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Das Phytochrom-Regulon und eine Phosphodiesterase als Beispiele zur
Wahrnehmung von Umweltsignalen in Pseudomonas aeruginosa
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.))
der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt im
Lehrstuhl für Biologie der Mikroorganismen/ AG Physiologie der Mikroorgansmen
vorgelegt von
Sabrina Heine
aus
Reutlingen
Bochum April 2014
Referentin: Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel Korreferent: Prof. Dr. Ulrich Kück
The phytochrome regulon and a phosphodiesterase as paradigms
for perception of environmental signals in Pseudomonas aeruginosa
Dissertation to obtain the degree Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
at the Faculty of Biology and Biotechnology International Graduate School of Biosciences
Ruhr-University Bochum
Department of Microbiology/ Physiology of Microorganisms
submitted by
Sabrina Heine
from Reutlingen
Bochum April 2014
First Supervisor: Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel Second Supervisor: Prof. Dr. Ulrich Kück
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen
Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel
verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um
sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.
Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten
und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.
Bochum, den 22.04.2014 Sabrina Heine
Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei meiner Doktormutter Prof. Dr. Nicole
Frankenberg-Dinkel für die Bereitstellung der interessanten Themen, die
fortwährende Unterstützung und die stetige Diskussionsbereitschaft in einer sehr
angenehmen Atmosphäre bedanken. Ebenfalls bedanke ich mich für die
Ermöglichung der Teilnahme an internationalen Konferenzen.
Für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens danke ich Herrn Prof. Dr. Ulrich
Kück.
Ein großes Dankeschön gilt auch Dr. Bernd Masepohl für das Interesse an dieser
Arbeit und die zahlreichen, sowie hilfreichen Diskussionen.
Bei Prof. Dr. Karin Sauer und ihrer Doktorandin Yi Li der Binghamptom University,
USA bedanke ich mich für die gelungene Kooperation.
Für die Bereitstellung der Transposonstämme danke ich Prof. Dr. Susanne Häussler
(HZI, Braunschweig). Prof. Dr. Wofgang Gärtner (MPI, Mühlheim), Prof. Dr. Amanda
Oglesby-Sherrouse (University of Maryland, USA) und Prof. Dr. Eric Deziel (Centre
INRS-Institut Armand-Frappier, Kanada) danke ich für die zur Verfügung gestellten
Plasmide.
Für die Durchführung der in vivo-Quervernetzungsexperimenten bedanke ich mich
bei Anette Hettwer, sowie Dr. Sina Langklotz und Jun.-Prof. Dr. Julia Bandow (RUB)
für die massenspektrometrischen Analysen.
Bedanken möchte ich mich auch beim gesamten Lehrstuhl für das gute Arbeitsklima.
Vor allem möchte ich allen jetzigen und ehemaligen „FKB-lern“ Danke sagen: Danke
Julia, Krissy, Basti und natürlich allen „kleinen“ für die wunderbare Zeit in und
außerhalb des Labor. Ein ganz herzliches Dankeschön geht auch an Britta für die
tägliche Unterstützung im Labor.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei all meinen Freunden bedanken, die trotz der
manchmal nicht ganz so leichten Zeit immer für mich da waren.
Inhaltsverzeichnis
I
II Abkürzungsverzeichnis VI
1. Einleitung 1
1.1 Der Modellorganismus Pseudomonas aeruginosa 1
1.2 Transkriptionsregulation durch Sigmafaktoren 2
1.3 Zwei-Komponenten-Systeme 3
1.3.1 Allgemeiner Aufbau und Signaltransduktion 3
1.3.2 Sensor-Histidin-Kinasen 6
1.3.3 Antwortregulatoren 7
1.3.4 Zwei-Komponenten-Systeme in P. aeruginosa 8
1.4 Photorezeption 8
1.5 Phytochrome 9
1.5.1 Allgemeine Eigenschaften von Phytochromen 9
1.5.2 Phytochrome in heterotrophen Bakterien 13
1.5.3 Das Phytochromsystem aus P. aeruginosa 13
1.6 Die Quorum-Sensing Systeme in P. aeruginosa 14
1.7 Second messenger vermittelte Signaltransduktion durch c-di-GMP 17
1.7.1 Einfluss von c-di-GMP auf den Biofilmzyklus 19
1.7.2 NbdA ist essentiell für die Biofilmauflösung in P. aeruginosa 21
1.8 Zielsetzung 23
2. Material und Methoden 24
2.1 Bakterienstämme 24
2.2 Vektoren und rekombinante Plasmide 27
2.3 Oligonukleotide 28
2.4 Medien und Zusätze 29
2.4.1 Medien 29
2.4.2 Antibiotika und Medienzusätze 30
2.5 Enzyme, Antiserum, Kits und Chemikalien 30
Inhaltsverzeichnis
II
2.5.1 Enzyme, Antiserum und Kits 30
2.5.2 Chemikalien 31
2.6 Geräte und Software 32
2.7 Mikrobiologische Methoden 33
2.7.1 Bakterienkultivierung 33
2.7.1.1 Plattenkulturen 33
2.7.1.2 Flüssigkulturen 33
2.7.2 Lagerung von Bakterien 33
2.7.3 Messung der Zelldichte 33
2.7.4 Anzucht von P. aeruginosa unter verschiedenen Bedingungen 34
2.8 Molekularbiologische Methoden 34
2.8.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen 34
2.8.2 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen 35
2.8.3 Diparentales Mating zur Transformation in P. aeruginosa 35
2.8.4 Präparation von Plasmid-DNA 35
2.8.5 Präparation chromosomaler DNA aus P. aeruginosa 36
2.8.6 Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration 37
2.8.7 Amplifikation von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion 37
2.8.8 Agarose-Gelelektrophorese 38
2.8.9 Reinigung von DNA-Fragmenten 39
2.8.10 Hydrolytische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 39
2.8.11 Ligation von DNA-Fragmenten 39
2.8.12 Sequenzierung 40
2.9 Promotoranalysen 40
2.9.1 Herstellung von lacZ-Reportergenfusionen 40
2.9.2 Konstitutive Expression von rhlR 41
2.9.3 Bestimmung der ß-Galaktosidase-Enzymaktivität 42
Inhaltsverzeichnis
III
2.10 Herstellung von Deletionsmutanten 43
2.11 DNA mobility shift assay (DMSA) 44
2.12 Phänotypische Untersuchungen 45
2.12.1 Osmotischer Stress 45
2.12.2 Motilität 46
2.12.3 SDS-Hemmhoftest 46
2.12.4 Extraktion von 4-Hydroxy-2-alkyl-quinolonen (HAQ) 46
2.13 Proteinbiochemische Methoden 47
2.13.1 Heterologe Proteinproduktion in E. coli 47
2.13.1.1 Produktion von Strep-tagII-Fusionsproteinen 47
2.13.1.2 Produktion von (His)6-tag Fusionsproteinen 47
2.13.2 Homologe Proteinproduktion in P. aeruginosa 47
2.13.3 Chromosomal integrierte PaBphP Strep-tagII-Fusion 48
2.13.4 Zellaufschluss 48
2.13.5 Affinitätschromatographische Reinigung der Fusionsproteine 49
2.13.6 Reinigung des Transkriptionsregulators LasR 49
2.13.7 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese 50
2.13.8 Western-Blot-Transfer von Proteinen 52
2.13.9 Immunologischer Nachweis von Strep-tagII-Fusionsproteinen 52
2.13.10 Dialyse 53
2.13.11 Konzentrieren von Proteinen 54
2.13.12 Photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration 54
2.13.13 Proteinbestimmung nach Bradford 54
2.13.14 UV/Vis-Spektroskopie 55
2.13.15 Proteinkinaseexperimente 55
2.13.15.1 Autophosphorylierung 55
2.13.15.2 Phosphorylgruppenübertragung 56
Inhaltsverzeichnis
IV
2.13.16 In vivo-Degradation 56
2.13.17 In vivo-Quervernetzung 57
3. Ergebnisse 58
Kapitel I 58
3.1.1 Biochemische Charakterisierung des Phytochroms PaBphP
aus P. aeruginosa PA14 58
3.1.1.1 Isolierung von PaBphP aus PA14 58
3.1.1.2 Photoisomerisierung von homolog isoliertem PaBphP 60
3.1.1.3 Der native Chromophor von PaBphP 61
3.1.1.4. Autophosphorylierung 64
3.1.2 Phänotypische Charakterisierungen von Phytochrommutanten 66
3.1.2.1 Osmotischer Stress 66
3.1.2.2 Synthese von 4-Hydroxy-2-alkyl-quinolonen (HAQ) 67
3.1.2.3 Auswirkung von SDS auf die Membran 68
3.1.2.4 Motilitätsverhalten 69
3.1.2.5 Pyocyaninproduktion 70
3.1.3 Die Regulation von bphOP und bphP 71
3.1.3.1 Vergleichende Promotoraktivitätsstudien 71
3.1.3.2 LasR-abhängige Regulation 73
3.1.3.3 RhlR-abhängige Regulation 76
3.1.4.4 RpoS-abhängige Regulation 78
3.1.4 Die intrazelluläre Signaltransduktion von PaBphP 81
3.1.4.1 Entwicklung eines genetischen Screens zur Identifizierung putativer
Phytochrom-Antwortregulatoren 81
3.1.4.2 Phosphorylgruppenübertragung auf die putativen Regulatoren 86
3.1.5 In vivo-Quervernetzung zur Identifikation von PaBphP
Interaktionspartnern 91
Inhaltsverzeichnis
V
3.1.6 Pull-down-Experimente zur Identifikation von PaBphP
Interaktionspartnern 94
3.1.7 Proteolytischer Abbau von PaBphP 95
Kapitel II 99
3.2.1 Die Transkriptionsregulation von nbdA 99
3.2.1.1 Identifikation des Transkriptionsregulators 100
3.2.1.2 Charakterisierung der Regulation von nbdA durch FhpR 102
4. Diskussion 105
Kapitel I 105
4.1.1 P. aeruginosa besitzt ein funktionelles Phytochrom 105
4.1.2 Die Transkriptionsregulation des Phytochroms aus PA14 ist
komplex 108
4.1.2.1 bphP besitzt einen eigenen Promotor 108
4.1.2.2 Das bphOP-Cotranskript: RpoS- und RhlR-reguliert? 112
4.1.3 Einblicke in die Signaltransduktion von PaBphP 114
4.1.4 PaBphP ist möglicherweise in verschiedene metabolische Vorgänge
involviert 119
4.1.5 PaBphP- mehr als nur ein Rotlichtrezeptor? 120
4.1.6 Das Phytochrom-Regulon 123
Kapitel II 125
4.2.1 Wird die Transkription von nbdA durch NO induziert? 126
5. Zusammenfassung 129
6. Summary 131
7. Literaturverzeichnis 133
8. Anhang 149
8.1 Vorveröffentlichungen der Dissertation 149
8.2 Lebenslauf 151
Abkürzungsverzeichnis
VI
II Abkürzungsverzeichnis Es gelten die die SI-Einheiten (Système International d’unités) und weden nicht
gesondert aufgeführt.
A.dest . Aqua destilla (destiliertes Wasser)
AHT Anhydrotetrazyklin
ATP Adensointriphosphat
AR Antwortregulator
BV Biliverdin
BON Domäne, bacterial OsmY and nodulation
BSA bovine serum albumin; Rinderserumalbumin
ß-Gal ß-Galaktosidase
bp Basenpaare
C- Carboxy-
CA katalytische Domäne einer Sensor-Histidin-Kinase
c-di-GMP zyklisches di-Guanosinmonophosphat
Da Dalton
DGC Diguanylatzyklase
DMSA DNA mobility shift assay, Bandshift-Analyse
DMSO N,N-Dimethylsulfoxid
dNTPs Desoxynukleotidtriphosphat
DHp Dimerisierungs- und Phosphotransferdomäne einer
Sensor-Histidin-Kinase
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EPS extrazelluläre polymere Substanzen
GAF Domäne, die zuerst beschrieben wurde in cGMP
spezifischen Phosphodiesterasen, Adenylatzyklasen und
bakteriellen Formiathydrogenlyase Transkriptionsfaktor
FhlA
GTP Guanosintriphosphat
HAMP Domäne in Histidinkinasen, Adenylatzyklasen,
Methylakzeptorproteinen und Phosphatasen
Abkürzungsverzeichnis
VII
HAQ 2-Heptyl-4-quinolon
HHQ Heptyl-4-hydroxy-quinolon (Autoinduktor)
HKD Histidinkinase-Domäne
HPt Histidinphosphotransferase
HSL Homoserinlakton
HTH helix turn helix
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktosid
LB Luria Bertani (Medium)
MU Miller-Units
N- Amino-
NO Stickstoffmonoxid
oD optische Dichte
ONPG o-Nitrophenyl-ß-D-galaktopyranosid
orf open reading frame; offener Leserahmen
PA Pseudomonas aeruginosa
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PAS Domäne, PER (periodic clock), ARNT (aromatic
hydrocarbon receptor tranlocater), SIM (single minded)
PCB Phycocyanobilin
PCR polymerase chain reaction;Polymerase-Kettenreaktion
PDE Phosphodiesterase
Pfr dunkelrotlichtabsorbierende Form des Phytochroms
PHY Phytochrom-Domäne
PQS Pseudomonas Quinolon Signal (4-Heptyl-3-Hydroxy-4-
quinolone)
Pr hellrotlichtabsorbierende Form des Phytochroms
PΦB Phytochromobilin
PVDF Polyvinylidenfluorid
pGpG 5´-Phosphoguanylyl-(3´-5´)-guanosin
QS Quorum-Sensing
SDS Natriumdodecylsulfat
STAS Domäne in Sulfattransportern und Anti-Sigmafaktor
Antagonisten
RNAP RNA-Polymerase
Abkürzungsverzeichnis
VIII
SHK Sensor-Histidin-Kinase
SV Säulenvolumen
TSS Transkriptionsstartpunkt
üN über Nacht
UpM Umdrehung pro Minute
v/v volume per volume, Volumen pro Volumen
WT Wildtyp
w/v wight per volume, Gewicht pro Volumen
ZKS Zwei-Komponenten-System
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Der Modellorganismus Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa ist ein Gram-negatives, stäbchenförmiges γ-Proteo-
bakterium und bildet zusammen mit P. putida, P. fluorescens und P. syringae die
Gattung der Pseudomonaden. P. aeruginosa gilt als einer der anpassungsfähigsten
Mikroorganismen überhaupt, was sich in der ubiquitären Verbreitung des Bakteriums
wiederspiegelt (Spiers et al., 2000). Durch die Fähigkeit über 100 verschiedene
Kohlenstoffquellen verstoffwechseln zu können, dazu zählen neben
unterschiedlichen Kohlenhydraten auch Fettsäuren, Alkohole und aromatische
Verbindungen, können sie auch unter minimalsten Nährstoffbedingungen überleben
(Van der Wauven et al., 1984). Unter anaeroben Bedingungen ist P. aeruginosa in
der Lage über eine Denitrifikation NO3- und NO2
- als terminalen Elektronenakzeptor
zu nutzen, und alternativ eine anaerobe Arginin- oder Pyruvatfermentation
durchzuführen (Spiers et al., 2000). Das opportunistische Pathogen zählt zu den
wichtigsten nosokomialen Keimen und ist für zahlreiche Krankheitsbilder wie
beispielsweise Harnwegs- und Wundinfektionen sowie Pneumonien verantwortlich,
die sich vor allem bei immunsupprimierten Patienten manifestieren (Govan & Deretic,
1996). In diesem Zusammenhang ist die Fähigkeit des Bakteriums zur Biofilmbildung
von Bedeutung. Insbesondere TypIV-Pili ermöglichen eine Anheftung an biotische
und abiotische Oberflächen, was dort die Ausbildung einer Biofilmmatrix aus
verschiedenen EPS (extrazelluläre polymere Substanzen) zur Folge haben kann
(O'Toole et al., 1998). Die Organisation in solchen Biofilmen begünstigt eine hohe
Resistenz gegenüber Antibiotika, wodurch die Behandlung einer Pseudomonas-
Infektion erschwert wird (Hentzer et al., 2001; Yoon et al., 2002). Die Virulenz des
Pathogens ist außerdem durch die Sekretion unterschiedlicher Virulenzfaktoren
geprägt. Zu diesen zählen neben Exotoxin A und Exoenzym S auch verschiedene
Phospholipasen, Elastasen und das grünpigmentierte Pyocyanin (Ostroff et al., 1990;
Van Delden et al., 1998). Zu den weitverbreitesten und infolgedessen am besten
untersuchten P. aeruginosa Spezies gehören die Stämme PA14 und PAO1
(Wiehlmann et al., 2007). Die Genome beider Unterarten sind bereits vollständig
sequenziert und zählen mit 6,23 Mbp für PAO1 bzw. 6,54 Mbp für PA14 zu den
Einleitung
2
größten bakteriellen Genomen (Stover et al., 2000; Winsor et al., 2009). Beide
Stämme weisen eine sehr hohe Sequenzhomologie von etwa 96 % auf. Rund 9 %
aller offenen Leserahmen kodieren dabei für beschriebene oder vorhergesagte
Transkriptionsfaktoren sowie Ein- oder Zwei-Komponenten-Systeme (Stover et al.,
2000).
1.2 Transkriptionsregulation durch Sigmafaktoren
Die Transkription eines Gens kann in mehrere Phasen unterteilt werden. Sie beginnt
mit der Transkriptionsinitiation, der sich die Elongation anschließt und endet mit der
Termination. Bei diesem Prozess dient die Initiation als elementarer Kontrollpunkt,
der von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase (RNAP) übernommen wird. Die
bakterielle RNAP setzt sich aus mehreren Untereinheiten (α2ββ´ω) zusammen und
existiert in zwei Formen. Als Kern-Enzym kann es zwar an die DNA binden, aber
nicht die Transkription initiieren. Dazu muss die RNAP zuvor mit einem
Sigmafaktor (σ) assoziieren wodurch das holo-Enzym entsteht. Dieser Sigmafaktor
ist für die Erkennung von Promotorstukturen verantwortlich und rekrutiert die RNAP
an die entsprechende Region (Helmann et al., 1988). Dabei dienen innerhalb der
Promotorregion zwei Hexanukleotidsequenzen, die nach ihrer Position relativ zum
Transkriptionsstartpunkt als -10 und -35 Region bezeichnet werden, als
Erkennungssequenzen (Gross et al., 1998). Neben dem primären Sigmafaktor RpoD
(σ70), der die Transkription von Haushaltsgenen unter „normalen“ Bedingungen
initiiert, besitzt P. aeruginosa 23 alternative Sigmafaktoren. Diese erkennen
spezifische Promotorsequenzen und vermitteln die Adaptation an diverse
Stress-Situationen (Potvin et al., 1997). Zu den besonders gut untersuchten
alternativen Sigmafaktoren gehört RpoS, der Sigmafaktor der stationären Phase
(Fujita et al., 1994). Durch globale Transkriptomanalysen konnten in P. aeruginosa
über 700 Gene identifiziert werden, die mit Beginn der stationären Phase durch
RpoS reguliert werden (Schuster et al., 2003). Der Sigmafaktor kontrolliert unter
anderem die Transkription von Genen, die zur Synthese von Pyocyanin sowie
verschiedener Exotoxine benötigt werden. Auch die Synthese der Flagellen wird
beispielsweise durch einen alternativen Sigmafaktor (RpoF) reguliert (Starnbach et
al., 1992; Tanaka et al., 1993). Eine weitere größere Subklasse der alternativen
Sigmafaktoren bilden die ECF-Sigmafaktoren (extracytoplasmic function). Diese
Einleitung
3
regulieren Gene, deren Produkte eine Funktion außerhalb der Zelle einnehmen
(Missiakas et al., 1998). P. aeruginosa besitzt 19 ECFs, von denen bislang jedoch
nur drei näher charakterisiert wurden (Potvin et al., 2008).
Eine weitere Gruppe stellen die σ54 (RpoN)-Sigmafaktoren dar. In den meisten
Organismen, wie auch in P. aeruginosa, gibt es nur einen Vertreter dieser Klasse
(Gruber et al., 2003). RpoN unterscheidet sich in der Transkriptionsinitiation zu den
anderen Sigmafaktoren. So befinden sich zum einen die Bindestellen der σ54-
assoziierten RNAP in den Regionen -12 und -24 relativ zum Transkriptionsstartpunkt,
und zum anderen wird mindestens ein Aktivatorprotein benötigt, der unter ATP-
Verbrauch zusammen mit der holo-RNAP die Transkription initiiert (Thony et al.,
1989).
Die Expression der meisten Gene ist jedoch nicht nur von einer
Sigmafaktor-assoziierten RNAP abhängig, sondern benötigt in vielen Fällen einen
weiteren Transkriptionsregulator. Für P. aeruginosa werden 550 verschiedene
Transkriptionsregulatoren postuliert (Potvin et al., 2008). Diese können dabei
entweder als Aktivatoren oder Repressoren fungieren. Die Aktivität dieser
Transkriptionsfaktoren wird durch spezifische intra- oder extrazelluläre Reize
reguliert. Durch die Bindung beispielsweise eines Signalmoleküls, ändern sie ihre
Konformation und können im Anschluss mit der RNAP interagierten, wodurch die
Transkription des Zielgens initiiert oder verstärkt wird (Ramos et al., 2005). Die
Aktivität eines Transkriptionsfaktors kann aber auch über eine Modifikation, wie z.B.
durch eine Phosphorylierung, reguliert werden. Letzteres findet häufig im
Zusammenhang einer Signaltransduktion durch Zwei-Komponenten-Systeme statt,
die im nächsten Kapitel näher vorgestellt werden.
1.3 Zwei-Komponenten-Systeme
1.3.1 Allgemeiner Aufbau und Signaltransduktion
Zwei-Komponenten-Systeme (ZKS) sind für die Wahrnehmung und Weiterleitung von
diversen extra- und intrazellulären Signalen und die daraufolgende Auslösung einer
physiologischen Antwort zuständig (Gao et al., 2009). Obwohl sie auch in Archaeen,
Pilzen, Hefen und einigen Pflanzenarten vorkommen, spielen ZKS vor allem in der
Regulation der prokaryotischen Genexpression eine wichtige Rolle (Chang et al.,
1993; Smith et al., 1997; Nagahashi et al., 1998). Die Anzahl an ZKS variiert dabei je
Einleitung
4
nach Bakterienspezies und Lebensraum. Generell weisen frei lebende und
pathogene Arten eine höhere Anzahl an ZKS auf, als Mikroorganismen mit einer
kleinen ökologischen Nische. So besitzen beispielsweise einige Mycoplasmen, wie
der obligate Parasit Mycoplasma genitalium, der ausschließlich im Genitalbereich
von Primaten vorkommt, keine derartigen Signaltransduktionssysteme (Fraser et al.,
1995). Im Vergleich dazu zeichnet sich der Tuberkuloseerreger Mycobacterium
tuberculosis durch 28 Gene aus, die für Bestandteile von ZKS kodieren (Parish et al.,
2003). Die höchste Anzahl solcher Komponenten besitzt jedoch das opportunistische
Pathogen P. aeruginosa und nehmen eine wichtige Funktion in der Vermittlung der
Virulenz sowie der Resistenz gegenüber Antibiotika ein (Tomenius et al., 2006;
Gooderham & Hancock, 2009).
Ein typisches bakterielles ZKS besteht aus einer reizerkennenden Sensor-Histidin-
Kinase (SHK) und einem dazugehörigen Antwortregulator (AR) (Stock et al., 2000).
Beide Komponenten zeichnen sich durch einen modularen Aufbau aus (Abb. 1). Die
SHK besteht aus einer N-terminalen Sensor- und einer C-terminalen Kinasedomäne.
Letztere ist wiederum in eine katalytische Domäne (CA) und eine Dimerisierungs-
und Phosphotransferdomäne (DHp) unterteilt. Die Erkennung eines spezifischen
Reizes der Sensordomäne führt zu einer Konformationsänderung der SHK, wodurch
die CA-Domäne ein ATP bindet und den Transfer der γ-Phosphorylgruppe auf einen
konservierten Histidinrest innerhalb der DHp-Domäne katalysiert.
Alle bisherigen untersuchten SHK bilden Homodimere und in der Regel
phosphoryliert die CA-Domäne des einen Monomers den Histidinrest der DHp-
Domäne des anderen Monomers wodurch diese Reaktion in trans verläuft (Stock et
al., 2000). Die phosphorylierte Kinase wird dadurch zu einem Phosphodonor und im
Zuge der Signalweiterleitung wird die Phosphorylgruppe auf den korrespondierenden
AR übertragen.
Dieser AR kann ebenfalls in zwei Domänen, eine N-terminale Empfänger- und eine
C-terminale Effektordomäne unterteilt werden (Abb. 1). Die Phosphorylgruppe der
SHK wird auf einen konservierten Aspartatrest innerhalb der Empfängerdomäne
übertragen. Dies führt zu einer Strukturveränderung, die in der Regel eine
Dimerisierung zur Folge hat. Dadurch nimmt der AR seine aktive Form ein und kann
eine physiologische Antwort beispielsweise durch Modifikation der Transkription
spezifischer Gene auf den eingegangenen Reiz vermitteln (Stock et al., 2000).
Einleitung
5
Abb. 1: Aufbau eines klassischen bakteriellen Zwei-Komponenten-Systems Nach der Reizwahrnehmung durch die Sensordomäne der Sensorkinase kommt es zu einer Autophosphorylierung innerhalb der Kinasedomäne. Die katalytische Domäne (CA) bindet das ATP
und katalysiert den Transfer der γ-Phosphorylgruppe auf einen konservierten Histidinrest in der
Dimerisierungs-und Phosphotransferdomäne (DHp). In einem zweiten Schritt erfolgt die Übertragung der Phosphorylgruppe auf einen konservierten Aspartatrest (D) innerhalb der Empfängerdomäne des Antwortregulators. Dies bewirkt eine Konformationsänderung, worauf dieser seine aktive Form einnimmt (modifiziert nach Stock et al., 2000).
SHK besitzen neben der hier beschriebenen Kinase- und Phosphotransferaktivität
meistens zusätzlich eine intrinsische Phosphataseaktivität, durch die der AR wieder
dephosphoryliert werden kann und das System in den Ausgangszustand
zurückgesetzt wird (Kenney, 2010).
Neben dem prototypischen ZKS bestehend aus einer SHK und einem AR, gibt es
eine hohe Variabilität, wodurch der Mechanismus der Signaltransduktion deutlich
komplexer werden kann. So besteht die Möglichkeit einer Kreuzreaktion (cross talk).
Dabei kann sowohl eine SHK mehrere AR phosphorylieren (one-to-many-Prinzip) als
auch ein AR von mehreren SHK aktiviert werden (many-to-one-Prinzip) (Laub et al.,
2007). Auf diese Weise können einerseits verschiedene eingehende Signale die
gleiche Zellantwort generieren, andererseits kann so ein einzelnes Signal gleich
mehrere Gene parallel aktivieren.
Oftmals erfolgt die Weiterleitung auch über ein sogenanntes Phosphorelay-System.
Dabei erfolgt die Übertragung der Phosphorylgruppe der SHK zunächst auf ein
zwischengeschaltetes Regulatorprotein. Dieses kann direkt mit der SHK fusioniert
sein oder als alleinstehendes Protein vorliegen. Dieses leitet das Signal auf eine
Histidin-Phosphotransferase (HPt) weiter und erst in einem weiteren Schritt erhält der
finale AR die Phosphorylgruppe (Appleby et al., 1996).
Einleitung
6
1.3.2 Sensor-Histidin-Kinasen
Sensor-Histidin-Kinasen werden aufgrund ihrer Lokalisation in drei Hauptgruppen
eingeteilt (Mascher et al., 2006). Die meisten SHK sind über zwei Membranhelices in
der Membran verankert, wobei die Sensordomäne extrazelluläre Reize wahrnimmt.
Die Kinasedomäne ist dabei, wie bei allen anderen SHK auch, im Zytosol lokalisiert.
Diese SHK sind meistens an der Wahrnehmung von Nährstoffen und weiteren
kleinen gelösten Stoffen beteiligt. Eine weitere Klasse von SHK bilden membran-
durchspannende Rezeptoren, die keine periplasmatische Sensordomäne besitzen.
Sie nehmen Reize innerhalb der Zytoplasmamembran wie mechanischen Stress
oder den Tugordruck wahr. In der dritten Gruppe sind SHK zusammengefasst, die
entweder an der Membran verankert sind oder sich löslich im Zytosol befinden. Sie
nehmen neben löslichen Stoffen vor allem intrazelluläre Reize wahr. Jedoch sind nur
in wenigen Fällen die genauen Signalmoleküle bzw. Reize bekannt, die von der
Sensordomäne wahrgenommen werden (Laub, 2011).
Die Fähigkeit der verschiedenen SHK, unterschiedlichste Reize zu erkennen, geht
auf die N-terminale Sensordomäne zurück. Zu den am häufigsten vorkommenden
Sensordomänen zählen die PAS- GAF- und HAMP-Domänen. Benannt wurden
Domänen nach Proteinen in denen sie erstmals beschrieben wurden. So leitet sich
die PAS-Domäne von dem „periodic clock“-Protein (PER) aus Drosophila
melanogaster, der „aromatic hydrogen receptor translocater“ (ARNT) aus Vertebraten
und „singe minded“ (SIM) aus D. melanogaster ab (Aravind & Ponting, 1997). PAS-
Domänen können kleine Moleküle wie Häme, Flavine oder planare aromatische
Verbindungen als Kofaktor binden. Daher sind sie in der Lage Licht, Sauerstoff sowie
den Redoxzustand zu registrieren (Taylor & Zhulin, 1999). Den PAS-Domänen
strukturell sehr ähnlich sind die GAF-Domänen. Sie wurden erstmals für cGMP-
spezifische Phosphodiesterasen aus Vertebraten, cyanobakteriellen Adenylatzy-
klasen und dem bakteriellen Formiathydrolase-Transkriptionsfaktor FhlA beschrieben
(Avarind & Ponting, 1999). Sie können ebenfalls kleine Liganden binden (Ho et al.,
2000). HAMP-Domänen (beschrieben in Histidinkinasen, Adenylatzyklasen,
Methylakzeptorproteinen und Phosphatasen) hingegen leiten extrazytoplasmatische
Signale die intrazellulär lokalisierte Kinasedomäne weiter. Sie befinden sich direkt an
der Zytoplasmamembran und vermitteln den eingegangenen Reiz durch eine
Konformationsänderung (Parkinson, 2010). Im Gegensatz zu der Sensordomäne, die
aufgrund der verschiedenen Domänen sehr variabel sein kann, sind die C-terminal
Einleitung
7
gelegenen Domänen, die katalytische ATP-bindende Domäne (CA) und die
Dimerisierungs- und Phosphotransferdomäne (DHp) hochkonserviert (Grebe et al.,
1999).
1.3.3 Antwortregulatoren
Wie SHK bestehen AR ebenfalls aus zwei Domänen, einer Empfängerdomäne und
einer regulatorischen Effektordomäne. Innerhalb der N-terminalen Empfänger-
domäne befindet sich ein konservierter Aspartatrest der die Phosphorylgruppe der
SHK erhält. Alternativ dazu kann ein AR auch nur aus einer Empfängerdomäne
bestehen wie beispielsweise CheY des Chemotaxissystems aus E. coli (Karatan et
al., 2001; Galperin, 2006).
Bei einem klassischen AR ist die Effektordomäne die ausführende Domäne und
zeichnet sich entweder durch ein DNA-Bindemotiv oder durch eine Enzymaktivität
aus. Über 60% aller AR besitzen in ihrer Effektordomäne ein DNA-Bindemotiv,
sodass sie als Transkriptionsregulatoren fungieren können. Sie werden aufgrund von
Sequenz- und Strukturvergleiche mit klassifizierten AR in drei Hauptfamilien
unterteilt: OmpR-, NarL- und NtrC-ähnliche Regulatoren (Galperin, 2006) (Abb. 2).
Abb. 2: Domänenaufbau verschiedender AR mit DNA-Bindemotiven Innerhalb der DNA-bindenden AR können diese in drei Hauptklassen eingeteilt werden: AR mit einer hohen Ähnlichkeit zu OmpR mit einem winged helix turn helix-Motiv (wHTH), NarL-ähnliche AR mit einem helix turn helix-Motiv (HTH) und NtrC-ähnliche AR mit einer intrinsischen ATPase-Domäne (AAA+) und einer FIS-Domäne (verändert nach Galperin, 2006).
Die Klassifizierung der AR geht auf die unterschiedliche Ausprägung der
Sekundärstrukturelemente zurück, die an die DNA binden. Dabei zeichnet sich die
Gruppe der OmpR-ähnlichen AR durch ein sogenanntes winged helix turn helix-DNA-
Einleitung
8
Bindemotiv aus, während NarL-ähnliche AR in der Regel vier helix turn helix-
Domänen besitzen. NtrC-ähnliche AR weisen neben einem DNA-bindenden helix
turn helix-Motiv innerhalb der FIS-Domäne (factor of inversion stimulation) eine
ATPase-Domäne auf. Sie agieren als Transkriptionsaktivatoren für die σ54-assoziierte
RNAP.
1.3.4 Zwei-Komponenten-Systeme in P. aeruginosa
Die enorm hohe Anpassungsfähigkeit an verschiedenste Habitate sowie die
Pathogenität von P. aeruginosa hat zur Folge, dass der Organismus auf viele
unterschiedliche Umweltreize reagieren muss. Daher ist es nicht verwunderlich, dass
diese Spezies eine sehr große Anzahl an regulatorischen Elementen besitzt. Es
kodieren etwa 9 % aller Gene für beschriebene oder putative Transkriptionsfaktoren
sowie mögliche Bestandteile von Ein- oder Zwei-Komponenten-Systemen (Stover et
al., 2000). P. aeruginosa besitzt die größte bisher bekannte Anzahl dieser
Signalweiterleitungssysteme. Die genaue Anzahl der ZKS variiert jedoch in der
Literatur. So postulieren Stover et al. nach der Genomsequenzierung von PAO1 118
SHK und AR, während Rodriges et al. im selben Jahr 63 SHK und 64 AR postulieren
(Rodrigue et al., 2000; Stover et al., 2000). Wenige Jahre später erhöhte sich die
Anzahl der postulierten SHK und AR auf 64 SHK und 72 AR (Gooderham &
Hancock, 2009). Durch den zunehmen wissenschaftlichen Fortschritt werden
demnach immer mehr Komponenten dieser Signaltransduktionsmechanismen
entdeckt. In der Pseudomonas-Datenbank (www.pseudomonas.com) werden alle
diese Daten fortwährend aufgezeichnet und aktualisiert. Zu Beginn dieser Arbeit
(2010) waren bereits 107 beschriebene sowie putative AR in dieser Datenbank
gelistet.
1.4 Photorezeption
Die Signalwahrnehmung durch Licht ist für viele Organismen von entscheidender
Bedeutung (van der Horst et al., 2004). Dabei spielen Photorezeptoren, die in den
verschiedenen sprektralen Bereichen des Lichtes absorbieren können, eine zentrale
Rolle. In der Regel handelt es sich dabei um Chromoproteine, die aus einem apo-
Protein und einem lichtsensorischen Chromophor bestehen. Die Absorption von Licht
Einleitung
9
führt dabei meist zu einer strukturellen Änderung des Proteins. Dies induziert eine
Signaltransduktionskaskade mit einer anschließenden Aktivierung der zellulären
Antwort (Hellingwerf, 2000). Anhand des gebundenen Chromophors und somit der
Absorptionseigenschaften werden Photorezeptoren in verschiedene Klassen
eingeteilt: Die blaulichtabsorbierenden Chryptochrome, und Phototropine, die
grünlichtabsorbierenden Rhodopsine, sowie die rotlichtsensorischen Phytochrome
(van der Horst & Hellingwerf, 2004).
1.5 Phytochrome
1.5.1 Allgemeine Eigenschaften von Phytochromen
Phytochrome sind hellrot/dunkelrotlichtabsorbierende Photorezeptoren. Sie bestehen
aus einem apo-Protein und verwenden ein offenkettiges Tetrapyrrol (Bilin) als
Chromophor, welches für die Lichtrezeption verantwortlich ist (Rockwell et al., 2006).
Die Assemblierung der prosthetischen Gruppe zum holo-Phytochrom erfolgt über
einen autokatalytischen Mechanismus (Lagarias et al., 1989). Abhängig von dem
eingestrahlten Licht kommt es zu einer reversiblen Photokonversion zwischen der
hellrotlichtabsorbierenden Pr- und der dunkelrotlichtabsorbierenden Pfr-Form
(Abb. 3-A) (Braslavsky et al., 1997). Die Absorption von hellrotem Licht in der
Pr-Form führt zu einer cis/trans-Isomerisierung des Chromophors an der
C15-C16-Doppelbindung zwischen dem C- und D-Ring des Tetrapyrrols und
resultiert in der Pfr-Form. Umgekehrt bewirkt die Anregung der Pfr-Form durch
dunkelrotes Licht die Umwandlung in die Pr-Form. Beide Formen sind relativ stabil
und besitzen unterschiedliche spektrale Eigenschaften (Abb. 3-B). Durch die
Überlappung beider Spektren herrscht ein Photogleichgewicht zwischen der Pr- und
der Pfr-Form (Sharrock, 2008). Ohne Einwirkung von Licht findet eine sogenannte
Dunkelreversion statt, wobei eine langsame Isomerisierung in die Pr-Grundform
erfolgt (Chen et al., 2004).
Einleitung
10
Abb. 3: Spektrale Eigenschaften eines pflanzlichen Phytochroms (A) Cis/trans-Isomerisierung des Chromophors Phytochromobilin unter Hellrot- (660 nm) und Dunkelrotlicht (750 nm). In Abwesenheit von Licht tritt eine Dunkelreversion auf. (B) Absorptions-spektren eines pflanzlichen holo-Phytochroms unter Hellrot- und Dunkelrotlicht (modifiziert nach Chen et al., 2004).
Phytochrome wurden zuerst in Pflanzen entdeckt, in denen sie essentielle Prozesse
wie die Induktion der Keimung, der Blütenbildung sowie den Photoperiodismus
regulieren (Butler et al., 1959; Mathews, 2006). Erst viel später wurden diese
Rotlichtrezeptoren auch in Pilzen, Cyanobakterien und sogar heterotrophen
Bakterien nachgewiesen (Montgomery et al., 2002). Als Beispiel für die Bedeutung
von Phytochromen in Pilzen kann die rotlichtabhängige sexuelle Vermehrung
genannt werden (Blumenstein et al., 2005). In Cyanobakterien gibt es eine große
Variabilität an Phytochromen und Phytochrom-ähnlichen Proteinen. Über die
Funktion des klassischen Phytochroms, wie beispielsweise Cph1 aus Synechocystis
sp. PCC6803, wird eine Adaptation an die vorherrschende Lichtbedingungen
Einleitung
11
spekuliert, da eine Deletion des Gens zu einem deutlichen Wachstumsdefizit unter
Rotlichtdedingungen führt (Fiedler et al., 2004; Garcίa-Domίnguez et al., 2000). Die
Rolle dieser Rotlichtrezeptoren in heterotrophen Bakterien, vor allen in nicht-
photosynthetischen Arten, ist bisher kaum verstanden.
Innerhalb der Phytochrom-Familie gibt es in den verschiedenen Organismen sowohl
Gemeinsamkeiten, als auch Unterschiede. Der größte Unterschied besteht in der Art
des verwendeten Chromophors (Tab. 1). Die Synthese des Chromophors beginnt
jedoch immer ausgehend von einem Häm-Molekül. Durch die Spaltung des Häms an
der α-Position durch eine Hämoxygenase entsteht Biliverdin IXα (BV IXα)
(Frankenberg, 2004). Dieses offenkettige Tetrapyrrol dient fungalen und bakteriellen
Phytochromen ohne weitere Syntheseschritte als Chromophor. Cyanobakterielle und
pflanzliche Chromophore werden durch eine weitere regiospezifische Reduktion
durch Bilinreduktasen weiter zu Phycocyanobilin (PCB) bzw. Phytochromobilin (PФB)
modifiziert (Frankenberg et al., 2001).
Aufgrund der verschiedenen Bilin-Derivate sind ebenfalls die Absorptionsmaxima
verändert. BV IXα besitzt ein stärker ausgeprägtes π-Elektronensystem als PCB und
PФB, wodurch es Licht höherer Wellenlänge absorbiert (Rottwinkel et al., 2010).
Tab. 1: Eigenschaften verschiedener Chromophore
Strukturell zeichnen sich Phytochrome durch einen gemeinsamen Domänenaufbau
aus. Unabhängig von dem Organismus bestehen sie aus einer N-terminalen
photosensorischen Domäne und einer C-terminalen regulatorischen Domäne
(Abb. 4). Der Chromophor wird innerhalb der photosensorischen Domäne gebunden,
Einleitung
12
die sich wiederum in die PAS-, GAF- und PHY-Domäne unterteilt. Die PHY-Domäne
ist den GAF-Domänen sehr ähnlich und leitet sich evolutionär von dieser ab. Die
genaue Funktion ist bisher nicht bekannt, jedoch wird postuliert, dass die PHY-
Domäne einen Einfluss auf die spektrale Integrität des Phytochroms ausübt
(Montgomery & Lagarias, 2002).
Abb. 4: Allgemeine Domänenorganisation von klassischen Phytochromen Phytochrome bestehen aus einer N-terminalen photosensorischen und einer C-terminalen regulatorischen Domäne. Innerhalb der photosensorischen Domäne wird der Chromophor entweder in der PAS- oder GAF-Domäne gebunden. Die regulatorische Domäne zeichnet sich durch den Aufbau einer typischen Histidin-Kinasedomäne (HKD) einer bakteriellen SHK aus (modifiziert nach Montgomery & Langarias, 2002).
Der Chromophor wird in einer autokatalytischen Reaktion an einem konservierten
Cysteinrest im apo-Protein, über eine Thioether-Brücke, kovalent gebunden.
Allerdings unterscheidet sich in den Phytochromen verschiedener Organismen die
Binderegion des Tetrapyrrols. So binden pflanzliche und cyanobakterielle
Phytochrome das PФB bzw. PCB an einen konservierten Cysteinrest innerhalb der
GAF-Domäne, wohingegen bakterielle und fungale Phytochrome BVI Xα an einem
konservierten Cysteinrest innerhalb der PAS-Domäne assemblieren (Montgomery &
Lagarias, 2002).
Die C-terminale regulatorische Domäne der Phytochrome weist den typischen
Aufbau einer bakteriellen Histidin-Kinasedomäne (HKD) eines SHK eines ZKS auf.
Pflanzliche Phytochrome besitzen im Gegensatz zu anderen Arten keinen
konservierten Histidinrest in der regulatorischen Domäne. Sie sind Serin-oder
Threonin-Kinasen, die sich von den bakteriellen Histidin-Kinasen ableiten (Yeh et al.,
1998).
Einleitung
13
1.5.2 Phytochrome in heterotrophen Bakterien
Mit der Entdeckung eines Phytochrom-ähnlichen Proteins in dem heterotrophen
Bakterium Deinococcus radiodurans änderte sich die allgemein vorherrschende
Meinung, dass Rotlichtrezeptoren ausschließlich in phototrophen Organismen
vorkommen (Davis et al., 1999). Die Photobiologie einiger Phytochrome dieser
Organismen ist zwar bereits gut untersucht, jedoch gibt es nur wenige Beispiele in
denen die physiologische Rolle geklärt werden konnte.
Alle bislang untersuchten heterotrophen Bakterien genieren das holo-Protein durch
die Assemblierung mit BVI Xα (Bhoo et al., 2001). Anhand der spektralen
Eigenschaften lassen sich Bakteriophytochrome in zwei Klassen einteilen.
Prototypische Rotlichtrezeptoren, wie sie auch in Pflanzen vertreten sind, weisen
ohne Bestrahlung von Licht eine hellrotlichtabsorbierende Pr-Form auf. Bathy-
Phytochrome hingegen haben ihren Grundzustand im langwelligen Bereich, in der
Pfr-Form. Andere Bakterienarten wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens oder
P. syringae besitzen sogar zwei der rotlichtabsorbierenden Photorezeptoren. Die
Kinaseaktivitäten dieser Phytochrome sind bereits untersucht. In P. syringae konnte
dabei bei beiden Phytochromen eine klare chromophorabhängige, jedoch nur für
PsBphP1 eine lichtregulierte Phosphorylierungsaktivität beobachtet werden (Bhoo et
al., 2001; Schwach, 2010). In A. tumefaciens hingegen weisen beide Phytochrome
eine lichtregulierte Kinaseaktivität auf. Dabei sind diese jedoch in ihrer Aktivität
gegensätzlich. Während für AtBphP1 die Kinaseaktivität in der Pr-Form höher ist,
besitzt AtBphP2 eine höhere Autophosphorylierungsaktivität in der Pfr-Form. Beiden
gemein ist jedoch die höhere Phosphorylierungsaktivität in der apo-Form ohne
gebundenen Chromophor (Lamparter et al., 2002; Karniol et al., 2003).
1.5.3 Das Phytochromsystem aus P. aeruginosa
P. aeruginosa zählte zu den ersten heterotrophen Bakterienarten, in denen ein
Phytochrom (PaBphP) entdeckt wurde. Das Gen bphP, kodierend für das apo-
Phytochrom und ist mit der Hämoxgenase bphO zusammen in einem Operon
organisiert (Bhoo et al., 2001; Barkovits et al., 2008) (Abb. 5). Die Expression ist
zelldichteabhängig und wird durch den alternativen Sigmafaktor RpoS reguliert
(Barkovits et al., 2008). Anders als beispielsweise in D. radiodurans, P. putida oder
Rhizobium leguminosarium (Bhoo et al., 2001) ist kein putativer AR stromabwärts
Einleitung
14
von bphP lokalisiert, der an der Phytochrom-vermittelten Signaltransduktion beteiligt
sein könnte.
Abb. 5: Die genetische Organisation von bphO und bphP in P. aeruginosa Die Gene bphO, kodierend für die Hämoxygenase, und bphP, kodierend für das apo-Phytochrom, bilden ein bicistronisches Operon. Dabei liegt bphO stromaufwärts von bphP.
Biochemische Analysen anhand von rekombinant produzierten Proteinen bestätigten
die Spaltung von Häm zu BV IXα durch die Hämoxgenase BphO (Wegele et al.,
2004). Die Bindung des Chromophors an das apo-Phytochrom mit der dabei
verbundenen rotlichtinduzierten Photokonversion sowie die Kinaseaktivität von
PaBphP konnte ebenfalls bereits in vitro gezeigt werden. Dabei scheint die
Autophosphorylierung unabhängig von einem gebundenen Chromophor oder den
vorliegenden Lichtbedingungen abzulaufen (Tasler et al., 2005).
Obwohl globale Transkriptomanalysen einer ∆bphO- und ∆bphP-Deletionsmutante
eine Regulation von über 120 Genen durch das Phytochrom aufdeckten, konnte die
physiologische Funktion von PaBphP nicht geklärt werden. Allerdings fiel in diesen
Untersuchungen auf, dass etwa 50 % der identifizierten Gene zelldichteabhängig,
über das Quorum-Sensing-System (QS) reguliert werden (Barkovits et al., 2011).
1.6 Die Quorum-Sensing-Systeme in P. aeruginosa
Die Fähigkeit von Bakterien, die eigene Populationsdichte wahrzunehmen und die
Genexpression in Abhängigkeit der Zelldichte zu regulieren, wird als Quorum-
Sensing (QS) bezeichnet. Die Grundlage dieses Systems bilden kleine
Signalmoleküle (Autoinduktoren), die jede Bakterienzelle kontinuierlich durch die
Membran in ihre Umgebung abgibt. Mit zunehmender Zelldichte steigt die
Konzentration dieser Autoinduktoren somit proportional an. Bei Erreichen eines
Schwellenwertes diffundieren diese Signalmoleküle zurück in die Zelle und binden an
einen Transkriptionsregulator, der daraufhin die Expression spezifischer Gene
steuert (Waters & Bassler, 2005).
Einleitung
15
Die Fähigkeit zur Zell-Zell-Kommunikation wurde erstmals 1979 in dem marinen
Bakterium Vibrio fischeri im Zusammenhang mit der Regulation der Biolumineszenz
entdeckt (Nealson et al., 1979). Diese wird durch die beiden Genprodukte des Lux-
Operons, LuxI und LuxR, vermittelt. Die Autoinduktor-Synthase LuxI produziert
ausgehend von S-Adenosylmethionin das Signalmolekül N-(-3-oxo-hexanoyl)-L-
Homoserinlakton. Nach der Diffusion zurück in die Zelle bindet der Autoinduktor an
den Transkriptionsregulator LuxR. Neben vielen anderen Genen, induziert LuxR
auch das Lux-Operon selbst, wodurch es einer positiven Rückkopplungs-Regulation
unterliegt.
P. aeruginosa besitzt mehrere QS-Systeme die miteinander verbunden sind und
gehören dadurch zu den komplexesten bisher bekannten Regulationsnetzwerken
(Jimenez et al., 2012). Zu den Lux-Systemen, die Homoserinlaktone (HSL) als
Autoinduktoren verwenden, zählen das Las- und das Rhl-System. Diese sind
hierarchisch aufgebaut, wobei das Las- dem Rhl-System übergeordnet ist (Abb. 6).
Innerhalb des Las-Regulons synthetisiert LasI den Autoinduktor N-(3-oxo-
dedecanoyl)-L-Homoserinlakton (3-oxo-C12-HSL), welcher an den korrespon-
dierenden Transkriptionsregulator LasR bindet (Pearson et al., 1994). Dieser reguliert
unter anderem die Genexpression vieler Virulenzfaktoren, die in der akuten Infektion
involviert sind und die Wirtszellen schädigen. Darunter befinden sich verschiedene
Elastasen, Exotoxine und Proteasen (Toder et al., 1991; Gambello et al., 1993;
Jones et al., 1993).
Das zweite System bilden die Genprodukte von rhlI und rhlR, die beide ebenfalls
durch LasR induziert werden. Dabei bindet RhlR den durch RhlI synthetisierten
Autoinduktor N-butanoyl-HSL (C4-HSL) (Pearson et al., 1995). Das Rhl-System
reguliert ebenfalls viele Gene, deren Produkte entscheidend für die
Virulenzeigenschaften von P. aeruginosa sind. So unterliegen beispielsweise die
Gene für die Rhamnolipid-, Hydrogencyanid- oder Phenanzinsynthese einer Kontrolle
durch RhlR (Ochsner et al., 1994; Latifi et al., 1995). Neben diesen Faktoren wird
auch RpoS, der Sigmafaktor der stationären Phase, durch RhlR reguliert (Latifi et al.,
1996). Trotz des hierarchischen Aufbaus beider QS-Systeme, ist die Transkription
von rhlI und rhlR nicht komplett von LasR abhängig. In einer ∆lasR-Mutante ist die
Transkription dieser Gene nicht vollständig reprimiert, sondern werden verzögert
exprimiert (Schuster et al., 2003).
Einleitung
16
Zusätzlich zu den beiden dargestellten QS-Systemen die HSL als Autoinduktoren
verwenden, besitzt P. aeruginosa noch ein weiteres System, in welchem 4-Hydroxy-
2-Alkylquinole (HAQs) für die Zell-Zell-Kommunikation synthetisiert werden (Pesci et
al., 1999). Ausgehend von Anthranilat synthetisieren die Enzyme PqsABCD zunächst
das Molekül 2-Heptyl-4-quinolon (HHQ). In einem weiteren Schritt wird HHQ durch
PqsH in 2-Heptyl-3Hydroxy-4-quinolon (PQS) umgesetzt. Letzteres kann aufgrund
seiner hydrophoben Eigenschaften nicht durch die Membran diffundieren und wird
deshalb mittels Membranvesikel nach außen transportiert (Mashburn et al., 2005).
Beide, sowohl HHQ als auch PQS, fungieren als Autoinduktoren für den zugehörigen
Transkriptionsregulator PqsR (Abb. 6). Dieser wiederrum kontrolliert einige Gene, die
für verschiedene Virulenzfaktoren kodieren (Wade et al., 2005; Xiao et al., 2006).
Zum Großteil handelt es sich dabei um Gene, die ebenfalls durch LasR bzw. RhlR
induziert werden (Deziel et al., 2005). Sowohl pqsR als auch pqsH unterliegen einer
Kontrolle von LasR wodurch diese QS-Systeme miteinander verknüpft sind (Deziel et
al., 2005)
Einleitung
17
Abb. 6: Überblick über die QS-Systeme in P. aeruginosa P. aeruginosa besitzt zwei QS-Systeme, die HSL als Autoinduktoren verwenden: Das Las- und das Rhl-System. LasI produziert den Autoinduktor 3-oxo-C12-HSL, wohingegen RhlI C4-HSL synthetisiert. Beide binden an ihren dazugehörigen Transkriptionsregulator LasR bzw. RhlR und induzieren die Expression vieler Gene, sowie ihre eigene Expression. LasR kontrolliert ebenfalls die Transkription von rhlI und rhlR. Auch pqsR und pqsH unterliegen einer Kontrolle durch LasR. Die Quinolone HHQ und PQS diesen als Autoinduktoren für PqsR. Ausgehend von Anthranilat wird durch die Genprodukte von pqsABCD das Signalmolekül HHQ synthetisiert. Durch eine weitere enzymatische Katalyse von durch PqsH wird HHQ zu PQS umgesetzt. Das hydrophobe PQS wird mittels Membranvesikeln in die extrazelluläre Umgebung abgegeben (modifiziert nach Sifri, 2008).
1.7 Second messenger vermittelte Signaltransduktion durch
c-di-GMP
Neben den bereits beschriebenen ZKS und der charakteristischen Transphospho-
rylierung wird die intrazelluläre Signalweiterleitung auf ein eingehendes Signal
oftmals auch über second messenger vermittelt. Dabei handelt es sich um kleine
endogene Moleküle, deren Konzentration als Reaktion auf einen äußeren Reiz (first
messenger) hin verändert wird. In der Regel bindet solch ein Botenstoff an ein
Einleitung
18
Effektorprotein, welches daraufhin seine Konformation ändert und schließlich die
zelluläre Antwort auf das eingegangene Signal einleitet (Hengge, 2009). Dieser
Mechanismus der Signaltransduktion ist in allen Domänen des Lebens vertreten.
Sekundäre Botenstoffe auf der Basis von zyklischen Nukleotiden sind die
weitverbreitetsten Signalmoleküle und kommen sowohl in Eu- als auch in
Prokaryoten vor (Gomelsky, 2011). Zyklische Dinukleotide hingegen wurden bislang
nur in Bakterien entdeckt. Vor allem der second messenger zyklisches-di-
Guanosinmonophosphat (c-di-GMP) hat in den letzten Jahren durch die Aufdeckung
seiner Beteiligung an zentralen metabolischen Prozessen zunehmend an
Aufmerksamkeit gewonnen. Der ubiquitär in Bakterien vorkommende Botenstoff
reguliert unter anderem die Synthese von Adhäsinen, Exopolysacchariden, Alginat
sowie der Flagellen (Lee et al., 2007; Merighi et al., 2007; Wolfe et al., 2008).
Infolgedessen gilt c-di-GMP mittlerweile als der zentrale sekundäre Botenstoff für die
Regulation zwischen einer motilen und sessilen Lebensweise. Dabei ist die
intrazelluläre Konzentration von c-di-GMP entscheidend. Während ein niedriger
c-di-GMP-Spiegel die Motilität und planktonische Lebensweise fördert, induziert eine
hohe Konzentration die sessile Lebensweise und begünstigt somit die Ausbildung
von Biofilmen (Römling et al., 2005). Die Konzentration des second messengers wird
durch zwei Enzyme reguliert, die in ihrer Funktion gegensätzlich sind (Abb. 7). Dabei
katalysieren Diguanylatzyklasen (DGC) die Synthese von c-di-GMP durch die
zyklische Verknüpfung zweier Moleküle Guanosintriphosphat (GTP) über
3´-5´-Phosphodiesterbrücken. Der Abbau wird von Phosphodiesterasen (PDE) durch
die Spaltung einer dieser beiden Phosphodiesterbindungen zu dem linearen Produkt
5´-Phosphoguanylyl-(3´-5´) guanosin (pGpG) reguliert. Beide Enzymgruppen
enthalten konservierte Domänen, die nach der Aminosäuresequenz ihres
katalytischen Zentrums benannt wurden. So besitzen DGCs ein GGDEF-Motiv, PDEs
hingegen zeichnen sich durch eine EAL-Domäne aus (Hengge, 2009).
Einleitung
19
Abb. 7: Synthese und Hydrolyse von c-di-GMP Diguanylatzyklasen (DGC) mit einer charakteristischen GGDEF-Domäne katalysieren die Synthese von c-di-GMP aus zwei Molekülen Guanosintriphosphat (GTP). Phosphodiesterasen (PDE) mit einer charakteristischen EAL-Domäne hydrolysieren das zyklische Molekül zu dem linearen Produkt pGpG.
GGDEF- und EAL-Domänen kommen häufig in Kombination vor, wobei die EAL-
Domäne meist N-terminal gelegen ist. Für gewöhnlich weist dabei eine der beiden
Domänen ein degeneriertes Motiv auf, welches einen modulierenden Einfluss auf die
katalytisch aktive Domäne ausübt. Bifunktionale Proteine, die in vivo beide Aktivitäten
besitzen, sind selten (Jenal et al., 2006). Gesteuert wird der Auf- oder Abbau von
c-di-GMP meistens über eine N-terminal fusionierte Sensordomäne. Genau wie bei
SHK ist diese sehr variabel und spiegelt die Diversität der Signalintegration auf
verschiedene Reize wieder (Galperin et al., 2001). Neben PAS- und GAF-Domänen
sind DGCs und PDEs auch häufig mit REC-Domänen oder DNA-bindenden
Domänen fusioniert, wodurch sie Teil eines ZKS darstellen (Paul et al., 2004). Durch
die Wahrnehmung der vorherrschenden Umweltbedingungen über diese
Sensordomänen wird der c-di-GMP-Pool dahingehend angepasst und die
Lebensform, planktonisch oder sessil in Biofilmen, reguliert.
1.7.1 Einfluss von c-di-GMP auf den Biofilmzyklus
Sowohl eine planktonische Lebensform, als auch eine hochstrukturierte Organisation
in Biofilmen bietet den Organismen Vorteile. Frei schwimmende, planktonische
Zellen sind beispielsweise in der Lage, neue Habitate mit für sie optimalen
Nährstoffbedingungen zu erschließen. Die Ansammlung von Bakterien, umhüllt von
einer Matrix aus verschiedenen extrazellulären polymeren Substanzen (EPS), bietet
den Organismen dahingegen einen enormen Schutz gegenüber äußeren Einflüssen.
Es wird geschätzt, dass etwa 90 % aller Bakterien in einer derartigen
Lebensgemeinschaft angesiedelt sind (Costerton, 1995). Die Ausbildung eines
Einleitung
20
solchen Biofilms ist ein sehr komplexer Prozess und kann in verschiedene Stadien
eingeteilt werden. (Abb. 8). Zunächst lagern sich einzelne motile Zellen an eine
Oberfläche an (1). Es folgt die initiale Anheftung, die durch die Flagellen und TypIV-
Pili vermittelt wird. Nach der Anlagerung bilden sich die Flagellen zurück, wodurch
die Anheftung irreversibel wird (2). Parallel wird die Sekretion von EPS, vor allem das
Zuckerpolymer Alginat, induziert (Davies et al., 1993; Garrett et al., 1999). Neben
Alginat werden auch Proteine, Nukleinsäuren sowie verschiedene Lipide sezerniert
(Flemming et al., 2010). Durch die Anlagerung weiterer Zellen bilden sich zunächst
kleine Mikrokolonien aus (3). Innerhalb dieser vermehren sich die angehefteten
Bakterien und produzieren weiter EPS, wodurch der Biofilm kontinuierlich wächst und
komplexe dreidimensionale Strukturen ausbildet (4). In diesem Stadium ist er von
kleinen Gängen durchzogen, um einerseits die Nährstoffversorgung der im inneren
lebenden Zellen zu gewährleisten und andererseits anfallende Stoffwechselprodukte
abzutransportieren (Costerton, 1995; Espinosa-Urgel, 2003). Trotz dieses
Tunnelsystems ist das Milieu in einem solchen reifen Biofilm nicht homogen. Sowohl
der pH-Wert als auch der Sauerstoffgehalt sinkt mit zunehmender Schichttiefe und es
entstehen anoxische Bereiche (Xu et al., 1998). Das letzte Stadium stellt die
Auflösung des Biofilms dar (5). Dabei werden motile Zellen freigesetzt, die neue
Habitate besiedeln können.
Abb. 8: Stadien der Biofilmbildung Die Biofilmbildung kann in fünf Phasen eingeteilt werden. 1: Reversible Anheftung; 2: Irreversible Anheftung; 3: Bildung von Mikrokolonien; 4: Reifung des Biofilms, 5: Biofilmauflösung. Die genauen Vorgänge sind im Text beschrieben (entnommen aus Sauer, 2003).
Einleitung
21
Der second messenger c-di-GMP ist in allen Stadien der Biofilmbildung unmittelbar
involviert. In P. aeruginosa ist die Konzentration des sekundären Botenstoffes in
Biofilmzellen etwa 10-fach höher, als in aufgelösten Zellen (Barraud et al., 2006).
Diese Messungen korrelieren dabei mit einer niedrigen PDE-Aktivität der sessilen
bzw. einer erhöhten Aktivität der aufgelösten Zellen. Die Dispersion des Biofilms
unter nativen Bedingungen wird beispielsweise durch das endogen freigesetzte
Stickstoffmonoxid (NO), welches bei der Denitrifikation entsteht, induziert. Das
entstandene Gas hat dabei einen positiven Einfluss auf die PDE-Aktivität, wodurch
die Auflösung des Biofilms eingeleitet wird (Barraud et al., 2009). Diese Auflösung
kann auch gezielt unter Laborbedingungen durch eine Zugabe von NO oder durch
Änderung des Nährstoffangebots, wie z.B. eine erhöhte Glutamatmenge,
hervorgerufen werden (Sauer et al., 2004; Barraud et al., 2009). In P. aeruginosa
konnten bereits verschiedenen Proteine und PDEs identifiziert werden, die essentiell
für die NO-induzierten Biofilmauflösung sind (Morgan et al., 2006; An et al., 2010;
Roy et al., 2012). Gemeinsam haben diese PDEs, dass sie nicht selbst in der Lage
sind NO wahrzunehmen und die katalytische Aktivität somit nicht direkt durch NO
reguliert wird.
1.7.2 NbdA ist essentiell für die Biofilmauflösung in P. aeruginosa
Mit NbdA wurde eine PDE identifiziert, die direkt an der NO-Wahrnehmung beteiligt
zu sein scheint (Li et al., 2013). Dieses Protein zeichnet sich durch eine EAL-
Domäne und degeneriertes GGDEF-Motiv (AGDEF) aus und gehört zu einem der 16
Proteinen mit beiden Motiven (Kulasakara et al., 2006). Biochemische Analysen von
verkürzten Varianten sowie phänotypische Untersuchungen einer ∆nbdA-Mutante
bestätigten die PDE-Aktivität (Li et al., 2013; Heine, 2009). Die beiden zytosolisch
lokalisierten GGDEF- und EAL-Domänen sind mit einer N-terminal gelegenen MHYT-
Sensordomäne fusioniert. Diese Domäne wurde ebenfalls nach einer konservierten
Aminosäuresequenz benannt. Sie besteht aus sechs Transmembranhelices und
weist konservierte Methionin- und Histidinreste nahe der äußeren Membran auf.
Daher wird postuliert, dass diese Domäne putativ ein Kupferion binden kann, und
über dieses diatomische Gase wie Sauerstoff, Kohlenstoffmonoxid oder NO
wahrgenommen werden kann (Galperin et al., 2001). Anders als bei bisher in
P. aeruginosa beschriebene PDEs könnte der c-di-GMP-Abbau direkt über die
Einleitung
22
Bindung des Gases an diese Domäne reguliert werden. Die Bedeutung von NbdA
auf die NO-regulierte Biofilmauflösung konnte zudem bereits gezeigt werden (Li et
al., 2013). Dabei führt eine Deletion des Gens zu einem Verlust der NO-induzierten
Biofilmauflösung, weshalb es auf Basis dieser Funktion NO-induced biofilm
dispersion locus A, kurz NbdA annotiert wurde (Li et al., 2013).
Einleitung
23
1.8 Zielsetzung
Phytochrome sind weit verbreitete Photorezeptoren, die vor allem in autotrophen
Organismen dafür bekannt sind, zelluläre Funktionen auf hellrotes und dunkelrotes
Licht zu vermitteln. Mit fortschreitender Technik auf dem Gebiet der Genom-
sequenzierung sind Phytochrom-ähnliche Rezeptoren inzwischen auch für
heterotrophe Organismen wie Pilze und Bakterien beschrieben. Sie zeichnen durch
ihre Histidin-Kinase-Domäne als Bestandteile eines Zwei-Komponenten-Systems
aus. Obwohl die biochemischen Eigenschaften dieser Phytochrome bereits gut
verstanden sind, bleibt die Bedeutung von Rotlichtrezeptoren in nicht-
photosynthetischen, heterotrophen Bakterien immer noch offen. Zu den ersten dieser
heterotrophen Bakterienarten, in denen ein Phytochrom nachgewiesen wurde, gehört
auch der Modellorganismus P. aeruginosa.
In der vorliegenden Arbeit sollte durch eine Kombination verschiedener
experimenteller Ansätze ein Überblick über die Funktion des Phytochroms aus
P. aeruginosa (PaBphP) in vivo gewonnen werden. Durch die homologe Isolierung
des Phytochroms mit anschließender Charakterisierung der Photobiochemie,
insbesondere im Hinblick auf den nativ gebundenen Chromophor, sowie die
Untersuchung der Kinaseeigenschaften, sollte das bestehende Wissen erweitern.
Neben der Untersuchung der genetischen Regulation des Phytochroms, sollte
ebenfalls die weiterführende Signaltransduktionskaskade aufgedeckt, sowie putative
Interaktionspartner von PaBphP identifiziert werden. Darüber hinaus sollten
phänotypische Analysen von Deletionsmutanten ebenfalls Hinweise auf die Funktion
des Phytochroms in P. aeruginosa liefern.
In einem weiteren Projekt sollte die Transkriptionsregulation von nbdA, kodierend für
eine Phosphodiesterase (PDE), näher charakterisiert werden. PDEs regulieren durch
den Abbau des sekundären Botenstoffes c-di-GMP den Biofilmzyklus. Dabei ist NbdA
maßgeblich an der NO-induzierten Dispersion beteiligt. Es zeigte sich, dass NO
dabei auch einen Einfluss auf die Transkription von nbdA hat, was bisher einzigartig
für eine PDE ist. Mittels Reportergenanalysen sollte diese Regulation, mit dem Fokus
auf der Identifizierung des entsprechenden Transkriptionsfaktors, aufgeklärt werden.
Material und Methoden
24
2. Material und Methoden
2.1 Bakterienstämme
Tab. 2: Verwendete E. coli-Stämme
Stamm relevante Eigenschaften Referenz/Herkunft JM83 ara, ∆lac-pro, strA, thi, [Φ80lacZ∆M15] Vieira et al., 1982
BL21 (λDE3) F- ompZ r
-m
- lysPlacUV5-T7-GenlPlac
q-lacI Studier et al., 1990
S17-I Ec294::[RP4-2(Tc::Mu)(Km::Tn7), pro, res, recA, Tp
R, Sm
R
de Lorenzo & Timmis, 1994
Tab. 3: Verwendete P. aeruginosa Wildtypstämme
Stamm relevante Eigenschaft Referenz/Herkunft PAO1 Pseudomonas aeruginosa Wildtyp PAO1 Dunn et al., 1971
PA14 Pseudomonas aeruginosa Wildtyp UCBPP-14 Rahme et al., 1995
Tab. 4: Verwendete P. aeruginosa Deletionsstämme
Stamm relevante Eigenschaften Referenz/Herkunft PAO1∆fhpR PAO1∆fhpR::[Tc] Lewenza et al., 2005
PAO1∆rpoS PAO1∆rpoS::[Gm] Barkovits et al., 2008
PAO1∆lasR PAO1∆lasR::[Gm] Diese Arbeit
PAO1∆rpoN PAO1∆rpoN TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆rhlR PA14_∆rhlR TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆bphO PA14_∆bphO::[Gm] Heckmann, 2010, RUB
PA14_∆bphP PA14_∆bphP::[Gm] Heckmann, 2010, RUB
PA14_∆hemO PA14_∆hemO::[Gm] Diese Arbeit
Verwendete Transposonstämme für den „genetischen Screen“
PA14_∆00430 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆02260 AR CheY2, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆05320 AR PilG, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆05330 AR PilH, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆07840 AR AgtR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆06060 AR CreB, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆06950 Putativer Transkriptionsregulator, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆09690 AR BifR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆11120 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆11680 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆12780 AR RocA1, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆12810 AR RocR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆15290 Putativer Transkriptionsregulator, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆16350 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆16500 AR WspR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆17670 AR ErdR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆20780 Hypothetisches Protein, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆22940 AR GltR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆23130 Hypothetisches Protein, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆24350 AR CprR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆24710 AR RocA2, TM [Gm] Liberati et al., 20061
Material und Methoden
25
PA14_∆26570 Putativer Transkriptionsregulator, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆26830 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆27810 AR CpoR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆27940 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆27950 Hytothetisches Protein, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆30650 AR GacA, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆30830 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆31960 AR CzcR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆32580 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆33920 Putativer Transkriptionsregulator Liberati et al., 20061
PA14_∆38930 AR ErbR Liberati et al., 20061
PA14_∆39360 Putativer Transkriptionsregulator, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆41260 AR ParR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆41490 Hypotheteisches Protein, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆42970 Transkriptionsregulator Sfa2, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆45620 AR CheY, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆45880 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆46360 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆49180 AR PhoP, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆49440 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆50180 AR FleR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆50220 Transkriptionsregulator FleQ, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆52250 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆54510 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆55810 AR PprB, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆56750 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆56950 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆57140 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆58300 AR RoxR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆59770 AR RcsB, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆60260 AR PilR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆62540 AR CbrB, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆63150 AR PmrA, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆63210 PDE, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆65540 FimX, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆64050 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆64570 AR IrlR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆65880 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆67680 AR NtrC, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆68250 AR DctD, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆69470 AR AlgR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆70750 AR PhoB, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆70790 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆72720 AR MifR, TM [Gm] Liberati et al., 20061
PA14_∆72380 AR AlgB, TM [Gm] Liberati et al., 20061
*Bereitgestellt von Prof. Dr. S. Häussler, HZI Braunschweig; TM:Transposon-Mutante, CGm:15 µg/ml
Material und Methoden
26
Tab. 5: Verwendete P. aeruginosa Reportergenstämme
Stamm relevante Eigenschaften Referenz/Herkunft Untersuchung der bphOP-Promotoraktivität
PA14 bphOP-lacZ PA14 attp::pSHP25 Diese Arbeit
PA14_∆rpos bphOP-lacZ PA14∆rpos attp::pSHP25 Diese Arbeit
PA14_∆lasR bphOP-lacZ PA14∆lasR attp::pSHP25 Diese Arbeit
PA14_∆rhlR bphOP-lacZ PA14∆rhlR attp::pSHP25 Diese Arbeit
Untersuchung der bphP-Promotoraktivität
PA14 bphP-lacZ PA14 attp::pJKP01 Diese Arbeit
PAO1∆rpos bphP-lacZ PA14∆rpos attp::pJKP01 Diese Arbeit
PA14_∆lasR bphP-lacZ PA14∆lasR attp::pSHP25 Diese Arbeit
PA14_∆rhlR bphP-lacZ PA14∆rhlR attp::pJKP01 Diese Arbeit
Untersuchung der nbdA-Promotoraktivität
PAO1 nbdA-lacZ PAO1attp::pSHP48 Diese Arbeit
PAO1∆fhpR nbdA-lacZ PAO1∆fhpR attp::pSHP48 Diese Arbeit
PAO1∆lasR nbdA-lacZ PAO1∆lasR attp::pSHP48 Diese Arbeit
PA14_∆rhlR mucR-lacZ PA14∆ rhlR attp::pSHP48 Diese Arbeit
PAO1∆rpoN nbdA-lacZ PAO1∆rpoN attp::pSHP48 Diese Arbeit
Untersuchung der PA4739-Promotoraktivität („genetischer Screen“)
PA14 4739-lacZ PA14 attp::pKBP10 Heckmann, 2010, RUB
PA14_∆bphP 4739-lacZ PA14_∆bphP attp::pKBP10 Heckmann, 2010, RUB
PA14_∆38930 4739-lacZ PA14_∆38930 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB
PA14_∆43340 4739-lacZ PA14_∆43340 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB
PA14_∆03470 4739-lacZ PA14_∆03470 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB
PA14_∆46990 4739-lacZ PA14_∆46990 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB
PA14_∆46360 4739-lacZ PA14_∆46360 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB
PA14_∆29730 4739-lacZ PA14_∆29730 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB
PA14_∆26830 4739-lacZ PA14_∆26830 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB
PA14_∆26970 4739-lacZ PA14_∆26970 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB
PA14_∆30580 4739-lacZ PA14_∆30580 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB
PA14_∆00430 4739-lacZ PA14_∆00430 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆02260 4739-lacZ PA14_∆02260 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆05320 4739-lacZ PA14_∆05320 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆05330 4739-lacZ PA14_∆05330 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆07840 4739-lacZ PA14_∆07840 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆06060 4739-lacZ PA14_∆06060 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆06950 4739-lacZ PA14_∆06950 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆09690 4739-lacZ PA14_∆09690 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆11120 4739-lacZ PA14_∆11120 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆11680 4739-lacZ PA14_∆11680 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆12780 4739-lacZ PA14_∆12780 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆12810 4739-lacZ PA14_∆12810 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆15290 4739-lacZ PA14_∆15290 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆16350 4739-lacZ PA14_∆16350 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆16500 4739-lacZ PA14_∆16500 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆17670 4739-lacZ PA14_∆17670 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆20780 4739-lacZ PA14_∆20780 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆22940 4739-lacZ PA14_∆22940 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆23130 4739-lacZ PA14_∆23130 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆24350 4739-lacZ PA14_∆24350 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆24710 4739-lacZ PA14_∆24710 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆26570 4739-lacZ PA14_∆26570 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆26830 4739-lacZ PA14_∆26830 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆27810 4739-lacZ PA14_∆27810 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆27940 4739-lacZ PA14_∆27940 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆27950 4739-lacZ PA14_∆27950 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆30650 4739-lacZ PA14_∆30650 attP::pKBP10 Diese Arbeit
Material und Methoden
27
PA14_∆30830 4739-lacZ PA14_∆30830 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆31960 4739-lacZ PA14_∆31960 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆32580 4739-lacZ PA14_∆32580 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆33920 4739-lacZ PA14_∆33920 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆38930 4739-lacZ PA14_∆38930 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆39360 4739-lacZ PA14_∆39360 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆41260 4739-lacZ PA14_∆41260 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆41490 4739-lacZ PA14_∆41490 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆42970 4739-lacZ PA14_∆42970 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆45620 4739-lacZ PA14_∆45620 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆45880 4739-lacZ PA14_∆45880 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆46360 4739-lacZ PA14_∆46360 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆49180 4739-lacZ PA14_∆49180 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆49440 4739-lacZ PA14_∆49440 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆50180 4739-lacZ PA14_∆50180 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆50220 4739-lacZ PA14_∆50220 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆52250 4739-lacZ PA14_∆52250 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆54510 4739-lacZ PA14_∆54510 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆55810 4739-lacZ PA14_∆55810 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆56750 4739-lacZ PA14_∆56750 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆56950 4739-lacZ PA14_∆56950 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆57140 4739-lacZ PA14_∆57140 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆58300 4739-lacZ PA14_∆58300 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆59770 4739-lacZ PA14_∆59770 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆60260 4739-lacZ PA14_∆60260 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆62540 4739-lacZ PA14_∆62540 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆63150 4739-lacZ PA14_∆63150 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆63210 4739-lacZ PA14_∆63210 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆65540 4739-lacZ PA14_∆65540 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆64050 4739-lacZ PA14_∆64050 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆64570 4739-lacZ PA14_∆64570 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆65880 4739-lacZ PA14_∆65880 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆67680 4739-lacZ PA14_∆67680 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆68250 4739-lacZ PA14_∆68250 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆69470 4739-lacZ PA14_∆69470 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆70750 4739-lacZ PA14_∆70750 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆70790 4739-lacZ PA14_∆70790 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆72720 4739-lacZ PA14_∆72720 attP::pKBP10 Diese Arbeit
PA14_∆72380 4739-lacZ PA14_∆72380 attP::pKBP10 Diese Arbeit
2.2 Vektoren und rekombinante Plasmide
Tab. 6: Verwendete Vektoren
Vektor relevante Eigenschaften Referenz/Herkunft
mini-CTX1 Tc
r; selbtintegrierbarer Vektor mit Ω-Frt-
attP-MCS, ori, int und oriT, TcR
Becher & Schweizer, 2000
pASK-IBA3 PtetA, OtetA, tet-Repressor, Strep-tagII, AmpR IBA GmbH
pASK-IBA3_bphP Kodierender Bereich von bphP aus PAO1 in pASK-IBA3, Amp
R
Tasler et al., 2005
pBBR-mcs2 Mob, pBBR1-Replicon broad-host-range-Vektor, Kan
R,
Kovach et al., 1995
pBSL15 pUC-Derivat, Amp
R, Kan
R, Ursprung
Kanamycin-Kassette für pSHP48 Alexeyev, 1995
Material und Methoden
28
pET14b-lasR Kodierender Bereich von lasR aus PAO1 in pET14b mit Amp
R
Seet et al., 2011
pET21a DrbphR Kodierender Bereich von bphR aus Deinococcus radiodurans pET21a , Kan
R
Bhoo et al., 2001
pET52-PsbphP1-holo Kodierender Bereich des PsbphOP1-Operons aus P. syringae in pET52 , Kan
R
Shah et al., 2012
pEX18Ap_∆hemO Plasmid zur Deletion von hemO, Basisvektor: pEX18Ap, Amp
R
Prof. Dr. A. Oglesby-Sherrouse; University of Maryland
pHERD20T PBAD araC; E. coli/P. aeruginosa shuttle vector, erlaubt homologe Überproduktion in P. aeruginosa, Tc
R
Qiu et al., 2008
pJK01 Promotorregion von bphP (849 bp) in mini-CTX1, Tc
R
Konieczny, 2011
pSB219.9A pRIC380, Plasmid zur Deletion von lasR, Basisvektor: pEX18Ap, Amp
R, Gm
R
Beatson et al., 2002
pUCPKS_rhlR Kodierender Bereich von rhlR in pUCPKS, lac-Promotor, Amp
R
Dekimpe & Deziel, 2009
pYPRUB137II pACYC184-Derivat, Ursprung „lacZ-Kan
R-
oriT-Kassette, KanR, Cm
R
Pfänder, RUB
pSHP10 Promotorbereich von nbdA (621 bp) in mini-CTX1, Tc
R
Heine, 2009
pSHP23 Kodierender Bereich von PA14_02260 in pASK-IBA3, Amp
R
Diese Arbeit
pSHP24 Kodierender Bereich von PA14_27950 in pASK-IBA3,Tc
R
Diese Arbeit
pSHP25 Promotorregion von bphOP in miniCTX1 (550bp),Tc
R
Diese Arbeit
pSHP42
pASK-IBA3_bphP mit „lacZ-KanR-oriT-
Kassette aus pYPRUB137II, zur C-terminal chromosomalen Integration des Strep-tagII von bphP, Amp
R, Kan
R
Diese Arbeit
pSHP46 pHERD20T mit bphP-Strep-tagII aus pASK-IBA3_bphP, zur homologen Überproduktion in PA14, Tc
R, Amp
R
Diese Arbeit
pSHP48 Promotorregion von nbdA in mini-CTX1 mit Kan
R-Kassette, Tc
R, Kan
R
Diese Arbeit
pSHP59 Kodierender Bereich von PA14_62540 in pASK-IBA3, Amp
R
Diese Arbeit
2.3 Oligonukleotide
Die in Tabelle 7 aufgeführten Oligonukleotide (Primer) dienten zur Amplifikation
bestimmter DNA-Abschnitte mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und wurden
von der Firma MWG-Biotech AG, Ebersberg bezogen.
Tab. 7: Verwendete Oligonukleotide
Name Sequenz (5´ 3´) Primer zur Erstellung der Reportergenfusion pSHP25 (Promorregion von bphOP)
pSHP25 fwd, XhoI GCCTCGAGGAGCGCGCCCGCT
pSHP25 rev, HindIII GCAAGCTTCGCACCCCGGTTGCCTG
Primer zur Überprüfung der chromosomalen Integration der Reportergenfusionen
miniCTX fwd ACCTAGGATCTCGATCCCGGTCG
miniCTX rev ATCCACCGGCGCGCGTAATACG
Material und Methoden
29
Primer zur Erstellung der Überproduktionskonstrukte (CheY2, PA14_24950, CbrB)
pSHP23 fwd, BsaI ATGGTAGGTCTCAAATGGGCAAACCGATTCTGATCGTCG
pSHP23 rev, BsaI ATGGTAGGTCTCAGCGCTGGGCAGGACCTTGCGCGTCA
pSHP24 fwd, BsaI ATGGTAGGTCTCAAATGAGTACCGGTAAAATCCAGTTTGCC
pSHP24 rev, BsaI ATGGTAGGTCTCAGCGCTATGGCGCTCCAGGGCGCTGA
pSHP59 fwd BsaI ATGGTACGTCTCAAATGGCACATATTCTGATCGTCGAAGAC
pSHP59 rev BsaI ATGGTACGTCTCAGCGCTCGAGTCGGCCGA GGCCCCT
Primer zur Erstellung der Promotorfragmente der LasR-Bindestudien (DMSA)
rhlR fwd TTGTCACAACCGAGTATCG
rhlR rev TCTCGCTACGCAAACCGTCC
bphO fwd TGCTACCGGGTGGTGCAG
bphO rev GGTGGCGTCGCGGAGT
bphP fwd CGGGGCTACGGCCAGGCAAC
bphP rev CCTCCTCGCGGCAAGCGAGAACAT
2.4 Medien und Zusätze
2.4.1 Medien
Alle Medien wurden 20 min bei 121 °C und 120 kPa autoklaviert. Hitzelabile
Komponenten wurden sterilfiltriert (Millipore Membranfilter, Porendurchmesser
0,2 µm) und den autoklavierten Medien bei einer Temperatur unter 60 °C zugesetzt.
Für feste Medien wurden zusätzlich, soweit nicht anders angegeben, 1,5 % (w/v)
Agar vor dem Autoklavieren zugegeben.
LB-Medium
Als Komplexmedium wurde für E. coli und P. aeruginosa Luria-Bertani (LB) Medium
verwendet.
Trypton 10 g/l Hefe-Extrakt 5 g/l NaCl 10 g/l Synthetisches Medium
Für die Promotorstudien unter Zugabe von Stickstoffmonoxid-Donoren Nitrat und
Nitrit wurde ein synthetisches Medium (SM) als Minimalmedium verwendet (Wood,
1978).
Glutamat 6,76 g/l KH2PO4 4,76 g/l
NaNO3 3,4 g/l MgSO4 x 7*H2O 0,09 g/l
FeSO4 0,0022 g/l CuSO4 x 5*H2O. 0,0037 g/l (NH4)2Mo2O7 0,00019 g/l
Material und Methoden
30
2.4.2 Antibiotika und Medienzusätze
Alle Antibiotika und Medienzusätze wurden sterilfiltriert (Millipore Membranfilter,
Porendurchmesser 0,2 µm) und dem abgekühlten Medium nach dem Autoklavieren
bzw. der Kultur zur Induktion der Proteinproduktion zu verschiedenen Zeitpunkten
zugegeben.
Tab. 8: Verwendete Antibiotika
Antibiotikum E. coli [µg/ml] P. aeruginosa [µg/ml] Ampicillin 100 -
Carbenicillin - 500
Tetrazyklin 10 100
Gentamicin 10 200
Kanamycin 50 200
Tab. 9: Verwendete Zusätze
Zusatz Stammlösung Endkonzentration x-Gal 100 mg/ml 100 µg/ml
Succrose 50 % (w/v) 5 % (w/v)
Arabinose 50 % (w/v) 0,2-1 % (w/v)
AHT 2 mg/ml 0,2 µg/ml
2.5 Enzyme, Antiserum, Kits und Chemikalien
2.5.1 Enzyme, Antiserum und Kits
Die Enzyme (Tab. 10) wurden inklusive ihrer zugehörigen Puffersysteme
nach Angaben des Herstellers verwendet.
Tab.10: Verwendete Enzyme
Enzym Hersteller Restriktionsendonukleasen Fermentas, Thermo Scientific
RNase A Fermentas, Thermo Scientific
T4-Ligase Fermentas, Thermo Scientific
Pfu-Polymerase RUB, Bochum LS Biologie der Mikroorganismen
Taq-Polymerase Biotherm, Genecraft
Tab. 11: Verwendetes Antiserum
Antiserum Hersteller Antikörperkonjugat Strep-Tactin Alkalische Phosphatase
IBA GmbH
Material und Methoden
31
Tab. 12: Verwendete Kits
Bezeichung Hersteller
Nucleo Spin Extract II Macherey & Nagel
Nucleo Spin Plasmid Macherey & Nagel
2.5.2 Chemikalien
Tab. 13: Verwendete Chemikalien
Artikel Hersteller
[γ32P]-ATP Hartmann Analytic
ß-Mercaptoethanol Serva
Acryalamid/Bisacrylamid (30%) BioRad
Agar-Agar Roth
Agarose Serva
Anhydrotetrazyklin (AHT) IBA GmBH
Antibiotika Serva, Sigma Aldrich
Ammoniumpersulfat BioRad
Arabinose Sigma-Aldrich
Bacto Tryptone Difco
5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) Sigma-Aldrich
5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-Galaktopyranosid (x-Gal)
Roth
Bromphenolblau Serva
Chloroform Prolabo
Coomassie Brilliant Blue R 250 Serva
Desthiobiotin Sigma-Aldrich
Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) Fermentas, Thermo Scientific
DMSO J.T.Barker
EDTA Merck
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich
Hefe-Extrakt Gibco BRL
2-[4´-Hydroxy-Benzenazo] Benzoesäure (HABA) Sigma-Aldrich
MAHMA NONOate Sigma-Aldrich
p-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) Biomol
o-Nitrophenyl β-D-Galaktosid (ONPG) Serva
Rinderserumalbumin (BSA) Serva
S-Nitroglutathion Sigma-Aldrich
Sodiumdodecylsulfat (SDS) Applichem
Sodium Nitroprussid (SNP) Sigma-Aldrich
Strep-Tactin Sepharose IBA GmbH
TEMED BioRad
Tween-20 Serva
Material und Methoden
32
2.6 Geräte und Software
Tab. 14: Verwendete Geräte
Gerät Bezeichnung Hersteller
Agarose-Gelelektrophorese ChomPhor L mini BioRad
Autoklav LVSA50/70 Zirbus
Blotapparatur Trans-Blot® SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell
BioRad
Chromatographie-System Äkta Explorer 10 Amersham Bioscienes
Geldokumentationsanlage Multi Image Light Cabinet Biozym
Inkubationsschüttler SM-30 Control Bühler
Innova 4230 New Brunswick Scientifics
Aquatron Infors
Feinwaage BL1500 Sartorius
PCR-Gerät My CyclerTM BioRad
pH-Messgerät Seven Easy Mettler Toledo
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab
8453 UV visible system Agilent Technologies
Genesys 20 Thermo Scientific
Phospoimager BAS 1000 Fuji
Phospho-Imager-Platte BAS-MS2040 Fuji
Rotoren SS34 Sorvall
SLA 3000 Sorvall
A4-44 Eppendorf
Reinstwasseranlage Purelab Ultra ELGA
Rotlichtfilter 690 nm Oriel Instruments
750 nm Kodak
SDS-PAGE Apparatur Mini PROTEAN® 3 System BioRad
Spannungsgeber PowerPac 300 BioRad
Thermoblock Thermostat plus Eppendorf
Ultraschallgerät Sonifier 250 Branson
Zentrifugen Tischzentrifuge5415 D Eppendorf
Kühlzentrifuge 5810 Eppendorf
Kühlzentrifuge RC-5C Sorvall
Alle weiteren Geräte entsprachen den laborüblichen Standards. Tab. 15: Verwendete Software/Open Source-Programme
Software Hersteller/Beschreibung Clone Manager Sci-Ed
Seqman DNASTAR
Protein calculator http://protcalc.sourceforge.net
Prodoric Database http://prodoric.tu-bs.de
Pseudomonas-Datenbank http://pseudomonas.com
Pfam Database http://pfam.sanger.ac.uk
Material und Methoden
33
2.7 Mikrobiologische Methoden
2.7.1 Bakterienkultivierung
2.7.1.1 Plattenkulturen
Für die Anzucht von E. coli und P. aeruginosa auf Festmedium wurden Bakterien aus
einer Glycerinkultur (vgl. 2.7.2) mit einer sterilen Impföse entnommen und auf eine
LB-Agar-Platte ausgestrichen. Diese war bei Bedarf mit entsprechenden Zusätzen
versehen. Die Platten wurden anschließend über Nacht (üN) bei 37 °C inkubiert und
dienten als Stammplatten für Vorkulturen in Flüssigmedium.
2.7.1.2 Flüssigkulturen
Für Vorkulturen wurden je nach Bedarf 5 ml Medium in Reagenzgläsern oder
20-50 ml Medium in Schikanekolben mit entsprechenden Antibiotika versetzt und mit
einer Einzelkolonie einer Stammplatte inokuliert. Die Ansätze wurden üN bei 37 °C
und 200 Umdrehungen pro Minute (UpM) im Brutroller bzw. Rundschüttler inkubiert.
Diese Vorkulturen werden im Weiteren als Übernacht-Kulturen (ÜNK) bezeichnet.
2.7.2 Lagerung von Bakterien
Die Lagerung von Bakterienstämmen erfolgte in Glycerinkultur. Dazu wurden 0,7 ml
einer ÜNK mit 0,7 ml einer 80 %-igen (v/v) Glycerin-Stammlösung versetzt und bei
-80 °C gelagert.
2.7.3 Messung der Zelldichte
Die Messung der Zelldichte einer Flüssigkultur wurde photometrisch über die
optische Dichte (oD) bei einer Wellenlänge von 578 nm bestimmt. Eine oD578 nm von
1 entspricht etwa 1x109 Zellen/ml Kultur. Als Referenz diente das entsprechende
Medium.
Material und Methoden
34
2.7.4 Anzucht von P. aeruginosa unter verschiedenen Bedingungen
P. aeruginosa wurde unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen angezogen.
Ausgehend von einer aerob angewachsenen ÜNK bei 37 °C und 200 UpM wurden
Hauptkulturen mit einer oD578nm von 0,1, ohne Zugabe von Antibiotika, inokuliert. Für
das Wachstum unter aeroben Bedingungen wurden 30 ml LB- bzw. SM beimpft und
in 100 ml-Schikanekolben bei 37 °C und 200 UpM inkubiert. Sauerstofflimitierende
Bedingungen wurden durch die Inkubation von 40 ml Medium bei 50 UpM
geschaffen. In LB-Medium wurden dabei zudem 50 mM des alternativen
Elektonenakzeptors Natriumnitrat gegeben (in SM bereits enthalten). Es wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten Proben für die Bestimmung der Zellzahl über Messung
der oD578 nm bzw. zusätzlich Proben für die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität
(vgl. 2.10) entnommen.
2.8 Molekularbiologische Methoden
2.8.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen
Die Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen erfolgte nach der Calciumchlorid
Methode (Sambrook et al., 1989). Dazu wurden 70 ml LB-Medium 1/100 mit einer
ÜNK des gewünschten E. coli Stammes inokuliert und bei 37 °C und 200 UpM bis zu
einer oD578 nm von 0,4-0,6 inkubiert. Anschließend wurden je 25 ml Kultur in
Zentrifugenröhrchen überführt und die Zellen 10 min bei 4000 UpM und 4 °C
sedimentiert (Eppendorf 5810, Rotor A4-44). Das Pellet wurde in 12,5 ml kaltem
TMF-Puffer aufgenommen und 1 h auf Eis inkubiert. Nach anschließender
Zentrifugation für 10 min und 4000 UpM bei 4 °C (Eppendorf 5810, Rotor A4-44)
wurde das Sediment in 2,5 ml TMF-Puffer resuspendiert und 750 µl kaltes Glycerol
zugegeben. Die Zellen wurden in Aliquots zu 200 µl bei -80 °C gelagert.
TMF-Puffer
CaCl2 100 mM MnCl2 x 2*H2O 40 mM RbCl x 4*H2O 50 mM
Material und Methoden
35
2.8.2 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen
Für die Transformation von Plasmid-DNA (Sambrook et al., 1989) in chemisch
kompetente E. coli Zellen wurden 100 µl TMF-Puffer und 0,1 - 1 µg DNA bzw. 20 µl
Ligationsansatz zu den kompetenten Zellen gegeben. Nach einer 30-minütigen
Inkubation auf Eis erfolgte ein Hitzeschock bei 42 °C für 2 min. Anschließend wurden
0,7 ml LB-Medium zugegeben und bei 37 °C für 60-90 min bei 200 UpM inkubiert.
Volumina von 50 µl, 100 µl und der sedimentierte, resuspendierte Rest wurden auf
Selektivmedium ausplattiert und üN bei 37 °C inkubiert. Ansätze ohne zugegebene
Plasmid-DNA dienten der Kontrolle.
2.8.3 Diparentales Mating zur Transformation in P. aeruginosa
Die Konjugation von Plasmid-DNA in P. aeruginosa erfolgte mit Hilfe von E. coli
S17-I-Zellen. Diese enthalten für diesen Prozess benötigten tra-Gene. Dafür wurden
ÜNK von E. coli S17-I-Zellen mit dem entsprechenden Plasmid, sowie der
gewünschte P. aeruginosa Stamm ohne Antibiotika üN angezogen. Für das
diparentale Mating wurden die beiden Kulturen in einem Verhältnis 9:1
(Donor:Rezipient) in einem Endvolumen von 2 ml gemischt und 30 min bei RT
inkubiert. Der Ansatz wurde anschließend 1 min bei 4000 UpM zentrifugiert
(Eppendorf 5415 D), das Pellet in 100 µl LB vorsichtig resuspendiert, als Tropfen auf
eine LB-Platte gegeben und für 24 h bei 37 °C inkubiert. In dieser Zeit wird das
mobilisierbare Plasmid von E. coli nach P. aeruginosa übertragen. Die Zellen wurden
anschließend mit einer Glaspipette von der Platte abgenommen, auf
LB-Selektivplatten ausgestrichen und bei 37 °C für 24 h-48 h inkubiert.
2.8.4 Präparation von Plasmid-DNA
Die zur Plasmid-Präparation verwendete Methode beruht auf dem Prinzip der
alkalischen Lyse (Birnboim & Doly, 1979). Dazu wurden 1,5 ml einer E. coli ÜNK mit
dem entsprechenden Plasmid 1 min bei 13 000 UpM sedimentiert (Eppendorf
5415 D) und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 100 µl Mix 1
aufgenommen und nach Zugabe von 200 µl Mix 2 mehrmals invertiert. Nach 3-5 min
bei RT wurde anschließend 150 µl Mix 3 dazugegeben, gut gemischt und 10-60 min
auf Eis inkubiert. Zelltrümmer sowie die präzipitierte chromosomale DNA wurden
Material und Methoden
36
durch eine Zentrifugation bei 13 000 UpM (15 min, Eppendorf 5415 D) sedimentiert.
Die im Überstand enthaltene Plasmid-DNA wurde abgenommen und verbleibende
Proteinverunreinigungen durch Zugabe von 400 µl Phenol/Chlorform/Isoamylalkohol
(Verhältnis 25:24:1) entfernt. Der Ansatz wurde gemischt und anschließend 3 min bei
13 000 UpM zentrifugiert (Eppendorf 5415 D). Die Oberphase wurde erneut
abgenommen und mit 400 µl Isoamylalkohol/Chloroform (Verhältnis 24:1) versetzt
und 3 min bei 13 000 UpM zentrifugiert (Eppendorf 5415 D). Die darauf folgende
Ethanolfällung diente der Entfernung von Salzen und anderen Verunreinigungen. Zu
der Oberphase wurden 1000 µl Ethanol (100 % (v/v)) dazugegeben und für
mindestens 30 min bei -20 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Präzipitation der
Plasmid-DNA durch eine 15-minütige Zentrifugation bei 13 000 UpM (Eppendorf
5415 D). Die Oberphase wurde verworfen und die DNA wurde mit 1000 µl Ethanol
(70 % (v/v)) gewaschen (13 000 UpM, 2 min; Eppendorf 5415 D). Der Überstand
wurde restlos abgenommen und das Pellet bei RT getrocknet. Die gewonnene
Plasmid-DNA wurde in 30-100 µl A. dest. aufgenommen, für 20 min bei 70 °C gelöst
und anschließend bei -20 °C gelagert.
Lösungen für die Plasmid-Präparation
Mix 1 (pH 8) Tris-HCl 50 mM
EDTA 10 mM
Mix 2 NaOH 200 mM
SDS 1 % (w/v)
Mix 3 (pH 5,5) Kaliumacetat 3 M Natriumformiat 1,8 M
2.8.5 Präparation chromosomaler DNA aus P. aeruginosa
Zur Isolierung von genomischer DNA aus P. aeruginosa wurden 1,5 ml einer ÜNK mit
einem Volumen Chloroform/Phenol/Isoamylalkohol (Verhältnis 25:24:1) versetzt und
der Ansatz für 5 min bei 13 000 UpM und 4 °C zentrifugiert (Eppendorf 5810 R, Rotor
F45-30-11). Die Oberphase wurde abgenommen, mit einem Volumen Chloroform
versetzt und erneut 5 min bei 13 000 UpM und 4 °C zentrifugiert (Eppendorf 5810 R;
Rotor F45-30-11). Der erneut erhaltenen Oberphase wurden 1000 µl eiskaltes
Material und Methoden
37
Ethanol (100 % (v/v)) zugegeben und 5 min bei 13 000 UpM und 4 °C zentrifugiert
(Eppendorf 5810 R, Rotor F45-30-11). Das Sediment wurde anschließend mit
Ethanol (70 % (v/v)) gewaschen (5 min, 13 000 UpM, 4 °C; Eppendorf 5810 R, Rotor
F45-30-11) und bei 37 °getrocknet. Die isolierte chromosomale DNA wurde in 50 µl
A. dest. aufgenommen, 10 min bei 70 °C gelöst und bei -20 °C gelagert.
2.8.6 Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration
Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA-Lösungen erfolgte
photometrisch (Nanodrop, Peqlab) durch Ermittlung der Absorption bei 260 nm und
280 nm. Eine oD260 nm von 1 entspricht einer Doppelstrang-DNA (dsDNA)-
Konzentration von etwa 50 µg/ml. Für die Bestimmung des Reinheitsgrades von
DNA-Lösungen wurde der Quotient der Absorption bei 260 nm (DNA) und 280 nm
(Protein) gebildet. Dieser sollte für eine nahezu proteinfreie Lösung zwischen 1,8 und
2 liegen.
2.8.7 Amplifikation von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) diente der Amplifikation von DNA-Abschnitten
(Mullis et al., 1987). Bei dieser Methode wird die Eigenschaft der DNA-Polymerase
ausgenutzt, einzelsträngige DNA-Matrizen von einem Startpunkt aus zu
vervollständigen. Als Startpunkt dienen Primer (Oligonukleotide), die komplementär
zu den Randbereichen des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts sind. Es wurde
sowohl die thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq), als auch
die aus Pyrococcus furiosus (Pfu) verwendet. Ein typischer PCR-Ansatz setzte sich
wie folgt zusammen:
PCR-Ansatz
Template-DNA (33 ng/µl) 1,5 µl Primer fwd (20 µM) 1 µl Primer rev (20 µM) 1 µl dNTPs (25 mM) 1 µl DMSO (10 % v/v) 2,5 µl
Material und Methoden
38
Verwendung bei Taq-Polymerase zusätzlich:
10-fach Taq-Puffer 5 µl Taq-Polymerase 0,5 µl A.dest. ad 50 µl Verwendung von Pfu-Polymerase zusätzlich:
PCR-Puffer 5 µl Pfu-Polymerase 1 µl A.dest. ad 50 µl
Die Amplifikation der DNA wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Amplifikationsbedingungen
Erste Denaturierung 98 °C 2 min Denaturierung 95 °C 1 min Annealing 55-65 °C 1 min 35x Elongation 72 °C 2 min/kb Produktgröße (Pfu) 72 °C 1 min/kb Produktgröße (Taq) Finale Elongation 72 °C 10 min
Die Überprüfung der Amplifikate erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese.
2.8.8 Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese diente der Analyse von PCR-Amplifikaten, DNA-
Restriktionen, der Mengen- und Größenabschätzung linearisierter DNA sowie der
präparativen Isolierung von DNA-Fragmenten (Sambrook et al, 1989). Dabei trennen
sich die negativ geladenen DNA-Fragmente in einem elektrischen Feld proportional
zum negativen Logarithmus ihrer Größe in Richtung Anode auf. Es wurden
1-3 %-ige (w/v) Agarosegele verwendet. Die entsprechende Menge Agarose wurde
in TAE-Puffer gelöst und aufgekocht. Die DNA-Proben wurden in 5-fach
DNA-Probenpuffer aufgenommen und in die Taschen gegeben. Die Trennung
erfolgte bei einer Spannung von 90-120 V. Die Größen- bzw. Mengenabschätzung
erfolgte durch Vergleich mit einem zusätzlich aufgetragenen Größenstandard („Gene
Ruler DNA Ladder Mix“; Fermentas, Thermo Scientific). Die Visualisierung der DNA
erfolgte im Anschluss mit Ethidiumbromid (0,05 % (v/v)). Ethidiumbromid interkaliert
Material und Methoden
39
in die DNA und die Fragmente können anschließend unter UV-Licht bei einer
Wellenlänge von 312 nm detektiert werden.
Lösungen und Puffer für die Gelelektrophorese
TAE-Puffer (pH 8) Tris-Acetat 40 mM EDTA 1 mM 5-fach-DNA-Probenpuffer EDTA 250 mM Glycerin 49,98 % (v/v) Bromphenolblau 0,04 % (w/v)
2.8.9 Reinigung von DNA-Fragmenten
Die Reinigung von PCR-Produkten erfolgte mit Hilfe des Kits „Nucleo Spin
Extraction II“ der Firma Machery & Nagel nach Angaben des Herstellers. Die DNA
wurde anschließend in 15-50 µl A. dest. aufgenommen.
2.8.10 Hydrolytische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Die gezielte Spaltung von DNA erfolgte mittels Restriktionsendonukleasen. Diese
Enzyme erkennen spezifische DNA-Sequenzen, hydrolisieren die Phosphodiester-
bindungen und führen so zur Spaltung der DNA. Die verwendeten Restriktions-
endonuklasen entsprechen dem Typ II und spalten die DNA innerhalb oder nahe
ihrer Erkennungssequenz. Die Durchführung der Restriktionen erfolgte nach
Angaben des Herstellers (Fermentas, Thermo Scientific). Die Spaltprodukte wurden
mittels Agarose-Gelelektrophorese (vgl. 2.8.8) überprüft.
2.8.11 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligation von DNA-Fragmenten in einen restringierten Vektor wird durch die T4-
Ligase katalysiert. Die Ligase bewirkt, unter ATP-Hydrolyse, die kovalente
Verknüpfung benachbarter 3`-Hydroxy- und 5`-Phosphatenden doppelsträngiger
DNA-Moleküle (Sambook et al., 1989). Die Phosphodiesterbindung kann dabei
zwischen zwei komplementären, überhängenden Enden („sticky ends“) oder
zwischen zwei glatten Enden („blunt ends“) gebildet werden. Für die Ligation von
Material und Methoden
40
DNA-Fragmenten mit einem Vektor wurde ein 3-facher Überschuss an DNA-Insert-
Fragment eingesetzt. Der Ansatz wurde entweder 1 h bei 16 °C oder üN bei 4 °C
inkubiert. Die Ligase wurde durch Erhitzen auf 80 °C für 10 min inaktiviert.
Anschließend erfolgte eine Transformation in chemisch kompetente E. coli-Zellen
(vgl. 2.8.2).
2.8.12 Sequenzierung
Die in dieser Arbeit hergestellten Konstrukte wurden durch Sequenzierung überprüft.
Diese wurde von der Firma MWG (Ebersberg) durchgeführt. Die Auswertung der
Sequenzierung erfolgte computerbasierend mit dem Programm Seqman der Firma
Lasergene.
2.9 Promotoranalysen
Die Regulation von Genen kann mittels Reportergenfusionen analysiert werden.
Dabei wird der Promotorbereich des zu untersuchenden Gens entweder
trankriptionell oder translational mit einem gewünschten Reportergen fusioniert. Über
die Messung der Aktivität des gebildeten Reporterenzyms wird indirekt die Aktivität
des Promotors bestimmt. Das in dieser Arbeit verwendete promotorlose lacZ-
Reportergen aus dem Laktose-Operon von E.coli kodiert für die ß-Galaktosidase.
Über die Umsetzung eines alternativen Substates zu einem Farbstoffe durch die
ß-Galaktosidase kann somit die Stärke der Genexpression ermittelt werden.
2.9.1 Herstellung von lacZ-Reportergenfusionen
Für die Erstellung der Reportergenfusionen wurde der Vektor mini-CTX1 verwendet
(Becher & Schweizer, 2000). Dieser Vektor besitzt ein promotorloses lacZ-Gen
stromabwärts der multiple cloning site (MCS) mit einer eigenen Shine-Delgarno-
Sequenz und einer RNAseIII Schnittstelle. So wird ein translationaler Einfluss des
eingebrachten Promotorbereichs auf die entstandene ß-Galaktosidase verhindert.
Der Vektor besitzt weiterhin eine attp-Seite und ist somit in der Lage ist in die
genetische Plattform, den attB-Locus, in das Genom zu P. aeruginosa zu integieren.
Dies erfolgt durch eine Interagase-vermittelte Rekombination.
Material und Methoden
41
Für die Konstruktion der Reportergenfusionen wurde zunächst ein etwa 600 bp
langes Fragment der Promotorregion, ausgehend von genomischer DNA aus
P. aeruginosa, mittels PCR amplifiziert. Dabei wurden etwa 500 bp aus dem
stromaufwärts des annotierten Startcodons und 100 bp der kodierenden Sequenz
gewählt. Die verwendeten Primer besaßen an ihren 5´-Enden Restriktions-
schnittstellen, die eine gerichtete Klonierung in den gewünschten Vektor
ermöglichten (Tab. 7).
Nach Amplifikation der gewünschten Promotorbereiche wurden diese gereinigt und
mit entsprechenden Restiktionsendonukleasen verdaut. Die Fragmente wurden
anschließend in den Vektor ligiert, in chemisch kompetente JM83 Zellen transformiert
und die Transformanden auf Tetrazyklin selektioniert. Nach Isolierung der Plasmid-
DNA folgten eine Restriktionsanalyse zur Überprüfung sowie eine Sequenzierung der
Konstrukte. Diese wurden anschließend in E. coli S17-Zellen transformiert, mittels
diparentalen Mating in den gewünschten P. aeruginosa Stamm eingebracht und
erneut auf Tetrazyklin selektioniert. Eine erfolgreiche Integration wurde, neben der
Antibiotikaresistenz, durch Isolierung von genomischer DNA mit einer
anschließenden PCR-Reaktion verifiziert. Die verwendeten Primer (Tab. 7) binden an
den Randbereichen der MCS des mini-CTX1-Vektors und eine Amplifikation ist nur
durch eine erfolgreiche chromosomale Integration des Vektors möglich.
Die Herstellung des Plasmids pSHP48 zur Analyse der nbdA-Expression erfolgte
Analog der beschriebenen Methode. Aufgrund der Tetrazyklinresistenz der FhpR-
Transpononmutante, in dieser die Reportergenaktivität gemessen werden sollte,
wurde in das Reportergenplasmid (pSHP10) anschließend eine Kanamycin-
Resistenzkassette (aus pBSL15) eingebracht. Die Selektion erfolgte nach dem
diparentalen Mating somit auf Tetrazyklin und Kanamycin.
2.9.2 Konstitutive Expression von rhlR
Ein positiver Einfluss von RhlR auf die Promotoraktivtät wurde mittels einer
plasmidkodierten konstitutiven Expression von rhlR ermittelt (Dekimpe & Deziel,
2009). Dazu wurde das Plasmid (pUCPKS-rhlR, Dekimpe & Deziel, 2009) mittels
diparentalen Mating in die entsprechenden P. aeruginosa-Reportergen-stämme
gebracht. Durch die im LB-Medium enthaltene Laktose wird die Expression von rhlR
Material und Methoden
42
durch den N-terminal funionierten lac-Promotor geringfügig, jedoch kontinuierlich
induziert.
2.9.3 Bestimmung der ß-Galaktosidase-Enzymaktivität
Die Promotoraktivität der untersuchten Gene wurde durch die Aktivität der gebildeten
Menge an ß-Galaktosidase ermittelt. Die Bestimmung erfolgte nach Miller (Miller,
1970), bei der die ß-Galaktosidase-Aktivität quantitativ über die Spaltung des
farblosen Substrats o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid (ONPG) in Galaktose und
den gelben Farbstoff o-Nitrophenolat ermittelt wird. Letzteres wird dabei
photometrisch bei einer Wellenlänge von 420 nm gemessen, wodurch die relative
Aktivität der gebildeten ß-Galaktosidase berechnet werden kann.
Für die Bestimmung der Promotoraktivität wurden Hautkulturen mit einer oD578nm von
0,1 angelegt und zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums Proben für die
spätere Aktivitätsbestimmung entnommen. Das Probenvolumen variierte je nach Zell-
dichte zwischen 1 ml und 30 µl.
Die Proben wurden 5 min bei 13 000 UpM zentrifugiert (Eppendorf 5415 D) und der
Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 800 µl Z-Puffer, 25 µl Chloroform und
25 µl SDS (0,1 w/v) versetzt um die Zellmembranen zu permeabilisieren. Der Ansatz
wurde mehrmals invertiert und anschließend 5 min bei RT inkubiert. Gestartet wurde
die Reaktion durch Zugabe von 200 µl ONPG-Lösung (4 mg/ml). Nach eintretender
Gelbfärbung wurde die Reaktion durch Zugabe von 500 µl Na2CO3 (1 M) abgestoppt.
Trat keine Färbung ein, erfolgte das Abstoppen des Ansatzes nach 20 min. Die
Proben wurden für 20 min bei 13 000 UpM zentrifugiert (Eppendorf 5415 D) und der
Überstand photometrisch bei 420 nm gemessen. Als Referenz diente A. dest..
Die ß-Galaktosidase-Aktivität in Miller-Units [MU] wurde nach folgender Gleichung
bestimmt.
Material und Methoden
43
oD420nm Aktivität in Miller-Units: t [min] × OD578 nm× V [ml] oD420nm Optische Dichte des Reaktionsansatzes nach Abstoppen der Reaktion oD578nm Optische Dichte der eingesetzten Zellsuspension V [ml] Volumen der eingesetzten Zellsuspension t [min] Zeit der Enzymreaktion bis zum Abstoppen Die Anzahl der Miller-Units gibt die spezifische Aktivität in µmol des gespaltenen
Substrats (ONPG) pro min und Zelldichte (oD578nm) an (Miller et al., 1970).
Z-Puffer Na2HPO4 60 mM NaH2PO4 40 mM KCl 10 mM MgSO4 1 mM ß-Mercaptoethanol 50 mM
2.10 Herstellung von Deletionsmutanten
Zur Herstellung einer PA14_∆lasR- bzw. PA14_∆hemO-Deletionsmutante wurde das
Plasmid pSB219.9A (Beatson et al., 2002) bzw. pEX18Ap_∆hemO (Prof. Dr. A.
Oglesby-Sherrous, University of Maryland) verwendet. Diese Konstrukte basieren auf
dem Suizid-Vektor pEX18Ap und beinhalten die flankierenden Bereiche der zu
deletierenden Gene. Zwischen diese Bereiche wurde außerdem zu
Selektionszwecken jeweils eine Gentamicin-Resistenzkassette eingebracht. Für die
Deletion der Gene wurden die Plasmide zunächst in E. coli S17-I Zellen transformiert
und mittels diparentalen Mating in P. aeruginosa eingebracht. Die Selektion erfolgte
anschließend auf LB-Platten mit Carbenicillin (alternativ zu Ampicillin für
P. aeruginosa) und Gentamicin. Nur die P. aeruginosa-Zellen, die den Suizidvektor
stromaufwärts oder stromabwärts des Zielgens in das Genom integrierten, konnten
auf diesem Medium wachsen (Abb. 9). Erst durch ein weiteres cross-over im zweiten
homologen Bereich erfolgt die Deletion des Gens, wodurch der restliche
Plasmidanteil herausgeschnitten wird. Dieses kann durch das auf dem Suizid-Vektor
enthaltende sacB-Gen, welches für eine Levansucrase kodiert, induziert werden. Die
Material und Methoden
44
Levansucrase wandelt den Zucker Succrose enzymatisch in ein toxisches Produkt
um. Daher können nur Kolonien auf Succrose wachsen, die das sacB-Gen nicht
mehr besitzen. Es handelt sich dabei um einen negativen Selektionsmarker. Die
Selektion erfolgte auf LB-Platten mit 5 % Succrose (w/v) und Gentamicin. Die
gewünschten Kolonien konnten auf diesem Medium wachsen und zeigten sich
sensitiv gegenüber Carbenicillin.
Abb. 9: Schematische Darstellung zur Konstruktion von Deletionsmutanten Die Deletion auf der Basis des Suizid-Vektors pEX18Ap erfolgt durch eine doppelte homologe Rekombination in das Genom von PA14. Gm: Gentamicin-Resistenzkassette; sacB: kodierend für die Levansucrase; bla: Ampicilin-Resistenzkassette. Eine detailierte Beschreibung ist dem Text zu entnehmen.
2.11 DNA mobility shift assay (DMSA)
Eine direkte DNA-Protein-Interaktion kann in vitro anhand von DNA mobility shift
assays (DMSA) nachgewiesen werden. Dabei werden beide Komponenten in einem
Ansatz inkubiert und anschließend elektrophoretisch aufgetrennt. Eine Bindung des
Proteins an die DNA führt zu einer Laufweitenverschiebung. In dieser Arbeit wurde
die Bindung von LasR an die Promotorregionen von bphO und bphP untersucht.
Dafür wurde zunächst ausgehend von genomischer DNA diese Bereiche, sowie als
Positivkontrolle die Promotorregion von rhlR, mittels PCR amplifiziert. Nach
Material und Methoden
45
anschließender Reinigung der Fragmente wurden diese auf eine Konzentration von
50 ng/µl eingestellt.
Nach Inkubation der Fragmente mit dem gereinigten Transkriptionsregulator (vgl.
2.13.6) für 20 min bei RT, wurden die Proben über ein 3 %-iges Agarosegel
aufgetrennt. Die DNA wurde anschließend duch Inkubation des Agarosegels via
Etidiumbromid visualisiert. Zu jedem Ansatz wurde der unspezifische Kompetitor
poly-dl-dc (eng.: Poly (deoxyinosinic-deoxycytidylic) acid sodium salt) gegeben umd
unspezifische Bindungen zu minimieren. LasR benötigt unter nativen Bedingungen
das Signalmolekül 3-oxo-C12-HSL zur Dimerisierung und wurde daher sowohl bei
der Anzucht, Reinigung als auch bei der Durchführung der DMSA hinzugegeben.
Ansatz (10 µl)
DNA (50 ng) 1 µl poly-dl-dc 1 µl Protein 0,1 - 0,6 µg 3-oxo-C12-HSL 5 µM Bindepuffer 1-5 µl
Bindepuffer
Tris-HCl, pH 7,5 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM MgCl2 5 mM Glycerol 2,5 % NP-40 0,05 %
2.12 Phänotypische Untersuchungen
2.12.1 Osmotischer Stress
Die Tolerenz gegenüber osmotischem Stress in Form von hohen Salz-
konzentrationen wurde anhand von Hochsalz-LB-Platten untersucht. Dafür wurden
ausgehend von Hauptkulturen (oD578 nm 3,5) Verdünnungsreihen (10-1 - 10-8) angelegt
und jeweils 2 µl auf eine LB-Platte, die nach dem Autoklavieren mit 0,9 M NaCl
versehen war, aufgebracht. Diese wurden anschließend bei 37 °C für 48 h inkubiert.
Material und Methoden
46
2.12.2 Motilität
Die Motilität wurde anhand von LB-Platten mit einer Agarkonzentration von 0,3 %
und 0,5 % untersucht. Petrischalen wurden mit 25 ml des Mediums befüllt und 30 min
unter einer Sterilbank getrocknet. Direkt im Anschluss wurden 5 µl einer Hauptkultur
(oD578 nm 3,5) auf die Platte aufgetropft und 16 h bei 37 °C inkubiert.
2.12.3 SDS-Hemmhoftest
Die Wirkung von SDS auf das Wachstumsverhalten wurde anhand eines
Hemmhoftests durchgeführt. Dafür wurden 50 µl einer Hauptkultur (oD578 nm 3,5) auf
eine LB-Agar-Platte ausplattiert. Anschließend wurden Filterpapierplättchen
(Durchmesser 0,55 mm) mit 5 µl 10%-igem SDS versehen und auf die Platte gelegt.
Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37 °C wurden die entstandenen
Hofdurchmesser bestimmt.
2.12.4 Extraktion von 4-Hydroxy-2-alkyl-quinolonen (HAQ)
Die Analyse der produzierten HAQs erfolgte mittels dünnschichtchromatografischer
Trennverfahren (Jensen et al., 2006). Ausgehend von einer Hauptkultur (oD578 nm 3,5)
wurden 2 ml in ein Eppendorfgefäß überführt und die Zellen durch Zentrifugation
(2 min, 13 000 UpM, Eppendorf 5415 D) pelletiert. Die Extraktion der HAQs erfolgte
durch Zugabe von 1000 µl Dichlormethan zu je 500 µl des erhaltenen Überstandes.
Die Ansätze wurde gründlich gemischt und erneut zentrifugiert (10 min, 13 000 UpM,
Eppendorf 5415 D). Die in der unteren organischen Phase befindlichen HAQs
wurden entnommen und üN eingedampft. Für die Dünnschichtchromatografie wurden
Kieselgelplatten (60F254, Merck) verwendet die zuvor 30 min in einer 5 %-igen
KH2PO4 (w/v) Lösung getaucht und 1 h bei 100 °C aktiviert wurden. Die Isolierten
HAQs wurden in 12 µl Dichlormethan aufgenommen und auf die Platte aufgetragen.
Als Laufmittel diente ein Gemisch aus 95:5 Dichlormethan/Methanol (v/v). Die
Visualisierung erfolgte unter UV-Licht (312 nm).
Material und Methoden
47
2.13 Proteinbiochemische Methoden
2.13.1 Heterologe Proteinproduktion in E. coli
2.13.1.1 Produktion von Strep-tagII-Fusionsproteinen
Die Herstellung von C-terminalen Strep-tagII Fusionsproteinen erfolgte auf der Basis
des Vektors pASK-IBA3 der Firma IBA. Die Expression wird dabei durch einen
Anhydrotetrazyklin (AHT)-induzierbaren tetA-Promotor reguliert. Die verwendeten
Konstrukte wurden jeweils mittels gerichteter Kolnierung über BsaI-
Restriktionsschnittstellen hergestellt (pSHP23, pSHP24, pSHP59). Für die
Proteinproduktion wurden die Konstrukte in E. coli BL21(DE3)-Zellen transformiert
und je 1 l LB-Medium 1/100 der entsprechenden ÜNK unter Selektionsdruck
(Amp 100 µg/ml) inokuliert und bei 37 °C und 120 UpM inkubiert. Bei Erreichen einer
oD578 nm von 0,5 wurde die Kultur auf 17 °C abgekühlt und die Expression durch
Zugabe von 2 µg/ml AHT induziert. Nach 16 h wurden die Zellen durch eine
15-minütige Zentrifugation bei 4 °C (Sorvall RC-3C, SLA 3000, 4000 UpM) geerntet
und bis zur weiteren Verarbeitung bei -20 °C gelagert.
2.13.1.2 Produktion von (His)6-tag Fusionsproteinen
Ausgehend einer ÜNK von E. coli BL21(DE3)-Zellen mit dem entsprechenden
Konstrukt wurde 1 l LB-Medium 1/100 unter Selektionsdruck (Kan 100 µg/ml)
inokuliert und bis Erreichen einer oD578 nm von 0,5 bei 37 °C und 120 UpM inkubiert.
Nach Abkühlen der Kultur auf 17 °C wurde die Proteinproduktion durch Zugabe von
1 mM IPTG induziert, üN weiter inkubiert und anschließend geerntet (15 min, Sorvall
RC-3C, SLA 3000, 4000 UpM, 4 °C).
2.13.2 Homologe Proteinproduktion in P. aeruginosa
Die homologe Proteinproduktion von PaBphP erfolgte mittels des Shuttle-Vektors
pHERD20T (Qiu et al., 2008). Dieser Expressionsvektor besitzt einen Arabinose-
induzierbaren pBAD-Promotor. Aufgrund eines fehlenden Affinitäts-tags des Vektors
für eine weitere affinitätschromatographische Reinigung wurde das bphP-Gen mit
dem fusionierten Strep-tagII aus dem bereits vorliegenden Vektor pASK-IBA3_bphP
(Tasler et al., 2005) durch gerichtete Klonierung in den Vektor eingebracht (pSHP46).
Anschließend erfolge ein diparentalen Mating nach P. aeruginosa. Für die
Material und Methoden
48
Proteinproduktion wurde ausgehend von einer ÜNK 2 l LB-Medium 1/100 inokuliert
und unter Selektionsdruck (Tet 100 µg/ml) bei 37 °C und 120 UpM inkubiert. Bei
Erreichen einer oD578 nm von 3,0 wurde die Expression durch Zugabe von 1% (w/v)
Arabinose induziert und nach weiteren 2 h die Zellen geerntet (15 min, 4°C,
4000 UpM, Sorvall RC-3C, SLA 3000).
2.13.3 Chromosomal integrierte PaBphP Strep-tagII-Fusion
Für die Isolierung von PaBphP unter der Kontrolle des nativen Promotors wurde das
Gen chromosomal mit einem Strep-tagII fusioniert. Dies erfogte auf der Basis des
bereits vohandenen Vektors pASK-IBA_bphP (Tasler et al., 2005). Dieser Vektor
besitzt jedoch nur einen “origin of transfer” (oriT) für E. coli, nicht aber für
P. aeruginosa. Daher wurde ein entsprechender oriT zunächst, kombiniert mit einer
Kanamycin-Resistenzkassette (aus pYPRUB137II), in das Konstrukt eingebracht
(pSHP42). Nach Übertragung des Plasmids mittels diparentalen Mating nach
P. aeruginosa erfolgte die Selektion auf Kanamycin und Carbenicillin. Das Plasmid ist
nicht in der Lage in P. aeruginosa frei zu replizieren und es erfolgt eine einfache
homologe Rekombination in das Chromosom, wodurch das native bphP-Gen gegen
das plasmidkodierte Strep-tagII-fusionierte bphP ersetzt wird. Für die Isolierung des
PaBphPs wurden 4 l des Stammes 1/100 mit einer ÜNK inokuliert und unter
Selektionsdruck (Kan 200 µg/ml) bei 37 °C und 120 UpM inkubiert. Bei Erreichen
einer oD578 nm von 3,5 wurden die Zellen geerntet (15 min, 4°C, 4000 UpM, Sorvall
RC-3C, SLA 3000).
2.13.4 Zellaufschluss
Die geernteten Zellen wurde auf Eis aufgetaut und in Waschpuffer (10 ml pro 1 ml
Pellet) resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte mittels Ultraschallbehandlung
(Sonifier 250, Branson, 5-15 x 30 s, 50 % Amplitude). Im Anschluss wurden die
Zelltrümmer durch Zentrifugation für 1 h bei 19000 UpM (Sorvall, SS34, 4 °C)
sedimentiert und der erhaltene Rohextrakt mit den löslichen Proteinen zweimal
filtriert (Millipore, Membranfilter, Porendurchmesser 0,45 µm).
Material und Methoden
49
2.13.5 Affinitätschromatographische Reinigung der Fusionsproteine
Die Reinigung der Strep-tagII fusionierten Proteine erfolgte mittels einer Strep-Tactin
Sepharose Tropfsäule mit einem Säulenvolumen (SV) von 0,5 – 3 ml. Diese wurde
zunächst mit 5 SV Waschpuffer äquilibriert und anschließend der Rohextrakt
aufgetragen. Anschließend wurde die Säule mit mindestens 10 SV Waschpuffer
gewaschen. Die Elution der Proteine erfolgte mittels Desthiobiothin (2,5 mM in
Elutionspuffer). Es wurden 6 – 10 Elutionsfraktionen á 0,5 – 1 ml Eluat gesammtelt.
Die Reinigung von (His)6-tag-Fusionsproteine erfolgte an Ni-NTA Tropfsäulen mit
einem SV von 1 ml. Der Reinigungsprozess erfolgte analog der Reinigung von Strep-
tagII-Fusionsproteinen. Die Fusionsproteine wurden mittels Imidazol (150 mM in
Elutionspuffer) eluiert.
Alle erhaltenen Eluate wurden im Anschluss mittels SDS-PAGE auf ihren
Proteingehalt und Reinheit überprüft (vgl. 2.13.7).
Puffer für die Reinigung von Strep-tagII-Fusionsproteinen
Waschpuffer Tris-HCl pH 8,0 100 mM NaCl 150 mM Elutionspuffer
Waschpuffer mit Desthiobiothin 2,5 mM
Puffer für die Reinigung von (HIS)6-Fusionsproteinen
Waschpuffer pH 8,2 Na2HPO4 50 mM NaCl 300 mM
Elutionspuffer pH 7,0 Waschpuffer mit Imidazol 150 mM
2.13.6 Reinigung des Transkriptionsregulators LasR
Die Überproduktion von LasR erfolgte unter Verwendung des IPTG-induzierbaren
Plasmids pET14b-lasR rekombinant in E. coli BL21(DE3)-Zellen (Qihui et al., 2011).
Für die Expression wurde LB-Medium mit 2 µM 3-oxo-C12-HSL verwendet. Der
Material und Methoden
50
Autoinduktor wird von LasR gebunden und erhöht die Löslichkeit des Proteins. Es
wurde 1 l Medium mit einer ÜNK 1/100 inokuliert und bei 37 °C und 120 UpM bis
Erreichen einer oD578 nm von 0,5 inkubiert. Nach Abkühlen der Kultur auf 18 ° C
wurde die Proteinproduktion durch Zugabe von 500 µM IPTG induziert, üN weiter
inkubiert und anschließend die Zellen geerntet (15 min, 4 °C, 4000 UpM, Sorvall RC-
3C, SLA 3000). Das Pellet wurde in 25 ml Lysepuffer aufgenommen und die Zellen
mittels Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die Reinigung erfolgte mit Hilfe eines
Äkta Chromatographie Systems (Äkta Prime, Amersham Biosciences). Der erste
Reinigungsschritt erfolgte durch auftragen des Lysats auf eine HiTrapTM-Heparin HP
Säule (GE Healtcare). Die Matrix aus Heparin-Sepharose ist ein Polyanion und somit
negativ geladen. Proteine die eine positive Nettoladung besitzen werden so durch
elektrostatische Wechselwirkungen gebunden.
Nach der Waschung mit 5 SV Lysepuffer erfolgte die Elution des Proteins durch
einen NaCl-Gradienten (150 mM-1000 mM). Die Elutionsfraktionen wurden mittels
SDS-PAGE analysiert und die proteinhaltigen Fraktionen vereinigt. Das
anschließende Auftragen dieser Fraktionen auf eine Anionenaustauschersäule
(MonoQ) diente der Entsalzung. Der aufgefangene Durchlauf wurde zur weiteren
Reinigung erneut auf die HiTrapTM-Heparin HP-Säule gegeben und anschließend
eluiert.
Lysepuffer
Tris-HCl ph 7,5 25 mM NaCl 150 mM DTT 1 mM EDTA 1 mM Glycerol 10 % Tween-20 0,05 % 3-oxo-C12-HSL 200 nM
2.13.7 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ermöglicht eine vertikale
Auftrennung der Proteine unter denaturierenden Bedingungen. Das denaturierend
wirkende anionische Detergenz SDS überdeckt die Eigenladung der Proteine,
wodurch sie nur aufgrund ihrer molekularen Masse in einem elektrischen Feld
getrennt werden (Laemmli, 1970). Es wurden 5,25 %-ige Sammelgele zur
Fokussierung der Proteine und 10 bzw. 15 %-ige Trenngele zur Auftrennung
Material und Methoden
51
verwendet. Die Verwendung von großporigen Sammelgelen und kleinporigen
Trenngelen erhöht die Bandenschärfe und Trennleistung der SDS-PAGE
(Righetti, 1990). Die Proteinproben wurde vor dem Auftragen mit 2-fach
SDS-Probenpuffer versetzt und 2 min bei 95 °C inkubiert und 1 min bei 13 000 UpM
zentrifugiert (Eppendorf 5451 D). Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei
einer konstanten Spannung von 200 V (Mini Protean 3 System, Biorad) in
Elektrophoresepuffer. Als Größenreferenz diente der „Prestaind Protein Ladder“ von
Fermentas.
Im Anschluss wurden die aufgetrennten Proteine mittels einer Coomassielösung in
dem Polyacrylamidgel fixiert und angefärbt. Durch die Behandlung mit einer
Entfärbelösung wurde die Hintergrundfärbung entfernt. Alternativ wurden die
Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert. In diesem Fall erfolgte keine Färbung.
Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE
4 x Trenngelpuffer Tris-HCl pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % (w/v)
4 x Sammelgelpuffer Tris-HCl pH 6,8 1,5 M SDS 0,4 % (w/v) Sammelgel (Acrylamid-Konz. 5,25 %) Acrylamid/Bisacrylamid (30 %) 1,4 ml 4 x Sammelgelpuffer 2,0 ml A. dest. 4,6 ml APS 10 % (w/v) 30 µl TEMED 20 µl
Trenngel (Acrylamid-Konz. (10/15 %)) Acrylamid/Bisacrylamid (30 %) 6,7 ml/8,0 ml 4 x Sammelgelpuffer 4 ml/4 ml A. dest. 5,3 ml/4 ml APS 10 % (w/v) 80 µl/80 µl TEMED 8 µl/8 µl Die Mengenangaben von Sammel- und Trenngel beziehen sich jeweils auf vier Gele. Elektrophoresepuffer Tris-HCl pH 8,8 50 mM Glycin 380 mM SDS 0,1% (w/v)
Material und Methoden
52
4 x SDS-Probenpuffer Tris-HCl pH 6,8 100 mM SDS 110 mM Glycerin 40 % (w/v) ß-Mercaptoethanol 2 mM Bromphenolblau 1 % (w/v)
Färbelösung Essigsäure 10,% (v/v) Isopropanol 30,% (v/v) Coomassie Brillant Blue-G250 0,25 % (w/v) Entfärbelösung Ethanol 30 % (v/v) Essigsäure 10 % (v/v)
2.13.8 Western-Blot-Transfer von Proteinen
Der Western-Blot ist eine Technik, mit Hilfe der die durch SDS-PAGE aufgetrennten
Proteine durch Elektrotransfer auf eine Membran irreversibel übertragen werden
können. Dazu wurde eine PVDF-Membran zunächst mit Methanol aktiviert. Diese,
sowie zwei dicke Blotpapiere und das SDS-Gel wurden anschließend in Towbinpuffer
äquilibriert. Die Proteine wurden durch das „semidry-Blot“ Verfahren auf die
Membran bei einer Spannung von 15 V für 30 min transferiert (BioRad).
Towbin-Puffer Tris-HCl pH 8,3 25 mM Glycin 192 mM
Im Anschluss erfolgte ein immunochemisches Nachweisverfahren mittels
Antikörperkonjugat gegen die immobilisierten Fusionsproteine.
2.13.9 Immunologischer Nachweis von Strep-tagII-Fusionsproteinen
Nach Transfer der Proteine auf deine PVDF-Membran wurde zur Absättigung
unspezifischer Antikörperbindungen die Membran zunächst 1 h bei RT oder üN bei
4 °C mit BSA blockiert. Die überschüssige Blockierungslösung wurde durch
dreimaliges Waschen für 5 min mit PBST-Puffer entfernt. Die Behandlung mit 2 µg/ml
Avidin in PBST-Puffer verhindert eine endogene Reaktion mit unspezifisch
Material und Methoden
53
biotinylierten Proteinen. Nach 10-minütiger Inkubation wurde die Membran 1 h mit
dem Antikörperkonjugat Strep-Tactin Alkalische Phosphatase (IBA, 3 µl in 10 ml
PBS-Puffer) inkubiert. Anschließend wurde die Membran dreimal mit PBST-Puffer
und zweimal mit PBS-Puffer für je 1 min gewaschen. Die Detektion erfolgte in AP-
Puffer mit je 33 µl Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und 5-Bromo-4Chlor-
3-indolylphosphat (BCIP). Die an den Antikörper gekoppelte Alkalische Phosphatase
katalysiert das NBT und BCIP, sodass eine bläuliche Farbreaktion eintritt. Die
Reaktion wurde im Anschluss durch die Zugabe von H2O gestoppt.
Puffer und Lösungen für die Antikörperbehandlung
10 x PBS-Puffer NaCl 1,37 M KCl 27 mM Na2HPO4 50 mM KH2PO4 15 mM
Blockierungslösung
BSA 5 % (w/v) Tween 20 0,5 % (v/v)
in 1 x PBS-Puffer
PBS-Tween-Puffer Tween 20 0,1 % (v/v) in 1 x PBS-Puffe
AP-Puffer Tris-HCl pH 9,5 100 mM MgCl2 5 Mm NaCl 100 mM
NBT 100 mg/ml NBT in 70 % DMF
BCIP 50 mg/ml BCIP in DMF
2.13.10 Dialyse
Die Umpufferung von Proteinlösungen erfolgte je nach Volumen in
Dialyseschläuchen (Volumen > 1ml) oder in Dialyseknöpfen (Volumen < 1 ml) gegen
Material und Methoden
54
das mind. 100-fache Volumen des gewünschten Puffers. Die Auschlussgrenze
betrug dabei je nach verwendetem Dialyseschlauch 10 kDa bzw. 4 kDa.
2.13.11 Konzentrieren von Proteinen
Die Einengung von Proteinen erfolgte mit Hilfe von Centricon 10 (Amicon)
Ultrafiltrationsmembrankonzentratoren mit einem Ausschlussvolumen von 10 kDA
nach Angaben des Herstellers.
2.13.12 Photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Konzentration der gereinigten Proteine wurde spektroskopisch bei einer
Wellenlänge von 280 nm bestimmt. Bei dieser Wellenlänge absorbieren die
Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Durch ihre Häufigkeit in einem
Protein kann der Extinktionskoeffizient ermittelt werden. Dieser Wert wurde mit Hilfe
des Computerprogramms ProteinCalculator bestimmt.
Die Proteinkonzentration wurde nach dem Lambert-Beer-Gesetz ermittelt:
c [mol/l)= A280nm/ε280nm x d
c [mol/l]: Proteinkonzentration
A280 nm: Absorption bei 280nm
ε280nm [M-1cm-1]: molarer Extinktionskoeffizient bei 280nm
d [cm]: Schichtdicke der Küvette
2.13.13 Proteinbestimmung nach Bradford
Die Gesamtproteinkonzentration von Rohextrakt wurde mittels Bradford-Reagenz
(BioRad) nach Angaben des Herstellers bestimmt. Dazu wurde zunächst eine
Eichgerade mittels Rinderserumalbumin (BSA) mit verschiedenen Konzentrationen
erstellt (0,05/0,1/0,2/0,4 µg/µl). Von jeder Verdünnung wurden in einer Doppel-
bestimmung 20 μl mit 1 ml Bradford-Reagenz versetzt, 10 min bei RT inkubiert und
anschließend die Absorption bei 595 nm gegen den Leerwert (20 μl A. dest. in 1 ml
Bradford-Reagenz) gemessen und aus den erhaltenen Werten eine Eichgerade
erstellt. Der Rohextrakt wurde im Verhältnis 1/10, 1/50 und 1/100 verdünnt und wie
Material und Methoden
55
beschrieben vorgegangen. Über die Absoption konnte mit Hilfe der erstellten
Eichgerade anschließend die Konzentration bestimmt werden.
2.13.14 UV/Vis-Spektroskopie
Bakterielle Phytochrome können ausgehend von dem absorbierten Licht in zwei
verschiedenen Konformationen vorliegen. Nach Absorption von hellrotem Licht
(690 nm) liegt das Phytochrom in der Pfr-Form vor, nach Absorption von dunkelrotem
Licht (750 nm) in der Pr-Form. Dies wurde mittels Bestrahlung durch Interferenzfilter
erreicht (je 3 min). Es wurden Spektren im Bereich von 500 – 800 nm aufgenommen
und anschließend durch Subtraktion des Pfr- von dem Pr-Spektrum ein Differenz-
spektum berechnet.
2.13.15 Proteinkinaseexperimente
2.13.15.1 Autophosphorylierung
Die Fähigkeit der Autophosphorylierung wurde mittels radioaktiv markierten
[γ32P]-ATP untersucht. Dafür wurde zunächst das gereinigte apo- bzw. holo-
Phytochrom gegen 1 x Kinasepuffer ohne ß-Mercapthoethanol üN dialysiert. Die
Ansätze wurden anschließend unter verschiedenen Lichtbedingungen (690 nm bzw.
750 nm) 30 min bei RT bestrahlt. Die Autophoshorylierung erfolgte durch Zugabe von
ATP-Mix. Nach weiteren 20 min Bestrahlung wurde die Reaktion durch Zugabe von
10 µl SDS-Probenpuffer abgestoppt. Die Proben wurden über eine SDS-PAGE
aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Durch Auflegen einer
Phospho-Imagerplatte konnten die Signale am Phosphoimager (BAS, Fuji) nach 24 h
detektiert werden.
Puffer und Lösungen für die Proteinkinaseexperimente
5x Kinasepuffer Tris-HCl ph7,7 125 mM EDTA 1 mM MgCl2 25 mM ß-Mercaptoethanol 12 mM
Material und Methoden
56
ATP-Mix [γ32P]-ATP 0,25 µl ATP 0,25 µl A.dest 2 µl
Ansatz 5 x Kinasepuffer 4 µl ATP-Mix 4 µl Phytochrom 5 µg A.dest. ad 20 µl
2.13.15.2 Phosphorylgruppenübertragung
Die für viele Zwei-Komponenten-Systeme typische Phosphorylgruppenübertragung
einer Sensorkinase auf den Antwortregulator wurde mittels radioaktiv markierten,
autophoshoryliertem Phytochrom untersucht. Dazu wurde der potentielle Regulator in
einem Verhältnis 1:2 mit dem zuvor autophosphoryliertem Phytochrom für 30 min
unter verschiedenen Lichtbedingungen inkubiert. Nach Abstoppen der Reaktion
durch Zugabe von SDS-Probenpuffer wurden die Proteine mittels SDS-PAGE
separiert und auf eine PVDF-Membran transferiert. Durch Auflegen einer Phospho-
Imagerplatte konnten die Signale nach 24 h an einem Phosphoimager (BAS, Fuji)
detektiert werden (BAS, Fuji).
2.13.16 In vivo-Degradation
Der intrazelluläre Abbau von PaBphP wurde anhand von in vivo-
Degradationsexperimenten untersucht. Ausgehend des homologen Überproduktions-
stammes (PA14 x pSHP46) wurde die Expression durch Zugabe von 1% Arabinose
bei einer oD578 nm 3,5 induziert. Nach 30-minütiger Inkubation wurde die Translation
sämtlicher Proteine durch Gentamicin gestoppt (400 µg/µl). Gentamicin bindet an die
30S-Untereinheit der Ribosomen und verhindert so die Translation aller Proteine. Im
Anschluss wurden Proben zu verschiedenen Zeitpunkten (eingestellt auf eine
Konzentration von 1 ml einer oD578 nm von 0,5) entnommen, via SDS-PAGE
aufgetrennt und mittels immunulogischer Detektion gegen das Strep-tagII des
Fusionsproteins analysiert.
Material und Methoden
57
2.13.17 In vivo-Quervernetzung
Die Kopplung von Interaktionspartnern an PaBphP efolgte durch in vivo-
Quervernetzungen (crosslinking). Diese wurde im Rahmen der Materarbeit von A.
Hettwer durchgeführt (Hettwer, 2013). Dafür wurde die homologe Überproduktion von
PaBphP (PA14 x pSHP46) duch Zugabe von 1 % Arabinose bei einer oD578 nm 3,0
induziert und die Zellen nach einer Inkubationsdauer von 2 h in Zentrifugenröhrchen
(je 50 ml) überführt und sedimentiert (15 min, 4000 UpM, Eppendorf 5810 R, Rotor
F45-30-11). Die Pellets wurden mit je 10 ml PBS-Puffer gewaschen (15 min,
4000 UpM, Eppendorf 5810 R, Rotor F45-30-11), in 10 ml Reaktionspuffer
aufgenommen und die quervernetzende Substanz (Formaldehydlösung: 1 %,
DSP: 1,5 mM) zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation unter kontinuierlicher
Bewegung wurde die Reaktion durch Zugabe einer Stopplösung (20 mM) beendet.
Nach Sedimentation (15 min, Eppendorf 5810 R, Rotor F45-30-11) erfolgte eine
affinitätschromatographische Reinigung des PaBphP-Fusionsproteins an Strep-
Tactin-Sepharose (2.13.5). Die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford-
Reagenz bestimmt und auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt. Die
crosslinker wurden bei 98 °C für 20 min abgespalten. Alle weiteren Schritte der
tryptische Verdau, die Probenvorbeitung sowie die massensprektrometrische Analyse
(nanoACQUITY UPLC Systems, Synapt G2-S-HDMS Anlage, Waters) und die
Auswertung erfolgten in Kooperation mit Jun. Prof. Dr. J. Bandow der NG Mikrobielle
Antibiotikaforschung, der Ruhr-Universität Bochum.
Lösungen für die in vivo-Quervernetzung
Reaktionspuffer (pH 7,4)
Na3PO4 25 mM
Stopplösung (pH 7,4)
Tris-HCl 1 M Formaldehydlösung PBS-Puffer mit 0,4 % Paraformaldehyd (w/v) DSP Stocklösung: 50 mM in DMSO
Ergebnisse
58
3. Ergebnisse
Kapitel I
3.1.1 Biochemische Charakterisierung des Phytochroms PaBphP
aus P. aeruginosa PA14
Phytochrome zählen neben den Cryptochromen und Phototropinen zu der
wichtigsten Klasse an Photorezeptorproteinen (van der Horst & Hellingwerf, 2004).
Ihre Existenz in der Pflanzenwelt ist schon seit etwa 1950 bekannt. Erst Jahre später
wurden Rotlichtrezeptoren ebenfalls in Pilzen, Cyanobakterien und sogar heterotroph
lebenden Bakterien entdeckt. P. aeruginosa gehört dabei zu einer der ersten
heterotrophen Bakterienarten, in denen ein Phytochrom gefunden wurde. Die bio-
chemischen Eigenschaften des Rotlichtrezeptors PaBphP aus P. aeruginosa wurden
bisher jedoch lediglich über ein in E. coli heterolog produziertes Protein
charakterisiert (Tasler et al., 2005). Um ein besseres Verständnis für die Funktion
des Rotlichtrezeptors unter physiologischen Bedingungen zu gewinnen, wurde
PaBphP in der vorliegenden Arbeit erstmalig homolog produziert und isoliert. Die
putative Sensorkinase wurde anschließend mit Hilfe von spektroskopischen
Methoden und Phosphorylierungsexperimenten hinsichtlich der Funktion als
Rotlichtrezeptor bzw. als Kinase analysiert.
3.1.1.1 Isolierung von PaBphP aus PA14
Für die homologe Expression des Phytochroms aus P. aeruginosa PA14 in
zellphysiologischen Mengen wurde eine chromosomal integrierte C-terminale
Strep-tagII-Fusion hergestellt. Auf diese Weise konnte die Expression des Gens
durch seinen nativen Promotor reguliert und zugleich ein Affinitäts-tag zur einfachen
und schnellen Isolierung an das Protein gekoppelt werden.
Zu Beginn dieser Arbeiten war bereits bekannt, dass die Expression des
Phytochromgens zelldichteabhängig reguliert wird (Barkovits et al., 2008). Um eine
möglichst hohe Ausbeute von homologen PaBphP zu erhalten, wurde das Protein
Ergebnisse
59
aus 4 l Zellkultur der stationären Phase (oD578 nm 3,5) gereinigt. Die Eluate der
affinitätschromatographischen Isolierung wurden anschließend mittels SDS-PAGE
(Abb. 10-A) sowie immunologischer Nachweisverfahren analysiert (Abb. 10-B).
Abb. 10: SDS-PAGE-Analyse und immunologische Detektion von chromosomal Strep-tagII-fusionierten PaBphP aus PA14 (A) Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (10 %) nach affinitätschromatographischer Reinigung von PaBphP aus PA14. Es wurden jeweils 10 µl der Fraktionen Pellet (P), Lysat (L), Durchlauf (D), letzte Waschfraktion (W), sowie die Elutionsfraktionen (E2 - E10) aufgetragen. (B) Zu (A) korrespondierende immunologische Detektion mittels Strep-Tactin-Alkalische Phosphatase Antikörperkonjugat gegen das Strep-tagII nach Elektro-Transfer auf eine PVDF-Membran. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).
Trotz mehrmaliger Waschschritte konnte kein absolut reines Fusionsprotein ge-
wonnen werden. Über die immunologische Detektion gegen das Strep-tagII des
Fusionsproteins wurde in den Elutionsfraktionen ein Protein bei etwa 80 kDa
nachgewiesen. Dies entspricht der theoretischen Größe eines PaBphP-Monomers,
sodass von einer erfolgreichen Reinigung von homolog produziertem PaBphP
ausgegangen werden kann. Da zudem kein Signal in der Pelletfraktion
nachgewiesen wurde, scheint PaBphP ein vollständig lösliches Protein zu sein.
Insgesamt betrug die Ausbeute von homologem PaBphP ca. 25 µg/l Zellkultur. Dies
entspricht einer theorethischen Menge von etwa 52 Molekülen PaBphP pro Zelle.
Ergebnisse
60
3.1.1.2 Photoisomerisierung von homolog isoliertem PaBphP
Phytochrome können aufgrund ihres gebundenen Chromophors zwischen zwei
Formen photoisomerisieren. Dabei kommt es in Abhängigkeit der Lichtbedingungen
zu einer Konformationsänderung des Chromophors und das Phytochrom kann
reversibel zwischen einer hellrotlichtabsorbierenden Pr-Form und einer
dunkelrotlichtabsorbierenden Pfr-Form wechseln. Durch eine Subtraktion des Pfr-
Spektrums vom Pr-Spektrum ergibt sich ein für Phytochrome charakteristisches
Differenzspektrum.
Das unter nativen Bedingungen synthetisierte PaBphP wurde daher mit hellrotem
(690 nm) sowie dunkelrotem (750 nm) Licht bestrahlt und anschließend das
Differenzspektrum berechnet. Dabei konnten die Absorptionsmaxima der Pr- und der
Pfr-Form bei 700 nm bzw. bei 754 nm nachgewiesen werden (Abb. 11).
Abb. 11: Absorptionsspektren der Pr- und der Pfr-Form sowie das Differenzspektrum des homolog isolierten PaBphPs aus PA14 (A) Das gereinigte PaBphP aus PA14 wurde mit hellrotem (690 nm) und dunkelrotem (750 nm) Licht bestrahlt und die Absorptionsspektren der Pfr- bzw. Pr-Konformation aufgenommen. (B) Berechnetes Differenzspektrum aus (A). Eingesetzt wurde eine Proteinkonzentration von 8 µM.
Ergebnisse
61
Aufgrund dieser Photokonversion kann angenommen werden, dass unter
physiologischen Bedingungen das Phytochrom als holo-Phytochrom mit einem
gebundenen Chromophor vorliegt. Nach der Bestrahlung mit hellrotem Licht zeigte
sich weiterhin keine vollständige Isomerisierung in die Pfr-Form. Es handelt sich
dabei um eine Pfr-angereichterte Form. Um den Grundzustand des Phytochroms zu
ermitteln, wurde das PaBphP im Dunkeln gereinigt und ein Absorptionsspektrum
aufgenommen (Daten nicht gezeigt). Es zeigte sich eine Pfr-angereicherte Form,
wodurch PaBphP zu den sogenannten bathy-Phytochromen zählt (Rottwinkel et al.,
2010). Anhand dieser spektralen Eigenschaften von homolog isoliertem PaBphP
konnte auch unter physiologischen Bedingungen die Funktionalität eines aktiven
Phytochroms aus P. aeruginosa nachgewiesen werden.
3.1.1.3 Der native Chromophor von PaBphP
P. aeruginosa besitzt im Gegensatz zu allen anderen sequenzierten Bakterienarten
zwei Hämoxygenasen: HemO und BphO. Beide Enzyme sind in der Lage, Häm zu
Biliverdin (BV) zu spalten. Sie unterscheiden sich dabei jedoch in ihrer
Regiospezifität. So spaltet HemO das Häm-Molekül an der δ- und β-
Kohlenstoffbrücke, wodurch BV IXδ und BVI Xβ in einem Verhältnis von 70:30
entstehen (Ratliff et al., 2001). BphO hingegen öffnet den Porphyrinring an der
α- Kohlenstoffbrücke und erzeugt somit BV IXα (Wegele et al., 2004). In bisherigen
in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass letzteres als Chromophor für
PaBphP dient. Weiterhin wurde in vitro eine Photoisomerisierung von PaBphP auch
nach Zugabe von BVI Xδ beobachtet (Tasler et al., 2005).
Um in vivo den natürlichen Chromophor von PaBphP zu identifizieren, wurde
PaBphP aus einer ∆bphO- bzw. ∆hemO-Deletionsmutante gereinigt. Die isolierten
PaBphPs wurden daraufhin hinsichtlich einer Photokonversion untersucht, wobei das
homolog produzierte PaBphP aus dem Wildtypstamm als Referenz diente. Da die
native Synthesemenge von PaBphP sehr gering ist (vgl. 3.1.1.1), wurde ein Konstrukt
zur homologen Überproduktion in P. aeruginosa auf der Basis des Arabinose-
induzierbaren pHERD-Vektors konstruiert (Qiu et al., 2008).
Ergebnisse
62
Die Reinheitsanalyse der erhaltenen Eluate nach der affinitätschromatographischen
Isolierung erfolgte mittels SDS-PAGE (Abb. 12).
Abb. 12: SDS-PAGE-Analyse von homolog überproduziertem und isoliertem PaBphP aus verschiedenen PA14-Stämmen Für die homologe Überproduktion von PaBphP wurde mittels diparentalen Mating das entsprechende Konstrukt (pSHP46) in den PA14 WT, einer ∆bphO- und ∆hemO-Mutante eingebracht. Dargestellt ist eine Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (10 %) nach affinitätschromatographischer Reinigung von PaBphP. Es wurden jeweils 10 µl der vereinigten Elutionsfraktionen aufgetragen. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).
Anhand der SDS-PAGE zeigt sich, dass aus allen Stämmen ein nahezu homogenes
Fusionsprotein in vergleichbaren Konzentrationen gewonnen werden konnte.
Demnach hatte das Fehlen der Hämoxygenase BphO bzw. HemO keinen Einfluss
auf die Proteinproduktion und -stabilität.
Um den in vivo gebundenen Chromophor zu identifizieren, wurde die Fähigkeit einer
Photokonversion der isolierten PaBphPs getestet. Dazu wurden erneut die
lichtabsorbierenden Eigenschaften des Chromophors auf der Basis der
rotlichtabhängigen Photoisomerisierung charakterisiert (Abb. 13). Die
spektroskopische Analyse ergab eine lichtinduzierte Umwandlung für PaBphP aus
dem WT und der ∆hemO-Mutante. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe,
dass die BV-Isomere BV IXβ und BVI Xδ für die Assemblierung eines funktionellen
holo-Phytochroms nicht benötigt werden. Das PaBphP, isoliert aus der ∆bphO-
Mutante, zeigte keine Photoisomerisierung. Daraus kann geschlussfolgert werden,
dass BV IXα, das durch die Hämspaltung der BphO-Hämoxygenase generiert wird,
der native Chromophor von PaBphP ist. Anders als in den durch Tasler et al.
Ergebnisse
63
durchgeführten in vitro-Analysen, kann die Assemblierung eines holo-Phytochroms in
vivo nicht mit dem Spaltprodukt der HemO-Hämoxgenase, BV IXδ, erfolgen.
Abb. 13: Differenzspektren von homolog überproduzierten PaBphPs aus verschiedenen PA14-Stämmen Berechnete Differenzspektren nach Bestrahlung mit hellrotem (690 nm) und dunkelrotem (750 nm) Licht der homolog überproduzierten und isolierten PaBphPs aus dem WT (schwarzes Spektrum) und den Hämoxygenase-Mutanten ∆hemO (rotes Spektrum) und ∆bphO (grünes Spektrum). Eingesetzt wurden jeweils 15 µM Protein.
Durch die Zugabe äquimolarer Menge von BVI Xα konnte ein funktionelles PaBphP
holo-Phytochrom aus der ∆bphO-Mutante generiert werden. Daraufhin wurden die
spektroskopischen Eigenschaften der homolog überproduzierten Phytochrome aus
dem WT und der ∆hemO-Mutante ebenfalls unter Zugabe von BV IXα bestimmt. Dies
hatte eine deutliche Zunahme der Differenzspektren zur Folge. Durch diese Zugabe
stieg die relative Absorptionsdifferenz (∆∆ A) von etwa 0,004 auf 0,2 (Abb. 14).
Ergebnisse
64
Abb. 14: Relative Absorptionsdifferenz vor und nach Zugabe von BV IXα Berechnete relative Absorptionsdifferenz (∆∆ A) der PaBphPs aus verschiedenen PA14-Stämmen vor und nach Zugabe von äquimolarem BVI Xα (15 µM) und Bestrahlung mit hellrotem (690 nm) und dunkelrotem (750 nm) Licht.
Anhand von Berechnungen der Differenz vor und nach Zugabe von BV IXα wird
deutlich, dass nur ein kleiner Teil des isolierten PaBphPs mit einem Chromophor
besetzt war (~2 %). Durch dieses Experiment wurden auch neue Erkenntnisse über
die enzymatischen Eigenschaften der BphO- Hämoxygenase gewonnen. Die
Synthese des Chromophors scheint unabhängig von der vorliegenden Menge an
apo-Phytochrom zu sein und die Enzymaktivität wird nicht dahingehend angepasst.
3.1.1.4. Autophosphorylierung
Aufgrund ihres Domänenaufbaus sind bakterielle Phytochrome Rotlichtsensoren mit
Kinaseeigenschaften. Eine lichtregulierte Autophosphorylierung eines holo-
Phytochroms konnte bereits für einige bakterielle Phytochrome nachgewiesen
werden (Davis et al., 1999; Bhoo et al., 2001). Eine aktuelle Publikation weist zudem
darauf hin, dass eine lichtregulierte Autophosphorylierung auch ohne gebundenem
Chromophor stattfinden kann (Fixen et al., 2014).
Unter Berücksichtigung dieser Studien wurde in der vorliegenden Arbeit das homolog
überproduzierte PaBphP auf eine mögliche lichtregulierte Autophosphorylierung
durch Zugabe von radioaktiv markiertem [γ32-P]-ATP in der holo- und der apo-Form
Ergebnisse
65
des Proteins untersucht. Dazu wurden die homolog gereinigten PaBphPs aus dem
WT und der ∆bphO-Mutante verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass die
Autophosphorylierung der untersuchten PaBphPs unabhängig sowohl von den
vorherrschenden Lichtbedingungen, als auch unabhängig von einem assemblierten
Chromophor erfolgen kann (Abb. 15).
Abb. 15: Lichtabhängige Autophosphorylierung von homolog überproduzierten PaBphPs in der holo- und apo-Form
(A) Autoradiogramm nach Inkubation mit [γ32-P]-ATP und 30-minütiger Bestrahlung mit dunkelrotem
(750 nm) sowie hellrotem (690 nm) Licht des holo-Phytochroms (PaBphP überproduziert und isoliert aus dem WT) bzw. des apo-Phytochroms (PaBphP überproduziert und isoliert aus der ∆bphO-Mutante). (B) Proteinkontrolle mittels SDS-PAGE (10 %) und anschließender Coomassiefärbung.
Da in vorangegangenen Arbeiten gezeigt wurde, dass nach einer homologen
Überproduktion von PaBphP aus dem WT nur ein kleiner Anteil der synthetisierten
Proteine mit Chromophor abgesättigt ist (vgl. 3.1.1.2), wurde die
Autophosphorylierung nach einer vollständigen Chromophorylierung des
Phytochroms wiederholt (Daten nicht gezeigt). Das resultierende Autoradiogramm
zeigte jedoch keine signifikanten Unterschiede zu den Ergebnissen der ersten
Untersuchung. Somit wurde eine chromophorunabhängige Autophosphorylierung
und damit die Kinaseaktivität für beide Formen bestätigt.
Ergebnisse
66
3.1.2 Phänotypische Charakterisierungen von Phytochrommutanten
Durch die im vorherigen Abschnitt biochemischen Untersuchungen von homolog
gereinigtem PaBphP konnte die Funktionalität eines Rotlichtrezeptors in vivo
nachgewiesen werden. Daran knüpft die Frage der physiologischen Bedeutung des
Phytochroms in P. aeruginosa an. Hinweise auf eine Rolle in der stationären Phase
lieferten bereits durchgeführte transkriptionelle lacZ-Reportergenfusionen (Barkovits
et al., 2008). Auch wurde anhand von Transkriptiomanalysen eine Vielzahl
deregulierter Gene in einer ∆bphO- sowie ∆bphP-Mutante identifiziert (Barkovits et
al., 2011). Diese sind jedoch nicht einem funktionellen Bereich zuzuordnen, wodurch
kein eindeutiger Rückschluss in Hinblick auf die physiologische Funktion des
Phytochroms gezogen werden kann. Auch bisherige phänotypische Untersuchungen
von PAO1 ∆bphO- und ∆bphP-Deletionsmutanten konnte diese Frage nicht klären.
Innerhalb dieser Arbeit wurde diese Phänotypisierung zur Aufklärung der zellulären
Funktion fortgeführt. Dafür wurde im Unterschied zu den bisherigen Analysen der
Parentalstamm PA14, sowie die entsprechenden Mutanten verwendet. Da keine
lichtabhängige Regulation von PaBphP, in Form einer Kinaseaktivität, nachgewiesen
wurde (vgl. 3.1.1.4), erfolgten die weiteren Untersuchungen ohne definierte
Lichtbedingungen.
3.1.2.1 Osmotischer Stress
Innerhalb der bereits durchgeführten Transkriptionsstudien wurde eine erhöhte
Anzahl an Genen identifiziert, die durch osmotischen Stress induziert werden. Um
einen möglichen Einfluss von PaBphP bei der osmotischen Adaptation zu
analysieren, wurde die Sensibilität der Stämme gegenüber hohen Salz-
konzentrationen analysiert. Dazu wurden Verdünnungsreihen, ausgehend von
Hauptkulturen aus der stationären Phase (oD578 nm 3,5) angelegt und durch
Aufbringen auf Hochsalz-LB-Platten (0,9 M) untersucht (Abb. 16). Aus diesem Test
geht hervor, dass der Unterschied zwischen dem WT und den Deletionsmutanten
gegenüber osmotischen Stress nur marginal ist. Daher kann ein Einfluss des
Phytochroms an der osmotischen Stressantwort unter diesen Bedingungen
weitgehend ausgeschlossen werden.
Ergebnisse
67
Abb. 16: Untersuchung der Sensibilität gegenüber hohen Salzkonzentrationen von WT und einer ∆bphO- sowie ∆bphP-Mutante Ausgehend von Hauptkulturen einer oD578 nm 3,5 wurden Verdünnungsreihen angelegt. Davon wurden jeweils 2 µl auf eine Hochsalz-Agar-Platte aufgebracht (0,9 M NaCl) und 48 h bei 37 °C inkubiert.
3.1.2.2 Synthese von 4-Hydroxy-2-alkyl-quinolonen (HAQ)
Die Transkriptomdaten (Barkovits et al., 2011) deuten weiterhin auf eine mögliche
Regulation der Synthesegene der Autoinduktoren HHQ und PQS hin, woduch das
Phytochrom einen Einfluss auf die Produktion dieser Signalmoleküle haben könnte.
Um dieser Hypothese nachzugehen, wurden HHQ und PQS aus dem
Kulturüberstanden der Stämme bei einer oD578 nm von 3,5 isoliert und
dünnschichtchromatographisch aufgetrennt (Abb. 17). Da weder ein HHQ- noch ein
PQS-Standard zu Verfügung stand, und keine Rf-Werte bekannt sind, wurden die
separierten Moleküle mittels Literaturvergleich bestimmt (Jensen et al., 2006).
Ergebnisse
68
Abb. 17: Extraktion von HAQs aus Kuturüberständen von WT und einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante Dünnschichtchromatographische Auftrennung der Signalmoleküle HHQ und PQS aus dem Kulturüberstand des WTs, einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante. Diese wurden ausgehend von Hauptkulturen mit einer oD578 nm von 3,5 mittels Dichlormethan extrahiert. Als Laufmittel diente ein Gemisch aus 95:5 (v/v) Dichlormethan/Methanol.
Die dargestellte dünnschichtchromatographische Auftrennung der Signalmoleküle
zeigt, dass eine Deletion von bphO und bphP keinen Einfluss auf die Synthese von
HHQ hat, da es in nahezu gleicher Menge nachgewiesen wurde. Jedoch ist in beiden
Mutanten die Menge an gebildeten PQS deutlich geringer als im WT.
3.1.2.3 Auswirkung von SDS auf die Membran
Innerhalb der Transkriptomanalysen (Barkovits et al., 2011) wurden auch einige
wenige deregulierte Gene identifiziert, deren Produkte entweder in der Membran
lokalisiert, oder an der Synthese von Komponenten der Lipopolysaccharidschicht
beteiligt sind. Die Analyse, ob sich durch eine Deletion von bphO oder bphP die
Membranstabilität beeinflusst wird, wurde mittels des Detergenz Natrium-
dodecylsulfat (SDS) untersucht. Nach Ausplattieren der Stationärphasenkulturen
einer oD578 nm von 3,5 auf eine LB-Agar-Platte wurde die Sensibilität gegen das
Detergenz (10 %) mittels eines Plättchentests untersucht und nach 24 h die
entstandenen Hemmhöfe bestimmt. Sowohl der WT als auch die ∆bphO-Mutante
wiesen einen durchschnittlichen Hemmhof von 1,0 cm auf. Im Gegensatz dazu war
der Hemmhof der ∆bphP-Mutante mit 1,3 cm deutlich größer, wodurch ein möglicher
Einfluss des Phytochroms auf die Membranintegrität besteht.
Ergebnisse
69
3.1.2.4 Motilitätsverhalten
Ein Phytochrom-reguliertes, lichtabhängiges Motilitätsverhalten wurde kürzlich bei
dem Verwandten von P. aeruginosa, P. syringae B728a entdeckt. Dabei hat das
PsBphP1 einen negativen Effekt auf die Fortbewegung, was sich in einer erhöhten
Motilität der entsprechenden Mutante wiederspiegelt (Wu et al., 2013). Zur Klärung,
ob das Phytochrom aus P. aeruginosa ebenfalls eine Rolle in der Fortbewegung
einnimmt, wurde diese durch LB-Platten mit verschiedener Agar-Konzentration
untersucht. Die Fortbewegung wird durch eine Kombination aus Flagellen und TypIV-
Pili vermittelt. Bei einer niedrigen Agar-Konzentration (0,3 %) beruht die Motilität
überwiegend auf den Flagellen, was als „Schwimmen“ bezeichnet wird (Wolfe &
Visick, 2008). Hingegen beruht die Fortbewegung bei einer Verwendung von 0,5 %
Agar auf einer Kombination aus Flagellen und TypIV-Pili und wird als „Schwärmen“
bezeichnet (Mattick, 2002) (Abb. 18).
Sowohl bei einer Verwendung von 0,3 %-igen als auch bei 0,5 %-igen Agar-Platten
wies die ∆bphO-Mutante ein WT-ähnliches Motilitätsverhalten auf. Durch die Deletion
von bphP hingegen konnte eine leicht reduziertes Schwimmverhalten bei einer Agar-
Konzentration von 0,3 % im Vergleich zum WT beobachtet werden (Abb. 18-A).
Weiterhin war eine markante Grünfärbung der Zellen der ∆bphP-Mutante auffällig.
Dies könnte auf eine erhöhte Produktion des für P. aeruginosa charakteristischen
grün pigmentierten Virulenzfaktors Pyocyanin zurückgeführt werden, und wurde
dahingehend weiter analysiert.
Abb. 18: Untersuchung des Motilitätsverhalten im WT und einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante Für die Analyse der Motilität wurden je 5 µl einer Hauptkultur des WT, einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante mit einer oD578 nm von 3,5 auf eine LB-Platte gegeben und üN bei 37 °C inkubiert. (A) Agar-Konzentration der LB-Platte: 0,3 %. (B) Agar-Konzentration der LB-Platte: 0,5 %.
Ergebnisse
70
3.1.2.5 Pyocyaninproduktion
Pyocyanain ist ein blau-grün pigmentierter sekundärer Metabolit. Strukturell handelt
es sich um Phenanzin-Derivat mit zwitterionischem Aufbau. Dadurch kann es leicht
die Membran passieren und durch seine Redox-Eigenschaften ein großes Spektrum
an Zellschäden verursachen (Lau et al., 2004). Der Wirkmechanismus ist bisher noch
nicht geklärt, jedoch ist bekannt, dass Pyocyanin einer der wichtigsten
Virulenzfaktoren von P. aeruginosa ist. Pyocyanin kann nach der Extraktion aus dem
Kulturüberstand, aufgrund seiner colorimetrischen Eigenschaften, spektral untersucht
werden. Eine erhöhte Synthese des Virulenzfaktors im Kulturüberstand der ∆bphP-
Mutante wurde jedoch nicht nachgewiesen. Interessanterweise konnte die verstärkte
Grünfärbung nur bei einer Anzucht auf Agar-Platten, jedoch nicht in Flüssigkultur,
beobachtet werden. Versuche das Pigment aus den Plattenkulturen zu extrahieren,
lieferte ebenfalls nicht den Nachweis einer erhöhten Pyocyaninproduktion der
∆bphP-Mutante.
Ergebnisse
71
3.1.3 Die Regulation von bphOP und bphP
Die genetische Organisation von bphP, kodierend für das apo-Phytochrom und
bphO, kodierend für die Hämoxygenase, ist innerhalb vieler bakterieller
Phytochromsysteme gleich (Bhoo et al., 2001). In der Regel sind beide Gene auf
dem Chromosom in unmittelbarer Nähe lokalisiert, wobei bphO direkt stromaufwärts
von bphP liegt. In P. aeruginosa sind diese beiden Gene durch eine kleine
intergenische Region von 26 bp getrennt. Dies deutet auf eine bicistronische
Operonstruktur von bphO und bphP hin und wurde bereits durch Reverse-
Transkriptase-PCR-Experimente bestätigt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass
die Transkription des Operons von RpoS, dem Sigmafaktor der stationären Phase,
induziert wird (Barkovits et al., 2008). Mehrere unabhängige globale Transkriptom-
analysen geben außerdem Hinweise auf eine mögliche zweite Promotorregion
stromaufwärts von bphP (Schuster et al., 2003; Schuster et al., 2004; Gilbert et al.,
2009). Dies würde eine zusätzliche, von bphO unabhängige, Transkription des apo-
Proteins bedeuten. Darüber hinaus wird eine Quorum-Sensing-regulierte (QS;
vgl. 1.6) Transkription, vermittelt durch LasR, postuliert (Gilbert et al., 2009).
Aufgrund dieser Hypothese wurde im Rahmen dieser Arbeit die Transkriptions-
regulation dieser Gene weiter im Detail untersucht.
3.1.3.1 Vergleichende Promotoraktivitätsstudien
Um das Vorhandensein eines putativen bphP-Promotors zu überprüfen, wurde eine
transkriptionelle lacZ-Fusion des putativen Promotorbereichs von bphP konstruiert.
Der verwendete Vektor mini-CTX1 ist in der Lage, in das Genom von P. aeruginosa
durch eine Integrase-vermittelte Rekombination in den attB-Locus, zu integrieren.
Diese genomische Verankerung bietet den Vorteil einer einzelnen zusätzlichen Kopie
des Promotorbereiches ohne das der native Ort des zu untersuchenden Gens
beeinflusst wird (Becher & Schweizer, 2000). Über die Messung der Aktivität der
gebildeten ß-Galaktosidase kann indirekt auf die Stärke der Promotoraktivität des zu
untersuchenden Gens geschlossen werden. Die Aktivität der bphP-Reportergen-
fusion wurde in verschiedenen Wachstumsphasen bestimmt und mit einer
transkriptionellen lacZ-Fusion des bphOP-Promotors verglichen (Abb. 19).
Ergebnisse
72
Abb 19: Promotoraktivität von bphOP und bphP in verschiedenen Wachstumsphasen Für die Untersuchung der Promotoraktivitäten von bphOP und bphP wurden transkriptionelle lacZ-Reportergenfusionen in das Genom des PA14 WT integriert. Die Messungen erfolgten in der logarithmischen (oD578 nm 0,5), exponentiellen (oD578 nm 1,5), stationären (oD578 nm 4,5) und der späten stationären Phase (oD578 nm 5,5) durch Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) Schematische Darstellung der erstellten transkriptionellen lacZ-Reportergenfusionen von bphOP und bphP. (B) ß-Galaktosidaseaktivität der bphOP- und bphP-lacZ-Reportergenfusion im WT in verschiedenen Wachstumsphasen.
Eine stationärphaseninduzierte bphOP-Genexpression war bereits zu Beginn dieser
Arbeit bekannt (Barkovits et al., 2008) und konnte unabhängig bestätigt werden.
Darüber hinaus wurde aber auch eine Promotoraktivität für bphP nachgewiesen.
Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese der eigenständigen
Expressionskontrolle für bphP. Durch die durchgeführten Aktivitätsbestimmungen
wurde weiterhin eine ebenfalls zelldichteabhängige Transkription von bphP, mit
maximaler Induktion in der Stationärphase, ermittelt. Verglichen mit der Aktivität des
bphOP-Promotors ist diese in allen analysierten Wachstumsphasen um etwa
20 - 40 % geringer. Die Regulation der bphP-Transkription wurde weiterhin bezüglich
der postulierten QS-Abhängigkeit genauer analysiert (QS: vgl. 1.6).
Ergebnisse
73
3.1.3.2 LasR-abhängige Regulation
Wie bereits gezeigt werden konnte, wird bphP nicht nur zusammen mit bphO in
einem bicistronischen Operon cotranskribiert, sondern verfügt auch über einen
eigenen Promotor. Gilbert et al. postulieren weiterhin eine Transkriptionsaktivierung
von bphP durch den QS-Regulator LasR (Gilbert et al., 2009). Die Induktion des
bphOP-Cotranskripts hingegen wird von RpoS reguliert (Barkovits et al., 2008). Die
Genexpression des Sigmafaktors wird jedoch indirekt von LasR über RhlR,
gesteuert. Dabei ist nicht auszuschließen, dass auch eine zusätzliche direkte
Regulation durch LasR möglich ist. Die Expressionskontrolle vieler Gene ist sehr
dynamisch und kann auch durch mehrere Regulatoren gesteuert werden. Um einen
möglichen Einfluss von LasR auf die bphP- und bphOP-Transkription zu überprüfen,
wurde eine ∆lasR-Mutante erstellt, die Reportergenfusionen in das Genom integriert
und anschließend die Aktivität über die Messung der gebildeten ß-Galaktosidase
bestimmt (Abb. 20). Da die vorausgegangenen Promotorstudien eine maximale
Induktion des Reportergens in der stationären Phase aufzeigten, wurden die
folgenden Analysen jeweils bei einer oD578 nm von 3,5 durchgeführt.
Abb. 20: Promotoraktivität von bphP und bphOP im WT und einer ∆lasR-Mutante Für die Untersuchung einer LasR-abhängigen Promotorinduktion von bphOP und bphP wurden transkriptionelle lacZ-Reportergenfusionen in das Genom von PA14 WT und einer ∆lasR-Mutante integriert. Die Messung erfolgte bei einer oD578 nm von 3,5 durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) ß-Galakosidaseaktivität der bphP-lacZ-Reportergenfusion im WT und in einer ∆lasR-Mutante. (B) ß-Galaktosidaseaktivität der bphOP-lacZ-Reportergenfusion im WT und in einer ∆lasR-Mutante.
Ergebnisse
74
Das Fehlen des Transkriptionsregulatoes LasR hat eine fast vollständige Repression
des bphP-Promotors zur Folge (Abb. 20-A). Auch die Aktivität der bphOP-lacZ-
Fusion ist in der ∆lasR-Mutante im Vergleich zu WT ebenfalls um ca. 85 % reduziert
(Abb. 20-B). Damit konnte LasR als Aktivator der Transkription von bphP und auch
für das bphOP-Cotranskript nachgewiesen werden. Aufgrund der hierarchischen
Organisation der QS-Systeme mit LasR als übergeordneten Regulator, lassen die
durchgeführten experimentellen Ansätze jedoch keine Aussage darüber zu, ob die
Induktion der Genexpression direkt oder indirekt erfolgt. Eine direkte Aktivierung setzt
eine DNA-Bindung des Regulators an die Promotorregion voraus. Hinweise auf eine
solche direkte Bindung an die DNA geben oftmals konservierte palindromische
Sequenzen in der Promotorregion, die auch als las-Boxen bezeichnet werden
(Schuster et al., 2004). Eine solche Las-Box wurde auch für den intergenischen
Bereich von bphO und bphP postuliert. Eine direkte Bindung von LasR an diese
Region konnte jedoch bisher nicht gezeigt werden (Gilbert et al., 2009).
Darauf aufbauend wurden im Rahmen dieser Arbeit DNA-Bindestudien sowohl mit
der stromaufwärts von bphO gelegenen, als auch mit der putativen bphP-
Promotorregion durchgeführt.
Um das für die DNA mobility shiftt assays (DMSA) benötigte LasR-Protein zu
gewinnen, wurde der Transkriptionsregulator heterolog in E. coli überproduziert und
affinitätschromatographisch mittels Heparin-Sepharose isoliert (Qihui et al., 2011).
Die Überprüfung des Reinheitsgrades des isolierten Proteins erfolgte anschließend
gelelektrophoretisch (Abb. 21). Dabei wurde ein Protein ohne weitere Verun-
reinigungen bei 26 kDa detektiert, was der theoretischen berechneten Größe eines
LasR-Monomers entspricht. LasR konnte somit einer nahezu 100 %-igen
Homogenität isoliert werden.
Ergebnisse
75
Abb. 21: SDS-PAGE Analyse von heterolog überproduziertem und isoliertem LasR Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (10 %) nach zweimaliger affinitätschromatographischer Reinigung mittels Heparin-Sepharose von LasR (pET14b-lasR; Quihui et al,. 2001). Aufgetragen wurde 10 µl der vereinigten Elutionsfraktionen. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).
Die zu untersuchenden Promotorregionen wurden mittels PCR amplifiziert und die
erhaltene DNA mit aufsteigenden Konzentrationen des Regulators inkubiert. Die
Auftrennung der potentiellen DNA-Protein-Komplexe erfolgte anschließend über ein
3 %-iges Agarosegel (Abb. 22). Als Positivkontrolle diente die Promotorregion von
rhlR.
Abb. 22: DMSA mit LasR und den putativen Promotorregionen von bphOP und bphP Für die Bindestudien wurden jeweils 50 ng der PCR-amplifizierten DNA-Fragmente mit steigenden LasR-Konzentrationen (0,1 µg - 0,6 µg) inkubiert und anschließend über ein 3 %-iges Agarosegel aufgetrennt. Die Visualisierung der DNA erfolgte mit Ethidiumbromid. (-): ohne Proteinzugabe. (A) Positivkontrolle: 193 bp der Promotorregion von rhlR. (B) 320 bp der putativen Promotorregion von bphP. (C) 200 bp der putativen bphOP-Promotorregion. (*): freie DNA; (**): gebundene DNA.
Die Auswertung der Bindestudien zeigte eine Verschiebung der Laufweite für die
PCR-amplifizierte rhlR-Promotorregion mit zunehmender LasR-Konzentration infolge
einer direkten Bindung. Dies impliziert, dass der Transkriptionsfaktor in seiner aktiven
Form isoliert wurde. Im Vergleich dazu konnte eine direkte Bindung von LasR an die
Ergebnisse
76
Promotorbereiche von bphOP und bphP nicht beobachtet werden (Abb. 22-B und C).
Um auszuschließen, dass die LasR-Bindung in vivo noch von weiteren Faktoren für
eine DNA-Bindung abhängig ist, wurden die Experimente unter Zugabe von
P. aeruginosa-Rohextrakt aus der stationären Phase wiederholt. Jedoch wurde auch
in diesen Experimenten keine Laufweitenverschiebung im DMSA detektiert (Daten
nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass LasR in seiner Funktion
Transkriptionsaktivator für bphOP und bphP nicht direkt mit der DNA interagiert.
3.1.3.3 RhlR-abhängige Regulation
Da die vorausgegangenen DMSA-Studien eine direkte Kontrolle der bphOP- und
bphP-Genexpression durch LasR vermutlich ausschließen, wurde im Folgenden die
Möglichkeit einer indirekten Regulation über den LasR-abhängigen
Transkriptionsfaktor RhlR untersucht. Dazu wurden die bphOP- und bphP-
Reportergenfusionen in das Genom einer ∆rhlR-Mutante integriert und die
Promotorinduktion analysiert. Die Messungen ergaben jeweils eine um etwa 50 %
verringerte ß-Galaktosidaseaktivität beider Reportergenfusionen in der Mutante im
Vergleich zum WT (Abb. 23). Diese Beobachtungen deuten auf eine RhlR-abhängige
Transkriptionskontrolle von sowohl bphOP als auch bphP hin.
Abb. 23: Promotoraktivität von bphP und bphOP im WT und einer ∆rhlR-Mutante Für die Untersuchung einer RhlR-abhängigen Promotorinduktion von bphP und bphOP wurden transkriptionelle lacZ-Reportergenfusionen in das Genom des PA14 WT und einer ∆rhlR-Mutante integriert. Die Messung erfolgte bei einer oD578 nm von 3,5 durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) ß-Galaktosidaseaktivität der bphP-lacZ-Reportergenfusion im WT und in einer ∆rhlR-Mutante. (B) ß-Galaktosidaseaktivität der bphOP-lacZ-Reportergenfusion im WT und in einer ∆rhlR-Mutante.
Ergebnisse
77
Da im Rahmen dieser Arbeit kein funktionsfähiges rhlR-Überproduktionskonstrukt
erzeugt werden konnte, wurde alternativ eine plasmidkodierte konstitutive Expression
des Regulators gewählt (Dekimpe & Deziel, 2009). Durch die erhöhte Expression des
Regulators steigt folglich im Falle einer Transkriptionsaktivierung durch RhlR auch
die Induktion der entsprechenden Promotoren.
Als Bestandteil des QS-Systems liegt RhlR erst bei einer hohen Zellzahl in seiner
aktiven Form vor. Eine konstitutive Expression hingegen ist von der hohen
Populationsdichte unabhängig, wodurch eine Induktion der regulierten Gene bereits
bei einer geringeren Zellzahl möglich ist. Dementsprechend wurde das Plasmid
(pUCPKS_rhlR, Dekimpe & Deziel, 2009) in die WT-Stämme mit den bereits
integrierten bphP- und bphOP-Reportergenfusionen eingebracht und die
Promotoraktivität erneut bestimmt.
Es zeigte sich, dass die erhöhte Regulatorkonzentration nur eine geringfügige
Zunahme der Promotoraktivität von bphP zur Folge hatte (Abb. 24-A). Somit kann
eine direkte Regulation durch RhlR vermutlich ausgeschlossen werden. Im Vergleich
dazu führte die konstitutive Expression von rhlR zu einer deutlich verstärkten Aktivität
der bphOP-lacZ-Fusion, die dabei bereits bei niedriger Zellzahl (oD578 nm 2,5) zu
beobachten war (Abb. 24-B).
Ergebnisse
78
Abb. 24: Einfluss einer konstitutiven Expression von rhlR auf die Promotoraktivitäten von bphP und bphOP Für die Untersuchung der Promotoraktivitäten von bphP und bphOP wurden lacZ-Reportergenfusionen in das Genom von PA14 WT integriert. Im Anschluss wurde mittels diparentalem Mating das plasmidkodierte rhlR (pUCPSK_rhlR, Dekimpe & Deziel, 2009) in die Stämme eingebracht. Die Messung der Promotoraktivitäten erfolgte in der frühen stationären Phase (oD578 nm 2,5) sowie in der stationären Phase (oD578 nm 3,5) durch Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) ß-Galaktosidaseaktivität der bphP-Reportergenfusion im WT sowie im WT mit konstitutiver Expression von rhlR (WT/rhlR
C).(B) ß-Galaktosidaseaktivität der bphOP-Reportergenfusion im WT
sowie im WT mit konstitutiver Expression von rhlR (WT/rhlRC).
3.1.4.4 RpoS-abhängige Regulation
Die bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass RhlR zwar die Transkription von
bphP moduliert, jedoch eine direkte Aktivierung wahrscheinlich ausgeschlossen
werden kann. Aufgrund der hierarchischen Struktur des QS-Systems besteht jedoch
erneut die Möglichkeit einer durch RhlR indirekten Transkriptionsaktivierung durch
RpoS. Um dies zu testen, wurde die Aktivität der bphP-Reportergenfusion in einer
entsprechenden ∆rpoS-Mutante analysiert (Abb. 25). Dabei konnte eine um 50 %
reduzierte bphP-Promotoraktivität im Vergleich zum WT festgestellt werden. Da keine
vollständige Repression durch das Fehlen des alternativen Sigmafaktors vorlag, ist
die Beteiligung weiterer Transkriptionsaktivatoren sehr wahrscheinlich.
Ergebnisse
79
Abb. 25: Promotoraktivität von bphP im WT und einer ∆rpoS-Mutante Für die Untersuchung einer RpoS-abhängigen Promotoraktivität von bphP wurden eine transkriptionelle lacZ-Reportergenfusion in das Genom von PA14 WT und einer ∆rpoS-Mutante integriert. Die Messung erfolgte bei einer oD578 nm von 3,5 durch die Bestimmung der ß-Galaktosidase-aktivität.
Durch die Analyse der bphOP-Promotoraktivität bei konstitutiver Expression von rhlR
konnte ein Einfluss des QS-Regulators auf die Induktion gezeigt werden (Abb. 25).
Ob es sich dabei um eine direkte oder durch RpoS-vermittelte indirekte Kontrolle
handelt, wurde die Promotoraktivität von bphOP in einer ∆rpoS-Mutante, einer
∆rpoS-Mutante mit konstitutiv exprimiertem rhlR gegenübergestellt (Abb. 26). Die
Aktivität der bphOP-Reportergenfusion in einer ∆rpoS-Mutante ist dabei zwar stark
verringert, jedoch nicht vollständig reprimiert. Hingegen führte eine konstitutive
Expression von rhlR in der ∆rpoS-Mutante zu einer stark erhöhten Induktion des
bphOP-Promotors. Diese Ergebnisse bestätigen einerseits die vorliegenden Daten
einer Regulation durch RpoS, andererseits konnte weiterhin aufgezeigt werden, dass
RhlR ebenfalls in die Transkriptionsaktivierung von bphOP involviert ist.
Ergebnisse
80
Abb. 26: Promotoraktivität von bphOP bei konstitutiver Expression von rhlR in einer ∆rpoS-Mutante Für die Untersuchung einer RpoS-abhängigen Promotorinduktion von bphOP wurden eine transkriptionelle bphOP-lacZ-Reportergenfusion in das Genom von PA14 WT und einer ∆rpoS-Mutante integriert. Im Anschluss wurde mittels diparentalem Mating das plasmidkodierte rhlR (pUCPKS_rhlR, Dekimpe & Deziel, 2009) in die Stämme eingebracht. Die Messung erfolgte bei einer oD578 nm von 3,5 durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität.
Ergebnisse
81
3.1.4 Die intrazelluläre Signaltransduktion von PaBphP
Nachdem die Regulation der Gene bphO und bphP untersucht wurde, sollte die
weiterführende Signaltransduktionskaskade von PaBphP analysiert werden. Dabei
stand die Identifizierung der korrespondierenden Antwortregulatoren von PaBphP im
Fokus. In den meisten Prokaryoten bilden die kodierenden Gene für das
apo-Phytochrom, die chromophor-erzeugende Hämoxygenase und dem AR oftmals
ein Operon oder sie befinden sich in räumlicher Nähe (Bhoo et al., 2001).
Bioinformatische Analysen ergaben, dass diese Co-Lokalisation in P. aeruginosa
nicht vorliegt und es ferner keine Hinweise auf einen putativen AR der Sensorkinase
gibt. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein „genetischer Screen“
auf der Basis von Transkriptomdaten einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante (Barkovits et
al., 2011) durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Signalweiterleitung durch einen
Transfer der Phosphorylgruppe auf die dabei identifizierten putativen Regulatoren
untersucht.
3.1.4.1 Entwicklung eines genetischen Screens zur Identifizierung putativer
Phytochrom-Antwortregulatoren
Dieser Arbeit vorausgegangenen globalen Expressionsanalysen identifizierten eine
Vielzahl an Genen, deren Regulation durch eine Deletion von bphO bzw. bphP
beeinflusst wird (Barkovits et al., 2011). Dabei fiel unter anderem die starke
Repression des Gens PA4739 (Faktor 19) auf. Das Genprodukt von PA4739 ist ein
hypothetisches Protein mit putativ periplasmatischer Lokalisation und noch
unbekannter Funktion. Strukturell weist PA4739 eine 60 %-ige Ähnlichkeit zu OsmY
aus E. coli auf. Diese Übereinstimmung basiert auf der N-terminal gelegenen BON-
Domäne (bacterial OsmY and nodulation). Da weiterführende transkriptionelle
lacZ-Reportergenanalysen die PaBphP-abhängige Regulation von PA4739
verifizieren konnten (Barkovits et al., 2001), diente dieses Gen als Basis für einen
Screen zur Identifikation putativer AR von PaBphP. Das Prinzip dieses genetischen
Screens beruhte auf der Hypothese, dass die Genexpression von PA4739 über den
korrespondierenden AR von PaBphP reguliert wird. Eine Deletion des
entsprechenden Regulators sollte somit ein zur ∆bphP-Mutante vergleichbares
Expressionsprofil von PA4739 aufweisen.
Ergebnisse
82
Nach der Festlegung des experimentellen Ansatzes musste zunächst geklärt werden,
welche AR getestet werden sollten. Von allen bekannten Bakterienarten besitzt
P. aeruginosa die größte Anzahl an Genen, deren Produkte regulatorische Elemente
sind. Durch bioinformatische Datenbank-Recherchen konnten 107 annotierte und
putative AR ermittelt werden (www.pseudomonas.com). Ausgehend von diesen 107
putativen AR wurden zunächst 72 ausgewählt. Dabei standen AR, deren zugehörige
Sensorkinase noch nicht bekannt ist, besonders im Vordergrund.
Den Transkriptomanalysen von Barkovits et al. lag der P. aeruginosa-Stamm PAO1
zugrunde. Die verwendeten AR-Mutanten zur Durchführung des Screens wurden
hingegen von einer Transposon-Bibliothek, basierend auf dem PA14-Wildtypstamm,
bezogen (Liberti et al., 2006). Die Genome beider Stämme sind jedoch zu 96 %
homolog (Stover et al., 2000; Winsor et al., 2009), wobei die verwendete
Promotorregion von PA4739 sogar zu 99 % identisch mit dem Homolog aus PA14
PA14_62690 ist. Es konnte weiterhin kein Unterscheid in der Expression von
PA4739 in den beiden Stämmen beobachtet werde. Infolgedessen sind Effekte durch
einen Stammwechsel sehr unwahrscheinlich.
Für die Identifikation des korrespondierenden AR von PaBphP wurden 64
Transposonmutanten der PA14-Transposon-Bibliothek bezogen (Liberti et al., 2006;
bereitgestellt von Prof. Dr. S. Häussler, HZI Braunschweig). Weitere acht Gene die
für putative AR kodierenden, wurden im Rahmen einer Masterarbeit mittels
Plasmidintegration deletiert (Hettwer, 2013). In diese Stämme wurde eine PA4739-
lacZ-Reportergenfusion in das Genom integriert und die Promotoraktivität durch
Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität ermittelt. Die Werte wurden jeweils mit der
Reportergenaktivität im WT und der ∆bphP-Mutante verglichen. Die Messung erfolgte
sowohl in der frühen stationären Phase (oD578 nm 2,5), als auch in der stationären
Phase (oD578 nm 3,5). Die Ergebnisse des genetischen screenings sind in
nachfolgender Tabelle zusammengefasst (Tab. 16). Die Werte der PA4739-lacZ-
Promotoraktivität in den Mutanten sind dabei relativ zur bestimmten Promotoraktivität
im WT dargestellt.
Ergebnisse
83
Tax. 16: Zusammenfassung der PA4739-lacZ-Promotoraktivität in den Mutanten-Stämmen
PA14_ Gennummer
1
Funktion1
Charakteristische Domäne
2
oD578nm 2,5 [%]
oD578 nm 3,5 [%]
∆bphP Bakteriophytochrom Histidinkinase-D 57 8
PA14_00430 Putativer AR RRR-D 49 103
PA14_02260 AR CheY2 CheY-D 68 31
PA14_03470H Hypothetisches Protein RRR-D - 137
PA14_05320 AR PilG CheY-D 76 114
PA14_05330 AR PilH CheY-D 77 97
PA14_07840 AR AgtR RRR-D 128 94
PA14_06060 AR CreB RRR-D 108 121
PA14_06950 Putativer Transkriptionsregulator RRR-D 57 84
PA14_09690 AR BifR RRR-D 124 94
PA14_11120 Putativer AR RRR-D 156 103
PA14_11680 Putativer AR RRR-D 125 93
PA14_12780 AR RocA1 RRR-D 61 95
PA14_12810 AR RocR EAL-D, RRR-D 61 125
PA14_15290 Putativer Transkriptionsregulator HTH-D 113 106
PA14_16350 Putativer AR RRR-D 59 97
PA14_16500 AR WspR GGDEF-D 93 108
PA14_17670 AR ErdR RRR-D 77 94
PA14_20780 Hypothetisches Protein SpoIIE-D, RRR-D 48 72
PA14_22940 AR GltR RRR-D 62 73
PA14_23130 Hypothetisches Protein GGDEF-D 100 97
PA14_24350 AR CprR RRR-D 81 132
PA14_24710 AR RocA2 RRR-D 78 109
PA14_26570 Putativer Transkriptionsregulator HTH-D 69 113
PA14_26830H Putativer AR RRR-D 95 109
PA14_27810 AR CpoR RRR-D 101 120
PA14_29730H Putativer AR RRR-D 91 130
PA14_27940 Putativer AR RRR-D 140 118
PA14_27950 Hypothetisches Protein STAS-D 144 37
PA14_30580H Regulator VqsR HTH-D 76 66
PA14_30650 AR GacA RRR-D 104 88
PA14_30830 Putativer AR RRR-D 83 98
PA14_31960 AR CzcR RRR-D 92 78
PA14_32580 Putativer AR RRR-D 90 79
PA14_33920 Putativer Transkriptionsregulator RRR-D 107 108
PA14_38900 AR EraR RRR-D 82 89
PA14_38930H AR ErbR RRR-D 85 113
PA14_39360 Putativer Transkriptionsregulator σ
54-Interaktions-D,
HTH -D 97 85
PA14_41260 AR ParR RRR-D 79 111
PA14_41490 Hypothetisches Protein ANTAR-D 94 90
PA14_42970 Transkriptionsregulator Sfa2 σ
54-Interaktions-D,
HTH-D 107 90
PA14_43340H AR KdpE HTH-D 85 92
Ergebnisse
84
PA14_45620 AR CheY CheY-D 110 114
PA14_45880 Putativer AR RRR-D 100 91
PA14_46360H Putativer AR RRR-D 237 104
PA14_46990H Putativer AR RRR-D 153 100
PA14_49180 AR PhoP RRR-D 77 100
PA14_49440 Putativer AR RRR-D 109 78
PA14_50180 AR FleR RRR-D 102 82
PA14_50220 Transkriptionsregulator FleQ HTH-D 140 121
PA14_52250 Putativer AR RRR-D 91 82
PA14_54510 Putativer AR RRR-D 70 103
PA14_55810 AR PprB RRR-D 94 104
PA14_56750 Putativer AR RRR-D 149 81
PA14_56950 Putativer AR RRR-D 149 83
PA14_57140 Putativer AR GGDEF-D 129 86
PA14_58300 AR RoxR RRR-D 159 75
PA14_59770 AR RcsB RRR-D 121 106
PA14_60260 AR PilR RRR-D 113 79
PA14_62540 AR CbrB RRR-D 56 20
PA14_63150 AR PmrA RRR-D 77 106
PA14_63210 PDE RRR-D 107 107
PA14_65540 FimX EAL-D 92 100
PA14_64050 Putativer AR GGDEF-D 152 100
PA14_64570 AR IrlR HTH-D 95 110
PA14_65880 Putativer AR RRR-D 82 89
PA14_67680 AR NtrC RRR-D 123 104
PA14_68250 AR DctD RRR-D 72 88
PA14_69470 AR AlgR RRR-D 78 89
PA14_70750 AR PhoB RRR-D 45 74
PA14_70790 Putativer AR RRR-D 113 132
PA14_72720 AR MifR RRR-D 102 98
PA14_72380 AR AlgB σ
54-Interaktions-D,
RRR-D 102 93
Prozentuale Promotoraktivität von PA4739 im Vergleich zum WT
0 100 200 [%]
1:Annotierte PA14-Gennummern und Funktionen sind der Pseudomonas-Datenbank entnommen
(www.pseudomonas.com). 2: Durch die Pfam-Datenbank vorhergesagte Domänenstruktur (RRR-D: Empfängerdomäne eines
typischen ZKS mit N-terminaler DNA-bindender Effektordomäne; CheY-D: Phosphatempfänger-domäne; EAL: Phosphodiesterase-Motiv, GGDEF: Diguanylatzyklase-Motiv; STAS-D: Sulfat-Transporter- und Anti-Sigmafaktor Antagonist-Domäne; σ
54-Interaktions-D: σ
54-bindende Domäne;
SpoIIE: Domäne des Phase II Sporulationsproteins E; ANTAR: RNA-bindende Domäne) (www.pfam.sanger.ac.uk). H: Herstellung der Mutante sowie die Messungen erfolgten durch A. Hettwer (Hettwer, 2013).
Ergebnisse
85
Anhand der durchgeführten Expressionsanalysen zur Regulation von PA4739
konnten in drei der 72 untersuchten Stämme eine signifikant reduzierte
Promotoraktivität im Vergleich zum WT beobachtet werden (Tab. 16). Die Induktion
der PA4739-lacZ-Fusion in der ∆PA14_02260- (cheY2), ∆PA14_27950- sowie
∆PA14_62540- (cbrB) Mutante war dabei im Schnitt um etwa 70 % reduziert
(Abb. 27).
Abb. 27: Aktivität der PA4739-lacZ-Reportergenfusion in verschiedenen PA14-Stämmen In die Genome des WTs sowie in die 72 Mutanten mit inaktivierten putativen AR wurde eine transkriptionelle PA4739-lacZ-Reportergenfusion integriert. Die Messung der Expression erfolgte durch Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität bei einer oD578 nm von 3,5. Dargestellt sind die Ergebnisse der drei Mutanten mit signifikant reprimierter Reportergenaktivität im Vergleich zum WT. Die Werte sind dabei relativ zum WT gesetzt.
Die verminderte Promotoraktivität der PA4739-Reportergenfusion der über einen
genetischen Screen identifizierten Regulatoren impliziert, dass diese in der
Signaltransduktionskaskade der Phytochrom-vermittelten Transkriptionsaktivierung
von PA4739 involviert sind. Der dabei identifizierte AR CbrB weist mit einer
Empfänger- und einer DNA-bindenden Domäne die strukturellen Charakteristika
eines typischen AR eines Zwei-Komponenten-Systems auf. Daher könnte CbrB die
Transkription von PA4739 direkt aktivieren. Hingegen besitzen CheY2 und
PA14_27950 keine DNA-bindende Region, wodurch eine direkte Transkriptions-
initiation von PA4739 ausgeschlossen werden kann. CheY2 gehört in die Klasse der
Ergebnisse
86
CheY-ähnlichen AR. Aufgrund der STAS-(Sulfat-Transporter und Anti-Sigmafaktor
Antagonist) Domäne ist PA14_27950 als putativer Anti-Sigmafaktor Antagonist
annotiert. Es ist jedoch bekannt, dass Proteine mit einer STAS-Domäne, durch
Phosphorylierung reguliert werden können (Aravind & Koonin, 2000).
3.1.4.2 Phosphorylgruppenübertragung auf die putativen Regulatoren
PaBphP besitzt mit dem C-terminalen Histidin-Kinase-Motiv das typische
Charakteristikum einer Zwei-Komponenten-Sensorkinase. Die Kinaseaktivität konnte
bereits in dieser Arbeit gezeigt werden (vgl. 3.1.1.4). Demzufolge besteht die
Möglichkeit einer Phosphorylgruppenübertragung auf die identifizierten Regulatoren.
Ob ein solcher Phosphotransfer stattfindet, wurde anhand von Transphosphorylier-
ungsexperimenten untersucht. Für die Durchführung dieser Analysen wurden
zunächst C-terminale Strep-tagII-Fusionskonstrukte zur heterologen Überproduktion
der putativen AR CheY, CbrB und PA14_27950 konstruiert und anschließend
affinitätschromatographisch gereinigt. Für diese Experimente wurde PaBphP
ebenfalls heterolog in E. coli synthetisiert. Um die Abhängigkeit der
Transphosphorylierung von der Bindung eines Chromophors zu untersuchen, wurde
sowohl das apo- als auch das holo-Phytochrom verwendet. Die Synthese des holo-
Phytochroms erfolgte über eine Coexpression mit dem Hämoxygenase-Gen bphO
ebenfalls heterolog in E. coli. Als Positivkontrolle diente die bereits nachgewiesene
Übertragung der Phosphorylgruppe von dem holo-Phytochrom aus
P. syringae pv. tomato DC3000 (holo-PsBphP1) auf den Phytochrom-AR aus
Deinococcus radiodurans (DrBphR) (Bhoo et al., 2001). Diese beiden Proteine
wurden ebenfalls heterolog überproduziert und isoliert. Das PsBphP1 wurde
zusammen mit der Hämoxygenase in einem Operon C-terminal mit einem His6-tag
fusioniert und als holo-Phytochrom isoliert (Shah et al., 2012). Der Phytochrom-AR
DrBphR wurde mit Hilfe eines C-terminal fusionierten His6-tags gereinigt
(Bhoo et al., 2001) (Abb. 28).
Ergebnisse
87
Abb. 28: SDS-PAGE-Analyse von heterolog überproduzierten und isolierten Proteinen verschiedener Phytochrome und Regulatoren (A) Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (15 %) nach affinitätschromatographischer Reinigung mittels Strep-Tactin-Sepharose von CheY2, PA14_27950 und CbrB. (B) Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (10%) nach affinitätschromatographischer Reinigung mittels Strep-Tactin-Sepharose von holo- und apo-PaBphP. (C) Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (15 %) nach affinitätchromatographischer Reinigung mittels Ni-NTA von holo-PsBphP1 und DrBphR. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).
Die dargestellten SDS-PAGE-Analysen zeigen eine erfolgreiche Isolierung aller
Fusionsproteine. Bis auf CbrB, konnte ein Laufverhalten der Proteine entsprechend
der berechneten Größe beobachtet werden (Tab. 17). CbrB migrierte in der SDS-
PAGE bei etwa 60 kDa und weicht damit um etwa 7 kDa von der berechneten
molekularen Masse ab. Dieses divergente Laufverhalten konnte bereits in anderen
Arbeiten beobachtet werden (Abdou et al., 2011).
Tab.17: Berechnete molekulare Massen der überproduzierten und isolierten Proteine
Protein Berechnete molekulare
Masse [kDa]
CheY2 13,1
PA14_27950 17,7
CbrB 53,4
holo- / apo-BphP 80,8
holo-PsBphP1 82,2
DrBphR 15,6
Nach der Isolierung wurde zunächst eine mögliche Autophosphorylierung der
putativen Regulatoren bzw. die Kinaseaktivität der Phytochrome getestet. Diese
wurde durch die Inkubation mit radioaktiv markierten [γ32-P]-ATP mit anschließender
autoradiographischer Auswertung analysiert (Abb. 29).
Ergebnisse
88
Abb. 29: Kontrolle der Autophosphorylierungsaktivitäten verschiedener Phytochrome und Regulatoren
Autoradiogramm nach 20-minütiger Inkubation mit [γ32-P]-ATP der gereinigten Phytochrome, putative
AR CheY und CbrB, des putativen Anti-Sigmafaktor Antagonisten PA14_27950 sowie des Phytochrom AR DrBphR. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Auswertung erfolgte durch einen Phosphoimager. (*): ungefähr erwartete Bandenhöhe der Regulatoren.
Das resultierende Autoradiogramm zeigte deutliche Signale der autophosphorylierten
Phytochromproteine. Diese Kinaseaktivitäten deuteten darauf hin, dass die Proteine
in ihrer strukturell intakten Form gereinigt werden konnten. Die putativen AR CheY2
und CbrB sowie PA14_27950 und DrBphR wiesen hingegen wie erwartet keine
Autophosphorylierungsaktivität auf. Somit wurde im nächsten Schritt die
Transphosphorylierung untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Regulatoren jeweils
in einem Konzentrationsverhältnis von ~ 1:2 mit dem zuvor autophosphorylierten
Phytochrom inkubiert. Eine mögliche chromophorabhängige Phosphorylgruppen-
übertragung wurde durch die Verwendung von apo- (Abb. 30-A) bzw. holo-PaBphP
(Abb. 30-B) analysiert. Als Positivkontrolle diente der Transfer der Phosphorylgruppe
von holo-PsBphP1 auf DrBphR. Parallel wurde auch eine Übertragung von PaBphP
auf DrBhpR untersucht.
Ergebnisse
89
Abb. 30: Chromophorabhängige Phosphorylgruppenübertragung von PaBphP auf die putativen Regulatoren
Autoradiogramm nach 20-minütiger Inkubation der zuvor mit [γ32-P]-ATP autophosphorylierten
Phytochrome mit den verschiedenen Regulatoren. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Auswertung erfolgte durch einen Phosphoimager. Als Positivkontrolle wurde jeweils das holo-PsBphP1 zusammen mit DrBphR inkubiert (Spur 2). Der PaBphP Negativkontrolle wurde jeweils kein Regulator zugegeben (Spur 6). (A) Autoradiogramm der Phosphorylgruppenübertragung von apo-PaBphP auf die putativen Regulatoren CheY2 (Spur 3), PA14_27950 (Spur 4) und CbrB (Spur 5). (B) Autoradiogramm der Phosphorylgruppenübertragung von holo-PaBphP auf die putativen AR CheY2 (Spur 3), PA14_27950 (Spur 4) und CbrB (Spur 5). (*): ungefähr erwartete Bandenhöhe der aufgetrennten Regulatoren.
Aus dem Autoradiogramm geht hervor, dass neben der Positivkontrolle, dem
Phosphotransfer von holo-PsBphP1 auf den Phytochrom-AR DrBphR, auch eine
Phosphorylgruppenübertragung von PaBphP auf den AR DrBphR beobachtet
werden konnte. Dieser Transfer scheint dabei unabhängig einer Chromophorbindung
abzulaufen, da sowohl nach Inkubation mit apo- als auch mit holo-PaBphP der
Regulator phosphoryliert wurde. Hingegen konnte eine Übertragung der
Phosphorylgruppe von PaBphP auf putativen AR CheY2 und CbrB sowie
PA14_27950 nicht nachgewiesen werden.
Eine lichtunabhängige Autophosphorylierung der PaBphP-Kinaseaktivität konnte
bereits innerhalb dieser Arbeit gezeigt werden (vgl. 3.1.1.4). Aus der Literatur geht
weiterhin hervor, dass auch die Möglichkeit einer lichtregulierten Phosphoryl-
gruppenübertragung besteht (Bhoo et al., 2001). Daher wurden diese Versuche mit
holo-PaBphP in einem weiteren Ansatz unter definierten Hellrot- und
Dunkelrotlichtbedingungen durchgeführt. Parallel wurde ebenfalls die Trans-
phosphorylierung auf den AR aus D. radiodurans unter diesen Bedingungen näher
betrachtet (Abb. 31).
Ergebnisse
90
Abb 31: Lichtabhängige Phosphorylgruppenübertragung von PaBphP auf die putativen Regulatoren
Autoradiogramm nach 20-minütiger Inkubation der zuvor mit [γ32-P]-ATP autophosphorylierten
Phytochrome mit den verschieden Regulatoren unter Dunkelrotlicht (750 nm; Generierung der Pr-Form) und Hellrotlicht (690 nm; Generierung der Pfr-Form). Die Proben wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Auswertung erfolgte durch einen Phosphoimager. Als Negativkontrolle diente jeweils das PaBphP ohne zugegebenen Regulator (Spur 1). (A) Autoradiogramm der Phosphorylgruppenübertragung von holo-PaBphP auf DrBphR (Spur 2), die putativen Regulatoren CheY2 (Spur 3), PA14_27950 (Spur 4) und CbrB (Spur 5) unter Dunkelrotlicht. (B) Autoradiogramm der Phosphorylgruppenübertragung von holo-PaBphP auf DrBphR (Spur 2), die putativen Regulatoren CheY2 (Spur 3), PA27950 (Spur 4) und CbrB (Spur 5) unter Hellrotlicht. (*): ungefähr erwartete Bandenhöhe der Regulatoren.
Die Ergebnisse des Autoradiogramms impizieren einen von den Lichtbedingungen
unabhängigen Transfer der Phosphorylgruppe von PaBphP auf DrBphR, da sowohl
für die Pr- als auch für die Pfr-Form eine Übertragung beobachtet wurde. Im
Gegensatz dazu konnte auch unter definierten Rotlichtbedingungen vermutlich kein
Phosphotransfer auf die putativen Regulatoren festgestellt werden.
In der Pr-Form des Phytochroms scheint eine Phosphorylgruppenübertragung auf
CheY2 stattzufinden (Abb. 31-A), jedoch nimmt die Signalstärke des
phosphorylierten PaBphPs nicht wie bei der Transphosphorylierung auf DrBphR ab.
Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich nicht um eine echte Phosphorylierung
von CheY2, sondern es sich dabei um freies [γ32-P]-ATP handeln könnte.
Ergebnisse
91
3.1.5 In vivo-Quervernetzung zur Identifikation von PaBphP
Interaktionspartnern
In den vorangegangenen Transphosphorylierungsexperimenten konnte keine direkte
Überragung der Phosphorylgruppe von PaBphP auf die potentiellen Regulatoren
nachgewiesen werden. Aus diesem Grund wurde die Suche nach putativen AR
alternativ durch eine sogenannte in vivo-Quervernetzung (crosslinking) weitergeführt.
Bei der Phosphorylgruppenübertragung kommt es zu einer transienten Interaktion
zwischen der Sensorkinase und dem dazugehörigen AR. Dieser Moment kann durch
quervernetzende Agenzien (crosslinker) fixiert werden. Darüber hinaus ist es
möglich, durch diese Methode weitere Interaktionspartner des Phytochroms zu
identifizieren. Diese Arbeiten wurden im Rahmen der Masterarbeit von A. Hettwer
durchgeführt (Hettwer, 2013). Die Fixierung der putativen Interaktionspartner erfolgte
durch die Verwendung zweier verschiedener homobifunktionaler, quervernetzender
Substanzen: Formaldehyd und 2-2-Dithiobis(succinylpropionat) (DSP). Beide
Reagenzien unterscheiden sich dabei sowohl in der Art, als auch in dem Abstand der
reaktiven Gruppen. Formaldehyd besitzt ein Aldehyd als reaktive Gruppe und kann
sowohl mit primären, sekundären Aminogruppen sowie den Seitenketten von Lysin
und Tryptophan binden. Durch die sehr kurze Länge des „spacer Arms“ von 2,3-2,7 Å
werden Proteine, die sich in unmittelbarer Umgebung zueinander befinden, fixiert.
DSP wiederum kennzeichnet sich durch eine Armlänge von 12 Å zwischen den NHS-
Estern als reaktive Enden aus und vernetzt primären Aminogruppen.
Für die Quervernetzung wurde PaBphP in PA14 in der stationären Phase homolog
überproduziert und anschließend die quervernetzenden Substanzen den Kulturen
zugegeben. Als Kontrolle dienten unbehandelte Ansätze. Nach dem Abstoppen der
Reaktion wurde PaBphP mit den gebundenen Proteinen mittels affinititäts-
chromatographischer Reinigung isoliert und tryptisch verdaut. Die Identifizierung der
gebundenen Peptide erfolgte massenspektrometrisch in Kooperation mit der NG
Mikrobielle Antibiotikaforschung, der Ruhr-Universität Bochum.
Die größte Klasse an identifizierten Proteinen beinhaltet ribosomale Proteine sowie
Elongationsfaktoren. Diese können weitgehend als physiologische Interaktions-
partner ausgeschossen werden und sind vermutlich auf die Überproduktion von
PaBphP während der Quervernetzung zurückzuführen. Unter Ausschluss dieser
Proteine sind die erhaltenen Ergebnisse in nachfolgender Tabelle (Tab. 18)
aufgeführt.
Ergebnisse
92
Tab. 18: Zusammenfassung der durch MS identifizierten Interaktionspartner von PaBphP nach der Quervernetzung mit Formaldehyd und DSP
Gennummer1 Funktion1 MG (kDa)1 Ident.
Peptide2
Theor.
Peptide2
PA14_10700F,D
PaBphP 80,8 6 14
Transkription
PA14_08780(rpoC) F
RNA-Polymerase β-UE 154,4 34 129
PA14_63170(cueR)D Transkriptionsregulator 15,0 4 17
Energiemetabolismus
PA14_01290(coxB)F Cytochrom-C-Oxidase-UE 42,2 6 30
PA14_24445 (gdhB)D
NAD-abhängige Glutamat-
Dehydrogenase 18,3 7 137
PA14_30190 (icd)F Isocitrat-Dehydrogenase 45,6 13 34
PA14_30380(galU)F
UTP-Glukose-1-phosphat-
Uridyltransferase 31,2 10 15
PA14_43940 (sucD)F Succinyl-CoA-Synthetase α-UE 41,5 4 12
PA14_43950 (sucC)F Succinyl-CoA-Synthetase β-UE 30,2 11 24
PA14_43970 (ipdG)F,D
Dihydrolipamin-Dehydrogenase 5,01 16 32
PA14_73290 (atpF)F,D
F0F1 ATP-Synthase UE B 16,9 11 15
Lipidstoffwechsel
PA14_23370 (orfK)F
UDP N-Acetylglucosamin-2-
Epimerase 42,9 13 38
PA14_43680 (fabA)F
3-Hydroxy-decanoyl ACP-
Dehydratase 18,7 6 13
Chaperone und Proteasen
PA14_01710 (ahpC)F Alkyl-Hyperoxydase 20,5 9 15
PA14_41230 (clpx)F
APT-abhängige Protease, ATP-
bindende UE 46,9 14 33
PA14_57010 (groEL)F Chaperon GroEL 57,0 3 10
PA14_62970 (dnaK)F Chaperon DnaK 68,4 4 23
PA14_66790 (hslU)F
ATP-abhängige Protease, ATP-
bindende UE 50,0 12 42
Andere funktionelle Klassen
PA14_16630 (lptF)D
Äußeres Membranprotein,
Lipotoxin F 28,5 3 16
PA14_23420F Dehydrogenase 77,9 20 50
PA14_36110F Hypothetisches Protein 36,1 8 30
PA14_41250F Triggerfaktor 48,5 3 61
PA14_41570 (oprF)D Vorstufe der Porin-Pore der
äußeren Membran
37,6 5 23
PA14_58730 (pilA)F,D
TypIV-Pilin-UE 18,0 5 10
PA14_60800F ABC-Transporter, ATP-
bindendesProtein
77,9 20 50
PA14_62690F Hypothetisches Protein 11,7 4 6
PA14_66790F Hypothetisches Protein 11,8 4 6
1: Gennummer, Funktion und molekulare Masse wurden der Pseudomonas-Datenbank entnommen
(www.pseudomonas.com). 2: Ident. Peptide: identifizierte Peptide; Theor. Peptide: Theoretische Anzahl an Peptiden nach dem
trypischen Verdau. F: mit Formaldehyd als quervernetzendes Reagenz identifiziert.
D: mit DSP als quervernetzendes Reagenz identifiziert.
Ergebnisse
93
Insgesamt wurden 53 putative Interaktionspartner mit Hilfe der massenspektro-
metrischen Analysen identifiziert. Durch den Einsatz von Formaldehyd als
quervernetzendes Reagenz wurden im Vergleich zu DSP deutlich mehr Peptide an
PaBphP gekoppelt (Tab.18). Dabei wurden 21 Proteine nach der Behandlung mit
Formaldehyd, hingegen nur sieben nach Zugabe von DSP, identifiziert. Eine
Überschneidung in beiden Ansätzen war nur bei drei Genprodukten der Fall
(PA14_43970/IpdG; PA14_73290/ AtpF; PA14_57830/PilA).
Generell sind die identifizierten Interaktionspartner des Phytochroms keiner
spezifischen funktionellen Gruppe zuzuordnen. So befinden sich unter den
potentiellen Interaktionspartnern verschiedene Enzyme des Energie- und
Lipidstoffwechels. Weiterhin konnte so auch der Transkriptionsregulator CueR als
möglicher AR für PaBphP aufgedeckt werden. Dabri handelt es sich um einen
Regulator des MerR-Typs und ist an der Kupferstress-Antwort beteiligt (Thaden et
al., 2010). Ebenfalls wurde eine Gruppe von Proteinen an PaBphP gekoppelt, die an
oder in der Membran lokalisiert sind. Darunter befindet sich auch das Protein
PA14_62690, das in PAO1 dem Genprodukt von PA4739 entspricht. Wie im
vorherigen Abschnitt dargestellt, wird die Transkription dieses Gens von PaBphP
reguliert.
Ergebnisse
94
3.1.6 Pull-down-Experimente zur Identifikation von PaBphP
Interaktionspartnern
Neben dem in vivo-crosslinking gehören Pull-down-Experimente zu den gängigsten
Methoden um unbekannte Protein-Protein-Interaktionen aufzudecken. Ziel war dabei
die detektierten Interaktionspartner der in vivo-Quervernetzung zu verifizieren. Für
den Pull-down-Ansatz wurde das heterolog in E. coli überproduzierte und isolierte
PaBphP durch das fusionierte Strep-tagII an Strep-Tactin-Sepharose immobilisiert.
Für die globale Analyse der Protein-Protein-Interaktion wurde PA14-Rohextrakt mit
den löslichen Proteinen aus der stationären Phase (oD578 nm 3,5) dem an die Matrix
gekoppelten PaBphP zugegeben und 20 min inkubiert. Die weiteren Schritte
erfolgten analog einer affinitätschromatographischen Reinigung mit anschließender
SDS-PAGE-Analyse. Es konnte jedoch weder das Phytochrom noch potentielle
Interaktionspartner nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis
implizierte, dass PaBphP in dem zugegebenen Rohextrakt nicht stabil war. Um diese
Vermutung näher zu analysieren, wurde „freies“ PaBphP 20 min mit Zelllysat
inkubiert. Der Nachweis des PaBphPs erfolgte immunologisch gegen das Strep-tagII
des Fusionsproteins (Abb. 32). Eine Detektion des Fusionsproteins war jedoch nach
Zugabe des Rohextrakts nicht mehr möglich. Daraus kann vermutet werden, dass
PaBphP nicht stabil in dem zugegebenen Lysat ist und impliziert eine mögliche
proteolytische Degradation des Proteins. Daher ist es nicht möglich, anhand von in
vitro-Experimenten in dieser Form putative Interaktionspartner von PaBphP zu
identifizieren.
Abb. 32: Immunologische Detektion von PaBphP nach Inkubation mit PA14-Rohextrakt Nach 20-minütiger Inkubation von PaBphP mit PA14-Rohextrakt aus der stationären Phase (oD 578 nm 3,5) wurden die Proteine mittels SDS-PAGE separiert, auf eine PVDF-Membran transferiert und PaBphP durch immonologischer Nachweisverfahren gegen das Strep-tagII das Fusionsprotein detektiert. Es wurden 5 µg PaBphP und 15 µg Gesamtprotein aus Zelllysat eingesetzt. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).
Ergebnisse
95
3.1.7 Proteolytischer Abbau von PaBphP
Die Protein-Protein-Interaktionsstudien mittels Pull-down-Experimenten deuteten
darauf hin, dass das Phytochrom nach Zugabe von Rohextrakt nicht stabil ist und
möglicherweise eines proteolytischen Abbaus unterliegt. Neben der Regulation der
Genexpression, ist eine posttranslationale Regulation durch verschiedene Proteasen,
einer der wichtigsten Regulationsmechanismen in einer Zelle. Die regulierte
Proteolyse ist sehr effektiv und verläuft wesentlich schneller ab, als eine Änderung
des Expressionsprofils (Jenal et al., 2003). Dadurch wird eine rasche Adaptation an
sich änderte Umweltbedingungen gewährleistet. Auch unterliegen synthetisierte
Proteine einer Qualitätskontrolle und fehltranslatierte Polypeptide werden daraufhin
degradiert (Gottesman, 2003). Neben dieser Qualitätskontrolle wird auch die
Quantität des Proteoms an die gegeben Umweltbedingungen angepasst.
Überschüssige oder gar toxische Proteine werden ebenfalls durch verschiedene
Proteasen degradiert (Gottesmann, 2003).
Für die weitergehenden Analysen einer möglichen Degradation von PaBphP wurden
zuvor einige Kontrollexperimente durchgeführt um einen möglichen unspezifischen
Abbau auszuschließen. Dabei wurde ein genereller Abbau überproduzierter Proteine,
mit dem Ursprung aus P. aeruginosa sowie aus anderen Organsimen, analysiert. In
allen Fällen blieben die Proteine in Rohextrakt aus PA14 stabil und konnten durch
SDS-PAGE oder durch immunologische Nachweisverfahren gegen den Fusions-tag
nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
Die durchgeführten Untersuchen implizierten eine spezifische Degradation von
PaBphP durch eine oder mehrere Proteasen und wurde genauer untersucht.
PaBphP wird unter nativen Bedingungen zelldichteabhängig in der stationären Phase
gebildet. Um zu untersuchen, ob der Abbau ebenfalls mit der Populationsdichte
zusammenhängt, wurde PaBphP mit Rohextrakt aus verschiedenen
Wachstumsphasen inkubiert. Dabei wurden jeweils 5 µg des Phytochroms sowie
15 µg Gesamtprotein aus Zelllysat eingesetzt und die Reaktion nach 20 min durch
Zugabe von SDS-Probenpuffer und 10-minütiger Inkubation bei 95 °C gestoppt. Die
Analyse erfolgte durch eine immunologische Detektion gegen das fusionierte
Strep-tagII (abb. 33). Anhand dieser Analyse geht hervor, dass eine Degradation von
PaBphP erst bei Erreichen der stationären Phase, in der das Phytochrom unter
nativen Bedingungen exprimiert wird, stattfindet. Der proteotytische Abbau beginnt
Ergebnisse
96
ab einer oD578 nm von 2,5 und bei Zugabe von Lysat ab einer oD578nm von 3,5 ist nach
20-minütiger Inkubation kein Fusionsprotein mehr nachweisbar.
Abb. 33. Immunologische Detektion von PaBphP nach Inkubation von PA14-Rohextrakt aus verschiedenen Wachstumsphasen Eine zelldichteabhängige Degradation von PaBphP wurde durch eine 20-minütige Inkubation von PaBphP und PA14-Rohextrakt aus verschiednen Wachstumsphasen analysiert. Die Detektion von PaBphP erfolgte mittels immunologischer Nachweisverfahren gegen das Strep-tagII des Fusionsproteins. Es wurden jeweils 5 µg PaBphP und 15 µg Gesamtprotein aus Zelllysat eingesetzt. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).
Weiterhin wurde mittels einer Zeitreihe die Halbwertszeit von PaBphP in Rohextrakt
bestimmt (Abb. 34). Hierfür wurde Rohextrakt aus der stationären Phase
(oD578 nm 3,5) verwendet. Der Abbau von PaBphP ist sehr rasch und bereits nach
wenigen Minuten ist kein Fusionsprotein mehr detektierbar. Die Halbwertszeit von
PaBphP in Rohextrakt unter diesen Bedingungen beträgt etwa 5 min.
Abb. 34. Immunologische Detektion von PaBphP nach Inkubation von PA14-Rohextrakt nach verschiedenen Zeitpunkten Um die Halbwertszeit von PaBphP zu bestimmen wurde 5 µg PaBphP mit 15 µg Gesamtprotein aus Zelllysat (oD 578 nm 3,5) inkubiert und nach verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen. Der Nachweis von PaBphP erfolgte immunologisch gegen dass Strep-tagII des Fusionsprotein. K: Kontrolle, PaBphP ohne Lysatzugabe; M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).
Proteasen werden im Allgemeinen aufgrund ihrer Aktivitäten und ihrem
Katalysemechanismus in vier Klassen eingeteilt: Serin-, Cystein-, Apartat- und
Metalloproteasen. Welche Art von Protease/n für die Degradation von PaBphP
verantwortlich ist, wurde durch Zugabe verschiedener Inhibitoren analysiert. Der
verwendete Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche) blockiert die Aktivität von Serin-
sowie Cystein-Proteasen, wohingegen EDTA als Metallchelator die Aktivität von
Metalloproteasen hemmt. Um den Effekt dieser Inhibitoren auf die Stabilität von
Ergebnisse
97
PaBphP zu untersuchen, wurden den Ansätzen aus 5 µg Phytochrom und 15 µg
Gesamtprotein aus Zelllysat, der Protease-Inhibitor-Cocktail nach Angaben des
Herstellers, bzw. 20 mM ETDA zugefügt.
Nach einer 20-minütigen Inkubation erfolgte die immunologische Detektion des
Strep-tagII des PaBphP-Fusionsproteins (Abb. 35). Ohne Zugabe eines Inhibitors
wurde PaBphP fast vollständig abgebaut. Eine Blockierung der Serin- und Cystein-
Proteasen, durch einen Protease-Inhibitor-Cocktail, führte ebenfalls zu einer fast
vollständigen, jedoch verzögerten Degradation von PaBphP. Dies lassen die
zahlreichen detektierten Abbau-Fragmente vermutet. Die Chelierung aller Metalle im
Rohextrakt durch EDTA führt zu einer deutlich erhöhten Stabilität von PaBphP.
Jedoch konnte dadurch der Abbau nicht vollständig inhibiert werden.
Abb. 35: Immunologische Detektion von PaBphP nach Inkubation von PA14-Rohextrakt mit verschiedenen Proteaseinhibitoren Der Einfluss von verschiedenen Proteasen-Inhibitoren auf die Stabilität von PaBphP in PA14-Rohextrakt wurde durch Zugabe eines Protease-Inhibitor-Cocktails (Roche, nach Angaben des Herstellers) und bzw. EDTA (20 mM) analysiert. Es wurden jeweils 5 µg PaBphP und 15 µg Gesammtprotein aus Zelllysat (oD578 nm 3,5) eingesetzt. Nach einer 20-minütigen Inkubation erfolgte die Detektion von PaBphP immunologisch gegen das Strep-tagII des Fusionsproteins. K: Kontrolle ohne Lysat; M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).
Es handelt sich den Analysen zufoge um mindestens eine metallabhängige
Protease, die an der Degradation von PaBphP beteiligt ist. Eine Beteiligung weiterer
Serin- und Cystein-Protasen kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Bei den vorliegenden Daten handelt es sich in allen Fällen um in vitro-Experimente.
Ob PaBphP ebenfalls in der lebenden Zelle eines Abbaus unterliegt, wurde anhand
einer in vivo-Degradation analysiert. Dies wurde auf der Basis einer homologen
Ergebnisse
98
Überproduktion von PaBphP in PA14 durchgeführt. Durch eine Inhibierung der
Translation und der anschließenden quantitativen Analyse des Proteins über eine
immunologische Detektion lassen sich Rückschlüsse auf eine mögliche vorliegende
Degradation ziehen. Die homologe Überproduktion in PA14 wurde in der stationären
Phase bei einer oD578 nm von 3,5 induziert und nach 30-minütiger Inkubation die
Translation aller Proteine durch Zugabe des Antibiotikums Gentamicin inhibiert.
Durch die Bindung von Gentamicin an die ribosomale 30S-Untereinheit wird die
Synthese sämtlicher Proteine blockiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden der
Kultur Proben entnommen und wie zuvor durch den immunologischen Nachweis
gegen das Strep-tagII analysiert (Abb. 36).
Abb. 36: In vivo-Degradation von PaBphP Immunologische Detektion gegen das Strep-tagII des PaBphP-Fusionsproteins. Die homologe Überproduktion von PaBphP in PA14 wurde durch Zugabe von 0,75 % (w/v) Arabinose bei einer oD578 nm von 3,5 induziert. Nach 30 min wurde die Translation durch Zugabe von Gentamicin (400 µg/ml) gestoppt und zu verschiedenen Zeitpunkten der Kultur Proben entnommen. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).
Analog zu den in vitro-Untersuchungen, konnte in vivo ebenfalls eine Degradation
nachgewiesen werden. Diese verläuft in gleicher Weise sehr schnell ab und nach
etwa 15 min nach Abstoppen der Translation ist PaBphP nicht mehr detektierbar.
Ergebnisse
99
Kapitel II
3.2.1 Die Transkriptionsregulation von nbdA
Neben der Wahrnehmung von Licht durch Photorezeptoren, ist es für Organismen
ebenso von großer Bedeutung auf vorherrschende Gase zu reagieren. Ähnlich wie
bei der Adaptation an verschiedene Lichtbedingungen, müssen Organsimen ihren
Metabolismus ebenfalls dahingehend anpassen. In P. aeruginosa wird
beispielsweise Sickstoffmonoxid (NO) durch den Denitrifikationsprozess unter
anaeroben Bedingungen freigesetzt. Dieses Gas spielt vor allem innerhalb einer
Lebensgemeinschaft in Biofilmen eine Rolle. Durch die im inneren der Matrix
liegenden, anaerob wachsenden Zellen wird dieses Gas freigesetzt und führt ab
einem gewissen Schwellenwert zur Auflösung des Biofilms. Der Prozess der
Biofilmbildung- und auflösung wird unter anderem durch den second messenger
c-di-GMP reguliert. Dabei geht eine hohe Konzentration mit einer sesshaften in
Biofilmen, eine geringen mit einer motilen Lebensweise einher (Merritt et al., 2007).
Der Aufbau von c-di-GMP wird durch Diguanylatzyklasen (DGC), der Abbau von
Phosphodiesterasen (PDE) katalysiert
In Kooperation mit Prof. Dr. Karin Sauer der Binghampton University, USA wurde die
erste PDE in P. aeruginosa identifiziert, die durch Stimulation von NO an der
Biofilmauflösung beteiligt sein könnte. Basierend auf dieser Eigenschaft wurde das
Protein NbdA (NO-induced biofilm disperion locus A) benannt (Li et al., 2013). NbdA
ist durch die N-terminal lokalisierte MHYT-Domäne, die putativ das Gas wahrnehmen
kann und darüber die enzymatische Aktivität der PDE steuern könnte,
gekennzeichnet. Interessanterweise deckten Messungen der mRNA-Menge von
nbdA anhand von qRT-PCR-Experimenten eine erhöhte Transkription des Gens
nach einer NO-Zugabe auf. Der Einfluss des Gases auf die nbdA-Expression konnte
dabei sowohl in planktonisch lebenden Zellen, vor allem jedoch in den aufgelösten
Zellen, gezeigt werden (Li et al., 2013).
Unklar war bisher jedoch, wie die Transkription von nbdA dabei reguliert wird und
wurde daher in der vorliegenden Arbeit näher untersucht. Die Messungen erfolgten
zunächst in planktonisch wachsenden Zellen. Dies sollte Grundlage für weitere
Analysen unter Biofilmbedingungen schaffen.
Ergebnisse
100
3.2.1.1 Identifikation des Transkriptionsregulators
Bis heute gibt es nur wenig beschriebene Transkriptionsregulatoren in P. aeruginosa
die direkt mit NO interagieren. In der Regel ändern diese Regulatorproteine nach
Bindung des Gas-Liganden ihre Konformation und wirken dann regulierend auf die
Expression spezifischer Gene. Darunter befindet sich z.B. NsrR, ein Mitglied der Rrf2
Familie (Rodionov et al., 2005). Diese Klasse an Regulatoren fungiert jedoch als
Repressoren und NsrR kann daher vermutlich als Regulator von nbdA
ausgeschlossen werden. Der bekannteste NO-bindende Transkriptionsaktivator DNR
ist an der Regulation der Denitrifikation unter anaeroben Bedingungen beteiligt. DNR
induziert die Expression der Gene nirS, nirQ, norBC und nos, wodurch die
Nitratatmung gewährleistet wird (Rodionov et al., 2005). Diese Regulation ist schon
sehr gut verstanden und es ist bekannt, dass DNR an hochkonservierte
Konsensussequenzen an die DNA bindet. Eine Regulation von DNR kann aufgrund
dieser fehlenden Sequenz im Promotorbereich von nbdA auch weitgehend
ausgeschlossen werden. Zu einer weiteren wichtigen Klasse der NO-bindenden
Transkriptionsaktivatoren zählt FhpR. Dieser Transkriptionsregulator induziert das
Gen fhp. Dies kodiert für ein Flavohämoglobin, das an der NO-Detoxifizierung unter
aeroben Bedingungen beteiligt ist (Arai et al., 2005). Neben einer direkten Regulation
durch einen dieser genannten Transkriptionsfaktoren, die NO wahrnehmen können,
besteht ebenfalls die Möglichkeit einer indirekten Aktivierung. Eine solche indirekte
Regulation kann beispielsweise durch die QS-Systeme erfolgen. Diese haben sowohl
beim Aufbau des Biofilms, als auch bei der Auflösung einen bedeutenden Einfluss
durch die Regulation vieler biofilmassoziierter Genprodukte. Dabei sind vor allem die
beiden QS-Regulatoren LasR und RhlR involviert (de Kievit, 2009).
Um die Regulation von nbdA näher zu untersuchen, wurde eine transkriptionelle
lacZ-Reportergenfusion des Promotorbereichs von nbdA erstellt und in das Genom
des PAO1-WT integriert. Um eine mögliche Regulation durch FhpR bzw. den QS-
Regulatoren LasR und RhlR zu untersuchen, wurde die nbdA-lacZ-Reportergen-
fusion ebenfalls in die entsprechenden Mutantenstämme integriert. Bereits
vorliegende Daten belegen eine stationärphasenabhängige Expression von nbdA
(Heine, 2009). Basierend darauf wurde die Reportergenaktivität der nbdA-lacZ-
Fusion im WT und in einer ∆fhpR-, sowie ∆lasR- und ∆rhlR-Mutante durch
Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität nach einer 8-stündigen Anzucht und
Erreichen der stationären Phase ermittelt. Die Messungen der Reportergenaktivität
Ergebnisse
101
wurden sowohl unter aeroben Bedingungen, als auch unter sauerstofflimitierenden
Bedingungen durchgeführt (Abb. 37). Die Promotoraktivität von nbdA im weißt im WT
keinen Unterscheid unter aeroben und sauerstofflimitierenden Bedingungen auf.
Weiterhin scheinen unter aeroben Bedingungen weder FhpR, noch die QS-
Regulatoren LasR und RhlR einen Einfluss auf die Expression von nbdA zu haben
(Abb. 37-A). Ebenfalls ist die Reportergenaktivität unter sauerstofflimitierenden
Bedingungen durch das Fehlen der QS-Regulatoren LasR und RhlR unverändert
zum WT. Im Gegensatz dazu konnte eine etwa 60 % reduzierte Aktivität der nbdA-
lacZ-Fusion in der ∆fhpR-Mutante beobachtet werden (Abb.37-B).
Abb. 37: Promotoraktivität von nbdA in verschiedenen Deletionsmutanten Für die Untersuchung einer QS-abhängigen Regulation durch RhlR und LasR bzw. durch den Transkriptionsregulator FhlR wurde eine trankriptionelle nbdA-lacZ-Reportergenfusion in die Genome des PAO1 WT sowie einer ∆rhlR-, ∆lasR- und ∆fhpR-Mutante integriert. Die Messung erfolgte nach einer 8-stündigen Inkubation durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) ß-Galaktosidaseaktivität der nbdA-Reportergenfusion im WT und den Mutanten unter aeroben Bedingungen. (B) ß-Galaktosidaseaktivität der nbdA-Reportergenfusion im WT und in den Mutanten unter sauerstofflimitierenden Bedingungen.
Anhand dieser Untersuchungen kann ein Einfluss auf die Expression von nbdA durch
das QS-Systems weitgehend ausgeschlossen werden. Hingegen impliziert die stark
verringerte Reportergenaktivität in der ∆fhpR-Mutante unter sauerstoffarmen
Bedingungen, eine FhpR-vermittelte Transkriptionskontrolle und wurde im Hinblick
darauf weiter charakterisiert.
Ergebnisse
102
3.2.1.2 Charakterisierung der Regulation von nbdA durch FhpR
FhpR besitzt neben einer GAF-Domäne, über die das NO-Gas registriert wird, eine
σ54-Interaktions- sowie eine DNA-Bindedomäne. FhpR ist somit ein Transkriptions-
aktivator für die σ54-assoziierte RNA-Polymerase. Die Transkriptionsinitiation ist
daher ebenfalls von diesem alternativen Sigmafaktor (RpoN) abhängig. Dies konnte
bereits für die Transkriptionsaktivierung von fhp gezeigt werden (Arai et al., 2005).
Um zu untersuchen, ob dies auch für die Expression von nbdA zutrifft, wurde die
Reportergenfusion in eine ∆rpoN-Mutante eingebracht und nach einer 8-stündigen
Anzucht unter sauerstofflimitierenden Bedingungen die Promotoraktivität über die
Messung der ß-Galaktosidaseaktivität bestimmt (Abb. 38). Im Gegensatz zur
vorherigen Messung in einer ∆fhpR–Mutante wurde ein WT-ähnliches
Expressionsprofil in der ∆rpoN-Mutante ermittelt. Daraus kann vermutete werden,
dass der alternative Sigmafaktor keinen Einfluss auf die Trankription von nbdA hat.
Abb. 38: Vergleichende Promotoraktivität von nbdA im WT und einer ∆rpoN-Mutante Für die Untersuchung einer RpoN-abhängigen Promotorinduktion von nbdA wurde eine transkriptionelle lacZ-Reportergenfusion in das Genom des PAO1 WT sowie einer ∆rpoN-Mutante integriert. Die Messung erfolgte nach einer 8-stündigen Inkubation durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität.
Weiterhin ist bekannt, das die Expression von fhp bei einer erhöhten
NO-Konzentration unter sauerstofflimitierenden Bedingungen induziert wird (Arai et
al., 2005). Die in Kooperation durchgeführten qRT-PCR-Messungen zur
Quantifizierung der nbdA-mRNA-Menge wurde ebenfalls bereits eine NO-induzierte
nbdA-Transkription beobachtet (Li et al., 2013). Diese Messungen sollten im Rahmen
dieser Arbeit unabhängig durch die alternative Methode der Reportergenanalyse
verifiziert werden. Hierfür wurden die Kulturen mit verschiedenen NO-Donoren
Ergebnisse
103
versetzt. Zum einen wurde dazu Natriumnitroprussid (SNP), welcher in den qRT-
PCR-Experimenten eingesetzt wurde, sowie die NO-Donoren S-Nitroglutathion
(GSNO) und 6-(2-Hydroxy-1-Methyl-Nitrohydrazion)-N-Methyl-1-Hexamin (NONOate)
verwendet. Diese unterscheiden sich sowohl in der zeitlichen Freisetzung der NO-
Moleküle, als auch in dem molekularen Ablauf des NO-Freisetzungsprozesses. Zur
Analyse, ob NO einen Effekt auf die Promotoraktivität von nbdA hat, wurden den
Kulturen nach einer 6-stündigen Anzucht die NO-Donoren zugegeben. Es wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen und die Reportergenaktivität
analysiert. Es wurden dabei verschiedene Konzentrationen der NO-Donoren
eingesetzt und die Messungen ebenfalls in definiertem Minimalmedium durchgeführt.
Jedoch konnte unter keinen Bedingungen eine Steigerung der Reportergenaktivität
festgestellt werden. In Abb. 39 ist beispielhalt die Messung durch die Zugabe von 50
µM NONOate gezeigt. Diese Ergebnisse implizieren, dass unter den gewählten
Bedingungen NO keinen Einfluss auf die Expression von nbdA hat.
Abb. 39: Promotoraktivität von nbdA im WT unter Zugabe von 50 µM des NO-Donors NONOate Für die Untersuchung der Promotoraktivität von nbdA in Anwesenheit von NO wurde eine transkriptionelle nbdA-lacZ-Reportergenfusion in das Genom des PAO1 WT integriert. Nach einer 6-stündigen Inkubation wurde der Kultur 50 µM des NO-Donors NONOate zugegeben und zu verschiedenen Zeiten Proben entnommen und die ß-Galaktosidaseaktivität bestimmt. Als Kontrolle diente eine unbehandelte Kultur.
Neben einer NO-induzierten Expression von fhp, kann ebenfalls eine Zunahme der
Transkription durch Nitrat und Nitrit erfolgen. Eine mögliche Induktion der nbdA-
Ergebnisse
104
Expression wurde dahingehend ebenfalls untersucht. Dafür wurden den Kulturen
nach einer 6-stündigen Inkubation 5 mM NO2 bzw. 20 mM NO3 zugegeben. Die
dargestellten Messungen in Abb. 40 zeigen die Reportergenaktivität nach einer
Inkubationsdauer von 1 h. Eine Änderung der Aktivität der nbdA-Reportergenfusion
im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle wurde nicht detektiert. Auch eine
verlängerte Inkubationsdauer, sowie die Verwendung eines definierten
Minimalmediums zeigten keinen signifikanten Unterschied zu dem dargestellten
Ergebnis.
Abb. 40: Promotoraktivität von nbdA im WT unter Zugabe von NO2 und NO3 Für die Untersuchung der Promotoraktivität von nbdA in Anwesenheit von NO2 bzw. NO3 wurde eine transkriptionelle nbdA-lacZ-Reportergenfusion in das Genom von PAO1 WT integriert. Nach einer 6-stündigen Inkubation wurde den Kulturen 5 mM NO2 bzw. 20 mM NO3 zugegeben, nach 1 h Proben entnommen und die ß-Galaktosidaseaktivität bestimmt. Als Kontrolle diente eine unbehandelte Kultur.
Diskussion
105
4. Diskussion
Kapitel I
Phytochrome sind eine weitverbreitete Klasse von Rotlichtrezeptoren, deren
Vorkommen und Funktion vor allem bei Pflanzen gut verstanden ist. Der rasante
Fortschritt auf dem Gebiet der Genomsequenzierung führte seit Mitte der 90er Jahre
zur Aufdeckung von Phytochrom-Homologen auch in Cyanobakterien, Pilzen und
heterotrophen Bakterien. Vor allem in Organismen, die nicht zu einer oxygenen
Photosynthese befähigt sind, ist die physiologische Rolle von Rotlichtsensoren bis
heute nahezu ungeklärt. Das nosokomiale Pathogen P. aeruginosa gehört zu den
ersten nicht-photosynthetischen, heterotrophen Organismen, in denen ein
Phytochrom identifiziert wurde. Bisherige funktionale Analysen wurden jedoch
ausschließlich anhand von heterolog produziertem PaBphP in vitro durchgeführt und
auch konnte die physiogische Bedeutung des Photorezeptors bisher nicht eindeutig
geklärt werden (Tasler et al., 2005; Barkovits et al., 2008; Barkovits et al., 2011). Um
die Besonderheit eines Phytochroms in diesem heterotrophen Organismus
ganzheitlich verstehen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit neben der
biochemischen Charakterisierung von homolog produziertem PaBphP und
phänotypischen Untersuchungen von Deletionsmutanten, ebenfalls die genetische
Regulation sowie die weiterführende intrazelluläre Signaltransduktionskaskade
analysiert.
4.1.1 P. aeruginosa besitzt ein funktionelles Phytochrom
In früheren Untersuchungen konnte anhand von rekombinant hergestelltem PaBphP
bereits die Funktion eines Rotlichtrezeptors sowie eine Kinaseaktivität nachgewiesen
werden (Tasler et al., 2005). Da sich durch in vitro-Studien gewonnene Erkenntnisse
jedoch nicht immer analog auf den lebenden Organismus übertragen lassen, wurde
das Phytochrom in dieser Arbeit erstmals mittels einer chromosomal integrierten
Strep-tagII-Fusion homolog unter der Kontrolle seines nativen Promotors isoliert. Die
anschließende Analyse der spektralen Eigenschaften ergaben Absorptionsmuster,
wie sie bereits für das heterolog produzierte PaBphP beobachtet wurden
Diskussion
106
(Tasler et al., 2005). Die ermittelten Absorptionsmaxima bei 700 nm und 754 nm sind
typisch für bakterielle Phytochrome, die Biliverdin zur Assemblierung eines holo-
Phytochroms nutzen (Bhoo et al., 2001).
Biliverdin (BV) ist das Produkt einer enzymatischen Spaltung von Häm durch eine
Hämoxygenase. Im Gegensatz zu allen anderen sequenzierten Bakterienarten,
besitzt P. aeruginosa mit BphO und HemO zwei solcher Hämoxygenasen, die Häm
regiospezifisch zu BV IXα bzw. BV IXβ und BV IXδ spalten können (Ratliff et al.,
2001; Wegele et al., 2004).
Die Isolierung und spektroskopische Analyse von homolog produziertem PaBphP
aus den entsprechenden ∆bphO- und ∆hemO-Deletionsmutanten ergab, dass
BV IXα der native Chromophor des Phytochroms aus P. aerugionsa ist. Dies stimmt
mit den Daten für das heterolog gereinigte PaBphP überein (Tasler et al., 2005). Im
Gegensatz dazu konnte eine Bindung von BVI Xδ an PaBphP (Tasler et al., 2005),
für das homolog isolierte Phytochrom nicht betätigt werden. Diese Diskrepanz ist
vermutlich darauf zurückzuführen, dass es sich bei Tasler et al, um einen in vitro-
Versuch handelte, bei dem der Chromophor im Überschuss vorlag.
Bei der Katalyse von Häm zu BV wird das zentrale Eisenatom des Häms freigesetzt.
Untersuchen zur Funktion von HemO zeigten, dass durch diese Hämoxygenase
extrazellulär importiertes Häm unter Eisenmangelbedingungen gespalten wird und
der Gewinnung des divalenten Kations dient (Ratliff et al., 2001). Die dabei
entstanden BV-Isomere BV IXβ und BV IXδ, nicht aber BV IXα, können zudem im
Kulturüberstand nachgewiesen werden (Barker et al., 2012). Es kann daher vermutet
werden, dass die Assemblierung von BV IXδ an PaBphP nur in vitro stattfindet und
für P. aeruginosa in vivo keine physiologische Relevanz hat.
Die durchgeführten spektroskopischen Analysen zeigten weiterhin eine
unvollständige Photokonversion in die Pfr-Form. Die Bedeutung dieser Pfr-
angereicherten Form ist bisher noch ungeklärt, wurde aber ebenfalls für andere
Rotlichtrezeptoren beschrieben. So zeichnet sich beispielsweise das Phytochrom aus
A. tumefaciens AtBphP2 sowie Avp1 aus A. vitis S4 durch eine distinkte Pr- und eine
Pfr-angereicherte Form aus (Karniol & Vierstra, 2003; Rottwinkel et al., 2010). Die
Pfr-angereicherte Form ist zugleich der Grundzustand von PaBphP, d.h. die Form in
der das Phytochrom ohne Bestrahlung vorlieg. Diese sogenannte bathy-Grundform
wurde bereits bei mehreren bakteriellen Phytochromen nachweisen, vor allem in
Organismen der Ordnung Rhizobiales (Rottwinkel et al., 2010). Durch die
Diskussion
107
symbiontische Lebensart mit Pflanzen bekommen diese Organismen wenig Licht,
wodurch sich die langwellige Grundform entwickelt haben könnte. P. aeruginosa als
ubiquitär vorkommender Organismus ist nahezu in allen ökologischen Nischen
anzutreffen. Licht längerer Wellenlänge hat eine weitere Reichweite in den Boden als
kurzwelliges Licht (Smith, 1982). So könnte das PaBphP aus ähnlichen Gründen, wie
einige Rhizobiales, die in der Erbe leben, eine dunkelrotlichtabsorbierende
Grundform entwickelt haben, die gewähreistet auch auf Licht zu reagieren, wenn sie
sich nicht direkt an der Oberfläche befinden.
Die gewonnene Proteinmenge des synthetisierten Phytochroms unter der Kontrolle
des nativen Promotors war mit einer Konzentration von 25 µg/l Zellkultur sehr gering.
Unter Berücksichtigung der Verunreinigungen kann eine theoretische Menge von
~52 Molekülen PaBphP pro Zelle in P. aeruginosa in der stationären Phase
berechnet werden. Das Phytochrom Cph1 aus Synechocystis sp. wurde unter ähnlich
nativen Bedingungen isoliert und Berechnungen zufolge befinden sich etwa 23
Moleküle des Rotlichtrezeptors in jeder Zelle (Hübschmann et al., 2001). Für die
Phytochrome aus A. tumefaciens werden, basierend auf spektroskopischen Analysen
des Zellextraktes unter Einbezug des molaren Extinktionskoeffizienten der Pr- und
Pfr-Form, zehn für das AtBphP1 und 19 Moleküle für das AtBphP2 pro Zelle
postuliert (Oberpichler et al., 2006). Die Autoren geben jedoch zu bedenken, dass
aufgrund der angewandten Methode nicht auszuschließen ist, dass sich ein Teil der
Phytochromproteine in der unlöslichen Fraktion befand. Da mittels immunologischen
Nachweisverfahren sichergestellt wurde, dass sämtliches PaBphP löslich war, kann
eine derartige Messungenauigkeit hier ausgeschlossen werden.
Bakterielle Rotlichtrezeptoren sind in der Regel Sensorproteine eines typischen Zwei-
Komponenten-Systems (Bhoo et al., 2001). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt
werden, dass das Phytochrom aus P. aeruginosa zwar die spektralen Eigenschaften
mit anderen untersuchten Rotlichtrezeptoren teilt, sich jedoch hinsichtlich der
Kinaseaktivität unterscheidet. So scheint die Autophosphorylierung von PaBphP
nicht von einer Chromophorbindung oder den vorherrschenden Lichtbedingungen
abhängig zu sein. Generell sind Phytochrome zwar im klassischen Sinne
Photorezeptoren, jedoch kann ihre Kinaseaktivität auch durch weitere Stimuli
reguliert werden. Das Phytochrom AtBphP1 aus A. tumefaciens z.B. weist neben
Licht ebenfalls eine temperaturabhängige Modulation der
Diskussion
108
Autophosphorylierungsaktivität auf. Dabei ist die Kinaseaktivität bei 25 °C am
höchsten und sinkt mit zunehmender Temperatur (Njimona et al., 2011). Die
Analysen zur Kinaseaktivität von PaBphP wurden bisher jedoch nur bei RT
durchgeführt. Eine temperaturbedingte Regulation ist für ein ubiquitär verbreitetes
Bakterium wie P. aeruginosa durchaus möglich und könnte in zukünftigen Studien
untersucht werden. Es ist auch weiterhin nicht auszuschließen, dass PaBphP
generell phosphoryliert vorliegt. Dies könnte z.B. durch SDS-PAGE-Analysen unter
Zugabe von Phos-tagTM geklärt werden. Phos-tagTM bindet spezifisch phosphorylierte
Gruppen und verändert so das Laufverhalten der Proteine in einer SDS-PAGE. Der
Vergleich von dephosphorylierten PaBphP, durch Behandlung mit alkalischer
Phosphatase, und dem nativ isolierten Protein könnte diese Frage klären.
4.1.2 Die Transkriptionsregulation des Phytochroms aus PA14 ist
komplex
Um ein besseres Verständnis für die Rolle von PaBphP in P. aeruginosa zu erlangen,
sollten im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe von Promotorstudien detaillierte Einblicke in
die Transkriptionsregulation des Phytochroms gewonnen werden. Zu Beginn der
Arbeit war bereits bekannt, dass die für die Ausbildung eines holo-Phytochroms
kodierenden Gene bphO und bphP in einem bicistronischen Operon organisiert sind,
dessen Transkription unter der Kontrolle von RpoS steht (Barkovits et al., 2008). Die
in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Daten deuten jedoch auf eine weitaus
komplexere Regulation der Phytochromkomponenten hin.
4.1.2.1 bphP besitzt einen eigenen Promotor
Die durchgeführten Promotorstudien deckten erstmals eine von bphO unabhängige
Expression für bphP auf. Die Induktion des Promotors ist analog zu dem bphOP-
Cotranskript zelldichteabhängig und in der stationären Phase maximal. Die
postulierte Regulation durch den übergeordneten QS-Regulator LasR (Schuster et
al., 2004; Gilbert et al., 2009) konnte anhand der durchgeführten Reportergenstudien
einer bphP-lacZ-Fusion in einer ∆lasR-Mutante nachgewiesen werden. Die in diesem
Zusammenhang beschriebene putative LasR-Bindestelle, in dem intergenischen
Diskussion
109
Bereich zwischen bphO und bphP, wurde mittels DMSA-Studien mit isoliertem LasR
überprüft. Es wurde jedoch keine Bindung des Regulatorproteins an die postulierte
DNA-Bindestelle nachgewiesen. Die mit Hilfe von bekannten LasR-Bindestellen
ermittelte Konsensussequenz weist zudem lediglich eine geringe Homologie zu
diesem Bereich auf (Gilbert et al., 2009). Daher ist anzunehmen, dass die
Transkriptionskontrolle von bphP durch LasR indirekt erfolgt. Weitere
Untersuchungen in Form von Reportergenanalysen sollten dahingehend näheren
Aufschluss über die beteiligten Regulatoren geben.
Aufgrund der Netzwerk-Architektur der QS-Systeme in P. aeruginosa ist LasR unter
anderem an der Expressionskontrolle von rhlR beteiligt. RhlR ist, wie LasR, ein
Transkriptionsregulator für viele Gene, deren Produkte die Pathogenität von
P. aeruginosa vermitteln. Weiterhin unterliegt auch rpoS, der alternative Sigmafaktor
der stationären Phase, einer Regulation durch RhlR.
Es wurde zwar eine verringerte Aktivität der bphP-Reportergenfusion in einer ∆rhlR-
Mutante festgestellt, jedoch konnte bei einer konstitutiven Expression von rhlR keine
erhöhte Promotorinduktion beobachtet werden. Daher ist RhlR vermutlich ebenfalls
kein direkter Transkriptionsaktivator von bphP. Die verringerte Expression von bphP
in der ∆rhlR-Mutante unterliegt somit wahrscheinlich ebenfalls einem indirekten
Effekt. Da RhlR ein Transkriptionsaktivator von rpoS ist, wurde die bphP-
Promotoraktivität entsprechend in einer ∆rpoS-Mutante analysiert. Die reprimierte
Aktivität der Reportergenfusion in dieser Mutante deutet an, dass bphP durch den
alternativen Sigmafaktor reguliert wird. Globale Transkriptomanalysen einer ∆rpoS-
Mutante unterstützen diese Ergebnisse (Schuster et al., 2004). In diesen
Untersuchungen wurde ebenfalls eine reprimierte Expression von bphP festgestellt.
Anhand von Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierungen (RNA-Seq) konnte ein
putativer Transkriptionsstartpunkt (TSS) in der potentiellen Promotorregion von bphP
ermittelt werden (Häussler, unveröffentlichte Daten). Dieser liegt dabei 59 bp
stromaufwärts des ATG-Startcodons und befindet somit im kodierenden Bereich von
bphO (Abb. 42-A). Die Bindesequenz des alternativen Sigmafaktors RpoS (σS) an
den Promotorbereich in der -10-Region, relativ zum TSS, ist konserviert
(CATATACT) (Schuster et al., 2004). Durch eine 72 %ige Übereinstimmung dieser
Sequenz in der -10-Region vor dem TSS von bphP kann eine RpoS-Bindestelle
vermutet werden (Abb. 42-B).
Diskussion
110
Abb. 42: Promotorbereich von bphP mit postulierter σ
S-Bindestelle
(A) Durch Reportergenanalysen konnte eine RpoS-abhängige Transkriptionskontrolle von bphP gezeigt werden. Unter Einbezug des putativen TSS bei -59 bp relativ zum Translationsstartpunkt (Häussler, unveröffentlichte Daten) ist die mögliche Bindestelle des alternativen Sigmafaktor RpoS in der -10 Region dargestellt. Grün unterstrichen: postulierte LasR-Bindestelle; schwarz unterstrichen: TGA: Translationsstopp von BphO, ATG: Translationsstart von BphP. (B) Vergleich der RpoS-Konsensussequenz mit der putativen RpoS-Bindestelle.
Da es sich bei den RNA-Seq-Experimenten um einen globalen Ansatz handelt, sollte
der postulierte TSS durch ein weiteres Experiment verifiziert werden. Dies könnte
beispielsweise durch 5´RACE-Analysen (rapid amplification of cDNA ends) erfolgen.
Bei dieser Methode werden ausgehend von isolierter mRNA an die 5´Enden
Oligonukleotidlinker ligiert und cDNA mit einem genspezifischen Primer synthetisiert.
Darauf folgt eine Standard-PCR-Reaktion mit einem genspezifischen und einem zu
dem ligierten Oligonukleotidlinker komplementären Primer. Dies liefert den
vollständigen 5´-untranslatierten Bereich eines Gens.
Da die Aktivität der bphP-lacZ-Reportergenfusion in der ∆rpoS-Mutante nicht
vollständig reprimiert ist, deutet auf die Beteiligung von mindestens einem weiteren
Regulator hin. In den durchgeführten Promotorstudien wurde auch eine indirekte
Modulation durch den QS-Regulator LasR nachgewiesen. LasR kontrolliert über eine
positive rhlR-Transkription nicht nur das zweite QS-System in P. aeruginosa, sondern
ist auch an der Regulation vieler weiterer globaler Transkriptionsregulatoren beteiligt.
So wurden infolge von globalen Transkriptomanalysen etwa 300 LasR-abhängige
Gene identifiziert (Schuster et al., 2003; Waite et al., 2005). Darunter befinden sich
auch beispielsweise der alternative Sigmafaktor PvdS, der die Synthese der
Pyoverdine reguliert, RsaL, der die Expression von Genprodukten kontrolliert, die an
Diskussion
111
der Motilität und Biofilmbildung beteiligt sind, oder VqsR (Gilbert et al., 2009). Der
globale Transkriptionsfaktor VqsR (virulence and quorum sensing regulation) ist
dabei ein noch nicht lang bekannter Masterregulator der virulenzinduzierten
Genexpression. Die Expression von vqsR wird direkt über die Bindung von LasR an
die Promotorregion reguliert und induziert unter artifiziellen Virulenzbedingungen die
Transkription von 113 Genen (Li et al., 2007). Interessanterweise zeigte sich in
diesen globalen Transkriptomanalysen einer ∆vqsR-Mutante eine Repression von
bphP auf. Unter Berücksichtigung dieses Hinweises auf eine VqsR-abhängige
Transkriptionsregulation des Phytochroms, ist es also möglich, dass PaBphP eine
Rolle in der Pathogenität von P. aeruginosa einnehmen könnte.
Erste Belege für diese Hypothese ergeben sich aus den phänotypischen
Untersuchungen der ∆bphO- und ∆bphP-Mutanten. In der stationären Phase wurde
in beiden Deletionsstämmen signifikant weniger PQS im Vergleich zum WT
detektiert. Auch Transkriptomdaten dieser Mutanten deuteten diesen Einfluss suf die
PQS-Synthese bereits an. Dieser konnte jedoch bisher nicht bestätigt werden
(Barkovits et al., 2011). Die Bildung von PQS verläuft über mehrere Schritte und wird
von den Genprodukten des Operons pqsA-D sowie von pqsH synthetisiert. Dabei
übernimmt PqsH den letzten Schritt der Synthese von HHQ zu PQS (Abb. 43).
Abb. 43: PQS-Syntheseweg Ausgehend von Anthranilat wird über mehrere Zwischenstufen durch PqsABCD HHQ gebildet. Die Umsetzung von HHQ zu PQS erfolgt durch PqsH.
In der ∆bphO- und ∆bphP-Mutante ist jeweils die PQS-Menge verringert, nicht aber
das Vorläufermolekül HHQ. Dies deutet darauf hin, dass der letzte Schritt der der
PQS-Synthese, die Umsetzung von HHQ zu PQS, durch das Phytochrom beeinflusst
werden könnte. Anhand der Transkriptomanalysen einer ∆vqsR-Mutante wurde
ebenfalls eine Repression des Gens pqsH festgestellt (Juhas et al., 2004). Diese
Diskussion
112
Regulation verläuft jedoch vermutlich indirekt, da in DMSA-Experimenten mit
isoliertem VqsR keine Bindung an die Promotorregion von pqsH festgestellt wurde
(Liang et al., 2012). Diese Regulation von pqsH könnte daher möglicherweise über
das Phytochrom erfolgen. Um die Hypothese zu prüfen, könnte in zukünftigen
Untersuchungen zum einen die Transkription von bphOP und bphP in einer ∆vqsR-
Mutante, und zum anderen die Transkription von pqsH in einer ∆bphO- und ∆bphP-
Mutante durch Reportergenanalysen untersucht werden.
4.1.2.2 Das bphOP-Cotranskript: RpoS- und RhlR-reguliert?
Zu Beginn der Arbeit bereits bekannt, dass die Gene bphO und bphP in einem
bicistronischen Operon organisiert sind und die Transkription durch den alternativen
Sigmafaktor RpoS reguliert wird (Barkovits et al., 2008). Die Expression des Operons
ist jedoch in einer ∆rpoS-Mutante nicht vollständig reprimiert und deutet auf das
Mitwirken eines oder mehrere zusätzlicher Transkriptionsregulatoren hin. Die
Expression des bphOP-Cotranskripts wurde daher analog zu bphP auf eine mögliche
Regulation durch die QS-Systeme analysiert. Die Aktivität bphOP-lacZ-Fusion war
dabei in einer ∆lasR-Mutante um etwa 50 % reprimiert. Jedoch kann anhand von
DMSA-Analysen eine direkte Bindung von LasR an den Promotorbereich
stromaufwärts von bphO vermutlich ausgeschlossen werden. Diese Ergebnisse
deuten eine indirekte Kontrolle von LasR auf die bphOP-Transkription an. Die
weiterführenden Analysen in der ∆rhlR-Mutante wiesen ebenfalls eine verringerte
Expression des bphOP-Promotors auf. Um wiederum einen indirekten Effekt von
RhlR durch die Kontrolle von rpoS auszuschließen, wurde rhlR konstitutiv in einer
∆rpoS-Mutante exprimiert. Ob die dabei beobachtete erhöhte Reportergenaktivität
der bphOP-lacZ-Fusion durch eine direkte Interaktion von RhlR an die
Promotorregion resultiert oder ob dies auf einen indirekten Effekt zurückzuführen ist,
kann anhand dieser Analysen jedoch nicht abschließend geklärt werden. Hierfür
müssten weitere Experimente in Form von DMSA-Analysen erfolgen. Jedoch ist der
Großteil von heterolg produzierten RhlR unlöslich, sodass eine Reinigung erschwert
wird (Medina et al., 2003). Schuster and Greenberg postulieren allerdings, dass eine
erhöhte Promotorinduktion, bei einer erhöhten rhlR-Expression, meistens auf eine
direkte Interaktion von DNA und dem Transkriptionsaktivator zurückgeht (Schuster et
al., 2007). Durch bioinformatische Analysen des Promotorbereichs konnte zudem
Diskussion
113
eine putative RhlR-Bindestelle in dieser Region ermittelt werden (www.prodoric.com).
Die kombinierte Transkriptionskontrolle durch RpoS und einem QS-Regulator, wie sie
bei bphOP vermutlich auch zutrifft, scheint nicht ungewöhnlich zu sein. Dies wurde
bereits für diverse QS-regulierte Gene ebenfalls nachgewiesen (Winzer et al., 2000;
Schuster et al., 2004; Waite et al., 2005). Darunter befindet sich beispielsweise das
Gen lecA, welches für das zytotoxische Lektin kodiert. Die Expression von lecA
benötigt sowohl RpoS als auch RhlR für eine vollständige Geninduktion (Winzer et
al., 2000).
Anhand von Primer-Extension-Analysen wurde ein Transkriptionsstartpunkt (TSS)
stromaufwärts von bphO (-59 bp relativ zum TSS) nachgewiesen (Barkovits et al.,
2008). Die putative Bindestelle von RhlR befindet sich 45 bp stromaufwärts von
diesem TSS (Abb. 43). Die Organisation dieser regulatorischen Elemente ist in der
bereits erwähnten lecA-Promotorregion sehr ähnlich. So wird auch 42 bp
stromaufwärts vor dem TSS eine RhlR-Bindestelle postuliert (Winzer et al., 2000).
Der Abstand zwischen der Bindestelle eines QS-Regulators scheint generell eine
wichtige Rolle zu spielen und ist möglicherweise ein Indiz für eine direkte Interaktion
mit der DNA (Winzer et al., 2000). Detaillierte Analysen der Promotorregionen von
beispielsweise dem Operon rhlAB, welches ebenfalls einer Transkriptionskontrolle
von RhlR unterliegt, weist ebenfalls eine Bindestelle 40 bp vor dem TSS auf
(Pearson et al., 1997). Diese Beispiele unterstützen die Hypothese einer RhlR-
Bindestelle in der Promotorregion stromaufwärts von bphO.
Abb. 43: Promotorbereich von bphOP mit postulierter σ
S- und RhlR-Bindestelle
Durch Primer-Extension-Experimente wurde ein TSS bei -59 bp relativ zum Translationsstart (ATG, nicht dargestellt) ermittelt. Die postulierte RpoS-Bindestelle in der -10 Region (Barkovits et al., 2008) ist blau dargestellt. Die putative RhlR-Bindestelle wurde bioinformatisch ermittelt (grün, www.prodoric.com). TSS: Transkriptionsstartpunkt.
Diskussion
114
4.1.3 Einblicke in die Signaltransduktion von PaBphP
Bakterielle Phytochrome zeichnen sich durch den Aufbau einer typischen Sensor-
Histidin-Kinase (SHK) eines Zwei-Komponenten-Systems aus. Diese Funktion
konnte im Rahmen dieser Arbeit sowohl für das apo- sowie für das holo-Protein
bestätigt werden. Der Signaltransduktionsweg in einem deratigen System erfolgt im
Anschluss an die Autophosphorylierung der SHK durch eine Phosphorylgruppen-
übertragung auf einen zugehörigen Antwortregulator (AR), der daraufhin die
Transkription spezifischer Gene aktiviert. Anders als bei einigen anderen bakteriellen
Phytochromsystemen befindet sich der zugehörige AR nicht zusammen mit der
Hämoxygenase bphO und dem apo-Phytochrom bphP in einem tricistronischen
Operon. Um diesen AR von PaBphP zu identifizieren, wurden zwei verschiedene
experimentelle Ansätze gewählt. Zum einen sollten mittels eines genetischen
Screens putative Regulatoren, die an der Phytochrom-vermittelten Signaltransduktion
beteiligt sind ermittelt werden. Anschließende Phosphotransferexperimente sollten
klären, ob eine direkte Übertragung der Phosphorylgruppe auf die identifizierten
putativen Regulatoren stattfindet. Zum anderen wurde auf der Basis einer in vivo-
Quervernetzung die transiente Interaktion einer Sensorkinase mit einem AR bei der
Phosphorylgruppenübertragung genutzt, um diesen Moment zu fixieren. Durch diese
Methode werden neben putativen AR ebenfalls weitere Interaktionspartner an das
Protein gekoppelt. Die Identifizierung dieser Interaktionspartner sollte weiterhin
Rückschlüsse über die zellulären Funktionen oder beteiligten Signaltransduktions-
wege von PaBphP zulassen. Im Folgenden wird zunächst näher auf die
identifizierten putativen AR von PaBphP eingegangen.
Der genetische Screen zur Identifizierung von putativen AR von PaBphP basierte auf
den bereits bestehenden Transkriptomdaten einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante. In
beiden Mutanten fiel die starke Repression des orfs PA4739 auf und wurde daher als
Basis genutzt. Eine RpoS-regulierte Transkription von PA4739 konnte bereits
beobachtet werden (Barkovits et al., 2011). Die Expression von PA4739 weist in
einer ∆rpoS-Mutante eine 50 % verringerte Induktion im Vergleich zum WT auf. Wie
ebenfalls in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, unterliegt PaBphP ebenfalls einer
Kontrolle durch RpoS. Die Transkription von PA4739 ist in einer ∆bphO- sowie
∆bphP-Mutante im Vergleich zum WT um etwa 90 % reduziert. Daher ist es sehr
Diskussion
115
wahrscheinlich, dass der Effekt durch RpoS auf die Transkription von PA4739
indirekt ist und über PaBphP verläuft.
Die Grundlage des genetischen Screens basierte auf der Hypothese, dass der
korrespondierende AR von PaBphP an der Regulation von PA4739 beteiligt ist. Die
Aktivität einer PA4739-lacZ-Reportergenfusion sollte demnach in einen Stamm mit
einer Deletion des gesuchten AR eine vergleichbare Aktivität aufweisen, wie in der
∆bphP-Mutante.
Anhand der durchgeführten Experimente wurden von 72 getesteten AR drei putative
Regulatoren ermittelt, die an der PaBphP-abhängigen Transkriptionsaktivierung von
PA4739 involviert sind: CheY2 (PA14_02260), PA14_27950 und CbrB
(PA14_62540). Die Identifizierung von mehr als einem Regulator ist nicht
ungewöhnlich (Bijlsma et al., 2003) und impliziert womöglich ein weitverzweigtes
Netzwerk der PaBphP-Signaltransduktion. Eine Regulation durch mehrere
Transkriptionsaktivatoren wird auch dadurch angedeutet, dass in keinem Fall eine
vollständige Repression der Promotoraktivität von PA4739 beobachtet wurde.
Als einer der putativen Regulatoren wurde das PA14_02260 Genprodukt CheY2
identifiziert. Dieser Regulator ist als AR des che2-Systems annotiert, das eine hohe
Homologie zu dem Chemotaxis cheY-System aus E. coli aufweist (Parales et al.,
2004). P. aeruginosa besitzt im Gegensatz zu E. coli zwei dieser Che-Systeme. Die
Funktion des zweiten Homologs aus P. aeruginosa ist noch weitgehend unbekannt.
Es wird postuliert, dass es eine modulierende Funktion auf das Che-System hat und
somit an der Flagellen-vermittelten Fortbewegung beteiligt ist (Guvener et al., 2006).
Bioinformatische Vorhersagen implizieren eine Operon-Struktur der che2-Gene. Die
Expression des che2-Systems ist RpoS-abhängig, wodurch es in der stationären
Phase exprimiert wird (Schuster et al., 2004). Der AR CheY2 besteht nur aus einer
Phosphatempfängerdomäne und besitzt kein DNA-Bindemotiv. Eine direkte
Transkriptionsaktivierung des Gens PA4739 durch CheY2 ist demnach nicht möglich.
Ein weiterer putativer Regulator, der über den genetischen Screen ermittelt wurde, ist
PA14_27950. Dabei handelt es sich nicht um einen typischen AR eines Zwei-
Komponenten-Systems. Aufgrund der STAS-Domäne ist das Protein als putativer
Anti-Sigmafaktor Antagonist annotiert. Über Proteine mit einer STAS-Domäne ist
bislang nur bekannt, dass sie an der globalen Regulation von Sigmafaktoren beteiligt
sind und mit membranständigen Sulfattransportern fusioniert sein können (Aravind &
Koonin, 2000). Die genaue Funktion dieser Proteine für den Organismus, wie auch
Diskussion
116
für P. aeruginosa ist bisher noch unklar. Oftmals sind sie mit verschiedenen
Sensordomänen fusioniert, wodurch sich die Funktion oder Prozesse postulieren
lassen, an denen diese Proteine beteiligt sind (Aravind & Koonin, 2000).
PA14_27950 besteht jedoch nur aus einer alleinstehende STAS-Domäne, wodurch
sich die Funktion nicht vorhersagen lässt. Auch besitzt diese Domäne kein DNA-
Bindemotiv, sodass eine direkte Transkriptionsaktivierung von PA4739
ausgeschlossen werden kann.
Neben CheY2 und PA14_27950 wurde CbrB (PA14_62540) als putativer AR der
PaBphP-Signaltransduktionskaskade identifiziert. CbrB besitzt den Aufbau eines
klassischen AR mit einer Phosphatempfängerdomäne und einem DNA-Bindemotiv.
Mit der zugehörigen Sensorkinase CbrA reguliert das CbrA/B-System viele Gene
deren Produkte im Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus involviert sind (Nishijyo et
al., 2001). Das CbrA/B Zwei-Komponenten-System ist weiterhin an der Regulation
der Motilität, Virulenz sowie der Biofilmbildung beteiligt (Yeung et al., 2011). Es
werden jedoch neben CbrB noch weitere unbekannte AR für die Sensorkinase CbrA
postuliert (Yeung et al., 2011). Dementsprechend wäre es ebenfalls möglich, dass
auch CbrB mit PaBphP als weiterer Sensorkinase interagiert.
Die Ergebnisse des genetischen Screens deuten darauf hin, dass alle drei
Regulatoren an der Phytochrom-abhängigen Transkriptionsaktivierung von PA4739
beteiligt sind. In einem weiteren Schritt wurde eine direkte Übertragung der
Phosphorylgruppe des autophosphorylierten PaBphPs auf diese Regulatorproteine
analysiert. Einen für Phytochrome typischen lichtabhängigen Phosphotransfer von
PaBphP auf diese Regulatoren konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Damit
müssen die identifizierten Regulatoren jedoch nicht zwangsläufig als AR für PaBphP
ausgeschlossen werden. Es ist möglich, dass unter den gewählten Bedingungen das
initiierende Signal für die Transphosphorylierung nicht vorhanden war. So könnte
neben Licht ein weiterer Stimulus nötig sein, um die Phosphorylgruppenübertragung
zu ermöglichen. In diesem Zusammenhang muss berücksichtigt werden, dass die
durchgeführten Promotorstudien zur Identifizierung dieser Regulatoren in vivo
ermittelt wurden. Die anschließenden Untersuchungen hingegen erfolgen auf der
Basis von heterolog produzierten Proteinen in einem in vitro-Ansatz. Eine Zugabe
von Rohextrakt zur Verifizierung der Hypothese, dass ein intrazelluläres Signal
benötigt wird, war aufgrund der Instabilität von PaBphP in Rohextrakt jedoch nicht
Diskussion
117
möglich. Die aus diesen Ergebnissen hervorgehende mögliche Signaltransduktion-
kaskade ausgehend von PaBphP zur Aktivierung der Transkription von PA4739 ist in
nachfolgender Abb. 44 dargestellt.
Abb. 44 Mögliche Signaltransduktionskaskade von PaBphP zur Transkriptionsaktivierung von PA4739 durch die identifizierten Regulatoren CheY2 und PA14_27950 (Anti-Sigmafaktor Antagonist, AσA) könnten zwar über eine Phosphoryl-gruppenübertragung von PaBphP aktiviert werden, benötigen aber aufgrund einer fehlenden DNA-Bindedomäne mindestens einen weiteren zwischengeschalteten Regulator X, um die Transkription von PA4739 zu initiieren. CbrB hingegen könnte nach Erhalt der Phosphorylgruppe direkt die Transkription von PA4739 induzieren. Das Signal für die Initiierung der Phosphorylgruppen-übertragung ist nicht bekannt.
Dieses Modell zeigt zum einen, dass die Signaltransduktion sehr komplex zu sein
scheint und zum anderen, dass neben Licht noch weitere Faktoren benötigt werden,
um die Transkription von PA4739 zu induzieren.
Alternativ kann die Signaltransduktion auch über ein komplexes Phosphorelay-
System verlaufen. Neben einem klassischen AR besitzen einige Phytochrom-AR nur
eine Phosphatempfängerdomäne und keine Effektordomäne zur Bindung an die DNA
(Bhoo et al., 2001; Karniol, 2006). Daher gehören diese zur Gruppe der CheY-
ähnlichen AR. Dieser Typ von AR kann auf direktem Wege mit dem Zielpartner
interagieren oder ist eine Komponente eines Phosphorelay-Systems. Die
Signaltransduktion über ein solches Phosphorelay-System zur Aktivierung von
PA4739 könnte somit auch auf die Signalweiterleitung von PaBphP zutreffen. Im
Rahmen des genetischen Screens wurden 72 der 103 putativen AR getestet, daher
besteht die Möglichkeit, das neben CheY2, PA14_27950 und CbrB noch weitere
Regulatoren an der Signaltransduktionskaskade beteiligt sein könnten und ein
derartiges Phosphorely-System bilden.
Diskussion
118
Dass PaBphP grundsätzlich die Fähigkeit besitzt, nach einer Autophosphorylierung
die gebundene Phosphorylgruppe an einen AR zu transferieren, konnte anhand der
Übertragung auf den Phytochrom-AR aus D. radiodurans nachgewiesen werden.
Anders als bei dem Phytochrom aus P. syringae PsBphP1 (Bhoo et al., 2001) findet
dieser Transfer unabhängig von einem Chromophor statt, da sowohl ausgehend von
dem apo-, als auch von dem holo-Phytochrom eine Transphosphorylierung
beobachtet wurde. Auch konnte kein Unterschied unter Hellrot- und Dunkelrotlicht
verzeichnet werden. Der Tansfer scheint somit ebenfalls nicht lichtreguliert zu sein.
Bislang ist noch nicht genau geklärt, welche Aminosäuren für die Spezifität einer
Transphosphorylierung verantwortlich sind. Es wird vermutet, dass vor allem die
Transmitterdomäne der Kinase sowie die Empfängerdomäne des AR daran beteiligt
sind (Laub & Goulian, 2007). Da die speziesübergreifende Phorphorylgruppen-
übertragung möglicherweise auf eine hohe Ähnlichkeit von DrBhpR zu dem AR des
Phytochroms basiert, wurden in silico Aminosäuresequenzvergleiche mit der
N-terminalen Region von DrBphR und der Pseudomonas-Datenbank durchgeführt
(www.pseudomonas.com). Innerhalb dieser Analysen konnten zwar einige Proteine
ermittelt werden, die eine gewisse Ähnlichkeit mit DrBphR haben, jedoch lassen sich
aufgrund der niedrigen Homologie keine eindeutigen Rückschlüsse ziehen, ob einer
dieser Regulatoren der AR von PaBphP ist.
Um auf einer globaleren Ebene die AR die durch einen Transfer der
Phosphorylgruppe von PaBphP phosphoryliert werden zu identifizieren, könnte das
Phosphoproteom untersucht werden. Durch eine affinitätschromatographische
Anreicherung aller phosphorylierten Proteine des WTs und einer ∆bphP-Mutante mit
einer anschließenden massenspektrometrischen Analyse, sollte Aufschluss darüber
geben, welche Proteine spezifisch von PaBphP eine Phosphorylgruppe empfangen.
Neben diesem genetischen Screen wurden ebenfalls durch in vivo-cross-
Quervernetzungs-Experimente durchgeführt, um putative AR von PaBphP zu
ermitteln. Innerhalb dieser Analysen wurde der AR CueR als weiterer putativer AR
des Phytochroms identifiziert. Dieser Regulator wird durch eine direkte Bindung von
LasR aktiviert und reguliert seinerseits die Transkription des Kupferstress-Regulons
(Thaden et al., 2010). Da die Aktivität von CueR nicht durch eine Phosphorylierung,
sondern durch eine Bindung von Kupfer reguliert wird, ist es bisher unklar, inwiefern
Diskussion
119
PaBphP hierbei einen Einfluss hat. Es kann lediglich vermutet werden, dass PaBphP
möglicherweise einen modulierenden Effekt auf die Aktivität von CueR durch eine
Interaktion ausübt.
4.1.4 PaBphP ist möglicherweise in verschiedene metabolische
Vorgänge involviert
Im Rahmen der durchgeführten in vivo-Quervernetzungen konnten neben CueR als
putativen AR von PaBphP ebenfalls weitere zahlreiche putative Interaktionspartner
ermittelt werden. Diese Interaktionspartner können nicht einer einzelnen funktionellen
Klasse zugeordnet werden, sondern sind in unterschiedliche metabolische Vorgänge
involviert. Durch die Interaktion mit mehreren Proteinen des Citratzykluses könnte
vermutet werden, dass PaBphP einen generellen Einfluss auf die Energiegewinnung
hat. In phänotypische Untersuchungen einer ∆bphP-Mutante wurde jedoch kein
Unterschied im Wachstum, weder in komplexem Vollmedium noch unter definierten
Minimalbedingungen, beobachtet (Barkovits et al., 2008, Barkovits, unveröffentlichte
Daten). Demnach könnte PaBphP zwar auf den Energiemetabolismus einzuwirken,
dieser Effekt ist jedoch nicht essentiell für den Organismus.
Im Zuge der in vivo-Quervernetzung wurden auch einige putative
membranlokalisierte Proteine identifiziert, mit denen PaBphP zu interagieren scheint.
Zu diesen zählen beispielsweise LptF (PA14_16630) und OprF (PA14_41570).
Während LptF an der Adhäsion von P. aeruginosa an Oberflächen beteiligt ist, bildet
OprF unter anderem eine membrandurchspannende Pore durch die unspezifisch
kleine polare Moleküle durchfließen können (Nestorovich et al., 2006). Darüber
hinaus ist OprF noch für weitere zelluläre Prozesse von Bedeutung. Eine Deletion
von oprF führt zu einer verringerten Adhäsion an die Oberfläche, sowie zu einer
verringerten Produktion von Exotoxinen, Pyocyanin und dem QS-Molekül PQS.
Aufgrund dieser Eigenschaften wird OprF eine wichtige Rolle in der Virulenz von
P. aeruginosa zugeschrieben (Fito-Boncompte et al., 2011). Weiterhin konnte
ebenfalls PA14_62690, das Homolog zu PA4739 aus PAO1, als putativer
Interaktionspartner von PaBphP nachgewiesen werden. Das periplasmatisch
Diskussion
120
lokalisierte Protein unterliegt, wie bereits im vorherigen Abschnitt gezeigt, einer
Transkriptionskontrolle von PaBphP.
Da es sich bei PaBphP um ein zytosolisches Protein handelt, ist es sehr
wahrscheinlich, dass vorwiegend lösliche, zytosolische Proteine mit PaBphP
wechselwirken. Eine experimentelle Einschränkung bei einer in vivo-Quervernetzung
ist jedoch, dass neben tatsächlich wechselwirkenden Partner auch Proteine in
unmittelbarer räumlicher Nähe aneinander gekoppelt werden. Daher ist nicht
auszuschließen, dass die Verknüpfung, vor allem mit den membranintegrierten
Proteinen, vielmehr auf eine Lokalisation von PaBphP in der Nähe der Membran
hindeutet. Eine räumliche Lokalisation zur Zytoplasmamembran wird zudem durch
bioinformatische Analysen unterstützt (http://db.psort.org).
4.1.5 PaBphP- mehr als nur ein Rotlichtrezeptor?
Die biochemische Charakterisierung des homolog gereinigten PaBphPs aus
P. aeruginosa bestätigten die Eigenschaften eines Rotlichtrezeptors. Die innerhalb
dieser Arbeit durchgeführten Analysen deuten jedoch auf noch weitere Funktionen
des Phytochroms innerhalb der Zelle hin. Dies zeigte beispielsweise an der Licht-
und chromophorunabhängigen Regulation der Kinaseaktivität. Weiterhin sprechen
die vorliegenden Ergebnisse für eine Bedeutung des Phytochroms in der stationären
Phase. Durch die Transkriptionsregulation der QS-Systeme, sowie die mögliche
Vermittlung QS-Regulierter Funktionen scheint PaBphP eine globale Rolle in der
Zelle einzunehmen. Die eigenständige Regulation des bphP-Promotors, impliziert
eine mögliche unabhängige Funktion des apo-Phytochroms. Diese Vermutung wird
zudem durch die phänotypischen Analysen unterstützt, in denen die ∆bphP-Mutante
weitere phänotypische Veränderungen aufwies, die in einer ∆bphO-Mutante nicht zu
beobachten waren. In beiden Stämmen wurde eine verringerte Menge des
Signalmoleküls PQS nachgewiesen. Dies könnte zum einen bedeuten, dass die
Hämoxygenase selbst auch einen Einfluss auf die Synthese von PQS hat. Zum
anderen könnte vermutet werden, dass das Phytochrom in seiner chromophorylierten
Form als holo-Protein vorliegen muss, um einen Einfluss auf die Bildung des
Signalmoleküls auszuüben. Sowohl PQS als auch HHQ fungieren als Autoinduktoren
Diskussion
121
für den Regulator PqsR und sind zusammen an der Vermittlung vieler RhlR-
abhängiger Funktionen beteiligt (Williams & Camara, 2009). Ein Verlust von PQS
führt beispielsweise zu einer verminderten Synthese des Virulenzfaktors Pyocyanin.
Bei einer Deletion von bphP, jedoch nicht bei einer Deletion von bphO, wurde eine
deutliche Grünfärbung der Kolonien bei einem Wachstum auf Festmedium
beobachtet. Dieser Phänotyp deutete zunächst auf eine erhöhte Pyocyanin-
Produktion hin. Bei der Extraktion des Pigments konnte dies jedoch nicht bestätigt
werden. Dies würde auch im Widerspruch zu der detektierten verringerten PQS-
Synthese stehen, da PQS als Autoinduktor für PqsR fungiert, und dieser die Gene
die zur Pyocyaninsynthese benötigt werden, induziert (Diggle et al., 2003). Da neben
Pyocyanin kein weiteres grünes Pigment in P. aeruginosa bekannt ist, das unter
diesen Bedingungen synthetisiert wird, kann bisher keine Aussage über die
Bedeutung dieser Grünfärbung getroffen werden.
Desweiteren führt die Deletion von bphP, nicht aber von bphO, zu einer erhöhten
Sensibilität gegenüber SDS. Das Detergenz hat die Eigenschaft Lipide zu emulgieren
und greift so die Zellmembran an. Die reduzierte SDS-Toleranz dieser Mutante
könnte möglicherweise auf einer destabilisierten Membran beruhen. Eine Membran
kann auf vielerlei Wege destabilisiert werden, wie beispielsweise eine Veränderung
der Lipidkomposition, der Fettsäurereste der Lipide und/oder auch durch die in oder
an der Membran assoziierten Strukturproteine (Zhang et al., 2008).
Die Transkriptomdaten der Phytochrommutanten bestärken die Annahme einer
möglichen veränderten Membranintegrität. In der ∆bphP-, jedoch nicht in der ∆bphO-
Mutante, sind einige wenige Gene, die für membranassoziierte Proteine kodieren,
reprimiert (Barkovits et al., 2011). Darunter befinden sich beispielsweise OmpA, die
Vorstufe eines äußeren Membranproteins, sowie das Lipoprotein OsmE und weitere
hypothetischen Proteine mit vorhergesagter Membranlokalisation.
Die Untersuchungen zur Motilität deckten ebenfalls eine leicht eingeschränkte
Flagellen-basierte Fortbewegung (Schwimmen) der ∆bphP-Mutante auf. Aufgrund
der Membranverankerung der Flagelle, ist die Integrität der Membran für Funktion
der Flagelle von entscheidender Bedeutung. Der Zusammenhang zwischen einer
veränderten Membran und einer reduzierten Motilität wurde bereits in mehreren
Untersuchungen gezeigt. Dabei korreliert eine defekte bzw. abnormale
Lipopolysaccharidschicht oder Membrankomposition mit einem Verlust der
Flagellenfunktion (Toguchi et al., 2000; Kim et al., 2005; Huang et al., 2006). Dieser
Diskussion
122
Effekt müsste jedoch auch bei den durchgefühten Analysen zum Schwärmverhalten,
welches, auf einer Kombination von Flagellen und TypIV-Pili basiert (Mattick, 2002),
zu beobachten sein. Dies wurde jedoch nicht nachgewiesen und sollte in weiteren
Experimenten geklärt werden.
Insgesamt betrachtet bestätigen diese Daten die Hypothese, dass PaBphP in sehr
unterschiedlichen Prozessen in der Zelle involviert ist und darüber hinaus das apo-
Phytochrom weitere Funktionen einnimmt.
Der Einfluss von PaBphP spiegelt sich auch anhand des proteolytischen Abbaus
wieder. Die Kombination aus in vitro- und in vivo- Degradationsanalysen deuten
darauf hin, dass PaBphP bei einer unphysiologisch hohen Menge proteolytisch
abgebaut wird. Eine Proteolyse von Phytochromen wurde bereits bei einigen
pflanzlichen Rotlichtrezeptoren nach Zugabe von Rohextrakt beobachtet. Diese
Regulation läuft dabei jedoch lichtabhängig und aufgrund der Spaltung des Proteins
in 2-3 Fragmente, reguliert ab (Vierstra et al.,1984). Im Gegensatz dazu wird PaBphP
in P. aeruginosa vollständig abgebaut. Daher handelt es sich vermutlich um eine
unregulierte Degradation. In der Regel dient ein derartig unregulierter proteolytischer
Abbau zum Schutz gegen eine toxische Proteinaggregation oder vor der Anhäufung
missgefalteten Proteine (Gottesman, 2003). Aufgrund der Löslichkeit des homolog
überproduzierten PaBphPs und den anschließenden Analysen zur Funktion ist eine
falsche Faltung des Proteins eher unwahrscheinlich. Da der Abbau von PaBphP in
vitro durch den Metallchelator EDTA stark verzögert wurde, handelt es sich
vermutlich um mindestens eine metallabhängige Protease. Ob es sich dabei um eine
ATP-abhängige Protease handelt, konnte abschließend nicht geklärt werden. Jedoch
kann aufgrund der hohen Geschwindigkeit des proteolytischen Abbaus vermutet
werden, dass dieser Prozess ATP-abhängig ist. Energieabhängige Proteasen sind
für über 90 % aller intrazellulären proteolytische Vorgänge verantwortlich
(Gottesman,2003; Jenal & Hengge-Aronis, 2003). Die bekanntesten Vertreter dieser
Proteasen sind Lon, ClpAP, ClpXP, HslUV und FtsH. Lediglich die enzymatische
Aktivität der membranintegrierten Protease FtsH ist von der Bindung von eines
Zinkions abhängig (Tomoyasu et al., 1993). Da in den in vitro-Experimenten die
Membranfraktion jedoch separiert wurde, kann ein Abbau durch diese Protease sehr
wahrscheinlich ausgeschlossen werden. In dem Genom von P. aeruginosa PA14
kodieren mindestens fünf weitere Gene für putative Proteasen, die metallabhängig
sind und daher an der Degradation beteiligt sein könnten (www.pseudomonas.com).
Diskussion
123
Da der Abbau von PaBphP durch die Chelierung der Metallionen nicht komplett
inhibiert wurde, impliziert die Beteiligung noch weiterer Proteasen. Die Behandlung
des Lysates mit einem Protease-Inhibitor-Cocktails, der die Aktivität von Serin- und
Cystein-Proteasen hemmt, bestärkt diese Annahme, da in Folge dieser der
proteolytische Abbau von PaBphP ebenfalls leicht verzögert wurde. In den in vivo-
Quervernetzungs-Experimenten wurden die Serin-Proteasen-Untereinheiten HslU
und ClpX an PaBphP gekoppelt und könnte ein Indiz auf eine mögliche Beteiligung
dieser Proteasen sein.
Durch die Inkubation von PaBphP mit Rohextrakt aus verschiedenen
Wachstumsphasen konnte zudem eine zelldichteabhängige Degradation gezeigt
werden. Dies lässt vermuten, dass die Protease/n entweder erst in der stationären
Phase synthetisiert werden oder dass eine unphysiologische Menge des
Phytochroms erst bei einer hohen Populationsdichte eine Degradation induziert. Ein
Ungleichgewicht des Proteoms in dieser Phase, durch eine erhöhte PaBphP Menge,
könnte einen schädigenden Einfluss auf die Zelle haben, wodurch sie sich durch
einen rapiden Abbau des Proteins schützt.
4.1.6 Das Phytochrom-Regulon
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Phytochrom des nicht-photosynthestisch,
heterotroph lebenden Bakteriums P. aeruginosa aus unterschiedlichen Blickwinkeln
durch eine Kombination verschiedener experimenteller Ansätze analysiert, um einen
Gesamtüberblick über die physiologische Bedeutung des Rotlichtrezeptors zu
erhalten. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse sind in Abb. 45 zusammengefasst.
Diskussion
124
Abb. 45 Überblick über das Phytochrom-Regulon Zusammenfassung aller erhaltenen Erkenntnisse zur Aufklärung der physiologischen Bedeutung von PaBphP. Eine nähere Beschreibung ist dem Text zu entnehmen.
Durch Reportergenanalysen wurde eine komplexe Transkriptionskontrolle des
bphOP-Cotranskripts, sowie eine von bphO entkoppelte eigenständige Expression
von bphP nachgewiesen werden (1). Die Hämoxygenase BphO ist dabei für die
Generierung des nativen Chromophors BVI Xα in vivo verantwortlich. Durch die
Assemblierung mit BV IXα an das apo-Protein entsteht das holo-Phytochrom (2).
Durch in vivo-Quervernetzung konnte eine Vielzahl von putativen
Interaktionspartnern für PaBphP ermittelt werden (3). Untersuchungen zur
intrazellulären Signaltransduktionskaskade ausgehend von PaBphP deckten
mehrere putative AR des Phytochroms auf (4). Der globale Einfluss des Phytochroms
auf diverse zelluläre Funktionen wurde ebenfalls durch phänotypische Analysen von
Phytochrommutanten bestätigt (5).
Zusammengefasst konten im Rahmen dieser Arbeit viele neue Erkenntnisse über
das Phänomen eines Phytochroms in einem heterotrophen Organismus gewonnen
werden. In P. aeruginosa scheint dieser Rotlichtrezeptor nicht „nur“ der
Lichtwahrnehmung zu dienen, sondern nimmt eine weitaus vielseitigere Rolle ein.
Diskussion
125
Kapitel II
Die Lebensgemeinschaft in Form von hochstrukturierten Biofilmen verschafft
Mikroorgansimen wie P. aeruginosa einen großen Vorteil gegenüber verschiedener
äußeren Einflüssen, wie beispielsweise eine erhöhte Toleranz gegenüber Antibiotika
(Hentzer et al., 2001; Yoon et al., 2002). Die Bildung dieser Biofilmen ist ein sehr
stringent regulierter Prozess und kann in verschiedene Stadien eingeteilt werden
(Sauer et al., 2002; Petrova et al., 2009). Die ersten Stadien umfassen die initiale
Anheftung sowie Reifung des Biofilms, wohingegen es in der letzten Phase zur
Auflösung des Biofilms kommt. Dadurch wird die Besiedelung neuer Habitate
ermöglicht. In allen Phasen der Biofilmbildung spielt die intrazelluläre Konzentration
des sekundären Botenstoffes c-di-GMP eine wichtige Rolle. Eine hohe Konzentration
fördert die Biofilmbildung, eine niedrige Konzentration korreliert mit einer motilen
Lebensweise (Römling et al., 2005). Der Abbau von c-di-GMP wird von
Phosphodiesterasen (PDE) katalysiert, deren katalytische Aktivität in den aufgelösten
Zellen besonders hoch ist (Barraud et al., 2009). Die Dispersion kann durch
verschiedene externe und interne Faktoren, wie Nährstoffangebot oder
Stickstoffmonoxid (NO) induziert werden. In anderen Bakterienarten wie
beispielsweise Shewanella woodyi oder S. oneidensis MR-1 sind sogenannte H-NOX
(heme nitric oxide binding)-Domänen, die das NO wahrnehmen können, an der
Modulierung der intrazellulären c-di-GMP-Konzentration beteiligt. In S. woodyi konnte
zudem bereits gezeigt werden, dass NO über die H-NOX-Domäne die PDE-Aktivität
stimuliert wird, während die c-di-GMP-abbauende Diguanylatzyklase-Aktivität des
bifunktionalen Enzyms gehemmt wird (Liu et al., 2012; Plate & Marletta, 2012). In
dem Genom von P. aeruginosa kodieren jedoch keine Gene für ein Protein mit einer
derartigen NO-wahrnehmenden H-NOX-Domäne.
Jedoch konnten auch bereits in P. aeruginosa einige wenige PDEs identifiziert
werden, die an der NO-induzierten Dispersion beteiligt sind (An et al., 2010; Roy et
al., 2012). Diese sind jedoch aufgrund ihrer Domänenstruktur nicht in der Lage NO
direkt zu registrieren und darüber die enzymatische Aktivität der PDE zu steuern.
In Kooperation mit Prof. Dr. Karin Sauer der Binghampton University, USA wurde mit
NbdA die erste PDE in P. aeruginosa identifiziert, die möglicherweise direkt an der
NO-induzierten Biofilmauflösung beteiligt ist (Li et al., 2013). Hierbei könnte die die
MHYT-Domäne im N-terminalen Abschnitt von NbdA direkt das Gas binden (Galperin
Diskussion
126
et al., 2001). Innerhalb der Untersuchugen zur Charakterisierung von NbdA fiel auf,
dass NO einen positiven Einfluss auf die Transkription von nbdA, sowohl in
planktonisch wachsenden, vor allem jedoch in den aufgelösten Zellen, hat (Li et al.,
2013). Eine solche Regulation wurde bislang noch für keine PDE beschrieben und
wurde daher näher untersucht.
4.2.1 Wird die Transkription von nbdA durch NO induziert?
Anhand der durchgeführten Reportergenanalysen zur Transkriptionskontrolle von
nbdA konnte FhpR als möglicher Transkriptionsregulator unter sauerstoff-
limitierenden Bedingungen identifiziert werden. Aus der Literatur ist FhpR bisher
lediglich als Transkriptionsaktivator von fhp bekannt, dessen Genprodukt ein
Flavohämoglobin ist (Arai et al., 2005). Unter aeroben Bedingungen, führt sowohl
eine Deletion von fhp, als auch von fhpR, zu einem deutlichen Wachstumsdefizit in
Anwesenheit hoher NO-Konzentrationen. Daher wird postuliert, dass Fhp und FhpR
unter diesen Bedingungen zusammen ein NO-Detoxifikationssystem bilden (Arai et
al., 2005). Durch die Regulation von FhpR könnte vermutet werden, dass auch NbdA
eine Funktion in der Detoxifikation von NO unter sauerstofflimitierenden Bedingungen
bei hohen Konzentrationen des schädlichen Gases einnimmt. NbdA als PDE besitzt
jedoch weder eine für Flavohämoglobine typische NO-Dioxygenase oder
NO-Reduktaseaktivität (Poole et al., 2000). Die mögliche schützende Funktion vor
hohen NO-Konzentrationen könnte demnach in der Auflösung des Biofilms bestehen
woduch die Zellen wieder eine planktonische Lebensweise einnehmen und eine
aerobe Atmung durchführen können. Im weiteren Verlauf wurde die Transkription von
nbdA vergleichend zu dem bekannten FhpR-reguliereden Gen fhp, untersucht. Die
hier vorliegenden Ergebnisse implizieren keine analoge Regulation für nbdA. Im
Gegesatz zu fhp (Arai et al., 2005) wird die Transkription nicht durch verschiedene
NO-Donoren, Nitrat oder Nitrit induziert. Dies steht jedoch im Widerspruch mit der
gemesenen erhöhten mRNA-Transkriptmenge von nbdA nach einer Zugabe des
NO-Donors SNP (Li et al., 2013). Die Ursache für diese Diskrepanz konnte bisher
nicht geklärt werden.
Für die Regulation durch FhpR ist darüber hinaus bekannt, dass dieser ein
σ54 -Transkriptionsaktiviator ist und somit die Transkriptionsinitiation von fhp neben
dem Regulator auch der alternative Sigmafaktor benötigt wird (Arai et al., 2005). In
Diskussion
127
den durchgeführten Reportergenanalysen in einer ∆rpoN-Mutante wurde diese
Abhängigkeit für nbdA jedoch nicht beobachtet. An dieser Stelle soll darauf
hingewiesen werden, dass es sich bei der verwendeten ∆fhpR-Mutante um eine
Transposonmutante eines anderen PAO1-Widtypstammes handelt (Lewenza et al.,
2005). Daher ist nicht auszuschließen, dass die verringerte nbdA-Expression in der
∆fhpR-Mutante auf die dabei unterschiedlichen WT-Stämme zurückzuführen ist. Da
diese reprimierte Transkription allerdings nur unter sauerstofflimitierenden
Bedingungen verzeichnet wurde, impliziert wiederrum einen reelen Einfluss des
Regulators. Um jedoch einen Einfluss durch den Stammwechsel auszuschließen,
sollte eine markerlose Deletionsmutante erstellt, und die Reportergenanalysen
fortgeführt werden.
Neben einer direkten Transkriptionsaktivierung von nbdA durch einen NO-bindenden
Regulator gibt es weiterhin ebenfalls die Möglichkeit einer indirekten Regulation. Die
QS-Systeme mit den Regulatoren LasR und RhlR sind in P. aeruginosa an der
Regulation vieler biofilmassoziierter Geneprodukten beteiligt (Parsek et al., 2005; de
Kievit, 2009). Die Reportergenstudien in einer ∆lasR- und ∆rhlR-Mutante konnte
jedoch kein Einfluss auf die Expression von nbdA nachgewiesen werden und daher
kann eine Beteiligung dieser beiden QS-Systeme vermutlich ausgeschlossen
werden.
Auf Basis der bisherigen Daten, kann weiterhin vermutet werden, dass noch weitere
Faktoren an der Transkriptionskontrolle beteiligt sind, da die Aktivität der
nbdA-Reportergenfusion in einer ∆fhpR-Mutante nicht vollständig reprimiert ist.
Sensorproteine mit einer GAF- oder PAS-Domäne sind beispielsweise in der Lage,
über ein gebundenen Häm- oder Eisen-Kofaktor, NO wahrzunehmen (Taylor &
Zhulin,1999). So wäre es denkbar, dass eine Sensorkinase eines Zwei-
Komponenten-Systems das NO registriert, die Signaltransduktionskaskade daraufhin
einleitet und der zugehörige AR die Expression von nbdA initiiert. Zur Identifizierung,
welche Sensorkinase dabei von Bedeutung ist, könnte durch einen genetischen
Screen geklärt werden (vgl. 3.3). Dabei sollten alle Sensorkinasen, die putativ NO als
Signal detektieren können, deletiert werden. Der Vergleich der nbdA-Expression im
WT und diesen Deletionsstämmen könnte die entsprechende Sensorkinase
identifizieren.
Diskussion
128
Insgesamt betrachtet zeigen die hier durchgeführten Expressionsanalysen, dass die
Transkriptionskontrolle von nbdA einer Regulation von FhpR unterliegt. Diese ist nur
unter sauerstofflimitierenden Bedingungen zu beobachten, ähnlich den Bedingungen,
die innerhalb eines Biofilms herrschen. Weiterhin konnte, anders als in den
qRT-PCR-Experimenten (Li et al., 2013), keine Induktion der Transkription nach einer
NO-Zugabe beobachtet werden. Anhand der im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführten Untersuchungen scheint NO nur eine untergeordnete Rolle im
Hinblick auf die Expression von nbdA zu spielen. Es kann daher vermutet werden,
dass NO möglicherweise keinen großen Einfluss auf die Neusynthese von NbdA hat.
Dies würde die Hypothese bestärken, dass NO einen regulatorischen Effekt auf die
PDE-Aktivität ausübt. Bisherige biochemische Analysen zur Aktivität wurden
lediglich mit verkürzten Varianten ohne die membranintegrale Sensordomäne
durchgeführt (Li et al., 2013). Der Einfluss von NO auf die PDE-Aktivität kann jedoch
nur durch die Isolierung des Volllängenproteins ganzheitlich geklärt werden. Initiale
Experimente wurden hierfür bereits durchgeführt (Daten nicht gezeigt), jedoch waren
die Proteinausbeuten bisher zu gering, um entsprechende Analysen durchzuführen.
Zusammenfassung
129
5. Zusammenfassung
Phytochrome sind hellrot/dunkelrotlicht-absorbierende Photorezeptoren, deren
lichtsensorische Eigenschaften durch ein kovalent gebundenen Chromophor
vermittelt werden. Diese Chromoproteine sind nicht wie ursprünglich angenommen
auf die Pflanzenwelt beschränkt, sondern wurden mittlerweile ebenfalls in Pilzen,
Cyanobakterien und auch heterotrophen Bakterien entdeckt. Vor allem das
Vorkommen von Phytochromen in heterotrophen, nicht-photosynthetischen Bakterien
wirft immer noch große Fragen auf hinsichtlich ihrer physiologischen Bedeutung. Zu
einer dieser Bakterienarten gehört auch das opportunistische Pathogen
Pseudomonas aeruginosa. Mit den Genprodukten von bphO und bphP ist
P. aeruginosa in der Lage ein holo-Phytochrom zu assemblieren. Dabei kodiert bphO
für eine Hämoxygenase, die durch Spaltung eines Häm-Moleküls den Chomophor
BV IXα generiert, wohingegen bphP für das apo-Protein kodiert. Bakterielle
Phytochrome zeichnen sich weiterhin durch eine N-terminal lokalisierte Histidin-
Kinase-Domäne aus, wodurch sie Sensorproteine eines klassischen Zwei-
Komponenten-Signaltransduktionssystems darstellen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand verschiedener experimenteller Ansätze ein
Überblick über die Bedeutung des bakteriellen Phytochroms aus P. aeruginosa in
vivo gewonnen werden. Die homologe Isolierung des Proteins mit anschließender
biochemischer Charakterisierung ergänzen die bereits vorliegenden Erkenntnisse
und bestätigen eine Funktion als Rotlichtrezeptor mit BV IXα als dem nativen
Chromophor sowie die Funktion einer lichtunabhängigen Sensorkinase.
Reportergenanalysen deckten eine komplexe Regulation des Phytochrom-Operons
auf. Neben der bekannten RpoS-Abhängigkeit des bphOP-Cotranskripts konnte
ebenfalls ein Einfluss des Quorum-Sensing-Systems nachgewiesen werden. Zudem
identifizierten diese Analysen einen zusätzlichen Promotor für bphP, welcher
ebenfalls zelldichteabhängig reguliert wird.
Um einen Einblick in die weiterführende Signaltansduktionskaskade von PaBphP zu
erlangen, wurde ein genetischer Screen auf der Basis von vorausgegangenen
Transkriptomdaten etabliert. Dabei konnten drei putative Antwortregulatoren ermittelt
werden. Eine direkte Phosphorylgruppenübertragung von PaBphP auf diese
Regulatoren konnte unter den getesteten Bedingungen nicht beobachtet werden, da
Zusammenfassung
130
vermutlich entweder das Signal zur Transphosphorylierung fehlte, oder sie
Komponenten eines Phosphorelay-Systems sind.
Auf der Basis von in vivo-Quervernetzungen konnten neben einem weiteren
Antwortregulator, eine Vielzahl an putativen Interaktionspartnern nachgewiesen
werden, die in verschiedene grundlegende metabolische Vorgänge involviert sind.
Phänotypische Analysen einer ∆bphO- und ∆bphP-Deletionsmutante deuten auf eine
Rolle des Phytochroms in der Zell-Zell-Kommunikation hin. Letztendlich liefert die
vorliegende Arbeit Hinweise, dass das apo-Phytochrom noch in weitere
physiologische Prozesse involviert zu sein scheint.
Zudem konnte gezeigt werden, dass das Phytochrom in der Stationärphase eines
proteolytischen Abbaus unterliegt.
In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation der
Phosphodiesterase nbdA näher charakterisiert. Phosphodiesterasen sind durch ihre
enzymatische Hydrolyse des sekundären Botenstoffes c-di-GMP an der Regulation
zwischen einer planktonischen und sessilen Lebensweise in Biofilmen beteiligt. NbdA
vermittelt dabei eine NO-induzierte Dispersion des Biofilms. Die in diesem
Zusammenhang postulierte erhöhte Transkription von nbdA in Anwesenheit von NO
konnte jedoch nicht bestätigt werden. Dies impliziert daher eher eine Regulation der
NO-induzierten Biofilmauflösung auf Proteinebene über die N-terminal lokalisierte
membranständige MHYT-Domäne, die putativ als Gassensor fungiert. Die
durchgeführten Reportergenanalysen deuten weiterhin auf eine Transkriptions-
kontrolle durch den Flavohämoglobin-Regulator FhpR unter sauerstofflimitierenden
Bedingungen hin.
.
Summary
131
6. Summary
Phytochromes are red/far-red light sensing photoreceptors whose light absorbing
properties are mediated by a bound chromophore. Originally believed to be limited to
plants, they were nowadays also found in fungi, cyanobacteria and heterotrophic
bacteria. Especially their occurrence in non-photosynthetic, heterotrophic organisms
remains a mystery. Among those organisms is the opportunistic pathogen
Pseudomonas aeruginosa. With the gene products of bphO and bphP, P. aeruginosa
is able to form a holo-phytochrome. While bphO encodes a heme oxygenase, which
produces the chromophore BV IXα by heme cleavage, bphP encodes the apo-
protein. Bacterial phytochromes consist of an N-terminal histidine kinase domain and
therefore represent sensor proteins of a two component signal transduction system.
Using different experimental strategies this thesis presents an overview of the in vivo
role of the bacterial phytochrome of P. aeruginosa. The homolog isolation and
subsequent biochemical characterization supplement the existing data and confirm
the functionality of a red/far-red light photoreceptor with BV IXα as the native
chromophore as well as the light-independent kinase activity.
Reporter gene analysis discovered a complex regulation of the phytochrome operon.
Besides the known RpoS-dependent regulation of the bphOP-cotranscript, an
influence of the quorum sensing systems was observed. In addition, this analysis
revealed an additional promoter for bphP, which is also regulated in a cell-density
dependent manner.
To gain insight into the downstream signaling pathway of PaBphP, a genetic screen
was established based on already existing transcriptome data. This study discovered
three putative response regulators. A direct phosphotransfer of these regulators
failed, probably due to the absence of a signal for transphosphorylation or because
these regulators represent components of a more complicated phosphorelay system.
In vivo cross-linking experiments identified another putative response regulator in
addition to several further putative interaction partners, which are involved in different
basic metabolic pathways.
Summary
132
Furthermore, phenotypical investigations of ∆bphO- and ∆bphP-mutants imply a role
for the phytochrome during cell-to-cell-communication. Finally, this thesis provides
hints for the involvement of the apo-phytochrome in other physiological processes.
In addition it was demonstrated the phytochrome undergoes proteolysis in the
stationary phase.
The aim of the second part of this thesis was to characterize the transcriptional
regulation of the phosphodiesterase nbdA. Based on the ability of
phosphodiesterases to hydrolyze the second messenger c-di-GMP, they are involved
in the regulation between a planktonic and sessile lifestyle in biofilms. In this regard,
NbdA has an impact on the NO-induced dispersion of biofilms. The postulated
increased nbdA-expression though NO could not be verified. This rather implicates a
regulation of the NO-induced biofilm dispersion via controlling the protein activity
mediated by the N-terminal membrane-bound MHYT-sensor domain, which putatively
binds gas. However, expression studies also indicate a transcriptional regulation by
the flavohemoglobin regulator FhpR under oxygen limited conditions.
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Anhang
149
8. Anhang
8.1 Vorveröffentlichungen der Dissertation
Publikationen
Barkovits, K., Schubert B., Heine, S., Scheer, M. and Frankenberg-Dinkel, N.
(2011). „Function oft he bacteriophytochrome BphP in the RpoS/Las quorum-sensing
network of Pseudomons aeruginosa.“ Microbiologie 157(6):1651-1664.
Li, Y., Heine, S., Entian, M., Sauer, K. and Frankenberg-Dinkel, N. (2013). „NO-
induced biofilm dispersion in Pseudomonas aeruginosa is mediated by an MHYT
domain-coupled phosphodiesterase.“ J Bacteriol 195(16):3531-3542.
Konferenzbeiträge
Posterpräsentationen:
Heine S., Barkovits K., Scheer M. and Frankenberg-Dinkel N. (2011).
„The phytochrome regulon of Pseudomonas aeruginosa“
Annual Meeting of the VAAM (Vereinigung für Allgemeine und Angewandte
Mikrobiologie), Karlsruhe, Book of abstracts p. 239
Heine S., Barkovits K., Scheer M. and Frankenberg-Dinkel N. (2011).
„The phytochrome regulon of Pseudomonas aeruginosa“
International conference on tetrapyrrol photoreceptors of photosynthetic organisms
(ICTPPO), Berlin, Book of abstracts poster no: P-D10 Heine S., Barkovits K., Scheer M. and Frankenberg-Dinkel N. (2011).
„The phytochrome regulon of Pseudomonas aeruginosa“
Pseudomonas Conference, Sydney, Australia, Book of abstracts p. 77
Anhang
150
Heine S., Barkovits K., Scheer M. and Frankenberg-Dinkel N. (2012).
„The phytochrome regulon of Pseudomonas aeruginosa“
Annual Meeting of the VAAM (Vereinigung für Allgemeine und Angewandte
Mikrobiologie), Tübigen, Book of abstracts p. 239
Vorträge:
Heine S., Barkovits K., Scheer M. und Frankenberg-Dinkel N. (2011).
„Das Phytochrom-Regulon in Pseudomonas aeruginosa“
Tetrapyrrol Retreat, Bochum, no book of abstracts
Heine, S., Li, Y., Entian, M., Sauer, K. and Frankenberg-Dinkel, N. (2013).
„NO-induced dispersion of Pseudomonas aeruginosa biofilms is mediated by the
phosphodiesterase NbdA“
Annual Meeting of the VAAM (Vereinigung für Allgemeine und Angewandte
Mikrobiologie), Bremen, Book of abstracts p. 211
Anhang
151
8.2 Lebenslauf
Name: Sabrina Heine
Anschrift: Wittener Strasse 99, 44803 Bochum
Geburtsdatum: 24.08.1983
Geburtsort: Reutlingen
Familienstand: ledig
Staatsangehörigkeit: Deutsch
Schulausbildung:
1990-1994 Grundschule, Mössingen 1994-1999 Firstwaldgymnasium, Mössingen 1999-2001 Realschule, Dußlingen Abschluss Mittlere Reife 2001-2004 Ernährungswissenschaftliches Gymnasium,
Tübingen-Derendingen Abschluss der allgemeinen Hochschulreife
Studium:
10/2004-12/2009 Diplomstudiengang Biologie, Ruhr-Universität Bochum Abschluss Diplom
Promotion:
seit 6/2010 Anfertigung Doktorarbeit an der Ruhr-Universität Bochum Lehrstuhl Biologie der Mikoorganismen AG Physiologie der Mikroorganismen
Berufstätigkeit:
3/2009-7/2009 Studentische Hilfskraft Lehrstuhl Biologie der Mikroorganismen Ruhr-Univeristät Bochum
seit 06/2010 Wissenschaftliche Mitarbeiterin, Ruhr-Universität Bochum
Lehrstuhl Biologie der Mikoorganismen AG Physiologie der Mikroorganismen