Upload
others
View
30
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
TC ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ-EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI
DENEYSEL SİYATİK SİNİR YARALANMASINDA
BETAMETAZON VE SİNİR BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN SİNİR
REJENERASYONUNA ULTRASTRÜKTÜREL ETKİLERİ
LEMAN SENCAR
YÜKSEK LİSANS TEZİ
DANIŞMANI
Prof. Dr. Sait POLAT
ADANA-2007
TC ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ-EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI
DENEYSEL SİYATİK SİNİR YARALANMASINDA
BETAMETAZON VE SİNİR BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN SİNİR
REJENERASYONUNA ULTRASTRÜKTÜREL ETKİLERİ
LEMAN SENCAR
YÜKSEK LİSANS TEZİ
DANIŞMANI
Prof. Dr. Sait POLAT
Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TF2005YL11 nolu proje olarak desteklenmiştir.
Tez No:….
ADANA-2007
iii
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim sırasında beni her konuda destekleyen, tez konumun
seçilmesi, yürütülmesi ve tamamlanmasında yardımlarını esirgemeyen, danışman
hocam Sayın Prof. Dr. Sait Polat’a sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca, tez
çalışmalarım sırasında yardımlarını esirgemeyen, Biyokimya Anabilim Dalı Öğretim
Üyelerinden Sayın Doç. Dr. Abdullah Tuli’ye, Diş Hekimliği Fakültesi Öğretim
Üyelerinden Sayın Yrd. Doç. Dr. Mehmet Kürkçü’ye, Biyofizik Anabilim Dalı
Öğr.Gör.Dr. Mustafa Güven ve Arş.Gör.İbrahim Kahraman’a ve Biyoistatistik
Anabilim Dalı Öğr.Gör.Dr. Yaşar Sertdemir’e sonsuz teşekkürlerimi ve saygılarımı
sunarım. Eğitimim sırasında, bana her zaman destek olan ve yardımlarını esirgemeyen
Anabilim Dalımızın bütün Öğretim Üyelerine şükranlarımı sunarım. Ayrıca tezimin
hazırlanmasında emeği geçen Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı’nın bütün akademik
ve idari personeline de teşekkür ederim.
Yaşamım boyunca her zaman yanımda olan, beni yüreklendiren, her koşulda
destekleyen anneme ve babama, hayatımdaki en değerli varlık olan kardeşim İlhan’a
çok teşekkür ederim.
Arş.Gör.Leman SENCAR
iv
İÇİNDEKİLER
KABUL VE ONAY TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vi SİMGELER VE KISALTMALAR viii ÖZET ix ABSTRACT xi 1.GİRİŞ 1 2.GENEL BİLGİLER 3 2.1. Periferik Sinir Histolojisi 3 2.2. Periferik Sinir Yaralanmaları 4 2.3. Sinir Yaralanmalarının Sınıflandırılması 5 2.4. Yaralanma Sonucu Sinirde Meydana Gelen Değişiklikler 6 2.4.1. Yaralanmayla Beraber Sinir Distalinde Meydana Gelen Değişiklikler 7 2.4.2. Sinir Proksimali ve Hücre Gövdesinde Meydana Gelen Değişiklikler 8 2.5. Schwann Hücreleri ve Rejenerasyondaki Rolleri 9 2.6. Nörotropik Faktörler 10 2.7. Periferik sinir yaralanmaları ve steroid maddeler 12 3.GEREÇ VE YÖNTEM 14 3.1. Deney hayvanlarının elde edilmesi ve gruplara ayrılması 14 3.2. Operasyon 14 3.3. Tedavinin uygulanması 14 3.4. Biyopsilerin alınması 15 3.5. Elektron Mikroskopi Yöntemleri 15 3.6. Biyokimyasal Analiz Yöntemi 16 3.6.1. Malondialdehit Analizi 17 3.6.2. Süperoksit dismutaz Analizi 17 3.7. Histomorfometrik Yöntemler 17 3.8. Footprint Analizi 17 3.9. İstatistik 18 4.BULGULAR 19 4.1. Histolojik ve elektron mikroskobik bulgular 19 4.1.1. Sağlam grup 19 4.1.2. Deney kontrol grubu 25 4.1.3. NGF grubu 34 4.1.4. Betametazon grubu 42 4.1.5. NGF+Betametazon grubu 48 4.2. Biyokimya Bulguları 55 4.3. Footprint Analizi Bulguları 57 4.4. Histomorfometrik Bulgular 58 5.TARTIŞMA 61
v
6.SONUÇLAR 69 7.KAYNAKLAR 71 8.ÖZGEÇMİŞ 74
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
ŞEKİL 1: Sağlam gruptan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 2: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 3: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 4: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 5: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 6: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 7: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 8: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 9: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL10:Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL11:Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 12: NGF grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 13: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 14: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 15: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 16: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 17: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 18: Betametazon grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 19: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 20: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 21: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.
ŞEKİL 22: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü. ŞEKİL 23: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. ŞEKİL 24: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. ŞEKİL 25: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. ŞEKİL 26: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. ŞEKİL 27: Tüm gruplardan elde edilen malondialdehit seviyeleri.
ŞEKİL 28: Tüm gruplardan elde edilen süperoksit dismutaz aktiviteleri.
vii
ŞEKİL 29: Tüm gruplara ait footprint analiz sonuçları.
ŞEKİL 30: Tüm grupların ortalama miyelinli sinir lifi sayıları.
ŞEKİL 31: Tüm grupların ortalama akson çapları.
ŞEKİL 32: Tüm grupların ortalama miyelin kılıf kalınlıkları.
viii
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
BDNF Beyin kökenli sinir büyüme faktörü CNTF Silyar kökenli sinir büyüme faktörü GDNF Glia kökenli sinir büyüme faktörü kDA Kilodalton LIF Lösemi inhibitör faktör MBP Miyelin temel proteini MDA Malondialdehit Ngr Nöroregülin NGF Sinir büyüme faktörü NT-3 Nörotropin-3 NT-4 Nörotropin-4 NT-5 Nörotropin-5 P0 Protein sıfır PMP Periferal miyelin proteini SOD Süperoksit dismutaz TGF Transforming growth factor TSF 1-5. parmak açıklık oranı μm Mikrometre μg Mikrogram U/g prot Unit/gram protein
ix
ÖZET
Deneysel Siyatik Sinir Yaralanmasında Betametazon ve Sinir
Büyüme Faktörünün Sinir Rejenerasyonuna Ultrastrüktürel Etkileri
Periferik sinir yaralanması dünyada ciddi sağlık sorunlarından birisidir. Yaralanma sonucunda özellikle sinir distalinde önemli yapısal değişiklikler meydana gelmektedir. Periferik sinir rejenerasyonunda çeşitli faktörlerin etkileri geniş olarak araştırılmıştır. Rejenerasyonda, schwann hücrelerinin primer rolleri yanında, eksojen olarak uygulanan nörotropinler, nörokinler ve bazı büyüme faktörlerinin de yararlı etkileri açıklanmıştır. Sinir dejenerasyonunda, sinir büyüme faktörü (NGF) gibi pek çok nörotropik faktörün sentezlenerek retrograd iletimle perikaryona ulaştırıldığı ve nöronda iyileştirici etkiyi başlattıkları kabul edilmektedir. Sunulan çalışmada, deneysel siyatik sinir yaralanmasında, NGF ve betametazon uygulamasının etkilerinin, footprint analizi, ışık ve elektron mikroskopi, histomorfometri ve biyokimyasal yöntemlerle araştırılması amaçlandı.
Elli adet erkek Wistar sıçan random olarak, sağlam grup, deney kontrol grubu, NGF tedavisi uygulanan grup, betametazon tedavisi uygulanan grup, NGF+betametazon uygulanan grup olmak üzere beş gruba ayrıldı. Sağlam grup dışındaki hayvanların sağ siyatik sinirlerinde ezilme tipi yaralanma yapıldı Betametazon, operasyondan hemen sonra, betametazon grubu ve NGF+betametazon tedavisi uygulanan gruptaki hayvanlara subkütan yolla perioperatif bölgeye, 8 saat aralıkla 1 gün süreyle verildi. NGF ve NGF+betametazon tedavisi uygulanan gruba operasyondan hemen sonra NGF-β subkütan yolla perioperatif bölgeye 14 gün boyunca enjekte edildi. Operasyonu takiben 7, 14, 21, 28, ve 35. günlerde footprint analizleri yapıldı. Operasyondan 6 hafta sonra, tüm gruplardan elde edilen sinir doku parçalarında, malondialdehit (MDA) seviyesi ve superoksit dismutaz (SOD) aktivitesi ölçüldü, ışık, elektron mikroskobik ve histomorfometrik değerlendirmeler yapıldı. Sağlam grupta sinir liflerinin normal yapıda oldukları gözlendi. Deney kontrol grubunda, sinir liflerinin çoğunda akson ve miyelin kılıfın dejenere olduğu, miyelin kılıf lamellerinin birbirlerinden ayrıldıkları, aksonun büzüştüğü ve bazı liflerde ise tamamen dejenere olduğu dikkati çekmekteydi. Dejenerasyonun belirgin olduğu alanlarda, dejenere sinir lifleri ve miyelin kılıf yapılarını fagosite etmiş pek çok makrofajın varlığı gözlendi. Bu değişikliklerin, NGF ve betametazon uygulanan gruplarda nisbeten azaldığı, NGF+betametazon kombine tedavi uygulanan grupta ise, sinir liflerinin çoğunda normal yapının korunduğu dikkati çekti. Deney kontrol grubunda MDA seviyesinin arttığı, SOD aktivitesinin belirgin olarak azaldığı bulundu. NGF+betametazon tedavisinin uygulandığı grupta, SOD aktivitesinde yükselme, MDA seviyesinde azalma ile birlikte, anlamlı motor fonksiyonel iyileşme belirlendi. Ayrıca, kombine tedavi uygulanan grupta,
x
miyelinli sinir liflerinin sayısında, akson çapında ve miyelin kılıf kalınlığında belirgin artış kaydedildi.
Sıçanlarda ezilme tipi siyatik sinir yaralanması sonrası NGF, betametazon ve NGF+betametazon tedavisinin uygulandığı bu çalışmada, NGF ve betametozon tedavi gruplarında sinir rejenerasyonunun meydana geldiği, NGF+betametazon kombine tedavisinin uygulandığı grupta, lipid peroksidasyonunun azaldığı, SOD aktivitesinin arttığı, ayrıca sinir rejenerasyonu, miyelin kılıf oluşumu ve anlamlı motor fonksiyonel iyileşmenin gerçekleştiği bulundu. Betametazonun antienflamatuvar ve antiödematöz etkisiyle yaralı bölgede sinir rejenerasyonuna engel olabilecek fibrozis ve ödemi azalttığı, lipid peroksidasyonunu engellediği, NGF’nin de uyarıcı etkisiyle, sinir rejenerasyonunu arttırdığı, böylece her iki maddenin birlikte etkisiyle, kombine grupta gözlenen iyileşmenin sağlandığı düşünüldü. Bu nedenle, NGF+betametazon kombinasyonunun, periferik sinir yaralanmalarının tedavisinde dikkate alınabileceği sonucuna varıldı.
Anahtar Kelimeler: Betametazon, Footprint analizi, Histomorfometri, Sinir büyüme faktörü, Siyatik sinir yaralanması, Ultrastrüktür.
xi
ABSTRACT
Ultrastructural Effects of Betamethasone and Nerve Growth Factor on
Nerve Regeneration After Experimental Nerve Injury
Peripheral nerve injuries are important health problem in the world. Injury
of a peripheral nerve leads to degeneration of distal nerve stump. Several neurotrophic agents have been evaluated for their efficacy in nerve injury. Furthermore, beneficial effects of neurotrophins, neurokines and some growth factors on the peripheral nerve injury were reported. After nerve degeneration, many of neurotrophic factors such as nerve growth factor (NGF), are synthesised in tissues and delivered to the neuronal soma via retrograde transport where they exert a trophic effect. In this study, the effects of NGF and betamethasone on the rat sciatic nerve crush injury were examined by footprint analysis, light and electron microscopic, histomorphometric and biochemical methods.
Fifty male Wistar rats were divided into five groups as intact, control, received NGF treatment, betamethasone treatment and NGF+betamethasone treatment. Nerve crush injury was performed on right sciatic nerve of the animals except the intact group. Immediately after injury, betamethasone was subcutenaously injected perioperative zone to the betamethasone and NGF+betametasone treatment groups three times during the first day. NGF-β was subcutenaously injected perioperative zone to the NGF and NGF+betamethasone groups for 14 days. Footprint analysis was made on 7, 14, 21, 28 and 35 days following the operation. After 6 weeks, sciatic nerve tissue samples were obtained and the levels of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) activity were measured. In addition, light and electron microscopic and histomorphometric evaluations were carried out. The structures of nerve fiber were seen normal in intact group. Most of the nerve fibers were revealed degeneration of the axon and myelin sheaths, separation of myelin lamellae and disintegration of axonal structures in control group. Additionally, numerous macrophages were encountered among the nerve fibers. Although some of these findings were also seen in NGF and betamethasone treatment groups, many of the nerve fibers were exhibited normal structures. Moreover, increase of MDA levels and decrease of SOD activities were found in control group. It was interesting that decrease of MDA levels and increase of SOD activities and significant motor functional recovery were observed in NGF+betamethasone received group. Furthermore, the number of the myelinated nerve fibers, axon diameter and myelin thickness were significantly greater in combined treatment group.
Although the nerve regeneration were seen in NGF and betamethasone groups, the decrease in lipid peroxidation and increase in SOD activities and significant nerve regeneration, myelin sheath formation and motor functional recovery were observed in NGF+betamethasone treatment group. Combination of
xii
nerve regenerative effect of NGF and anti-inflammatory and/or anti-edematous effects of betamethasone could be attributed to that improvement. In conclusion, combined therapy of NGF and betamethasone can improve functional recovery such a combination may be an effective approach for treatment of peripheral nerve injury.
Key words: Betamethasone, Footprint analysis, Histomorphometry, Peripheral nerve injury, Nerve growth factor (NGF), Ultrastructure.
1
1. GİRİŞ
Periferik sinir yaralanmaları, sinirde gerilme, ezilme ve kesilme nedeniyle
meydana gelmektedir.Yaralanmayla beraber sinirin distal ve proksimalinde önemli
histolojik değişiklikler ortaya çıkmaktadır.Yaralanma sonrası, ilk 6 saat içerisinde,
nöronun perikaryonunda çekirdek perifere doğru göç eder ve Nissl cisimciklerinin
yapıları bozularak, bütün nöroplazmaya dağılır. Yaralı bölgenin distalinde, akson ve
miyelin kılıfın fiziksel fragmantasyonu, nörotübül ve nörofilamanların düzensizleşmesi
ve sonuçta aksonal yapının tamamen bozulması ile karakterize olan Wallerian
dejenerasyonu meydana gelmektedir1-5.
Yaralanmadan sonra ilk 48-96 saat içinde akson devamlılığı kaybolur ve buna
bağlı olarak impuls iletimi bozulur. Aksonal dejenerasyonda Schwann hücrelerinin
rolleri bilinmektedir. Schwann hücreleri ve makrofajlar, dejenere miyelin kılıf ve akson
yıkıntılarını fagosite ederek, yaralanma bölgesini bir haftadan bir aya kadar değişebilen
bir süre içerisinde temizler2,6,7,8. Dejenerasyonun geç dönemlerinde, Schwann hücreleri
büyüyen akson filizlerine rehberlik eden Büngner bandlarını oluşturur. Bunların yanı
sıra, sinir yaralanmalarında, yaralı bölgeye komşu proksimal akson segmentinde de
önemli yapısal değişikliklerin oluştuğu rapor edilmiştir2,3,9,10.
Günümüzde, mikrocerrahi uygulamalarının yaygınlaşması, histolojik ve
immünohistokimyasal yöntemlerin gelişmesi, periferik sinir yaralanmalarında, sinir
onarımının başarısını büyük oranda arttırmıştır4. Periferik sinir yaralanmalarının
tedavisinde bugüne kadar, anastomoz, sinir graftları, nonnöral doku graftları, kombine
graftlar6, sinir konduitleri ve sentetik tüpler gibi pek çok yöntem uygulanmış ve bunların
sinir iyileşmesine olan muhtemel etkileri geniş olarak rapor edilmiştir11-13. Sinir
rejenerasyonunun arttırılmasında, başlıca nörotropik faktörler6,14,15,16, steroidler17,18,
hormonlar, çeşitli kimyasal maddeler ve düşük frekanslı manyetik alan uygulamalarının
etkinliği yapılan çalışmalarda rapor edilmiştir19.
Nörotropik faktörler; nörotropinler, nörokinler ve TGF-β üyelerini kapsayan,
nöronların yaşamını devam ettirmesi için ihtiyaç duydukları bir polipeptid ailesidir20. Bu
faktörler arasında en iyi tanımlanan ve nörotropin ailesinin bir üyesi olan NGF’nin,
nöronların yaşamını ve gelişmelerini desteklemesinin yanında, sinir yaralanmalarında
2
Schwann hücrelerinin proliferasyonunu arttırdığı ve aksonal rejenerasyonu hızlandırdığı
kaydedilmiştir4,12,16,20,21. Diğer taraftan, sinir yaralanmalarında, iskemi ve travmanın
etkisiyle oluşan ödem ve enflamatuvar reaksiyonların zararlı etkilerinin azaltılması ve
rejenerasyonun sağlanması amacıyla steroid tedavisinin yararlı olduğu bildirilmiştir17.
Bununla beraber literatürde periferik sinir yaralanmalarında, bir nörotropik faktör
olan NGF ve steroid yapısında bir madde olan betametazonun kombine etkilerinin
araştırıldığı bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada, sıçanlarda oluşturulan deneysel
ezilme tipi siyatik sinir yaralanması modelinde, NGF ve betametazonun ayrı ayrı ve
kombine etkilerinin, ışık, elektron mikroskopik ve biyokimyasal yöntemlerle
araştırılması amaçlandı. Ayrıca motor fonksiyonel iyileşmenin değerlendirilmesi
amacıyla hayvanlarda footprint analizleri22-24 de yapıldı.
3
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Periferik Sinir Histolojisi
Merkezi sinir sistemi ve periferal organlar arasındaki motor ve duyu uyarımını
sağlayan periferik sinirler, dıştan epinöryum olarak bilinen kalın fibröz bir bağ dokusu
ile sarılmışlardır. Epinöryumun altında sinir fasiküllerini çevreleyen ve perinöryum
olarak adlandırılan fibröz bağ dokusu yer almaktadır. Her bir sinir lifi (akson),
endonöryum adında, fibroblast ve kollajen liflerden oluşan daha ince bir bağ dokusu ile
örtülmüştür. Endonöryumda fibroblastların dışında, az sayıda mast hücreleri ve diğer
bağ dokusu hücrelerine de rastlanır. Endonöryumun altında Schwann hücreleri
tarafından oluşturulan nörilemma kılıfı yer alır. Miyelinli sinir liflerinde, Schwann
hücre sitoplazması içerisine gömülü olarak yer alan akson etrafında, konsantrik lamellar
tarzında düzenlenen miyelin kılıf bulunmaktadır. Akson ile Schwann hücresi arasında
periaksonal boşluk adı verilen ve 20 nm kadar genişlikte bir boşluk yer almaktadır.
Aksolemma ile sarılı olan aksonda, az sayıda mitokondriyon, SER tübülleri ile çok
miktarda nörotübül ve nörofilamanlar bulunmaktadır25,26. Schwann hücreleri periferik
sinir sisteminin destekleyici hücreleridir4,25-27. Bu hücreler nöral krestten gelişirler.
Schwann hücrelerinin temel fonksiyonu hem miyelinli hem de miyelinsiz sinir liflerini
desteklemektir. Miyelin kılıf, aksonu endonöryumun ekstrasellüler kompartmanından
ayırmakta ve sinir impulslarının hızlı bir şekilde iletilmesini sağlamaktadır. Akson
tepeciği ile hedef hücrelerle sinapsların kurulduğu akson terminalleri miyelin kılıfa
sahip değildir. Schwann hücreleri miyelinsiz sinir liflerini de sarmaktadır. Bu hücreler
ayrıca, periferik sinir sistemindeki yıkıntıları temizler ve yaralanma veya kesilme
sonrası aksonların yeniden büyümesine rehberlik ederler2,4,7,10,14,27. Miyelin kılıfın
yapısında, protein sıfır (P0), periferal miyelin proteini (PMP) ve miyelin temel protein
(MBP) olarak adlandırılan membran proteinleri bulunmaktadır3,18,25,26. P0, miyelin kılıf
lamellerinin sıkıca bir araya gelmesinden sorumlu esas yapısal miyelin proteinidir. P0
proteini, miyelinizasyon sırasında plazma membranında eksprese olan 30 kDA
ağırlığında bir hücre yapışma molekülüdür. Bu transmembran glikoprotein, karşılıklı iki
membran tabakası arasında güçlü bir adhezyon sağlar ve periferik sinir miyelininin
4
anahtar yapısal komponentidir. Yapısal ve genetik çalışmalar P0 proteinini kodlayan
genlerdeki mutasyonların demiyelinizan hastalıklara yol açabileceğini işaret etmektedir.
Miyelinizasyonda, miyelin kılıfın kalınlığı Schwann hücreleri tarafından değil,
akson çapı tarafından belirlenmektedir. Dolayısıyla, miyelin oluşumu, akson ve
Schwann hücresi arasındaki fonksiyonel ilişki sonucunda gerçekleşmektedir. Miyelin
kılıf kalınlığının düzenlenmesi, nöroregulin (Ngr1) adı verilen bir büyüme faktörüne
bağlıdır. Ngr1, aksonun nörolemması üzerinden salınan bir transmembran proteini olup,
Schwann hücrelerinin uygun kalınlıkta miyelin kılıf oluşturmasında sinyal molekülü
olabileceği düşünülmektedir25. Miyelin kılıf akson boyunca birbiri ardına dizilen birçok
Schwann hücresi tarafından yapıldığı için segmental bir görünümdedir. Komşu
Schwann hücrelerinin karşılaştığı bölgeler, miyelin kılıftan yoksundur. Bu alanlara
Ranvier düğümü (nodu) adı verilir. İki Ranvier nodu arasındaki miyelin kılıfla kaplı
bölgeye de internodal segment denilmektedir. Periferik sinir sisteminde Schwann
hücreleri miyelinsiz sinir liflerini de çevreler. Schwann hücreleri aksonun uzun ekseni
boyunca paralel olarak uzanır ve aksonlar hücre sitoplazmasına gömülü halde bulunur.
Miyelinsiz sinir liflerinde, her bir Schwann hücresi, bir ya da daha fazla aksonu aynı
anda sarmaktadır25,26.
2.2. Periferik Sinir Yaralanmaları
Sinir yaralanmalarının en yaygın görülen tipi gerilme tipi yaralanmalardır2.
Periferik sinirler, endonöryumlarından dolayı elastiktir, fakat sinire uygulanan çekme,
sinirin gerilme kapasitesinin üzerine çıkarsa, yaralanma meydana gelebilir ve
devamlılık tamamen kaybolabilir. Bununla beraber, çoğu yaralanmalarda devamlılığın
genellikle korunduğu rapor edilmiştir. Gerilme tipi yaralanmalar genellikle, periferik
sinir izolasyonunda veya ekstremite kırıklarında, sinirle kemiğin yakın olduğu
noktalarda görülür. Ciddi yaralanmaların % 30’unu oluşturan ve sinirde kesilme ile
karakterize yırtılma tipi yaralanmalar, diğer yaygın tip yaralanmalardır. Bu tip
yaralanmalarda tam bir kesi olabilmesine rağmen, sıklıkla bazı sinir elemanlarının
devamlılığı korunabilir1,2. Yırtılma tipi yaralanmalar, kolay bir şekilde
oluşturulabildiğinden, araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Yaygın
olarak görülen diğer yaralanma türü, ezilme tipi yaralanmalardır. Bu yaralanmada
5
sinirsel elemanların ayrılması veya kopması söz konusu değildir. Ezilme tipi
yaralanmalarda, motor ve duyu fonksiyonlarının total kaybı meydana gelebilmektedir.
Ezilme tipi yaralanmalarda, mekanik ezilme ve iskemi olmak üzere iki mekanizmanın,
primer etken olabileceği kabul edilmektedir. Bununla birlikte sinir hasarının
oluşumunda, hangi mekanizmanın daha önemli olduğu tam olarak açıklığa
kavuşmamıştır. Yapılan çalışmalar, kısa süreli ezilme tipi yaralanmalarda, iskeminin
fizyolojik iletim bloğuna neden olduğunu göstermiştir. Kısa süreli iskeminin, sinir
iletim bloğunu nasıl oluşturduğu açık değildir. Bununla birlikte, büyük çaplı miyelinli
liflerin, küçük çaplılara oranla daha fazla iskemik etkiye uğradığı gösterilmiştir. Kısa
süreli iskemide, histolojik değişiklikler genellikle geri dönüşümlüdür. Şiddetli iskemik
hasara uğramış sinirde, genellikle fonksiyonun kaybolabileceği ve tam bir iyileşmenin
oluşmayabileceği kabul edilmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, ezilme tipi
yaralanmalarda mekanik deformasyonun etkilerinin daha ön planda olduğunu görüşü ön
plana çıkmıştır1,2,9.
2.3. Sinir Yaralanmalarının Sınıflandırılması
Periferik sinir onarım yolunun başarısı ve süresi, sinir yaralanmasının derecesine
bağlıdır2,3. Sinir yaralanmasından sonra meydana gelen mikroskobik değişikliklerin
korelasyonuna izin veren ve klinikte kullanışlı olan yaralanma türleri geliştirilmiştir.
Seddon ile Sunderland tarafından geliştirilen sınıflandırma günümüzde yaygın olarak
kabul edilmektedir1-3,28. Seddon yaralanmaları şiddetine göre; nöropraksi, aksonotimes
ve nörotimes olmak üzere 3 sınıfa ayrılmaktadır. Sinir devamlılığının kaybolmadığı
ancak geçici bir fonksiyonel kaybın olduğu nöropraksi, bu yaralanmaların en hafif
tipidir. Nöropraksi’de, miyelin yapısında bazı değişiklikler meydana gelmesine rağmen,
oluşan geçici fonksiyon kayıplarının yaralanma bölgesindeki lokal bir iyon-aracılı iletim
bloğundan dolayı oluştuğu düşünülmektedir. Akson ve miyelin kılıfın tamamen
kesilmesiyle aksonotimes oluşmaktadır. Aksonotimeste, epinöryum ve perinöryum
genellikle korunmuştur. Yaralanmanın distal bölgesinde, akson ve miyelin
dejenerasyonu sonucu tam bir denervasyon meydana gelmektedir. Nörotimes, sinirin
bağlantılarının kesildiği ve tam bir fonksiyonel kaybın olduğu yaralanma tipidir. Bu tip
yaralanmada aksonda yeniden büyümeyi yönlendirecek yapılar kaybolur ve skar oluşur.
Cerrahi girişim yapılmadan genellikle iyileşme meydana gelmemektedir28.
6
Sunderland sinir yaralanmalarını 5 grupta değerlendirmiştir; 1.derece yaralanma,
Seddon’un nöropraksi tipi yaralanmasına, 2.derece yaralanma ise aksonotimes’e
eşdeğer olarak kabul edilmiştir. 3.derece yaralanmalar aksonda kesilme ile meydana
gelen, Seddon’un nöropraksi ve axonotimes tipleri arasında bir yaralanma tipine
eşdeğerdir. Bu tip yaralanmalarda endonöryum da kısmen hasar görmektedir.
Endonöryumdaki hasarın derecesine bağlı olarak iyileşme oluşabilir. Sunderland,
Seddon’un nörotimes tipi yaralanmasını, 4. ve 5.derece yaralanmalar olarak
sınıflandırmıştır. 4.derece yaralanmada, epinöryum haricinde sinirin bütün kısımları
bozulmakta, 5.derece yaralanmada ise sinir tamamen kesintiye uğramaktadır. Her iki
yaralanmada da iyileşme ancak cerrahi girişim ile sağlanabilmektedir1,2,5,28.
2.4. Yaralanma Sonucu Sinirde Meydana Gelen Değişiklikler
Sinir rejenerasyonunun başarısı, yaralanmanın başlangıçtaki şiddetine ve
meydana gelen dejeneratif değişikliklere bağlıdır. Yalnızca iletim bloğunun olduğu
birinci derece yaralanmalarda, patolojik değişiklikler ya hiç yoktur ya da çok hafiftir.
İkinci derece yaralanmalarda, yaralanma bölgesinde veya bu bölgenin proksimalinde
hafif histolojik değişiklikler oluşmaktadır. Yaralanma bölgesinin distalinde ise
Wallerian dejenerasyonu meydana gelmektedir2,3,5,7,10,29-32. Wallerian dejenerasyonunda
primer histolojik değişiklik, akson ve miyelin kılıfta oluşan yapısal bozukluklardır.
Dejenerasyon sonucu gözlenen başlıca yapısal değişikler, nöronda nörotübül ve
nörofilamanların düzensiz hale gelmesi, akson ve miyelin kılıfın birbirlerinden
ayrılmaları, aksonda varikoz şişkinliklerin oluşmasıdır. Miyelin kılıf dejenerasyonu
özellikle 36-48 saat içinde belirgin hale gelir. Yaralanmadan sonra 48-96 saatte
genellikle akson devamlılığı kaybolur ve impuls iletimi bozulur. Wallerian
dejenerasyonunda Schwann hücrelerinin anahtar rol oynadıkları kabul edilmektedir4,7,27.
Bu hücreler yaralanmadan sonra 24 saat içinde aktif hale geçer, çekirdek ve sitoplazmik
büyüme gösteren hücreler, hızla bölünerek, dejenerasyon ve tamir yoluna yardım
edecek bir çok molekülü eksprese ederler. Schwann hücreleri dejenerasyon sonrası,
akson ve miyelin artıklarını ortadan kaldırır. Periferik kandan göç eden makrofajlar ile
Schwann hücreleri, fagositoz yaparak, yaralanma bölgesini 1 haftadan bir kaç aya
ulaşan bir sürede temizler2,4,6. Bu süreçte, endonöryumda bulunan mast hücrelerinin de
7
önemli rollere sahip oldukları bilinmektedir. Bu hücreler yaralanmadan sonra ilk 2 hafta
içinde çoğalırlar, makrofaj göçünü kolaylaştıran ve kapiller permeabiliteyi arttıran
histamin ve serotonin salgılarlar7.
Başlangıç evresinde, travmaya cevap olarak endonöral tüp şişer, ilk iki haftadan
sonra çapı oldukça azalır. 5-8 haftada dejenere olan sinir artıkları genellikle ortadan
kaldırılmıştır. 3.derece yaralanmalarda travma-aracılı lokal bir reaksiyon meydana gelir.
İntrafasiküler yaralanmalarda sinir lifi distal kısımları elastik endonöryumlarından
dolayı retraksiyona uğrar. Lokal vasküler travma, etkin enflamatuvar cevapla
sonuçlanan hemoraji ve ödeme yol açar. Fibroblastlar prolifere olur ve oluşan fibröz bağ
dokusu, yaralı segmentte şişkinliğe neden olur. İntrafasiküler skar dokusu sinir
gövdesinde de gelişir ve genellikle perinöral skar dokusu ile kaynaşır2.
2.4.1. Yaralanmayla Beraber Sinir Distalinde Meydana Gelen Değişiklikler
Yaralı bölgenin distali karakteristik Wallerian dejenerasyonu ile karakterizedir.
İntrafasiküler yaralanmaların akson rejenerasyonunu bozması ve bundan dolayı
endonöral tüpün uzun süre denerve kalması önemli bir fark olarak ortaya çıkmaktadır.
Yaralanmadan sonra 3-4 ay içerisinde, endonöral tüp küçülmeye başlar. Schwann
hücresi bazal laminasının dış yüzeyindeki kollajene ilaveten, endonöral kılıfta da
kalınlaşma gözlenir. Endonöral tüp genellikle rejenere bir akson ile birleşir, akson ile
bağlantı kurulamadığında, artan fibrozis ile birlikte ortadan kalkar. Wallerian
dejenerasyonunun geç dönemlerinde Schwann hücre yığınları ile karakterize kollabe
endonöral tüpler mikroskopta da ayırt edilmektedir. Schwann hücre sütunlarından
oluşan aksonun rehber yolları, Büngner bandları2,9,10 olarak adlandırılır. Dolayısıyla bu
bandlar, sinir yaralanmasından sonra, akson büyümesi için Schwann hücrelerinin
nöronları destekleyici etkilerinin önemli bir göstergesidir. 4. ve 5.derece yaralanmalarda
endonöral tüpler tamamen bozulur, Schwann hücreleri ve aksonlar tanımlanamaz hale
gelirler. Bu tip yaralanmalarda epinöryumda önemli yapısal değişiklikler oluşur. 24 saat
içerisinde dejenere olmuş sinir uçlarında reaktif epinöral fibroblastlar ortaya çıkar.
Bütün bunlar, Schwann hücreleri, perinöral ve endonöral fibroblastların proliferasyonu
ile birliktedir. Etkin hücresel çoğalma bir hafta içinde en yüksek düzeye ulaşır ve uzun
süre devam eder. Hafif yaralanmalarda olduğu gibi, kapiller permeabilite artmaktadır,
8
bu artış, mast hücre proliferasyonu, ödem ve takip eden makrofaj infiltrasyonu sonucu
oluşmaktadır. Hücresel cevapların büyüklüğü, sinir ve onu saran dokulardaki travmanın
şiddetiyle paralel bir korelasyon göstermektedir. 4. ve 5. derece yaralanmalarda sinirin
son kısımları, şişkinleşmiş ve dejenerasyona uğramış Schwann hücreleri, fibroblastlar,
makrofajlar ve kollajen lif demetleri ile karaterizedir. Rejenere aksonlar, proksimal
segmentin şişkin kısmına ulaşır ve burada çok ciddi engellerle karşılaşır. Çoğu akson
skar dokusunda halka dizilimi oluşturur veya proksimal segment boyunca geri döner.
Bazı rejenere aksonlar distal kısma ulaşır. Sinir rejenerasyonu, orijinal yaralanmanın
şiddeti, skar oluşumunun büyüklüğü ve aksonun yaralı bölgeye ulaşmasından önce
geçen süre gibi, pek çok faktöre bağlı olarak değişiklik göstermektedir1,2,5,28.
2.4.2. Sinir Proksimali ve Hücre Gövdesinde Meydana Gelen Değişiklikler
Yaralanmaya bağlı olarak, nöron perikaryonunda ve sinir lifi proksimalinde
meydana gelen değişiklikler, yaralanmanın şiddetine ve yaralı bölgenin perikaryona
yakınlığına bağlıdır. Yaralı bölgenin yakınındaki proksimal segment boyunca, Schwann
hücrelerinde yapısal değişiklikler ile akson ve miyelin kılıf çapında azalma meydana
gelir. Şiddetli travmalarda olduğu gibi, sinir hücresi perikaryonu tam olarak dejenere
olduğunda, proksimal segmentin tamamı Wallerian dejenerasyonu bulgularını
göstermektedir1,2,4,9,28. Yaralanmayı takiben proksimal segmentte, akson çaplarının
azalmasıyla beraber sinir iletim hızı da düşmektedir. Rejenerasyon sürecinde, akson
çapları artmakla beraber, yaralanmadan önceki normal boyutlarını kazanamamaktadır.
Rejenerasyon sırasında, hücre perikaryonu ve akson arasındaki fonksiyonel ilişki son
derece önemlidir. Fonksiyonel periferal bağlantılar yeniden kurulmadan, hücre
perikaryonunda tam bir iyileşme meydana gelmez. Akson çapındaki artış, hücre
perikaryonundaki iyileşme ile doğru orantılıdır. Yaralanmayla beraber nöronun
çekirdeği 6 saat içinde perifere göç eder, Nissl cisimcikleri bozulur ve nöroplazmaya
dağılır3,9,25,29. Bunun dışında, nöronun sinaptik bağlantıları da genellikle bozulur. Bu
nedenle, şiddetli sinir yaralanmalarından sonra, hücre yaşamını daha fazla sürdüremez.
Aksonotimesi takiben, dorsal kök gangliyonunda apopitozla hücre ölüm insidansının,
%20-50’ye kadar arttığı rapor edilmiştir2. Yaralanma nedeniyle nöronal hücre
ölümünün mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Bununla beraber, yaralı alanın
9
mikroçevresinin hücre ölümünde önemli olduğuna inanılmaktadır9. Yaralanmadan
sonra, periferik sinir mikroçevresinde, Schwann hücrelerinin4,9,10,27 destekleyici rolleri
yanında, salınan pek çok tropik molekülün, hücre yaşamını etkilediğini bildiren
çalışmalar yayınlanmıştır6,11-16,34-36.
2.5. Schwann Hücreleri ve Rejenerasyondaki Rolleri
Schwann hücreleri, periferik sinir sisteminde aksonları saran ve akson etrafında
miyelin kılıfı yapan destek hücreleridir4,25,27. Schwann hücreleri ve aksonlar arasındaki
bu yakın ilişki, bu hücrelerin aksonlar üzerinde özel etkilere sahip olmasının bir
göstergesidir. Nöron-Schwann hücresi ilişkisinin bozulması, nöronlarda ve Schwann
hücrelerinde önemli değişikliklere neden olur. Wallerian dejenerasyonu2,3,5,7,10,29-32 adını
alan bu hücresel değişiklikler, proksimal ve distal sinir segmenti sonunda meydana
gelir. Sinir distalinde morfolojik değişiklikler yaralanmadan sonra ilk 3 günde meydana
gelir. Fragmanlar küçülmeye ve oval bir görünüm almaya başlar. 2. günden itibaren, 4
ve 7.günler arasında en fazla olmak üzere, makrofajlar buraya ulaşır ve 15-30 gün sonra
aksonal yıkıntıları hemen tamamen temizler. 3.günde Schwann hücreleri önceden akson
ve miyelin kılıfla dolmuş olan alanı doldurmak için hızla mitozla bölünür3. Rejeneratif
Schwann hücreleri aksonal kökten rejenere olan filizleri kabul etmek için distal
segmentte Büngner bandını2,4,9,10 yapar. Histolojik değişikliklerin yanında, yaralanma
sonrası sinir distalinde bir takım moleküler değişiklikler de meydana gelir. Yetişkin
sıçan siyatik sinirinde normalde çok düşük konsantrasyonda bulunan NGF mRNA,
deneysel sinir yaralanmalarından sonra Schwann hücrelerinde hızla artar2,4,6. NGF
mRNA’nın bu artışı aktive makrofajların göçüne bağlıdır. Ayrıca, Schwann
hücrelerinde BDNF mRNA’nın da yüksek olduğu rapor edilmiştir. BDNF mRNA
üçüncü günden sonra artmaya başlar, 3-4. haftada en yüksek derecesine ulaşır. NT-3’ün
merkezi sinir sistemindeki ekspresyonu belirgin olmakla birlikte, yetişkin sıçanlarda,
NT-3 varlığı, sağlam siyatik sinirde de keşfedilmiştir4. Sinir yaralanmasından 6-12 saat
sonra distal segmentte NT-3 konsantrasyonu oldukça azalır ve yaralanmadan 2 hafta
sonra kontrol değerlerine ulaşır. Siyatik sinir distal segmentinde, aksotomiden 6-12 saat
sonra NT-4/5 mRNA miktarı azalmakta, daha sonra artarak, kontrolün yaklaşık 8 katı
seviyesine kadar yükselmektedir. Düşük affiniteli NGF reseptörü (p75NGFR) sağlam
10
siyatik sinirde bulunmamakla birlikte, yaralanmayı takiben özellikle distal segmentte
ekspresse olmaktadır. Yaralı sinirin proksimal ve distal kısımlarında, trk mRNA
ekspresyonu belirgin olmamakla birlikte, sinir yaralanmasından 1 hafta sonra Schwann
hücrelerindeki trk B ve trk C mRNA, özellikle lezyon bölgesinin proksimalinde belirgin
hale gelmektedir. CNTF, periferik sinir sisteminde Schwann hücrelerinden ve merkezi
sinir sisteminde de astrositlerden eksprese olur. Aksotomiden sonra, CNTF mRNA
ekspresyonu, distal kısımda belirgin olarak azalır ve aksonal rejenerasyondan sonra
ekspresyonu genellikle artar. Sıçanlarda siyatik sinir yaralanması sonrası Schwann
hücrelerinde, yaralanma bölgesinin hem proksimal hem de distal kısmında, GDNF
mRNA’nın ekspresyonu belirgin olarak artmaktadır4,16,20.
2.6. Nörotropik Faktörler
Nörotropik faktörler, nöronların yaşamını devam ettirmesi için ihtiyaç duyduğu
bir polipeptid ailesidir20,21. Embriyonik yaşam boyunca nöronların gelişim ve
olgunlaşmalarına katkıda bulundukları ve sinir yaralanmalarından sonra da
rejenerasyonu ilerlettikleri rapor edilmiştir. Nörotropik faktörler 3 ana gruba ayrılır.
Birinci grup, NGF, BDNF, NT-3 ve NT-4/5’i içeren nörotropinlerdir. Bunlar trk
ailesinin (trk A,B,C) tirozin kinaz reseptörlerine etki eden küçük temel polipeptidlerdir.
İkinci grup, CNTF ve LIF’i içeren nörokinlerdir. Üçüncü grup ise, TGF-β1, TGF-β2,
TGF-β3 ve GDNF’yi içeren TGF-β ailesidir20.
NGF, ilk ve en iyi tanımlanan sinir kökenli büyüme faktörüdür. 26 kDA
ağırlığında homodimerik polipeptiddir ve orijinal nörotropik faktör olarak
tanımlanmıştır. NGF üretildiğinde, spesifik reseptörlerine bağlanarak sinir terminalleri
tarafından alınır ve sinir hücre gövdesine retrograd aksonal transport yoluyla iletilir.
NGF’nin embriyonik dorsal gangliyon nöronlarının, sempatik ve duyu nöronlarının
gelişim ve yaşamını desteklediği rapor edilmiştir6,20,34-36. Diğer taraftan, bazı
araştırmalarda, NGF’nin motor nöronların gelişimleri üzerinde çok az etkiye sahip
olduğu da kaydedilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, NGF’nin motor sinir
rejenerasyonuna etkili olabilmesi için ortamda fibronektin gibi, kombine etki
göstereceği diğer maddelerin de bulunması gerektiği ileri sürülmüştür4. Tropik
faktörlerin ilgili reseptörüne bağlanması, reseptör otofosforilasyonuna yol açar. Bu da
11
reseptörlerin hedef proteinlerdeki fosforile tirozin uçlarına bağlanmasını sağlar. Sonuçta
hücre büyümesini ve farklanmasını uyaran proteinler aktive olur.
Sağlam siyatik sinir Schwann hücrelerinde, CNTF yüksek konsantrasyonda
bulunur14,20. CNTF’nin duyu ve sempatetik nöronlarda sinir büyümesini ilerlettiği ve in
vitro koşullarda, motor nöronların yaşamını desteklediği ve motor nöronların
apopitozunu engellediği rapor edilmiştir. Sıçanlarda yapılan çalışmalarda da, CNTF’nin
aksotomi sonrası motor nöron ölümünü azalttığı rapor edilmiştir. Aksotomiden sonra
CNTF mRNA düzeylerinin belirgin olarak azaldığı, aksonların rejenere olmasından
sonra tekrar yükseldiği belirlenmiştir. CNTF’nin aksotomiden sonra siyatik sinirde
motor fonksiyonel iyileşmeyi arttırdığı bulunmuştur. Periferik sinir rejenerasyonundan
sonra BDNF ve CNTF’nin kombine kullanımının, BDNF’nin tek başına kullanımına
kıyasla, fonksiyonel iyileşme hızını arttırdığı gösterilmiştir. Nörotropin ailesinin diğer
bir üyesi olan GDNF’nin başlangıçta yalnızca dopaminerjik nöronlar üzerine etkili
olduğu düşünülmüş, fakat son yıllardaki raporlar, GDNF’nin diğer birçok nöronal
populasyon için etkili bir nörotrofik faktör olduğunu göstermiştir. Embriyonik sıçan
spinal kord motor nöronlarından elde edilen GDNF’nin aksotomi sonrası motor ve duyu
nöronlarında hücre ölümünü azalttığı, ayrıca Schwann hücrelerinde güçlü bir tropik
etkiye sahip olduğu bulunmuştur. GDNF’nin, nöronlar ve Schwann hücreleri arası
etkileşimde önemli bir role sahip olduğu belirlenmiştir20,33.
Nörotropik faktörler içerisinde etkisi iyi bilinen ve üzerinde pek çok çalışma
yapılan NGF’nin in vitro ve in vivo olarak, sempatetik ve duyu nöronlarında
rejenerasyonu arttırdığı tespit edilmiştir6,11,12,34. Klinikte NGF, Alzheimer hastalığında
ve nörotropik keratitiste, kolinerjik dejenerasyonun engellenmesi, terminal nöronal
filizlenmeyi uyarmak, korneal sensiviteyi düzenlemek ve epitelyal iyileşmeyi sağlamak
amacıyla kullanılmaktadır. Motor nöronların düşük affiniteli NGF reseptörleri ile ilişkili
olmasına rağmen, son zamanlardaki deneysel çalışmalar NGF’nin motor nöron
rejenerasyonu üzerine de olumlu etkilerinin olduğu kaydedilmiştir. Sinir
yaralanmasında silikon tüp boyunca NGF kullanımının fasial sinirde rejenerasyonu
sağladığı, sıçan siyatik sinir modelinde de, motor sinir iletim hızını arttırdığını rapor
edilmiştir. Ayrıca, sıçanlarda siyatik sinir ezilme modelinde yapılan çalışmada, eksojen
NGF verilmesinin siyatik sinirde, elektrofizyolojik ve histolojik bulguların iyileşmesini
arttırdığını gösterilmiştir. Bunların yanında, sıçan siyatik sinir kesisinde ven graftı
12
uygulanan çalışmada, NGF’nin, hem duyu hem de motor sinir rejenerasyonunu önemli
derecede arttırdığı kaydedilmiştir. Bunların dışında, sıçanlarda siyatik sinir kesisinde,
ters çevrilmiş ven graftı uygulanan çalışmada, NGF verilen gruplarda, miyelinli sinir
liflerinin sayıları, akson çapı ve miyelin kılıf kalınlığının kontrol gruplarına göre
anlamlı olarak artış gösterdiği rapor edilmiştir12. Bununla birlikte, bugüne kadar yapılan
çalışmalarda NGF ve diğer nörotropik maddelerin periferal sinir rejenerasyonundaki
etki mekanizmaları henüz tam olarak aydınlatılamamıştır12-14.
2.7. Periferik sinir yaralanmaları ve steroid maddeler
Periferik sinir sisteminin steroid reseptörlerine sahip olduğu ve dolayısıyla bu
dokuların nöroaktif steroidler için hedef oldukları bilinmektedir. Nöroaktif steroidler,
periferik sinir sistemi miyelinli sinir liflerinde, miyelin kılıf yapısında bulunan P0 ve
PMP22 proteinlerinin ekspresyonlarını stimüle etmektedirler. Yapılan son çalışmalarda,
nöroaktif steroidlerin Schwann hücrelerinin proliferasyonunu ve hücresel gelişimlerini
düzenledikleri açığa çıkarılmıştır. Nöroaktif steroidlerin, miyelin proteinlerinin sentezini
kontrol etmeleri yanında, miyelin kılıf ve akson gelişimi üzerine de etkili oldukları rapor
edilmiştir. Pregnenolonu, progesterona çeviren P450scc (sitokrom) ve 3β-hidroksi steroid
dehidrogenaz (3β-HSD)’ın Schwann hücrelerinden salındığı gösterilmiştir18. Periferik
sinirler ve Schwann hücreleri, nöroaktif steroidleri eksprese etmektedirler ve bu maddeler
için aynı zamanda hedef hücre ve yapılardır. Bunun dışında, sıçan siyatik sinirinde
özellikle Schwann hücrelerinin, progesteron, östrojen, glukokortikoid ve
mineralokortikoid reseptörleri gibi klasik steroid reseptörlerini eksprese ettikleri de
bilinmektedir. Ayrıca, sıçan siyatik sinirinden androjen reseptörlerinin eksprese olduğuna
dair bulgular da kaydedilmiştir.
Periferik sinir yaralanmalarında, oluşan iskemi ve travmanın etkisiyle kan akımı
bozularak kesintiye uğramakta ve travma etkisi ile kanama ve yaygın ödem meydana
gelmektedir.Yaralanma sonucunda, primer olarak ortaya çıkan değişikliklerin yanında,
lipid peroksidasyon ürünleri ve superoksit anyonlar gibi, pek çok zararlı etkenin varlığına
bağlı sekonder hücresel değişikliklerin de ortaya çıkmasıyla, ciddi hücresel hasarların
meydana geldiği yaygın olarak kabul edilmektedir. Sinir liflerinin yapısında bulunan
miyelin kılıfın lipid içeriğinin yüksek olduğu dikkate alındığında, travma ve dolaylı
13
olarak oluşacak iskemi sonrasında miyelin yapısının bozulacağı, membran yapılarının
etkileneceği ve lipid peroksidasyonun ortaya çıkacağı açıktır. Betametazon, bir
glukokortikoid olup, 9α-fluoro-16β-metilprednizolon yapısındadır. Betametazonun
antienflamatuvar ve antiödematöz etkileri yaygın olarak kabul edilmektedir17.
Bugüne kadar yapılan çalışmalarda, periferik sinir yaralanmalarında, nörotropik
bir madde olan NGF ve steroid yapısında olan betametazonun birlikte uygulandığı bir
çalışmaya literatürde rastlanmamıştır. Bu çalışmada sıçanlarda deneysel sinir ezilme
modelinde, NGF ve betametazonun ayrı ayrı ve kombine uygulanmasının, siyatik sinir
üzerine olan etkilerinin, ışık ve elektron mikroskopik, histomorfometrik, footprint analizi
ve biyokimyasal çalışmalarla araştırılması amaçlandı.
14
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Deney hayvanlarının elde edilmesi ve gruplara ayrılması
Sıçan siyatik sinirinde ezilme tipi yaralama sonrasında, sinir büyüme faktörü
(NGF-β, nerve growth factor-β) (Sigma, Katolog No: N-2513) ve steroid bir madde olan
Betametazon’un (Sigma, Katolog No: B-9675) ayrı ayrı ve kombine tedavilerinin,
periferik sinir rejenerasyonuna etkilerinin incelenmesi amacıyla Çukurova Üniversitesi
Tıbbi Bilimler Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezi’nden, 250-300 gr ağırlığında
50 adet yetişkin erkek Wistar cinsi sıçan temin edildi. Denekler; hiçbir cerrahi işlem
yapılmayan sağlam grup, ezilme tipi sinir yaralanması oluşturulan ve serum fizyolojik
enjekte edilen deney kontrol grubu, sinir yaralanması + yalnızca betametazon tedavisi
uygulanan grup, sinir yaralanması + yalnızca NGF tedavisi uygulanan grup ve sinir
yaralanması + betametazon ve NGF tedavisinin birlikte uygulandığı grup(kombine
tedavi grubu) olmak üzere 5 eşit gruba ayrıldı.
3.2. Operasyon
Sıçanlara 8 mg/100 gr ketamin ve 1 mg/100 gr xylazin karışımının
intraperitoneal verilmesiyle anestezi yapıldı. Anesteziyi takiben sağ dış uyluk traş
edildi, femoral ve gluteal kaslar arasından longitüdinal insizyonla siyatik sinir açığa
çıkarıldı. Siyatik sinirde, Aesculab66 hemostatik fine forceps kullanılarak, 2 diş
sıklığında 30 sn süreyle ezilme oluşturuldu. Daha sonra kas ve deri sırasıyla 4-0 vicryl
ve 4-0 nylon iplikle dikilerek kapatıldı36.
3.3. Tedavinin Uygulanması
Betametazon, operasyondan hemen sonra 2mg/kg/gün dozunda; sinir
yaralanması + betametazon grubu ve sinir yaralanması sonrası NGF+Betametazon’un
kombine tedavisi uygulanan hayvanlara, perioperatif bölgeye subkütan yolla, 1 gün
süreyle ve 8 saat aralıklarla 3 defa uygulandı17. NGF+Betametazon tedavisi uygulanan
gruba (kombine grup) ve NGF grubuna operasyondan hemen sonra 0.3 ml fosfat
15
tamponu içerisinde 1µg NGF-β subkütan yolla perioperatif bölgeye 14 gün boyunca
uygulandı12. Deney kontrol grubuna da aynı dozda ve aynı yolla serum fizyolojik
verildi. Operasyondan sonra 7, 14, 21, 28 ve 35. günlerde fonksiyonel iyileşmeyi
değerlendirmek amacıyla Footprint analizi yapıldı. Analizde, sırasıyla sıçanların arka
bacak 1-5. parmak açıklık oranları ( Toe spread factor, TSF değeri) ölçüldü22.
3.4. Biyopsi Alınması
Postoperatif 6.hafta sonunda siyatik sinir biyopsilerinin alınması amacıyla,
sıçanlara 8 mg/100 gr ketamin ve 1 mg/100 gr xylazin karışımı intraperitoneal olarak
verilerek anestezi yapıldı. Yaralanma oluşturulan sağ siyatik sinir açığa çıkarıldı ve kor
bölgesini içerecek şekilde alınan sinir doku parçaları, ışık, elektron mikroskopik ve
biyokimyasal yöntemlerle hazırlandı.
3.5. Elektron Mikroskopi Yöntemleri
Elektron mikroskobik değerlendirme için alınan sinir doku parçaları Millonig
fosfat tamponu ile hazırlanmış % 5 lik gluteraldehit solüsyonunda 1 saat bekletildikten
sonra üzerinde birkaç damla gluteraldehit olan dişçi mumuyla kaplı petri üzerinde jilet
yardımıyla 1 mm³ lük parçalara ayrıldı. Doku parçaları tekrar gluteraldehit solüsyonuna
alınarak 3 saat kadar tespit edildi. Böylece dokular toplam 4 saat tespit edilmiş oldu.
Daha sonra dokular Millonig fosfat tamponunda 10 dk çalkalandı. Dokular ikinci kez
Millonig fosfat tamponuna alındıktan sonra aynı tampon içerisinde bir gece bekletildi.
Ertesi gün dokular Millonig fosfat tamponu ile hazırlanmış %1 lik osmium tetraoksit
solüsyonu ile ikinci defa tespit edildi ve yine fosfat tamponu ile iki kez 10’ar dk
yıkandı. Dokular daha sonra aşağıdaki sıraya göre dehidrate edildi :
• % 50 Etil alkolde + 4º C’de 15 dakika
• % 70 Etil alkolde + 4º C’de 15 dakika
• % 86 Etil alkolde + 4º C’de 15 dakika
• % 96 Etil alkolde + 4º C’de 15 dakika
• % 100 Etil alkolde + 4º C’de 15 dakika
• % 100 Etil alkolde + 4º C’de 15 dakika
16
Buraya kadar olan işlemler buzdolabında + 4º C’de gerçekleştirildi. Daha sonra
aşağıdaki işlemler oda ısısında gerçekleştirildi :
• %100 Etil alkolde 15 dakika
• Propilen oksitte 15 dakika
• Propilen oksitte 15 dakika
Dehidrate edilen doku parçaları daha sonra aşağıdaki solüsyonlar içerisinde immerse
edildi :
Propilen oksit + gömme materyali 30 dakika
Propilen oksit + gömme materyali 30 dakika
Bu işlemlerden sonra doku parçaları içerisinde yeni hazırlanmış gömme materyali
(rezin) bulunan tüplere alındı ve bir gece süreyle rotatorda karıştırıldı.
Gömme Materyali :
• Araldit CY 212 20 ml
• Sertleştirici HY 964 20 ml
• Hızlandırıcı DY 064 0.6 ml
• Plastikleştirici – Dibütil Fitalat 1 ml
Ertesi gün doku parçaları taze hazırlanmış gömme materyali kullanılarak 00
polietilen kapsüllere gömüldü ve 60º C etüvde 48 saat süreyle polimerize edildi. Daha
sonra elde edilen bloklar etüvden çıkarılarak soğumaya bırakıldı. Bloklardan Reichert
Ultracut S ultramikrotomu ile 500 Aº kalınlığında kesitler alındı. Kesitler 200-300
gözenekli bakır gridlere toplandı ve % 70’lik etil alkolde doymuş uranil asetat ve
Reynolds’un kurşun sitrat solüsyonları ile boyandı. Boyanan kesitler Zeiss E.M. 10 B
elektron mikroskobu ile incelendi. Mikrograflar Dupont filmleri ile çekildi. Resimler
fohar ve fortezo kağıtlarına basıldı.
3.6. Biyokimyasal Analiz Yöntemi
Deneklerden elde edilen siyatik sinir doku parçaları serum fizyolojik içeren şişelere
konuldu ve buz içerisinde muhafaza edildi. Daha sonra serum fizyolojik içerisinden
çıkarılan dokular fosfat tamponu ile homojenize edilerek (homojenizat) santrifüj tüpü
17
içerisine konuldu ve buz içerisinde saklandı. Sonra fosfat tamponu ile 1/10 oranında
seyreltilen homojenizatlarda malondialdehit (MDA) ve süperoksit dismutaz (SOD)
ölçümleri yapıldı.
3.6.1. Malondialdehit (MDA) Analizi:
Homojenizatın pH:3,4’de aerobik koşullarda, tiobarbitürik asit ile 95°C’de
inkübasyonu sonucu oluşan pembe renkli kompleksin optik dansitesinin ölçümüyle
malondialdehit miktarı saptandı ve hesaplamaları yapıldı37.
3.6.2. Süperoksit Dismutaz (SOD) Analizi:
Homojenizatlarda, ksantin ve ksantin oksidaz kullanılarak oluşturulan süperoksit
radikallerinin p-iyodonitrotetrazoliyum viyolet (INT) ile meydana getirdiği kırmızı
renkli formazan boyasının optik dansitesinin okunması esasına dayanan randox kit
yöntemi kullanılarak süperoksit dismutaz tayini yapıldı. Daha sonra ölçülen değerlerin
hesaplamaları yapıldı38.
3.7. Histomorfometrik Yöntemler
Siyatik sinir doku bloklarından, ince kesitlerin hazırlanmasından önce, 1µm
kalınlığında yarı ince kesitler alındı. Kesitler toluidin mavisi ile boyandı ve Olympus
BX50 (Tokyo-Japanya) ışık mikroskobunda incelendi. Mikroskoba bağlı Bioquant
Omega II software analiz programı kullanılarak, ortalama miyelinli sinir liflerinin
sayıları, akson çapları ve miyelin kılıf kalınlıkları ölçüldü.
3.8. Footprint Analizi
Footprint analizi siyatik sinir yaralanmasından sonra fonksiyonel iyileşmeyi
ölçmek amacıyla, non-invaziv, duyu ve motor iyileşmenin kombinasyonunu gösteren
bir metoddur ve siyatik sinir rejenerasyonun değerlendirilmesinde yaygın olarak
18
kullanılmaktadır22-24. Bu çalışmada, Bervar tarafından tanımlanan22 video destekli
footprint analiz tekniğini kullanıldı.
Bütün gruplarda, footprint analizi 7, 14, 21, 28 ve 35. günlerde yapıldı. Video
footprint sistemi, 50x100 cm ebatlarında cam bir tablanın altına yerleştirilen bir video
kamera kaydedici ve bunların hemen yanına 100 W’lık elektrik lambasından
oluşturuldu. Ayrıca, standart bir televizyon monitörü de bu sisteme dahil edildi.
Sıçanlar, cam tabla üzerindeki 10x20x20 cm ebatlarındaki pleksiglas kutulara
yerleştirildi ve 5 dk. süreyle adaptasyona bırakıldı. Deneklerin, uygun ortamda 3 dk.
süreyle video kayıtları yapıldı ve dijital fotoğraf makinası ile de ayak fotoğrafları elde
edildi. Video kayıtlarının incelenmesinden sonra alınan veriler bilgisayara aktarıldı ve
Excel-Visual Basic tabanlı bir analiz programı değerlendirildi. Her bir sıçan için, en az
5 fotografta, 1-5. parmaklar arası açıklık oranı (TSF, toe spread factor) hesaplanarak,
ortalama TSF değerleri elde edildi.
3.9. İstatistik
Gruplar arası karşılaştırma tek yönlü varyans analizi (one-way ANOVA) ile
istatistiksel olarak değerlendirildi. Karşılaştırma Bonferroni ve Tamhane testine göre
yapıldı. 0,05’ten küçük p değerleri anlamlı olarak kabul edildi (p<0,05). Değerler
aritmetik ortalama (X) ± standart sapma şeklinde ifade edildi.
19
4. BULGULAR
4.1. Histolojik ve Elektron Mikroskobik Bulgular
4.1.1. Sağlam Grup
Sağlam gruba ait hayvanların siyatik sinirinin yarı ince kesitlerinin toluidin
mavisi ile boyanmasından elde edilen kesitlerin ışık mikroskobik incelenmesinde,
sinirin dıştan kalın fibröz bir bağ dokudan oluşan epinöryum ile çevrili olduğu izlendi.
Epinöryumda fibröz bağ dokusu dışında, kan damarlarının varlığı da gözlendi.
Epinöryumun altında sinir fasiküllerinin daha ince bir bağ dokusu olan perinöryumla
çevrili olduğu görüldü. Perinöryumdan kaynaklanan daha ince bağ dokusu bölmelerinin
tek tek sinir liflerini çevrelediği gözlendi. Endonöryum olarak adlandırılan bu ince bağ
dokusunun altında Schwann hücrelerinden oluşan nörilemma kılıfının varlığı izlendi.
Aksonları saran Schwann hücreleri, oval ya da yuvarlak çekirdekleri ile ayırt edildi.
Aksonlar, Schwann hücrelerinin sitoplazmasına gömülmüş halde, soluk renkli olarak
izlendi. Miyelinli sinir liflerinde, Schwann hücreleri tarafından yapılan ve aksonun
etrafında yerleşmiş olan bir miyelin kılıfın varlığı görüldü. Miyelinli sinir liflerinin
aralarında, miyelinsiz sinir lifleri, bağ dokusu hücreleri ve kan damarları da ayırt
edilmekteydi (Şekil 1). Bu grubun elektron mikroskobik incelenmesinde, sinir
fasiküllerinin miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinden oluştuğu dikkati çekti (Şekil 2,3).
Sinir liflerinin Schwann hücreleri tarafından çevrelendikleri ve Schwann hücresi
sitoplazması içerisinde bulundukları izlendi. Schwann hücrelerinin, heterokromatinden
zengin oval ya da yuvarlak bir çekirdeğe sahip oldukları, heterokromatinin genellikle
nüklear kılıf yakınında yoğunlaştığı dikkati çekti. Çekirdek, miyelinsiz sinir liflerini
saran hücrelerde, genellikle hücrenin ortasında yer alırken (Şekil 4), miyelinli sinir
liflerini saran Schwann hücrelerinde ise genellikle sitoplazmanın fazla bulunduğu bir
alanda yerleşmişti (Şekil 2,3). Schwann hücreleri dıştan bir bazal lamina ile sarılı idi,
bazal laminanın altında hücrenin plazmalemması yer almaktaydı. Hücrenin
sitoplazmasında endoplazmik retikulum sisternaları, golgi apparatus, mitokondriyonlar,
lizozomlar ve dağınık olarak ribozomlar yer almaktaydı. Schwann hücrelerinin,
miyelinli ve miyelinsiz bütün aksonları sardıkları izlendi. Miyelinli sinir liflerinde,
20
Schwann hücrelerinin aksonu sararak, akson etrafında konsantrik lamellar tarzda
miyelin kılıfı oluşturdukları görüldü. Miyelinli sinir liflerinde, Schwann hücrelerinin tek
bir aksonu sardığı ve aksolemma ile hücre zarı arasında periaksonal boşluğun
bulunduğu gözlendi. Akson içerisinde mitokondriyonlar, agranüler endoplazmik
retikulum sisternaları, çok miktarda nörotübül ve nörofilamanların varlığı izlendi (Şekil
2,3). Miyelinsiz sinir liflerinde, bir Schwann hücresinin, genellikle birden fazla aksonu
aynı anda sardığı dikkati çekti. Miyelin kılıfa sahip olmayan aksonlar, Schwann hücresi
sitoplazması içerisine gömülü olarak bulunmaktaydı (Şekil 3,4). Sinir lifleri, Schwann
kılıfının üzerinde fibröz bağ dokudan oluşan ve endonöryum adı verilen bağ dokusu
kılıfı ile sarılıydı. Sinir liflerinin aralarında, ince uzun sitoplazmik uzantıları ve
heterokromatik çekirdekleriyle karakterize edilen fibroblastların varlığı izlendi (Şekil
4). Ayrıca, az sayıda mast hücresi, kapiller damarlar ve başlıca kollajen liflerden oluşan
fibröz bağ dokusu da yer almaktaydı (Şekil 2,3,4).
21
ŞEKİL 1: Sağlam gruptan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin (a) belirgin bir miyelin kılıfa sahip olduğu (oklar) ve bu liflerin normal yapıda oldukları görülmektedir. Miyelinsiz sinir lifleri (ma) izlenmektedir.
22
ŞEKİL 2: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin akson (a), miyelin kılıf (Mk) yapılarıyla birlikte normal oldukları, akson (a) içerisinde; mitokondriyonlar (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) görülmektedir. Sinir liflerinin Schwann hücreleri (Sh) tarafından sarıldığı, Schwann hücrelerinin çekirdeği (Ç) ve sitoplazmik organellerinin normal yapıda olduğu görülmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) bir Schwann hücresinin birden fazla aksonu sardığı, sinir liflerinin aralarında kollajen liflerin (Kol) varlığı görülmektedir.X8100.
23
ŞEKİL 3: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda olduğu görülmektedir. Akson içerisinde mitokondriyonlar (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) normal olarak izlenmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) bir Schwann hücresinin birden fazla aksonu sardığı, sinir liflerinin aralarında kollajen liflerin (Kol) varlığı izlenmektedir. Çekirdek (Ç).X12400.
24
ŞEKİL 4: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin Schwann hücreleri (Sh) tarafından sarıldığı görülmektedir. Sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda olduğu ve miyelinsiz sinir liflerinin (ma) Schwann hücre sitoplazmasına gömülü olarak bulundukları görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında fibroblast (Fb) ve kollajen liflerin (Kol) bulunduğu dikkati çekmektedir. Çekirdek (Ç).X10100.
25
4.1.2. Deney Kontrol Grubu
Deney kontrol grubundan elde edilen siyatik sinirinin yarı ince kesitlerinin ışık
mikroskobik incelenmesinde, sinirin dıştan fibröz bir bağ dokudan oluşan epinöryum ile
çevrili olduğu izlendi. Epinöryumda fibröz bağ dokusu dışında, kan damarlarının varlığı
da gözlendi. Epinöryumun altında, içerisinde miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinin
bulunduğu sinir fasiküllerinin varlığı ayırt edildi. Miyelinli sinir liflerinin rejenerasyonu
belirgin olmakla birlikte, sinir liflerinin bazılarında akson ve miyelin kılıfın dejenere
olduğu, miyelin kılıf lamellerinin birbirlerinden ayrıldıkları, aksonun büzüştüğü ve bazı
liflerde ise tamamen dejenere olduğu dikkati çekti. Dejenerasyonun belirgin olduğu
alanlarda, dejenere sinir lifleri ve miyelin kılıf yapılarını fagosite etmiş ve sindirmiş pek
çok makrofajın varlığı da ayırt edildi. Bunların yanında, miyelinli sinir liflerinin önemli
bir kısmının normal yapılarını korudukları görülmekle birlikte, akson çapları ve miyelin
kılıf kalınlıklarında sağlam gruba göre önemli bir azalmanın meydana geldiği dikkati
çekti. Miyelinli sinir liflerinin aralarında, miyelinsiz lifler, makrofajlar, mast hücreleri
ve fibroblastlar ile fibröz bağ dokusunun varlığı gözlendi (Şekil 5). Deney kontrol
grubunun elektron mikroskobisinde, bazı alanlarda miyelinli ve miyelinsiz sinir lifleri
ve Schwann hücrelerinin normal yapılarını korudukları izlenmekle birlikte (Şekil 6,7),
çoğu alanlarda özellikle miyelinli sinir liflerinde miyelin kılıfta önemli yapısal
değişikliklerin meydana geldiği dikkati çekti (Şekil 8,9). Miyelin kılıfın normal
konsantrik lamellar yapısının yer yer bozulduğu ve akson içerisine doğru invajine
olduğu, bazı miyelinli sinir liflerinde ise miyelin kılıfın sinir lifi dışına doğru çıkıntı
oluşturduğu görüldü (Şekil 9). Miyelin kılıf dejenerasyonunun belirgin olduğu sinir
liflerinde, aksonlarda da belirgin yapısal değişiklikler izlendi. Aksonun genellikle
büzüştüğü, akson ile miyelin kılıf arasında çeşitli büyüklüklerde vakuollerin meydana
geldiği, bazı sinir liflerinde ise aksonun tamamen dejenere olduğu ve akson içerisindeki
organellerin tanınmaz bir şekil aldığı ayırt edildi (Şekil 8,9). Dejenerasyonun belirgin
olduğu alanlarda Schwann hücrelerinin çekirdek ve sitoplazmik özellikleri ile oldukça
aktif bir görünümde oldukları izlendi. Schwann hücrelerinde çekirdekteki kromatin
dağılımı ve sitoplazmik organellerin yapılarının nisbeten normal olduğu (Şekil 6,7),
bazı sinir liflerinde ise Schwann hücrelerinde çekirdekte heterokromatin artışı ve
sitoplazmada endoplazmik retikülüm genişlemesine bağlı olarak vakuolizasyonun
meydana geldiği dikkati çekti (Şekil 8). Miyelinsiz sinir liflerinin genellikle normal
26
yapılarını korudukları izlendi. Sinir liflerinin aralarında dejenere miyelin kılıf yapılarını
fagosite etmiş halde izlenen çok sayıda makrofajın varlığı kaydedildi. Makrofajların
sitoplazmalarında çok sayıda fagozom bulunmaktaydı. Bazı alanlarda, makrofajların
ileri derecede dejenere oldukları, çekirdeklerinin hiperkromatik görünüm kazandığı ve
piknotik değişiklikler gösterdiği izlendi (Şekil 6,7,10). Dejenerasyonun belirgin olduğu
alanlarda, fibroblast sitoplazmalarında bol miktarda ribozom yanında, çeşitli
büyüklüklerde lipid damlacıklarının birikimi de ilgi çekici bulundu (Şekil 7). Ayrıca
ortamda, oval ya da yuvarlak nispeten ökromatik bir çekirdeğe sahip, sitoplazmalarında
elektron dens birçok salgı granülünün bulunduğu mast hücreleri de yer almaktaydı.
Özellikle dejenere alanlarda, mast hücrelerinin Schwann hücreleri ve sinir liflerine
komşu yerleşimi ilgi çekici bulundu (Şekil 11). Bunun dışında, sinir liflerinin aralarında
aktif fibroblastların yanında, farklı yönlerde düzenlenmiş, kollajen liflerden zengin
fibröz bağ dokusunun artışı da izlendi (Şekil 7,8,10,11).
27
ŞEKİL 5: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü. Sinirin dıştan epinöryum (Ep) adı verilen fibröz bağ dokusuyla sarılı olduğu görülmektedir. Miyelinli sinir liflerinin çoğu alanlarda normal yapıda oldukları görülmekle birlikte (oklar) liflerin önemli bir kısmında akson ve miyelin kılıf yapılarının dejenere olduğu izlenmektedir (ok başları). Sinir liflerinin aralarında makrofaj (M) ve mast hücresi (Mh) dikkati çekmektedir.
28
ŞEKİL 6: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin Schwann hücreleri (Sh) tarafından sarılı oldukları, akson (a) ve miyelin kılıf (Mk) yapılarının normal olduğu izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) ve sitoplazması lipid damlacıkları (L) ve muhtemelen miyelin kılıf kalıntıları (x) içeren makrofajların (M) varlığı dikkati çekmektedir. Çekirdek (Ç).X10100.
29
ŞEKİL 7: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde Schwann hücrelerinin (Sh) normal yapıda oldukları görülmektedir. Miyelinli sinir liflerinde miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal olduğu, aksonların (a) bazılarında akson ile miyelin kılıf arasında boşlukların (b) oluştuğu dikkati çekmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) Schwann hücrelerinin (Sh) birden fazla aksonu çevrelediği izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında makrofaj (M), sitoplazmasında lipid damlacıkları (L) içeren fibroblast (Fb) görülmektedir. Çekirdek (Ç), kollajen lifler (Kol).X12100.
30
ŞEKİL 8: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) ileri derecede dejenere olduğu dikkati çekmektedir (oklar). Schwann hücrelerinde (Sh) çekirdekte (Ç) heterokromatin artışı, sitoplazmada vakuolizasyon (V) oluştuğu izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında kollajen liflerin (Kol) sıkıca bir araya geldikleri görülmektedir. X16100.
31
ŞEKİL 9: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin önemli bir kısmında miyelin kılıfın (Mk) akson (a) içerisine doğru invajine olduğu (ok başları) ve miyelin kılıf lamellerinin yer yer birbirinden ayrıldığı dikkati çekmektedir (oklar). Schwann hücresi (Sh), Fibroblast (Fb), kollajen lifler (Kol).X10100.
32
ŞEKİL 10: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin aralarında çekirdekleri (Ç) hiperkromatik hale dönüşmüş ve sitoplazmasında fagozom (f), lipid damlacıkları (L) ve vakuoller içeren (v) makrofajlar (M) görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında yoğun şekilde bir araya gelmiş kollajen lifler (Kol) izlenmektedir. Miyelinsiz sinir lifleri (ma), Schwann hücresi (Sh).X8100.
33
ŞEKİL 11: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir lifleri akson (a) ve miyelin kılıf (Mk) yapılarıyla normal olarak izlenmekle birlikte sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında karekteristik granülleriyle (gr) mast hücresinin (Mh) varlığı dikkati çekmektedir. Sinir liflerinin aralarında sıkıca bir araya gelmiş kollajen lifler (Kol) izlenmektedir. Miyelinsiz sinir lifleri (ma), Schwann hücresi (Sh), çekirdek (Ç).X12400.
34
4.1.3. NGF-β ile tedavi edilen grup
Siyatik sinir ezilmesi sonrası NGF-β verilen gruba ait sinirinin yarı ince
kesitlerinin ışık mikroskobik incelenmesinde, sinirin, miyelinli ve miyelinsiz sinir
liflerinden meydana geldiği gözlendi. Miyelinli sinir liflerinin çoğu alanlarda rejenere
oldukları ve akson ve miyelin kılıf yapıları ile birlikte normal görünümde oldukları
kaydedildi. Bununla beraber bazı miyelinli sinir liflerinde, akson etrafında yer alan
miyelin kılıfın normal yapısının bozulduğu, miyelin kılıf ve aksonun dejenere oldukları
gözlendi. Bu alanlara komşu fagositik hücrelerin, akson ve miyelin yıkıntılarını fagosite
ettikleri dikkati çekti. Makrofajlar, hiperkromatik bir çekirdek ve vakuoler görünümlü
sitoplazmaları ile ayırt edildi. Ayrıca mast hücreleri ve fibroblastların varlığı da izlendi.
Miyelinli sinir liflerinin yapılarının çoğu alanlarda genellikle normal olarak
değerlendirilmekle beraber, sağlam gruba göre, akson çapı ve miyelin kılıf
kalınlıklarında belirgin bir azalmanın olduğu ayırt edildi (Şekil 12). Siyatik sinir
ezilmesi sonrası NGF-β tedavisi uygulanan gruptan alınan sinir biyopsilerinin elektron
mikroskobik incelemelerinde, bazı alanlarda miyelinli sinir liflerinde hafif miyelin kılıf
bozuklukları, bazı aksonlarda yapısal değişiklikler, Schwann hücrelerinde sitoplazmik
vakuolizasyon izlenmekle birlikte (Şekil 13,14,15), çoğu alanlarda miyelinli, miyelinsiz
sinir liflerinin ve Schwann hücrelerinin genellikle normal yapılarını korudukları
gözlendi (Şekil 16,17). Dejenerasyonun belirgin olduğu alanlarda Schwann hücrelerinin
çekirdeklerinde heterokromatin artışı, sitoplazmada endoplazmik retikülüm
genişlemesine bağlı vakuolizasyon dikkati çekti (Şekil 14,15). Bazı alanlarda Schwann
hücrelerinin fagositik hücre özelliklerini kazanarak fagositoz yaptığı, hücrenin
çekirdeğinin heterokromatin artışına bağlı olarak piknotik hale geldiği,
sitoplazmalarında sekonder lizozomlar ve vakuollerin varlığı ayırt edilmekteydi (Şekil
13). Miyelinsiz aksonlar da Schwann hücresi ile sarılıydı. Miyelinsiz sinir liflerinde bir
Schwann hücresinin birden fazla aksonu aynı zamanda sarmış olduğu görüldü (Şekil
14,17). Miyelinli sinir liflerinde akson etrafında yer alan miyelin kılıfın bazı alanlarda
miyelin lamellerinde hafif ayrışma dışında (Şekil 13), genellikle normal yapıda
oldukları izlendi (Şekil 14,17). Miyelinli sinir liflerinde aksonların bazılarında yapısal
değişiklikler görülse de(Şekil 14), çoğu alanlarda aksonların normal yapıda oldukları,
aksoplazmada mitokondriyonların, nörotübül ve nörofilamanların yer aldığı görüldü
(Şekil 15,17). Dejenere miyelinli sinir liflerinin bulunduğu alanlara yakın yerleşimli
35
makrofajların varlığına bu grupta da rastlandı. Makrofajlarda çekirdekte heterokromatin
artışı, sitoplazmada lizozomal yapılar ve çeşitli büyüklüklerde vakuoller bulundu (Şekil
14). Sinir liflerinin aralarında fibroblastlar ile kollajen liflerden oluşan fibröz bağ
dokusu yer almaktaydı (Şekil 13-17).
36
ŞEKİL 12: NGF grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin çoğunlukla normal oldukları izlenmekle birlikte (oklar), bazı sinir liflerinde akson ve miyelin kılıfın dejenerasyona uğradığı dikkati çekmektedir (ok başı). Sinir liflerinin aralarında makrofajlar (M) ve mast hücreleri (Mh) görülmektedir. Epinöryum (Ep).
37
ŞEKİL 13: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde hafif miyelin değişiklikleri izlenmektedir (oklar). Aksonlar (a) normal olmakla birlikte bazı sinir liflerinde akson ile miyelin kılıf arasında boşluklar (b) oluştuğu dikkati çekmektedir. Miyelinli sinir liflerinin aralarında normal yapıda miyelinsiz sinir lifleri (ma), çekirdeği (Ç) piknotik hale dönüşmüş ve sitoplazmasında fagozomlar (f) içeren Schwann hücresinin (Sh) varlığı görülmektedir. Miyelin kılıf (Mk), kollajen lifler (Kol).X16100.
38
ŞEKİL 14: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Schwann hücrelerin (Sh) sitoplazmasında hafif vakuolizasyon (v) izlenmekle birlikte, miyelinli sinir lifleri, akson (a) ve miyelin kılıf (Mk) yapılarıyla normal olarak görülmektedir. Bazı sinir liflerinde akson yapısının bozulduğu dikkati çekmektedir (oklar). Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) bir Schwann hücresi birden fazla aksonu sarmış olarak izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında hiperkromatik çekirdeğe sahip sitoplazmalarında geniş vakuoller (v) ve fagozomlar (f) içeren makrofaj (M) görülmektedir. Kollajen lifler (Kol), fibroblast (Fb).X16100.
39
ŞEKİL 15: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında hafif miyelin kılıf hasarı (oklar) görülmekle beraber, sinir liflerinin çoğunda akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları izlenmektedir. Schwann hücresi (Sh) sitoplazmasında hafif vakuolizasyon (v) görülmekte, sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Miyelinsiz sinir lifleri (ma), Çekirdek (Ç), mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X10100.
40
ŞEKİL 16: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal yapılarını korudukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında sitoplazmasında lipid damlacıkları (L) bulunan bir fibroblast (Fb) ve kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Çekirdek (Ç), mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X8100.
41
ŞEKİL 17: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında hafif miyelin kılıf hasarı (oklar) izlenmekle beraber, sinir liflerinin çoğunda akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları görülmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) çekirdek (Ç) ve sitoplazmik özellikleriyle normal yapıda oldukları, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (ok başları). Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir. X10100.
42
4.1.4. Betametazon Grubu
Siyatik sinir ezilmesi sonrası betametazon verilen gruba ait sinirinin yarı ince
kesitlerinin ışık mikroskobik incelenmesinde, sinirin dıştan fibröz bir bağ dokudan
oluşan epinöryum ile çevrili olduğu gözlendi. Siyatik sinirin, miyelinli ve miyelinsiz
sinir liflerinden meydana geldiği, miyelinli sinir liflerinin akson etrafında bir miyelin
kılıf içerdikleri ayırt edildi. Bu grupta da, miyelinli sinir liflerinin rejenerasyonunun
oldukça belirgin olduğu dikkati çekici bulundu. Bununla birlikte, bazı alanlarda
miyelinli sinir liflerinde akson ve miyelin kılıfın dejenere oldukları görüldü. Dejenere
alanlarda, hiperkromatik oval veya yuvarlak çekirdeğe sahip, sitoplazmasında fagozom
ve lipid damlacıkları ile karakterize makrofajların varlığı da ilgi çekiciydi. Ayrıca mast
hücreleri ve fibroblastlar da izlendi. Miyelinli sinir lifleri, akson ve miyelin kılıf yapıları
ile birlikte normal olarak değerlendirilmekle beraber, akson çapı ve miyelin kılıf
kalınlıklarında sağlam gruba göre belirgin bir azalma, bu grupta da izlendi (Şekil 18).
Betametazonla tedavi edilen gruptan alınan sinir biyopsisi örneklerinin elektron
mikroskobik incelenmesinde, bazı alanlarda Schwann hücrelerinde çekirdekte
heterokromatin yoğunlaşması, sitoplazmada endoplazmik retikulumda genişleme,
miyelinli sinir liflerinde kısmi miyelin kılıf hasarları, interstisyumda makrofajlar
izlenmekle birlikte (Şekil19), çoğu alanlarda Schwann hücreleri ve sinir liflerinin
normal yapılarını korudukları dikkati çekti (Şekil 20,21). Dejenerasyonun belirgin
olduğu alanlarda miyelinli sinir liflerinde miyelin kılıfın aşırı şekilde kalınlaştığı ve
akson içerisine doğru invajinasyon oluşturduğu, aksonun ileri derecede büzüştüğü ve
akson içerisindeki organellerin yapılarının dejenarasyona uğradığı görüldü (Şekil 19).
Bununla beraber özellikle küçük çaplı sinir liflerinde histolojik yapının nispeten
korunduğu gözlendi. Miyelinli sinir liflerinde, aksonun bir Schwann hücresi ile sarılı
olduğu, Schwann hücresinin dıştan bir bazal lamina ile çevrelendiği görüldü. Miyelinli
sinir liflerinde, çoğu alanlarda, miyelin lamellerinin normal yapılarını korudukları
izlendi. Akson içerisinde, genellikle normal yapıda izlenen agranüler endoplazmik
retikülüm sisternaları, mitokondriyonlar, nörotübüller ve nörofilamanlar bulunmaktaydı.
Miyelinsiz sinir lifleri genellikle tüm alanlarda normal yapıdaydı. Miyelinsiz sinir
liflerinde bir Schwann hücresinin pek çok aksonu birlikte sardığı ve sinir liflerinin
aralarında farklı yönlerde seyreden kollajen liflerin bulunduğu görüldü (Şekil 20,21).
Ayrıca interstisyumda çekirdeklerinde heterokromatin artışı, sitoplazmasında bol
43
miktarda sekonder lizozomların yer aldığı makrofajların varlığına da sıklıkla rastlandı.
Makrofajların sitoplazmalarında muhtemelen fagosite edilen miyelin kılıf artıklarının
sindirilmesinden kaynaklanan lipid benzeri yapılar bulundu (Şekil 19).
44
ŞEKİL 18: Betametazon grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskopik görünümü. Siyatik sinirin miyelinli sinir liflerini (oklar) içerdiği izlenmektedir. Miyelinli sinir liflerinin bazılarında akson ve miyelin kılıfı içeren dejeneratif değişikliklerin (ok başları) varlığı görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında makrofajlar (M) gözlenmektedir.
45
ŞEKİL 19: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında miyelin kılıfta (Mk) hafiften orta dereceye kadar değişen miyelin kılıf hasarı (oklar) izlenmektedir. Schwann hücrelerinde çekirdekte (Ç) heterokromatin artışı, sitoplazmada endoplazmik retikülüm sisternalarında (er) genişlemeler görülmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) bir Schwann hücresi birden fazla aksonu aynı anda sarmaktadır. Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında, içerikleri kısmen veya tamamen ortadan kaldırılmış fagozomlar ile lizozom içeren makrofaj (M) gözlenmektedir. Ortamda ayrıca kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Çekirdek (Ç), mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X10100.
46
ŞEKİL 20: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal yapılarını korudukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (oklar). Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X12400.
47
ŞEKİL 21: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) çekirdek (Ç) ve sitoplazmik öezellikleriyle normal olduğu, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (oklar). Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X12400.
48
4.1.5. NGF-β + Betametazon Grubu
NGF ve Betametazon’un birlikte uygulandığı gruba ait siyatik sinirin yarı ince
kesitlerinin ışık mikroskobik incelenmesinde, sinirin dıştan epinöryum adı verilen kalın
fibröz bir bağ dokusu ile çevrili olduğu izlendi. Epinöryumun altında sinir fasiküllerinin
daha ince bir bağ dokusu olan perinöryumla çevrili olduğu görüldü. Perinöryumdan
kaynaklanan daha ince bağ dokusu bölmelerinin tek tek sinir liflerini çevrelediği
gözlenmekteydi. Endonöryum olarak adlandırılan bu ince bağ dokusu içerisinde
fibroblast ve nörilemmaya ait Schwann hücreleri görülmekteydi. Schwann hücreleri,
oval ya da yuvarlak çekirdekleri ile ayırt edildi. Aksonlar, Schwann hücrelerinin
sitoplazmasına gömülmüş halde, soluk renkli olarak izlendi. Miyelinli sinir liflerinde,
Schwann hücreleri tarafından yapılan ve aksonu çevreleyen miyelin kılıf belirgin olarak
izlendi. Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında fagozomlar bulunan makrofajların
varlığı gözlendi. Kombine tedavi uygulanan bu grupta da sinir liflerinin rejenerasyonu
belirgin olarak görüldü. Bunun dışında, miyelinli sinir liflerinin aralarında, miyelinsiz
sinir lifleri, bağ dokusu hücreleri ve kan damarları da ayırt edildi (Şekil 22). Siyatik
sinir zedelenmesinden sonra betametazon ve NGF-β’nın kombine tedavilerinin
uygulandığı grubun elektron mikroskobisinde, her ne kadar bazı alanlarda Schwann
hücrelerinde heterokromatin artışı, bazı aksonlarda mitokondriyonlarda yapısal
bozukluklar, miyelinsiz aksonlarda harabiyet ve fagozom içeren makrofajlara rastlansa
da (Şekil 23,24), çoğu alanlarda sinir liflerinin akson ve miyelin kılıf yapıları ile birlikte
normale yakın görünümde oldukları görüldü (Şekil 25,26). Miyelinsiz sinir liflerinde
aksonların Schwann hücre sitoplazmasına gömülü olarak bulundukları ve genellikle
normal yapılarını korudukları izlendi.
Miyelinli sinir liflerinde Schwann hücrelerinin tek bir aksonu sardığı, akson
etrafında miyelin kılıf oluşturduğu görüldü. Schwann hücrelerinin oval veya yuvarlak
çekirdeğe sahip olduğu, sitoplazmasında mitokondriyonlar, endoplazmik retikülüm
sisternaları, lizozom ve ribozomlar içerdiği izlendi. Hücrelerin yapıları genellikle
normal olarak değerlendirildi (Şekil 24,26). Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında
fagosite edilen materyal içeren makrofajlara bu grupta da rastlandı. Makrofaj
sitoplazmalarında, lizozomlar, lipid damlacıkları ve fagozom artıkları bulundu (Şekil
49
23,24). Ayrıca ortamda çekirdek ve sitoplazmik özellikleriyle normal görünümde
izlenen fibroblastlar ve kollajen lifler de yer almaktaydı (Şekil 23, 26).
50
ŞEKİL 22: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskopik görünümü. Sinirin dıştan epinöryum (Ep) adı verilen fibröz bağ dokusuyla sarılı olduğu ve miyelinli (oklar) ve miyelinsiz liflerden oluştuğu izlenmektedir. Miyelinli sinir liflerinin bazılarında (ok başları), akson ve miyelin kılıfı içeren dejeneratif değişikliklerin varlığı görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında makrofajlar (M), kan damarları ve bağ dokusunun varlığı da gözlenmektedir.
51
ŞEKİL 23: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında akson (a) içerisinde mitokondriyonlarda (m) yapısal bozukluklar izlenmekle birlikte, miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal yapıda olduğu dikkati çekmektedir. Schwann hücrelerinde çekirdekte (Ç) heterokromatin artışı, sitoplazmada endoplazmik retikülüm sisternalarında (er) hafif genişlemeler görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında membranöz yapılar, lipid damlacıkları (L) içeren, bazı alanlarda ise fagozom (f) içeriğinin kısmi veya tamamen sindirildiği makrofajlar (M) izlenmektedir. Ortamda ayrıca fibroblast (Fb), kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Çekirdek (Ç), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X12400.
52
ŞEKİL 24: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında akson (a) içerisinde mitokondriyonlarda (m) yapısal bozukluklar izlenmektedir. Miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal yapıda olduğu görülmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinden (ma) bazılarında aksonal dejenerasyon (oklar) dikkati çekmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) bazılarında sitoplazmada vakuolizasyon (v) gözlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında, lipid damlacıkları (L) ve fagozom (f) içeren makrofajlar (M) izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X16100.
53
ŞEKİL 25: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (oklar). Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında lipid damlacıkları (L) ve fagozom (f) içeren makrofajlar (M) izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir. X16100.
54
ŞEKİL 26: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) çekirdek (Ç) ve sitoplazmik özellikleriyle normal yapıda oldukları, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (oklar). Sinir liflerinin aralarında fibroblastlar (Fb), kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir. X6300.
55
4.2.Biyokimya Bulguları
Malondialdehit (MDA) miktarı, lipid peroksidasyonu seviyesinin
değerlendirilmesinde önemli bir ölçüttür. Bütün gruplardan elde edilen malondialdehit
(MDA) seviyeleri şekil 27’de gösterilmiştir. Malondialdehit seviyesinin gruplar
arasında karşılaştırılmasında; sağlam grupta MDA seviyesi 2,98±0,32 iken, deney
kontrol grubunda; 8,3±083, NGF verilen grupta; 6,97±0,93, Betametazon verilen
grupta; 7,45±0,77 ve NGF+Betametazon grubunda; 4,72±0,55 olduğu belirlendi. Deney
kontrol grubunda, diğer gruplar ile karşılaştırıldığında, MDA seviyesinin anlamlı olarak
arttığı bulundu (p<0.05). NGF ve Betametazon grupları arasında fark önemsizdi.
NGF+Betametazon grubunun, deney kontrol grubu, yalnızca NGF ve yalnızca
Betametazon uygulanan gruplar ile karşılaştırıldığında, MDA seviyesinin anlamlı
olarak azaldığı (p< 0.05) dikkati çekti.
Şekil 27: Tüm gruplardan elde edilen malondialdehit (MDA) seviyeleri
MD
A (n
mol
/mL)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
NGF+BetametazonBetametazonNGFDeneykontrol
Sağlam
56
Superoksit dismutaz enzim (SOD) seviyeleri şekil 28’de gösterilmiştir.
Superoksit dismutaz enzim seviyesinin gruplar arası karşılaştırılmasında; sağlam grupta
SOD seviyesi; 2823±193, deney kontrol grubunda; 1163±150, NGF verilen grupta;
1657±214, Betametazon verilen grupta; 1749±239 ve NGF+Betametazon grubunda ise
2143±117 olduğu bulundu. Deney kontrol grubuna ait SOD seviyesi diğer gruplar ile
karşılaştırıldığında, SOD seviyesinin anlamlı olarak azaldığı saptandı (p< 0.05). NGF ve
Betametazon grupları arasındaki fark önemsizdi. NGF+Betametazon grubunun, deney
kontrol grubu ve yalnızca NGF ve Betametazon uygulanan gruplar ile
karşılaştırıldığında, SOD seviyesinin anlamlı olarak artış gösterdiği ilgi çekiciydi
(p< 0.05).
Şekil 28: Tüm gruplardan elde edilen superoksit dismutaz aktiviteleri
SOD
(U/g
pro
tein
)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
NGF+BetametazonBetametazon
NGFDeney Kontrol
Sağlam
57
4.3. Footprint Analiz Bulguları
Footprint analiz sonuçları şekil 29’da görülmektedir. Analiz sonuçlarına göre, 7.
ve 14. günlerde gruplar arasında anlamlı bir fonksiyonel iyileşmenin oluşmadığı
görülmektedir. 21. günde, fonksiyonel iyileşmenin oluşmaya başladığı, 28 ve 35.
günlerde iyileşmenin belirgin olarak arttığı dikkati çekmektedir. 21.günde deney
kontrol, NGF ve Betametazon grupları arasında, anlamlı bir fark meydana gelmemekle
birlikte, NGF + Betametazon grubunda anlamlı bir fonksiyonel iyileşmenin oluştuğu, bu
iyileşmenin 28. ve 35. günlerde daha belirgin olduğu izlenmektedir. 35.günde; deney
kontrol ve Betametazon gruplarında fonksiyonel iyileşme yüzdeleri birbirine yakın
olmakla birlikte, NGF grubunda, deney kontrol ve Betametazon gruplarına göre anlamlı
bir iyileşme oluştu. NGF + Betametazon grubunda diğer gruplara göre anlamlı bir
fonksiyonel iyileşmenin oluşması ilgi çekiciydi. Bununla beraber, normal TS oranı 100
kabul edildiğinde, 35 günlük süre içinde grupların hiçbirinde tam bir fonksiyonel
iyileşmenin meydana gelmediği gözlendi.
0102030405060708090
100
7 14 21 28 35Günler
1-5
Parm
ak a
ralığ
ı (%
kon
trol)
Deney kontrolNGF
BetametazonKombine
Şekil 29: Tüm gruplardan elde edilen footprint analiz sonuçları
58
4.4. Histomorfometrik Bulgular
Gruplar arasında miyelinli sinir liflerinin sayıları Şekil 30’da verilmiştir.
Ortalama miyelinli sinir lifi sayıları dikkate alındığında; sağlam grupta ortalama
miyelinli sinir lifi sayısı; 7671±211, deney kontrol grubunda; 4360±349, NGF
grubunda; 5245±375, Betametazon grubunda; 5025±442 ve NGF+Betametazon
grubunda; 6079±513 olarak bulundu. NGF ve Betametazon grupları karşılaştırıldığında,
NGF grubunda miyelinli sinir lifi sayısı yüksek olmakla birlikte iki grup arasındaki fark
anlamlı değildi (p> 0.05). Buna karşın, NGF+Betametazon grubunda miyelinli sinir lifi
sayısının, deney kontrol grubu ile tek başına NGF ve Betametazon uygulanan gruplara
göre anlamlı olarak artış gösterdiği belirlendi (p< 0.05).
Şekil 30:Tüm gruplarda ortalama miyelinli sinir lifi sayıları
NGF+BetametazonBetametazon NGFDeneykontrol
Sağlam
M
iyel
inli
sini
r lifi
say
ısı (μm
)
10000
8000
6000
4000
2000
59
Gruplardan elde edilen akson çapları Şekil 31’de verilmiştir. Ortalama akson
çapları dikkate alındığında; sağlam grupta ortalama akson çapı; 9.3 ± 1.5, deney kontrol
grubunda; 5.5 ± 2.3, NGF grubunda; 5.8 ±1.8, Betametazon grubunda; 5.8 ± 2.3 ve
NGF + Betametazon grubunda; 6.8 ± 2.4 olarak bulundu. Sağlam grupla deney kontrol
grubu karşılaştırıldığında, deney kontrol grubunda akson çapının anlamlı olarak azaldığı
dikkati çekti (p< 0.05). NGF ve Betametazon grupları karşılaştırıldığında, Betametazon
grubunda akson çapı bir miktar yüksek olmakla birlikte iki grup arasındaki fark anlamlı
değildi (p> 0.05). Ayrıca, NGF + Betametazon grubunda akson çapının, deney kontrol
grubu ile tek başına NGF ve Betametazon uygulanan gruplara göre yüksek olmakla
birlikte, aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p> 0.05).
Şekil 31: Tüm gruplarda ortalama akson çapları
NGF+BetametazonBetametazonNGFDeney
kontrolSağlam
Aks
on ç
apı (μm
)
12.00
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
60
Gruplardan elde edilen miyelin kılıf kalınlıkları Şekil 32’de verilmiştir.
Ortalama miyelin kılıf kalınlıkları dikkate alındığında; sağlam grupta ortalama miyelin
kılıf kalınlığı; 1.67 ± 0.54, deney kontrol grubunda; 0.69 ± 0.28, NGF grubunda; 0.83 ±
0.25, Betametazon grubunda; 0.72 ± 0.31 ve NGF + Betametazon grubunda ise 1.04 ±
0.29 olarak bulundu. Sağlam grupla deney kontrol grubu karşılaştırıldığında, miyelin
kılıf kalınlığının deney kontrol grubunda anlamlı olarak azaldığı dikkati çekti (p< 0.05).
NGF ve Betametazon grupları karşılaştırıldığında, NGF grubunda miyelin kılıf kalınlığı
daha yüksek olmakla birlikte, iki grup arasındaki fark anlamlı değildi (p> 0.05). Ayrıca,
NGF + Betametazon grubunda miyelin kılıf kalınlığının, deney kontrol grubu ile tek
başına NGF ve Betametazon uygulanan gruplara göre yüksek olmakla birlikte, farkın
istatistiksel olarak anlamlı olmadığı dikkati çekti (p> 0.05).
Şekil 32: Tüm gruplarda ortalama miyelin kılıf kalınlıkları
NGF+BetametazonBetametazonNGFDeney
kontrolSağlam
Miy
elin
kılı
f kal
inlığ
ı (μm
)
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
61
5. TARTIŞMA
Deneysel sıçan siyatik sinir ezilmesi modelinde, sinir büyüme faktörü (NGF) ve
betametazon tedavisinin etkinliğinin araştırıldığı bu çalışmada, yaralanma sonrası
NGF+betametazon kombine tedavi uygulamasının siyatik sinirde, sinir liflerinin
rejenerasyonu, akson çapı ve miyelin kılıf kalınlığında artışa neden olduğu, lipid
peroksidasyonunu azalttığı, SOD aktivitesini anlamlı olarak yükselttiği ve motor
fonksiyonlarda iyileşmeyi sağladığı bulundu.
Sıçan siyatik sinir modeli, sinir yaralanması sonrası fonksiyonel değişikliklerin
incelenmesi, farklı cerrahi yöntemler ve medikal tedavilerin etkinliğinin
araştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır39. Bunun yanında, periferik sinir
araştırmalarında sıçan siyatik sinir ezilme yöntemi de sıklıkla kullanılan bir metoddur.
Sinir ezilmesinde farklı tekniklerin kullanılması ve değerlendirme yöntemlerinin
farklılık göstermesi, karşılaştırmalarda önemli güçlükleri ortaya çıkarmaktadır40. Sinir
rejenerasyonunun ölçülmesi, periferik sinir araştırmalarında önemli problemlerden
birisidir34,36. Günümüzde periferik sinir rejenerasyonunun değerlendirilmesinde,
histolojik, morfometrik, elektrofizyolojik yöntemler ve footprint analizlerinin birlikte
korele edilmesinin önemi vurgulanmıştır12. Sunulan çalışmada, sinir ezilmesi sonrası
uygulanan tedavi yöntemlerinin etkinliği, histolojik, ultrastrüktürel ve histomorfometrik
yöntemler yanında, footprint analizi ve biyokimyasal analizler ile birlikte
değerlendirilmiştir. Sinir yaralanmaları sonucunda oluşan travma ve iskeminin primer
etkileri yanında ortaya çıkan ödem ve enflamatuvar reaksiyonların da hücre ve dokular
üzerinde ciddi yapısal değişikliklere neden olabileceği yaygın olarak kabul
edilmektedir3,6,7. Dolayısıyla, sinir rejenerasyonunun değerlendirilmesi ve olası
nedenlerinin araştırılmasında, lipid peroksidasyonu41 superoksit anyonların artışı, ödem
ve enflamatuvar reaksiyonların meydana gelmesi7,17 primer doku hasarı yanında
sekonder doku hasarlarına neden olmaktadır.
Çalışmamızda lipid peroksidasyonunun önemli bir göstergesi olan
malondialdehit (MDA) seviyesinin, deney kontrol grubunda anlamlı olarak arttığı,
NGF+Betametazon kombine tedavi grubunda anlamlı olarak azaldığı dikkati
çekmektedir (Şekil 27). MDA seviyesinin tek başına NGF ve betametazon tedavisi
uygulanan gruplarda azaldığı görülmekle birlikte, gruplar arasındaki fark istatistiksel
62
olarak anlamsız olarak değerlendirildi. Periferik sinir ezilmesi sırasında travma ve kısa
süreli iskeminin etkisi ile miyelin kılıf yapısında bozulma, miyelin lamellerinin
birbirlerinden ayrılması, akson zarı ve organellerde yapısal değişikliklerin meydana
geldiği bilinmektedir. Sinir dokusunda, miyelin kılıf lamellerinin lipid içeriğinden
zengin olması ve yaralanma sonrası ortamda superoksit anyonlar gibi oksidatif ajanların
ortaya çıkması, dokuda lipid peroksidasyonuna neden olacağı ve buna bağlı olarak da
sinir liflerinin yapılarının bozulacağı açıktır. Gerçekten de sinir yaralanmasını takiben
makrofajların bölgeye göç ettikleri ve şiddetli yaralanmalarda, enflamatuvar
reaksiyonların meydana geldiği, buna bağlı olarak da hücresel yapıların bozulmasına
neden oldukları bilinmektedir3,6,7. Çalışmamızda yalnızca serum fizyolojik verilen
deney kontrol grubuna ait sinir kesitlerinin ışık mikroskobik incelenmesinde sinirlerin
miyelin kılıf yapılarının çoğu alanlarda dejenere oldukları, ortamda makrofajların artış
gösterdiği ve makrofaj sitoplazmalarında miyelin kılıf artıklarının fagosite edildikleri
izlenmektedir (Şekil 5). Elektron mikroskopik incelemelerde de miyelin kılıf yapısında
bozukluklar, akson yapısında değişiklikler, makrofaj infiltrasyonu, aktif fibroblastlar ve
kollajen lifleri içeren yoğun fibröz bağ dokusunun varlığı dikkati çekmektedir (Şekil
7,8,9,10). Ayrıca ortamda çok sayıda karakteristik sitoplazmik granüllere sahip mast
hücrelerinin de bulunması, sinir yaralanması sonucunda ortamda enflamatuvar
reaksiyonların meydana geldiğini göstermektedir. Bu reaksiyonlara bağlı olarak
membran yapılarının bozulabileceği ve lipid peroksidasyonunun artacağı söylenebilir.
Nitekim sinir yaralanması sonrası, ortamda endonöral makrofajlar ve Schwann
hücrelerinin miyelin kılıf artıkları ve aksonal kalıntıları fagosite etmeye başladıkları,
daha sonra da periferik kan kökenli makrofajların bölgeye göç ederek reaksiyonlara
katıldıkları ve dejenerasyona uğrayan yapıları ortadan kaldırdıkları rapor edilmiştir3.
Sinir yaralanması sonrası makrofajların ortama göç etmeleri ve fagositoz yapmaları
normal fonksiyonel bir süreç olarak kabul edilmektedir3,6,7. Bununla birlikte aşırı
enflamatuvar reaksiyonların oluşumu, yoğun fibröz bağ dokusunun meydana gelmesi,
sinir rejenerasyonuna zarar vermekte ve çoğunlukla da skar dokusunun gelişimine
neden olmaktadır. Atkinson et al42 skar dokusunun travma ve cerrahi yaralanmalar
sırasında oldukça sık rastlanan bir problem olduğunu, bu oluşumun rejenerasyon
sırasında akson filizleri için mekanik bir bariyer olabileceğini rapor etmişlerdir.
Yaralanma sonrası, enflamatuvar reaksiyonların azaltılmasına paralel olarak, skar
63
dokusunun da azaltılması sinir iyileşmesinde önemli hedeflerden birisini
oluşturmaktadır. Bu amaçla, yaralanma sonrası glukokortikoidler43 ve nonsteroid
antienflamatuvar ilaçların44 kullanımının yararlı olabileceği bildirilmiştir. Sunulan
çalışmada ezilme tipi yaralanma uygulanan siyatik sinirde glukokortikoid türevi olan
betametazon, perioperatif olarak 24 saat süreyle verildi. Gerçekten de bu grupta ışık ve
elektron mikroskobik bulguların deney kontrol grubuna göre daha iyi durumda olması,
lipid peroksidasyonunun nisbeten azalması ilgi çekici bulundu (Şekil 18,19,20). Sinir
yaralanmasından hemen sonra uygulanan steroid tedavisi muhtemelen enflamasyonu
azaltmakta ve buna bağlı olarak meydana gelen sekonder doku hasarlarının oluşumunu
engellemektedir. Nitekim Becker et al45 lokal glukokortikoid uygulamasının periferik
sinir yaralanmasında fibroblast sayısını ve dolayısıyla da skar dokusu oluşumunu
azalttığını rapor etmişlerdir. Araştırmacılar, glukokortikoidlerin bu yolla nöroma
oluşumunu engellediklerini, ayrıca Schwann hücrelerini aktive ederek miyelin kılıf
yapımını uyardıklarını ve aksonal filizlenmeyi de arttırarak rejenerasyonu
desteklediklerini kaydetmişlerdir. Sunulan çalışmada deney kontrol grubunda
yaralanmayı takiben ortamda çok sayıda aktif fibroblastın ve yoğun kollajen liflerin
bulunduğu (Şekil 10,11), betametazon verilen gruplarda fibröz bağ dokusu oluşumunun
nisbeten normale yakın olduğu izlenmektedir (Şekil 21).
Yaralanma sonrası ortamda meydana gelen enflamatuvar reaksiyonlara bağlı
olarak, çok miktarda superoksit anyonlarının ortaya çıktığı ve bu anyonların özellikle
mitokondriyonlar başta olmak üzere, hücresel yapılar üzerinde dejeneratif etkilere neden
oldukları rapor edilmiştir46. Superoksit dismutaz, doğal antioksidan savunma sisteminde
yer alan ve superoksit anyonların ortamdan uzaklaştırılmasını sağlayan enzimlerden
birisidir. Çalışmamızda siyatik sinir yaralanması sonrası SOD aktivitesinin, deney
kontrol grubunda belirgin olarak azaldığı, betametazon grubunda artış gösterdiği,
NGF+betametazon tedavi grubunda SOD aktivitesinin anlamlı olarak arttığı dikkati
çekmektedir (Şekil 28). Sinir yaralanması sonucunda ortamda meydana gelen
enflamatuvar reaksiyonlara bağlı olarak superoksit anyonların artış göstermesi, buna
bağlı olarak membranların zarar görmesi sonucu SOD aktivitesinin azalması, serbest
oksijen radikallerinin oksidatif hasarlarını arttıracaktır. Nitekim betametazon ve
NGF+Betametazon gruplarında, SOD aktivitesinin deney kontrol grubuna göre artış
göstermesi, betametazonun antienflamatuvar etkisinin bir sonucu olarak
64
değerlendirilebilir. Betametazon ve NGF+Betametazon gruplarında, MDA seviyesinin
de azalması ve sinir liflerinin yapılarının nisbeten korunmuş olması (Şekil 27) bu
görüşümüzü destekler niteliktedir.
Periferik sinir yaralanmasında sinir lifleri ve Schwann hücrelerinin primer hedef
oldukları bilinmektedir3. Yaralanma sonrası distal segmentte, akson ve miyelin kılıfın
dejenerasyonuna bağlı olarak akson fonksiyonu bozulmaktadır. Akson fonksiyonunun
yeniden kazanılması, proksimal uçtan yeni gelişen akson filizlerinin oluşması ve
effektör hücrelere bağlanması ile sağlanmaktadır. Sunulan çalışmada sinir yaralanması
sonrası uygulanan NGF ve betametazon tedavisinin motor fonksiyonel iyileşme üzerine
etkisini değerlendirmek üzere, yaralanma sonrası, 7, 14, 28 ve 35.günlerde footprint
analizi yapıldı. Motor fonksiyonel iyileşmenin önemli bir göstergesi olan footprint
analiz22 sonuçları değerlendirildiğinde, yaralanma sonrası 7. ve 14. günlerde gruplar
arasında anlamlı bir fonksiyonel iyileşmenin oluşmadığı görülmektedir. 21. günde,
fonksiyonel iyileşmenin oluşmaya başladığı, 28 ve 35. günlerde ise iyileşmenin belirgin
olduğu dikkati çekmektedir (Şekil 29). Yaralanma sonrası 21.günde, deney kontrol,
NGF ve betametazon grupları arasında, motor fonksiyonel iyileşmede anlamlı bir fark
meydana gelmemekle birlikte, NGF + Betametazon grubunda anlamlı bir iyileşmenin
oluştuğu, bu iyileşmenin 28. ve 35. günlerde daha belirgin olduğu dikkati çekmektedir.
Bunun yanında, 35.günde deney kontrol ve betametazon gruplarında fonksiyonel
iyileşme yüzdeleri birbirine yakın olmakla birlikte, NGF grubunda, deney kontrol ve
betametazon gruplarına göre anlamlı bir iyileşmenin oluştuğu görüldü. NGF +
Betametazon grubunda diğer gruplara göre belirgin bir fonksiyonel iyileşme meydana
gelmesine rağmen, 35 günlük süre içinde grupların hiçbirinde tam bir motor fonksiyonel
iyileşmenin oluşmadığı gözlenmektedir (Şekil 29).
Sinir yaralanması sonrasında, birinci haftada dejenere olan akson ve miyelin
kılıfların ortadan kaldırıldığı, Schwann hücrelerinin prolifere oldukları ve makrofajların
bölgeye göç ettikleri bilinmektedir2,3. Yaralanma sonrası ilk 2-3 hafta içerisinde
nörotropik faktörlerin ekspresyonları, yaralanmanın etkisiyle son derece
azalmaktadır4,20. Bu nedenle, çalışmamızda sinir rejenerasyonun uyarılması amacıyla
perioperatif bölgeye 2 hafta süreyle NGF enjeksiyonu yapıldı. NGF, ilk keşfedilen
nöronal büyüme faktörü olup, sinir yaralanmalarında üzerinde en çok çalışma yapılan
nörotropik faktörlerden birisidir20. NGF, klinikte, Alzheimer hastalığında ve nörotropik
65
keratitiste, kolinerjik dejenerasyonda, terminal nöronal filizlenmeyi uyarmada, korneal
sensiviteyi düzenleme ve epitelyal iyileşmeyi sağlamak amacıyla kullanılmaktadır.
NGF’nin in vitro ve in vivo olarak, sempatetik ve duyu nöronlarında rejenerasyonu
arttırdığı yaygın olarak kabul edilmektedir. Deneysel çalışmalarda motor nöronların,
düşük affiniteli NGF reseptörleri ile ilişkili olduğunu, bu nedenle de, motor nöron
rejenerasyonu üzerine etkisinin oldukça az olduğu ileri sürülmüştür. Bununla birlikte,
son yıllarda yapılan deneysel çalışmalarda, NGF’nin motor nöron rejenerasyonu üzerine
de olumlu etkilerinin olduğu kabul edilmiştir. Bununla birlikte, NGF’nin sinir
rejenerasyonunda olumlu etkilerinin olduğu pek çok araştırmacı tarafından kabul edilse
de, NGF’nin rejenerasyondaki bu etkilerinin nasıl gerçekleştirdiği hala tam olarak
açıklanamamıştır12.
Çalışmamızda, NGF verilen grupta lipid peroksidasyonunun azaldığı, SOD
düzeyinin yükseldiği (Şekil 28), miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinin yapılarının
nisbeten normale yakın oldukları, sinir rejenerasyonunun da, deney kontrol grubuna
göre daha iyi olduğu belirlendi (Şekil 12,15,16) Bunun yanında, NGF verilen grupta,
miyelinli sinir lifi sayıları, akson çapları ve miyelin kılıf kalınlıkları dikkate alındığında,
deney kontrol grubuna göre anlamlı bir artışın meydana geldiği dikkati çekmektedir
(Şekil 30,31,32). Gravannis ve arkadaşları12, sıçan siyatik sinirinde kesilme tipi
yaralanma sonrası, iç-dış ven graftı uyguladıkları deneysel çalışmalarında, NGF verilen
gruplarda, sinir rejenerasyonun ve motor fonksiyonel iyileşmenin daha fazla
gerçekleştiğini, akson çapı, miyelin kılıf kalınlığı ve miyelinli sinir lifleri sayılarının
kontrol gruplarına göre artış gösterdiğini rapor etmişlerdir.
Sinir yaralanmasını takiben, başlıca yaralı bölgenin distalinde, aksonlardan ve
Schwann hücrelerinden NGF’nin salgılandığı, üretilen NGF’nin sinir terminallerinden
alınarak, retrograd aksonal iletimle nöron perikaryonuna iletildiği ve böylece akson
rejenerasyonunun uyarıldığı yaygın olarak kabul edilmektedir14,20. Periferik sinir
rejenerasyonunda aksonun dışında, Schwann hücrelerinin de önemli rollere sahip
olduğu düşünülmektedir. Nitekim aksonal yaralanma sonucunda, Schwann hücrelerinde
NGF reseptörlerinin artış gösterdiği yapılan çalışmalarda rapor edilmiştir2. Yaralanma
sonucu, Schwann hücrelerinin hücre yapışma moleküllerini sentezledikleri, bu yolla
aksonal oryantasyon ve rejenerasyonu kolaylaştırdıkları kaydedilmiştir12. NGF
konsantrasyonunun yaralanmadan sonra oldukça azaldığı yaygın olarak kabul
66
edilmektedir12,20. Çalışmamızda bunu kompanse etmek amacıyla sıçanlara 2 hafta
süreyle perioperatif olarak eksojen NGF verildi. NGF uygulanan gruplarda sinir lifleri
ve hücresel yapının nispeten korunmuş olması (Şekil 16,17), fonksiyonel iyileşmenin
deney kontrol grubuna göre daha fazla olması (Şekil 29), muhtemelen NGF’nin uyarıcı
etkisiyle yaralı bölgede Schwann hücrelerinin prolifere oldukları ve aksonal
rejenerasyonu sağladıkları ileri sürülebilir.
Schwann hücrelerinin rejenerasyon sırasında, akson filizlerinin effektör hücre ve
dokulara ulaşmasında rehberlik ettikleri bilinmektedir4. Bununla birlikte, rejenere
aksonların doğru hücre bandlarına ulaşmalarının mekanizması hala tam olarak
bilinmemektedir14,20. Schwann hücrelerinin bazal laminasının rehber yol oluşumunda
önemli bir role sahip olduğu, muhtemelen NGF’nin uyarıcı etkisiyle hücre
proliferasyonunun oluştuğu, bu yolla da fonksiyonel iyileşme üzerine etkili olduğu
düşünülmektedir.
Sıçan siyatik sinirinde ezilme tipi yaralanmadan sonra NGF ve betametazon
kombinasyonunun etkilerinin incelendiği bu çalışma, literatür bilgilerine göre ilk defa
yapılmaktadır. Steroidlerin, antienflamatuvar ve antiödematöz etkileriyle, NGF’nin
akson rejenerasyonu üzerine uyarıcı etkilerinin birlikte değerlendirildiği,
NGF+Betametazon kombine tedavi grubunda, siyatik sinirin ışık mikroskobik (Şekil
22), ultrastrüktürel (Şekil 23,24,25) ve histomorfometrik bulgularının (Şekil 30,31,32),
bu maddelerin tek başına uygulandığı gruplar ve deney kontrol grubu ile
karşılaştırılmasında, kombine tedavinin, sinir iyileşmesinde anlamlı olarak etkili olduğu
bulundu. Ayrıca, kombine grupta, lipid peroksidasyonunun azaldığı (Şekil 27), SOD
enzim seviyesinin yükseldiği (Şekil 28), motor fonksiyonel iyileşmenin de anlamlı
olarak artış gösterdiği (Şekil 29) dikkati çekti.
Betametazonun, antienflamatuvar ve antiödematöz etkileri ile yaralı bölgede
sinir rejenerasyonuna engel olabilecek fibrozis ve ödemi azalttığı, lipid
peroksidasyonunu engellediği, NGF’nin de uyarıcı etkisiyle, sinir rejenerasyonunu
arttırdığını, böylece her iki maddenin sinerjik etkisiyle, kombine grupta gözlenen
verilerin oluştuğu söylenebilir. Gerçektende Li et al. sıçanlarda spinal kord yaralanması
sonrası nörotropik bir madde olan BDNF ve steroid madde metilprednisolone
kombinasyonunun etkilerini inceledikleri çalışmalarında, kombine tedavinin spinal
korda, periferik kan kökenli enflamatuvar hücrelerin infiltrasyonunun azalttığını,
67
aksonal miyelinizasyonu arttırdığını ve fonksiyonel iyileşmeyi hızlandırdığını rapor
etmişlerdir.
Periferik sinir yaralanması sonrası gelişen sinir rejenerasyonunun objektif
değerlendirmelerinden birisi de, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinin sayısal
dağılımları, oryantasyonları, akson çapları, ve miyelin kılıf kalınlıklarının
ölçülmesidir12,34,36. Çalışmamızda, ezilme tipi sinir yaralanmasını takiben 6 hafta sonra
elde edilen sinir kesitlerinde, miyelinli sinir lifi sayısı, akson çapları ve miyelin kılıf
kalınlıkları değerlendirildi (Şekil 30,31,32). Sağlam ve deney kontrol gruplarının tedavi
grupları ile karşılaştırılması yapıldığında, tedavi gruplarında, miyelinli sinir lifi sayısı,
akson çapı ve miyelin kılıf kalınlığının, deney kontrol grubuna göre artış gösterdiği
belirlendi. Bununla beraber, akson çapları deney kontrol grubuna göre bir miktar artış
göstermekle birlikte, farkın istatistiksel açıdan önemli olmadığı görüldü. Buna karşın,
NGF+Betametozon kombine tedavi grubunda miyelinli sinir lifi sayıları, akson çapları
ve miyelin kılıf kalınlıklarının anlamlı olarak arttığı bulundu (Şekil 30,31,32). Kombine
tedavinin etkisiyle, sinir rejenerasyonu için uygun ortamın yaratıldığını, nöronların ve
Schwann hücrelerinin uyarılması sonucu aksonların rejenere olduklarını, akson
sayılarının ve çaplarının arttığını ve rejenere aksonlar etrafında miyelin yapımının
uyarıldığını söylemek yanlış olmayacaktır.
Sinir yaralanmalarını takiben, kesi oluşmadığında veya kesi anastomozundan
sonra normal şartlarda da sinir rejenerasyonun meydana geldiği yaygın olarak kabul
edilmektedir2,3. Bu durumda, motor fonksiyonel iyileşmenin daha az oranda
gerçekleştiği, iyileşme sürecinin geciktiği, yaralı alanda skar dokusunun geliştiği ve
sıklıkla nöroma oluşumuna rastlandığı rapor edilmiştir42. Yaralanmış sinirde yapısal
değişikliklerin ortadan kaldırılması, normal yapının yeniden kazandırılması ve sonuçta
da fonksiyonel iyileşmenin gerçekleştirilmesi en önemli hedeftir. Bu amaçla, sinir
konduitleri6,12silikon kaplamalar17, çeşitli kimyasal maddeler44 ve nörotropik
maddeleri4,6,34,36,47,48 içeren medikal tedavilerin uygulanması ve geliştirilmesine yönelik
çalışmalar hala sürdürülmektedir.
Sonuç olarak, sıçanlarda ezilme tipi siyatik sinir yaralanması sonrası NGF,
betametazon ve NGF+betametazon kombine tedavisinin uygulandığı bu çalışmada,
NGF ve betametozon tedavilerinin ayrı ayrı uygulandığı gruplarda sinir
rejenerasyonunun meydana geldiği, NGF+betametazon kombine tedavisinin
68
uygulandığı grupta, lipid peroksidasyonunun azaldığı, SOD aktivitesinin arttığı, ayrıca
sinir rejenerasyonu, miyelin kılıf oluşumu ve anlamlı motor fonksiyonel iyileşmenin
gerçekleştiği bulundu. Betametazonun, antienflamatuvar ve antiödematöz etkisiyle,
yaralı bölgede sinir rejenerasyonuna engel olabilecek fibrozis ve ödemi azalttığı, lipid
peroksidasyonunu engellediği, NGF’nin de uyarıcı etkisiyle, sinir rejenerasyonunu
arttırdığı, böylece her iki maddenin birlikte etkisiyle, kombine tedavi uygulanan grupta
gözlenen iyileşmenin sağlandığı düşünüldü. Bu nedenle, NGF+betametazon
kombinasyonunun, periferik sinir yaralanmalarının medikal tedavisinde dikkate
alınabileceği sonucuna varıldı.
69
6. SONUÇLAR
Deneysel siyatik sinir yaralanmasında, sinir büyüme faktörü (NGF) ve
betametazon uygulamasının etkilerinin, footprint analizi, ışık, elektron mikroskopi,
histomorfometri ve biyokimyasal yöntemlerle araştırılmasının amaçlandığı bu çalışma
sonucunda;
1- Siyatik sinir ezilmesi sonrasında yalnızca serum fizyolojik verilen kontrol
grubunun ışık ve elektron mikroskobik incelenmesinde, miyelinli sinir liflerinde
akson ve miyelin kılıfta önemli yapısal değişikliklerin oluştuğu,
2- Deney kontrol grubunda, sağlam gruba göre MDA seviyesinin anlamlı olarak
yükseldiği, SOD aktivitesinin azaldığı,
3- Deney kontrol grubunda, miyelinli sinir lifi sayısı, akson çapı ve miyelin
kalınlığının sağlam gruba göre anlamlı olarak azaldığı,
4- Motor fonksiyonel iyileşmenin değerlendirildiği footprint analizi sonuçlarına
göre deney kontrol grubunda da kısmi iyileşmenin oluştuğu,
5- Yaralanma sonrası perioperatif olarak yalnızca NGF verilen grubun ışık ve
elektron mikroskobik değerlendirilmesinde, bazı alanlarda yapısal bozuklukların
varlığı izlenmekle birlikte, sinir liflerinin yapılarının deney kontrol grubuna göre
nisbeten normal olduğu,
6- Yalnızca NGF verilen grupta, deney kontrol grubuna göre, MDA seviyesinde
hafif azalma ve SOD aktivitesinde hafif artışın meydana geldiği,
7- Yalnızca NGF verilen grupta, deney kontrol grubuna göre, footprint analizinde,
35. günde bir miktar artış olmakla birlikte, farkın istatistiksel açıdan önemli
olmadığı,
8- Yaralanma sonrası perioperatif olarak yalnızca betametazon verilen grubun ışık
ve elektron mikroskobik incelenmesinde, sinir liflerinin bazılarında miyelin kılıf
hasarı, aksonal değişiklikler izlenmekle birlikte, görünümün daha çok yalnızca
NGF uygulanan gruba benzerlik gösterdiği,
9- Yalnızca betametazon verilen grupta, deney kontrol grubuna göre, MDA
seviyesinde azalma ve SOD aktivitesinde hafif artışın meydana geldiği,
70
10- Yalnızca betametazon verilen grupta, deney kontrol grubuna göre, footprint
analizinde, her nekadar, 28. günde bir miktar artış olmakla birlikte, farkın
istatistiksel açıdan önemli olmadığı,
11- Yalnızca NGF ve betametazon verilen gruplarda, MDA seviyeleri, SOD
aktiviteleri ve footprint analiz sonuçlarının birbirleriyle karşılaştırılmasında,
farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı,
12- Yalnızca NGF ve betametazon verilen gruplarda, miyelinli sinir sayısı, akson
çapı ve miyelin kılıf kalınlığında bazı küçük farklılıklar görülse de,
histomorfometrik sonuçlar arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı
olmadığı,
13- Yaralanma sonrası perioperatif olarak NGF+betametazon kombine tedavisi
uygulanan grubun ışık mikroskobik değerlendirilmesinde, sinir
rejenerasyonunun belirgin olduğu, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinin
yapılarının çoğunlukla normal olduğu,
14- NGF+Betametazon kombine tedavisi uygulanan grupta footprint analizi
incelendiğinde, deney kontrol, NGF ve betametazon gruplarına göre anlamlı
olarak motor fonksiyonel iyileşmenin gerçekleştiği,
15- NGF+Betametazon kombine tedavisi uygulanan grupta, deney kontrol, NGF ve
betametazon gruplarına göre anlamlı olarak, MDA seviyesinde azalma ve SOD
aktivitesinde artışın meydana geldiği dikkati çekti.
Bütün bu sonuçlar dikkate alındığında, betametazonun antienflamatuvar ve
antiödematöz etkisiyle, yaralı bölgede sinir rejenerasyonuna engel olabilecek fibrozis ve
ödemi azalttığı, lipid peroksidasyonunu engellediği, NGF’nin de uyarıcı etkisiyle, sinir
rejenerasyonunu arttırdığı, böylece her iki maddenin birlikte etkisiyle, kombine tedavi
uygulanan grupta gözlenen iyileşmenin sağlandığı düşünüldü. Bu nedenle,
NGF+betametazon kombinasyonunun, periferik sinir yaralanmalarının tedavisinde
dikkate alınabileceği sonucuna varıldı.
71
7. KAYNAKLAR
1. Robinson LR. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle & Nerve, 2000; 23: 863-873. 2. Burnett MG, Zager EL. Pathophysiology of peripheral nerve injury: a brief review. Neurosurg Focus, 2004; 16 (5): 1-7. 3. Stoll G, Müller HW. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathology, 1999; 9: 313-325. 4. Frostick SP, Yın Q and Kemp GJ. Schwann cells, neurotrophic factors, and peripheral nerve regeneration. Microsurgery, 1998; 18: 397-405. 5. Quan D, Bird S. Nerve conduction studies and electromyography in the evaluation of peripheral nerve injuries. Orthopaedic Journal, 1999; 12: 45-51. 6. Pagnotta A, Tos P, Fornaro M, Gigante A, Geuna S, Battiston B. Neurotrophins and their receptors in early axonal regeneration along muscle-vein-combined grafts. Microsurgery, 2002; 22: 300-303. 7. Hirata Kazuho and Kawabuchi Masaru. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during wallerian degeneration. Microscopy Research and Technique, 2002; 57:541-547. 8. Jones LL, Oidega M, Bunge MB and Tuszynski MH. Neurotrophic factors, cellular bridges and gene therapy for spinal cord injury. J Physiology, 2001; 533.1: 83-89. 9. Zochodne DW. The microenvironment of injured and regenerating peripheral nerves. Muscle Nerve Supplement, 2000; 9:33-38. 10. Ansselin AD, Fink T, Davey DF. An alternative to nerve grafts in peripheral nerve repair: Nerve guides seeded with adult Schwann cells. Acta Chururgica Austriaca , 1998; 147: 19-24. 11. Midha R, Munro CA., Dalton PD, Tator CH and Shoiched MS. Growth factor enhancement of peripheral nerve regeneration through a novel synthetic hydrogel tube. J Neurosurg, 2003; 99:555-565. 12. Gravvanis AI, Tsoutsos DA, Tagaris GA, Papalois AE, Patralexis CG, Iconomou TG, Panayotou PN, and Ioannovich JD. Beneficial effect of nerve growth factor-7S on peripheral nerve regeneration through inside-out vein grafts: an experimental study. Microsurgery, 2004; 24:408-415. 13. Sheng CY, Liang HC, Chuan TC, Hsin CT, Chiang CW, Li HC, Hsu YC. Peripheral nerve regeneration using silicone rubber chambers filled with collagen, laminin and fibronectin. Biomaterials 2000; 21: 1541-1547. 14. Makwana M, Raivich G. Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. FEBS Journal, 2005; 272: 2628-2638 15. Evans GRD. Challenges to nerve regeneration. Seminars in Surgical Oncology, 2000; 19: 312-318. 16. Gordon T, Sulaiman O, Boyd GJ. Experimental strategies to promote functional recovery after peripheral nerve injuries. J Peripheral Nervous System, 2003; 8: 236-250. 17. Al-Bishri A, Dahlin L, Sunzel B and Rosenquist J. Systemic betamethasone accelerates functional recovery after a crush injury to rat sciatic nerve. J Oral Maxillofac Surg, 2005; 63(7): 973-977.
72
18. Melcangi RC, Cavarretta IT, Ballabio M, Leonelli E, Scheone A, Azcoitia I, Magnaghi V. Peripheral nerves: a target for the action of neuroactive steroids. Brain Research, 2005; 48(2): 328-338. 19. Mendonca AC, Barbieri HC, Mazzer N. Directly applied low intensity direct electric current enhances peripheral nerve regeneration in rats. J Neuroscience Methods, 2003; 129:183-190. 20. Terenghi G. Peripheral nerve regeneration and neurotrophic factors. J Anat, 1999; 194: 1-14. 21. Funakoshi H, Risling M, Carlstedt T, Lendahl U, Tımmusk T, Metsis M, Yamamoto Y and Ibanez CF. Targeted expression of a multifunctional chimeric neurotrophin in the lesioned sciatic nerve accelerates regeneration of sensory and motor axons. Proc Natl Acad Sci, 1998; 95: 5269-5274. 22. Bervar M. Video analysis of standing-an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neuroscience Methods, 2000; 102:109-116. 23. De Medicanelli L, Freed WJ, Wyatt RJ. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology, 1982; 77: 634-643. 24. Varejao AS, Meek MF, Ferreira AJ, Cabrita AM. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat : walking track analysis. J Neuroscience Methods, 2001; 108: 1-9. 25. Ross MH, Pawlina W. Histology: A text and atlas. Baltimore, Philadelphia, 5th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2006. 26. Junqueira LC, Carneiro J. Basic Histology: Text and atlas. 10th ed, New York, LANGE Mc Graw- Hill, 2003. 27. Mirajullah M, Xinya S. Schwann cells: Leader of nervenkitt. J Ayub Med Coll Abbottabad, 2002; 14 (1): 30-33. 28. Fernandez E, Pallini R, Lauretti L, Scogna A. Neurosurgery of the peripheral nervous system: ınjuries, degeneration and regeneration of the peripheral nerves. Surg Neurol, 1997; 48: 446-447. 29. Stoll G, Jander S and Myers RR. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripheral Nervous System, 2002; 7: 13-27. 30. Patsalos PN, Bell ME, Wiggins RC. Pattern of myelin breakdown during sciatic nerve wallerian degeneration: reversal of the order of assembly. J Cell Biology , 1980; 187: 1-5. 31. Behnam-Rasouli M, Nikravesh MR, Mahdavi-Shahri N, and Tehranipour M. Post-Operative Time Effects after Sciatic Nerve Crush on the Number of Alpha Motoneurons, Using a Stereological Counting Method (Disector). Iran Biomed J, 2000; 4: 45-49. 32. Cunha MTR, Silva AL, Fenelon SB. Comparison of nerve graft integration after segmentar resection versus epineural burying in crushed rat sciatic nerves. Acta Cir Bras, 1997; 12 (4): 221-5 33. Boyd JG and Gordon T. Glial cell line-derived neurotrophic factor and brain-derived neurotrophic factor sustain the axonal regeneration of chronically axotomized motoneurons in vivo. Experimental Neurology, 2003; 183: 610-619. 34. Santos X, Rodrigo J, Hontanilla B and Bilboa G. Evaluation of peripheral nerve regeneration by nevre growth factor locally administered with a novel system. J Neuroscience Methods, 1998; 85 (1): 119-127. 35. Xu X, Yee WC, Hwang PYK., Yu H, Wan ACA, Gao S, Boon KL, Mao HQ, Leong Kam WL and Wang S. Peripheral nerve regeneration with sustained release of poly (phosphoester)
73
microencapsulated nevre growth factor within nerve guide conduits. Biomaterials, 2003; 24 (13): 2405-2412. 36. Lee AC, Yu VM, Lowe YB, Brenner MJ, Hunter DA, Mackinnon SE, Elbert-Sakiyama SE. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Experimental Neurology, 2003; 184 (1): 295-303. 37. Okhawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxidase in animal tissue by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 1979; 95:351. 38. Durak I, Yurtaslanlı Z, Canpolat O, Akyol O. A methodological approach to superoxide dismutase (SOD) activity assay based on inhibition of nitroblue tetrazolium (NBT) reduction. Clin Chim Acta, 1993; 214: 103-104. 39. Varejao AS, Melo-Pinto P, Meek MF, Filipe VM, Blulas-Cruz J. Methods for experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research, 2004; 26: 186-194. 40. Varejao AS, Cabrito AM, Meek MF, Blulas-Cruz J, Melo-Pinto P, Raimondo S, Geuna S, Giacobini- Roberchi MG. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma, 2004; 21: 1652-1670. 41. İldan F, Öner A, Polat S, İsbir T, Göcer İ, Kaya M, Karadayı A. Correlation of alterations on Na+-K+/Mg+2 ATP ase activity, lipid peroxidation and ultrastructural findings following experimental spinal cord injury with and without intravenous methylprednisolone treatment. Neurosurg Rev, 1995; 35-44. 42. Atkins S, Smith KG, Loescher AR, Boissonade FM, Ferguson MWJ, Robinson PP. The effect of antibodies to TGF-β1 and TGF-β2 at a site of sciatic nerve repair. J Peripheral Nervous System, 2006; 11:286-293. 43. Nasser RM, Chen LE, Seaber AV, Urbaniak JR. Protective effect of 21-aminosteroid pretreatment in peripheral nerve low-load crush injury in mature and immature rats. J Orthop Res, 1996; 14: 823-829. 44. Subbana PKT, Prosanna CG, Gunale BK, Tyapi MG. Acetyl salicylic acid augments functional recovery following sciatic nerve crush in mice. J Brachial Plexus Peripheral Nerve Injury, 2007; 2: 1-4. 45. Becker KW, Kienecker EW, Andrea I. Effect of locally applied corticoids on the morphology of peripheral nerves following neurotmesis and microsurgical suture. Neurochirurgia, 1987; 30: 161-167. 46. Lieven CJ, Hoegger MJ, Schliene CR, Lewin LA. Retinal ganglion cell axotomy induces an increase in intracellular superoxide anion. Invest Ophthalmol Vis, 2006; 47: 1477-1485. 47. Hirata A, Masaki T, Motoyoshi K and Kamakura K. Intrathecal administration of nerve growth factor delays GAP 43 expression and early phase regeneration of adult rat peripheral nerve. Brain Research, 2002; 944 (1-2): 146-156. 48. Li L, Xu Q, Wu Y, Hu W, Gu P, Fu Z. Combined therapy of methylprednisolone and brain derived neurotrophic factor promotes axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury in rats. Chin Med J, 2003; 116 (3): 414-418.
74
ÖZGEÇMİŞ
Leman Sencar, 1981 yılında Mersin’de doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini
Mersin’de tamamlayan Leman Sencar, 1999 yılında İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa
Tıp Fakültesi Tıbbi Biyolojik Bilimler Bölümünü kazandı ve 2003 yılında da mezun
oldu. 2004 yılında, Ç.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü Histoloji-Embriyoloji Anabilim
Dalı’nda Yüksek Lisans eğitimine başlayan Leman Sencar, 2006 yılında Histoloji-
Embriyoloji Anabilim Dalına Araştırma Görevlisi olarak atandı. Arş.Gör.Leman
Sencar, halen aynı Anabilim Dalında görevini sürdürmektedir.