8. T o dong cDNA băng cach bô sung tuân t cac linker nhân tao. ạ ự Đo n Klenow t oạ ạ

đ u b ng cho cDNA s i đôi và enzyme nuclease S1 c t vòng c p tóc. Các linker th nh t vàầ ằ ợ ắ ặ ứ ấ

th hai đ c g n tu n t vào hai đ u c a cDNA, sau đó đo n cDNA này s đ c c t cùngứ ượ ắ ầ ự ầ ủ ạ ẽ ượ ắ

enzyme h n ch v i vector t o dòng có v trí nh n bi t trên hai linker nhân t o. Cu i cùng,ạ ế ớ ạ ị ậ ế ạ ố

đo n cDNA có hai đ u t ng đ ng đ c g n v i vector và bi n n p vào ạ ầ ươ ồ ượ ắ ớ ế ạ E. coli.

Hinh 6.9. Tông h p cDNA s i đôi băng ph ng phap primer-adapter ợ ợ ươ

Đoan cDNA đ c t ng h p theo ph ng pháp trên khi g n vao trong cac vector ượ ổ ợ ươ ắ biêu hiên nh ư λgt20 va λgt22 chi co 1/6 c hôi biêu hiên trong vi khuân, lý do: chi môt ơ n a cac phân t cDNA đ c đ a vao trong vector theo h ng chinh xac đôi v iử ử ượ ư ướ ớ promoter lacZ, va chi môt trong ba phân t đ c găn h ng phai se trong khung ử ượ ở ướ ở đoc chinh xac đê san xuât protein h p nhât. ợ

V. Cac bacteriophage λ vector dung trong tao dong cDNA

1. Cac bacteriophage λ vector đ c dung phô biênượ

Hai loai vector bi u hi n c a bacteriophage ể ệ ủ λ th ng dung đê xây d ng thườ ự ư viên cDNA la λgt10 va λgt11. Vector λgt10 dung đê xây d ng cac th viên ch đ c ự ư ỉ ượ sang loc băng cac mâu do nucleic acid, trong khi vector λgt11 dung đê xây d ng cac ự th viên đ c sang loc băng cac mâu do miên dich đê phân lâp cac chuôi DNA maư ượ hoa cac khang nguyên đăc hiêu.

1.1. Vector λgt10

λgt10 la vector đ c thiêt kê đê nhân cac đoan DNA ngoai lai trong vung ma hoa ượ cua gen c ch ứ ế cI2. Cac vector nay mang gen cI, giông nh bacteriophage ư λ, no tao thanh cac v t tan m đuc trên hâu hêt cac chung ế ờ E. coli. DNA cua λgt10 mang vi tri nhân biêt đ n ơ EcoRI năm trong vung ma hoa cua gen cI la n i ma cac đoan DNA co thê ơ găn vao. Kêt qua chèn đoan DNA se lam bât hoat gen cI, san sinh ra cac bacteriophage cI tai tô h p va tao thanh cac plaque mau sang, dê dang phân biêt v i cac plaque m đuc ợ ớ ờ cua λgt10 bô me.

DNA cua λgt10 bô me xâp x 43 kb va nh vây co thê nhân cac đoan DNA ỉ ư ngoai lai dai t i 7,6 kb. Cac th viên cDNA đ c xây d ng trong ớ ư ượ ự λgt10 luôn ch aứ hôn h p cac bacteriophage tai tô h p va không tai tô h p. Hai loai bacteriophage nay ợ ợ ợ co thê phân biêt kiêu hinh nh vao kha năng tao thanh cac plaque cua chung. ờ

1.2. Vector λgt11

λgt11 la vector biêu hiên mang ban sao cua gen lacZ cua E. coli, co vi tri nhân biêt đ n ơ EcoRI năm vung ng c h ng 53 bp cua codon kêt thuc dich ma cua gen ở ượ ướ lacZ. DNA ngoai lai co kich th c xâp x 7,2 kb co thê đ c găn vi tri nay. Cac chuôi ma ướ ỉ ượ ở hoa găn trong khung đoc theo h ng chinh xac se đ c biêu hiên đê san xuât cac protein ướ ượ dung h p (fusion protein) co đâu tân cung amino ch a cac chuôi ợ ứ β-galactosidase va đâu tân cung carboxyl ch a mach polypeptide ngoai lai. Môt sô protein dung h p nay se thê ứ ợ hiên cac y u t quy t đ nh khang nguyên (epitopes) đ c phat hiên b i kha năng phan ế ố ế ị ượ ở

ng v i cac khang thê cua chung.ứ ớ Cac protein dung h p mang cac y u t quy t đ nh khang nguyên ngoai lai co thê ợ ế ố ế ị

đ c phat hiên b ng cach sang loc cac plaque v i m u dò miên dich. Bacteriophageượ ằ ớ ẫ đ c dan trai 42ượ ở oC trên E. coli. Sau khoang 4 gi , cac đia petri đ c chuyên đên nhiêt ờ ượ đô 37 oC va đ c phu mang loc vô trung nitrocellulose có thâm isopropylthio- ượ β-D-galactoside (IPTG), chât lam bât hoat gen c chê ứ lac va cam ng biêu hiên protein ngoai ứ lai. Sau môt vai gi nuôi 37 ờ ở oC, cac mang loc đ c u v i khang thê đê liên kêt v i ượ ớ ớ khang nguyên quan tâm. Cac khang thê nay sau đo đ c phat hiên băng cac xét nghiêm ượ hoa hoc phong xa (radiochemistry) hoăc hoa hoc mô (histochemistry).

2. Môt sô bacteriophage λ vector khac 2.1. Vector λgt18 và λgt19

Hai loai vector λgt18 va λgt19 co nguôn gôc t vector ừ λgt11 đ c cai tiên mangượ vùng tao dong (polycloning sites) vi tri ở EcoRI đ n cua ơ λgt11. Co thê s dung hai loai ử vector nay đê tao dong đinh h ng va không đinh h ng cDNA. H n n a, it nhât môt ướ ướ ơ ữ trong cac vi tri cua vung tao dong ( SalI) it khi xuât hiên trong DNA đông vât co vu (trung binh 1 vi tri/đoan 100 kb), va vi thê it co kha năng các dong cDNA co ch a vi tri ứ SalI. Nh vây, cac cDNA s i đôi co đâu băng mang cac linker ư ợ SalI không cân phai đ c bao ượ

vê băng cach methyl hoa (methylation) tr c khi đ c thuy phân băng RE. Khi cac đoan ướ ượ linker đ c loai bo, se dân đên kêt qua quân thê cac phân t cDNA co thê đ c găn tr cượ ử ượ ự tiêp v i cac nhanh cua ớ λgt18 hoăc λgt19.

2.2. Vector λgt20 và λgt21 Các vector λgt20 va λgt21 co nguôn gôc t ng ng t ươ ứ ừ λgt18 va λgt19, va nh ư

vây co nhiêu tinh chât giông nh đa mô ta ư ở λgt18 va λgt19. Nh ng thay đôi đăc biêt soữ v i ớ λgt18 va λgt19 nh sau:ư

- Vi tri tông h p ợ chi đ c đ a vao vector cho phep lo i b s chon loc đoan chènượ ư ạ ỏ ự cDNA ch a cac vi tri ứ chi.

- Cac vi tri SacI va XbaI đ c loai bo khoi cac nhanh cua vector sao cho vi tri ượ XbaI trong vung tao dong la duy nhât, cac thao tac nay làm khuyêt môt đoan khoang 500 bpở

trong DNA c a bacteriophage ủ λ phia bên phai gen ở lac5. Đăc điêm nay cho phep nhân cac đoan chèn DNA l n h n (t i 8,2 kb) so v i các vector ớ ơ ớ ớ λgt18 va λgt19.

2.3. Vector λgt22 và λgt23

Cac vector nay cung băt nguôn t ừ λgt18 va λgt19, mang trình t tông h p ự ợ chi va các v trí tao dong trong môt khung khac gân đâu 3’ cua vung ma hoa gen ị lacZ. Các vector λgt22 va λgt23 giông hêt nhau ngoai tr h ng cua các v trí tao dong. Cac vi tri ừ ướ ị XbaI va SacI cac nhanh cua ở λgt18 va λgt19 bi loai bo, nh vây cac vector này chi ư mang năm vi tri căt han ch duy nhât đ tao dong là: ế ể NotI, XbaI, SacI, SalI va EcoRI. Cac đoan cDNA găn vao môt trong năm vi tri co thê đ c biêu hiên nh la môt protein ượ ư dung h p LacZ. Các vector ợ λgt22 va λgt23 đ c thiêt kê đê cho phep tao dong đinhượ h ng cDNA vao trong cac vi tri ướ SalI va NotI. Tông h p s i th nhât va th hai cua ợ ợ ứ ứ cDNA băng ph ng pháp primer-linker cho phep cDNA s i đôi đ c căt băng ươ ợ ượ SalI va NotI va găn tr c tiêp trong cac nhanh cua vector theo h ng liên quan v i promoter ự ướ ớ lacZ. Môt trong ba thê tai tô h p se mang phân t cDNA trong khung đoc chinh xac đê ợ ử san xuât protein dung h p. ợ

2.4. Vector λZAP

Vector λZAP mang vung tao dong cung h ng v i promoter ướ ớ lacZ cua E. coli. Đoan cDNA dai 10 kb co thê đ c găn vao trong các vi tri nay va biêu hiên hoăc trong vi ượ khuân đ c xâm nhiêm hoăc trong cac thê tiêm tan đ c cam ng, nh mô ta ượ ượ ứ ư ở λgt11. H n n a, cac protein dung h p ơ ữ ợ λZAP co thê đ c biêu hiên t cac plasmid co sô l ng ượ ừ ượ ban sao l n. Vector ớ λZAP co môt sô đăc điêm nh sau: ư

- Co sáu vi tri RE trong vung tao dong đ c s dung đê tao dong đinh h ng cac ượ ử ướ phân t cDNA, trong đo co m t vi tri căt ử ộ EcoRI t ng t nh ươ ự ư λgt11.

- Co cac promoter c a bacteriophage T3 va T7 năm bên canh vung tao dong. ủ

- Co cac trinh t co nguôn gôc t bacteriophage f1 đê chuyên đôi ự ừ in vivo đoan chèn DNA t bacteriophage ừ λ vector t i Bluescript plasmid, cac trinh t cua no đ c ch aớ ự ượ ứ trong λZAP. Qua trinh căt bo đ c th c hi n d dàng nh s bô tri cac trinh t cua ượ ự ệ ễ ờ ự ự bacteriophage f1 (kh i đâu tông h p DNA s i đ n) vê môt phia cua Bluescript plasmidở ợ ợ ơ DNA mang vung tao dong va s bô tri cac trinh t bacteriophage f1 (kêt thuc tông h p ự ự ợ DNA s i đ n) vê môt phia khac cua plasmid DNA.ợ ơ

Vector λZAP la dang đâu tiên cua vector thê hê m i đ c thiêt kê nh m cung câp ớ ượ ằ môt trinh t cac vi tri tiêm năng đê tao dong va biêu hiên cDNA, m t ph ng phap tiên ự ộ ươ l i và đ n gian đê thu hôi va th c hi n các thao tac tiêp theo cua cDNA. Do tinh linhợ ơ ự ệ hoat cua chung, cac vector nay thay thê cho λgt10 va λgt11 va đ c xem la vector thich ượ h p đê xây d ng cac th viên cDNA. Vector ợ ự ư λZAPII cung t ng đông v i ươ ớ λZAP.

VI. Nhân dang cac dong cDNA quan tâm

1. Cac ph ng phap sang loc ươ

Co ba ph ng phap sang loc th viên cDNA cho cac dong quan tâm: ươ ư

- Lai nucleic acid.

- Phat hiên cac khang nguyên miên dich đăc hiêu.

- Chon loc sib cac dong cDNA.

D i đây chi trinh bay hai ph ng phap phô biên đó là lai nucleic acid và phátướ ươ hi n các kháng nguyên mi n d ch đ c hi u.ệ ễ ị ặ ệ

1.1. Lai nucleic acid

Đây la ph ng phap đ c s dung phô biên va đang tin cây nhât khi sang loc cac ươ ượ ử th viên cDNA đê tim ki m cac dong quan tâm. Sang loc băng ph ng phap lai nucleicư ế ươ acid cho phep phân tich đông th i nhiêu dong va nhanh, không đoi hoi cac dong cDNA ờ phai hoàn chinh va san phâm đ c tông h p trong tê bao vât chu phai co hoat tinh sinh ượ ợ hoc hoăc khang nguyên. H n n a, c s ly thuyêt cua ky thuât lai nucleic acid đã đ c ơ ữ ơ ở ượ hiêu biêt đây đu. Điêu nay cho phep phat triên môt sô l ng l n cac ky thuât khac nhau ượ ớ co thê điêu chinh cac m u dò c a nucleic acid co cac chiêu dai va đăc điêm khac nhau. ẫ ủ

- Cac m u dò t ng đông. ẫ ươ Cac m u dò t ng đông ch a it nhât môt phân cua ẫ ươ ứ chuôi nucleic acid chinh xac cua dong cDNA mong muôn. Chung đ c dung trong nhiêu ượ tr ng h p khac nhau, vi du: khi môt dong bô phân cua cDNA hiên co đ c s dung đêườ ợ ượ ử phân lâp môt dong hoàn chinh t th viên cDNA. Thông th ng, đoan băt nguôn t môt ừ ư ườ ừ đâu hoăc đâu khac cua dong hiên co đ c phân lâp, đanh dâu phong xa ượ in vitro va dung

đê thăm do th viên. Lai v i cac m u dò t ng đông th ng đ c tiên hanh d i cac ư ớ ẫ ươ ườ ượ ướ điêu kiên nghiêm ngăt (stringency).

- Cac m u dò t ng đông t ng phân. ẫ ươ ừ Cac m u dò t ng đông t ng phân đ c ẫ ươ ừ ượ dung đê phat hiên cac dong cDNA co quan hê ho hang, nh ng không giông hêt nhau ư hoàn toan, v i cac trình t c a m u dò. Nêu cac m u dò khang thê lân nucleic acid ớ ự ủ ẫ ẫ không co săn, thi co thê thay đôi băng môt vai ph ng pháp. Vi du: Nêu dung gen đa ươ đ c tao dong t cac loai khac hoăc nêu gen liên quan đa đ c tao dong t cung loai,ượ ừ ượ ừ thi cân tiên hanh môt loat cac thi nghiêm kiêm tra xem co s bao toan đây đu cua trinh t ự ự nucleic acid hay không đê cho phep sang loc th viên cDNA băng cach lai. Điêu nay ư đ c th c hiên dê dang nhât băng cach tô ch c môt loat cac phan ng lai Southern vaượ ự ứ ứ Northern cac m c đô nghiêm ngăt khac nhau. Dung môt l ng tôi thiêu (5-10 ở ứ ượ µg) cua genomic DNA đa đ c căt băng RE đê chay điên di trên agarose gel 0,8%, cac phân ượ đoan sau đo đ c chuyên vao mang lai nitrocellulose. Mang đ c căt thanh t ng manh ượ ượ ừ nho, môi manh đ c lai d i cac điêu kiên khac nhau v i cac l ng mâu do co hoat ượ ướ ớ ượ tinh phong xa giông nhau. Môt lo t cac phan ng lai t ng t co thê tiên hanh v i cac ạ ứ ươ ự ớ mRNA đ c tiêu phân hoa băng điên di va chuyên lên gia thê răn. M c đích c a c haiượ ụ ủ ả tr ng h p la thiêt lâp cac điêu kiên cho phep cac gen đ c tao dong tr c đo đ c sườ ợ ượ ướ ượ ử dung nh la m u dò cho cDNA quan tâm. ư ẫ

- Cac oligonucleotide m u dò nhân tao. ẫ Cac oligonucleotide m u dò nhân tao la ẫ cac đo n nucleotide cua trinh t xac đinh đ c tông h p ạ ự ượ ợ in vitro. Trinh t cua cac m u ự ẫ dò nay đ c suy luân, băng cach dung ma di truyên, t cac vung ngăn cua chuôi amino ượ ừ acid đa biêt cua protein quan tâm. Do s thoai bi n (degeneracy) cua ma di truyên, chuôi ự ế amino acid đê xuât có th không đ c đăc tr ng chính xác b i các oligonucleotide đ n ể ượ ư ở ơ đ c d đoan cho trinh t . Măc du, trong rât nhiêu tr ng h p, trinh t cac amino acidượ ự ự ườ ợ ự giông nhau co thê đ c đăc tr ng b i nhiêu oligonucleotide khac nhau. Không co cách ượ ư ở nao đê biêt chăc chăn cac oligonucleotide nay trên th c tê có đ c dung trong gen quan ự ượ tâm hay không. Ba giai phap đ c đ a ra cho vân đê nay là nh sau: ượ ư ư

+ Môt ho oligonucleotide co thê đ c tông h p ch a tât ca cac trinh t co kha ượ ợ ứ ự năng ma hoa cho môt trinh t đa cho cua chuôi amino acid. Sô l ng cac thanh viên ự ượ trong ho nay tuy thuôc vao m c đô thoai bi n cua ma bô ba cho cac amino acid đăc biêt. ứ ế Tuy nhiên, do tât ca cac trinh t oligonucleotide co kha năng đ c hiên diên, nên it nhât ự ượ môt trong sô cac thanh viên se t ng h p v i dong cDNA quan tâm. Duy tri kich th c ươ ợ ớ ướ cua môi ho trong ty lê dê s dung, cac oligonucleotide ngăn (14-17 base) th ng đ c ử ườ ượ s dung, m t kich th c tôi thiêu đ c tiên hanh cho phan ng lai. ử ộ ướ ượ ứ

+ Oligonucleotide dai h n (40-60 base) cua trinh t duy nhât co thê đ c tông h p ơ ự ượ ợ băng cach dung cac ma bô ba đ c s dung phô biên nhât cho môi amino acid (tranh ượ ử dung dinucleotide CpG, vi no đ c hiên diên lai trong hâu hêt cac cDNA cua eukaryote). ượ Tât nhiên, oligonucleotide nay se không t ng h p môt cach chinh xac v i trinh t trong ươ ợ ớ ự

cDNA, nh ng no se cô đinh đu tôt đê phat hiên băng cach lai d i cac điêu kiên khôngư ướ nghiêm ng t (non-stringency).ặ

+ Môt oligonucleotide co thê đ c tông h p ch a môt base nh la inosine cac vi ượ ợ ứ ư ở tri thoai bi n tiêm tàng. Inosine co thê băt căp v i tât ca b n loai base truyên thông ma ế ớ ố không lam tôn th ng nghiêm trong kha năng ôn đinh cua cac thê lai co kêt qua. Vi thê, ươ no co kha năng s n sinh ra cac ho oligonucleotide dai h n đ c lam giam sô l ng va ả ơ ượ ượ còn lai v i gân nh tât ca cac dong cDNA co thê ma hoa cho protein quan tâm.ớ ư

Cuôi cung, nêu trinh t protein co s n t đâu tân cung amino cua protein, thi th ự ẵ ừ ư viên cDNA đ c sang loc phai co chât l ng cao đê chăc chăn răng hâu hêt đâu tân cung ượ ượ 5’ cua mRNA đ c đai diên. ượ

1.2. Phat hiên miên dich cac khang nguyên đăc hiêu

Cac th viên cDNA đ c xây d ng trong cac vector biêu hiên nh ư ượ ự ư λgt11, λgt18-23, λZAP... co thê đ c sang loc băng khang thê theo h ng chông lai protein quan tâm. ượ ướ Cac mang loc nitrocellulose in cac vêt tan cua vi khuân đ c ngâm trong dung dich ch a ượ ứ khang thê. Sau khi r a, mang loc đ c u v i protein A cua ử ượ ớ Staphylococcus aureus hoăc băng khang thê th hai theo h ng chông lai cac y u t quy t đ nh kháng nguyên đăc ứ ướ ế ố ế ị hiêu loai cua khang thê th nh t. cac mô ta đâu tiên cua ph ng phap nay, phôi t ứ ấ Ơ ươ ử (ligand) th hai đ c đanh dâu đông vi phong xa v i ứ ượ ớ 125I. Ngay nay, phôi t th hai ử ứ đ c liên kêt hoa tri v i enzyme ma hoat tinh cua enzyme co thê đ c phat hiên b ngượ ớ ượ ằ hoa tô ch c hoc (vi du: alkaline phosphatase). ứ

Chia khóa thanh công cua ph ng phap nay năm trong chât l ng cua khang thê. ươ ượ Điêu cân thiêt la khang thê nhân diên đ c protein bi biên tinh (Vi du: no phai cho cac ượ tin hiêu manh trong phân tich Western blot-xem ch ng 7). H n n a, qua trinh sang loc ươ ơ ữ đ c tiên hanh dê dang h n va mân cam h n nêu khang thê đ c băt nguôn t huyêtượ ơ ơ ượ ừ thanh đa dong (polyclonal antiserum) đô chuân cao. B i vi cac huyêt thanh nh thê phan ở ư

ng binh th ng v i nhiêu y u t quy t đ nh kháng nguyên khac nhau, c hôi đê phatứ ườ ớ ế ố ế ị ơ hiên dong cDNA biêu hiên đoan protein quan tâm đ c tăng lên. Cac huyêt thanh đa ượ dong th ng ch a cac khang thê phan ng cheo nhân diên cac thanh phân không tai tô ườ ứ ứ h p cua vi khuân tiêm tan và chúng phai đ c loai bo tr c khi quá trình sang loc đ cợ ượ ướ ượ th c hiên.ự

Phan ng liên kêt không đăc hiêu se thâp h n nhiêu khi s dung khang thê đ n ứ ơ ử ơ dong lam m u dò. Tuy nhiên, sô l ng cac thê tai tô h p co thê đ c phat hiên cung bi ẫ ượ ợ ượ giam b i vi môi khang thê đ n dong riêng biêt co thê phan ng v i chi môt y u t ở ơ ứ ớ ế ố quy t đ nh kháng nguyên đ n. Vi thê, m u dò miên dich ly t ng co thê ch a môt hônế ị ơ ẫ ưở ứ h p cua nhiêu khang thê đ n dong khac nhau, ma môi khang thê phan ng manh v iợ ơ ứ ớ protein bi biên tinh.

2. Cac ph ng phap xac nhân cac dong cDNA ươ

Cac th viên cDNA th ng đ c dan trai mât đô cao đê sang loc v i khang thê ư ườ ượ ở ớ hoăc cac m u dò c a nucleic acid, va môi dong phan ng d ng tinh trong vong đâu ẫ ủ ứ ươ tiên đoi hoi môt sô chu ky dan trai va sang loc bô sung tr c khi chung đ c xem nh ướ ượ ư thuân khiêt. Tuy nhiên, kha năng phan ng thich h p v i m u dò đăc biêt la không đây ứ ợ ớ ẫ đu đê ch ng minh dong cDNA thu đ c băt nguôn t mRNA quan tâm. S ch ng minh ứ ượ ừ ự ứ chi tuyêt đôi khi cho thây dong cDNA ch a môt khung đoc m ma hoa cho trinh t ứ ở ự amino acid hoàn toan cua protein. Môt sô vân đê sau c n đ c l u ý đ đ m b o m c ầ ượ ư ể ả ả ứ đô chinh xac c a các dòng cDNA thu đ c: ủ ượ

- Biêu hiên cua protein t cDNA hoàn chinh trong cac tê bao prokaryote hoăc ừ eukaryote thê hiên cac hoat tinh sinh hoc hoăc enzyme chinh xac.

- S t ng ng gi a cac phân cua chuôi nucleotide cua cDNA va cac chuôi aminoự ươ ứ ữ acid cua cac peptide co nguôn gôc t protein đ c tinh sach. ừ ượ

- S t ng ng gi a cac ban đô peptide cua chu i polypeptide đ c tông h p ự ươ ứ ữ ỗ ượ ợ in vitro băng s phiên ma cua dong cDNA va cac ban đô peptide cua protein đich th c. ự ự

- S kêt tua miên dich cua polypeptide đ c tông h p ự ượ ợ in vitro hoăc in vivo t sừ ự phiên ma dong cDNA băng cac khang thê đ c tăng kh năng chông l i protein quan ượ ả ạ tâm. S chăt che cua th nghiêm nay tăng lên khi no đ c tiên hanh b i môt chuôi cacự ử ượ ở khang thê đ n dong xac nhân cac y u t quy t đ nh kháng nguyên khac nhau trên phân ơ ế ố ế ị t protein.ử

- Kêt tua miên dich protein đich th c v i cac khang thê tăng kh năng ch ng l i ự ớ ả ố ạ cac peptide tông h p ma cac trình t cua chung đ c xac đinh b i trinh t nucleic acid ợ ự ượ ở ự cua cDNA đ c tao dong. ượ

VII. Xây d ng th viên cDNA trong bacteriophage ự ư λ vector

S dung th viên cDNA co hai u điêm sau: ử ư ư

- Cac dong cDNA ch a trinh t ma hóa liên tuc cua môt gen. Nhiêu gen ứ ự ở eukaryote la gian đoan, co ch a nhiêu đoan intron. Sau khi căt tiên thân mRNA (pre- ứ mRNA) va nôi lai, cac đoan intron đa bi loai va mRNA hoàn thiên (mature mRNA) co trinh t ma hóa liên tuc đ c tao thanh. Do cDNA đ c phiên mã ng c t khuôn mâu ự ượ ượ ượ ừ mRNA hoàn thiên nên cac dong cDNA co thê tông h p protein cân thiêt v i sô l ng ợ ớ ượ l n nh mong muôn.ớ ư

- Nhiêu protein đ c tông h p v i sô l ng l n b i nh ng tê bao chuyên hóa va ượ ợ ớ ượ ớ ở ữ nh vây trong cac tê bao nay mRNA cua protein đo se co ty lê cao va th viên cDNAư ư đ c tao ra t cac tê bao nay se co nhiêu cDNA ma hóa cho cac protein t ng ng. Sượ ừ ươ ứ ự

dôi dao cDNA c a môt vai loai mRNA nao đo lam giam nhe đang kê viêc xac đinh đung ủ dong mong muôn t th viên gen. ừ ư

Ph ng phap tông h p gen t mRNA ngay cang đ c phat triên, no kêt h p v iươ ợ ừ ượ ợ ớ cac ph ng phap khac cua sinh hoc phân t cho phep ng dung trong nhiêu linh v c. ươ ử ứ ự

Các b c chính c a quá trình xây d ng th vi n cDNA nh sau:ướ ủ ự ư ệ ư

1. Chon loc kich th c cua cDNA ướ

cDNA sau khi căt han chê đ c phân đoan băng săc ky côt Sepharose đê loai b ượ ỏ nh ng linker th a va cac phân t cDNA co kich th c nho h n 500 bp. Côt săc kyữ ừ ử ướ ơ th ng co kich th c 27ườ ướ × 0,3 cm thich h p cho viêc phân đoan cac cDNA. ợ

2. Găn cac cDNA v i cac nhanh cua bacteriophage ớ λ

Thông th ng cân phai tiên hanh th môt loat cac phan ng găn va phan ng đongườ ử ứ ứ goi. Trong cac phan ng nay, môt l ng không đôi cua cac nhanh bacteriophage ứ ượ λ đ c gănượ v i cac l ng khac nhau cua cDNA, muc đich la đê xac đinh l ng cDNA tao ra it nhât laớ ượ ượ 5× 106 bacteriophage tai tô h p. ợ

Phan ng găn cân đ c thiêt kê sao cho tôi thiêu m t bacteriophage tai tô h p đ n ứ ượ ộ ợ ơ se ch a nhiêu h n m t phân t cDNA băng cach dung ty lê cua cac nhanh đ c ứ ơ ộ ử ượ phosphoryl hóa va cDNA đê chi 5% bacteriophage đ c tai tô h p. Nêu s dung cac ượ ợ ử nhanh dephosphoryl hóa, thi cac bacteriophage không tai tô h p bi c chê hiêu qua, va vi ợ ứ thê không thê xac đinh l ng cDNA cân thiêt đê tao ra môt quân thê bacteriophage ch a ượ ứ 5% thê tai tô h p. ợ

Viêc s dung cac nhanh dephosphoryl hóa hoăc cac nhanh co đâu tân cung không ử t ng thich, tao ra băng cach lâp đây t ng phân, đ c khuy n cáo s d ng khi xâyươ ừ ượ ế ử ụ d ng th viên cDNA trong cac bacteriophage nh ự ư ư λgt11, λgt18-23 va λZAP, la nh ng ữ vector không co hê thông cho phep chon loc d a theo cac bacteriophage bô me. Sô ự l ng cac thê không tai tô h p co thê đ c giam xuông khoang 100 lân băng cach dungượ ợ ượ cac nhanh dephosphoryl hóa. Trong hê thông nay, cac bacteriophage không tai tô h p tao ợ thanh cac plaque mau xanh trên cac chung E. coli thich h p khi co măt cua IPTG va X- ợ gal, trong khi đo cac plaque tai tô h p la không mau. ợ

3. Phân tich cac đoan chèn cDNA

Thu thâp khoang m i hai plaque c a bacteriophage tai tô h p va chuân bi DNA ườ ủ ợ đê căt băng RE thich h p. Phân tich kich th c cua cac đo n chèn cDNA băng điên di ợ ướ ạ trên agarose gel 1%, dung DNA marker co cac đoan t 500 bp t i 5 kb. Nêu cac ừ ớ

bacteriophage tai tô h p ch a cac đoan chèn co kich th c khac nhau va nêu kich th c ợ ứ ướ ướ trung binh cua chúng x p x 1 kb hoăc l n h n, thi co thê tiên hanh cac b c tiêp theo ấ ỉ ớ ơ ướ (vi du: tao ra th viên cDNA hoàn chinh). Nêu kich th c trung binh cua cac đoan chèn ư ướ nho h n 1 kb môt cach ro rêt, thi chât l ng cua th viên la không cao. Trong tr ng ơ ượ ư ườ h p nay cân quay lai phân tich chât l ng cua mRNA kh i đâu va cac phan ng tôngợ ượ ở ứ h p cDNA.ợ

4. Tao th viên cDNA hoàn chinh ư

Nêu s dung cac nhanh dephosphoryl hóa đê xây d ng th viên cDNA, thi tinh ử ự ư toan l ng cDNA cho kêt qua tăng gâp 10 lân sô l ng cua cac plaque không tai tô h p. ượ ượ ợ Nêu s dung cac nhanh phosphoryl hóa, thi tinh toan l ng cDNA cho kêt qua quân thê ử ượ bacteriophage ch a xâp x 5% cac thê tai tô h p. Thiêt kê môt phan ng găn quy mô l n,ứ ỉ ợ ứ ớ tăng sô l ng cua tât ca cac thanh phân môt ty lê thich h p. Chăc chăn răng thiêt kê ượ ở ợ phan ng găn đôi ch ng chi ch a cac nhanh cua bacteriophage ứ ứ ứ λ ma không ch a cDNA. ứ Đong goi tât ca cac hôn h p găn băng cach thiêt kê môt chuôi cac phan ng găn, môi ợ ứ phan ng ch a 0,5 ứ ứ µg cac nhanh cua bacteriophage λ. Gôp cac tiêu thê đong goi va xac đinh đô chuân cua bacteriophage gôc trên cac chung vi khuân thich h p. ợ

5. Khuêch đai th viên cDNA ư

- Vector λgt10. Đê thiêt lâp môt s cung câp lâu dai cua th viên, thi no cân phai ự ư đ c khuêch đai băng s sinh tr ng trên chung ượ ự ưở E. coli thich h p (chăng han chung ợ BNN102) trên đia agar. Nêu th viên chi đ c sang loc m t lân, b c khuêch đai nay co ư ượ ộ ướ thê bo qua va cac bacteriophage co thê đ c dan mong tr c tiêp trên chung BNN102 ượ ự ở môt mât đô tôi u đê tiên hanh sang loc. ư

- Vector λgt11 va cac dân xuât cua no va λZAP, λZAPII. Cac th viên cDNA ư đ c xây d ng trong cac vector biêu hiên ượ ự λgt11, λgt18, λgt20 va λgt22 phai đ c ượ khuêch đai trên chung E. coli Y1090hsdR (hoăc nêu la vector λZAP thi trên chung BB4, vector λZAPII thi trên chung XL1-Blue). Cac chung nay la không hoàn hao cho s căt ự han chê kiêm soat vât chu nh ng lai mang môt hê thông methyl hóa hoat đông. Cac vi tri ư tiêm tang cho ph n ng căt han chê băng hê thông ả ứ EcoK s đ c methyl hóa trong suôtẽ ượ quá trình khuêch đai sao cho, nêu cân thiêt, cac thê tai tô h p co thê đ c dung đê gây ợ ượ nhiêm chung E. coli kha biên-căt han chê. Trong suôt qua trinh khuêch đai, điêu quan trong la c chê san xuât cac protein đôc tô tiêm tang b i cac bacteriophage tai tô h p. ứ ớ ợ

Tài li u tham kh o/đ c thêmệ ả ọ

1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl

K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.

2. Brown TA. 2001. Gene Cloning-An Introduction. 4th ed. Blackwell Science, Oxford,

UK.

3. Calladine CR and Drew HR. 1997. Understanding DNA: The Molecule and How It

Works. 2nd ed. Academic Press, London, UK.

4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and

Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA.

5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory

Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA.

6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood

Cliffs, New Jersey, USA.

7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed.

Blackwell Science, Oxford, UK.

8. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press

Inc. New Jersey, USA.

9. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin,

Heidelberg, Germany.

1Vong căp toc: hinh dang cua phân t DNA hoăc RNA đ c dung lam môi cho qua trinh tông ử ượ h p s i th hai.ợ ợ ứ2cI repressor: gen c ch có s n ph m protein liên k t v i vùng operator ho c promoter c aứ ế ả ẩ ế ớ ặ ủ gen và kìm hãm phiên mã b ng cách ngăn ch n s liên k t c a RNA polymerase.ằ ặ ự ế ủ

Ch ng 7ươ

Biêu hi n gen tái t h p trong ệ ổ ợEscherichia coli

Vector biêu hiên là vector có th mang cac gen ngo i lai mong muôn cho phép ể ạ th c hi n s phiên ma cua cac ban sao đ c tao dong va s dich ma cac mRNA cuaự ệ ự ượ ự chung trong Escherichia coli. Nh ng vector nh thê đ c dung đê biêu hiên cac gen c aữ ư ượ ủ eukaryote trong E. coli ho c tăng hi u suât cac san phâm c a gen prokaryote. M c dùặ ệ ủ ở ặ E. coli không ph i là m t v t ch lý t ng đ bi u hi n các gen c a eukaryote doả ộ ậ ủ ưở ể ể ệ ủ chúng không có kh năng s a đ i h u d ch mã (post-translation modification) cho cácả ử ổ ậ ị chu i polypeptide c a các protein có c u trúc ph c t p. Tuy nhiên, trong m t s tr ngỗ ủ ấ ứ ạ ộ ố ườ

h p ng i ta v n có th s d ng vi khu n ợ ườ ẫ ể ử ụ ẩ E. coli cho nh ng protein có c u trúc đ nữ ấ ơ gi n h n. Đ i v i nh ng protein có c u trúc ph c t p, v t ch th ng đ c s d ngả ơ ố ớ ữ ấ ứ ạ ậ ủ ườ ượ ử ụ là các c th eukaryote (ví d : n m men ơ ể ụ ấ Saccharomyces cerevisiae, n m m cấ ố Aspergillus niger…) do chúng có th h u d ch mã đ c. ể ậ ị ượ

Đ bi u hi n t t c các gen ngo i lai trong ể ể ệ ấ ả ạ E. coli ph i b t đ u b ng vi c g nả ắ ầ ằ ệ ắ đo n gen ngo i lai vào trong vector bi u hi n (th ng là plasmid). Vector này ph i cóạ ạ ể ệ ườ ả đ các c u trúc c n thi t sau: ủ ấ ầ ế

- Trinh t kh i đ u sao chep ự ở ầ (ori) đê co thê t o ra nhi u b n sao trong t bào v tạ ề ả ế ậ ch . ủ

- Các trình t mã hóa gen ch th ch n l c (selectable marker) đ đ m b o duy trìự ỉ ị ọ ọ ể ả ả vector trong t bào.ế

- M t promoter ki m soát phiên mã (ví d : ộ ể ụ lac, trp ho cặ tac) cho phép s n xu tả ấ m t l ng l n mRNA t các gen đ c t o dòng.ộ ượ ớ ừ ượ ạ

- Các trình t ki m soát d ch mã nh trình t liên k t ribosome đ c b trí thíchự ể ị ư ự ế ượ ố h p và codon kh i đ u AUG.ợ ở ầ

- M t polylinker đ đ a gen ngo i lai vào trong m t h ng chính xác v iộ ể ư ạ ộ ướ ớ promoter.

Ch khi đ c c u trúc đ y đ nh th , các vector bi u hi n mang gen ngo i laiỉ ượ ấ ầ ủ ư ế ể ệ ạ m i đ c bi n n p vào ch ng ớ ượ ế ạ ủ E. coli thích h p.ợ

Ch ng này mô t các ph ng pháp và các plasmid vector đ c s d ng đ s nươ ả ươ ượ ử ụ ể ả

xu t các protein dung h p (fusion protein) và các protein nguyên th (native protein)ấ ợ ể

trong vi khu n. Các protein dung h p có th đ c s n xu t v i m t l ng l n, dẩ ợ ể ượ ả ấ ớ ộ ượ ớ ễ

dàng tinh s ch và có th đ c dùng đ gây ra m t đáp ng mi n d ch. Các proteinạ ể ượ ể ộ ứ ễ ị

nguyên th có th đ c s n xu t trong vi khu n b ng cách g n m t promoter m nh vàể ể ượ ả ấ ẩ ằ ắ ộ ạ

m t trình t liên k t ribosome hi u qu ng c h ng v i gen đ c t o dòng (vùng 5’ộ ự ế ệ ả ượ ướ ớ ượ ạ

không d ch mã). Thông th ng, các protein đ c bi u hi n m c đ cao trong các thị ườ ượ ể ệ ở ứ ộ ể

vùi không hòa tan.

I. S n xu t các protein dung h pả ấ ợ

1. Protein dung h pợ

Protein dung h p (protein lai) đ c mã hóa b i m t gen lai do s dung h p ợ ượ ở ộ ự ợ in

vitro hai đo n gen khác nhau. Vì v y, protein dung h p s mang trình t amino acidạ ậ ợ ẽ ự

c a hai protein khác bi t (Hình 7.1). ủ ệ

Hình 7.1. Protein dung h p. ợ Bao g m gen đ c t o dòng (gen A) và m t gen khác c a viồ ượ ạ ộ ủ

khu n (gen B), do đó protein dung h p có ch a m t ph n protein c a vi khu n. SD: đo nẩ ợ ứ ộ ầ ủ ẩ ạ

Shine-Dalgarno.

S dung h p gen đ c th c hi n b ng cách g n ph n mã hóa c a gen đ c t oự ợ ượ ự ệ ằ ắ ầ ủ ượ ạ

dòng g n đ u cu i 3’ c a gen vi khu n (ví d : gen ở ầ ầ ố ủ ẩ ụ lacZ). Protein dung h p có nh ngợ ữ

u đi m sau:ư ể

- Protein dung h p th ng đ c s n xu t v i hàm l ng l n do s kh i đ uợ ườ ượ ả ấ ớ ượ ớ ự ở ầ

phiên mã và d ch mã đ c đi u khi n b i các trình t tiêu chu n c a ị ượ ề ể ở ự ẩ ủ E. coli.

- Dung h p các trình t ngo i lai v i các gen c a ợ ự ạ ớ ủ E. coli th ng cho k t qu cácườ ế ả

s n ph m n đ nh h n các protein ngo i lai nguyên th .ả ẩ ổ ị ơ ạ ể

- Protein dung h p có kh i l ng phân t l n h n so v i h u h t các protein c aợ ố ượ ử ớ ơ ớ ầ ế ủ

E. coli và vì th d dàng nh n bi t trong đi n di polyacrylamide gel c a protein. Băngế ễ ậ ế ệ ủ

protein dung h p có th đ c c t ra kh i gel, đông khô (lyophilize) sau đó nghi nợ ể ượ ắ ỏ ề

thành b t và dùng nh m t kháng nguyên.ộ ư ộ

- Protein dung h p co thê đ c tiêt ra môi tr ng nh biêu hiên cua vi khuân nêuợ ượ ườ ờ

gen eukaryote đ c g n v i trình t ma hoa cho peptide tin hiêu (signal peptide), khi đóượ ắ ớ ự

peptide s nay tao ra s chuyên dich protein qua mang. Tuy nhiên, hiên t ng nay chiẽ ự ượ xay ra môt vai tr ng h p. ở ườ ợ

2. Các h th ng vector bi u hi n các gen dung h p v i gen lacZệ ố ể ệ ợ ớ

M t s h th ng vector đ c phát tri n đ bi u hi n các gen dung h p v i genộ ố ệ ố ượ ể ể ể ệ ợ ớ

lacZ. Ch ng h n, các vector h pUR có các v trí t o dòng ẳ ạ ọ ị ạ BamHI, SalI, PstI, XbaI,

HindIII và ClaI đ u 3’ c a gen ở ầ ủ lacZ (Hình 7.2). B ng cách ch n l a các vector và vằ ọ ự ị trí c t h n ch thích h p ng i ta có th ti n hành dung h p cho h u h t gen đ cắ ạ ế ợ ườ ể ế ợ ầ ế ượ

t o dòng. Trong m t s tr ng h p, s dung h p có th th c hi n b ng cách lo i bạ ộ ố ườ ợ ự ợ ể ự ệ ằ ạ ỏ

đ u t n cùng l i ho c làm đ y đ u t n cùng b khuy t tr c khi g n.ầ ậ ồ ặ ầ ầ ậ ị ế ướ ắ

M t h th ng vector t ng t khác cũng đ c phát tri n đ s n xu t các proteinộ ệ ố ươ ự ượ ể ể ả ấ

dung h p, đó là các vector bi u hi n pEX1-3. Promoter Pợ ể ệ R đ c đi u hòa và c m ngượ ề ả ứ

trong cùng m t ki u nh promoter Pộ ể ư L c a bacteriophage ủ λ. Các vector pEX1-3 có các vị trí t o dòng mang các đi m nh n bi t ạ ể ậ ế EcoRI, SmaI, BamHI, SalI và PstI n m đ u 3’ằ ở ầ

c a gen ủ lacZ. Các codon k t thúc d ch mã và các tín hi u k t thúc phiên mã đ c đ tế ị ệ ế ượ ặ

cùng h ng (downstream) v i v trí t o dòng (Hình 7.3).ướ ớ ị ạ

Hình 7.2. Các vector h pUR.ọ Đây là các vector dung h p v i gen ợ ớ lacZ, có các v trí t o dòngị ạ

BamHI, SalI, PstI, XbaI, HindIII và ClaI đ u 3’ c a gen ở ầ ủ lacZ. Chèn đo n DNA ngo i laiạ ạ

(cDNA) vào trong các v trí t o dòng thích h p cho phép s n xu t protein dung h p c a ị ạ ợ ả ấ ợ ủ β-

galactosidase ho t đ ng v i chu i peptide đ c mã hóa b i DNA ngo i lai. Các vectorạ ộ ớ ỗ ượ ở ạ

pUR278, pUR288 và pUR289 ch ch a m t v trí ỉ ứ ộ ị PstI trong gen Ampr. Các vector pUR290,

pUR291 và pUR292 ch a m t v trí ứ ộ ị PstI trong vùng t o dòng do v trí ạ ị PstI trong gen Ampr đã bị

lo i b . S d ng các plasmid vector này r t ti n l i khi đo n DNA ngo i lai quan tâm đ cạ ỏ ử ụ ấ ệ ợ ạ ạ ượ

t o dòng trong v trí ạ ị PstI b ng ph ng pháp đuôi GC.ằ ươ

Hình 7.3. Vector pEX2. Plasmid vector này dài kho ng 5,8 kb đ c thi t k đ bi u hi nả ượ ế ế ể ể ệ

đo n DNA ngo i lai (cDNA) đ c dung h p đ u 3’ c a gen ạ ạ ượ ợ ở ầ ủ lacZ. Ph n t n cùng amino c aầ ậ ủ

gen lacZ đ c thay th b ng m t s trình t c a gen ượ ế ằ ộ ố ự ủ cro c a bacteriophage ủ λ và gen lacI c aủ

E. coli. Promoter PR c a bacteriophage ủ λ (dùng đ bi u hi n protein dung h p) đ c đi u hòaể ể ệ ợ ượ ề

b i gen c ch ở ứ ế cIts857 c a bacteriophage ủ λ. Vùng t o dòng hi n di n đ u 3’ c a gen ạ ệ ệ ở ầ ủ lacZ,

ti p theo là các codon k t thúc d ch mã (Stop) và tín hi u k t thúc phiên mã (Term) c aế ế ị ệ ế ủ

bacteriophage fd.

3. Xây d ng plasmid bi u hi n và phát hi n các protein dung h pự ể ệ ệ ợ

G n plasmid vector (pUR ho c pEX) thích h p v i đo n DNA ngo i lai đ t oắ ặ ợ ớ ạ ạ ể ạ ra m t s dung h p trong khung đ c. Bi n n p các vector này vào ộ ự ợ ọ ế ạ E. coli (ch ng K12ủ 71/18 ho c JM 103 cho các vector pUR, ch ng M5219 cho các vector pEX). Ki m traặ ủ ể các khu n l c đ n mang đo n DNA ngo i lai mong mu n b ng cách tách chi t DNAẩ ạ ơ ạ ạ ố ằ ế

(DNA miniprep) c a plasmid vector, sau đó c t b ng enzyme h n ch thích h p vàủ ắ ằ ạ ế ợ đi n di ki m tra trên agarose gel. Sàng l c các khu n l c s n xu t protein dung h p.ệ ể ọ ẩ ạ ả ấ ợ

Ph ng pháp sàng l c khu n l c đ phát hi n protein dung h p đ c ti n hànhươ ọ ẩ ạ ể ệ ợ ượ ế nh sau: Nuôi c y qua đêm 37ư ấ ở oC (m t l ng nh ) t 5-10 khu n l c trong môiộ ượ ỏ ừ ẩ ạ tr ng LB có ch a ampicillin. Sau đó, c m ng nuôi c y b ng cách b sung thêmườ ứ ả ứ ấ ằ ổ isopropylthio-β-galactoside (IPTG) cho vector pUR và ti p t c nuôi 37ế ụ ở oC, đ i v iố ớ vector pEX thì chuy n nuôi c y 37ể ấ oC lên nhi t đ 40ệ ộ oC và ti p t c nuôi c y (có s cế ụ ấ ụ khí). Sau các kho ng th i gian nuôi c y khác nhau (1, 2, 3 và 4 gi …), l y 1 mL d chả ờ ấ ờ ấ ị nuôi c y ly tâm nhanh đ thu ti u th , tái huy n phù chúng trong đ m 1ấ ể ể ể ề ệ × SDS, bi nế tính 100ở oC trong 3 phút, ly tâm 12.000 g trong 1 phút nhi t đ phòng. Ti n hànhở ệ ộ ế đi n di SDS trên polyacrylamide gel 6%. Dùng d ch huy n phù t bào ch mang m tệ ị ề ế ỉ ộ mình vector làm đ i ch ng. Protein dung h p s xu t hi n nh là m t băng m i d chố ứ ợ ẽ ấ ệ ư ộ ớ ị chuy n ch m h n băng β-galactosidase trong đ i ch ng.ể ậ ơ ố ứ

4. Tách chi t các protein dung h p đ s n xu t kháng th ế ợ ể ả ấ ể

Protein dung h p có th đ c tách chi t theo m t s cách: dùng d ch chi t urea, s c ký ái l c aminophenylthiogalactoside,ợ ể ượ ế ộ ố ị ế ắ ự

đi n di SDS-polyacrylamide gel ho c ph i h p gi a các cách này. Ph ng pháp đ n gi n nh t là đi n di SDS-PAGE (sodiumệ ặ ố ợ ữ ươ ơ ả ấ ệ

dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), nh trình trình bày m c 3 (nuôi c y m t l ng l n trong 200 mL). Nhu m gelư ở ụ ấ ộ ượ ớ ộ

và phát hi n băng protein m i, sau đó c t băng này ra kh i gel, đông khô kho ng 2 ngày r i nghi n thành b t m n. B t này s đ cệ ớ ắ ỏ ả ồ ề ộ ị ộ ẽ ượ

dùng tiêm vào th đ s n xu t kháng th .ỏ ể ả ấ ể

II. S n xu t các protein nguyên thả ấ ể

Các protein nguyên th có th đ c s n xu t trong ể ể ượ ả ấ E. coli b ng cách s d ngằ ử ụ promoter đi u hòa m nh và m t trình t liên k t ribosome hi u qu . Đ bi u hi n genề ạ ộ ự ế ệ ả ể ể ệ prokaryote có trình t liên k t ribosome m nh ch c n cung c p m t promoter là đ .ự ế ạ ỉ ầ ấ ộ ủ Trong khi đó, đ bi u hi n m t gen eukaryote (ho c m t gen prokaryote v i m t trìnhể ể ệ ộ ặ ộ ớ ộ t liên k t ribosome y u) c n ph i cung c p c promoter l n trình t liên k t ribosomeự ế ế ầ ả ấ ả ẫ ự ế (Hình 7.4). Các m c đ bi u hi n có th khác nhau t d i 1% cho t i h n 30%ứ ộ ể ệ ể ừ ướ ớ ơ protein hòa tan t ng s (total soluble protein) c a t bào.ổ ố ủ ế

Hình 7.4. Protein nguyên th . ể Gen t o dòng (gen A) đ c đ t sau promoter và trình t SDạ ượ ặ ự c a vi khu n. mRNA ch mã hóa các amino acid đ c hi u c a đo n chèn đ t o ra lo i proteinủ ẩ ỉ ặ ệ ủ ạ ể ạ ạ

nguyên th . ể

Bi u hi n c a các gen prokaryote: Promoterể ệ ủ ơ

B c đ u tiên khi bi u hi n các protein c a eukaryote trong vi khu n là ch nướ ầ ể ệ ủ ẩ ọ m t vector bi u hi n mang promoter m nh (strong promoter) c a prokaryote. Promoterộ ể ệ ạ ủ la trình t DNA h ng dân RNA polymerase liên kêt v i DNA va kh i đâu s tông h p ự ướ ớ ở ự ợ RNA. Cac promoter khac nhau co hiêu suât khac nhau, nói chung, promoter manh giup cac mRNA đ c kh i đâu tân sô cao. Cac promoter khac nhau đ u mang hai đoan bao ượ ở ở ề toan cao, môt đ c xac đinh khoang 10 bp va môt khoang 35 bp n m vùng ng c ượ ằ ở ượ h ng (upstream) v i điêm kh i đâu cua s phiên ma (còn g i là vùng 5’ không d chướ ớ ở ự ọ ị mã-5’ untranslation region). Hai đoan nay đ c đánh giá rât quan trong trong viêc xac ượ đinh c ng đô c a promoter. ườ ủ

Cac promoter thích h p nhât cho biêu hiên cua gen ngoai lai ợ ở E. coli la nh ng ữ promoter ma ca hai c ng đô va kha năng điêu hòa thê hiên manh. Nêu san phâm cua ườ gen đ c tao dong la đôc (toxin) đôi v i cac tê bao ượ ớ E. coli thi sau đo s nhân đôi gen se ự lam cho c ng đô promoter yêu va promoter không điêu hòa đ c. S phiên ma m c ườ ượ ự ở ứ đô cao co thê gây tr ngai cho vi c sao chep DNA c a plasmid va dân đên tinh không ôn ở ệ ủ đinh cua plasmid.

Ph n này gi i thi u các vector bi u hi n mang promoter Pầ ớ ệ ể ệ L c a bacteriophage ủ λ, promoter (lai) trp-lac và promoter bacteriophage T7.

1. Promoter PL cua bacteriophage λ

Promoter PL cua phage λ (Hình 7.5) la m t promoter manh, có kh năng điêu hòa ộ ả tôt và đ c dung trong môt sô vector biêu hiên. nhiêt đô thâp (31 ượ Ơ oC), promoter PL

đ c duy tri trang thai bi c chê b i san phâm c a gen ượ ở ứ ở ủ cI. Sau khi hoat tinh cua gen c chê bi pha h y băng cach tăng nhiêt đô nuôi cây thi promoter Pứ ủ L s xúc ti n phiên mãẽ ế

phân l n mRNA. Môt vai vector s dung promoter P ớ ử L c a ủ λ nh : pPLa 2311, pPLa 8 vàư pKC30.

Hình 7.5. Vector pKC30. pKC30 là plasmid có kích th c x p x 6,4 kb, mang promoter Pướ ấ ỉ L

c a bacteriophage ủ λ và v trí nh n bi t ị ậ ế HpaI n m vùng cùng h ng (có 321 nucleotides)ằ ở ướ

v i v trí kh i đ u phiên mã c a Pớ ị ở ầ ủ L. Plasmid này là d ng phân chia c a vector pBR322 vàạ ủ

ch a đo n ứ ạ HindIII-BamHI có ngu n g c t bacteriophage ồ ố ừ λ đ c chèn vào gi a các v tríượ ữ ị

HindIII và BamHI c a vector. Đo n chèn cDNA mang tín hi u promoter (Pủ ạ ệ L), m t v trí đ cộ ị ượ

nh n bi t b i s n ph m c a gen ậ ế ở ả ẩ ủ N (nutL), b n thân gen ả N, và tín hi u k t thúc phiên mã phệ ế ụ

thu c ộ rho (tL). V trí nh n bi t ị ậ ế HpaI n m v i vùng mã hóa c a gen ằ ớ ủ N. Các trình t DNAự

đ c chèn vào trong v trí ượ ị HpaI có th đ c đi u ch nh b ng cách chuy n plasmid tái t h pể ượ ề ỉ ằ ể ổ ợ

vào th ti m tan c a bacteriophage m n c m v i nhi t đ (ể ề ủ ẫ ả ớ ệ ộ cIts857). Các t bào đ c sinhế ượ

tr ng đ n gi a pha log 30ưở ế ữ ở oC và sau đó thay đ i t i 40ổ ớ oC đ b t ho t s n ph m c a gen ể ấ ạ ả ẩ ủ cI

và m promoter Pở L. Vector này đ c dùng đ bi u hi n protein ượ ể ể ệ cII c a bacteriophage ủ λ v iớ

m t m c đ kho ng 4% protein hòa tan t ng s c a t bào.ộ ứ ộ ả ổ ố ủ ế

2. Promoter trp-lac

S biêu hiên cua cac gen đ c tao dong trong vi khuânự ượ E. coli còn đ c điêu hòaượ băng cac promoter khac. Chăng han promoter tac (m t d ng promoter lai gi a promoterộ ạ ữ trp và promoter lac) đã đ c s d ng thành công đ s n xu t m t l ng l n proteinượ ử ụ ể ả ấ ộ ượ ớ trong E. coli (Hình 7.6).

- Promoter trp đ c điêu hòa b i gen c chê ượ ở ứ trp va co thê đ c cam ng b i s ượ ứ ở ự bô sung 3-IAA (3-indolylacetic acid) vao môi tr ng, hoăc băng cach thiêu tryptophan. ườ

- Promoter lac đ c điêu hòa b i gen c chê ượ ở ứ lac va vi thê co thê đ c cam ng ượ ứ b i s bô sung nhân tô cam ng IPTG cho nuôi cây vi khuân.ở ự ứ

- Cuôi cung promoter lai trp-lac ch a đoan ứ trp-35 g n v i đoan ắ ớ lac-10 va operator lac đ c Boer va cs thi t k năm 1982, promoter lai ượ ế ế trp-lac đ c điêu hòa b i gen cượ ở ứ chê lac (lac repressor).

Hình 7.6. Vector pKK177-3. pKK177-3 là m t ộ tac vector ch a các v trí t o dòng gen ngo i laiứ ị ạ ạ

cùng h ng v i promoter ướ ớ tac. Cùng h ng v i các v trí t o dòng là ướ ớ ị ạ rrnB mang gen 5S c a ủ E.

coli và hai nhân t k t thúc phiên mã Tố ế 1 và T2.

3. Promoter bacteriophage T7

M t h th ng bi u hi n khác đã đ c phát tri n b i Tabor và Richardson (1985),ộ ệ ố ể ệ ượ ể ở Studier và Moffatt (1986) đó là h th ng bacteriophage T7 RNA polymerase/promoterệ ố (Hình 7.7). H th ng này đ c thi t k cho các bi u hi n có ch n l c c a gen đ cệ ố ượ ế ế ể ệ ọ ọ ủ ượ t o dòng. Chúng cho phép m c đ bi u hi n cao c a m t vài gen không đ c bi uạ ứ ộ ể ệ ủ ộ ượ ể hi n hi u qu trong các h th ng khác.ệ ệ ả ệ ố

Hình 7.7. Vector pET-3 mang promoter (PФ10) c a bacteriophage T7 Ф10 và y u t k tủ ế ố ế thúc phiên mã Ф (TФ). Y u t k t thúc phiên mã có th t o ra các th phiên mã có s c đế ố ế ể ạ ể ứ ề kháng m nh h n đ i v i ho t tính exonuclease. Vector pET-3a là d ng phân chia c a vectorạ ơ ố ớ ạ ạ ủ pET-3 trong đó vùng kh i đ u d ch mã (Sở ầ ị 10) c a bacteriophage T7 Ф10 (protein chính c a vủ ủ ỏ bacteriophage T7) có mang v trí ị BamHI codon 11 đ c đã chèn vào. V trí ở ượ ị NdeI (CATATG) đ c đ t vùng kh i đ u d ch mã và có th đ c s d ng đ xây d ng plasmid bi u hi n cácượ ặ ở ở ầ ị ể ượ ử ụ ể ự ể ệ protein nguyên th . ể

Hình 7.8. Vector pAS1. Vector pAS1 là m t plasmid dài kho ng 5,8 kb mang promoter Pộ ả L

c a bacteriohage ủ λ và v trí c t h n ch duy nh t ị ắ ạ ế ấ BamHI đ nh v codon kh i đ u ATGị ị ở ở ầ c a gen ủ cII c a bacteriophage ủ λ. Plasmid này có ngu n g c t pKC30, trong đó gen ồ ố ừ cII c aủ bacteriophage λ đ c chèn vào v trí ượ ở ị HpaI. Gen cII sau đó đ c c t b b i enzymeượ ắ ỏ ở exonuclease cho t i khi ch còn l i codon kh i đ u ATG (G c a ATG là nucleotide đ u tiênớ ỉ ạ ở ầ ủ ầ c a v trí ủ ị BamHI). Đ bi u hi n gen b m t codon kh i đ u, pAS1 đ c c t b ng ể ể ệ ị ấ ở ầ ượ ắ ằ BamHI và sau đó x lý v i enzyme mung-bean nuclease ho c nuclease S1 đ lo i b đ u l i (đ uử ớ ặ ể ạ ỏ ầ ồ ầ t n cùng s i đ n). G n DNA đ u b ng này v i đo n DNA đ u b ng b t đ u v i codonậ ợ ơ ắ ầ ằ ớ ạ ầ ằ ắ ầ ớ th hai c a gen đ c bi u hi n đ t gen đó trong khung v i ATG. Các gen đ c chèn vàoứ ủ ượ ể ệ ặ ớ ượ theo ki u này đ c đi u hòa b ng cách chuy n plasmid tái t h p vào trong th ti m tanể ượ ề ằ ể ổ ợ ể ề m n c m nhi t đ c a bacteriophage ẫ ả ệ ộ ủ λ (cIts857). Các t bào sinh tr ng t i pha log mu nế ưở ớ ộ

30ở oC và sau đó nâng lên 40oC đ b t ho t gen c ch (repressor) và m promoter Pể ấ ạ ứ ế ở L. Gen đ c chèn vào cũng có th đ c đi u hòa b ng ho t đ ng c a protein N ượ ể ượ ề ằ ạ ộ ủ ở nutL và nutR đ ngăn c n k t thúc ể ả ế ở tR.

Hiêu suât dich ma cua mRNA chiu s chi phôi cua môt vai yêu tô: ự

- M c đô bô sung gi a chuôi SD va đâu 3’ cua 16S rRNA.ứ ữ

- Kho ng cách gi a chuôi SD va codon AUG đê chuôi DNA c a eukaryote đ nhả ữ ủ ị v . ị

- Nucleotide theo sau AUG anh h ng s liên kêt ribosome. ưở ự

Đ a codon ATG vào trong gen đ c tao dong va duy tri vi tri liên kêt ribosomeư ượ (RBS) cua vi khuân băng cach dung vector pAS1 (Hình 7.8). Vector pAS1 mang promoter PL và RBS c a gen ủ cII c a bacteriophage ủ λ, codon kh i đ u ATG đ c dungở ầ ượ h p tr c tiêp v i phân ma hoa đ u t n cùng amino cua gen eukaryote mu n biêu hiên.ợ ự ớ ầ ậ ố

Cách làm này co thê h n ch viêc tôi u khoang cach gi a chuôi SD c a vi khuân va ạ ế ư ữ ủ codon kh i đ u ATG cua gen eukaryote đê co đ c s biêu hiên hiêu qua cua gen. Đoanở ầ ượ ự DNA có g n promoter va chuôi SD sau đo đ c bi n n p vào các ch ng ắ ượ ế ạ ủ E. coli thích h p. Sàng l c th bi n n p đ thu các khu n l c có m c đ phiên mã cao.ợ ọ ể ế ạ ể ẩ ạ ứ ộ

III. Xác đ nh m c đ bi u hi n c a gen đ c t o dòngị ứ ộ ể ệ ủ ượ ạ

Nói chung có ba cách th ng đ c dùng đ đánh giá m c đ bi u hi n proteinườ ượ ể ứ ộ ể ệ ngo i lai c a gen đ c t o dòng:ạ ủ ượ ạ

- Đi n di polyacrylamide gel đ xác đ nh protein có kích th c thích h p đ cệ ể ị ướ ợ ượ s n xu t m c đ cao trong các t bào mang vector bi u hi n. Thông th ng, proteinả ấ ở ứ ộ ế ể ệ ườ quan tâm có th quan sát b ng cách nhu m gel v i Coomassie Brilliant Blue ho c b ngể ằ ộ ớ ặ ằ thu c nhu m b c. N u không th y có băng protein m i khi dùng các thu c nhu m này,ố ộ ạ ế ấ ớ ố ộ thì đánh d u s trao đ i ch t v i 100 ấ ự ổ ấ ớ µCi c a [ủ 35S]Met ho c [ặ 35S]Cys trên 1 mL d chị nuôi c y trong 5 phút. Đi n di SDS-polyacrylamide gel và th c hi n phóng x t ghi cóấ ệ ự ệ ạ ự th cho phép phát hi n protein quan tâm.ể ệ

- Phân tích Western blot b ng cách dùng các kháng th liên k t đ c hi u v i protein quan tâm đã đ c th m tích lên màngằ ể ế ặ ệ ớ ượ ẩ

nitrocellulose sau khi th c hi n di n di SDS-PAGE (xem ch ng 2). ự ệ ệ ươ

- N u m c đ bi u hi n th p thì nên đ t gen ế ứ ộ ể ệ ấ ặ lacZ cùng h ng v i gen đ cướ ớ ượ bi u hi n. Nh v y, n u s phiên mã ho c d ch mã h n ch bi u hi n c a gen thìể ệ ư ậ ế ự ặ ị ạ ế ể ệ ủ nh ng thay đ i trong h th ng bi u hi n có th đ c ki m soát b ng nh ng thay đ iữ ổ ệ ố ể ệ ể ượ ể ằ ữ ổ trong ho t tính c a β-galactosidase.ạ ủ

1. Western blot

Ph n ng liên k t kháng nguyên-kháng th có tính đ c hi u r t cao. Vì v y, cóả ứ ế ể ặ ệ ấ ậ th áp d ng ph n ng này đ phát hi n s có m t và tinh s ch protein. Kháng thể ụ ả ứ ể ệ ự ặ ạ ể (antibody) đ c s n xu t khi đ a kháng nguyên vào th và đ c tinh s ch t máu thượ ả ấ ư ỏ ượ ạ ừ ỏ sau khi gây nhi m. Nh ng kháng th t o ra b ng cách này là nh ng kháng th đa dòngễ ữ ể ạ ằ ữ ể (polyclonal antibodies-do các t bào lympho khác nhau ti t ra), do đó chúng có khế ế ả năng nh n bi t m t s kháng nguyên. Ng c l i, kháng th đ n dòng (monoclonalậ ế ộ ố ượ ạ ể ơ antibodies) ch t ng tác v i m t kháng nguyên nh t đ nh.ỉ ươ ớ ộ ấ ị

Hình 7.9. S đ k thu t Western blotơ ồ ỹ ậ

Kháng th đ c đánh d u b ng b ng enzyme (ho c b ng ch t phát huỳnhể ượ ấ ằ ằ ặ ằ ấ quang) đ phát hi n protein đ c hi u (th ng đ c th m tích lên màng nitrocelluloseể ệ ặ ệ ườ ượ ẩ sau khi ch y đi n di SDS-PAGE, và c đ nh đó) thông qua k thu t Western blotạ ệ ố ị ở ỹ ậ (ho c immunoblot) (Hình 7.9). C ch c a ph n ng liên k t kháng nguyên-kháng thặ ơ ế ủ ả ứ ế ể đ c trình bày hình 7.10. Sau khi protein trên màng lai g n v i kháng th th nh tượ ở ắ ớ ể ứ ấ đ c hi u và ti p đ n là kháng th th hai có đánh d u enzyme (alkaline phosphatase,ặ ệ ế ế ể ứ ấ horse-radish peroxidase…) thì ph c h p này s đ c liên k t v i c ch t đ t o màu.ứ ợ ẽ ượ ế ớ ơ ấ ể ạ S hi n di n c a protein ngo i lai (s n ph m d ch mã c a gen ngo i lai đ c chuy nự ệ ệ ủ ạ ả ẩ ị ủ ạ ượ ể vào t bào v t ch ) s đ c phát hi n nh s xu t hi n màu c a ph n ng lai.ế ậ ủ ẽ ượ ệ ờ ự ấ ệ ủ ả ứ

Hình 7.10. S đ mô t liên k t protein (kháng nguyên) v i kháng th th nh t đ c hi uơ ồ ả ế ớ ể ứ ấ ặ ệ

và kháng th th hai có đánh d u enzyme trong Western blotể ứ ấ

S phân b c a protein đ c hi u trong t bào và t ch c mô cũng có th phátự ố ủ ặ ệ ế ổ ứ ể hi n b ng k thu t lai ệ ằ ỹ ậ in situ (in situ hybridization) v i nguyên t c t ng t Westernớ ắ ươ ự blot. Ngoài ra, kháng th đ c s d ng đ tinh s ch protein đ c hi u b ng k t t aể ượ ử ụ ể ạ ặ ệ ằ ế ủ mi n d ch ho c s c ký ái l c (affinity chromatography). Kháng th đánh d u đ cễ ị ặ ắ ự ể ấ ượ dùng đ đ nh l ng kháng nguyên trong k thu t xét nghi m h p th mi n d ch liênể ị ượ ỹ ậ ệ ấ ụ ễ ị k t enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) g i t t là ELISA.ế ọ ắ

2. ELISA

ELISA là m t k thu t hóa sinh, cũng d a trên ph n ng liên k t kháng nguyên-ộ ỹ ậ ự ả ứ ếkháng th , đ c dùng ch y u trong mi n d ch h c đ phát hi n s có m t c a khángể ượ ủ ế ễ ị ọ ể ệ ự ặ ủ th ho c kháng nguyên trong m u. T ng t k thu t Western blot, trong ELISAể ặ ẫ ươ ự ỹ ậ ng i th ng dùng hai lo i kháng th . M t kháng th đ c hi u v i kháng nguyênườ ườ ạ ể ộ ể ặ ệ ớ protein (kháng th th nh t). M t kháng th khác, ph n ng v i các ph c h p khángể ứ ấ ộ ể ả ứ ớ ứ ợ th -kháng nguyên, đ c k t h p v i enzyme (kháng th th hai). Kháng th th haiể ượ ế ợ ớ ể ứ ể ứ nh có liên k t v i enzyme (nh tên c a k thu t xét nghi m) nên có th b t màu v iờ ế ớ ư ủ ỹ ậ ệ ể ắ ớ c ch t đ t o ra tín hi u (Hình 7.11).ơ ấ ể ạ ệ

Hình 7.11. S đ k thu t ELISAơ ồ ỹ ậ

Do ELISA có th th c hi n đ đánh giá s có m t c a kháng nguyên ho c khángể ự ệ ể ự ặ ủ ặ th trong m u b ng ph ng pháp quang ph (đo đ h p th quang), cho nên nó làể ẫ ằ ươ ổ ộ ấ ụ công c h u ích đ xác đ nh n ng đ (đ nh l ng) kháng nguyên và kháng th .ụ ữ ể ị ồ ộ ị ượ ể

IV. Tăng m c đ bi u hi n c a gen đ c t o dòngư ộ ể ệ ủ ượ ạ

Cac m c đô biêu hiên cua gen ngoai lai trong ứ E. coli th ng đ c kiêm tra băngườ ượ th nghiêm ch c năng hoăc băng cac xét nghiêm miên dich khac nhau. Tuy nhiên, nêu côử ứ đat đên m c tôi đa s biêu hiên cua san phâm gen thi cac phân tích nh thê la ph c tap. ứ ự ư ứ Đê khăc phuc kho khăn nay khi san phâm gen eukaryote không dung h p đ c biêu hiên ợ ượ ng i ta đa s dung ph ng phap cho DNA ngoai lai đ c dung h p v i đoan t ngườ ử ươ ượ ợ ớ ươ

ng cua gen ứ lacZ cho phép gen ngo i lai sao chep lai va dich ma môt cach hiêu qua.ạ Plasmid đ c dùng trong ph ng pháp này là pLG mang gen ượ ươ lacZ ma hoa đ u t n cùng ầ ậ carboxyl có ho t tính ạ β-galactosidase. Tuy nhiên, β-galactosidase v n ch a đ c tôngẫ ư ượ h p do còn thi u promoter và trình t SD plasmid. Do đó, m t promoter di đ ngợ ế ự ở ộ ộ (portable promoter) s đ c g n phía tr c gen dung h p va đi u ch nh s bi u hi n ẽ ượ ắ ướ ợ ề ỉ ự ể ệ ở m c đô cao protein dung h p co hoat tinh ứ ợ β-galactosidase. Cac plasmid có cac đoan promoter đ c đăt tôi u co thê nhân biêt băng cach biên nap vi khuân Lacượ ư - va thu đ c ượ hoat tinh β-galactosidase trên cac đia chi thi lactose (lactose indicator). Cac plasmid nay sau đo co thê đ c dung đê tai câu truc gen eukaryote không h p nh t ma no đ c biêu ượ ợ ấ ượ hiên m c đô cao. ở ứ

M c đ bi u hi n th p c a gen đ c t o dòng có th là do RNA không n đ nh,ứ ộ ể ệ ấ ủ ượ ạ ể ổ ị s k t thúc ch a hoàn ch nh, s d ch mã không hi u qu , ho c chính protein không nự ế ư ỉ ự ị ệ ả ặ ổ đ nh.ị

V. Tinh s ch proteinạ

1. Th vùi và pể h ng pháp hòa tan th vùiươ ể

1.1. Th vùiể

Protein có m c đ bi u hi n cao trong ứ ộ ể ệ E. coli th ng t o ra các h t nh khôngườ ạ ạ ỏ hòa tan trong t bào ch t (th vùi), có th quan sát b ng kính hi n ng c pha vàở ế ấ ể ể ằ ể ượ tách kh i d ch tan c a t bào s ng b ng ph ng pháp ly tâm. Các t bào bi u hi nỏ ị ủ ế ố ằ ươ ế ể ệ m c đ cao các protein ngo i lai đ c cô l i b ng ly tâm và phá v b ng các kứ ộ ạ ượ ạ ằ ơ ằ ỹ thu t c h c, siêu âm, ho c dùng lysozyme k t h p v i ch t t y. Các th vùiậ ơ ọ ặ ế ợ ớ ấ ẩ ể (inclusion) đ c t o ti u th b ng ly tâm và r a v i Triston X-100 và EDTA ho cượ ạ ể ể ằ ử ớ ặ urea.

Đ thu đ c ch t hòa tan, protein ho t đ ng, các th vùi đ c r a ph i hòa tanể ượ ấ ạ ộ ể ượ ử ả và sau đó ph i đ c tái cu n xo n. M i protein có th c n m t ph ng pháp hòa tanả ượ ộ ắ ỗ ể ầ ộ ươ khác nhau và th ng đ c xác đ nh theo kinh nghi m. Các đi u ki n khác nhau (víườ ượ ị ệ ề ệ d : guanidine HCl [5-8 M], urea [6-8 M], SDS, alkaline pH, ho cụ ặ acetonitrile/propanol) có th đ c s d ng đ hòa tan các th vùi.ể ượ ử ụ ể ể Trong nhi uề tr ng h p, ch c n pha loãng đ n gi n d ch chi t hòa tan trong m t đ m thích h p làườ ợ ỉ ầ ơ ả ị ế ộ ệ ợ đ . N u protein ch a các c u n i disulfide, ng i ta c n ph i ti n hành oxy hóa vàủ ế ứ ầ ố ườ ầ ả ế kh glutathione. M t đôi khi c n b sung đ ng dung môi (co-solvent) nh PEG, ho cử ộ ầ ổ ồ ư ặ các ch t t y r a nh Triton X-100, Tween 20 ho c Zwittergent 3-16. ấ ẩ ử ư ặ

Sau khi hòa tan thành công, có th th nghi m các ph ng pháp tái cu n xo nể ử ệ ươ ộ ắ khác nhau bao g m s pha loãng ho c th m tách. Hi u su t t o ra protein ho t đ ngồ ự ặ ẩ ệ ấ ạ ạ ộ ho c protein có các liên k t disulfite gi ng nh protein g c ph thu c vào n ng đ , đặ ế ố ư ố ụ ộ ồ ộ ộ tinh s ch và kích th c c a chu i polypeptide; đ pH và c ng l c ion c a dung môi;ạ ướ ủ ỗ ộ ườ ự ủ

và t l tái cu n xo n c a chúng. Các nhân t khác bao g m s l ng c a các liên k tỷ ệ ộ ắ ủ ố ồ ố ượ ủ ế disulfite và b n ch t c a chính protein. Trong m t s tr ng h p, các protein hòa tanả ấ ủ ộ ố ườ ợ có th r t khó tái cu n xo n và ng i ta th y r ng vi c b sung chaperonins có thể ấ ộ ắ ườ ấ ằ ệ ổ ể giúp ích cho các quá trình này. Chaperonins là các protein c n đ đ m b o cu n xo nầ ể ả ả ộ ắ chính xác các in vivo protein, v i kh năng thu n l i c a chaperonin tái t h p chúngớ ả ậ ợ ủ ổ ợ đ c dùng đ xúc tác cho quá trình tái cu n xo n chính xác c a các ượ ể ộ ắ ủ in vitro protein.

Nguyên nhân t o thành các th vùi ch a đ c bi t đ y đ , vì không ph i t t cạ ể ư ượ ế ầ ủ ả ấ ả protein bi u hi n m c đ cao đ u t o thành th vùi. T bào v t ch cũng th hi nể ệ ở ứ ộ ề ạ ể ế ậ ủ ể ệ m t vai trò quan tr ng. C u trúc chính xác c a protein tái t h p cũng có th nhộ ọ ấ ủ ổ ợ ể ả h ng s t o thành các th vùi. M t nghiên c u đ c th c hi n v i ưở ự ạ ể ộ ứ ượ ự ệ ớ γ -interferon ng i tái t h p đã cho th y ch m t vài thay đ i amino acid cũng có th nh h ngườ ổ ợ ấ ỉ ộ ổ ể ả ưở đ n s chuy n hóa gi a các bi u hi n c a protein hòa tan và không hòa tan trong ế ự ể ữ ể ệ ủ E. coli.

1.2. Ph ng pháp hòa tan th vùiươ ể1.2.1. Làm tan t bàoế

Ly tâm thu ti u th t bào ể ể ế E. coli, tái huy n phù ti u th b ngề ể ể ằ phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) và lysozyme, đ t nhi t đ phòng (RT)ặ ở ệ ộ kho ng 20 phút (th nh tho ng khu y). Sau đó, b sung deoxycholic acid, đ t 37ả ỉ ả ấ ổ ặ ở oC và khu y cho t i khi d ch tan tr nên s n s t, b sung DNase I và đ 30 phút RT.ấ ớ ị ở ề ệ ổ ể ở

1.2.2. Tinh s ch và r a th vùi ạ ử ể

- Ph ng pháp 1. ươ Ly tâm d ch tan thu đ c b c trên, tái huy n phù ti u thị ượ ở ướ ề ể ể b ng Triston X-100 và EDTA, gi RT 5 phút. Ly tâm 15 phút l y ti u th và táiằ ữ ở ấ ể ể huy n phù trong n c. Tr n dung d ch v i đ m 2ề ướ ộ ị ớ ệ × SDS gel-loading dye và phân tích b ng đi n di polyacrylamide gel đ xác đ nh protein quan tâm có trong ti u th không.ằ ệ ể ị ể ể

- Ph ng pháp 2. ươ Ly tâm d ch tan, tái huy n phù ti u th b ng n c. Sau đó, lyị ề ể ể ằ ướ tâm l i và tái huy n phù ti u th trong Tris.HCl có b sung urea. Ly tâm và tái huy nạ ề ể ể ổ ề phù ti u th b ng n c. Tr n dung d ch v i đ m 2ể ể ằ ướ ộ ị ớ ệ × SDS gel-loading dye và phân tích đi n di polyacrylamide gel đ xác đ nh đi u ki n r a thích h p cho protein.ệ ể ị ề ệ ử ợ

1.2.3. Hòa tan các th vùi ể

Treo các ti u th đ c r a trong đ m dung ly ch a PMSF và urea, đ 1 gi ể ể ượ ử ệ ứ ể ờ ở RT. B sung dung d ch có KHổ ị 2PO4, EDTA và NaCl đ 30 phút RT, duy trì pH 10,7ể ở b ng KOH. Đi u ch nh pH t i 8,0 b ng HCl đ 30 min RT. Ly tâm thu ti u th và táiằ ề ỉ ớ ằ ể ở ể ể huy n phù b ng đ m 1ề ằ ệ × SDS gel-loading dye. Phân tích đi n di đ xác đ nh m c đệ ể ị ứ ộ hòa tan.

2. Các đuôi ái l cự

Khái ni m đuôi ái l c xu t hi n khi thi t k di truy n v i m c đích giúp cho sệ ự ấ ệ ế ế ề ớ ụ ự tinh s ch protein ho c enzyme hi u qu h n. Gen c a protein quan tâm đ c dung h pạ ặ ệ ả ơ ủ ượ ợ v i chu i DNA mã hóa cho m t s trình t amino acid s đ n gi n hóa quá trình tinhớ ỗ ộ ố ự ẽ ơ ả s ch protein, b ng cách bi n đ i các tính ch t c a nó trong m t ki u có th d đoán.ạ ằ ế ổ ấ ủ ộ ể ể ự M t trong các tr ng h p đ u tiên là dung h p di truy n c a m t s g c arginine v iộ ườ ợ ầ ợ ề ủ ộ ố ố ớ C-terminus c a urogastrone. Gen này s s n xu t m t protein liên k t m nh v i khuônủ ẽ ả ấ ộ ế ạ ớ trao đ i ion cho cation. Đuôi polyarginine sau đó đ c lo i b b ng cách dùng enzymeổ ượ ạ ỏ ằ b t đ ng carboxypeptidase A.ấ ộ

Hình 7.12. Tinh s ch protein đích b ng s c ký ái l c. ạ ằ ắ ự Cho h n h p protein tái t h p đi quaỗ ợ ổ ợ

c t s c ký có ch a m t ph i t liên k t đ c hi u v i các protein mang m t đuôi ái l c (ví d :ộ ắ ứ ộ ố ử ế ặ ệ ớ ộ ự ụ

His, Histidine ho c GST, glutathione-S-transferase). Các ch t b n s đ c r a trôi kh i c t, vàặ ấ ẩ ẽ ượ ử ỏ ộ

các protein đ c liên k t trên c t sau đó s đ c r a gi i d ng tinh s ch. Đuôi ái l c cóượ ế ộ ẽ ượ ử ả ở ạ ạ ự

nhi u u đi m trong tinh s ch protein. Trong IMAC (immobilized metal ion affinityề ư ể ạ

chromatography), His s liên k t ch n l c cao v i Niẽ ế ọ ọ ớ 2+ ho c các kim lo i chuy n ti p khácặ ạ ể ế

đ c b t đ ng trên ph i t , protein có g n đuôi ái l c có th đ c r a gi i ch n l c b ngượ ấ ộ ố ử ắ ự ể ượ ử ả ọ ọ ằ

imidazole. Protein đ c g n đuôi GST liên k t v i glutathione nh m t ph i t , và đ c r aượ ắ ế ớ ư ộ ố ử ượ ử

gi i v i các dung d ch glutathione. Các protein có đuôi dung h p GST mang ho t tính enzymeả ớ ị ợ ạ

ch có th đ c tinh s ch d i các đi u ki n t nhiên. Ng c l i, các protein g n đuôi His cóỉ ể ượ ạ ướ ề ệ ự ượ ạ ắ

th đ c tinh s ch d i các đi u ki n t nhiên ho c bi n tính.ể ượ ạ ướ ề ệ ự ặ ế

Hình 7.13. Phân tích SDS-PAGE và nhu m b ng Coomassie Blue các s n ph m proteinộ ằ ả ẩ

sau khi tinh s ch b ng s c ký ái l c. ạ ằ ắ ự 1: Chu n kh i l ng phân t c a protein. 2: Protein hòaẩ ố ượ ử ủ

tan t ng s . 3: Protein dung h p (protein đích và GST) đ c r a gi i kh i c t glutathioneổ ố ợ ượ ử ả ỏ ộ

sepharose. 4: Protein dung h p đ c c t b ng PresCission Protease cho ra 2 băng là GST vàợ ượ ắ ằ

protein đích. 5: Protein đích đã đ c tinh s ch sau khi cho đi qua IMAC.ượ ạ

Khó khăn ch y u các dung h p ái l c đ tinh s ch protein là ph i lo i bủ ế ở ợ ự ể ạ ả ạ ỏ thành công đuôi ái l c và các tác nhân đ c s d ng. V n đ này có th đ c gi iự ượ ử ụ ấ ề ể ượ ả quy t t ng ph n b ng s bi n n p di truy n các đi m đ c hi u cao cho protease ho cế ừ ầ ằ ự ế ạ ề ể ặ ệ ặ cho s c t b các liên k t acid không b n ch n i c a protein tái t h p và đuôi áiự ắ ỏ ế ề ở ỗ ố ủ ổ ợ l c. Nhi u ph ng pháp phân c t đã đ c g i ý. S d ng các protease đ c hi u làự ề ươ ắ ượ ợ ử ụ ặ ệ thích h p h n c , b i vì có th ng d ng trong các đi u ki n “nh nhàng”, ch y u làợ ơ ả ở ể ứ ụ ề ệ ẹ ủ ế thrombin, enterokinase và Factor Xa. T t c nh ng protein này ho t đ ng 37ấ ả ữ ạ ộ ở oC và có th phân c t các v trí bên trong protein quan tâm, ho c do m t tính đ c hi u ho c tể ắ ở ị ặ ấ ặ ệ ặ ừ s nhi m b n các protease. Cu i cùng, các b c s c ký ti p theo s đ c yêu c u đự ễ ẩ ố ướ ắ ế ẽ ượ ầ ể lo i b đuôi ái l c đ c phân c t và protease.ạ ỏ ự ượ ắ

Trong s phát tri n g n đây c a lĩnh v c này, ng i ta đã s d ng d ng tái tự ể ầ ủ ự ườ ử ụ ạ ổ h p c a protease 3C t rhinovirus c a ng i. Protease này có kích th c nh (20 kDa)ợ ủ ừ ủ ườ ướ ỏ và có m t tính đ c hi u r t h n ch . Nó đ c bi u hi n nh là m t protein tái t h pộ ặ ệ ấ ạ ế ượ ể ệ ư ộ ổ ợ đ c dung h p v i glutathione-S-transferase. Đi u này có m t vài u đi m, b n thânượ ợ ớ ề ộ ư ể ả protease có th đ c tinh s ch b ng s c ký ái l c trên glutathione-Sepharose. N uể ượ ạ ằ ắ ự ế protein đích đ c bi u hi n nh là m t s dung h p v i glutathione-S-transferase thìượ ể ệ ư ộ ự ợ ớ

nó có th đ c tinh s ch trên c t glutathione-Sepharose. Sau khi x lý v i protease,ể ượ ạ ộ ử ớ protein đích có th đ c phân tách kh i đuôi glutathione-S-transferase và protease b ngể ượ ỏ ằ cách chuy n qua c t glutathione-Sepharose th hai. ể ộ ứ

M t cách khác, ph n ng phân c t có th đ c đ t trên c t glutathione-ộ ả ứ ắ ể ượ ặ ộSepharose th nh t b ng cách b sung protease vào đ m c a c t, vì th tránh đ c sứ ấ ằ ổ ệ ủ ộ ế ượ ự c n thi t cho m t c t th hai. Protease này có s n d ng th ng m i d i tênầ ế ộ ộ ứ ẵ ở ạ ươ ạ ướ PreCission Protease do Amersham Pharmacia Biotech s n xu t (Hình 7.12 và 7.13).ả ấ

Tai liêu tham kh o/đ c thêm ả ọ

1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl

K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.

2. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory

Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA.

3. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood

Cliffs, New Jersey, USA.

4. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed.

Blackwell Science, Oxford, UK.

5. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press

Inc. New Jersey, USA.

6. Rosenberg IM. 1996. Protein Analysis and Purification-Benchtop Techniques.

Birkhäuser, Boston, USA.

7. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin,

Heidelberg, Germany.

8. Walker JM. 2002. The Protein Protocols Handbook. 2nd ed. Humana Press Inc. Totowa,

New Jersey, USA.