İRLANDA DUBLİNDE BİR 3. BASAMAK HASTANEDEN İZOLE EDİLEN KLEBSİELLA PNEUMONIAE İZOLATLARININ PLAZMİDİK AMP C B-LAKTAMAZLARININ SAPTANMASI VE MOLEKÜLER TİPLENDİRİLMESİ

Araş.Gör.Dr. Fatma Esenkaya Taşbent

Yrd. Doç Dr. Mehmet ÖZDEMİR

Detectıon and molecular characterısatıon of Detectıon and molecular characterısatıon of plasmıdıc Amp C B-lactamases ın plasmıdıc Amp C B-lactamases ın Klebsiella Klebsiella pneumoniaepneumoniae isalates from a tertiary-care hospıtal isalates from a tertiary-care hospıtal in Dublin,Ireland 2008 European Society of in Dublin,Ireland 2008 European Society of

Clinical Microbiology and Infectious Diseases Clinical Microbiology and Infectious Diseases

Dünya genelinde Klebsiella Dünya genelinde Klebsiella ppnneueumoniae izolatları moniae izolatları arasındaki Amp C B-laktamazlar gittikçe arasındaki Amp C B-laktamazlar gittikçe artmaktadırartmaktadır

Bununla birlikte dirençli Klebsiella Bununla birlikte dirençli Klebsiella ppnneueumoniae moniae izlolatları arasından Amp C tipi B-laktmazların izlolatları arasından Amp C tipi B-laktmazların prevelansı, Amerika da % 8,5 prevelansı, Amerika da % 8,5 denden İngilterede % İngilterede % 55 55 ee kadar bölgesel olarak farklılık göstermektedir kadar bölgesel olarak farklılık göstermektedir

İrlanda’daki Klebsiella İrlanda’daki Klebsiella ppnneueumoniae Amp C moniae Amp C enzimlerinin epidemiyolojisi ve tiplendirilmesi enzimlerinin epidemiyolojisi ve tiplendirilmesi hakkında hakkında sınırlısınırlı miktarda bilgi var miktarda bilgi var

Bu prospektif çalışma plazmid ile ilişkili Amp C B- Bu prospektif çalışma plazmid ile ilişkili Amp C B- laktamazları taşıyan Klebsiella laktamazları taşıyan Klebsiella ppnneueumoniae moniae izolatlarının epidemiyolojisini belirlediği gibi 3. izolatlarının epidemiyolojisini belirlediği gibi 3. kuşak sefalosporinlere dirençli Klebsiella kuşak sefalosporinlere dirençli Klebsiella ppnneueumoniae izolatları arasındaki Amp C enziminin moniae izolatları arasındaki Amp C enziminin tipini ve prevelansını da belirlemiştirtipini ve prevelansını da belirlemiştir

Seftazidim, sefotaksim ve/veya sefpodoksim gibi Seftazidim, sefotaksim ve/veya sefpodoksim gibi 3. kuşak sefalosporinlerin bir yada 3. kuşak sefalosporinlerin bir yada daha daha fazlasına fazlasına dirençli replike olmamış Klebsiella dirençli replike olmamış Klebsiella ppnneueumoniae moniae izolatları Nisan 2005 den Mart 2007 ye kadar izolatları Nisan 2005 den Mart 2007 ye kadar prospektif olarak toplanmıştırprospektif olarak toplanmıştır

Duyarlılıkları CLSI kriterlerine göre disk difüzyon, Duyarlılıkları CLSI kriterlerine göre disk difüzyon, E testE test, , agar dilüsyon ve VITECagar dilüsyon ve VITEC 2 duyarlılık test 2 duyarlılık test sistemisistemi kullanılarak belirlendi kullanılarak belirlendi

İzolatların identifikasyonu VITEC identifikasyon İzolatların identifikasyonu VITEC identifikasyon sistemine göre yapıldısistemine göre yapıldı

Amp C B- laktamaz taraması E test ve VITEC 2 ile Amp C B- laktamaz taraması E test ve VITEC 2 ile sefotaksim ve seftazidim MIC lerini ölçsefotaksim ve seftazidim MIC lerini ölçüülerek ve lerek ve 100 mg/L kloksasilin içeren 100 mg/L kloksasilin içeren ve içermeyen ve içermeyen Müller Müller Hinton Medyum kullanılarak yapılmıştırHinton Medyum kullanılarak yapılmıştır

Kloksasilin Kloksasilin varlığında varlığında MIC deki iki katMIC deki iki kat veya daha fazla veya daha fazla azalma Amp C B-laktamaz varlığını azalma Amp C B-laktamaz varlığını göstermektedirgöstermektedir

Sefoksitin 30 mg diskinin yanındaki sefotaksim 30 Sefoksitin 30 mg diskinin yanındaki sefotaksim 30 mg yanındaki zonda birleşme Amp C mg yanındaki zonda birleşme Amp C indüksiyonunuindüksiyonunun tespitinde problem oluşturmaktadırn tespitinde problem oluşturmaktadır

..

Amp C enzimini kodlayan genler Multiplex PCR Amp C enzimini kodlayan genler Multiplex PCR kullanılarak identifiye edildi. Ardışık PCR ve kullanılarak identifiye edildi. Ardışık PCR ve sekanslama sekanslama acc acc geni için geni için

5 – TTTTCTTTTGCATGCGGATT ve 5 – TTTTCTTTTGCATGCGGATT ve

5 – ACAGGGCGTGCTGTAATACC primerlerini, 5 – ACAGGGCGTGCTGTAATACC primerlerini, dhadha geni için 5- ACACTGATTTCCGCTCTGCT ve geni için 5- ACACTGATTTCCGCTCTGCT ve

5- ACAATCGCCACCTGTTTTTC primerlerini 5- ACAATCGCCACCTGTTTTTC primerlerini kullanarak oluşturulmuşturkullanarak oluşturulmuştur

Dha 1 geninin üzerindeki Dha 1 geninin üzerindeki Amp RAmp R geninin geninin saptanması için kullanılan primer saptanması için kullanılan primer

5 -CAGGGTAAAGCGGTGAACAT dır. Bu çalışmada 5 -CAGGGTAAAGCGGTGAACAT dır. Bu çalışmada bildirilen nükleotid sekansları şu numaralar bildirilen nükleotid sekansları şu numaralar altında (acc-1 için EF554600 ve Amp R ve dha 1 altında (acc-1 için EF554600 ve Amp R ve dha 1 için EF633612) gen bankasında için EF633612) gen bankasında bulunmaktadırbulunmaktadır

İntegron analizleri Levesque ve arkadaşlarınİntegron analizleri Levesque ve arkadaşlarının ın tarifine tarifine göre göre yapılmıştıryapılmıştır. . BBakteriyel DNA nın lizisiakteriyel DNA nın lizisi sonrasısonrası CHEF DR II sistemi kullanılarak pulsed field CHEF DR II sistemi kullanılarak pulsed field gel elektroforez ile izolatlar genotiplendirilmiştirgel elektroforez ile izolatlar genotiplendirilmiştir

İzolatlar arasındaki ilişki aritmetik ortalama ile İzolatlar arasındaki ilişki aritmetik ortalama ile eşleşmiş eşleşmiş grup yöntemi kullanılarak küme grup yöntemi kullanılarak küme analizleri analizleri yapılarakyapılarak Dice Coefficient kullanıla Dice Coefficient kullanılarrak ak hesaplanmıştırhesaplanmıştır

500 K500 K.p.pnneueumoniamoniaee klinik izolat klinik izolatıından 32 sinde en ndan 32 sinde en az az birbir oksiimino B-laktama artmış direnç gösterildi oksiimino B-laktama artmış direnç gösterildi

Bu izolatların Bu izolatların 15 i 15 i (%48i) m(%48i) muhtemeluhtemel Amp C üreten Amp C üreten bakteri olarakbakteri olarak seçildi. Bir izolat fenotipik testlere göre seçildi. Bir izolat fenotipik testlere göre klas A klas A tipi tipi ESBLESBL üretmiştir. Geri kalan 17 izolat da, üretmiştir. Geri kalan 17 izolat da, ESBL üreten Klas A fenotipine sahiptiESBL üreten Klas A fenotipine sahipti

15 seçilmiş izolatın Multiplex PCR la Amp C + 15 seçilmiş izolatın Multiplex PCR la Amp C + olduğu gösterilmiş olup bunlardan 13 ü acc tipi B olduğu gösterilmiş olup bunlardan 13 ü acc tipi B laktamazlaktamaz,, 2 si ise dha tipi B-laktamaz olduğu tespit 2 si ise dha tipi B-laktamaz olduğu tespit edildiedildi

2 izolattan sonuncusunda indüklenebilir direnç 2 izolattan sonuncusunda indüklenebilir direnç bulundubulundu..

Nükleotid sekanslama Nükleotid sekanslama sonucu sonucu 13 13 blabla accacc geni geni daha daha önce gen bankasına girişi yapılanönce gen bankasına girişi yapılan Klebsiella Klebsiella ppnneueumoniamoniaee bla bla acc-1acc-1 sekansı ile % 100 uyumlu sekansı ile % 100 uyumlu bulundubulundu

İki bla İki bla dha dha gen sekansıgen sekansı da identifiye edildi ve da identifiye edildi ve bilinen Klebsiella pneumoniae bla bilinen Klebsiella pneumoniae bla dha 1dha 1 geni ile geni ile %100 uyuma sahipti%100 uyuma sahipti

Ek olarak bla Ek olarak bla dha 1dha 1 gen izolatlarının her ikisinde de gen izolatlarının her ikisinde de Amp R bulundu. PCR sonuçlarına göre dha 1 olan Amp R bulundu. PCR sonuçlarına göre dha 1 olan iki izolat ve acc 1 olan bir izolat pozitif olarak iki izolat ve acc 1 olan bir izolat pozitif olarak izlendiizlendi

15 izolatın hepsi karbapenemlere ve sefepime 15 izolatın hepsi karbapenemlere ve sefepime duyarlı idi. Yüksek duyarlı idi. Yüksek düzeyde düzeyde sefoksitisefoksitinn direnci direnci,, yalnızca dha 1 üreten 2 izolatta bulundu. 15 yalnızca dha 1 üreten 2 izolatta bulundu. 15 izolatın hepsi amoksilin/klavulonik aside dirençli izolatın hepsi amoksilin/klavulonik aside dirençli idiidi. .

Ama en çok duyarlılık amikasin, gentamisin ve Ama en çok duyarlılık amikasin, gentamisin ve siprofloksasine karşı bulundusiprofloksasine karşı bulundu

Acc 1 üreten 13 izolatın küme analizinde birbirleri Acc 1 üreten 13 izolatın küme analizinde birbirleri ile farklı ilişki düzeyindeki izolatlardan 3 küme ile farklı ilişki düzeyindeki izolatlardan 3 küme oluşturulması oluşturulması düşünüldüdüşünüldü

Küme 1; bant farklılığı içermeyen 2 tip izolat (7 Küme 1; bant farklılığı içermeyen 2 tip izolat (7 ve 9) Küme 2; 4 band faklılığı içeren iki izolat (6 ve 9) Küme 2; 4 band faklılığı içeren iki izolat (6 ve 14) ve Küme 3; altı band farklılığı içeren 2 ve 14) ve Küme 3; altı band farklılığı içeren 2 izolattan oluşmaktadırizolattan oluşmaktadır

Bu üç küme birbiriyle ilişkili değildiBu üç küme birbiriyle ilişkili değildi Geri kalan izolatlar tamamen birbirinden farklı Geri kalan izolatlar tamamen birbirinden farklı

idi. idi.

SonSonuçuç olarak bu çalışma acc1 ve dha1 içeren iki olarak bu çalışma acc1 ve dha1 içeren iki tip plazmidik Amp C enzimini identifiye etmiştir.tip plazmidik Amp C enzimini identifiye etmiştir.

İrlandadaki Dha 1 üreten plazmidik indüklenebilir İrlandadaki Dha 1 üreten plazmidik indüklenebilir Amp C enzimAmp C enzimi bulundurani bulunduran iki izolat ilk iki izolat ilk defa defa bildiribildirilirkenlirken major kazanılmış Amp C enzimi acc 1 major kazanılmış Amp C enzimi acc 1 didi

Bu enzim Klebsiella pneumoniae izolatlarının % Bu enzim Klebsiella pneumoniae izolatlarının % 48 den identifiye edildi.48 den identifiye edildi.

Bu oran benzer seleksiyon kriterleri ile, İrlanda ve Bu oran benzer seleksiyon kriterleri ile, İrlanda ve İngilterede yapılan bir yeni çalışmadaki % 25 lik sıklığa İngilterede yapılan bir yeni çalışmadaki % 25 lik sıklığa benzemektedirbenzemektedir

Avrupa içinde yayılan acc 1 geniyle ilgili Fransa ve Avrupa içinde yayılan acc 1 geniyle ilgili Fransa ve İspanyadan yapılan diğer bildirimler de benzer İspanyadan yapılan diğer bildirimler de benzer sonuçlar içermekteydisonuçlar içermekteydi

Acc üreten Klebsiella pneumoniae izolatlarının çoğu Acc üreten Klebsiella pneumoniae izolatlarının çoğu sefoksitine duyarlı idisefoksitine duyarlı idi

Farklı olarak, sefoksitin dirençli ise oksiimino B-Farklı olarak, sefoksitin dirençli ise oksiimino B-laktamlara azalmış duyarlılık klas c B-laktamaz laktamlara azalmış duyarlılık klas c B-laktamaz üretimini gösterirüretimini gösterir

Klebsiella pneumoniae izolatları sefoksitin ve Klebsiella pneumoniae izolatları sefoksitin ve sefepime duyarlıdırsefepime duyarlıdır

Fakat seftazidim ve sefotaksime duyarlılık Fakat seftazidim ve sefotaksime duyarlılık azalmıştırazalmıştır

Bu durum plazmidik Amp C üretimi ile ilgili olabilir Bu durum plazmidik Amp C üretimi ile ilgili olabilir bu nedenle diğer testlerle konfirme edilmelidir. bu nedenle diğer testlerle konfirme edilmelidir.

Pulsed field jel elektroforezi, hastane içinde Pulsed field jel elektroforezi, hastane içinde transfer edilebilir Amp C ilişkili direncin transfer edilebilir Amp C ilişkili direncin insidansını,insidansını, tek bir klonun yayılımından ziyade tek bir klonun yayılımından ziyade mobil bir elementin transferi sonucu olduğunu mobil bir elementin transferi sonucu olduğunu belirtmektedir. belirtmektedir.

İrlandadaki bu enzimlerin prevelansınınİrlandadaki bu enzimlerin prevelansının ve ortaya ve ortaya çıkışınınçıkışının surveyansısurveyansı gereklidir gereklidir

TEŞEKKÜRLER