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Durchflusszytometrie
Apoptoseanalyse
Jörn SchulzeStrahlenbiologie, Klinik für Strahlentherapie, Campus Mitte
Inhalt
DurchflusszytometerApoptoseAnalyse der Apoptose
Durchflusszytometer- Einleitung -
optisches MesssystemStreulicht- und Fluoreszenzsignale von
Partikeln bzw. Zellengleichzeitige Messung von physikalischen
und biochemischen Parametern: Größe Oberfläche Granularität markierte Proteine
Durchflusszytometer- Geschichte -
50er Jahre: Hämatologiezählgeräte mittels elektrischer Widerstandsmessung
60er Jahre: Durchlusszytometer zur Messung von Tumorzellen, Lymphozyten und Bakterien mit Hilfe von Protein- und DNA-Farbstoffen und fluoreszenzmarkierten Antikörpern
Durchflusszytometer- Lichtstreuung -
Streuung eines Lichtstrahles beim Auftreffen auf eine Zelle
beeinflussende Zelleigenschaften: Querschnittsfläche Refraktionsindex Membranstruktur intrazelluläre Bestandteile
Durchflusszytometer- Lichtstreuung -
Vorwärtsstreulicht
FSC* (axial)
Seitwärtsstreulicht
SSC** (orthogonal)
Intensität FSC >> SSC
Sensitivität Querschnittsfläche Refraktionsindex
Information Zellgröße Granularität
Membranfaltung
Form
* forward angle light scatter
** side scatter
Durchflusszytometer- Komponenten -
Flüssigkeitssystemoptisches SystemSignalverarbeitunssystem
Durchflusszytometer- Flüssigkeitssystem -
Der Probenstrom wird durch eine konische, auf das Lumen der Küvette angepasste Kapillare stark beschleunigt (ca. 7 m/s). Damit wird eine Einzelzellsuspension, ähnlich einer Perlenkette gewährleistet.
1. Laserstrahl
2. Messküvette
3. Trägerflüssigkeit
4. Zellsuspension
5. hydrodynamische Fokussierung
Durchflusszytometer- optisches System -
1. Laserstrahl2. Quarzglasküvette3. Blockerstreifen4. Sammellinse5. Teilerspiegel6. Photodiode7. Lichtfilter8. verschiedene
Photomultiplier
Durchflusszytometer- optisches System -
Anregungsteil für Lichtstrahlformung prismatische Strahlexpander und Linsen Lichtstrahl mit horizontal-elliptischen
Durchmesser (ca. 20 x 60 μm) für hohe räumliche Auflösung und ausreichender Signalintensität
Durchflusszytometer- optisches System -
Detektionsteil Vorwärtsstreulicht Seitwärtsstreulicht Trennung von Seitwärtsstreu- und
Fluoreszenzlicht Zerlegung der Fluoreszenz in verschiedene
Farbbereiche Photoröhren für Seitwärtsstreu- und
Fluoreszenzlicht lichtaktive Photodioden für Vorwärtsstreulicht Umwandlung des Lichtsignals in ein elektrisches
Signal
Durchflusszytometer- Signalverarbeitungssystem -
Schwellenwert Differenzierung von Zell- und Störsignalen
mittels elektronischer Schwelle, bezogen auf einen bestimmten Auslöseparameter (Trigger, z.B. FSC)
Digitalisierung Analog-Digital-Wandler (ADC) registrierte Signalintensität [V] → Kanalzahl
(256 bzw. 1024 Kanäle)
Darstellung der Messergebnisse- einparametrig -
Histogramm bzw. Häufigkeitsverteilungdigitale Messsignale → Kanalwerte von 0
bis 255 bzw. 1023Ordinate: Anzahl der ZellenAbszisse: Kanälelineare und logarithmische Darstellung
Darstellung der Messergebnisse- einparametrig -
Apoptose- Definition -
apo…: <griech> ab, weg, losptosis: <griech> Senkungprgrammierter Zelltod („cell suicide“)aktiver, energieabhängiger Prozess ohne
entzündliche Reaktion (Abgrenzung zur Nekrose)
Apoptose- Definition -
physiologisch: Embryogenese Metamorphose normale Zellerneuerung im Gewebe Entwicklung des Immunsystems terminale Differenzierung myeloischer Zellen
Apoptose- Definition -
pathologisch: ionisierende Strahlung zytotoxische Chemikalien Entzug spezifischer Wachstumsfaktoren (IL-2,
IL-3, Serum, Steroidhormone) zytotoxische T-Zellen natürliche Killerzellen
Apoptose- Definition -
Der programmierte Zelltod ist in wachsenden und regressiven Tumoren nachweisbar. Er beeinflusst die Expansion der Tumor-Zell-Population über das Gleichgewicht von Zell-Gewinn und Zell-Verlust.
Die Apotose ist die Art des Tumor-Zelltodes nach zytotoxischer Therapie.
Apoptose- Morphologie -
Phase I Abnahme des Zellvolumens Auflösen des Zellverbundes Verlust von Membranstrukturen (Mikrovilli,
Pseudopodien) Kondensierung des Zytoplasmas Verdichtung zytoplasmatischer Organellen Auflösung des Nukleoli Kondensation des Chromatins Bildung von Vesikel, Verschmelzung mit der
Zellmembran unveränderte Ribosomen und Mitochondrien keine erhöhte Permeabilität der Membran
Apoptose- Morphologie -
Phase II verstärkte Bläschenbildung auf der Zelloberfläche Zeiose - Lappung der Zelle Karyorrhexis - Fragmentierung des Nukleoli Apoptosekörper: membranumhüllte Kernfragmente mit
Zytoplasma und Organellen einsetzende Phagozytose
Apoptose- Morphologie -
Phase III fortschreitende Degenerierung der restlichen Kern- und
Zytoplasmastrukturen Permeabilität der Membran, mögliche Vitalfärbung
Apoptose- Morphologie -
Apoptose- Differenzierung von der Nekrose -
Analyse der Apoptose
Möglichkeiten der Charakterisierung der Apoptose anhand der
DNA-Schädigung undMembranveränderung
Analyse der Apoptose - Membran -
Cytoskelett bestehend aus MikrofilamentenActin-FilamenteFormgebung (Mikrovilli)Kontakt (Pseudopodien)Beweglichkeit wandernder Zellen
(Zusammenwirkung mit Myosin)
Analyse der Apoptose - Membran -
Actin F-Actin (filamentäres) G-Actin (globuläres)
Polymerisation, ATP
G-Actin F-ActinDepolymerisation, ADP
CalciumMagnesiumProteine
Analyse der Apoptose - Membranveränderung -
Im Prozess der Apoptose kommt es zu einer Reduzierung der Pseudopodien und Mikrovilli und damit zu einer Abnahme des F-Actins.
Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Phalloidin-Fluorescein-Konjugat
Phalloidin: Grüner Knollenblätterpilz (Amanita phalloides) Hepatotoxizität:
Blockierung der m-RNA-Synthese durch Komplexbindung mit der RNA-Polymerase im Zellkern
irreversible Bindung an F-Actin und Hemmung der Depolymerisation
keine Enzym- und Proteinsynthese in der Leber LD50 (Maus)=2 mg/kg KG
Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Phalloidin
Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Phalloidin-Fluorescein-Konjugat
Fluorescein: Fluorochrom FITC (Fluorescein-Isothiocyanat):
Farbstoff für sekundäre Fluoreszenz (Substratbindung über Haupt- und Nebenvalenzen)
grüne Fluoreszenz 495 nm Extinktion 519 nm Emission
Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Fluorescein
stabile Kristallform (li.) und amorphie Verbindung (re.)
Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 72 h nach Einsaat
0 Gy2% FITC(-)
20 Gy9% FITC(-)
Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat
0 Gy4% FITC(-)
20 Gy36% FITC(-)
Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat, 0 Gy
Analyse der Apoptose - Membranfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat, 20 Gy
F-Actin-Verlust DNA-Verlust Polyploidie unregelmäßige Zellform
Analyse der Apoptose - Hinweise zur Methodik -
Die Durchführung der Methodik ist abhängig von der Zellart. Es müssen, i. b. bezüglich der Fixierung, eigene Erfahrungen gesammelt werden.
Toxizität von PhalloidinFITC-PI-BeeinflussungKorrelation der Messergebnisse mittels
Vitalfärbung Hoechst 33342
Analyse der Apoptose - Vitalfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat, 0 Gy
Analyse der Apoptose - Vitalfärbung -
Beispiel: Monolayerkultur H460 (non small cell lung cancer) - 240 h nach Einsaat, 20 Gy