Data Analysis Guide        

For the miRCURY LNA™ Universal RT microRNA Ready-to-Use PCR panels using Exiqon GenEx software Version 3 (February 2014)

                        

 

   

 

   

 

Contents 

Considerations on Normalization ................................................................................................... 4 

Why normalize? ................................................................................................................................ 4 

Controls and normalization assays ................................................................................................ 4 

Introduction to GenEx ...................................................................................................................... 6 

Flow of data analysis ....................................................................................................................... 8 

Export the run data from your cycler ............................................................................................. 9 

Importing and merging your instrument export files using the Exiqon import wizard .............. 14 

Inter-plate calibration ..................................................................................................................... 23 

Quality control ................................................................................................................................. 24 

Cut off ............................................................................................................................................... 28 

Frequency of missing data ............................................................................................................ 29 

Call rate plot .................................................................................................................................... 29 

Missing data – part 1 ..................................................................................................................... 30 

Normalization to global mean ....................................................................................................... 31 

Normalization to reference gene(s) ............................................................................................. 32 

Missing data – part 2 ..................................................................................................................... 38 

microRNAs detected only in a subset of samples ..................................................................... 39 

Average RT replicates ................................................................................................................... 39 

Converting to relative quantities ................................................................................................... 40 

Further data analysis using GenEx ................................................................................................. 42 

Using the Data manager ............................................................................................................... 43 

Statistical analysis in GenEx ........................................................................................................ 44 

Creating a subset of regulated assays ........................................................................................ 46 

Dat

3

a analysis g

   

Gene

Quick s

Online

Referen

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

guide versio

 

e info ...........

steps for exp

help ............

nces ............

on 3

....................

perienced u

....................

....................

....................

users ...........

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

....................

 

.......... 53 

.......... 54 

.......... 55 

.......... 55 

Dat

4

a analysis g

   

TheThis datreal‐timand howsuch as checkingstable realso prowhetherregulatepublicatinformat

The ExiqReady‐toboth Rea

ConWhy The purprelevant

In settinwhen pron each some buvariationthis purp

ContrIn the dePCR pan

Inter-plSince eaplates. Thave delayout fi

Three wpossibili

guide versio

 

e data a analysis gue PCR cyclerw to performinterplate cag for sample eference genvide a brief ir any of the sed microRNAtion‐ready figtion on analy

qon data impo‐Use PCR pady‐to‐Use P

nsidernormalizpose of a qPt expression 

ng up an experotocols are sample, RNAut not all samn. In order topose, differe

rols andesign of the nels, we have

late calibraach assay is pThis raises thsigned a caliiles).  

wells have bety for outlier

on 3

analyuide will provrs, import anm the data prealibration, seand assay q

nes (includingintroductionsamples are As across the gures such asyzed microR

port wizard aanels wherePCR panels a

rationze? CR experimelevels in a se

eriment, smastandardizedA extraction mples, pipetto get biologicent approach

d normalplate‐layoute incorporate

ator present only he issue of rubration assa

en assigned r removal. In

ysis guvide an instrud annotatione‐processingetting cut‐offuality, averag selection),  to basic statsignificantly samples. Fins heatmap aNAs from on

applies to  daas GenEx das well as miR

ns on

ent is usuallyet of samples

all differenced:  sampling may not be ting may not cally relevanhes to norma

ization afor the miRC

ed several op

once on eacun‐to‐run diffy with a com

for inter‐plan each of the

uide vuction on hon of data in Gg. The data pf, handling maging technic scaling and tistical analyy different fronally, it will bnd principal nline databas

ata generateta analysis mRCURY LNA™

Norm

y the detectios. 

es in replicatmay not be 100% reprodbe accurate

nt data, it is ialization may

assaysCURY LNA™ ptions for dat

ch plate, replferences. Tompanion tem

te calibratioese wells, bot

ersionow to export GenEx using pre‐processinmissing data pcal replica, nolog transformysis using eithom one anotbe mentionecomponent ses. 

d on miRCURmodule can b™ Universal R

maliza

on or verifica

te performanidentical, stoducible, PCRe, and real‐timmportant toy be employe

Universal RTta normalizat

licates must  allow for sim

mplate (annot

n to provideth the prime

n 2 data from ththe Exiqon dng described points, remoormalizing toming the dather T‐test orther, includind how to easanalysis, and

RY LNA™ Unbe used for dRT microRNA

tion

ation of diffe

nce cannot borage may ha inhibitors mme cyclers mfilter out teced. 

T microRNA Ption.

be performemple inter‐pltated as UniS

e triplicate vaers and the D

he most comdata import where involve

oving outlierso global meata. The guider ANOVA to sng a list of thsily create add retrieve fu

iversal RT mdata generateA individual a

erential, biol

be avoided, eave differentmay be presemay show runchnical varia

PCR, Ready‐t

ed using sepalate calibratiSp3 IPC in th

alues with thDNA template

 

mmon wizard, es steps s, an or e will show he most dvanced urther 

icroRNA ed on ssays. 

ogically 

even t effects ent in n‐to‐run ation. For 

to‐Use 

arate ion, we he plate 

he e are 

Dat

5

a analysis g

   

present,order toused to

SampleSome saresult incontrol fsynthesiprovidedmatchinwhich isnormaliz

Global Variatioendogendata agabe the band a hivalidatioGlobal nexpressi

ReferenThe use to samprecommdanger oat the exshould tThis seleFor validscreenin

In our paover a wand the approprnumber microRNmicroRN

guide versio

 

, giving high o give a signaquality contr

e spike-in ample types n different refor differencis. We have dd with the cDng primer set to be used wzing to the sy

Mean Normn due to samnously expreainst the globbest option wgh proportioon studies wnormalizationion level is ch

nce gene Nof endogeno

ple differencemended approof using endoxact same letherefore be ection can bedation studieng process, b

anels, we hawide range ofother three riateness of tof reference

NAs over othNA both biolo

on 3

reproducibilal (but may brol each plate

may containeverse transcces in efficiendesigned an DNA synthest. A UniSp6 Pwith our nonynthetic spik

malization mple differenessed miRs. Ibal mean; i.ewhen screenion of essentihere most ofn is also not hanged. 

Normalizatious references and handloach, great cogenous refevel in all sammade with ce performedes based on pbased on exp

ave pre‐assigf sample typare small RNthese referenes can be seler small RNAogically and 

lity. The intebe affected be run.

 PCR inhibitocription or PCncies is by adRNA spike‐insis kit. One wPCR primer sen‐plate basedke‐in – it sho

nces and hann large screee., the averaging samples wally unregulaf the genes aa good optio

ion ce genes can ing prior to ccaution shouerence genemple types. Tcare, and shousing Normpanel screenpression beha

ned 6 wells fes. Three of NA referencences can be aected. WhenA reference gduring exper

er‐plate calibby PCR inhib

ors, which soCR efficienciedding a known, UniSp6, fowell in the Reet is also prod PCR primeould be used 

ndling prior tening studiesge of all micrwith a high cated microRare chosen pon between s

 be another cDNA syntheuld be taken s lies in the aThis is rarely ould be specFinder and/oning, the refeavior most re

for 6 differenthese are me genes. Oncanalyzed forn applicable,genes, since rimental han

rator is indeitors in the s

ometimes sues between cwn RNA spikeor this purpoeady‐to‐Use Povided with tr set productfor sample q

o cDNA synts, it is often rroRNAs exprcall‐rate (numNAs, but shoprecisely for samples in w

approach toesis. Though in the selectassumption ttrue. The secific to the saor geNorm, berence genesesembling th

nt genes whiicroRNAs whe qPCR data r your specifi, we recommmicroRNA bndling (extrac

pendent of cample) and c

rvive RNA pucompared sae‐in to the sase. The UniSPCR plates cothe SYBR® grts. We do noquality contr

hesis can berecommendaressed in all smber of exprould be used being differewhich the ove

 normalize athis is a gootion of referethat a speciflection of refample set yoboth incorpos may be selehe global me

ich have stabhich are oftehas been obc samples an

mend choosinest resemblection, RT etc

cDNA qualitycan therefore

urification. Tamples. One ample duringSp6 RNA temontains the reen master ot recommenrol. 

e normalizedable to normsamples [1]. ressed micro with cautionentially expreerall microRN

against variatd and ence genes. Tfic gene is exference geneu are workinorated into Gected duringean. 

ble expressioen stably expbtained, the nd the optimng stably expe the behavic.)

 

y in e be

This may way to g cDNA mplate is 

mix kit, nd 

using malize This can oRNAs) n in essed. NA 

tion due 

The pressed es ng with. GenEx. g the 

on levels ressed, 

mal pressed or of 

Dat

6

a analysis g

   

HowIntrodExiqon hto our manalyze validate much m

Possiblysubsequcorrect odata hancomplex

GenEx ismerge band geNreferencpost‐nortests, clu

DownloTo insta“softwa

In the dilicense, days. 

Once insand upd

The Gen

guide versio

 

w to geduction thas partneremiRCURY LNAreal‐time qP reference gore. 

y the most imuent statisticorder and wndling. Powex experiment

s intuitive anbecomes simNorm in the sce genes in ormalization dustering met

oad and insll the Exiqonre download

ialogue box cuse the licen

stalled, remedates are per

nEx manual is

on 3

et starto GenEd with MultiA™ UniversalPCR data withenes, classify

mportant paral analysis. Pith confidencerful presenttal designs. 

nd easy to usple. Furthermsoftware. Thuone softwaredata analysisthods, princi

stall GenExn version of Gd” tab. 

choose run, nse key prov

ember to cheriodically rele

s available w

rted wEx iD to provide RT microRNh simple clicy samples, g

t of qPCR exPre‐processince. GenEx haation tools p

e, and with tmore, GenExus, you get be installations. Current feapal compone

x GenEx, go to 

and follow tided by ema

eck for updateased, so che

within the sof

with Ge

e a software NA PCR produks of the moroup genes, 

xperiments isng steps neeas a streamlipresent profe

the Exiqon qx has the advboth of these. GenEx alsoatures includent analysis,

http://www

he installatioail. Otherwise

tes. MultiD ceck for upda

ftware unde

enEx

for qPCR datucts. GenEx oouse. The memonitor tim

s the pre‐proed to be perfoned and useessional illus

qPCR plate imvantage of ine algorithms  offers advande parametri artificial neu

w.exiqon.com

on guide. If ye you may us

continuouslytes routinely

r the Help m

ta analysis spoffers advanethods are sue dependen

ocessing of raormed with cr‐friendly intstrations of e

mport wizardncorporatingon which tonced statisticic and non‐pural network

m/qpcr‐softw

you have purse a free dem

y works to imy.  

menu. 

pecifically adnced methoduitable to selnt processes 

aw data for consistence,terface whiceven the mos

d, data imporg both NormFo base your ccal solutionsparametric stks, and much

ware and the 

rchased a Gemo license fo

mprove the s

 

dapted ds to lect and and 

, in the ch aids st 

rt and Finder hoice of s for tatistical h more. 

enEx or 14 

oftware, 

Dat

7

a analysis g

   

PracData forfiles\Mu

The foldalong wivalues fo

guide versio

 

ctice dr testing the ultid\Genex5

der contains aith matchingor hemolysis

on 3

data sExiqon impo5\Exiqon\Exa

a full data seg layout files.s testing. 

set ort wizard anamples 

et of .txt files. You will als

nd data analy

s exported fro find an exc

ysis flow can 

rom panel I acel file with e

be found he

and II, analyzexamples of 

ere: c:\progr

zed on an LC4serum/plasm

 

am 

480, ma 

Dat

8

a analysis g

   

FlowBefore ydata ana

guide versio

 

w of dyou get startalysis flow: 

on 3

data aed with setti

analysing up your e

sis experimentss, it may be uuseful to consider the sho

 

own 

Dat

9

a analysis g

   

HowGenExpoRun you

Importaexperim(http://wcan be utemplat

For yourthis is noplace du

Below, w

ABI Vii

If you hathat the

First, it i

Second, dye in thdirectionPCR Instcorrect –

Once all

left‐han

choose 

to, and a

guide versio

 

w to genEx ort the ruur experimen

ant: For ABI Vment, it is poswww.exiqonused when see file and sta

r own convenot necessary uring the dat

we have give

a 7

ave used an A data analys

is important 

it is importahe experimenns on how totruction man– but it is alw

 settings are

d pane (Expe

assign an Exp

on 3

et the

un data fnt according 

Viia 7, 7900,ssible to down.com/sds). Tetting up theart the run. 

nience, it mafor data ana

ta import usi

en examples 

ABI Viia 7 cyis settings ha

that the exp

ant that you hnt, and that bo analyze thenual, tip 10. Ifways a good 

e correct and

eriment Men

port File Nam

. In the

raw d

from youto the proto

  7500,  7500wnload run teThese files spe experiment

ay be useful talysis when ung the wizar

of how to ex

cler for you ave been cor

periment has 

have indicatebaseline ande data, pleasef you have uidea to verif

d the experim

nu), click 

me (if differe

e various tab

data fr

ur cyclerocol.  

0 FAST and Semplate filespecify propert. In the SDS 

to annotate tusing Exiqonrd. 

xport your d

experiment,rrect.  

 been run as

ted whether od threshold se refer to ouused one of ofy that the th

ment analyze

. ent from the 

bs, make sure

rom yo

r

StepOnePluss (.sdt files) fr cycling andsoftware, si

the run with  Ready‐to‐us

ata from som

 please note

s Type: Stand

or not you haettings are sur miRCURY Lour run templhreshold is ad

ed, you are re

. In th

  and 

 to the locaautomatical

e that only R

our cy

s users. Priorrom the Exiq critical analmply open th

assay and sase plates. An

me of the ma

e that it is ne

dard Curve.  

ave used ROXet manually LNA™ Univerlates, the setdequately se

eady to expo

he window n

tion you wisly assigned n

esults is sele

ycler in

r to performiqon website ysis settingshe appropria

ample namennotation wil

ajor cycler ty

ecessary to ve

OX passive refand correctlrsal RT microttings shouldet. 

ort the data. 

now appearin

sh to export tname). Choo

ected, and th

 

nto

ing the 

, and ate 

es – but ll take 

ypes. 

erify 

ference ly. For oRNA d be 

In the 

ng, 

the file ose 

hat 

Dat

10

a analysis g

   

empty a

Select A

window

ABI 790

If you hathe data

First, it iversion o

Second, dye in thdirectionPCR Instcorrect –

Once all

the dialo

Tip: with

 me

analyzed

ABI 750

If you hanecessa

First, thepossible

guide versio

 

and omitted w

ll Fiels in Con

, or 

00

ave used an Aa analysis set

is important of the softwa

it is importahe experimenns on how totruction man– but it is alw

 settings are

og box, choo

h SDS 2.4 it is

enu, choose 

 the files yo

. Pleased correctly fi

00 and Ste

ave used an Ary to verify t

e experimente to change th

on 3

wells are not

ntent 

 in the top

ABI 7900 cycttings have b

that the expare allows yo

ant that you hnt, and that bo analyze thenual, tip 10. Ifways a good 

e correct, you

ose 

. Then 

s possible to

ou wish to ex

e note that thrst. 

pOnePlus

ABI 7500, 75that the data

t must have he experime

t skipped 

p right‐hand 

cler for you ebeen correct.

periment has ou to conver

have indicatebaseline ande data, pleasef you have uidea to verif

u are ready t

 to t

 perform bat

. In the dia

xport. Select 

his method is

500 FAST or Sa analysis set

been run as nt type after

. Click eithe

corner of th

experiment, .  

 been run asrt between th

ted whether od threshold se refer to ouused one of ofy that the th

to export the

the folder of

tch export w

log box, cho

the destinat

s only valid i

StepOne cycttings have b

Type: Quantr the run. 

r 

e window. 

please note 

s an AQ expehe two forma

or not you haettings are sur miRCURY Lour run templhreshold is ad

e data. In the

, 

f your choice

without open

ose 

tion folder w

f you are sur

ler for you ebeen correct.

titation – Sta

 at the

that it is nec

riment, not Rats post‐run)

ave used ROXet manually LNA™ Univerlates, the setdequately se

e   menu

 and 

e. 

ing the files 

with 

re that all the

xperiment, p  

andard Curve

e bottom of t

cessary to ve

RQ (the SDS ). 

OX passive refand correctlrsal RT microttings shouldet. 

u, choose 

to export. In

, then

e files have b

please note t

e experiment

 

 

the 

erify that 

2.4 

ference ly. For oRNA d be 

. In 

n the 

 and 

been 

that it is 

t. It is 

Dat

11

a analysis g

   

Second, dye in thdirectionInstructi

Once all

In the di

Roche

If you haanalysis 

yet, presbrowse 

Tip: For automatscope of

guide versio

 

it is importahe experimenns on how toion manual, 

 settings are

ialog box, tic

LC480

ave used a Rmethod, an

ss to the locati

high throughtically exportf this guide, 

on 3

ant that you hnt, and that bo analyze thetip 10. 

e correct, you

ck only 

. Then 

oche LC480 d make sure

). To expoon where yo

hput, it may t the data atand should b

have indicatebaseline ande data, please

u are ready t

,  and

.

for your exp that the Cq 

ort the data, ou wish the f

be worthwht the end of tbe learned fr

ted whether od threshold se refer to the

to export the

d select 

. Ass

 

periment, go values have

right‐click ofile, and save

hile to createthe run. Howrom the LC48

or not you haettings are se miRCURY L

e data. In the

sign file nam

to   ,  been calcul

n the data tae. 

e a macro forw to program80 manual.

ave used ROXet manually NA™ Univers

e   menu

e and locatio

choose the 2ated (if this h

able and cho

 

r running them such a mac

OX passive refand correctl

rsal RT micro

u, choose 

on, and selec

2nd derivativhas not been

oose Export t

e experimentcro goes beyo

 

ference ly. For RNA PCR 

. 

ct 

ve n done 

table, 

t and ond the 

Dat

12

a analysis g

   

Roche

If you ha

To expo

should s

anywhe

Alternat

and clickexport t

BioRad

If you haOnce th

or Quan

the data

Browse 

BioRad

If you haanalysis data, ple

Once all

click 

to your f

guide versio

 

LC96

ave used a R

. 

rt one file at

show 

re in the tab

tively, in the 

k he data to th

d CFX

ave a BioRade Cq calculat

ntification Da

a table in the

to the folder

d iQ5

ave used a Bsettings (baease refer to

 settings are

folder of cho

on 3

oche LC96 fo

t a time, in th

ble, and choo

 men

. Select thehe location o

d CFX cycler, tions have be

ata window

e window, rig

r of choice, n

ioRad iQ5 cyseline and tho our miRCUR

e correct, you

. Right‐cl

oice, name th

or your expe

he 

 with the

ose 

nu choose 

e run files foof choice. 

you can choeen perform

ght‐click and

name the file

ycler for yourhreshold) haRY LNA™ Uni

u are ready t

ick anywher

he file and 

eriment, whe

 tab, sub t

e 

. 

or which to e

oose to analymed, data can

 in the menu

e and 

r experimentve been corriversal RT m

to export the

re in the Resu

.

en you add a

ab 

 tab active. E

. Tick 

xport data, t

yse either as n be exporte

u popping up

. 

t, we recommrect. For direicroRNA PCR

e data. In the

ults table, an

nalysis 

, one of t

Export by rig

then click 

regression od either from

. Simply p

p choose 

mend verifyiections on hoR Instruction 

e 

nd choose 

 choose 

the 4 data w

ght‐clicking 

 a

or single threm the Quant

place the cur

ing that the dow to analyzmanual, tip 

 

indows 

 

nd 

eshold. ification 

rsor over 

. 

data e the 10.

 tab, 

. Browse 

Dat

13

a analysis g

   

Stratag

If you haanalysis data, ple

Once all

folder of

 

guide versio

 

gene Mx300

ave used a Stsettings (baease refer to

 settings are

f choice, nam

on 3

00P/3005P 

tratagene cyseline and tho our miRCUR

e correct, you

me the file an

ycler for yourhreshold) haRY LNA™ Uni

u are ready t

nd 

r experimentve been corriversal RT m

to export the

 then 

. 

t, we recommrect. For direicroRNA PCR

e data. In the

mend verifyiections on hoR Instruction 

e   menu 

ing that the dow to analyzmanual, tip 

 choose 

. Browse t

 

data e the 10. 

o your 

Dat

14

a analysis g

   

Impexp StartingOpen Ge If you ha

 

Click the In the po

 

guide versio

 

portingport fil

g the wizarenEx.  

ave the start

e Exiqon qPC

op‐up windo

on 3

g andles usrd:

t‐up window 

CR plate impo

ow, click star

d mergsing t

active, close

 

ort wizard bu

t. 

ging yhe Ex

e this. 

utton  

your ixiqon

. 

nstruimpo

umentort wiz

 

t zard

Dat

15

a analysis g

   

Step 1:The firstcycler yotwo plat

 You nowtype (gethese Exlayout fiIf you hawindow two imp

For each

Click  Step 2:You nowIf you hapanel w

guide versio

 

: Select pant choice to mou have beentes with diffe

w need to imene of interesxcel files can iles are creatave ticked Pa will be availport windows

h layout, bro

 

: Select insw need to selave run only ill appear for

on 3

nel type, fomake is whethn using, and erent layouts

port the layost, referencebe downloated during thanel I (your plable. If you s will be ava

wse to the lo

strument exlect your instone plate tyr file selectio

ormat and iher you havewhether yous (Panel I and

out file(s). The gene etc) oded from Exhe plate confpanel set conhave ticked Pilable, one fo

ocation of yo

xport filestrument expype (e.g.only on.  

instrumente been runniur panel set d II). 

his is the Excof assays in thxiqon’s homefiguration prntains only oPanel I and Ior each layou

our plate lay

port files (.txty Serum/plas

t ng panels incontains jus

cel file(s) spehe plate(s). Fepage. For Pirocess on Exine plate layoI (a plateset ut. 

out file, and 

t or .xml, depma panel in 

96‐ or 384‐wt one plate la

cifying the pFor all standaick&Mix custqon’s homepout), then onwith two dif

open the file

pending on c384‐well lay

well format, ayout (Pane

position (welard plate fortom panels, page. nly one impofferent layou

 e. 

cycler type). yout), then a 

 

which l I), or 

l) and mats, the 

ort uts), then 

single 

Dat

16

a analysis g

   

Click shift or cautomat

arrow b  If you ha

Each panthe right

guide versio

 

ctrl for multitically result

uttons . 

ave run a set

ne has a t pane open 

on 3

 aiple file seleced in the des

t of plates (e

the files of p

and browse tction, select sired file ord

.g. Human P

 bpanel II. 

 

to the locatioand open yoder, you can 

anel I and II 

 

utton. In the

on where yoour files. If thmove a file u

V2) two pan

e left pane op

u have your he file naminup or down i

es will open

pen the files 

files. While g has not n the list usi

. 

 for panel I a

 

using 

ng the 

and in 

Dat

17

a analysis g

   

Importasame sa

can mov 

Click  Please nnot poss Step 3:The tablclassifica

ClassifiePCR platclassificareferencbut thatin colum The waysame nu1 in a netreatmein an RT

guide versio

 

nt: The files mple are alig

ve a file up o

 

note that oncsible to go ba

: Edit sample generatedation column

er is a term ute, technical ation columnce genes andt function is nmns.  

y a sample clumber in the egative contrent classifier,T classifier. A 

on 3

for panel I agned. If the f

r down in th

ce you click nack without 

ple names ad after file imns.  

sed in GenExreplicates, bns. Classifiersd spike‐in connot relevant 

lassifier workclassificatiorol classifier, and RT repliclassificatio

nd II must hfile naming h

e list using t

next at this sre‐starting th

and add clmport contain

x to group sabiological gros are also usentrols). In thauntil step 4 –

ks, is that samn column. Fo treated samicates of the n column is r

ave the samhas not auto

the arrow bu

step a table ihe wizard. 

assifications 4 predefin

amples that boups or negaed to identifat case, the c– step 3 deal

mples belongor example, nmples could b same RNA srecognized a

e sample ordmatically res

uttons .

s created ba

n columnsned, automat

belong to theative controlsfy assays useclassifiers arels only with s

ging to the snegative conbe assigned 1sample shoulas having a #

der, so that tsulted in the 

sed on the im

s tically genera

e same categs). Sample clad for specifice found in clasample anno

ame categorntrol samples1 and non‐treld be assigne# as the first s

the two files correct orde

mported file

ated column

gory (i.e. on assifiers are c purposes (iassification rotation which

ry or group gs should be aeated 2 in a ed the same symbol in th

 

s for the er, you 

s. It is 

ns called 

 same found in i.e rows, h is done 

get the assigned 

number e header 

Dat

18

a analysis g

   

name. Ifwhich on As mentautomat #FileNammaking 

#Plate is

SampleIshould m

The onlyassignedbetweensample nfilling eaoverviewspread‐s

It is nowexperimgroups. easily beclassifica

For each#), and acells caninsert vaat this tiassignedbeen cre

For the s

guide versio

 

f you want Gnes these are

tioned abovetically assign

me serves toit easier to a

s a classifier 

D identifies amake it easie

y pre‐defined already in tn cycler typename to be uach cell indivw. The lattersheet as in th

w possible to ment, we recoYou may alse classified  dations may in

h classifier yoassign the clan be selectedalue (this funime, they shod 0 in the negeated with sa

sake of keep

on 3

GenEx to conse by adding a

e, Step 3 autoned columns

 help identifyassign correc

identifying w

a sample accer to assign p

d column tothe cycler, thes). Using theused during vidually or byr method reqhe wizard. 

add additionommend addo choose to during the sun some case

ou wish to adassifications d using shift onction does nould be givegative controample overv

ping the over

sider groups a column for

omatically ads should not 

fy which platect sample nam

which sample

cording to itsproper sampl

o edit is the #he sample nae file name afurther dowy copy‐paste quires that th

nal classificading classifieidentify negubsequent prs be relevant

dd, just clickstarting fromor ctrl, and anot work for n the classifiol classifier. Aview.  

rview, it is no

in the further each classif

dds 4 pre‐de be edited:

es/samples cmes. 

es were run o

s position inle names. 

#SampleNamame assignedand sample IDwnstream anafrom an Exche plates/sam

tion columners to identifyative controre‐processint, i.e. to iden

m 1 and onwassigned the #SampleNamication valueAgain, copy‐

ow possible t

er data analyfier. 

efined classif

came from w

on the same 

the Exiqon p

me. If correctd by your cycD to identifyalysis. This cacel spread‐shmples appea

s. To the exty at least tecl samples at g (explainedntify sub‐gro

, name wards for eacsame classifme). If you de 1 while unk‐paste can be

to re‐size the

ysis you need

fication colum

which instrum

plate.  

plate layout f

t sample namcler will appeeach samplean be done bheet containiar in the sam

tent it is relevchnical replicthis point, a

d in a later seups. 

the new colh group or cfier by right‐cdefine negatiknowns are lee used if a sp

e wizard win

d to let GenE

mns. The firs

ment export f

file. Again, th

mes have notear (this maye, assign eacby selecting aing a samplee order in th

vant in your cates and bioalthough thesection). Addit

umn (startincategory. Muclicking and ive control saeft empty orpread‐sheet 

dow. 

 

Ex know 

st three 

file, 

his 

t been y vary ch and  he 

ological se may tional 

ng with ultiple select amples r has 

Dat

19

a analysis g

   

If you ac

select thare nece

Once all

Step 4:

You are data for steps. Incolumns

guide versio

 

ccidentally ad

he column yoessary, and c

 sample nam

: Save data

now ready t later loadingn step 4, you s have been 

on 3

dded too ma

ou wish to decannot be de

mes and class

a or Load to

to load your g. During preget a chanceassigned cor

any classifica

elete, and clieleted. 

sifiers have b

o data edito

data into Gee‐processinge to verify thrrectly before

ation column

ick

been assigne

or

enEx and initg, GenEx will hat all sample loading to 

ns, they can e

. Not

ed, click 

iate pre‐proneed classife names andGenEx and c

easily be rem

te that the o

. 

cessing or alication columd necessary ccommencing

moved again.

original 4 colu

ternatively smns for someclassificationg the pre‐pro

 

 

. Simply 

umns 

save the e of the n ocessing.

Dat

20

a analysis g

   

If you sc

guide versio

 

croll all the w

on 3

way to the rigght, you will see the classsification columns.  

 

 

 

Dat

21

a analysis g

   

Note thapurposeneeded finterplatbetweenhuman pidentifie

If you sclater inttypes, yo

The #Refthe platecan easi

The #Spicontrol pused for

The ordetypes (i.ecyclers (down‐st

If all loo

Your dat

guide versio

 

at the #FileNe. Instead, twfor later use te calibratorn #Plate and panel I+II). Ines the individ

croll down, yerplate calibou may also 

fGene row ise layout(s). Ifily be chosen

ike will automprimer sets fr sample QC 

er of assays ie. Roche LC4(i.e. ABI 7900tream proces

ks well, 

ta is now rea

on 3

Name and Samwo new columin interplate

rs from the p#IPC‐PlateIDn this case #Pdual plates, to

ou will noticbration, and wnotice that a

s automaticaIf candidate rn during the s

matically be for detection(explained in

in the table d480) export t0) re‐arrangessing, and ca

 an

ady for pre‐p

mpleID colummns have appe calibration,late layout tD is mainly foPlate identifio allow for c

ce a number will disappeaa #RefGene a

ally assignedreference gesubsequent p

assigned in  of the RNA sn a later sect

depends on the assays in e the assay oan be change

d/or 

processing in

mns have dispeared autom, and since ththey were auound in expeies the plate correct interp

of almost emar once this tand/or #Spik

only if candienes have nopre‐processin

all plate layospike‐in supption). 

the instrumethe order of

order alphabeed once the d

 the Data ed

sappeared simatically: #Ihe wizard knutomatically aeriments whepair after mplate calibrat

mpty rows natask has beeke row has b

 

idate referent been identing (explained

outs containplied with th

ent export filef the plate, soetically. The data has bee

. 

ditor.

nce they havPC and #IPC‐nows the posassigned. There two plateerge. #IPC‐Ption of each i

amed IPC. Thn performedeen added. 

nce genes haified in the pd in a later se

ing one or me cDNA synth

e from your corted by roworder of assan loaded to t

ve served the‐PlateID .Thesition of the he difference es make a paPlateID insteaindividual pl

hese are need. For some p

ave been idenplate layout(section). 

more of the spthesis kit, and

cycler. Manyw. However, says has no efthe Data Edi

 

eir ese are 

air (as in ad ate. 

eded for plate 

ntified in s), these 

pike‐in d can be 

y cycler some ffect on itor. 

Dat

22

a analysis g

   

Howin GIn this seand genanalysis

If at som

the file u

later, berather th

At any ti

far. In thof steps 

The ordesort the anywhe

Through

specific In the diheader),

guide versio

 

w to prGenExection we goeration of re. 

me point duri

using the dat

e sure to imphan a data e

ime during t

he performed t

er of the assassays alphare in the Dat

hout the pre‐

gene or samialog box, se, and fill in yo

on 3

re-prox o through all elative values

ing the pre‐p

ta editor 

port the file uditor, and pr

he pre‐proce

 mthus far.

ays will at thabetically, yota Editor tab

‐processing a

mple within tlect whetherour search te

ocess

the steps nes (e.g. “delta

processing yo

 men

using edit filere‐processing

essing, you w

menu, choos

his point appou can do sole, and in the

 

and subsequ

he grid. In thr you want toerm. 

and n

ecessary to ga delta Cq” ca

ou wish to b

nu and 

e   ‐ othg will not be

will be able t

se 

pear in the oro at any time e menu choo

uent data ana

he o search in g

ormal

et your dataalculation), f

reak from th

. When

erwise data  an option.

o view which

 and a windo

rder specifieduring the pose Sort by G

alysis, you ha

 menu chogenes (colum

lize yo

a ready, inclufor subseque

he work and 

n you wish to

will loaded t

h steps have 

ow will appe

d by the cyclpre‐processinGene names.

ave the optio

ose mn header) o

our da

uding normalent statistica

continue lat

o continue t

to the contro

 been perfor

ear showing a

ler. If you wing. Simply rig. 

on of locatin

or samples (ro

 

ata

lization l 

er, save 

he work 

ol panel 

rmed so 

a full log 

sh to ght‐click 

g a 

. ow 

Dat

23

a analysis g

   

Futhermbar. 

If at som

can easi

Inter-When codata betnegligibcalibrati

During tidentifie

In the pr

Fill in th

Then 

You shothey havcolumn,

Note thaseparateseparatecalibratisame lin

Interplatgeneratiprecisio

guide versio

 

more, it may 

me point duri

ly creat new

-plate caomparing mutween the plle – in this caon requires 

the plate imped. 

re‐processin

e dialog box 

. 

uld notice thve now fulfill it will disap

at if you have lines beforely, and thuson, they arene. 

te calibratioing additionan of measure

on 3

be easier to 

ing pre‐proc

w classificatio

 an

alibrationultiple plateslates. Keep inase inter‐plaknowledge o

port using th

g menu

as shown he

hat the rows led their purpear from th

e run a platee the interpls need to be e automatica

n, as well as al decimals. Te is certainly

read the tab

essing you re

on columns. I

d specify the

n s, as for full pn mind that ste calibratioof negligible 

e Exiqon pla

ere: 

and columnrpose. This ishe table. 

e set of two pate calibratiinterplate cally merged –

several subsThese will bey not to the t

ble if you fix t

ealize that yo

In the 

e column(s) y

panels, the fsome cyclersn may not brun‐to‐run v

te wizard, in

, choose

ns containings a general th

plates per saon. This is bealibrated ind– therefore th

sequent pre‐e difficult to third or fourt

the labels. C

ou did not cr

 menu, 

you wish to c

first thing yos are so robue necessary.variation. 

nterplate cali

e  

g IPC and Platheme: once y

ample (panelecause they dependently.he two plate

‐processing slook at and th decimal). 

lick   in th

reate sufficie

choose 

create. 

u want to doust that run‐t However, sk

brators have

te classifiers you no longe

 I+II), these ahave technic During the ies of a set wi

steps, involvehave no realAt any point

he Data edit

ent classifier

o is calibrate to‐run variatkipping inter

e automatica

. 

 

 disappear, ser need a row

appeared oncally been ruinterplate ll now appea

es calculatiol meaning (tht during pre‐

 

or tool 

s, you 

your tion is r‐plate 

ally been 

since w or 

n un 

ar on the 

ons he 

Dat

24

a analysis g

   

processi

menu, c

QualiInterna

With theduring ththe cDNAbe purchUniSp4 asynthesi

If there iworthwhinhibitor

We do n

During pautomatcase for 

In the pr

Click 

Spike‐in 

If the spvalues w

guide versio

 

ing, it is poss

hoose 

ity contral amplifica

e cDNA synthhe cDNA synA synthesis ahased: cel‐mand UniSp5 iis reaction, s

is great diverhile to inspecrs in the sam

not recomme

plate import tically addedstandard pa

re‐processin

. 

 outlier value

pike‐in value will be highlig

on 3

sible to speci

rol ation contro

hesis kit, an Rnthesis, and tand PCR. FuriR‐39‐3p inteintended for erving as a c

rgence acrosct the datase

mple.  

end normali

using the Exd if any of theanels, option

g menu, cho

.  

es are calcul

of any sampghted in red 

ify the numb

ol

RNA spike‐inthen used asrthermore, a ended for adaddition durcontrol of ext

ss the differeet for the out

zing to the s

xiqon qPCR pe spike‐in coal for custom

oose 

ated using G

ple(s) deviateinside the gr

ber of decima

 and then 

n control is ins an internal  spike‐in kit pddition duringring sample ptraction effic

ent samples ftlier samples

spike‐in cont

plate import ontrol assaysm panels). 

 

Grubbs outlie

e beyound thrid. 

als displayed

the number 

ncluded. This amplificationproviding foug cDNA synthpreparationciency. 

for one or ms to estimate

trols. 

wizard, a spiwere presen

er test. 

he assigned c

d. In the Data

of decimals 

spike‐in is inn serving as ur additionalhesis, and a by spiking it 

ore spike‐inse whether the

ike‐in classifint in the plat

, then

confidence in

a editor 

you wish. 

ntended to ba quality chel spike‐in RNmix of UniSpt into the cDN

s, it may be ere might be

ication row wte‐layout (alw

n 

nterval, the C

 

 

e added eck on NAs can p2, NA 

e 

was ways the 

Cq 

Dat

25

a analysis g

   

A visual 

processiIn the di

A plot rebe highl

In the sa

can be c

If differen

guide versio

 

inspection c

ing menu, chialog box, se

epresenting  ighted and la

ame manner

created by se

is selected,t genes, this

on 3

can be perfor

hoose lect: 

each spike‐iabeled simp

r, a line plot i

electing 

, then a plot  may be help

rmed by crea

n control as ly by clicking

indicating th

of all assayspful – for full

ating a line p

  

a line acrossg it, and de‐s

 

e expression

s in the platel panel analy

plot for spike

, the

s the sampleelected by c

n profiles of a

 i

e will be showysis, the plot 

e‐in controls.

en 

es will now aplicking again

all pre‐define

n the dialog 

wn. For layoumay becom

. In the pre‐

ppear. Each n. 

ed reference

box. 

uts with fewe confusing.

 

. 

line can 

e genes 

 

Dat

26

a analysis g

   

Inhibitedseveral oamplific

The spikgene val

Note thanormaliz

Before dto RNA dimportaonly thedeviatinin this taaffected

Hemoly

In serumsampleshemolysthis ΔCqsample c

In the pr

 A plot o

guide versio

 

d samples shother assaysation efficien

ke‐in kit manlues, depend

at not all asszation. Inhib

discarding sadegrading fant to evaluate spike‐in wilg. Apart fromask since inhd samples. 

ysis test

m/plasma sams, giving rise sis is by moniq is used to excohorts for m

re‐processin

of the hsa‐mi

on 3

hould be eass (e.g. referenncy) than in 

ual providesding on samp

says will be ebited samples

mples, pleasctors such ate whether al deviate from the line plibition shou

mples, thereto cellular deitoring the Δxclude highlymonitoring p

g menu, cho

iR‐23a‐3p – h

ily identifiednce genes), aun‐inhibited

tables aidinple type. 

equally affects should be d

se keep in ms repeated frany discrepam other samot describedld result in a

is always a rerived microΔCq between y hemolyzedurposes with

oose 

hsa‐miR‐450

d as samples amplifying wd samples. 

ng in interpre

ted, and thudisregarded.

ind that the reeze‐thaw cncies in Cq a

mples, or samd above, the n unusually 

risk that hemRNA contam hsa‐miR‐23d samples andh regards to 

0a ΔCq is gen

 

 deviating nowith later Cq’

eting deviatio

s inhibited sa 

spike‐in is a cycles or preare due to spmple inhibitiooutlier deteclarge amoun

molysis has omination. A sia‐3p and hsad to evaluatesampling pro

nerated: 

ot only in thes (resulting f

ons in spike‐i

amples cann

small RNA, aesence of RNpike‐in degraon resulting iction describnt of outliers

occurred whilimple way ofa‐miR‐451a. e different saotocols and p

, then

e spike‐in, bfrom lower 

in and refere

not be rescue

and thus susases. It is thedation in whin several assbed below ms, all from the

le handling tf testing for We recommample sourceprocedures. 

n 

 

ut with 

ence 

ed by 

sceptible erefore hich case says 

may assist e 

the blood 

mend that es or 

. 

Dat

27

a analysis g

   

Any sam

SamplesΔCq of gconsiderconsider

Outlier

Sometimmissing detect a

 

 

 

In the prIn the clUsually tthe free

the outl

software

Inhibitedbiologica

Outlier vreasonadescribe

Negativ

A few asoff. For tvalues. Gor more 

The negadded), RNA notone enti

NOTE: Tis not poplease ghelp.

guide versio

 

mples missing

s with a ΔCq greater than red. Note thared carefully

r detection

mes a single wvalue. This isand deselect 

re‐processinassification cthe default Cdom to chan

iers highligh

e automatica

d samples shal group. Suc

values shouldble values foed below. 

ve control

ssays may hathese assaysGenEx is ablenegative co

ative controlnoRT controt containing ire panel wit

The preferreossible, threego to www.e

on 3

g data for on

of less than 7 have an inat some miRy. 

well has techs the reason a value that

g menu, chocolumn pull‐Confidence lenge these if y

ted for manu

ally delete al

hould light upch samples s

d now be remor later calcu

ave a tendens it will be use to set such ntrol(s), and

ls used for thol (no RT enzymicroRNA). Ih the negati

ed experimene cDNA syntxiqon.com/m

e of these ge

7 are fine, wndication of hRs may not be

hnical problewhy we recois an outlier

oose ‐down, choosevel (0.95) ayou so desire

ual inspectio

l outliers. 

p as having mhould now b

moved and nulations. This

ncy to form peful to set anan individua

d uploaded an

his purpose myme added inIf your studyve control. 

ntal design isthesis replica

mirna-pcr-ana

enes will be 

without seriohemolysis, ae affected by

ems and prodommend runr. GenEx uses

se your replind cutoff SDe. You can no

on and deleti

.  

many assays be removed f

not affect ths should be d

primer‐dimern individual cal cut‐off in and annotate

may be eithen the RT reacy consist of re

s to include aates followedalysis. You m

ignored. 

ous indicationnd exclusiony hemolysis, 

duces an errnning replicas the Grubb’

icate classifieD (0.25) will bow either ch

ion, or tick 

with outlierfrom further

e averages, bdone using th

rs at a lower cut‐off baseda simple operd these toge

er no templatction), or moeady‐to‐use p

at least threed by individuamay also con

ns of hemoly from the stuso exclusion

oneous Cq vates. Replicats test for thi

 thener (either tecbe applicableoose the pru

values (in rer analysis. 

but should bhe Missing da

Cq than the d on the negaration if you ether with the

te control (noock RT (RT repanels, you s

biological real PCR. For ntact Exiqon

ysis. Samplesudy could ben or not shou

value or eventes allow youis detection. 

 chnical or bioe, but you doudent way an

 and have 

ed) compare

be filled in wiata handling

chosen overative controlhave perfore rest of the 

o RNA templeaction on cashould run a

eplicates or, more informTechnical S

 

s with a e uld be 

n a u to   

. ological). o have nd have 

the 

ed to the 

ith g 

rall cut‐l Cq med one data. 

late arrier t least 

where this mation

upport for

Dat

28

a analysis g

   

If the sa(a classiidentified

box choo

To set th

desribinIn the exthe affecctrl indeis 1. 

If you tic

Click 

Cut oYou mayconsider

In the pr37), and

guide versio

 

mples used ification colud after loadin

ose

 identifyi

he cut-off for

g your negatxample belowcted assay mex indicates t

ck

. 

off y wish to defred backgrou

re‐processind for now rep

on 3

as negative mn where neng to the plat

ing the nega

r affected ass

tive control sw, the indiviminus 5 Cq. Vthe value of t

fine a cut off und.  

g menu, choplace with a b

have not beeegative contrte editor. Sim

tive samples

says, from th

, thensamples in thdual cut‐off Values too clothe classifier

, a new

f value indica

oose blank (just le

en defined brol samples a

mply select th

 and 

s will appear

he pre-proces

n he pull‐downwill be set aose to the inr specifying n

 

w table will g

ating that da

. In the deave that cel

y adding claare identifiedhe sample(s)

.

ssing menu c

. In thn menu, ands the averagdividual cut‐negative con

give you an o

ta with a Cq

dialog box, inl empty). 

 

ssifiers durind by 1, they c), right-click,

. A classif

choose

he dialog boxthe desired e of the neg‐off will be dtrol samples

overview of a

higher than 

ndicate your 

ng the wizardcan easily beand from the

fication colu

x, select the c delta‐Cq forative controdeleted. The s – the defau

affected assa

n this value sh

chosen cut‐

 

d import e e dialog

umn 

classifier r cut‐off. ls for Negative ult value 

ays. 

hould be 

off (e.g. 

Dat

29

a analysis g

   

Tick will be a

using th

FrequBefore m

choose of missin

This canlow call 

Call rIt is oftedetected

The plot

choose below w

valid val

guide versio

 

automatically

e validate sh

uency ofmoving on, it

ng data for e

 be helpful irate). 

rate ploten nice to getd assays,  

t can be gene

which the exp

lues, then pr

on 3

y removed. P

heet option. 

f missint can be nice

each gene (in

n choosing p

t t an overview

erated quite 

pression is co

ress 

Partially emp

Click 

g data  to get an ov

. A nn %). 

parameters la

w of the call‐

simply by pl

onsidered va

. 

 to rempty rows and

. 

verview of m

new row will

ater, when v

‐rate for eac

lotting this in

 then alid, whether

move all emp columns ca

missing data. 

 be added to

validating the

h assay. If  y

nformation. 

r you want o

ty rows and n be remove

In the pre‐pr

o the grid, giv

 

e sheet (rem

ou wish this 

In the pre‐pr

. Speonly assays w

undetected ed at a later s

rocessing me

ving the freq

moving assays

to include u

rocessing me

cify the cut‐owith less than

 

miRs step, 

enu, 

quency 

s with 

un‐

enu, 

off n a given % 

Dat

30

a analysis g

   

The resuthe cut‐oshown in

Note, if setting t

MissiNon-nu

Your reaUndetercoded rethese wthat reptreat all 

In the pr

Check

This will

guide versio

 

ulting plot shoff (valid) arn yellow, and

you want ththe cut‐off an

ng dataumerical va

al‐time cyclermined) in wed. The subsith empty celicate) or duas follows 

re‐processin

 remove NA

on 3

hows call ratee depicted ind the percen

e call‐rate plnd negative 

– part 1alues

r software mwells with no equent pre‐ells.  The mise to lack of e

g menu choo

N values. 

es for each gn green, the ntage of sam

lot to includecontrol. 

1

may have leftsignal. Theseprocessing ssing signal caexpression. F

ose 

gene. The pepercentage ples with mi

e un‐detecte

t cells emptye usually appteps may noan either be Fall‐outs will

. 

 

rcentage of of samples wissing values 

ed genes, it s

y or given valpear as “NANot allow NANdue to a tec be dealt wit

, leav

samples withwith Cq largeis shown in 

should be pe

ues of 0 or aN” in GenEx a values, so ychnical “fall‐oth as outliers

ve the cell em

h Cq values ber than cut‐ored.  

erformed bef

a text (e.g. and will be cyou need to rout” (no detes, so for now

mpty, and 

 

below off are 

fore 

color replace ection in w just 

.  

Dat

31

a analysis g

   

Assays

In orderdetected

In the prsamples

assays d

importa

Note: leseliminat

Values

If you habased o

type of rthis shoubiologicainfluenc

NormAs descrhandlingmean ofwhere aare regu

From th

 If you wSome geduring t

guide versio

 

s with low c

r to make datd in a certain

re‐processins that should

detected in o

nt. After the

ss than x% vte samples w

missing d

ave performen the replica

replicas you uld be your fal groups. Thcing normaliz

malizatioribed in the ig of these saf all expresse large numbulated. It req

e pre‐proces

wish to normenes may be he missing d

on 3

call-rate

ta analysis an proportion

g menu, cho have missin

one group bu

e message sp

alid data mewith more tha

ue to techn

ed technical ates. In the M

want to use first choice. his should bezation. 

n to globntroductionmples prior ed genes shoer of assays uires that th

ssing menu, 

alize to globexpressed o

data handling

nd interpret of samples.

oose ng values in o

andut not anothe

pecifying whi

eans that moan 40% missi

nical issue

replicates, tMissing Data 

for calculatiIf there are se performed 

bal meaof this guideto cDNA synould be the p(>100) are a

he majority o

choose 

al mean, simonly in a subsg, while gene

ation easier, 

. In thorder to rend

d  . er are not re

ich assays we

ore than 100ing data, you

es – technic

then missingdialog box, s

ing the fill‐instill missing vafter norma

an e, variability nthesis is minpreferred meanalyzed withof tested gen

mply tick set of samplees expressed

, you can now

he dialog boxder the assay

Be careful tomoved – suc

ere removed

‐x% data is inu should indi

cal replicat

data due toselect 

 and choos value. If RT values, the nalization, in o

arising fromnimized throethod of normhout presumes have little

es and filled d close to the

w remove al

x, specify they undetected

o set the % ech assays ma

d, 

nvalid. I.e. if icate less tha

tes

technical iss

e the classifireplicates haext choice shorder to avoi

m differences ugh normalizmalization inmptions on we or no regul

. 

in with above limit of dete

l assays not 

e percentaged. 

empty such tay indeed be 

 the windo

f you want toan 60% valid 

sues can be f

ier identifyinave been pehould be thed the filled‐i

s in RNA samzation. The gn screening swhich or how lation. 

ve‐cutoff valection (i.e. c

 

e of 

that 

ow. 

o data. 

filled in 

ng the rformed, e n values 

ples and global tudies, many 

. ues cut‐off) 

Dat

32

a analysis g

   

are knowdesirabl

for the gyour cho

Before gmainly bHoweve

should cclassifie

Click 

NormIf the stuthen gloof stablyexpresse

Pre-val

If a screeprior to for use iscreeninrecogniz

If this mfurther vsame sa

To identreferenc

choose 

guide versio

 

wn to have ge to include 

global mean,oice. 

getting to nobecause somer, if you hav

click r defining yo

. 

malizatioudy is on a liobal mean noy expressed ged microRNA

lidated refe

ening study a validation n the validatng study selezed as the m

ethod of selvalidate themmple type. 

tify the referce genes, (m

, the

on 3

greater technsuch values 

, tick 

ormalization,me downstreae chosen not

our groups of

n to refemited set oformalization genes. In micA, but in man

erence gen

using the Exexperiment,tion study mect the microicroRNAs ha

ection is usem since selec

rence genes iulti‐gene sel

en 

nical variatioin a global m

you should am statisticat to fill in all 

f interest. 

erence gf microRNAsis not an opcroRNA analny cases sma

nes

iqon miRCUR, using the sa

may be basedoRNAs most rving least va

ed, then 2‐3 rction was ba

in your plateection is pos

.  

on than genemean norma

already havel tests requimissing valu

gene(s)chosen on ttion. In this ysis, the preall non-codin

RY LNA™ micame sample  upon the scresembling tariation after

reference gesed on globa

e, simply selessible using s

s expressed lization. In o

, f

e consideredre that missiues (which in

he expectaticase, normaeferred refereng RNA can

croRNA PCR types, then creening resuthe behaviorr global mea

enes can be cal mean beh

ect the columshift or ctrl). 

at lower Cq rder to avoid

fill in the nor

d handling ofng data has  some cases

on that theylization shouence gene tyalso be used

panels has bthe choice oults. In this caof the globan normalizat

chosen, and avior during 

mns containinRight‐click a

values. It is d using such 

rmalization c

f missing datbeen handles may be vali

 and choose

y should be ruld be to a smype would bed.

been performof reference gase, from thal mean. Thetion.  

it is not necescreening of

ng candidateand from the

 

not genes 

cut‐off of 

a – this ed. d), you 

e the 

regulated, mall set e stably 

med genes e ese are 

essary to f the 

e e menu, 

Dat

33

a analysis g

   

Once refeditor ta

Now you

In the pr

activate 

referenc

guide versio

 

ference geneable identify

u are ready t

re‐processin

  , s

. ce genes  

on 3

es have beening candidat

to perform th

g menu, cho

select 

The pane 

n classified, ae reference 

he normaliza

oose 

a classificatiogenes by a 1

ation. 

 and set 

 should no

on row will a1. 

w be filled in

appear at the

. In th

. Now 

n to indicate 

 

e bottom of t

he dialog box

click 

the chosen 

 

the Data 

 

x, 

Dat

34

a analysis g

   

Click 

 

Candid

Candida(e.g. micshowingreferencamong t

NormFingenes, bUsing Noworkflow

In the prtwo sam

guide versio

 

 

date referen

te referencecroarray), frog stable exprce genes (typthe candidat

nder and geNbut they use ormFinder hw. 

re‐processinmple lists: 

on 3

nce genes

e genes can bom previous ession. In eapically 5‐6) aes.  

Norm both lodifferent algas the advan

g menu, cho

be chosen bastudies whic

ach of these cnd use Norm

ook at gene egorithms to dntage of ease

oose 

ased on resuch are similacases, it is nemFinder and/

expression vdo so and mae‐of‐use, sinc

 

lts from a dir but not ideecessary to p/or geNorm t

variance to chay come up wce it is integr

. Yo

fferent expeentical, or fropick and testto pick the b

hoose the mwith slightly rated in the p

ou will now s

erimental plaom literaturet several canbest referenc

most stably exdifferent respre‐processi

see a window

 

atform e didate ce gene(s) 

xpressed sults. ing 

w with 

Dat

35

a analysis g

   

Here yocontrols

Click one witha third w

guide versio

 

u can chooses not used in 

. Nh the chancewith genes no

on 3

e if certain sadata QC, the

Now will see e to manuallyot considere

amples shouey will autom

3 assay listsy unselect geed for validat

uld not be usmatically app

: one with alenes you dontion due to m

ed in the nopear in the U

ll available gen’t want to cmissing data.

rmalization. nselected sa

enes not havonsider as re 

If you have amples. 

ving missing eference gen

 

 

negative 

data, nes, and 

Dat

36

a analysis g

   

You alsounsuitaboff will aconsider

Click 

Now you

guide versio

 

o have the opble as refereappear in theration as refe

 

u will see tw

on 3

ption of remnce genes. Se cut‐off list.erence gene

o graphs app

oving genes Simply set a c Note: this ws. 

pearing: 

with Cq valucut‐off (e.g. 3will not remo

ues above a c34), and clickove any gene

 

certain level,k apply. Genes from your 

, making thees falling fordataset, onl

 

 

em r the cut‐y from 

Dat

37

a analysis g

   

The lowreferencgenes githe examchoose t

Note thacolours 

Once yo

guide versio

 

er graph shoce genes in riving the smamples aboveto use fewer

at the pre‐sechange in th

ou are happy

on 3

ows the geneed. In the upallest accum, there is no r. Simply plac

elected numbe lower grap

 with your se

es selected apper graph, Nulated standlarge differece the cursor

ber of refereph, depicting

election, clic

s reference gNormFinderdard deviatioence in Acc. Sr over the re

ence genes ing the new se

k 

genes in bluehas suggesteon (Acc. SD) –SD between ed line, and s

n the upper flection. 

 

e, and the geed the numb– but fewer musing 2 and lide it  to the

 

figure remain

and then 

enes not seleber of referemay do the t6 genes, so e left: 

ns red, while

.  

 

ected as nce trick. In you may 

e the 

Dat

38

a analysis g

   

You will genes to

If you ar

 

 

 

MissiValues

Biologicasame wagroups i

NOTE: Indelta to th

guide versio

 

now see twoo be normali

re happy wit

ng data missing d

al groups canay as mentios through in

n the “delta he normaliz

on 3

o gene lists: zed: 

h the selecti

– part 2ue to techn

n be used fooned above fterpolation. 

delta Cq” czation factor

one with the

on, click 

2 nical issue

r filling missfor RT replicaWhen using

alculation, tr.

e selected re

. 

es – biologi

ing data by uates. An alteg interpolatio

the normaliz

eference gen

ical replica

using the mernative methon, expressio

zation step

es, one with

ates

ean of biologhod for usingon of other ge

is the first d

h the remain

gical groups ig the biologicenes in a sam

delta Cq – n

 

ing 

 

n the cal mple is 

namely

Dat

39

a analysis g

   

taken in

box, sele

If a subs(see secmethod 

microRIn case adetectedfrom mi

In the M

 ‐ if you wwith the

 

AveraAs recomwith theinteresteaccepted

In the pr

In the N

You will now con

guide versio

 

to account w

ect 

set of candidtion on normfor filling in 

RNAs deteca given miR id groups to tssing data), 

Missing Data d

want higher e default 1 be

age RT mmended eae option of oed in compad technical r

re‐processin

ormalize by 

notice that tntain the ave

on 3

when calcula

ate referencmalization), imissing data

cted only ins detected inthe value of more than +

dialog box,, e

significance efore applyin

replicatearlier, the reamitting potering just onereplicates. 

g menu, sele

column pull‐

the replicateerage of the 

ating the valu

ce genes has nterpolationa. In this case

n a subset n some grouthe column 1. This can b

either tick 

from missingng: 

es ason for inclential outlierse value for ea

ect

‐down select

e rows have dreplicates, af

ue to fill in. F

been createn without cone, choose 

of samplesps but not inmaximum + be done by u

g data, choo

uding replicas due to techach sample. 

t your replica

disappearedfter removal

For this meth

ed for analysnsideration o

 

s n others, we 1, or (if you sing the mis

. If you arose the altern

 

ate RT reactihnical issuesThis value is

. 

ate classifier

d, leaving onel of the outlie

hod, in the M

. 

is with Normof groups can

recommendwant more ssing data fun

e happy withnative from t

ons is to get. But, in the obtained by

r and 

e row for eacers. 

Missing Data 

mFinder or gen be used as

d setting the statistical emnction. 

h +1, click the pulldown

t more robusend, we are y averaging t

. 

ch sample. T

 

dialog 

eNorm s a 

non‐mphasis 

 n menud 

st data 

the 

These 

Dat

40

a analysis g

   

 

ConvThe numstill be oquantitie

Step 1:

In the pr

You now

What yomake sescatter p

 

 

 

 

Step 2:Many sttrue assscale noto view 

NOTE:

N =2(C

where C

guide versio

 

verting tombers in the on the logarites on the lin

: Relative q

re‐processin

w have sever

ou want yourense to do replots). 

: Log convetatistical testumption whormal distribuin the log sca

The data ha

Cqrel-Cq)

Cqrel is the C

on 3

o relativedata table bthmic scale oear scale.  

quantities

g menu sele

al options fo

r data relativelative to a co

ersion ts, such as T‐en working wution is oftenale. 

ave now been

Cq value you

e quantiy now will noof Cq values.

ct 

or how you w

ve to dependontrol group

test and ANOwith expressn obtained. F

n converted t

u are relating

ities ot resemble . It is therefo

want values t

ds on the stup – or in som

OVA, assumesion data at tFurthermore

to linear sca

g to (i.e. norm

the original ore helpful to

. 

to be related

dy design ane cases relat

e normal disthe linear scae, some grap

le according

mal, untreated

Cq values. Ho convert the

d: 

nd the outputive to nothin

tribution. Thale, but by cohical represe

to the follow

d, or average

However, theese values to

ut wished forng (this gives

his is not alwonverting toentations are

wing formula:

e).

 

ey will o relative 

r. It may s nicer 

ways a  log e easier 

Dat

41

a analysis g

   

In the pr

are avai

Click 

and 

Your datprovided

 

guide versio

 

re‐processin

lable by choo

, and

. 

ta has now bd by GenEx. 

on 3

g menu you 

osing 

d in the dialo

been pre‐pro 

choose 

og box click y

ocessed and i

. Of yo

yes for saving

is ready for a

u prefer a di

. 

g your data. 

analysis by th

fferent log b

Choose a pa

he multiple s

base, more o

ath and file‐n

statistical fea

 

ptions 

name, 

atures 

Dat

42

a analysis g

   

FurAfter preor get ba

(saved aproject iperform

 At any ti

export p

projet toIf at som

by clickithe Cont

guide versio

 

rther de‐processingack to this la

at the end of in the data m

med 

ime during d

project funct

o the controme point you

ng  . An trol panel. 

on 3

data ag is completeater. If you co

pre‐processmanager, con

data analysis

ion  . Yo

l panels  have too m

already perf

analysed, you can eontinue at a 

sing) using thntaining your

, you can sav

ou can then g

. any window

formed test c

sis useither continlater time, y

he load file fur pre‐proces

ve your proje

get back to t

s open, you 

can be re‐pe

sing Gue directly wyou should im

unction sed data set

ect with all a

the project a

can close ev

erformed by 

GenExwith analysis mport the pr

. You shouland log of p

 

nalyses perf

t a later time

erything but

cliciking it in

x  of the loadere‐processed

ld now have pre‐processin

formed using

e by importi

t the Control

n the 

 

ed data,  data set 

a ng steps 

g the 

ng the 

l panel 

 tab of 

Dat

43

a analysis g

   

UsingBefore gfinal datthese grData maor group

Once yo

Data ma Under ththe file,  

In the replicateSelect th

names (name to

click When a appear i

guide versio

 

g the Dagenerating grta processingroups now beanager also aps of sample

ou have loade

anager has th

he Data selebut if you w

 tabes).  If you hahe tab Autom

Group‐1, ‐2 o edit, then w

. Congroup is selein the Group

 

on 3

ata manaraphs or perg. If your datefore you caallows you tos. 

ed your fully

hree tabs: 

ction tab youant to perfo

, you define ave assignedmatic and in 

etc) but can write the new

ntinue this prected, it is eap members p

ager forming stata contains gn perform ao customize y

y pre‐process

u can select rm analysis o

which sampd group classthe pull‐dow

 thebe easily re‐w name in th

rocedure forasy to inspecane: 

tistical analysroups with bny of the mayour graphs 

sed data, clic

which data yon a subset o

ples belong tosifiers, you cawn menu cho

en click ‐named to dhe Group nam

r each groupct which sam

sis, you shoubiological repany statisticaas you can a

ck on   t

.

you want to of your data 

o the same gan use the auoose the clas

. The groupescribe theirme text box 

. mples have be

uld open the plicates, you al analyses poassign differe

o open the D

analyze (typthis too is po

group (typicautomatic mosifier specify

s have been r content. Sim

een assigned

“Data mananeed to assiossible in Geent colors to

Data manage

pically all the ossible). 

ally your biolode: ying your gro

given genermply click th

d to the grou

 

ager” for ign enEx. o samples, 

er. The 

data in 

ogical 

oups 

ric e group 

 and 

up; these 

Dat

44

a analysis g

   

 

In the symbol f

Tick to the gr 

When yo 

StatisGenEx odesigns)perform 

T‐teand A th

The significachange bsignificaignoringthe P vaadvance

guide versio

 

for each sam

roup. 

ou are finish

stical anoffers a wide ). In the Statiming either a 

est comparehe group wit

nce). It will abetween gront even withg Bonferroni lue will be ined multiple te

on 3

 tab, youmple or group

ed remembe

nalysis inrange of staistics tab youT‐test (in cas

s two groupsh changes.  

 will galso specify woups, and theh Bonferroni correction, tn red. Below esting. 

u can choosep for graphs 

, s

er to click

n GenExatistical analyu can choosese of only tw

s of data, wh

give a list of twhether a noe difference correction, tthe P value isis shown an

e the color ofsuch as PCA

select each g

. 

x yses (some oe from differwo groups) o

here the grou

the tested asormality testbetween thethe P value is yellow. If th example in 

f each sampl plots. 

group in turn

of which requent analysesr an ANOVA 

up selected a

ssays, sortedt was performe two groupss green. If sihe differencethe P‐Value 

e or group fo

n and assign 

uire specific s. We recomm(if multiple g

as B is consid

  by P value (med and pass on a log scagnificance ise is not statiscompact vie

or bar charts

colour and/o

experimentamend as a mgroups are te

dered the co

(statistical ssed, the lineale. If the P‐vs obtained bystically signifew, without 

 

s and the 

or symol 

al minimum ested): 

ntrol, 

ear fold‐value is y ficant, 

Dat

45

a analysis g

   

 

 In additiplot by t 

A odifferenIn a onestatistica

guide versio

 

ion, you can ticking these

ne‐way ANOt treatments‐way ANOVAal test values

on 3

choose advae options in t

OVA tests fors).  A a P‐value fos will be give

anced multiphe t‐test dia

r differences 

or significancen for each g

ple testings, log box befo

between gro

ce of differegene.  

or a graphicaore pressing 

oups conside

nce between

al representarun. 

ering one pa

n groups as w

ation in a vo

rameter (e.g

well as vario

 

 

 

lcano 

g. 

us 

Dat

46

a analysis g

   

In additit‐test.   

 In aA table sThe resuthe two 

 

CreatWhen wbecomebe usefuassays). 

A subsetplot. 

Subset

If a t‐tesand/or d

guide versio

 

ion, a list of P

a  two‐way Ashowing the ult of a two‐w(i.e. whethe

ting a suworking with  difficult to iul to create a

t of assays re

t from t-tes

st or one‐waydifference) w

on 3

P values of d

ANOVA, testiresult for eaway ANOVA er the two fa

ubset offull panels, tnterpret duea subset of a

egulated bet

st or one-w

y ANOVA hawhile holding

difference be

ing for two dach tested mindicates thectors influen

f regulatthe figures cre to the veryssays includi

tween two gr

ay ANOVA

s been perfog down shift 

etween grou

different paramicroRNA wile significancnce each oth

ed assareated by e.gy large numbing only thos

roups can be

A

ormed, selecor ctrl. 

ps will be cre

ameters (e.gl result. e of each facer). 

ays g. Descriptivber of assays se assays of i

e created eit

t the assays 

eated, simila

g. genotype a

ctor, as well 

e Statistics oinvolved. In interest (e.g.

her from a t‐

of interest (b

ar to the resu

and time) is p

as the intera

or Heat‐map such a case,. only regula

‐test or a Sca

based on P v

 

 ult for a 

possible. 

action of 

 

may , it can ted 

atter 

value 

Dat

47

a analysis g

   

Then clic

In the t‐running 

In the vopane. Thclick‐andoption osubset, c

guide versio

 

ck  , 

test, you canthe test. 

olcano plot whe list is based‐drag. By deof selecting fclick Create g

on 3

n also create

window, tick ed on the folefault, genesurther genesgroup of Gen

 and 

e your subset

,d‐change slis with statists by ticking tnes. Name yo

. N

t from the vo

, and a list oders (the vetical significathem. Once your subset.

Name your su

olcano plot if

f regulated grtical lines), nce changesyou have sele

ubset. 

f that option

genes is showwhich can bes are pre‐seleected the ge

n was ticked w

wn in  the rige moved simected, with tenes you wis

 

 

when 

ght‐hand mply by the h in the 

Dat

48

a analysis g

   

Subset

A scatteof sampcorrespo

Check 

Click  

guide versio

 

t from Scat

r plot can beles, and the onds to a 2‐f

 

on 3

tter plot

e made in thetwo groups fold regulatio

e Correlationto plot. Checon if the data

and 

n tab, by clicck Show signa is log2 tran

king  . Innificance areansformed), a

 

n the dialog ba, Distance fnd List genes

 

 

box, choose from center (s outside are

 

Groups (1 ea. 

Dat

49

a analysis g

   

Note thaprocessivalues w

In the tasame wa

Activat

In the m

tab click

selectionone sub

selection

activate

 

Note thathese ge

guide versio

 

at if you haveing, then by twill lie on a st

able grid, seleay as for the

ting only th

main window 

k 

n box chooseset can be ac

n. Activated 

d genes are 

at you have enes can alw

on 3

e chosen onethe very natutraight line. T

ect the gene t‐test. Name

he subset g

click   t

 then 

e the group yctivated in th

genes can b

recognized b

now de‐activways be activa

e group relature all valuesThis is not an

es you wish te the subset

genes

o open the d

you have crehe same rou

e recognized

by having a 

vated all genated again at

tive to the ots in the groun error, just a

o include in t. 

data manage

. All assays

eated, click nd, by select

d by having a

 next to th

nes currentlyt a later time

ther when youp relative toa result of va

the subset a

er. In the Dat

s will now be

 ating the next

a   next to 

hem. Press 

y not of intere. 

ou set relativ have been salid data man

nd create th

ta selection t

e de‐activate

and t group and a

them in the 

 and 

est. Nothing

ve values durset to 0 – andnipulation. 

he subset in t

tab, Columns

ed. Now, in t

. Moactivating th

 list, while d

. 

g has been de

 

ring pre‐d thus all 

the 

s sub‐

he 

re than at 

e‐

eleted – 

Dat

50

a analysis g

   

Furthermnumber microRN 

  bars as Saccordin

  

Prinbeen ass

guide versio

 

more, severaof genes ha

NAs of intere

Descriptive SStandard devng to prefere

ncipal composigned by gro

on 3

al very nice gve been testest before cre

Statistics givviation (STDEence. 

onent analysouping, it be

graphical repted (e.g. full eating the va

es a graphicaEV), Standard

sis shows howecomes easy 

presentationsmiRNome), arious graph

al representd error of th

w the samplto see whet

s of the datait is recommical presenta

ation of expe mean (SEM

es group togther the sam

 set can be sended to creation. 

ression diffeM) or Confide

gether. If coloples group a

selected. If aeate a subse

erences, withence Interva

 

ors have preas expected. 

 

 large t of 

h error als (CI) 

eviously 

Dat

51

a analysis g

   

 

Hea

 

guide versio

 

at‐map show

on 3

ws clustering,, depicting grouping of mmicroRNAs an

 

nd samples 

 

Dat

52

a analysis g

   

To find ofunction Many ottests, Coexplanat

 

guide versio

 

out more abn. 

ther types ofohonen self‐otions for the

on 3

out these an

f plots and aorganizing mese types of a

nd other stat

nalysis possimaps, and neanalyses 

tistical analys

ibilities are asted ANOVA

sis options, p

available, sucA. The GenEx

please see th

ch as non‐pa help functio

he GenEx He

rametric staon contains d

 

lp 

tistical detailed 

Dat

53

a analysis g

   

GeneGenEx cnumber also direfunction

Once thThen selthe pull‐

GenEx w

 

 

 

guide versio

 

e info an easily retof relevant ectly retrievenal analysis. 

e project haslect your ass‐down menu

will now start

on 3

rieve microRdatabases sue information

s been loadesay of interesu and click se

t your intern

RNA informauch as miRBan on availabl

ed to the const in the dialoearch.  

 et browser, 

tion on the aase, miRecorle probes fro

ntrol panel, cog box appe

and find the

assays used rds and miRTom Exiqon’s w

click   inaring, choos

e selected mi

in and experTarget (amonwebshop, to

 the software the databa

icroRNA in th

riment from ng others). Yo ease the wa

re toolbar mase of intere

he chosen da

 

a You can ay into 

enu. st from 

atabase. 

Dat

54

a analysis g

   

Qui• • • •

• • • • • •

• • • • •

guide versio

 

ck steImport dRemembInterplatQuality c

o Into Exp

o Sero Ouo Ne

Cut off FrequenCall rateMissing ValidateFill in mi

o Teco Groo Spe

NormalizAverage Convert Load Define g

on 3

eps fodata usinber classte calibracontrol ternal ampresssion

candi spike‐

rum/plasutlier detegative co

cy of mis plot data – no sheet: Assing datchnical roups ecified Czation to RT replicto relativ

groups fro

or expg wizardifiers – mation 

mplification profilesdate refe‐ins sma: Hemection ontrol 

ssing dat

on‐numeAssays wita basedeplicates

q for nono global mcates ve quant

om class

periend minimum

on contrs  erence g

molysis t

ta 

erical valith low c on s 

n‐detectmean or 

tities + Lo

ifiers 

nced u

m #Group

ol outlie

enes 

est 

ues all‐rate

ed groupref gene

og2 

users

rs 

ps (Cut‐os 

s

off +1) 

 

Dat

55

a analysis g

   

OnlFor tech

http://w

 

Join the and Gen

http://w

 

Ref

1.

2.

3.

guide versio

 

ine hehnical suppor

www.exiqon.

GenEx onlinnEx, please g

www.multid.s

ferenc

A novel and uMestdagh P, VGenome Biol

NormalizatioidentificationPeltier HJ, Lat

Identificationanalysis in huDavoren PA, 

on 3

elp rt please go t

com/contac

ne forum wheo to: 

se/forum.ph

ces

universal metVan Vlierberg. 2009;10(6): 

on of microRNn of suitable rtham GJ.RNA.

n of suitable euman breast cMcNeill RE, Lo

to:  

t 

ere you can 

hp 

thod for microghe P, De WeeR64

NA expressionreference RNA. 2008 14(5): 8

endogenous ccancer. owery AJ, Keri

ask other us

oRNA RT‐qPCer A, Muth D, 

 levels in quaA targets in no844‐852

control genes 

in MJ, Miller N

sers and expe

CR data normaWestermann 

antitative RT‐Pormal and can

for microRNA

N. BMC Mol B

erts about qP

alization. F, Speleman F

PCR assays: ncerous huma

A gene expres

Biol. 2008 9: 7

PCR data ana

F, Vandesomp

an solid tissu

ssion  

76.

 

alysis 

pele J. 

es.