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Dal campione al risultato: valutazione delle performance
analitiche di Helios System nella determinazione di ANA e ANCA
Nicoletta Gallo UOC Medicina di Laboratorio Azienda Ospedaliera di Padova
Ricerca di ANA quale metodo? ACR ANA Task Force Reccomendations
(Meroni & Schur. Ann Rheum Dis 2010;69:1420-1422)
“The Task force has reviewed the
relevant literature published to date and
has concluded that solid phase
immunoassays may not be appropriate at
present for replacing IFA as a screening
test for the detection of ANA”
Il metodo IFA su cellule Hep2 è il gold standard per la ricerca di
ANA data la maggiore sensibilità vs i test in fase solida
Metodi di riferimento per la determinazione degli ANA
• Metodo di riferimento: immunofluorescenza indiretta
• Substrato consigliato: Cellule Hep-2 (ATCC-CCL-23) che consentono di evidenziare: titolo di positività
tipo di pattern fluoroscopico
• Titolo di screening consigliato: 1:80
• Lettura consigliata: a 400x
Cellule Hep-2: vantaggi • Substrato più sensibile:
identificazione di molti pattern
• Origine umana: miglior specificità rispetto ai tessuti animali
• Nuclei più grandi: si possono osservare anche dettagli nucleari complessi
• Il monostrato cellulare assicura la visualizzazione di tutte le strutture cellulari, nucleari e citoplasmatiche
• Elevato indice mitotico: gli antigeni associati alla divisione cellulare sono facilmente rilevabili (es. centromero, fuso mitotico)
• Le cellule non sono racchiuse in una matrice intercellulare: ridotta autofluorescenza
• La distribuzione degli antigeni è uniforme
• ini
ANA QUADRI FLUOROSCOPICI E PATOLOGIE ASSOCIATE
QUADRI
FLUOROSCOPICI
PATOLOGIA ANTIGENI
ASSOCIATI
QUADRI
NUCLEARI
CLASSICI
OMOGENEO LES dsDNA/ISTONI
FINEMENTE PUNTEGGIATO S SIOGREN, SSP SSA, SSB
GRANULARE MCTD Sm, U1-RNP
CENTROMERICO CREST, SCLERODERMIA
LIMITATA, RAYNAUD
CENP-B
NUCLEOLARE SS, SSP FIBRILLARINA, T0/Th,
RNA polimerasi I
GRANULIA DIFFUSA SCLERODERMIA
DIFFUSA
SCL-70
QUADRI
NUCLEARI
RARI
MULTIPLE NUCLEAR DOTS CBP Sp 100
FEW NUCLEAR DOTS S SJOGREN P 80 COILINA
LAMINA NUCLEARE CBP, LES LAMININA A,B,C
PCNA LES CICLINA
QUADRI
CITOPLASMATICI
RIBOSOMIALE LES PROTEINA P
RIBOSOMIALE
PUNTEGGIATO FINE POLIMIOSITE JO-1, PL7, PL12
MITOCONDRIALE CBP AMA-M2
CITOSCHELETRO-ACTINA EPATITE AUTOIMMUNE F-ACTINA
CITOSCHELETRO-
VIMENTINA
ARTRITE REUMATOIDE VIMENTINA
ANA in soggetti sani e in pazienti con LES: prevalenza
0
5
10
15
20
25
30
35
40 80 160 320
Healthy
SLE
Arthritis Rheum 1997;40:1601
QUANDO ESEGUIRE IL TEST ANA? • Non sorprende che il test ANA, come test di screening, non
abbia un forte PPV ed è spesso considerato un test over-utilizzato.
• Senza un forte razionale clinico il PPV è molto debole! Lo stesso dicasi per gli ANCA (Savige et al Am J Clin Pathol '99).
• Scoraggiare il test anche in casi limitati solo con forte sospetto clinico è pericoloso per il rischio di perdere alcuni pazienti potenziali (soprattutto per i non reumatologi).
• ANA può essere rilevato anche anni prima che la malattia conclamata (Arbuckle et al NEJM ‘03)
• Dato il costo di un singolo test ANA e l'eventuale costo diretto/indiretto di una mancata o ritardata diagnosi di una malattia autoimmune ANA-associata il rapporto costi/ benefici è a favore del test.
ANA 78%
Anti Ro/SSA 47%
Anti La/SSB 34%
Anti
fosfolipidi
18%
Anti ds/DNA 55%
Anti Sm 32%
Anti RNP 26%
Arbuckle MR, et al, N.Engl J Med 2003
115/130 pz con LES (88%) presentano almeno un autoanticorpo nel siero prima della diagnosi (in media 3,3 anni prima!)
ANA HEp-2 IFI: non tutto oro…
…. Ma anche zone d’ombra:
• Variabilità dell’analisi (isotipo del coniugato, microscopio, diluizione dei campioni, corretta preparazione dei vetrini)
• Soggettività interpretativa
• Automazione solo parziale
• Mancanza del consenso nella nomenclatura dei pattern
• Difficoltà di confronto inter-laboratorio
IFA DIGITALE
Standardizzazione dell’interpretazione dei vetrini ANA Hep-2 in IIF per migliorare l’affidabilità e la comparabilità dei risultati
Software d’immagine digitale per la lettura, la caratterizzazione e l’archiviazione
Inserimento in una piattaforma totalmente automatizzata per ridurre il tempo dell’esecuzione manuale
ANA Hep-2 IFA: standardizzazione meta raggiungibile Armonizzazione computerizzata della classificazione dei pattern
Hep-2 & creazione di un nomenclatore supportato da immagini digitali catalogate (Wiik AS et al. J Autoimmun 2010)
Possibile l’analisi della variabilità intra- ed inter –osservatore
Introduzione dell’automazione della lettura al microscopio dei vetrini Hep-2 (Aklides, EUROPattern, Helios, Image Navigator, NOVAView,
Zenit G-Sight)
Possibile l’analisi oggettiva
Valutare le prestazioni analitiche e il livello di accuratezza di Helios
system (Aesku Diagnostics, Wendelsheim, Germania) nella
preparazione, lettura (acquisizione delle immagini) ed elaborazione degli
anticorpi antinucleo (ANA) e degli anticorpi anti citoplasma dei
neutrofili (ANCA) .
HELIOS System (Aesku Diagnostics, Wendelsheim, Germania)
•IFA PROCESSING: esegue tutte le fasi del processo automaticamente
•SLIDE AND SAMPLE BARCODE READER: garantisce la tracciabilità del campione e del vetrino per tutto il processo
•BUILT-IN LED MICROSCOPE + IMAGE CAPTURE. Fotocamera esegue un autofocus high tech e le immagini sono salvate e archiviate automaticamente
724 sieri non selezionati
Processazione manuale
Preparazione vetrini (cellule Hep-2, Inova
Dianostics, USA)
Lettura con microscopio da parte di
due operatori
Refertazione su Lis
Processazione su piattaforma Helios
Refertazione Acquisizione immagini
Preparazione
Vetrini (Hep-2 Aesku,
Germany)
RISULTATI 1: ANA
IIF HELIOS
Neg Pos Failed
Neg
Basso titolo
Pos
84% ANA PPV 98% NPV con agreement totale del 94%.
174
168
382 372
58
27 143
105
8 2
5
4
Risultati discrepanti potrebbero dipendere da:
differenze del substrato e del coniugato utilizzato con le due metodiche;
differenze nel cut-off setting (Helios mostra però flessibilità nelle impostazioni di cut off, permettendo di dare preferenza alla sensibilità o alla specificità)
Valutazione dei campioni a basso titolo (aspetto raramente preso in considerazione)
ANCA
Il titolo ANCA CORRELA con l’attività di malattia
• In base ai diversi pattern ottenuti in immunofluorescenza possono essere distinti in
c-ANCA marker specifico di Granulomatosi di Wegener
p-ANCA riscontrati in alta percentuale in vasculiti sistemiche con glomerulonefrite idiopatica progresssiva (85-95%) si trovano anche nella poliarterite nodosa, snd di Churg Strauss, AR associata a vasculiti
p-ANCA atipici sono presenti soprattutto nelle MICI con una prevalenza variabile da 5-20% per il morbo di Crhon e dal 40- 70% nella rettocolite ulcerosa
• Esistono positività ANCA in alcune malattie non propriamente vasculitiche: malattie infettive (HIV, amebiasi, tubercolosi, epatiti, endocarditi), neoplasie (linfomi, mielodisplasie, ca colon e polmonari), silicosi, snd di Goodpasture, epatiti autoimmuni e CSP
RISULTATI 2: ANCA
IIF HELIOS
NEG POS
NEG 48 38 8
POS 93 10 85
TOT 141 141
European Vasculitis Group Recommendations (Villa Forte A., et al
European League Against Rheumatism/European Vasculitis Study Group
Recommendations for the management of vasculitis. Curr Opin rheumatol.
2010 Jan;22(1):49-53)
Sensibilità 90,3%, Specificità 81%
RISULTATI 3: ANCA
HELIOS
POS NEG
PR3 66 8 74
MPO 29 38 67
95 46 141
European Vasculitis Group Recommendations (Villa Forte A., et al
European League Against Rheumatism/European Vasculitis Study
Group Recommendations for the management of vasculitis. Curr
Opin rheumatol. 2010 Jan;22(1):49-53)
Sensibilità 69,5%, Specificità 82,6%
OSSERVAZIONI CONCLUSIVE
Helios è un processore automatico che include un sistema ottico
integrato per la lettura delle immagini, soprattutto dedicato
alla discriminazione positivo / negativo.
I risultati possono essere registrati, memorizzati e trasmessi
al sistema informativo di laboratorio.
La piattaforma Helios può ridurre la variabilità intra e inter-
laboratorio, migliorare efficienza di laboratorio e sostenere la
standardizzazione soprattutto nei laboratori caratterizzati da
elevati flussi di lavoro.
L'obiettivo primario della Medicina di Laboratorio è quello di fornire
informazioni utili alla formulazione della corretta decisione clinica, al fine di
contribuire significativamente alla qualità dell’assistenza sanitaria.
Tale obiettivo non può essere raggiunto che tramite la
produzione da parte del laboratorio clinico di risultati attendibili dal punto
di vista analitico e confrontabili indipendentemente dal laboratorio e/o dal
metodo utilizzato per produrli. Infatti, un’inadeguata prestazione da parte
del laboratorio può causare un’errata interpretazione e decisione da parte
del clinico, con gravi conseguenze per la pratica della medicina, per la
tutela della salute e, in definitiva, per il paziente stesso.
In altre parole, come recentemente ricordato, la standardizzazione dei
risultati degli esami di laboratorio racchiude in sé una dimensione etica
di grande importanza
«…quel vorticare di strumenti e di volti e di suoni che si trasfigurano nella
passione di creare, tutti insieme, quella che il protagonista chiama "l'armonia
suprema", è un'esperienza di profondo incanto, come capita di rado…»
IL CONCERTO