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NANOCYTES
Tovar_DECHEMA_9.März-2005© Tovar, Fraunhofer-Gesellschaft Institut für
GrenzflächenverfahrenstechnikUniversität Stuttgart
Institut für Zellbiologie und ImmunologieUniversität Stuttgart
Surfaces and Interfaces – Engineering at the Nanoscale, DECHEMA, 9. März 2005
Controlling the Surface Properties of Nanoparticles – Bioorganically modified Nanoparticles for Cell Signaling (NANOCYTES)
Dr. habil. Günter TovarFraunhofer-Institute for Interfacial Engineering and Biotechnology& University of Stuttgart, Institute for Interfacial Engineering
NANOCYTES
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Outline
TNF-NANOCYTESFunctional Principle
Nanoparticle Synthesis and Characterisation
Bioconjugation
TNF-Nanoparticles in Biological Systems
Conclusion
NANOCYTES
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Functional Principle TNF–NANOCYTES
SignalTransduktion
2
TNF-αKonversion
Enzym(TACE)
RezeptorBindung
TNF
gelöstes TNF-αMembran TNF-α NANOCYTES
?
Immobilisierung
TNF-Receptor 2
TNF-Rezeptor 1
Partikel
SignalTransduktion
1
TNFZelle
SignalTransduktion
2
TNF-αKonversion
Enzym(TACE)
RezeptorBindung
TNF
gelöstes TNF-αMembran TNF-α NANOCYTES
?
Immobilisierung
TNF-Receptor 2
TNF-Rezeptor 1
Partikel
SignalTransduktion
1
TNFZelle
Key to Control of TNF Cell-Signalling Behaviour: Surface-Bound TNF
Synthetic-Bionic Hybrid-Particles
NANOCYTES
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RequirementsImmobilization as a TrimerOrientation to Bind ReceptorSuitable Ligand DensityMinimized Nonspecific Binding
TNF–NANOCYTES®
Strategy for Immobilization
Target-cellTNF-R2
TNF
R4
R4
R4R1 R2 R3+ +
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Nanoparticle Preparation
1. Core-Shell Nanoparticles
O SiO
OO Et
Et
Et
Et OH-
Hydrolysis Condensation
-H20O Si
O
OO H
H
H
H
Si O HO
OO
Amorphous Silica
100 nm
Free Choice of Size. Here: 100 nm, 1 µm, 10 µmVarious fluorescence labels integrated in organic shell:green, red, violet
2. Single-Step Bioreactive Polymer NanoparticlesSurfmer-Technology
O
O
S+
R
3. Biodegradable Polymer Nanoparticles
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Surface Modification of Silica Nanoparticles1st Shell Reaction: Silanization
NH2SiOOO
EtEt
Et
NH2SiOO
OH+/OH- NH2Si
OOO
HH
HHydrolyse Condensation
NH
OOH
O
SiOO
ONH2SiO
OO
O
O
O
2nd Shell Reaction: Organic Derivatization
+
Quality Control
3 4 5 6 7 8 9 10 11
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
Si-OH -NH2 -COOH
pH
Zeta
pote
ntia
l[m
V]
ζ-potential
e.g. by Elemental Analysis andSurface Charge Determination:
90 µmol functional groupsper 1 g particles
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Shell Modification by Polymer Grafting ReactionReduction of Nonspecific Binding NSB (e.g. Pegylation)
NH
OOH
O
SiOO
O H2N- PEGEDC
-O-Me
0
20
40
60
80
-PEG
1x washing cycle 2x washing cycle
Dextra
n-NH 2
Dextra
n-COOH
-Spa
cer-N
H 2
-COOH
-NH 2
SiOH
BS
A a
dsor
bed
[%]
Low NSB of Proteins
+
Zero NSB
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Shell with Low NSB and Reactive Anchor GroupsGrafting of Functional PEG
H2N
O
O
NH
O
O( )n
Boc-Amino-PEG-Amine (MW 644, n: ~11)
+ EDC-COOH
TFA-NH2
100 nm
Particle size: SEM
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
Zeta
pote
ntia
l (m
V)
Modifier content (mg/ml)
Boc protected deprotected -NH2
Surface characterization:ζ−potential determination
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RequirementsImmobilization as a TrimerOrientation to Bind ReceptorSuitable Ligand DensityMinimized Nonspecific Binding
TNF–NANOCYTES®
Strategy for Immobilization
Target-cellTNF-R2
TNF
R4
R4
R4R1 R2 R3+ +
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Synthetic Nanoparticle Protein Conjugation R1 = NH2 R2——R3 = R4 = SHSulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)
HS
HS
R2 R3
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TNF-Nanoparticles Bind to TNF-Receptor 2 (TNF-R2)Cell-Membrane Ligand-Receptor Study by Confocal MicroscopyLigand TNF-Nanocytes® Binding to TNF-Receptor (HeLa80-R2)
Control: unmodified particles on HeLa80-R2
Particles OverlayTNF-R2
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TNF-Nanoparticles Bind to TNF-Receptor 2Cell-Membrane Ligand-Receptor Study by Confocal MicroscopyLigand TNF-Particles Binding to TNF-Receptor (HeLa80-R2)
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TNF-Nanoparticles Stimulate Cell Action via TNF-Receptor 2Signal Pathway Study by Confocal MicroscopyTNF-Particles on HeLa80-R2 with Transcription Factor (NFκB-GFP)
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TNF-Nanoparticles Stimulate Cell Action via TNF-Receptor 2Signal Pathway Study by Confocal MicroscopyTNF-Nanocytes® on HeLa80-R2 with Transcription Factor (NFκB-GFP)
15 min 30 min
60 min
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TNF-Nanoparticles Induce Apopotosis via TNF-Receptor 2TNF-Nanocytes® Action on Target Cell (MF-R2-Fas with FADD-GFP)
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1E-3 0,01 0,1 1 10 100
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
soluble TNF TNF modified nanoparticlesCe
ll ac
tivity
OD 50
Concentration TNF (ng/ml)
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
TNF-Nanoparticles Induce Apopotosis via TNF-Receptor 2Bioactivity in Cell Assay
Kym-1 cells:TNF-Receptor 1
MF-R2 cells:TNF-Receptor 2
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TNF-Nanoparticles Induce Apopotosis via TNF-Receptor 2TNF-Nanocytes® Action on Target Cell (MF-R2-Fas with FADD-GFP)
22 min 30 min15 min 40 min
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Conclusions
Synthesis of Reactive Core-Shell Nanoparticles
Reduced Non-Specific Binding of Proteins
Bioactive Conjugation of TNF to Nanoparticles
Hybrid Particles Mimick Membrane-Like TNF
TNF-Particles Recruit TNF-Receptor
TNF-Nanoparticles Stimulates Specific Cell Responses by Receptor-Binding
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Acknowledgements
IGB and IGVT
Prof. Herwig BrunnerDr. Thomas SchiestelDr. Achim WeberDr. Marc HeroldDr. Carmen GruberInstitute for Cell Biologyand ImmunologyUniversity of Stuttgart
Prof. Klaus PfizenmaierProf. Peter ScheurichDr. Ingo GrunwaldDr. Susanne Bryde
Institut für Zellbiologie und Immunologie
Universität Stuttgart
Funding by BMBF, Program Nanobiotechnology
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TNF-Nanoparticles Induce Apopotosis via TNF-Receptor 2TNF-Nanocytes® Action on Target Cell (MF-R2-Fas with FADD-GFP)
22 min 30 min15 min 40 min