Der schnelle Transfer einer Methode - waters.com · Transfer auf anderes LC System – Transfer einer etablierten Methode zwischen verschiedenen Geräten mit der gleichen oder „äquivalenten”

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Der schnelle Transfer einer Methode

Waters Pharma & Biopharmaceutical LC-MS Forum 20.06.2018 Eschborn

Waters GmbH Stefan Hübscher

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Einführung

Theorie zum Methodentransfer

Szenarien Zusammenfassung

Agenda


Warum Methodentransfer?


Arten des Methodentransfer

Transfer auf anderes LC System – Transfer einer etablierten Methode zwischen verschiedenen Geräten mit der

gleichen oder „äquivalenten” Säule

Anpassen der Methode – Bestimmte Parameter der Methode können (innerhalb gewisser Grenzen)

angepasst werden, um die Systemeignung für ein Verfahren zu erfüllen. – Gleichwertigkeit der Methode muß bestätigt werden

Wechsel der Methode – Signifikante Änderung der Methode, vollständige Validierung erforderlich


Herausforderung beim Methodentransfer

Arbeiten im regulierten Umfeld

System dwell volume (oder Gradientenverzögerungsvolumen) – Gradientenübertragung setzt gleiches Dwell Volumen und Mischverhalten

voraus – Kann Retentionszeit, Selektivität und Auflösung beeinflussen

Temperaturkontrolle und ähnliche Effekte

– Säulentemperatur und preheating – Thermische Effekte – Übertragbarkeit Weitere Charakteristika können Methodentransfer beeinflussen wie

z.B Gradientenformung, Detektionslimitation, Injektionsmodus etc.


Warum Methodentransfer Theorie zum Methodentransfer

– Transfer von HPLC auf UPLC – Transfer von System zu System

Szenarien

Zusammenfassung

Agenda


Die Van-Deemter-Kurve Bestimmung der optimalen Flussrate

Hei

gh

t Eq

uiv

alen

t to

Th

eore

tica

l Pla

te

Lineare Geschwindigkeit u (mm/s)

HET

P

Optimale lineare Geschwindigkeit

H

A-Term

B-Term

u H = c(dp)2u a(dp) b + +

A-Term B-Term C-Term

C-Term


A Term: Eddy Diffusion Unterschiedliche Flusswege durch die Säule

B Term: Molekulare/axiale Diffusion Diffusion der Bande (Funktion der Zeit)

C Term: Massentransferkinetik Wechselwirkungen mit der stationären Phase

Die drei Therme der van-Deemter Kurve

Große Effizienz durch kleine Partikel

Große Effizienz durch hohe Flußrate

Große Effizienz durch kleine Partikel und niedrige Flußrate


A Term: Eddy Diffusion Unterschiedliche Flusswege durch die Säule

Eddy ist klein wenn kleine Teilchen homogen gepackt sind. => Keine Verwirbelung in der Säule

B Term: Molekulare/axiale Diffusion

Diffusion der Bande (Funktion der Zeit) Abhängig von der Viskosität und Temp. der mobilen Phase C Term: Massentransferkinetik

Wechselwirkungen mit der stationären Phase und mobiler Phase Abhängig von der Korngröße, Porosität der Teilchen, Säulenlänge und

Säulenradius.

Die drei Therme der van-Deemter Kurve


0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Linear Velocity [mm/s]

HET

P (

µm

)

5 µm SunFire™ C18

3.5 µm SunFire™ C18

1.8 µm ACQUITY UPLC® HSS T3

1.7 µm ACQUITY UPLC® BEH C18

Der Vorteil kleiner Partikel die van Deemter Kurve


Verhältnis Säulenlänge/Partikelgröße Vergleich der Trennleistungen

1970er > 30 min

1980er 10-15 min

1990er 5-10 min

2004 1-2 min

29.500 µm 1,7 mm 50

33.000 µm 3 mm 100

30.000 µm 5 mm 150

30.000 µm 10 mm 300

=

=

=

=

=dL

p

Die chromatographische Auflösung bleibt konstant, solange das L/dp-Verhältnis gleich bleibt.

Voraussetzung: Die Flussrate wird angepasst!


Welche Volumina kennen wir in der LC Welt?

Dwell Volume = Gradientenverzögerungsvolumen Totvolumen

Säulenvolumen

Systemvolumen

Bandenverbreiterungsvolumen

Injektionsvolumen

Column Volume „CV“ = Verhältnis: Systemvolumen / Säulenvolumen


Dwell Volume

Dwell Volume

Volumen zwischen Mixer und Säulenkopf Wie lange benötigt meine mobile Phase bis sie auf die Säule trifft?


Unterschiedliche Volumina: Niederdruck- vs Hochdruck-Mischung

Kleineres Systemvolumen = kleineres Dwell-Volumen Mehrere Pumpen (binäres Mischen)

Detektor Injektor Säule Pumpe A

Pumpe B

Mischer

Gradienten- proportionier- ventil

Detektor Injektor A B

C D

Säule Pumpe

Größeres Systemvolumen = größeres Dwell-Volumen Eine Pumpe (quaternäres Mischen)

Bei gleicher Säulendimension


Mischbatterie tief – Mehr Rohrleitungsvolumen – Mehr Zeitverzögerung

Mischbatterie hoch – Weniger Rohrleitungsvolumen – Weniger Zeitverzögerung

Transfer von HPLC / UHPLC / UPLC


Systemvolumen Zeitversatz

Lösungsmittel- zusammensetzung

am Mischer

Lösungsmittel- zusammensetzung

am Säulenkopf

Profil der mobilen Phase im

Ausgangsystem, gemessen am Säuleneinlass

0 Injektion

x

Das Systemvolumen führt zu einem Zeitversatz, bevor die geänderte Lösungsmittelzusammensetzung am Säulenkopf angekommen ist. Zu

Beginn jedes Gradienten gibt es also eine isokratische Phase.

tg

{ }

Zeit


Unterschiedliche Systemvolumina Konsequenzen für die Trennung

Original-Gerät Systemvolumen 0.9 mL

Zielsystem mit kleinerem Volumen (kürzere isokratische Phase)

Zielsystem mit größerem Volumen (längere isokratische Phase)

Größeres Volumen Systemvolumen 1.4 mL

Kleineres Volumen Systemvolumen 0.35 mL


Übertragung von HPLC-Methoden zwischen verschiedenen LC Systemen

Um sicherzustellen, dass die Kapazität und Selektivität der Methode im ursprünglichen LC-System unverändert bleiben, müssen Systemunterschiede berücksichtigt werden ! Unterschiede im Systemvolumen haben Auswirkung auf Gradiententrennungen dwell Volumen=Gradientenverzögerungsvolumen ist von Anlage zu Anlage verschieden groß ! Die Beibehaltung des Verhältnisses von Systemvolumen zu Säulenvolumen stellt sicher, dass die vom System beim Start des Gradienten zugeteilte isokratische Phase konstant ist.


Gradienten Typen: Ausgleich der Systemvolumen

Vergleich der Systemvolumen – Das Volumen sollte zum besseren Vergleich in “column volumes (CVs)”

angegeben werden

Wenn das Ziel-System einen großen isokratischen Abschnitt hat Verwenden der injection-delay Funktion

Wenn das Ziel-System einen kleinen isokratischen Abschnitt hat ZUSÄTZLICH eine Verzögerung (initial hold) am Anfang des Gradientenprofils zufügen, um identische isokratische Phase zu erzielen


Worauf sollte noch geachtet werden? Temperatur

Temperatur beeinflusst direkt jeden chromatographischen Mechanismus

Im Methodentransfer muß die Temperatur konstant gehalten werden

Pre-heating ist essentiell


Worauf sollte noch geachtet werden? Skalierung des Injektionsvolumens

4,6 x 150 mm

2,1 x 50 mm

20 µL Injektion/2,49 mL = 0,8%

20 µL Injektion/0,17 mL = 12%

2,49 mL

0,17 mL

Wenn Sie zuviel injizieren, leidet die Peakform aufgrund der Überladung.

0,17x0,8%= 1,36 µl Injektion

Skalieren des Injektionsvolumens auf das Säulenvolumen •Das Injektionsvolumen sollte ca. 1% des Säulenvolumens sein


Warum Methodentransfer



Agenda


Geräteausfall

Validierung – Robustheit

Szenario 1: Wechsel des LC Gerätes bei Beibehaltung der Methode


Smaller Volume System Volume 0.35 mL

Szenario 1: Wechsel des LC Gerätes

Original Instrument System Volume 0.9 mL

Zielsystem mit kleinerem Volumen (geringe isokratische Phase) Hier muss mit einer isokratischen Phase kompensiert werden,um die Trennung beizubehalten. – Inital Hold (After Injection)

Column Volume 4.6 x100 mm : 1.66 ml

Angepasst in column volumes cv: 0.9/1.66 =0.54 cv


Angepasst in column volumes cv : 0.35/1.66 =0.21 cv


Szenario 1, das Ergebnis: Wechsel des LC Gerätes

Relative RT to Clozapine

Peak H-Class HPLC

Impurity D 0.867 0.865

Impurity C 0.898 0.895

Impurity A 0.951 0.950

Clozapine 1.000 1.000

Impurity B 1.507 1.513

Lassen Sie HPLC-Methoden auf der

ACQUITY UPLC H-Class laufen

Flexibilität für sowohl HPLC- als auch UPLC-

Methoden


Szenario 2: LC Instrumenten Transfer Anpassen der Methode - Verkürzen der Analysezeit

Bei hohen Probenaufkommen

Klassischer Anwendungsbereich der UPLC

Auch für die QC nach Einhaltung der Regularien


Szenario 2: LC Instrumenten Transfer Anpassen der Methode - Verkürzen der Analysezeit

Original Instrument System Volume 0.9 mL

Zielsystem mit größerem CV (längere isokratische Phase) -

Injection Delay (Before-Injection)

Larger Volume System Volume 0.35 mL


Einheiten Säulenvolumen: 0.9/1.66 =0.54 cv


Angepasst in column volumes : 0.35/0.17 =2.06 cv


Szenario 2, das Ergebnis: Anpassen der Methode

AU

0.000

0.010

0.020

0.030

0.040

0.050

0.060

0.070

0.080

0.090

Minutes0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00

HPLC Separation on Alliance HPLC System

XBridgeTM C18 4.6 x 100 mm, 3.5 µm Tailing = 1.60 Rs = 7.6

Gal

anta

min

e

1 2

4 5

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00

UPLC Separation on ACQUITY UPLC H-Class

ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 µm Tailing = 1.43 Rs = 7.2

Gal

anta

min

e

1 2

4 5

Anpassen der Methode

Verkürzung der Analysezeit um den Faktor 4,3 bei Beibehaltung

der Trennung

Kriterien für Tailing und Auflösung wurden erfüllt

Kriterien

USP Tailing < 2,0,

Rs (Galantamin/Verunreinigung 4) > 4,5


Warum Methodentransfer



Agenda


Zusammenfassung

HPLC-Methoden können entsprechend angepasst werden, um die Vorteile der sub-2-µm-Technologie zu nutzen – Bessere Trennleistung – Schnellere Anayltik

Bestehende HPLC-Methoden können einfach zwischen HPLC-

Geräten und der ACQUITY UPLC transferiert werden – Gleiche Trennleistung bei Einhaltung L/dp – Unterschiedliche Dwell-Volumina der Systeme müssen kompensiert

werden – Vergleich des Column Volumns „CV“ für einen leichtern Transfer – Temperatur und Injektionsvolumina anpassen

Vielen Dank Ihr Waters Team


Changes are allowed to registered methods – Werden Standards eingehalten ist die Etablierung neuer Techniken

erlaubt, aber die Methodik darf nicht geändert werden

Klassifizierung der Änderungen – Minor (annual report – no fees) – Moderate (supplement) – Major (Prior approval supplement)

Exercise of Enforcement Discretion – Notification that FDA does not intend to take action to enforce compliance

with the compendia changes requirement as stated in 21 CFR 314.70(c)(2)(iii) if manufacturers submit such changes in their annual reports.

– FDA intends to develop further guidance to clarify the requirements of 21 CFR 314.70(c)(2)(iii).

Das bedeutet: Bei gleicher Methodik, equivalenter oder gesteigerter Sicherheit, bleiben Akzeptanzkriterien unverändert; eine vollständige Revalidierung ist nicht notwendig.

Methodentransfer aus regulatorischer Sicht US FDA Guidelines for Method Change


USP <621> Chromatography Defines “Allowable Adjustments”

Adjustments to a USP method may be made to meet system suitability requirements

Verification tests must be performed after changes

– Full re-validation not required

Must use the same L-designation of column

Isocratic hold or dwell volume adjustments are allowed

USP 37 NF 32 S1 - Official Aug. 1, 2014 - Significant changes to Chapter <621> Chromatography


USP 37-NF 32 through First Supplement - August 1, 2014

Parameter USP 36-NF 31 USP 37-NF 32 Through first supplement

Isocratic Gradient

Particle Size -50% L/dp Ratio Constant or N: -25 to + 50%

No changes allowed

Column Length ±70%

No changes allowed

Flow Rate F2=F1 (d22/d12) and ±50% F2-F1 x[(dc22 x dp1)/dC12 x dp2)] and ±50% Not applicable

Column ID

Any allowed if linear velocity is constant

Any allowed if linear velocity is constant

No changes allowed

Injection Volume

Any reduction consistent with precision and detection limits;

no increase permitted

Can be adjusted as consistent with precision and detection

limits

Can be adjusted as consistent with precision and

detection limits

Column Temperature ±10 0C ±10 0C

±10 0C

Mobile Phase pH ±0.2 unit ±0.2 unit

±0.2 unit

F=Flow rate; d = internal column diameter; dc = column diameter, dp = particle size


Summary of ‘Allowable Adjustments’ Stated within USP Chapter <621>

Isokratische Methoden

- Verbessern der Analysengeschwindigkeit und –qualität mit UPLC und sub-2µ Säulen

- Verbesserte Methoden 2.x µm auf HPLC und UHPLC Systemen

- Keine Revalidierung erfoderlich Gradienten Methoden

- Jede Änderung bedingt Revalidierung - Voll optimierte Methoden durch sub-2-µm Partikel

und UPLC - Entwicklung besserer Methoden mit mehr Sicherheit

durch Einbindung von Massendetektion und Photodioden Array

System - Wählen des passenden Systems zur Maximierung der Anlagennutzung

Software - Umrechnungstools für schnellen Transfer - Nachahmungstools

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